JP2009102231A - Degranulation inhibitor of mast cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、肥満細胞の脱顆粒抑制剤に関し、アレルギーの治療分野に属する。 The present invention relates to a mast cell degranulation inhibitor and belongs to the field of allergy therapy.
肥満細胞はイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）関連Ｔｈ２ヘルパー細胞依存性の即時型過剰反応およびアレルギー疾患ならびにある種の自然免疫応答において、主要なエフェクター細胞である（非特許文献１〜３）。高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）に結合したＩｇＥ分子への多価抗原の結合によって、肥満細胞上に発現するＦｃεＲＩが凝集し、かかる凝集が肥満細胞の活性化を開始する（非特許文献４、５）。活性化した肥満細胞は、プロテアーゼや、ヒスタミン等の血管作動性アミンを含む前もって作られた（細胞質内の顆粒に貯蔵されている）メディエーターを分泌する。また、肥満細胞の活性化は、前炎症性脂質メディエーターおよびサイトカインのde novo合成につながる。ＦｃεＲＩ凝集に応答したこのようなメディエーターの合成および放出は、多数のプロテインチロシンキナーゼカスケードを含むシグナル伝達経路を介して調節される。 Mast cells are major effector cells in immunoglobulin E (IgE) -related Th2 helper cell-dependent immediate hyperreactivity and allergic diseases and certain innate immune responses (Non-Patent Documents 1 to 3). By binding of a multivalent antigen to an IgE molecule bound to a high affinity IgE receptor (FcεRI), FcεRI expressed on mast cells aggregates, and such aggregation initiates activation of mast cells (Non-Patent Document 4, 5). Activated mast cells secrete pre-made mediators (stored in granules in the cytoplasm) that contain proteases and vasoactive amines such as histamine. Also, activation of mast cells leads to de novo synthesis of proinflammatory lipid mediators and cytokines. The synthesis and release of such mediators in response to FcεRI aggregation is regulated through signal transduction pathways involving multiple protein tyrosine kinase cascades.
これらのカスケードの下流の重要な標的の１つは、ホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣγ）である。ＰＬＣγは、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェートのジアシルグリセロールおよびイノシトール−１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）への加水分解を触媒する。ＩＰ３は、小胞体（ＥＲ）膜のその受容体に結合し、それにより、Ｃａ２＋が迅速ではあるが一過性にＥＲストアから放出される。カルシウム動員の第２ステージでは、形質膜（ＰＭ）を横切って細胞外Ｃａ２＋が持続的に流入する。この第２段階で、ＥＲプール内のＣａ２＋ストアが空になることそれ自体がＰＭのＣａ２＋チャネルを活性化すると考えられている（いわゆるストア作動性Ｃａ２＋（ＳＯＣ）流入メカニズム)（非特許文献６、７）。しかしながら、ストア枯渇に依存しない、ＰＭ中のＣａ２＋チャネルを活性化する他のメカニズムも報告されている。 One important target downstream of these cascades is phospholipase C-γ (PLCγ). PLCγ catalyzes the hydrolysis of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate to diacylglycerol and inositol-1,4,5-triphosphate (IP 3 ). IP 3 binds to its receptor on the endoplasmic reticulum (ER) membrane, thereby releasing Ca 2+ rapidly but transiently from the ER store. In the second stage of calcium mobilization, extracellular Ca 2+ continuously flows across the plasma membrane (PM). In this second stage, emptying of the Ca 2+ store in the ER pool is believed to itself activate the PM Ca 2+ channel (so-called store-operated Ca 2+ (SOC) influx mechanism) (non-patented) References 6 and 7). However, other mechanisms for activating Ca 2+ channels in PM that do not depend on store depletion have also been reported.
最近の研究により、ＳＯＣ流入メカニズムにおける主要なプレーヤーが明確にされてきた（非特許文献８〜１１）。Ｃａ２＋流入のゲノムワイドＲＮＡｉスクリーニングにより、ＥＲ膜タンパク質ＳＴＩＭ１が同定された。ＳＴＩＭ１は、そのＥＦハンドＣａ２＋結合モチーフにより、内腔のＣａ２＋量の枯渇を検出するＣａ２＋センサーである（非特許文献８、９）。ストア枯渇の際に、ＳＴＩＭ１はＰＭ下部の点状に移動し、その後ＰＭのＳＯＣチャネルが活性化される（非特許文献９、１２、１３）。 Recent research has clarified the major players in the SOC inflow mechanism (Non-Patent Documents 8 to 11). The genome-wide RNAi screen for Ca 2+ entry identified the ER membrane protein STIM1. STIM1 is a Ca 2+ sensor that detects depletion of the amount of Ca 2+ in the lumen by its EF hand Ca 2+ binding motif (Non-patent Documents 8 and 9). When the store is depleted, STIM1 moves in a dotted shape below the PM, and then the PM SOC channel is activated (Non-Patent Documents 9, 12, 13).
肥満細胞活性化および脱顆粒におけるＣａ２＋の重要性は、薬理学的試験に基づいて広く信じられている。ＥＧＴＡ処理は、ＦｃεＲＩが介在するカルシウム動員および脱顆粒をほぼ完全に抑制した（非特許文献１４、１５）。しかし、最近の知見によると（非特許文献１６〜１９）、Ｌｙｎ欠損肥満細胞はカルシウムの動員が減弱しているにも関らず、脱顆粒を誘導可能であり、カルシウム動員の第２ステージ（主としてカルシウム流入）が実際に肥満細胞の活性化および脱顆粒に必須であるのか否か不明である。さらに、もしそうだとしても、ＳＯＣ依存性および非依存性経路の両方が共存していると思われるので、ＳＯＣ経路が肥満細胞応答に主要な役割を果たしているのか未だに不明である。
本発明の目的は、新たな作用機序に基づく肥満細胞の活性化の抑制手段、具体的には肥満細胞の脱顆粒抑制剤等を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a means for suppressing mast cell activation based on a new mechanism of action, specifically, a mast cell degranulation inhibitor and the like.
肥満細胞活性化におけるＳＯＣ流入の関与に直接取り組むために、本発明者らは、ＳＴＩＭ１欠損マウスを作出した。その結果、ＳＴＩＭ１がＦｃεＲＩ誘導性Ｃａ２＋流入を厳密に調節し、ＮＦ−κＢおよびＮＦＡＴ活性化を介し、脱顆粒ならびにin vivoアナフィラキシー応答を調節していることを解明し、本発明を完成するに至った。これは、肥満細胞活性化におけるＳＴＩＭ１の重要性を直接遺伝学的に証明したものである。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。 In order to directly address the involvement of SOC influx in mast cell activation, we created STIM1-deficient mice. As a result, it was elucidated that STIM1 strictly regulates FcεRI-induced Ca 2+ influx and regulates degranulation and in vivo anaphylactic response via NF-κB and NFAT activation, thereby completing the present invention. It came. This is a direct genetic demonstration of the importance of STIM1 in mast cell activation. That is, the present invention is as follows.
〔１〕 ＳＴＩＭ１阻害物質を有効成分として含有する肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
〔２〕 ＳＴＩＭ１阻害物質を有効成分として含有するアレルギーの予防または治療剤。
〔３〕 ＳＴＩＭ１阻害物質を有効成分として含有するアナフィラキシーの予防または治療剤。
〔４〕 ＳＴＩＭ１阻害物質を有効成分として含有する肥満細胞の炎症性サイトカインの産生抑制剤。
〔５〕 ＳＴＩＭ１阻害物質が、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはそれらの発現ベクターである、前記〔１〕〜〔４〕いずれかに記載の剤。
〔６〕 ＲＮＡｉ誘導性核酸がｓｉＲＮＡである、前記〔５〕に記載の剤。
〔７〕 ｓｉＲＮＡが、配列番号１の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである、前記〔６〕に記載の剤。
〔８〕 被験物質がＳＴＩＭ１遺伝子の発現または機能を抑制し得るか否かを評価することを含む、肥満細胞の脱顆粒を抑制し得る物質のスクリーニング方法。
〔９〕 下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、前記〔８〕記載の方法：
（ａ）被験物質とＳＴＩＭ１遺伝子の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＳＴＩＭ１遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるＳＴＩＭ１遺伝子の発現量と比較する工程；および
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＳＴＩＭ１遺伝子の発現量を抑制する被験物質を選択する工程。
〔１０〕 下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、前記〔８〕記載の方法：
（ａ）被験物質をＳＴＩＭ１蛋白質に接触させる工程；
（ｂ）被験物質のＳＴＩＭ１蛋白質に対する結合能を測定する工程；および
（ｃ）上記（ｂ）の結果に基づいて、ＳＴＩＭ１蛋白質に結合能を有する被験物質を選択する工程。
[1] A mast cell degranulation inhibitor comprising a STIM1 inhibitor as an active ingredient.
[2] A prophylactic or therapeutic agent for allergy comprising a STIM1 inhibitor as an active ingredient.
[3] A preventive or therapeutic agent for anaphylaxis comprising a STIM1 inhibitor as an active ingredient.
[4] A mast cell inflammatory cytokine production inhibitor containing a STIM1 inhibitor as an active ingredient.
[5] The agent according to any one of [1] to [4], wherein the STIM1 inhibitor is an RNAi-inducible nucleic acid, an antisense nucleic acid, a ribozyme, or an expression vector thereof.
[6] The agent according to [5] above, wherein the RNAi-inducing nucleic acid is siRNA.
[7] The above [6], wherein the siRNA is composed of a sense strand containing 19 to 25 consecutive base sequences in mRNA corresponding to the base sequence of SEQ ID NO: 1 and an antisense strand containing the complementary sequence thereof. The agent described in 1.
[8] A screening method for a substance capable of suppressing mast cell degranulation, comprising evaluating whether a test substance can suppress the expression or function of the STIM1 gene.
[9] The method according to [8] above, comprising the following steps (a) to (c):
(A) contacting the test substance with a cell capable of measuring the expression of the STIM1 gene;
(B) measuring the expression level of the STIM1 gene in the cell contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of the STIM1 gene in the control cell not contacted with the test substance; and (c) (b) above A step of selecting a test substance that suppresses the expression level of the STIM1 gene based on the comparison result of.
[10] The method according to [8] above, comprising the following steps (a) to (c):
(A) contacting the test substance with the STIM1 protein;
(B) measuring the binding ability of the test substance to the STIM1 protein; and (c) selecting a test substance having the binding ability to the STIM1 protein based on the result of (b) above.
本発明の肥満細胞の脱顆粒抑制剤によれば、ＳＴＩＭ１阻害物質を有効成分として含むことから、これまでにない作用機序に基づいた分子標的医薬品の開発に貢献することができる。ＳＴＩＭ１阻害物質を有効成分として含む医薬は、アレルギーまたはアナフィラキシーの予防または治療薬として有用である。また、本発明のスクリーニング方法によれば、ＳＴＩＭ１を分子標的とする候補物質を迅速にスクリーニングすることができる。 According to the mast cell degranulation inhibitor of the present invention, since it contains a STIM1 inhibitor as an active ingredient, it can contribute to the development of a molecular target drug based on an unprecedented mechanism of action. A medicament containing a STIM1 inhibitor as an active ingredient is useful as a preventive or therapeutic agent for allergy or anaphylaxis. Moreover, according to the screening method of the present invention, a candidate substance having STIM1 as a molecular target can be rapidly screened.
本発明は、ＳＴＩＭ１阻害物質を有効成分として含有する肥満細胞の脱顆粒抑制剤を提供する。 The present invention provides a mast cell degranulation inhibitor containing a STIM1 inhibitor as an active ingredient.
本発明において、ＳＴＩＭ１とは、１つの膜貫通ドメインと１つのＥＦ−ハンドカルシウム結合モチーフを有する間質細胞相互作用分子１をいい、小胞体膜に存在するカルシウムセンサータンパク質である。 In the present invention, STIM1 refers to stromal cell interaction molecule 1 having one transmembrane domain and one EF-hand calcium binding motif, and is a calcium sensor protein present in the endoplasmic reticulum membrane.
本発明において、ＳＴＩＭ１は、任意の哺乳動物由来の膜タンパク質である。哺乳動物としては、ヒトおよびヒトを除く哺乳動物が挙げられ、ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。ヒトのアレルギー疾患の治療に用いるためには、ヒト由来のＳＴＩＭ１が好ましい。ヒトＳＴＩＭ１の塩基配列およびアミノ酸配列は公知であり、例えば、ＳＴＩＭ１の塩基配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）（GenBank Accession No. NM_003156）などがＧｅｎＢａｎｋに登録され、公表されている。また、マウスＳＴＩＭ１の塩基配列およびアミノ酸配列も公知であり、例えば、マウスＳＴＩＭ１の塩基配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）（GenBank Accession No. NM_009287）などがＧｅｎＢａｎｋに登録され、公表されている。 In the present invention, STIM1 is a membrane protein derived from any mammal. Examples of mammals include humans and mammals other than humans. Examples of mammals other than humans include rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, and laboratory animals such as rabbits, pigs, cows, and goats. , Primates such as domestic animals such as horses and sheep, pets such as dogs and cats, monkeys, orangutans and chimpanzees. For use in the treatment of human allergic diseases, human-derived STIM1 is preferred. The base sequence and amino acid sequence of human STIM1 are known. For example, the base sequence (SEQ ID NO: 1) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of STIM1 (GenBank Accession No. NM_003156) are registered and published in GenBank. . The nucleotide sequence and amino acid sequence of mouse STIM1 are also known. For example, the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of mouse STIM1 (GenBank Accession No. NM_009287) are registered in GenBank and published. Has been.
本発明において、ＳＴＩＭ１阻害物質とは、ＳＴＩＭ１の発現を阻害する物質およびＳＴＩＭ１の機能（作用）を阻害する物質の両方を含む。 In the present invention, the STIM1 inhibitor includes both a substance that inhibits the expression of STIM1 and a substance that inhibits the function (action) of STIM1.
本発明の薬剤に有効成分として含まれるＳＴＩＭ１の発現を阻害する物質は、ＳＴＩＭ１の転写過程に作用してその発現を阻害する物質であれば特に限定されるものではない。かかる阻害物質としては、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはそれらの発現ベクターが挙げられる。 The substance that inhibits the expression of STIM1 contained as an active ingredient in the drug of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that acts on the transcription process of STIM1 and inhibits its expression. Such inhibitors include RNAi-inducible nucleic acids, antisense nucleic acids or ribozymes or their expression vectors.
前記ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡのキメラ分子である。ＲＮＡ干渉とは、ｍＲＮＡと同一の塩基配列（またはその部分配列）を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する効果をいう。このＲＮＡｉ効果を得るには、例えば、少なくとも１９の連続する標的ｍＲＮＡと同一の塩基配列（またはその部分配列）を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが好ましい。ただし、ＳＴＩＭ１の発現阻害作用を有していれば数塩基置換されているものであってもよく、１９塩基長よりも短いＲＮＡであってもよい。２本鎖構造は、センス鎖とアンチセンス鎖の異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。 The RNAi-inducible nucleic acid refers to a polynucleotide capable of inducing RNA interference by being introduced into a cell, and is preferably RNA or a chimeric molecule of RNA and DNA. RNA interference refers to the effect that a double-stranded RNA containing the same base sequence (or a partial sequence thereof) as mRNA suppresses the expression of the mRNA. In order to obtain this RNAi effect, for example, it is preferable to use RNA having a double-stranded structure having the same base sequence (or a partial sequence thereof) as at least 19 consecutive target mRNAs. However, as long as it has STIM1 expression inhibitory action, it may be substituted by several bases, or may be RNA shorter than 19 bases. The double-stranded structure may be composed of different strands of a sense strand and an antisense strand, or may be a double strand (shRNA) provided by a single RNA stem-loop structure. Examples of RNAi-inducible nucleic acids include siRNA and miRNA.
ＲＮＡｉ誘導性核酸は、転写抑制活性が強いという観点から、ｓｉＲＮＡが好ましい。ＳＴＩＭ１に対するｓｉＲＮＡは、ＳＴＩＭ１のｍＲＮＡの任意の部分を標的とすることができる。ＳＴＩＭ１に対するｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ効果を誘導できる限り特に制限されないが、例えば１９〜２７塩基長、好ましくは２１〜２５塩基長である。ＳＴＩＭ１に対するｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二重鎖である。具体的には、ＳＴＩＭ１に対するｓｉＲＮＡは、配列番号１または３の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである。ＳＴＩＭ１に対するｓｉＲＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖の一方または双方の５’末端または３’末端においてオーバーハング（overhang）を有していてもよい。オーバーハングは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端における１〜数個（例、１、２または３個）の塩基の付加により形成されるものである。ｓｉＲＮＡの設計方法は、当業者に公知であり、ｓｉＲＮＡの様々な設計ソフトウエアまたはアルゴリズムを用いて、上記塩基配列から適切なｓｉＲＮＡの塩基配列を選択することができる。 The RNAi-inducing nucleic acid is preferably siRNA from the viewpoint of strong transcriptional repression activity. The siRNA against STIM1 can target any part of STIM1 mRNA. The siRNA molecule for STIM1 is not particularly limited as long as it can induce the RNAi effect, but is, for example, 19 to 27 bases long, preferably 21 to 25 bases long. The siRNA against STIM1 is a duplex comprising a sense strand and an antisense strand. Specifically, siRNA for STIM1 is composed of a sense strand containing 19 to 25 consecutive base sequences in mRNA corresponding to the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, and an antisense strand containing its complementary sequence. is there. The siRNA against STIM1 may have an overhang at the 5 'end or 3' end of one or both of the sense strand and the antisense strand. The overhang is formed by the addition of 1 to several (eg, 1, 2 or 3) bases at the ends of the sense strand and / or the antisense strand. Methods for designing siRNA are known to those skilled in the art, and an appropriate siRNA base sequence can be selected from the above base sequences using various siRNA design software or algorithms.
ＳＴＩＭ１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の一具体例としては、下記配列：
5’-AAGGCTCTGGATACAGTGCTC-3’(配列番号５)
5’-AAGAAGCTGCGCGATGAGATC-3’（配列番号６）
が挙げられる。
As a specific example of the sense strand of siRNA against STIM1, the following sequence:
5'-AAGGCTCTGGATACAGTGCTC-3 '(SEQ ID NO: 5)
5'-AAGAAGCTGCGCGATGAGATC-3 '(SEQ ID NO: 6)
Is mentioned.
ＳＴＩＭ１に対するアンチセンス核酸は、ＳＴＩＭ１の転写産物（ｍＲＮＡまたは初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該転写産物とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該転写産物にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得るポリヌクレオチドをいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンス核酸は、天然型のリン酸ジエステル結合を有するものであっても、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’-Ｏ-メチル型等の修飾ヌクレオチドであってもよい。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性および細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。アンチセンス核酸の長さは、ＳＴＩＭ１の転写産物（例、配列番号１または３の塩基配列に対応するｍＲＮＡ）と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５塩基程度、長いもので転写産物の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約１５塩基以上、好ましくは約１５〜約３０塩基、より好ましくは約１８塩基〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。さらに、アンチセンス核酸は、ＳＴＩＭ１の転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。 The antisense nucleic acid against STIM1 has a base sequence that can hybridize with the transcription product under physiological conditions of a cell that expresses the transcription product (mRNA or initial transcription product) of STIM1, and the transcription product in a hybridized state. A polynucleotide capable of inhibiting the translation of the polypeptide encoded by. The type of the antisense nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera. Even if the antisense nucleic acid has a natural phosphodiester bond, the thiophosphate type (P = O in the phosphate bond is replaced by P = S) or 2′-O-methyl, which is stable to a degrading enzyme It may be a modified nucleotide such as a type. Other important factors for the design of antisense nucleic acid include enhancement of water solubility and cell membrane permeability. These can also be overcome by devising dosage forms such as the use of liposomes and microspheres. The length of the antisense nucleic acid is not particularly limited as long as it can specifically hybridize with the transcription product of STIM1 (eg, mRNA corresponding to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3), and is about 15 bases short. The sequence may be long and include a sequence complementary to the entire sequence of the transcript. From the viewpoint of ease of synthesis, antigenicity problems, etc., for example, oligonucleotides comprising about 15 bases or more, preferably about 15 to about 30 bases, more preferably about 18 bases to about 30 bases are exemplified. Furthermore, antisense nucleic acids not only hybridize with STIM1 transcripts and inhibit translation, but also bind to double-stranded DNA to form triplex and inhibit transcription into mRNA. It may be a thing.
本明細書において、「相補的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（NationalCenter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。 In the present specification, “complementary” means about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, most preferably 100% between base sequences. % Complementarity. The homology of the nucleotide sequences in the present specification uses the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) and the following conditions (expected value = 10; allow gap; filtering = ON; match score) = 1; mismatch score = -3).
前記「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いる。具体的には、リボザイムは、ＳＴＩＭ１をコードするｍＲＮＡまたは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得る。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる（Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)）。 The “ribozyme” refers to RNA having an enzyme activity that cleaves nucleic acid. Recently, it has been clarified that oligo DNA having the base sequence of the enzyme active site also has a nucleic acid cleavage activity. In the specification, it is used as a concept including DNA as long as it has sequence-specific nucleic acid cleavage activity. Specifically, the ribozyme can specifically cleave mRNA encoding STIM1 or an initial transcription product within the coding region (including an intron portion in the case of the initial transcription product). The most versatile ribozyme is self-splicing RNA found in infectious RNA such as viroid and virusoid, and the hammerhead type and hairpin type are known. The hammerhead type exhibits enzyme activity at about 40 bases, and a few bases at both ends adjacent to the part having the hammerhead structure (about 10 bases in total) are made into a sequence complementary to the desired cleavage site of mRNA. By doing so, it is possible to specifically cleave only the target mRNA. Furthermore, when the ribozyme is used in the form of an expression vector containing the DNA encoding the ribozyme, in order to promote the transfer of the transcription product to the cytoplasm, the ribozyme should be a hybrid ribozyme further linked with a tRNA-modified sequence. (Nucleic Acids Res., 29 (13): 2780-2788 (2001)).
ＳＴＩＭ１の機能（作用）を阻害する物質としては、ＳＴＩＭ１に対する抗体があげられる。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製できる。また、該抗体は、抗体のフラグメント（例えば、Fab、F(ab’)2）、組換え抗体（例えば、単鎖抗体）であってもよく、さらに、該抗体をコードする核酸（プロモーター活性を有する核酸に機能可能に連結されたもの）であってもよい。 Examples of the substance that inhibits the function (action) of STIM1 include antibodies against STIM1. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be prepared by a known immunological technique. The antibody may be an antibody fragment (for example, Fab, F (ab ′) 2 ), a recombinant antibody (for example, a single chain antibody), and further a nucleic acid (promoter activity) encoding the antibody. Operably linked to the nucleic acid possessed).
前記抗体は、ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、キメラ抗体、ヒト化またはヒト型抗体であってもよい。キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）, Vol.6, No.10, 1988」、特公平3-73280号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平4-506458号公報、特開昭62-296890号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997」、「Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994」、特表平4-504365号公報、国際出願公開WO94/25585号公報、「日経サイエンス、６月号、第40〜第50頁、1995年」、「Nature, Vol.368, p.856-859, 1994」、特表平6-500233号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。 The antibody may be a chimeric antibody, a humanized or humanized antibody in consideration of therapeutic effects and safety in humans. Chimeric antibodies include, for example, “Experimental Medicine (Special Issue), Vol. 6, No. 10, 1988”, Japanese Patent Publication No. 3-73280, and humanized antibodies include, for example, Japanese Patent Publication No. 4-506458, JP-A-62-296890 and the like, human antibodies include, for example, `` Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997 '', `` Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994 '', JP 4-504365 Publication, International Application Publication No. WO 94/25585 Publication, “Nikkei Science, June, 40 to 50, 1995”, “Nature, Vol.368, p.856-859, 1994 ", Japanese Patent Publication No. 6-500233, and the like.
さらに別の実施形態では、ＳＴＩＭ１の機能（作用）を阻害する物質は、ＳＴＩＭ１のドミナントネガティブ変異体、該変異体をコードする核酸を含む発現ベクターが例示される。 In yet another embodiment, the substance that inhibits the function (action) of STIM1 is exemplified by an expression vector containing a dominant negative mutant of STIM1 and a nucleic acid encoding the mutant.
ＳＴＩＭ１のドミナントネガティブ変異体とは、ＳＴＩＭ１に対する変異の導入によりその活性が低減したものをいう。該ドミナントネガティブ変異体は、天然のＳＴＩＭ１と競合することで間接的にその機能を阻害することができる。該ドミナントネガティブ変異体は、ＳＴＩＭ１遺伝子をコードする核酸に変異を導入することによって作製することができる。変異としては、例えば、機能性部位における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例えば、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。ドミナントネガティブ変異体は、ＰＣＲや公知のキットを用いる自体公知の方法により作製できる。 The dominant negative mutant of STIM1 refers to a substance whose activity is reduced by introducing a mutation into STIM1. The dominant negative mutant can indirectly inhibit its function by competing with natural STIM1. The dominant negative mutant can be prepared by introducing a mutation into a nucleic acid encoding the STIM1 gene. Examples of the mutation include an amino acid mutation (for example, deletion, substitution, or addition of one or more amino acids) that causes a decrease in the function of the functional site. The dominant negative mutant can be prepared by a method known per se using PCR or a known kit.
ＳＴＩＭ１阻害物質は、発現ベクターとしても提供され得る。かかる発現ベクターは、ＳＴＩＭ１阻害物質をコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含む。 STIM1 inhibitors can also be provided as expression vectors. Such an expression vector includes a polynucleotide encoding a STIM1 inhibitor and a promoter operably linked to the polynucleotide.
前記プロモーターは、その制御下にある発現対象の核酸の種類により適宜選択され得るが、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター）、哺乳動物用プロモーター（例、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター）が挙げられる。 The promoter can be appropriately selected depending on the type of nucleic acid to be expressed under the control thereof. For example, polIII promoter (eg, tRNA promoter, U6 promoter, H1 promoter), mammalian promoter (eg, CMV promoter, CAG) Promoter, SV40 promoter).
本発明の発現ベクターはさらに、選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含んでいてもよい。 The expression vector of the present invention further includes a selection marker gene (a gene that confers resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, phosphinothricin, a gene that complements an auxotrophic mutation, etc.). May be.
本発明の発現ベクターのバックボーン（backbone）としては、ヒト等の哺乳動物細胞中でＳＴＩＭ１阻害物質を産生できるものであれば特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターが挙げられる。哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。なかでも、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス由来のウイルスベクターが好ましい。 The backbone of the expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it can produce a STIM1 inhibitor in mammalian cells such as humans, and examples thereof include plasmid vectors and virus vectors. Suitable vectors for administration to mammals include viral vectors such as retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, pox virus, poliovirus, Sindbis virus, Sendai virus and the like. Of these, virus vectors derived from retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, and vaccinia viruses are preferred.
本発明の肥満細胞の脱顆粒抑制剤は、肥満細胞からのヒスタミン、サイトカイン、ケモカインおよびプロテアーゼ等の遊離物質の分泌を抑制することが可能であり、かかる遊離物質に起因する様々なアレルギー疾患の予防または治療剤としても有用である。アレルギー疾患としては、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸炎などが挙げられる。 The mast cell degranulation inhibitor of the present invention can suppress secretion of free substances such as histamine, cytokines, chemokines and proteases from mast cells, and prevent various allergic diseases caused by such free substances. It is also useful as a therapeutic agent. Examples of allergic diseases include asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, atopic dermatitis, allergic gastroenteritis and the like.
本発明において、ＳＴＩＭ１が受動皮膚アナフィラキシー反応（ＰＣＡ）に必要であることを生体内で確認したことにより、本発明は、ＳＴＩＭ１阻害物質を有効成分として含有するアナフィラキシーの予防または治療剤を提供することができる。 In the present invention, by confirming in vivo that STIM1 is required for passive skin anaphylactic reaction (PCA), the present invention provides a preventive or therapeutic agent for anaphylaxis containing a STIM1 inhibitor as an active ingredient Can do.
また、本発明において、肥満細胞からの炎症性サイトカインの産生および分泌にＳＴＩＭ１が必須の役割を果たしていることを確認したことにより、本発明は、ＳＴＩＭ１阻害物質を有効成分として含有する肥満細胞の炎症性サイトカインの産生抑制剤を提供することができる。 In addition, in the present invention, by confirming that STIM1 plays an essential role in the production and secretion of inflammatory cytokines from mast cells, the present invention enables inflammation of mast cells containing a STIM1 inhibitor as an active ingredient. An agent for suppressing the production of sex cytokines can be provided.
前記炎症性サイトカインとしては、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αなどが挙げられる。 Examples of the inflammatory cytokine include IL-3, IL-6, and TNF-α.
前記脱顆粒抑制剤、アレルギー疾患の予防または治療剤、アナフィラキシーの予防または治療剤および炎症性サイトカインの産生抑制剤を総称して、本発明の薬剤と略す場合がある。 The degranulation inhibitor, the preventive or therapeutic agent for allergic diseases, the preventive or therapeutic agent for anaphylaxis, and the inflammatory cytokine production inhibitor may be collectively referred to as the agent of the present invention.
本発明の薬剤の投与量は、有効成分の種類もしくは活性、投与対象となる動物種、投与対象の病気の重篤度、薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１０００ｍｇ／ｋｇが例示される。 The dose of the drug of the present invention varies depending on the type or activity of the active ingredient, the animal species to be administered, the severity of the disease to be administered, drug acceptability, body weight, age, etc. The amount of active ingredient is exemplified by about 0.0001 to about 1000 mg / kg.
本発明の薬剤は、患者に対して経口的または非経口的に投与することができ、投与形態としては、経口投与、局所投与（点鼻投与、点眼投与、吸入投与等）、静脈内投与、経皮投与などが挙げられ、必要に応じて、製薬学的に許容され得る添加剤と共に、投与に適した剤型に製剤化される。経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などが挙げられ、非経口投与に適した剤型としては、例えば、点鼻剤、点眼剤、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などが挙げられる。これらは当該分野で汎用されている通常の技術を用い、調製することができる。本発明の薬剤は、上述の治療効果を奏する限りその投与経路および剤形は特に限定されない。 The drug of the present invention can be administered orally or parenterally to a patient, and the administration form includes oral administration, topical administration (instillation administration, instillation administration, inhalation administration, etc.), intravenous administration, For example, transdermal administration can be mentioned, and if necessary, it is formulated with a pharmaceutically acceptable additive into a dosage form suitable for administration. Examples of dosage forms suitable for oral administration include tablets, capsules, granules, powders, etc. Examples of dosage forms suitable for parenteral administration include nasal drops, eye drops, injections, and patches. Agents, lotions, creams and the like. These can be prepared using conventional techniques widely used in the field. The administration route and dosage form of the drug of the present invention are not particularly limited as long as the above-described therapeutic effect is exhibited.
例えば、本発明の薬剤を注射剤として用いる場合、安定剤（例えば、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、溶解補助剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、懸濁化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、乳化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０など）、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸、イプシロンアミノカプロン酸など）、粘稠剤（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなど）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル類、エデト酸ナトリウム、ホウ酸など）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）、清涼化剤（例えば、ｌ−メントール、ｄ−カンフル、ｄ−ボルネオール、ハッカ油など）、軟膏基剤（白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン、植物油（オリーブ油、椿油、落花生油など）など）などを添加剤として加えることができる。これら添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよい。 For example, when the agent of the present invention is used as an injection, a stabilizer (for example, sodium bisulfite, sodium thiosulfate, sodium edetate, sodium citrate, ascorbic acid, dibutylhydroxytoluene, etc.), a solubilizing agent (for example, glycerin) , Propylene glycol, macrogol, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, etc.), suspending agents (eg, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose), emulsifiers (eg, polyvinylpyrrolidone, soybean lecithin, egg yolk) Lecithin, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polysorbate 80, etc.), buffer (for example, phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer) , Glutamic acid, epsilon aminocaproic acid, etc.), thickener (for example, water-soluble cellulose derivatives such as methylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, carboxymethylcellulose, chondroitin sulfate sodium, sodium hyaluronate, carboxyvinyl polymer, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone , Macrogol, etc.), preservatives (eg, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, chlorhexidine gluconate, chlorobutanol, benzyl alcohol, sodium dehydroacetate, paraoxybenzoates, sodium edetate, boric acid, etc.), isotonic Agents (eg, sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, glucose) Propylene glycol, etc.), pH adjusters (eg, hydrochloric acid, sodium hydroxide, phosphoric acid, acetic acid, etc.), cooling agents (eg, l-menthol, d-camphor, d-borneol, mint oil, etc.), ointment bases (White petrolatum, refined lanolin, liquid paraffin, vegetable oil (such as olive oil, camellia oil, peanut oil), etc.) can be added as additives. The amount of these additives to be added varies depending on the kind of additive to be added, the use, etc., but a concentration that can achieve the purpose of the additive may be added.
本発明の薬剤は、ｓｉＲＮＡ等の核酸をリポフェクション法を用いて製剤化することもできる。 The agent of the present invention can also be formulated using a lipofection method with a nucleic acid such as siRNA.
本発明はまた、被験物質がＳＴＩＭ１遺伝子の発現または機能を抑制し得るか否かを評価することを含む、肥満細胞の脱顆粒抑制物質のスクリーニング方法、ならびに当該スクリーニング方法により得られる物質、および当該物質を含有してなる脱顆粒抑制剤を提供する。 The present invention also includes a method for screening a mast cell degranulation inhibitor comprising evaluating whether a test substance can suppress the expression or function of the STIM1 gene, a substance obtained by the screening method, and the There is provided a degranulation inhibitor comprising a substance.
スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物および新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。 The test substance to be subjected to the screening method may be any known compound and novel compound, for example, nucleic acid, carbohydrate, lipid, protein, peptide, low molecular organic compound, compound prepared using combinatorial chemistry technology Examples include libraries, random peptide libraries prepared by solid phase synthesis and phage display methods, or natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like.
一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質とＳＴＩＭ１遺伝子の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＳＴＩＭ１遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるＳＴＩＭ１遺伝子の発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＳＴＩＭ１遺伝子の発現量を抑制する被験物質を選択する工程。
In one embodiment, the screening method of the present invention includes the following steps (a) to (c):
(A) contacting the test substance with a cell capable of measuring the expression of the STIM1 gene;
(B) measuring the expression level of the STIM1 gene in a cell contacted with the test substance and comparing the expression level with the expression level of the STIM1 gene in a control cell not contacted with the test substance;
(C) A step of selecting a test substance that suppresses the expression level of the STIM1 gene based on the comparison result of (b).
上記方法の工程（ａ）では、被験物質がＳＴＩＭ１遺伝子の発現を測定可能な細胞と接触条件下におかれる。ＳＴＩＭ１遺伝子の発現を測定可能な細胞に対する被験物質の接触は、培養培地中で行われ得る。 In step (a) of the above method, the test substance is placed in contact with cells capable of measuring STIM1 gene expression. Contact of the test substance with a cell capable of measuring the expression of the STIM1 gene can be performed in a culture medium.
ＳＴＩＭ１遺伝子の発現を測定可能な細胞とは、ＳＴＩＭ１遺伝子の産物、例えば、転写産物、翻訳産物の発現レベルを直接的または間接的に評価可能な細胞をいう。ＳＴＩＭ１遺伝子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、ＳＴＩＭ１遺伝子を天然で発現可能な細胞であり得、一方、ＳＴＩＭ１遺伝子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、ＳＴＩＭ１遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。ＳＴＩＭ１遺伝子の発現を測定可能な細胞は、動物細胞、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、ヒト等の哺乳動物細胞であり得る。 A cell capable of measuring the expression of the STIM1 gene refers to a cell capable of directly or indirectly evaluating the expression level of a product of a STIM1 gene, for example, a transcription product or a translation product. The cell that can directly evaluate the expression level of the STIM1 gene product can be a cell that can naturally express the STIM1 gene, while the cell that can indirectly evaluate the expression level of the STIM1 gene product can be It can be a cell that allows a reporter assay for the gene transcription regulatory region. The cells capable of measuring the expression of the STIM1 gene can be animal cells, for example, mammalian cells such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, monkeys, and humans.
ＳＴＩＭ１遺伝子を天然で発現可能な細胞は、ＳＴＩＭ１遺伝子を潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。 The cell capable of naturally expressing the STIM1 gene is not particularly limited as long as it can potentially express the STIM1 gene. Such cells can be easily identified by those skilled in the art, and primary cultured cells, cell lines derived from the primary cultured cells, commercially available cell lines, cell lines available from cell banks, and the like can be used.
ＳＴＩＭ１遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＳＴＩＭ１遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＳＴＩＭ１遺伝子転写調節領域およびレポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。ＳＴＩＭ１遺伝子転写調節領域は、ＳＴＩＭ１遺伝子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＳＴＩＭ１遺伝子の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能な蛋白質または検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。 A cell enabling a reporter assay for the STIM1 gene transcription regulatory region is a cell comprising a STIM1 gene transcription regulatory region and a reporter gene operably linked to the region. The STIM1 gene transcription regulatory region and the reporter gene can be inserted into an expression vector. The STIM1 gene transcription regulatory region is not particularly limited as long as it is a region that can control the expression of the STIM1 gene. For example, the region from the transcription start point to about 2 kbp upstream or the base sequence of the region lacks one or more bases. Examples thereof include a region consisting of a lost, substituted or added base sequence and having the ability to control transcription of the STIM1 gene. The reporter gene may be any gene that encodes a detectable protein or an enzyme that produces a detectable substance. For example, the GFP (green fluorescent protein) gene, GUS (β-glucuronidase) gene, LUC (luciferase) gene, CAT (Chloramphenicol acetyltransferase) gene and the like.
ＳＴＩＭ１遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、ＳＴＩＭ１遺伝子転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＳＴＩＭ１遺伝子に対する生理的な転写調節因子を発現し、ＳＴＩＭ１遺伝子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、ＳＴＩＭ１遺伝子を天然で発現可能な細胞が好ましい。 A cell into which a STIM1 gene transcription regulatory region and a reporter gene operably linked to the region are introduced can quantitatively analyze the expression level of the reporter gene as long as the STIM1 gene transcription regulatory function can be evaluated. There is no particular limitation. However, since a physiological transcriptional regulatory factor for the STIM1 gene is expressed and considered to be more appropriate for evaluation of the expression regulation of the STIM1 gene, the cells to be introduced include cells that can naturally express the STIM1 gene. preferable.
被験物質とＳＴＩＭ１遺伝子の発現を測定可能な細胞とが接触される培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。 The culture medium in which the test substance is brought into contact with the cells capable of measuring the expression of the STIM1 gene is appropriately selected according to the type of cells used and the like, for example, a minimum containing about 5 to 20% fetal calf serum. Essential medium (MEM), Dulbecco's modified minimal essential medium (DMEM), RPMI 1640 medium, 199 medium, and the like. The culture conditions are also appropriately determined according to the type of cells used, etc. For example, the pH of the medium is about 6 to about 8, the culture temperature is usually about 30 to about 40 ° C., and the culture time is About 12 to about 72 hours.
上記方法の工程（ｂ）では、先ず、被験物質を接触させた細胞におけるＳＴＩＭ１遺伝子の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、ＳＴＩＭ１遺伝子の発現を測定可能な細胞として、ＳＴＩＭ１遺伝子を天然で発現可能な細胞を用いた場合、発現量は、ＳＴＩＭ１遺伝子の産物、例えば、転写産物または翻訳産物を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からtotal ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、蛍光抗体法などが使用できる。一方、ＳＴＩＭ１遺伝子の発現を測定可能な細胞として、ＳＴＩＭ１遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。 In step (b) of the above method, first, the expression level of the STIM1 gene in the cell contacted with the test substance is measured. The expression level can be measured by a method known per se in consideration of the type of cells used. For example, when a cell capable of naturally expressing the STIM1 gene is used as a cell capable of measuring the expression of the STIM1 gene, the expression level is a method known per se for a product of the STIM1 gene, such as a transcription product or a translation product. Can be measured. For example, the expression level of the transcript can be measured by preparing total RNA from cells and performing RT-PCR, Northern blotting, or the like. The expression level of the translation product can be measured by preparing an extract from the cells and using an immunological technique. As an immunological method, a radioisotope immunoassay (RIA method), an ELISA method (Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)), a fluorescent antibody method, or the like can be used. On the other hand, when a cell capable of performing a reporter assay for the STIM1 gene transcription regulatory region is used as a cell capable of measuring the expression of the STIM1 gene, the expression level can be measured based on the signal intensity of the reporter.
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるＳＴＩＭ１遺伝子の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＳＴＩＭ１遺伝子の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＳＴＩＭ１遺伝子の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＳＴＩＭ１遺伝子の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。 Next, the expression level of the STIM1 gene in the cell contacted with the test substance is compared with the expression level of the STIM1 gene in the control cell not contacted with the test substance. The comparison of expression levels is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference. The expression level of the STIM1 gene in the control cells not contacted with the test substance is the expression level measured at the same time, even if the expression level was measured in advance, compared with the measurement of the expression level of the STIM1 gene in the cells contacted with the test substance. Although it may be present, it is preferably the expression level measured simultaneously from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.
上記方法の工程（ｃ）では、ＳＴＩＭ１遺伝子の発現量を抑制する被験物質が選択される。ＳＴＩＭ１遺伝子の発現量の抑制は、発現量の減少であり得る。ＳＴＩＭ１遺伝子の発現量を減少させる（発現を抑制する）被験物質は、脱顆粒機能を抑制する作用を有し得、アレルギー疾患またはアナフィラキシーの予防・治療薬となり得る。従って、ＳＴＩＭ１遺伝子の発現量を指標として、アレルギー疾患の予防・治療剤等の医薬、または研究用試薬のための候補物質を選択することが可能となる。 In step (c) of the above method, a test substance that suppresses the expression level of the STIM1 gene is selected. The suppression of the expression level of the STIM1 gene can be a decrease in the expression level. A test substance that reduces (suppresses expression) the expression level of the STIM1 gene can have an action of suppressing the degranulation function, and can be a prophylactic / therapeutic agent for allergic diseases or anaphylaxis. Therefore, it becomes possible to select a candidate substance for a medicine such as a prophylactic / therapeutic agent for allergic diseases or a research reagent, using the expression level of the STIM1 gene as an index.
別の実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質をＳＴＩＭ１蛋白質に接触させる工程；
（ｂ）被験物質のＳＴＩＭ１蛋白質に対する結合能を測定する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の結果に基づいて、ＳＴＩＭ１蛋白質に結合能を有する被験物質を選択する工程。
In another embodiment, the screening method of the present invention comprises the following steps (a) to (c):
(A) contacting the test substance with the STIM1 protein;
(B) a step of measuring the binding ability of the test substance to the STIM1 protein;
(C) A step of selecting a test substance capable of binding to the STIM1 protein based on the result of (b) above.
上記方法の工程（ａ）では、被験物質がＳＴＩＭ１蛋白質と接触条件下におかれる。被験物質の該蛋白質に対する接触は、溶液中での被験物質とＳＴＩＭ１蛋白質との混合により行われ得る。 In step (a) of the above method, the test substance is brought into contact with the STIM1 protein. The contact of the test substance with the protein can be performed by mixing the test substance and the STIM1 protein in a solution.
ＳＴＩＭ１蛋白質は自体公知の方法により調製できる。例えば、遺伝子組換え技術により組換えＳＴＩＭ１蛋白質を調製するのが好ましい。組換え蛋白質は、細胞系、無細胞系のいずれで調製したものでもよい。 The STIM1 protein can be prepared by a method known per se. For example, it is preferable to prepare a recombinant STIM1 protein by a gene recombination technique. The recombinant protein may be prepared in either a cell system or a cell-free system.
上記方法の工程（ｂ）では、ＳＴＩＭ１蛋白質に対する被験物質の結合能が測定される。結合能の測定は、自体公知の方法、例えば、バインディングアッセイ、表面プラズモン共鳴を利用する方法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の使用）により行われ得る。ＳＴＩＭ１蛋白質に対する被験物質の結合能はまた、ＳＴＩＭ１蛋白質に対する拮抗体（例えば、ＳＴＩＭ１蛋白質の共役因子）の存在下で測定してもよい。この場合、例えば、ＳＴＩＭ１蛋白質に対する拮抗体の結合量の変化を指標に、ＳＴＩＭ１蛋白質に対する被験物質の結合能が測定され得る。 In step (b) of the above method, the binding ability of the test substance to the STIM1 protein is measured. The binding ability can be measured by a method known per se, for example, a binding assay, a method using surface plasmon resonance (for example, use of Biacore (registered trademark)). The ability of the test substance to bind to the STIM1 protein may also be measured in the presence of an antagonist to the STIM1 protein (eg, a STIM1 protein coupling factor). In this case, for example, the binding ability of the test substance to the STIM1 protein can be measured using the change in the binding amount of the antagonist to the STIM1 protein as an index.
上記方法の工程（ｃ）では、ＳＴＩＭ１蛋白質に結合能を有する被験物質が選択される。ＳＴＩＭ１蛋白質に結合能を有する被験物質は、ＳＴＩＭ１遺伝子の機能を抑制し得る物質となる可能性がある。従って、本方法論は、例えば、ＳＴＩＭ１遺伝子の機能を抑制し得る物質の一次スクリーニングとして有用である。 In step (c) of the above method, a test substance capable of binding to the STIM1 protein is selected. A test substance capable of binding to the STIM1 protein may be a substance that can suppress the function of the STIM1 gene. Therefore, this methodology is useful, for example, as a primary screening for substances that can suppress the function of the STIM1 gene.
本発明のスクリーニング方法はまた、被験物質の動物への投与により行われ得る。該動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の哺乳動物が挙げられる。動物を用いて本発明のスクリーニング方法が行われる場合、例えば、ＳＴＩＭ１遺伝子の発現量を抑制する被験物質が選択され得る。 The screening method of the present invention can also be performed by administering a test substance to an animal. Examples of the animal include mammals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs and monkeys. When the screening method of the present invention is performed using an animal, for example, a test substance that suppresses the expression level of the STIM1 gene can be selected.
本発明のスクリーニング方法は、脱顆粒を抑制し得る物質のスクリーニングを可能とする。従って、本発明のスクリーニング方法は、上述の薬剤または研究用試薬の開発などに有用である。 The screening method of the present invention enables screening for substances that can suppress degranulation. Therefore, the screening method of the present invention is useful for the development of the aforementioned drugs or research reagents.
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited at all by these Examples.
実施例１
ＳＴＩＭ１標的化マウスの作出
ＳＴＩＭ１標的化マウスを作出するためのターゲティングベクターは、ＳＴＩＭ１の膜貫通領域をコードする配列を含むエキソン６の両端にそれぞれloxP部位を有するように２つのloxP部位を隣接させて設計した。かかるコンストラクトのために、ゲノムＤＮＡ断片をC57BL/6起源のBruce-4 ES細胞（ハーバードメディカルスクール、ＣＢＲバイオメディカルリサーチ研究所のK. Rajewsky博士より供与）から増幅させた。KSTKNEOLOXPベクター（K. Rajewsky博士より供与）中の第１のloxP部位を有するネオマイシン耐性カセットを、Stim1のイントロン５を含む1.7-kbの5'ホモロジー領域の下流にクローニングし、エキソン６を含む断片を２つのloxP部位の間に挿入した。エキソン７を含む4.5-kbの3'ホモロジー領域の後に、ジフテリアトキシンＡ（ＤＴＡ）カセット（Yagi, T. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 9918-9922 (1990)）を連結した。ＤＴＡ 遺伝子は、ランダムインテグレーションを有するクローンのネガティブセレクションに使用した。ターゲティングコンストラクトを直鎖状にし、Bruce-4 ES細胞にエレクトロポレーションにより導入した。形質転換細胞は、G418で選択した。ターゲットクローンをサザンブロット解析により同定し、C57BL/6の胚盤胞にマイクロインジェクションし、キメラを生成させた。キメラ雄性マウスとC57BL/6雌性マウスとの交配により、flox-neoアレルが生殖系列へ伝達された。得られたStim1flox/+マウスを、サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー−ニワトリアクチンハイブリッド（ＣＡＧ）プロモーターの制御下にCreトランスジーンを保持するトランスジェニックマウス系列と交配して、CAGCre/+Stim1flox/+（遺伝子型;Stim1+/-）を作出した。次いで、このマウスを交雑させて、Stim1-/-マウスを作出した。すべての実験は、理化学研究所の動物実験委員会のガイドラインに遵守してなされた。
Example 1
Generation of STIM1-targeted mice A targeting vector for generating STIM1-targeted mice has two loxP sites flanked so that each has an loxP site at both ends of exon 6 containing a sequence encoding the transmembrane region of STIM1. Designed. For such a construct, genomic DNA fragments were amplified from Bruce-4 ES cells of C57BL / 6 origin (provided by Dr. K. Rajewsky, Harvard Medical School, CBR Biomedical Research Laboratory). The neomycin resistance cassette with the first loxP site in the KSTKNEOLOXP vector (provided by Dr. K. Rajewsky) was cloned downstream of the 1.7-kb 5 ′ homology region containing intron 5 of Stim1, and the fragment containing exon 6 was cloned. Inserted between two loxP sites. After the 4.5-kb 3 ′ homology region containing exon 7, a diphtheria toxin A (DTA) cassette (Yagi, T. et al. Proc Natl Acad Sci USA 87, 9918-9922 (1990)) was ligated. The DTA gene was used for negative selection of clones with random integration. The targeting construct was linearized and introduced into Bruce-4 ES cells by electroporation. Transformed cells were selected with G418. Target clones were identified by Southern blot analysis and microinjected into C57BL / 6 blastocysts to generate chimeras. By mating a chimeric male mouse with a C57BL / 6 female mouse, the flox-neo allele was transmitted to the germline. The resulting Stim1flox / + mice were crossed with a transgenic mouse line carrying the Cre transgene under the control of the cytomegalovirus immediate early enhancer-chicken actin hybrid (CAG) promoter to obtain CAGCre / + Stim1flox / + ( Genotype; Stim1 +/-) was created. The mice were then crossed to create Stim1 − / − mice. All experiments were conducted in accordance with the guidelines of the animal experiment committee of RIKEN.
抗体
Syk、LAT、JNK、p38、IκBα、p65、ActinおよびNFAT1 (NFATc2)に対する抗体は、Santa Cruz社から購入した。抗リン酸化JNK抗体、抗リン酸化p38抗体および抗Erk1/2抗体は、Promega社から購入した。PLCγ1、リン酸化PLCγ1、リン酸化Syk、リン酸化IκBα、リン酸化LATおよびリン酸化Erk(p42/44)に対する抗体は、Cell Signaling Technology社から購入し、リン酸化NFAT1に対する抗体は、Abcam社から購入した。抗STIM1抗体は、既報（Baba, Y. et al. Proc Natl Acad Sci USA103, 16704-16709 (2006)）に従って製造した。FITC-結合抗CD45.2 mAbおよびPE-結合抗FcεRI mAb、APC-結合抗c-Kit mAbは、それぞれ、BD社およびeBioscience社から購入した。
antibody
Antibodies against Syk, LAT, JNK, p38, IκBα, p65, Actin and NFAT1 (NFATc2) were purchased from Santa Cruz. Anti-phosphorylated JNK antibody, anti-phosphorylated p38 antibody and anti-Erk1 / 2 antibody were purchased from Promega. Antibodies against PLCγ1, phosphorylated PLCγ1, phosphorylated Syk, phosphorylated IκBα, phosphorylated LAT and phosphorylated Erk (p42 / 44) were purchased from Cell Signaling Technology, and antibodies against phosphorylated NFAT1 were purchased from Abcam. . Anti-STIM1 antibody was produced according to a previous report (Baba, Y. et al. Proc Natl Acad Sci USA 103, 16704-16709 (2006)). FITC-conjugated anti-CD45.2 mAb, PE-conjugated anti-FcεRI mAb, and APC-conjugated anti-c-Kit mAb were purchased from BD and eBioscience, respectively.
実施例２
肥満細胞の培養
胎仔肝由来肥満細胞(FLMCs)の調製のため、STIM1-/-マウスおよび同腹子野生型マウス由来のE15.5胎仔肝から懸濁細胞を取り出し、10% FCS、β-メルカプトエタノール、抗生物質および20ng/ml組換えマウス(rm)IL-3(R&D systems)を補足したRPMI1640で培養した。培養中、培地を３〜４日毎に交換した。培養後4〜5週に、当該細胞がその細胞表面にFcεRIおよびc-Kitを発現していることを確認し、実験に使用した（< 98% 肥満細胞)。
Example 2
Cultivation of mast cells For preparation of fetal liver-derived mast cells (FLMCs), suspension cells were removed from E15.5 fetal liver derived from STIM1 -/- mice and littermate wild type mice, and 10% FCS, β-mercaptoethanol Cultured in RPMI 1640 supplemented with antibiotics and 20 ng / ml recombinant mouse (rm) IL-3 (R & D systems). During the culture, the medium was changed every 3 to 4 days. Four to five weeks after culturing, the cells were confirmed to express FcεRI and c-Kit on their cell surfaces and used for experiments (<98% mast cells).
実施例３
組織染色
E15.5の胎仔の５μmパラフィン切片を固定し、ニュークレアファストレッドおよびアルシャンブルーで染色した。肥満細胞を観察するために、各試料中のアルシャンブルー染色細胞を計数した。
Example 3
Tissue staining
E15.5 fetal 5 μm paraffin sections were fixed and stained with Nuclea Fast Red and Alcian Blue. In order to observe mast cells, Alcian blue stained cells in each sample were counted.
実施例４
脱顆粒およびサイトカイン産生の測定
細胞(1 x 106/ml)を、1μg/ml 抗DNP IgE (SPE-7; Sigma)を用いて37℃で6時間感作し、次いで、感作した細胞を、Tyrode’s緩衝液(10 mM HEPES pH 7.4、130 mM NaCl、5 mM KCl、1.4 mM CaCl2、1 mM MgCl2、5.6 mM グルコース、0.1% BSA)中、多価ジニトロフェニル-ヒト血清アルブミン(DNP-HSA, Sigma)で30分間刺激した。β-ヘキソサミニダーゼ反応に関しては、50μlの細胞上清または細胞溶解液を、100μlの1.3mg/ml p-ニトロフェニル-N-アセチル-D-グルコサミド(0.1M クエン酸塩（pH 4.5）中)とともにインキュベートし、37℃で60分発色させた。次いで、0.2M グリシン-NaOH（pH 10.2）を150μl添加することにより酵素反応を停止させ、405nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Rad)で測定した。細胞を、1%Triton X-100を含むTyrode’s緩衝液で溶解し、β-ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。放出されたβ-ヘキソサミニダーゼの割合を、下記式:
放出(%) = 上清 / (上清 + 細胞溶解液) x 100
を用いて計算した。サイトカイン放出の測定のため、細胞培養上清中のIL-6、TNF-αおよびIL-13を、既報（Kabu, K. et al. J Immunol 177, 1296-1305 (2006)）に記載のＥＬＩＳＡアッセイにより検出した。
Example 4
Measurement of degranulation and cytokine production Cells (1 x 10 6 / ml) were sensitized with 1 μg / ml anti-DNP IgE (SPE-7; Sigma) for 6 hours at 37 ° C, then the sensitized cells were , Tyrode's buffer (10 mM HEPES pH 7.4,130 mM NaCl , 5 mM KCl, 1.4 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5.6 mM glucose, 0.1% BSA) in the multivalent dinitrophenyl - human serum albumin (DNP- HSA, Sigma) for 30 minutes. For β-hexosaminidase reaction, 50 μl of cell supernatant or cell lysate is added in 100 μl of 1.3 mg / ml p-nitrophenyl-N-acetyl-D-glucosamide (0.1 M citrate, pH 4.5). ) And developed for 60 minutes at 37 ° C. Subsequently, the enzyme reaction was stopped by adding 150 μl of 0.2 M glycine-NaOH (pH 10.2), and the absorbance at 405 nm was measured with a microplate reader (Bio-Rad). Cells were lysed with Tyrode's buffer containing 1% Triton X-100, and β-hexosaminidase activity was measured. The percentage of β-hexosaminidase released is expressed as:
Release (%) = supernatant / (supernatant + cell lysate) x 100
Calculated using For measurement of cytokine release, IL-6, TNF-α and IL-13 in the cell culture supernatant were measured by ELISA described in a previous report (Kabu, K. et al. J Immunol 177, 1296-1305 (2006)). Detected by assay.
実施例５
カルシウム濃度の測定
細胞質ゾルのカルシウム濃度は、既報（Baba, Y. et al. Proc Natl Acad Sci USA103, 16704-16709 (2006)）に従って測定した。簡潔に記載すると、胎仔肝肥満細胞を、RPMI1640/ 1% FCS中、37℃で45分、Indo-1-AMおよびPluronic F-127 (Invitrogen)を負荷した。FcεRI刺激に関しては、胎仔肝肥満細胞を抗DNP IgE(2μg/ml)で同時に感作した。蛍光強度の変化を、LSRII(BD Biosciences)でモニターした。FL4(Ca2+-フリーindo-1)の蛍光に対するFL5(Ca2+-結合indo-1)の蛍光の比として、値をプロットした。データは、Flowjo software(Treestar)で解析した。
Example 5
Measurement of calcium concentration The cytosolic calcium concentration was measured according to a previous report (Baba, Y. et al. Proc Natl Acad Sci USA 103, 16704-16709 (2006)). Briefly, fetal liver mast cells were loaded with Indo-1-AM and Pluronic F-127 (Invitrogen) in RPMI 1640/1% FCS for 45 minutes at 37 ° C. For FcεRI stimulation, fetal liver mast cells were simultaneously sensitized with anti-DNP IgE (2 μg / ml). Changes in fluorescence intensity were monitored with LSRII (BD Biosciences). Values were plotted as the ratio of the fluorescence of FL5 (Ca 2+ -bound indo-1) to that of FL4 (Ca 2+ -free indo-1). Data was analyzed with Flowjo software (Treestar).
実施例６
細胞の刺激およびイムノブロッティング
細胞(1 x 106/ml)を、1μg/ml IgEで37℃、6時間感作し、次いで、Tyrode’s緩衝液中50 ng/ml DNP-HASで刺激した。あるいは、未感作細胞を1μM イオノマイシンで刺激した。刺激後、前記細胞を、10 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 % NP-40、0.1 % SDS、0.5 mM EDTA、プロテアーゼ阻害剤(Roche)およびホスファターゼ(Nakarai)阻害剤カクテルを含む溶解緩衝液中で溶解し、清澄化させた細胞溶解液を、5 x SDSサンプル緩衝液とともに煮沸した。5 x 105〜1 x 106 細胞分の試料を、PVDF膜に電気泳動で転写し、適切な抗体でブロットした。核抽出物は、Extraction Kit (Pierce)を用いて製造業者のプロトコルに従って調製し、イムノブロッティングに供した。
Example 6
Cell Stimulation and Immunoblotting Cells (1 × 10 6 / ml) were sensitized with 1 μg / ml IgE at 37 ° C. for 6 hours and then stimulated with 50 ng / ml DNP-HAS in Tyrode's buffer. Alternatively, naïve cells were stimulated with 1 μM ionomycin. After stimulation, the cells are lysed containing 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5 mM EDTA, protease inhibitor (Roche) and phosphatase (Nakarai) inhibitor cocktail. Cell lysates lysed and clarified in buffer were boiled with 5 x SDS sample buffer. Samples from 5 × 10 5 to 1 × 10 6 cells were electrophoretically transferred to PVDF membrane and blotted with the appropriate antibody. Nuclear extracts were prepared using Extraction Kit (Pierce) according to the manufacturer's protocol and subjected to immunoblotting.
実施例７
イムノフルオレッセンスおよび共焦点顕微鏡観察
細胞を、余熱した4 %パラホルムアルデヒドで15分間固定し、0.2 % Triton X-100で5分間透過処理した。前記細胞を2 %ヤギ血清でブロッキングした後、2 %ヤギ血清を含むPBSで1:50希釈した抗p65 Abとともに1時間インキュベートした。前記一次抗体を、Alexa Fluor 488で標識した抗ウサギ二次抗体(Invitrogen)を用いて検出した。核は、DAPIで共染色した。染色した細胞は、共焦点蛍光顕微鏡(DMIRE2; Leica Microsystems) 下で観察した。
Example 7
Immunofluorescence and confocal microscopy Cells were fixed with preheated 4% paraformaldehyde for 15 minutes and permeabilized with 0.2% Triton X-100 for 5 minutes. The cells were blocked with 2% goat serum and then incubated with anti-p65 Ab diluted 1:50 in PBS containing 2% goat serum for 1 hour. The primary antibody was detected using an anti-rabbit secondary antibody (Invitrogen) labeled with Alexa Fluor 488. Nuclei were co-stained with DAPI. The stained cells were observed under a confocal fluorescence microscope (DMIRE2; Leica Microsystems).
実施例８
RT-PCR解析
MMCP-5、MMCP-6、アクチン、IL-6、TNF-α、IL-13およびGAPDHの発現を評価するためのRT-PCRは、既報（Kabu, K. et al. J Immunol 177, 1296-1305 (2006)）に記載された遺伝子特異的プライマーを用いて行った。
Example 8
RT-PCR analysis
RT-PCR for evaluating the expression of MMCP-5, MMCP-6, actin, IL-6, TNF-α, IL-13 and GAPDH has been reported (Kabu, K. et al. J Immunol 177, 1296- 1305 (2006)).
実施例９
胎仔肝細胞の移植
STIM1-/-または野生型同腹子のE15.5胎仔由来の2 x 106個の胎仔肝細胞を、致死量(950rad)を照射したコンジェニックマウス(CD45.1)に静脈内に移植した。10週間後、前記マウスから腹膜腔を回収し、フローサイトメトリーにより解析した。CD45.2を用いて、宿主細胞とドナー細胞とを区別した。
Example 9
Transplantation of fetal liver cells
2 × 10 6 fetal liver cells from E15.5 fetuses of STIM1 − / − or wild-type littermates were transplanted intravenously into congenic mice (CD45.1) irradiated with a lethal dose (950 rad). Ten weeks later, the peritoneal cavity was collected from the mouse and analyzed by flow cytometry. CD45.2 was used to distinguish between host cells and donor cells.
実施例１０
レトロウイルスの産生および感染
GFPタグ化したSTIM1 cDNA（Baba, Y. et al. Proc Natl Acad Sci USA103, 16704-16709 (2006)）を、pMX-puroレトロウイルスベクター(東京大学T. Kitamura博士より供与)にクローニングした。得られたベクターおよび対照のGFP単独mockベクターを、FuGENE6(Roche)を用いてEcoPack2(BD Biosciences)にトランスフェクションし、形質転換した細胞を、1.5 μg/mlピューロマイシンで選択した。培地交換後24時間で培養上清を回収し、直ちに感染に用いた。胎仔肝由来肥満細胞の感染のため、当該細胞を20ng/ml rmIL-3およびrmSCF(R&D systems)の存在下で16〜18時間、前刺激した。次いで、等量のウイルス上清および10ng/ml DOTAP(Roche)を添加した後、32℃で2時間、2000rpmでのスピン感染を行い、プレートを37℃で一晩インキュベートした。翌日、rmIL-3を含む新鮮な培地と交換した。
Example 10
Retrovirus production and infection
GFP-tagged STIM1 cDNA (Baba, Y. et al. Proc Natl Acad Sci USA 103, 16704-16709 (2006)) was cloned into a pMX-puro retroviral vector (provided by Dr. T. Kitamura, University of Tokyo). The resulting vector and the control GFP-only mock vector were transfected into EcoPack2 (BD Biosciences) using FuGENE6 (Roche), and the transformed cells were selected with 1.5 μg / ml puromycin. The culture supernatant was collected 24 hours after the medium was changed and immediately used for infection. For infection of fetal liver-derived mast cells, the cells were pre-stimulated for 16-18 hours in the presence of 20 ng / ml rmIL-3 and rmSCF (R & D systems). Equal volumes of virus supernatant and 10 ng / ml DOTAP (Roche) were then added, followed by spin infection at 2000 rpm for 2 hours at 32 ° C., and the plates were incubated overnight at 37 ° C. The next day, the medium was replaced with a fresh medium containing rmIL-3.
実施例１１
受動皮膚アナフィラキシー(PCA)
PCAは、既報（Kabu, K. et al. J Immunol 177, 1296-1305 (2006)）に従って行った。動物の右耳に、0.5μgの抗DNP IgEを含む20μl生理食塩水を皮下に注射した。左耳には、20μlの生理食塩水を注射した。16〜18時間後、前記動物を、250μgの多価ジニトロフェニル-ウシ血清アルブミン(DNP-BSA)および5mg/mlエバンスブルーダイ(Sigma)を含む250μlの生理食塩水でチャレンジした。前記耳におけるエバンスブルーの血管外溢出を30分間モニターし、耳バイオプシーを、700μlホルムアミド中、63℃で一晩インキュベートした。ホルムアミド抽出物の定量解析は、620nmでのエバンスブルーの吸光度を測定することにより決定した。
Example 11
Passive skin anaphylaxis (PCA)
PCA was performed according to a previous report (Kabu, K. et al. J Immunol 177, 1296-1305 (2006)). The animal's right ear was injected subcutaneously with 20 μl saline containing 0.5 μg anti-DNP IgE. The left ear was injected with 20 μl of physiological saline. After 16-18 hours, the animals were challenged with 250 μl saline containing 250 μg polyvalent dinitrophenyl-bovine serum albumin (DNP-BSA) and 5 mg / ml Evans blue dye (Sigma). Evans Blue extravasation in the ear was monitored for 30 minutes and the ear biopsy was incubated overnight at 63 ° C. in 700 μl formamide. Quantitative analysis of the formamide extract was determined by measuring the absorbance of Evans blue at 620 nm.
結果
STIM1欠損マウスでの肥満細胞の発生
肥満細胞およびアレルギー応答におけるSTIM1の生理学的機能を研究するため、マウスのStim1遺伝子を遺伝的に欠失させた。Stim1遺伝子を、Cre-loxP-介在遺伝子ターゲティングストラテジーを用いて、C57B6/Cマウスで不活性化した(図１a)。サザンブロッティングにより、組換えおよびSTIM1の膜貫通領域をコードするエキソン６のCreによる除去を確認した(図1b)。胎仔肝細胞および胎仔肝由来肥満細胞(FLMCs)におけるSTIM1タンパク質の破壊は、イムノブロット解析により確認した。STIM1+/+、STIM1+/-およびSTIM1-/-細胞の細胞溶解液を、抗STIM1抗体でブロットした。STIM1+/+細胞は、STIM1タンパク質を発現していたが、STIM1-/-細胞ではSTIM1タンパク質が検出されず、STIM1+/-細胞ではその発現レベルが著しく低下していた(図1c、d)。ホモ接合性STIM1-/-マウスは、原因は不明であるが、周産期死亡を示した。E18.5まで、STIM1-/-胎仔は、明らかな異常は示さなかった。STIM1-/-マウスは稀に出生する場合があり、新生STIM1-/-はSTIM1+/+マウスよりも若干小さく、呼吸障害により一日以内に死亡した。
result
Development of mast cells in STIM1-deficient mice To study the physiological function of STIM1 in mast cells and allergic responses, the mouse Stim1 gene was genetically deleted. The Stim1 gene was inactivated in C57B6 / C mice using a Cre-loxP-mediated gene targeting strategy (FIG. 1a). Southern blotting confirmed recombination and removal of exon 6 encoding the transmembrane region of STIM1 by Cre (FIG. 1b). The destruction of STIM1 protein in fetal liver cells and fetal liver-derived mast cells (FLMCs) was confirmed by immunoblot analysis. Cell lysates of STIM1 + / + , STIM1 +/− and STIM1 − / − cells were blotted with anti-STIM1 antibody. STIM1 + / + cells expressed STIM1 protein, but STIM1 − / − cells did not detect STIM1 protein, and STIM1 +/− cells had significantly reduced expression levels (FIG. 1c, d). . Homozygous STIM1 − / − mice showed perinatal death for unknown reasons. Until E18.5, STIM1 − / − fetuses showed no obvious abnormalities. STIM1 − / − mice were rarely born, and newborn STIM1 − / − were slightly smaller than STIM1 + / + mice and died within a day due to respiratory impairment.
胎生致死のため、E15.5胎仔由来の肝臓から肥満細胞前駆細胞を収集し、IL-3を含む培地中で高度に純粋な肥満細胞を生成させた。細胞の純度は、FcεRIおよびc-Kitの細胞表面の発現で評価した(図2a)。サイトスピンした試料のアルシャンブルー染色により、STIM1-/-肥満細胞の形態は野生型肥満細胞の形態とは異ならないことが示された(図2b)。MMCP-5およびMMCP-6等の肥満細胞に特異的な遺伝子は、野生型およびSTIM1欠損FLMCsで同程度のレベルで発現していた(図2c)。
肥満細胞のin vivo の分化状態を調べるため、野生型およびSTIM1欠損胎仔での組織肥満細胞の数を決定した。STIM1欠損E15.5胎仔の背の皮膚における肥満細胞の密度は、野生型の密度と同程度であった(図2d)。さらに、野生型およびSTIM1欠損マウスの胎仔肝細胞(CD45.2)を、致死量放射線を照射したコンジェニックマウス(CD45.1)に適応移植し、フローサイトメトリーにより再構成の有無を解析した。ドナー型細胞を、CD45マーカーにより区別した。再構成したマウス末梢血中のSTIM1+/+およびSTIM1-/- 細胞によるキメリズムは、ほとんど同等であった(>90%;データは示さず)。このことから、STIM1欠損マウス由来の造血幹細胞の正着能力は正常であることが示唆された。腹腔内のフローサイトメトリー解析により、肥満細胞の発生も無傷であることがわかった(図2e)。前記結果をまとめると、肥満細胞の分化はSTIM1非存在下でも障害されないことが示された。
For embryonic lethality, mast cell progenitor cells were collected from livers derived from E15.5 fetuses to produce highly pure mast cells in a medium containing IL-3. Cell purity was assessed by cell surface expression of FcεRI and c-Kit (FIG. 2a). The cytospun sample of Alcian blue staining showed that the morphology of STIM1 − / − mast cells was not different from that of wild type mast cells (FIG. 2b). Mast cell specific genes such as MMCP-5 and MMCP-6 were expressed at similar levels in wild-type and STIM1-deficient FLMCs (FIG. 2c).
To examine the in vivo differentiation status of mast cells, the number of tissue mast cells in wild-type and STIM1-deficient fetuses was determined. The density of mast cells in the dorsal skin of STIM1-deficient E15.5 fetuses was similar to that of wild type (FIG. 2d). Furthermore, wild-type and STIM1-deficient mouse fetal liver cells (CD45.2) were adaptively transplanted into congenic mice (CD45.1) irradiated with lethal dose radiation, and the presence or absence of reconstitution was analyzed by flow cytometry. Donor type cells were distinguished by CD45 markers. Chimerism by STIM1 + / + and STIM1 − / − cells in reconstituted mouse peripheral blood was almost equivalent (>90%; data not shown). This suggested that the ability of hematopoietic stem cells derived from STIM1-deficient mice to be normal. Intraperitoneal flow cytometric analysis revealed that mast cell development was intact (FIG. 2e). In summary, the mast cell differentiation was not impaired even in the absence of STIM1.
STIM1欠損FLMCsにおける障害されたストア感受性Ca2+流入
STIM1は、RNAiに基づいたノックダウンHeLa細胞およびJurkat細胞、ならびにノックアウトDT40 B細胞におけるSOC流入の重要な分子であることが示されている。肥満細胞におけるSOC流入に対するSTIM1の効果を決定するために、0.5 mM EGTAの存在下で小胞体Ca2+ポンプ阻害剤であるタプシガルギン(TG)処理でCa2+ストアを枯渇させ、FLMCsの細胞質内Ca2+をモニターし、次いで、2 mM Ca2+ を戻し入れてCa2+ 流入をモニターした。図3aに示すように、STIM1欠損FLMCsにおいて、Ca2+流入の有意な抑制が観察された。このSTIM1依存性SOC流入メカニズムは、FcεRIシグナル伝達コンテクストによって優位に利用されており、STIM1の非存在下ではFcεRIにより誘導されたストア枯渇からCa2+流入の障害も生じた(図3a)。Ca2+動員におけるSTIM1の効果をさらに評価するために、細胞外Ca2+が存在する条件下で、IgEおよび抗原によるFcεRI刺激を行った。野生型FLMCsは、シャープなスパイクを示した後、持続的なCa2+流入を示した(図3b)。対照的に、STIM欠損FLMCsでは細胞質内Ca2+レベルが有意に低下していた。イオノマイシン処理野生型FLMCsは、連続的に高いレベルのCa2+増加を示した。この持続したCa2+は、STIM1欠損FLMCsでは劇的に低下した(図3b)。これらの結果より、イオノマイシンはCa2+流入の引き金となり得ることを示唆し、これは全体的にSTIM1に依存する。イオノマイシンが内部のCa2+ストアを枯渇させることによりPMにおけるSOCチャネルを活性化できるという以前の証拠があることから、STIM1は、このイオノマイシン依存性Ca2+枯渇のセンサーとしても機能し、Ca2+流入を活性化すると思われる。
Impaired store-sensitive Ca2 + influx in STIM1-deficient FLMCs
STIM1 has been shown to be a key molecule for SOC influx in RNAi-based knockdown HeLa and Jurkat cells, and knockout DT40 B cells. To determine the effect of STIM1 on SOC influx in mast cells, the endoplasmic reticulum Ca 2+ pump inhibitor thapsigargin (TG) was depleted of Ca 2+ stores in the cytoplasm of FLMCs in the presence of 0.5 mM EGTA. Ca 2+ was monitored and then 2 mM Ca 2+ was added back to monitor Ca 2+ influx. As shown in FIG. 3a, significant suppression of Ca 2+ influx was observed in STIM1-deficient FLMCs. This STIM1-dependent SOC influx mechanism is exploited predominantly by the FcεRI signaling context, and in the absence of STIM1, Ca 2+ influx was also impaired by store depletion induced by FcεRI (FIG. 3a). To further evaluate the effect of STIM1 on Ca 2+ mobilization, FcεRI stimulation with IgE and antigen was performed in the presence of extracellular Ca 2+ . Wild type FLMCs showed a sharp Ca spike followed by a sustained Ca 2+ influx (FIG. 3b). In contrast, cytoplasmic Ca 2+ levels were significantly reduced in STIM-deficient FLMCs. Ionomycin-treated wild-type FLMCs showed a continuously high level of Ca 2+ increase. This sustained Ca 2+ was dramatically reduced in STIM1-deficient FLMCs (FIG. 3b). These results suggest that ionomycin can trigger Ca 2+ influx, which is totally dependent on STIM1. Given the previous evidence that ionomycin can activate SOC channels in PM by depleting the internal Ca 2+ store, STIM1 also functions as a sensor for this ionomycin-dependent Ca 2+ depletion, and Ca 2 + It seems to activate the inflow.
Ca2+流入の上記した欠損がSTIM1が存在しないことによるものであるか否かを検証するために、GFP標識したSTIM1をSTIM1欠損FLMCsにレトロウイルスにより導入し、細胞質内Ca2+プロフィールを分析した。モックGFPを導入したSTIM1欠損FLMCsは、Ca2+流入を誘導する能力がなかったが、GFP-STIM1のバックトランスフェクションにより、FcεRIおよびTG刺激後、Ca2+流入を明確にレスキューした(図3c)。一貫して、2 mM Ca2+ の存在下でIgE凝集またはイオノマイシンによって媒介されるCa2+の動員は、GFP-STIM1導入細胞において十分回復した。まとめると、これらの結果から、STIM1が肥満細胞においてSOC流入活性化に関与すること、およびこのメカニズムはFcεRIおよびイオノマイシン刺激により誘導されるCa2+流入において重要な役割を果たすことを明確に示している。 To verify whether the above deficiency in Ca 2+ entry is due to the absence of STIM1, GFP-labeled STIM1 was retrovirally introduced into STIM1-deficient FLMCs and analyzed for cytoplasmic Ca 2+ profiles did. STIM1-deficient FLMCs introduced with mock GFP did not have the ability to induce Ca 2+ influx, but GFP-STIM1 back-transfection clearly rescued Ca 2+ influx after FcεRI and TG stimulation (Figure 3c). ). Consistently, Ca 2+ mobilization mediated by IgE aggregation or ionomycin in the presence of 2 mM Ca 2+ was well restored in GFP-STIM1-introduced cells. Taken together, these results clearly demonstrate that STIM1 is involved in activation of SOC influx in mast cells and that this mechanism plays an important role in Ca 2+ influx induced by FcεRI and ionomycin stimulation. Yes.
STIM1は肥満細胞脱顆粒およびサイトカイン産生に必須である
FcεRIが介在する肥満細胞活性化は、迅速な脱顆粒ならびに代謝産物およびサイトカインのde novoの合成を誘導する。このことは、アレルギー反応に重要な役割を果たす。これらの肥満細胞の機能にとってSTIM1が必要であるか否かを探究するために、FcεRI刺激後の野生型およびSTIM1欠損FLMCs由来のβ-ヘキソサミニダーゼの放出を測定した。STIM1の喪失により、抗原により誘発される脱顆粒の顕著な抑制が生じた(図4a)。また、STIM1欠損FLMCsがイオノマシンにより誘導される脱顆粒の極度の低下を示したことを見出した。イオノマイシンは、FcεRI近位のシグナル伝達をバイパスし、遊離Ca2+イオンの動員を通じて直接細胞を刺激することが知られている。β-ヘキソサミニダーゼの総含量は野生型FLMCsとSTIM1欠損FLMCsとで相違しなかった点に注目すべきである (データ示さず)。したがって、STIM1は肥満細胞の脱顆粒にとって必須であることが結論される。これらの知見は、一過性のCa2+ の上昇では脱顆粒を有効に行うには不十分であることも示唆する。
STIM1 is essential for mast cell degranulation and cytokine production
FcεRI-mediated mast cell activation induces rapid degranulation and synthesis of metabolite and cytokine de novo. This plays an important role in allergic reactions. To explore whether STIM1 is required for the function of these mast cells, the release of β-hexosaminidase from wild-type and STIM1-deficient FLMCs after FcεRI stimulation was measured. Loss of STIM1 resulted in significant suppression of antigen-induced degranulation (FIG. 4a). We also found that STIM1-deficient FLMCs showed an extreme reduction in degranulation induced by ionomachines. Ionomycin is known to bypass FcεRI proximal signaling and stimulate cells directly through the recruitment of free Ca 2+ ions. Note that the total content of β-hexosaminidase did not differ between wild-type FLMCs and STIM1-deficient FLMCs (data not shown). Therefore, it is concluded that STIM1 is essential for degranulation of mast cells. These findings also suggest that a transient increase in Ca 2+ is not sufficient for effective degranulation.
サイトカイン産生を評価するために、FcεRIライゲーション後の野生型およびSTIM1欠損FLMCsにおけるELISAアッセイを行った。IL-6、TNF-αおよびIL-13の分泌は、野生型FLMCsに比べてSTIM1欠損FLMCsで顕著に低下していた(図4b)。半定量的RT-PCRにより、これらのサイトカインのmRNA合成もSTIM1の非存在下で顕著に抑制されていたことが示された(図4c)。これらの結果は、STIM1がIL-6、TNF-αおよびIL-13の遺伝子発現ならびに当該サイトカインの分泌に必須であることを示している。 To assess cytokine production, ELISA assays were performed in wild-type and STIM1-deficient FLMCs after FcεRI ligation. IL-6, TNF-α and IL-13 secretion was significantly reduced in STIM1-deficient FLMCs compared to wild-type FLMCs (FIG. 4b). Semiquantitative RT-PCR showed that mRNA synthesis of these cytokines was also significantly suppressed in the absence of STIM1 (FIG. 4c). These results indicate that STIM1 is essential for IL-6, TNF-α and IL-13 gene expression and secretion of the cytokine.
STIM1欠損FLMCsにおける正常なFcεRI介在近位シグナル伝達およびMAPKs活性化
上記したデータは、STIM1依存性の持続的Ca2+ 障害が肥満細胞の機能に応答可能な細胞内シグナル伝達事象の欠損に導く可能性を示唆した。どの細胞内シグナル伝達経路が攪乱されるのかを決定するために、野生型およびSTIM1欠損FLMCsにおける様々なFcεRIシグナル経路を調べた。感作したFLMCsを所定の時間抗原刺激し、イムノブロッティングによりSyk、LATおよびPLCγ1等の近位分子の活性化状態を調べた。STIM1欠損FLMCsは、Syk、LATおよびPLCγ1の正常なチロシンリン酸化を示した(図5a)。このことは、FcεRI近位のシグナル伝達は一般にSTIM1により影響されないことを示す。MAPKs カスケードは、サイトカイン産生を調節していることが知られている。しかしながら、FcεRIが介在するJNK、p38およびErkの活性化は、STIM1の不在によって変化しなかった(図5b)。イオノマイシンによる細胞質内Ca2+濃度の強制的上昇は、野生型FLMCs においてJNK、p38およびErkを活性化した(図5b)。対照的に、イオノマイシンで誘導されたこれらのMAPKsの活性化は、STIM1欠損FLMCsで消滅した。このことは、STIM1はイオノマイシンで誘導されたCa2+流入により誘発されるJNK、p38およびErkの活性化に不可欠であることを示唆する。
Normal FcεRI-mediated proximal signaling and MAPKs activation in STIM1-deficient FLMCs The above data suggest that STIM1-dependent persistent Ca 2+ damage may lead to a loss of intracellular signaling events that can respond to mast cell function Suggested sex. In order to determine which intracellular signaling pathways are perturbed, various FcεRI signaling pathways in wild-type and STIM1-deficient FLMCs were examined. Sensitized FLMCs were stimulated with antigen for a predetermined time, and the activation states of proximal molecules such as Syk, LAT and PLCγ1 were examined by immunoblotting. STIM1-deficient FLMCs showed normal tyrosine phosphorylation of Syk, LAT and PLCγ1 (FIG. 5a). This indicates that FcεRI proximal signaling is generally not affected by STIM1. The MAPKs cascade is known to regulate cytokine production. However, FcεRI-mediated activation of JNK, p38 and Erk was not altered by the absence of STIM1 (FIG. 5b). Forced increase in cytoplasmic Ca 2+ concentration by ionomycin activated JNK, p38 and Erk in wild-type FLMCs (FIG. 5b). In contrast, ionomycin-induced activation of these MAPKs disappeared with STIM1-deficient FLMCs. This suggests that STIM1 is essential for JNK, p38 and Erk activation induced by ionomycin-induced Ca 2+ influx.
NF-κBおよびNFATシグナル伝達経路に対するSTIM1の必須の役割
FcεRIの刺激は、２つの転写因子NF-κBおよびNFATを活性化させる。当該転写因子は、サイトカイン産生等の肥満細胞の機能を調節していることが知られている。以前の研究により、NF-κBは大きな一過性のCa2+上昇により選択的に活性化され、他方、NFATは低い持続したCa2+プラトーにより活性化されることが示されている。そこで、本発明者らは、NF-κBおよびNFAT活性化に対するSTIM1の寄与を評価した。STIM1欠損FLMCsにおいて、FcεRIおよびイオノマイシン刺激後のIκBαのリン酸化および分解は、野生型FLMCsと比較して有意に低下していた(図6a)。さらに、FcεRIが介在するp65の核への移行は、STIM1欠損FLMCsにおいて顕著に低下していた(図6b)。NFAT活性化を探究するために、NFAT1のSer54におけるリン酸化の状況を調べた。リン酸化がNFAT活性を抑制する他の部位とは異なり、Ser54をリン酸化されたNFATは、自身の活性を高める。図6cに示すように、STIM1欠損FLMCsでは、FcεRIおよびイオノマイシン刺激後にNFATのSer54はほとんどリン酸化されていなかった。さらに、NFAT1の脱リン酸化および核への移行がSTIM1欠損FLMCsで非常に障害されていたことを見出した(図6c、下部パネル、および図6d)。以上の結果をまとめると、NF-κBおよびNFAT活性化は両方とも、STIM1依存性Ca2+流入により調節されていると結論付けられる。肥満細胞におけるIL-6/TNF-αおよびTNF-α/IL-13産生はそれぞれ、NF-κBおよびNFATにより調節されていることを考慮すると、STIM1不在によるNF-κBおよびNFAT活性化の低下は、かかるサイトカインの産生を不十分にさせるものと思われる。
Essential role of STIM1 on NF-κB and NFAT signaling pathway
Stimulation of FcεRI activates two transcription factors NF-κB and NFAT. The transcription factor is known to regulate mast cell functions such as cytokine production. Previous studies have shown that NF-κB is selectively activated by a large transient Ca 2+ increase, whereas NFAT is activated by a low sustained Ca 2+ plateau. Therefore, the inventors evaluated the contribution of STIM1 to NF-κB and NFAT activation. In STIM1-deficient FLMCs, phosphorylation and degradation of IκBα following FcεRI and ionomycin stimulation was significantly reduced compared to wild-type FLMCs (FIG. 6a). Furthermore, FcεRI-mediated translocation of p65 to the nucleus was markedly reduced in STIM1-deficient FLMCs (FIG. 6b). To investigate NFAT activation, the state of phosphorylation of NFAT1 at Ser54 was examined. Unlike other sites where phosphorylation inhibits NFAT activity, NFAT phosphorylated on Ser54 enhances its own activity. As shown in FIG. 6c, in STIM1-deficient FLMCs, Ser54 of NFAT was hardly phosphorylated after FcεRI and ionomycin stimulation. Furthermore, we found that NFAT1 dephosphorylation and translocation to the nucleus were greatly impaired in STIM1-deficient FLMCs (FIG. 6c, bottom panel, and FIG. 6d). To summarize the above results, it can be concluded that both NF-κB and NFAT activation are regulated by STIM1-dependent Ca 2+ influx. Given that IL-6 / TNF-α and TNF-α / IL-13 production in mast cells is regulated by NF-κB and NFAT, respectively, the decrease in NF-κB and NFAT activation in the absence of STIM1 is , It seems to cause insufficient production of such cytokines.
STIM1はin vivoでのアナフィラキシー応答に必要である
STIM1がin vivoの肥満細胞において機能的な役割を果たしているかどうかを評価するために、FcεRIが介在する受動皮膚アナフィラキシー(PCA)反応を行った。STIM1欠損マウスは胎生致死であるので、成体のSTIM1+/-マウスを解析した。図１に示すように、STIM1+/-マウス由来のFLMCsでは、STIM1+/+マウス由来のものに比べて、STIM1タンパク質が非常に低量であった。PCAは、抗DNP IgEを右耳の耳介に皮内注射することにより誘導した。内部標準として、左耳に同量の生理食塩水を注射した。16〜18時間後、マウスを抗原DNP-HSAで静脈内注射によりチャレンジし、エバンスブルー染色を行った。PCA誘導後最初の１時間の間のエバンスブルー染色の血管外溢出は、主として、活性化した肥満細胞の迅速なヒスタミンおよびセロトニン放出を伴う脱顆粒と、それによる局所的に血管の透過性が上昇することに依存している。血管外溢出は、生理食塩水処理耳と比較して、IgE処理耳由来の組織バイオプシーにおける染色のレベルを決定することにより定量した。対照条件として、STIM1+/+マウスとSTIM1+/- マウスとの間で、エバンスブルーのレベルは相違しなかった。しかしながら、STIM1+/- マウスのIgE処理耳介における血管外溢出は、STIM1+/+マウスよりも有意に低く、このことから、STIM1は抗原で誘導された肥満細胞が介在するPCA反応に必要であることが示唆された。
STIM1 is required for anaphylactic responses in vivo
To evaluate whether STIM1 plays a functional role in mast cells in vivo, a passive skin anaphylaxis (PCA) reaction mediated by FcεRI was performed. Since STIM1-deficient mice are embryonic lethal, adult STIM1 +/− mice were analyzed. As shown in FIG. 1, FLTIMs derived from STIM1 +/− mice had very low amounts of STIM1 protein compared to those derived from STIM1 + / + mice. PCA was induced by intradermal injection of anti-DNP IgE into the right ear pinna. As an internal standard, the same amount of physiological saline was injected into the left ear. After 16-18 hours, mice were challenged with the antigen DNP-HSA by intravenous injection and Evans blue staining was performed. Extravasation of Evans Blue staining during the first hour after PCA induction is mainly due to degranulation of activated mast cells with rapid histamine and serotonin release, resulting in increased vascular permeability Depends on what you do. Extravasation was quantified by determining the level of staining in tissue biopsies from IgE-treated ears compared to saline-treated ears. As a control condition, the level of Evans blue was not different between STIM1 + / + and STIM1 +/− mice. However, extravasation in IgE-treated ears of STIM1 +/- mice is significantly lower than that of STIM1 + / + mice, indicating that STIM1 is required for antigen-induced mast cell-mediated PCA responses. It was suggested that there is.
配列表のフリーテキスト
〔配列番号：５〕siRNAセンス鎖
〔配列番号：６〕siRNAセンス鎖
Free text of the sequence listing [SEQ ID NO: 5] siRNA sense strand [SEQ ID NO: 6] siRNA sense strand
本発明によれば、新たな作用機序に基づく肥満細胞の脱顆粒抑制剤が提供される。当該作用機序を指標とした本発明のスクリーニング方法は、ＳＴＩＭ１に特異的に作用する薬剤の開発に貢献することができる。 According to the present invention, a mast cell degranulation inhibitor based on a new mechanism of action is provided. The screening method of the present invention using the action mechanism as an index can contribute to the development of a drug that specifically acts on STIM1.
Claims (10)
（ａ）被験物質とＳＴＩＭ１遺伝子の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＳＴＩＭ１遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるＳＴＩＭ１遺伝子の発現量と比較する工程；および
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＳＴＩＭ１遺伝子の発現量を抑制する被験物質を選択する工程。 The method according to claim 8, comprising the following steps (a) to (c):
(A) contacting the test substance with a cell capable of measuring the expression of the STIM1 gene;
(B) measuring the expression level of the STIM1 gene in the cell contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of the STIM1 gene in the control cell not contacted with the test substance; and (c) (b) above A step of selecting a test substance that suppresses the expression level of the STIM1 gene based on the comparison result of.
（ａ）被験物質をＳＴＩＭ１蛋白質に接触させる工程；
（ｂ）被験物質のＳＴＩＭ１蛋白質に対する結合能を測定する工程；および
（ｃ）上記（ｂ）の結果に基づいて、ＳＴＩＭ１蛋白質に結合能を有する被験物質を選択する工程。 The method according to claim 8, comprising the following steps (a) to (c):
(A) contacting the test substance with the STIM1 protein;
(B) measuring the binding ability of the test substance to the STIM1 protein; and (c) selecting a test substance having the binding ability to the STIM1 protein based on the result of (b) above.
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