JP2009096929A - Pseudopeptide library - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a pseudopeptide library which can be easily produced in comparison with a conventional peptide library and includes various kinds of pseudopeptides (with increased library size). <P>SOLUTION: The pseudopeptide library consists of a mixture of two or more kinds of amino acid-modified dendrimers each prepared by modifying each terminal group of a dendrimer or its derivative with one molecule of the same amino acid or with one molecule of different amino acids. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、デンドリマーの複数の末端基にアミノ酸が結合したアミノ酸修飾デンドリマー（擬似ペプチド）の混合物からなる擬似ペプチドライブラリーに関する。   The present invention relates to a pseudopeptide library comprising a mixture of amino acid-modified dendrimers (pseudopeptides) in which amino acids are bonded to a plurality of terminal groups of the dendrimer.

生体内のシグナル伝達反応などの生体反応は、タンパク質とタンパク質との相互作用、例えば、酵素と基質、受容体とリガンド、抗原と抗体の間の相互作用により媒介される。このような生体内のタンパク質の間の相互作用について研究することは、有用な生理活性物質の発見、疾患に関連する受容体の解析、ひいては疾患を治療しうる医薬品の発見などにつながる重要な研究である。   Biological reactions such as in vivo signal transduction reactions are mediated by protein-protein interactions, for example, interactions between enzymes and substrates, receptors and ligands, antigens and antibodies. Research on interactions between proteins in the body is important research that leads to discovery of useful bioactive substances, analysis of receptors related to diseases, and discovery of drugs that can treat diseases. It is.

ある特定の標的分子（例えば受容体）とタンパク質が相互作用する場合、相互作用に関与するタンパク質の領域は、ある大きさ以下のペプチドであることが知られている。よって、標的分子と相互作用可能なタンパク質を見出すために、ある大きさのペプチドの集合であるペプチドライブラリーを用いることが簡便であることがよく知られている。ペプチドライブラリーとは、任意の長さの種々のアミノ酸配列を有するペプチドの混合物であり、このペプチドの混合物と標的分子とを反応させて、標的分子に結合可能なペプチドを選択することができる。このようなペプチドライブラリーは、コンビナトリアルケミストリーにおいて重要な要素であり、従来、生物学的な方法（バクテリオファージ法など）又は化学的なペプチド合成法により作製されている。   When a protein interacts with a specific target molecule (for example, a receptor), it is known that the region of the protein involved in the interaction is a peptide of a certain size or less. Therefore, it is well known that it is convenient to use a peptide library that is a collection of peptides of a certain size in order to find a protein that can interact with a target molecule. A peptide library is a mixture of peptides having various amino acid sequences of any length, and a peptide capable of binding to a target molecule can be selected by reacting this mixture of peptides with a target molecule. Such a peptide library is an important element in combinatorial chemistry, and is conventionally produced by a biological method (such as a bacteriophage method) or a chemical peptide synthesis method.

生物学的方法により作製されたライブラリーは、目的とするペプチドを遺伝子組み換えなどにより発現させるので、現在、１０⁸種もの多数のペプチドを含む大きいサイズのライブラリーを得ることが可能になっている（非特許文献１）。 Since a library prepared by a biological method expresses a target peptide by genetic recombination or the like, it is now possible to obtain a large-size library containing as many as 10 ⁸ peptides. (Non-Patent Document 1).

一方、化学的な方法によるペプチドライブラリーの作製は、従来、主にペプチドの固相合成法に基づいて行われている。
しかし、従来の化学的なペプチド合成では、長くても６アミノ酸程度のペプチドの混合物であるペプチドライブラリーしか提供できない。２０種類のアミノ酸が存在することを考慮すると、化学的なペプチド合成により提供できるペプチドライブラリーを構成するペプチドの種類は、理論的には最大で２０⁶種である。しかし、実際に全ての種類のアミノ酸配列を有するペプチドのペプチドライブラリーを作製することは不可能であり、化学合成法により得られるペプチドライブラリーのサイズは、生物学的に得られるライブラリーのサイズよりも小さい（非特許文献１）。 On the other hand, the preparation of a peptide library by a chemical method has heretofore been performed mainly based on a peptide solid-phase synthesis method.
However, conventional chemical peptide synthesis can only provide a peptide library that is a mixture of peptides of about 6 amino acids at the longest. Considering the existence of 20 types of amino acids, the maximum number of types of peptides constituting a peptide library that can be provided by chemical peptide synthesis is theoretically 20 ⁶ types. However, it is impossible to actually create peptide libraries of peptides having all kinds of amino acid sequences, and the size of peptide libraries obtained by chemical synthesis methods is the size of biologically obtained libraries. (Non-patent Document 1).

固相合成のような化学合成法により得られるペプチドライブラリーに含まれる各ペプチドは、６アミノ酸程度の長さの直鎖状のペプチドであるが、このようなペプチドの構造は三次元構造が比較的不安定であり、標的分子との結合の際に構造が安定しにくいので、ペプチドライブラリーのペプチドと標的分子との間の結合定数が大きくなりにくい（解離定数が大きくなりやすい）、という問題も存在する。   Each peptide included in a peptide library obtained by a chemical synthesis method such as solid phase synthesis is a linear peptide having a length of about 6 amino acids. Instability, and the structure is difficult to stabilize upon binding to the target molecule, so the binding constant between the peptide in the peptide library and the target molecule is difficult to increase (dissociation constant tends to increase). Is also present.

ところで、樹状構造を有する３次元的に高度に分枝した高分子として、デンドリマー及びその誘導体（以下、「デンドリマー」という。）が知られている。デンドリマーは、従来の線状の高分子に比べて、分子量や分子構造をより厳密に規定できるので、デンドリマーに基づいて設計された機能的材料は、様々な分野で用いられている。
例えば、デンドリマーの末端に抗原ペプチドを結合させた多価抗原ペプチドが製造され、ワクチンとして機能することが知られている（非特許文献２）。 Incidentally, dendrimers and derivatives thereof (hereinafter referred to as “dendrimers”) are known as three-dimensionally highly branched polymers having a dendritic structure. Since dendrimers can define molecular weight and molecular structure more strictly than conventional linear polymers, functional materials designed based on dendrimers are used in various fields.
For example, it is known that a multivalent antigen peptide in which an antigen peptide is bound to the end of a dendrimer is produced and functions as a vaccine (Non-patent Document 2).

また、デンドリマーを支持体として、デンドリマーの末端でペプチド合成を行うことにより、ペプチドライブラリーを作製する方法が知られている（非特許文献３）。この方法は、デンドリマーの末端基に１種類のアミノ酸を別々に結合させたものを混合し、１種類ずつのアミノ酸を結合させてペプチド鎖を伸長し、作製されたペプチドをデンドリマーから切断して、ペプチドライブラリーを作製する方法である。
コンビナトリアルケミストリー研究会編、「コンビナトリアルケミストリー」、化学同人社、1997年4月10日、ｐ．４４〜６４ 青井 啓悟、柿本 雅明 監修、「デンドリティック高分子−多分岐構造が拡げる高機能化の世界」、ＮＴＳ社、2005年10月31日、ｐ．３５４−３５６ R. M. Kim, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, (1996) p. 10012-10017 In addition, a method of preparing a peptide library by performing peptide synthesis at the end of a dendrimer using a dendrimer as a support is known (Non-patent Document 3). In this method, one obtained by separately bonding one type of amino acid to the end group of the dendrimer, combining one type of amino acid to elongate the peptide chain, cleaving the prepared peptide from the dendrimer, This is a method for preparing a peptide library.
Combinatorial Chemistry Study Group, “Combinatorial Chemistry”, Kagaku Dojinsha, April 10, 1997, p. 44-64 Supervised by Keigo Aoi and Masaaki Enomoto, “Dendritic Polymers—A World of Higher Functionality with Expanded Multi-Branched Structures”, NTS, October 31, 2005, p. 354-356 RM Kim, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, (1996) p. 10012-10017

本発明は、従来のペプチドライブラリーよりも簡便に作製できる、多くの種類の擬似ペプチドを含む（サイズが大きい）擬似ペプチドライブラリーを提供することを課題とする。   It is an object of the present invention to provide a pseudo peptide library containing many types of pseudo peptides (large in size) that can be more easily produced than conventional peptide libraries.

上記の課題を解決するために、本発明者らは、デンドリマーの複数の末端基のそれぞれにアミノ酸を１分子ずつ結合させた分子が、直鎖状に結合したアミノ酸の配列を有するペプチドのように作用して標的分子と結合し得ることを見出した。すなわち、デンドリマーの末端基にアミノ酸を１分子ずつ結合させることにより得られるアミノ酸修飾デンドリマーの混合物を、擬似ペプチドライブラリーとして用い得ることができることを見出して、本発明を完成した。   In order to solve the above problems, the present inventors have proposed that a molecule in which one molecule of amino acid is bonded to each of a plurality of terminal groups of a dendrimer is a peptide having a sequence of amino acids bonded in a straight chain. It was found that it can act and bind to a target molecule. That is, the present invention was completed by finding that a mixture of amino acid-modified dendrimers obtained by binding amino acids to the end groups of dendrimers one by one can be used as a pseudopeptide library.

よって、本発明は、デンドリマー及びその誘導体（以下、「デンドリマー」という）の末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの２種以上の混合物からなる擬似ペプチドライブラリーを提供する。   Therefore, the present invention provides a pseudo peptide library comprising a mixture of two or more amino acid-modified dendrimers in which the terminal groups of dendrimers and derivatives thereof (hereinafter referred to as “dendrimers”) are modified with the same or different amino acid molecules. provide.

本明細書において、「擬似ペプチドライブラリー」とは、ペプチド結合したアミノ酸の並びからなるペプチドではないが、標的分子に結合可能であるという意味においてペプチドと同様の作用を発揮できる分子の混合物を意味する。「擬似ペプチドライブラリー」は、２種以上の異なる分子の混合物である。
また、本明細書において、「擬似ペプチド」とは、擬似ペプチドライブラリーを構成する各分子のことであり、より具体的には、デンドリマーの末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーのことである。 In this specification, “pseudopeptide library” means a mixture of molecules that are not peptides consisting of a sequence of amino acids that are peptide-bonded but that can exhibit the same action as peptides in the sense that they can bind to a target molecule. To do. A “pseudopeptide library” is a mixture of two or more different molecules.
In the present specification, “pseudopeptide” refers to each molecule constituting a pseudopeptide library. More specifically, the end groups of the dendrimer are modified with the same or different amino acid molecules. Amino acid-modified dendrimer.

本発明の擬似ペプチドライブラリーは、デンドリマーの末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの混合物であるので、デンドリマーにアミノ酸を結合させる１段階の反応で作製することができ、作製が簡便である。また、デンドリマーの世代を増加させることにより、デンドリマーの末端基の数が増え、より長い擬似ペプチドを作製できるので、ライブラリーのサイズを大きくすることが容易である。   Since the pseudopeptide library of the present invention is a mixture of amino acid-modified dendrimers in which the terminal group of the dendrimer is modified with the same or different amino acid molecules, it can be prepared by a one-step reaction in which an amino acid is bound to the dendrimer. It is easy to manufacture. In addition, by increasing the generation of dendrimers, the number of end groups of dendrimers is increased, and longer pseudopeptides can be prepared. Therefore, it is easy to increase the size of the library.

また、本発明の擬似ペプチドライブラリーの構成要素である各擬似ペプチド（アミノ酸修飾デンドリマー）は、比較的密な構造を有するデンドリマーの末端基にアミノ酸が結合したものであるので、従来のペプチドライブラリーの直鎖状に結合したペプチドに比べて、擬似ペプチドの構造が比較的安定する。よって、標的分子との結合実験において用いる場合に、直鎖状のペプチドよりも、標的分子との結合をより強固な安定したものとすることができる。   In addition, each pseudo peptide (amino acid-modified dendrimer), which is a constituent element of the pseudo peptide library of the present invention, has an amino acid bonded to a terminal group of a dendrimer having a relatively dense structure. The structure of the pseudo peptide is relatively stable compared to the linearly bound peptide. Therefore, when used in the binding experiment with the target molecule, the binding with the target molecule can be made stronger and more stable than the linear peptide.

本発明に用いられるデンドリマー及びその誘導体とは、樹状構造を有する３次元的に高度に分枝した化合物である。デンドリマーの誘導体とは、デンドリマーを構成する部分構造であるデンドロンを含む。本発明において、デンドリマーは、デンドロンが好ましい。
一般に、デンドリマーは、コアと、いくつかの世代の分岐部分と、末端基とからなる。
デンドリマーのコアは、１つ以上の官能基を有する化合物から誘導されるものである。好ましい官能基としては、第１級アミノ基、第２級アミノ基、水酸基、カルボン酸基、チオール基、エステル基、アミド基、ケトン基、アルデヒド基などが挙げられる。 The dendrimer and derivatives thereof used in the present invention are three-dimensionally highly branched compounds having a dendritic structure. Dendrimer derivatives include dendrons, which are partial structures constituting dendrimers. In the present invention, the dendrimer is preferably a dendron.
In general, dendrimers consist of a core, several generations of branching moieties, and end groups.
The core of the dendrimer is derived from a compound having one or more functional groups. Preferred functional groups include primary amino groups, secondary amino groups, hydroxyl groups, carboxylic acid groups, thiol groups, ester groups, amide groups, ketone groups, aldehyde groups, and the like.

デンドリマーのコアは、上記のコアがジスルフィド結合により連結されたものであってもよい。
デンドリマーがデンドロンである場合、コアは、適切な保護基で保護されていてもよいし、置換されていてもよいし、以下に記載する標識物質で標識されていてもよい。適切な保護基としては、Boc（ｔ−ブトキシカルボニル）、Tos（ｐ−トルエンスルホニル）、Z（ベンジルオキシカルボニル）、Fmoc（9-フルオレニルメトキシ）などが挙げられる。 The core of the dendrimer may be one in which the above cores are linked by a disulfide bond.
When the dendrimer is a dendron, the core may be protected with an appropriate protecting group, may be substituted, or may be labeled with a labeling substance described below. Suitable protecting groups include Boc (t-butoxycarbonyl), Tos (p-toluenesulfonyl), Z (benzyloxycarbonyl), Fmoc (9-fluorenylmethoxy) and the like.

デンドリマーの分岐部分は、３以上の原子価を有する原子を含む分岐構造単位の繰り返しからなる。３以上の原子価を有する原子としては、炭素、窒素、ケイ素、リンなどが挙げられる。
デンドリマーの分岐部分としては、以下に示すような構造が、一般的に知られている。 The branched portion of the dendrimer is composed of repeating branched structural units containing atoms having a valence of 3 or more. Examples of the atom having a valence of 3 or more include carbon, nitrogen, silicon, and phosphorus.
As the branched portion of the dendrimer, the following structures are generally known.

上記の分岐構造を有する各デンドリマーについては、以下の文献に記載されている。
（Ａ）D.A. Tomaliaら、Polym. J. 17, 117 (1985)；D.A. Tomaliaら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29, 138 (1990)
（Ｂ）E.M.M. de Brabander-van den Bergら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1308 (1993)；E.M.M. de Brabander-van den Bergら、Macromol. Symp. 77, 51 (1994)；J.C. Hummelenら、Chem. Eng. J. 3, 1489 (1997)；C. Wanerら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1300 (1993)
（Ｃ）H.K. Hall Jr.ら、Polym. Bull. 17, 409 (1987) Each dendrimer having the above branched structure is described in the following documents.
(A) DA Tomalia et al., Polym. J. 17, 117 (1985); DA Tomalia et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29, 138 (1990).
(B) EMM de Brabander-van den Berg et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1308 (1993); EMM de Brabander-van den Berg et al., Macromol. Symp. 77, 51 (1994); Hummelen et al., Chem. Eng. J. 3, 1489 (1997); C. Waner et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1300 (1993).
(C) HK Hall Jr. et al., Polym. Bull. 17, 409 (1987)

（Ｄ）米国特許第4289872号；米国特許第4410688号
（Ｅ）L.J. Twymanら、Tetrahedron Lett. 35, 4423 (1994)
（Ｆ）K.E. Uhrichら、J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1623 (1992)
（Ｇ）S.C.E. Bucksonら、Macromol. Symp. 77, 1 (1994)
（Ｈ）G.R. Newkomeら、J. Org. Chem. 50, 2004 (1985)；G.R. Newkomeら、J. Chem. Soc. Chem. Commun. 752 (1986)；G.R. Newkomeら、J. Am. Chem. Soc. 108, 849 (1986)；G.R. Newkomeら、J. Am. Chem. Soc. 112, 8458 (1990)；G.R. Newkomeら、Macromolecules 24, 1443 (1991)；G.R. Newkomeら、J. Org. Chem. 53, 5552 (1988)；米国特許第5136096号；米国特許第5206410号；米国特許第5210309号
（Ｉ）M. Okazakiら、J. Am. Chem. Soc. 125, 8120 (2003)；I. Washioら、Macromolecules 38, 2237 (2005) (D) U.S. Pat. No. 4,287,882; U.S. Pat. No. 4,410,688 (E) LJ Twyman et al., Tetrahedron Lett. 35, 4423 (1994).
(F) KE Uhrich et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1623 (1992)
(G) SCE Buckson et al., Macromol. Symp. 77, 1 (1994)
(H) GR Newkome et al., J. Org. Chem. 50, 2004 (1985); GR Newkome et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 752 (1986); GR Newkome et al., J. Am. Chem. 108, 849 (1986); GR Newkome et al., J. Am. Chem. Soc. 112, 8458 (1990); GR Newkome et al., Macromolecules 24, 1443 (1991); GR Newkome et al., J. Org. Chem. 53. , 5552 (1988); U.S. Patent No. 5136096; U.S. Patent No. 5206410; U.S. Patent No. 5210309 (I) M. Okazaki et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 8120 (2003); , Macromolecules 38, 2237 (2005)

（Ｊ）R. Haagら、J. Am. Chem. Soc. 122, 2954 (2000)
（Ｋ）M. Jayaramanら、J. Am. Chem. Soc. 120, 12996 (1998)
（Ｌ）C.J. Hawkerら、J. Am. Chem. Soc. 112, 7638 (1990)；G. L'abbeら、Chem. Commun. 2143 (1996)
（Ｍ）P. Murerら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34, 2116 (1995)
（Ｎ）H.T. Changら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 182 (1995)
（Ｏ）H. Threら、J. Am. Chem. Soc. 118, 6388 (1995)；H. Threら、J. Am. Chem. Soc. 123, 5908 (2001) (J) R. Haag et al., J. Am. Chem. Soc. 122, 2954 (2000)
(K) M. Jayaraman et al., J. Am. Chem. Soc. 120, 12996 (1998)
(L) CJ Hawker et al., J. Am. Chem. Soc. 112, 7638 (1990); G. L'abbe et al., Chem. Commun. 2143 (1996).
(M) P. Murer et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34, 2116 (1995)
(N) HT Chang et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 182 (1995)
(O) H. Thre et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 6388 (1995); H. Thre et al., J. Am. Chem. Soc. 123, 5908 (2001).

（Ｐ）Y. Hirayamaら、Org. Lett. 7, 525 (2005)；中村大輔ら、高分子学会予稿集、54, 2949 (2005)
（Ｑ）C.J. Hawkerら、J. Am. Chem. Soc. 114, 8405 (1992)；C.J. Hawkerら、J. Am. Chem. Soc. 121, 262 (1999)；D.M. Haddletonら、J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1, 649 (1996)
（Ｒ）D. Seebachら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 2795 (1996)；D. Seebachら、Helv. Chim. Acta. 80, 989 (1997)
（Ｓ）M.A. Carnahanら、J. Am. Chem. Soc. 123, 2905 (2001)
（Ｔ）M.A. Carnahanら、Macromolecules 34, 7648 (2001)
（Ｕ）F. Zengら、J. Am. Chem. Soc. 118, 5326 (1996) (P) Y. Hirayama et al., Org. Lett. 7, 525 (2005); Daisuke Nakamura et al., Proceedings of the Society of Polymer Science, 54, 2949 (2005)
(Q) CJ Hawker et al., J. Am. Chem. Soc. 114, 8405 (1992); CJ Hawker et al., J. Am. Chem. Soc. 121, 262 (1999); DM Haddleton et al., J. Chem. Soc Perkin. Trans. 1, 649 (1996)
(R) D. Seebach et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 2795 (1996); D. Seebach et al., Helv. Chim. Acta. 80, 989 (1997).
(S) MA Carnahan et al., J. Am. Chem. Soc. 123, 2905 (2001)
(T) MA Carnahan et al., Macromolecules 34, 7648 (2001)
(U) F. Zeng et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 5326 (1996)

（Ｖ）A. Morikawaら、Macromolecules 26, 6324 (1993)；A. Morikawa, "Polymeric Materials Encyclopedia" J.C. Salamone ed., CRC Press, 1996, vol. 3, p.1806
（Ｗ）S.R. Rannardら、J. Am. Chem. Soc. 122, 11729 (2000)
（Ｘ）M. Tominagaら、Chem. Lett. 374 (2000)
（Ｙ）H. Uchidaら、J. Am. Chem. Soc. 112, 7077 (1990)；A. Morikawaら、Macromolecules 24, 3460 (1991)；M. Kakimoto, "Polymeric Materials Encyclopedia" J.C. Salamone ed., CRC Press, 1996, vol. 3, p.1809 (V) A. Morikawa et al., Macromolecules 26, 6324 (1993); A. Morikawa, "Polymeric Materials Encyclopedia" JC Salamone ed., CRC Press, 1996, vol. 3, p.1806
(W) SR Rannard et al., J. Am. Chem. Soc. 122, 11729 (2000)
(X) M. Tominaga et al., Chem. Lett. 374 (2000)
(Y) H. Uchida et al., J. Am. Chem. Soc. 112, 7077 (1990); A. Morikawa et al., Macromolecules 24, 3460 (1991); M. Kakimoto, "Polymeric Materials Encyclopedia" JC Salamone ed., CRC Press, 1996, vol. 3, p.1809

デンドリマーの分岐部分は、デンドリマーの水溶性の観点から、水溶性を示すアミド結合などの酸素原子及び／又は窒素原子を含む構造が好ましい。   The branched portion of the dendrimer preferably has a structure containing an oxygen atom and / or a nitrogen atom such as an amide bond exhibiting water solubility from the viewpoint of water solubility of the dendrimer.

デンドリマーの分岐部分は、上記のような繰り返し単位を２種以上含むものであってもよい。   The branched portion of the dendrimer may contain two or more repeating units as described above.

デンドリマーの末端基の構造は、所望により適宜選択できる。例えば、末端基は、分岐部分の最後の繰り返し単位の構造を有してもよいし、末端基は、分岐部分とは別の構造を有してもよい。
また、デンドリマーの末端基の数は、分岐部分の構造及びデンドリマーの世代数に依存する。デンドリマーは、一般に、コアの官能基に分岐構造を有する単位が１つずつ結合したものを第１世代、第１世代の末端基の末端に別の分岐構造を有する単位が１つずつ結合したものを第２世代というように、分岐構造を有する単位の数に応じて、「第ｎ世代（Ｇｎ）のデンドリマー」と称される。一般に、第１〜１０世代のデンドリマーが知られており、理論的には、より大きい世代のデンドリマーを製造することも可能である。 The structure of the end group of the dendrimer can be appropriately selected as desired. For example, the terminal group may have a structure of the last repeating unit of the branched portion, or the terminal group may have a structure different from the branched portion.
The number of end groups of the dendrimer depends on the structure of the branched portion and the number of generations of the dendrimer. In general, dendrimers are those in which one unit having a branched structure is bonded to the functional group of the core one by one, and one unit having another branched structure is bonded to the end of the terminal group of the first generation one by one. Is referred to as “second generation,” depending on the number of units having a branched structure, and is referred to as “nth generation (Gn) dendrimer”. In general, first to tenth generation dendrimers are known, and it is theoretically possible to produce larger generation dendrimers.

第１世代の末端基の数は、（コアの官能基の数）×１であり、第２世代の末端基の数は、（第１世代の末端基の数）×（分岐部分の分岐数−１）であり、第ｎ世代の末端基の数は、（第１世代の末端基の数）×（分岐部分の分岐数−１）^n-1である。
なお、例えば、分岐部分が−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＮＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｎ＜である場合、「分岐部分の分岐数」は３である。 The number of end groups in the first generation is (number of functional groups in the core) × 1, and the number of end groups in the second generation is (number of end groups in the first generation) × (number of branches in the branching portion). -1), and the number of terminal groups of the nth generation is (number of terminal groups of the first generation) × (number of branches of branching part ⁻¹ ) ⁿ⁻¹ .
For example, when the branch portion is —CH ₂ CH ₂ CONHCH ₂ CH ₂ N <, the “number of branches in the branch portion” is 3.

本発明におけるデンドリマーは、好ましくは、ポリアミドアミンデンドリマー（例えば上記の（Ａ）の分岐部分を有するもの）、ポリイミンデンドリマー（例えば（Ｂ））、ポリアミンデンドリマー（例えば（Ｃ））、ポリアミドデンドリマー（例えば（Ｄ）〜（Ｇ））、ポリエーテルアミドデンドリマー（例えば（Ｈ）、（Ｉ））、ポリエーテルデンドリマー（例えば（Ｊ）〜（Ｎ））、ポリエステルデンドリマー（例えば（Ｏ）〜（Ｔ））、ポリエーテルエステルデンドリマー（例えば（Ｕ））、ポリエーテルケトンデンドリマー（例えば（Ｖ））、ポリカルボナートデンドリマー（例えば（Ｗ））、複素環含有デンドリマー（例えば（Ｘ））、ケイ素含有デンドリマー（例えば（Ｙ））である。
これらのデンドリマーの製造方法は、上記の文献に記載されている。 The dendrimer in the present invention is preferably a polyamidoamine dendrimer (for example, one having the branched portion of (A) above), a polyimine dendrimer (for example (B)), a polyamine dendrimer (for example (C)), a polyamide dendrimer (for example, (D) to (G)), polyether amide dendrimers (eg (H), (I)), polyether dendrimers (eg (J) to (N)), polyester dendrimers (eg (O) to (T)) , Polyether ester dendrimers (eg (U)), polyether ketone dendrimers (eg (V)), polycarbonate dendrimers (eg (W)), heterocyclic-containing dendrimers (eg (X)), silicon-containing dendrimers (eg (Y)).
The manufacturing method of these dendrimers is described in said literature.

上記のデンドリマーは、より好ましくは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーの部分骨格（デンドロン）である。ポリアミドアミンデンドロンは、以下の式に示される構造を有するものである。
第１世代（Ｇ１）：Ｒ¹Ｎ（ＸＨ₂）₂
Ｇ２：Ｒ¹Ｎ（Ｘ（ＸＨ₂）₂）₂
Ｇ３：Ｒ¹Ｎ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ₂）₂）₂）₂
Ｇ４：Ｒ¹Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ₂）₂）₂）₂）₂
Ｇ５：Ｒ¹Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ₂）₂）₂）₂）₂）₂
Ｇ６：Ｒ¹Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ₂）₂）₂）₂）₂）₂）₂
Ｇ７：Ｒ¹Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ₂）₂）₂）₂）₂）₂）₂）₂
Ｇ８：Ｒ¹Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ₂）₂）₂）₂）₂）₂）₂）₂）₂
（式中、Ｒ¹は、置換されていてもよいアミノアルキル基、メルカプトアルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、アルデヒドアルキル基、アジドアルキル基、エポキシアルキル基又はアセチレンアルキル基を表し、Ｘは、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＮＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｎ＜を表す。） The dendrimer is more preferably a partial skeleton (dendron) of a polyamidoamine (PAMAM) dendrimer. The polyamide amine dendron has a structure represented by the following formula.
First generation (G1): R ¹ N (XH ₂ ) ₂
G2: R ¹ N (X (XH ₂ ) ₂ ) ₂
G3: R ¹ N (X (X (XH ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂
G4: R ¹ N (X (X (X (XH ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂
G5: R ¹ N (X (X (X (X (XH ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂
G6: R ¹ N (X (X (X (X (X (XH ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂
G7: R ¹ N (X (X (X (X (X (X (XH ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂
G8: R ¹ N (X (X (X (X (X (X (X (XH ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂
(Wherein R ¹ represents an optionally substituted aminoalkyl group, mercaptoalkyl group, hydroxyalkyl group, carboxyalkyl group, aldehyde alkyl group, azidoalkyl group, epoxyalkyl group or acetylenealkyl group, and X represents ,. representing the _{-CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2} N <)

本発明において、上記のポリアミドアミンデンドロンは、Ｇ２以上かつＧ７以下のものが好ましい。   In the present invention, the polyamide amine dendron is preferably G2 or more and G7 or less.

上記の式中、Ｒ¹のアルキル鎖としては、直鎖状又は分岐鎖状のＣ₂〜Ｃ₅の低級アルキルが好ましい。Ｒ¹は、好ましくはアミノエチル基である。
Ｒ¹基は、所望により置換又は保護されていてもよい。適切な保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、Tos（ｐ−トルエンスルホニル）、Z（ベンジルオキシカルボニル）、Fmoc（9-フルオレニルメトキシ）などが挙げられる。また、例えば、本発明によるアミノ酸修飾デンドリマーが標識される場合、Ｒ¹のアミノ基が標識物質と結合することもできる。 In the above formula, the alkyl chain of R ¹ is preferably a linear or branched C ₂ -C ₅ lower alkyl. R ¹ is preferably an aminoethyl group.
The R ¹ group may be optionally substituted or protected. Suitable protecting groups include t-butoxycarbonyl (Boc) group, Tos (p-toluenesulfonyl), Z (benzyloxycarbonyl), Fmoc (9-fluorenylmethoxy) and the like. Further, for example, when the amino acid-modified dendrimer according to the present invention is labeled, the amino group of R ¹ can be bonded to the labeling substance.

上記のデンドリマーは、従来公知の製造方法により製造できる。また、一部のものは市販でも入手可能である。   Said dendrimer can be manufactured with a conventionally well-known manufacturing method. Some are also commercially available.

例えば、上記の好ましいポリアミドアミンデンドロンは、原料である第１級アミンに、アクリル酸エステルを反応させるマイケル付加反応と、ジアミノアルカンを用いるエステルアミド交換反応とにより第１世代のアミド化合物を得て、マイケル付加反応及びエステルアミド交換反応を繰り返すことにより製造できる（Tomalia, D.ら、Polym. J. 17、117〜132 (1985)；Frechet, J. M. J., Tomalia, D. A.編、(2001) Dendrimers and other dendritic polymers, J. Wiley & Sons, West Sussexを参照）。原料となるジアミンは、市販で入手可能である。
上記の好ましいポリアミドアミンデンドロンの製造法のスキームの例を、以下に示す。 For example, the preferable polyamide amine dendron is obtained by obtaining a first generation amide compound by a Michael addition reaction in which an acrylic acid ester is reacted with a primary amine as a raw material and an ester amide exchange reaction using a diaminoalkane, It can be produced by repeating the Michael addition reaction and the ester amide exchange reaction (Tomalia, D. et al., Polym. J. 17, 117-132 (1985); Frechet, JMJ, Tomalia, DA, (2001) Dendrimers and other dendritic. polymers, J. Wiley & Sons, West Sussex). The diamine used as a raw material is commercially available.
An example of a scheme for producing the above preferred polyamidoamine dendron is shown below.

（式中、Ｘは、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＮＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｎ＜を表す。）

(In the formula, X represents —CH ₂ CH ₂ CONHCH ₂ CH ₂ N <).

本発明の擬似ペプチドライブラリーは、上記のデンドリマーの末端基に、同じ又は異なるアミノ酸が１分子ずつ結合したアミノ酸修飾デンドリマーからなる。
本明細書において、「アミノ酸」とは、アミノ基とカルボキシル基とを同一分子内に有する化合物、及びアミノ基、カルボキシル基又はそれ以外の基が保護又は置換されたものも含むことを意図する。
アミノ酸は、天然のタンパク質を構成する２０種のアミノ酸（天然アミノ酸)、及びそれ以外のアミノ酸を含む。
天然アミノ酸以外のアミノ酸としては、例えばβ−アラニン、γ−アミノ酪酸、δ−アミノレブリン酸、ホモシステイン、ヒドロキシトリプトファン、ヒドロキシプロリンなどが挙げられる。 The pseudopeptide library of the present invention comprises an amino acid-modified dendrimer in which the same or different amino acids are bonded to the terminal group of the dendrimer one molecule at a time.
In the present specification, the term “amino acid” is intended to include compounds having an amino group and a carboxyl group in the same molecule, and those in which an amino group, carboxyl group or other group is protected or substituted.
The amino acid includes 20 kinds of amino acids (natural amino acids) constituting natural proteins, and other amino acids.
Examples of amino acids other than natural amino acids include β-alanine, γ-aminobutyric acid, δ-aminolevulinic acid, homocysteine, hydroxytryptophan, and hydroxyproline.

本発明の擬似ペプチドライブラリーは、２種以上のアミノ酸修飾デンドリマーの混合物からなる。本発明においては、あるアミノ酸修飾デンドリマー分子と、別のアミノ酸修飾デンドリマー分子とを比較したときに、少なくとも１つの位置の末端基を修飾しているアミノ酸の種類が異なる場合に、これらのアミノ酸修飾デンドリマーは異なる種類であるとみなす。例えば、４つの末端基Ｙ¹、Ｙ²、Ｙ³及びＹ⁴がアミノ酸Ａ又はＢで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの末端アミノ酸の組み合わせとしては、以下の１６種類が考えられる。
（Ｙ¹、Ｙ²、Ｙ³、Ｙ⁴）＝
（Ａ、Ａ、Ａ、Ａ）、
（Ａ、Ａ、Ａ、Ｂ）、（Ａ、Ａ、Ｂ、Ａ）、（Ａ、Ｂ、Ａ、Ａ）、（Ｂ、Ａ、Ａ、Ａ）、
（Ａ、Ａ、Ｂ、Ｂ）、（Ａ、Ｂ、Ａ、Ｂ）、（Ａ、Ｂ、Ｂ、Ａ）、（Ｂ、Ａ、Ａ、Ｂ）、（Ｂ、Ａ、Ｂ、Ａ）、（Ｂ、Ｂ、Ａ、Ａ）、
（Ａ、Ｂ、Ｂ、Ｂ）、（Ｂ、Ａ、Ｂ、Ｂ）、（Ｂ、Ｂ、Ａ、Ｂ）、（Ｂ、Ｂ、Ｂ、Ａ）、
（Ｂ、Ｂ、Ｂ、Ｂ）
これらのうち、例えば（Ｙ¹、Ｙ²、Ｙ³、Ｙ⁴）＝（Ａ、Ａ、Ａ、Ｂ）と（Ａ、Ａ、Ｂ、Ａ）のものは、Ａが３分子、Ｂが１分子という点では同じであるが、Ｙ³、Ｙ⁴の位置の末端基を修飾するアミノ酸が異なるので、２種類の異なるアミノ酸修飾デンドリマーとみなすことができる。
また、本発明の擬似ペプチドライブラリーは、末端基を修飾するアミノ酸がすべて同じもの、例えば（Ｙ¹、Ｙ²、Ｙ³、Ｙ⁴）＝（Ａ、Ａ、Ａ、Ａ）のようなものも含み得る。 The pseudopeptide library of the present invention consists of a mixture of two or more amino acid-modified dendrimers. In the present invention, when one amino acid-modified dendrimer molecule is compared with another amino acid-modified dendrimer molecule, if the type of amino acid that modifies the terminal group at at least one position is different, these amino acid-modified dendrimers Are considered different types. For example, the following 16 types of amino acid-modified dendrimer combinations in which four terminal groups Y ¹ , Y ² , Y ³ and Y ⁴ are modified with amino acids A or B are considered.
(Y ¹ , Y ² , Y ³ , Y ⁴ ) =
(A, A, A, A),
(A, A, A, B), (A, A, B, A), (A, B, A, A), (B, A, A, A),
(A, A, B, B), (A, B, A, B), (A, B, B, A), (B, A, A, B), (B, A, B, A), (B, B, A, A),
(A, B, B, B), (B, A, B, B), (B, B, A, B), (B, B, B, A),
(B, B, B, B)
Among these, for example, (Y ¹ , Y ² , Y ³ , Y ⁴ ) = (A, A, A, B) and (A, A, B, A) are those where A is 3 molecules and B is 1 Although they are the same in terms of molecules, since the amino acids that modify the terminal groups at the positions of Y ³ and Y ⁴ are different, they can be regarded as two different amino acid-modified dendrimers.
The pseudo peptide library of the present invention has the same amino acid that modifies the terminal group, for example, (Y ¹ , Y ² , Y ³ , Y ⁴ ) = (A, A, A, A) May also be included.

本発明の擬似ペプチドライブラリーにおいて、アミノ酸修飾デンドリマーは、デンドリマーの全ての末端基がアミノ酸で修飾されていてもよく、デンドリマーの一部の末端基がアミノ酸で修飾されていてもよい。   In the pseudopeptide library of the present invention, in the amino acid-modified dendrimer, all terminal groups of the dendrimer may be modified with amino acids, or some terminal groups of the dendrimer may be modified with amino acids.

本発明の擬似ペプチドライブラリーは、ペプチドライブラリーの代替として用いることができる、異なる擬似ペプチドの混合物である。本発明の２種以上の擬似ペプチド、すなわちアミノ酸修飾デンドリマーを含む擬似ペプチドライブラリーは、２種以上のアミノ酸をデンドリマーと反応させることにより、作製することができる。
２種以上のアミノ酸とデンドリマーとの反応は、デンドリマーの末端基の種類によって適宜選択できる。例えばデンドリマーの末端基が−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＮＨＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂である場合のようにデンドリマーの末端基の末端がアミノ基である場合、アミノ酸のカルボキシル基を末端のアミノ基と反応させることにより、アミノ酸をデンドリマーの末端基に結合させることができる。また、デンドリマーの末端基がカルボキシル基である場合、アミノ酸のアミノ基を末端のカルボキシル基と反応させることにより、アミノ酸をデンドリマーの末端基に結合させることができる。また、デンドリマーとアミノ酸の結合として、ヒドロキシル基とカルボキシル基、チオール基同士、チオール基やマレインイミド基、アジド基とアルキン、エポキシ基とアルキンの結合などを利用することも可能である。
デンドリマーとアミノ酸とを結合させる反応では、通常、アミノ酸のデンドリマーと反応する反応部位以外の反応性部位を保護又は置換すること、アミノ酸に反応性部位を導入することなどが行われる。 The pseudopeptide library of the present invention is a mixture of different pseudopeptides that can be used as an alternative to a peptide library. A pseudo peptide library containing two or more pseudo peptides of the present invention, that is, an amino acid-modified dendrimer, can be prepared by reacting two or more amino acids with a dendrimer.
The reaction of two or more amino acids with a dendrimer can be selected as appropriate depending on the type of end group of the dendrimer. For example, when the terminal group of the dendrimer is an amino group, as in the case where the terminal group of the dendrimer is —CH ₂ CH ₂ CONHCH ₂ CH ₂ NH ₂ , by reacting the carboxyl group of the amino acid with the terminal amino group An amino acid can be attached to the end group of the dendrimer. When the terminal group of the dendrimer is a carboxyl group, the amino acid can be bound to the terminal group of the dendrimer by reacting the amino group of the amino acid with the terminal carboxyl group. Further, as a bond between a dendrimer and an amino acid, a hydroxyl group and a carboxyl group, a thiol group, a thiol group or a maleimide group, an azide group and an alkyne, an epoxy group and an alkyne, or the like can be used.
In the reaction of binding a dendrimer and an amino acid, usually a reactive site other than the reactive site that reacts with an amino acid dendrimer is protected or substituted, or a reactive site is introduced into an amino acid.

上記のアミノ酸修飾デンドリマーは、末端基に結合したアミノ酸同士はペプチド結合していないにもかかわらず、デンドリマーが密な分子構造を有するので、その末端に結合したアミノ酸が、あたかも直鎖状にペプチド結合しているかのように擬似ペプチドとして作用できる。よって、標的分子の結合部位に結合することが可能である。   The above-mentioned amino acid-modified dendrimer has a dense molecular structure even though the amino acids bonded to the terminal groups are not peptide-bonded to each other. It can act as a pseudopeptide as if it were. Therefore, it is possible to bind to the binding site of the target molecule.

本発明の擬似ペプチドライブラリーに含まれるアミノ酸修飾デンドリマーは、標識物質と結合していることが好ましい。標識物質とは、標識物質が結合しているアミノ酸修飾デンドリマーの存在を他の物質と区別できる物質であれば、特に限定されない。標識物質が結合しているアミノ酸修飾デンドリマーの存在を他の物質と区別する様式としては、標識物質が放射線を含む光を吸収及び発光すること、標識物質がアミノ酸修飾デンドリマー以外の別の物質と特異的に結合することなどが挙げられる。
標識物質は、蛍光物質、酵素（例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなど）、放射性同位元素（例えば¹²⁵Ｉ、¹⁴Ｃ、³²Ｐなど）、別の物質と特異的に結合可能な物質（例えばアビジン又はストレプトアビジン、ビオチン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）など）が挙げられる。 The amino acid-modified dendrimer contained in the pseudo peptide library of the present invention is preferably bound to a labeling substance. The labeling substance is not particularly limited as long as it can distinguish the presence of the amino acid-modified dendrimer to which the labeling substance is bound from other substances. To distinguish the presence of the amino acid-modified dendrimer to which the labeling substance is bound from other substances, the labeling substance absorbs and emits light containing radiation, and the labeling substance is specific to another substance other than the amino acid-modified dendrimer. For example.
The labeling substance can specifically bind to fluorescent substances, enzymes (eg alkaline phosphatase, peroxidase, glucose oxidase, tyrosinase, acid phosphatase etc.), radioisotopes (eg ¹²⁵ I, ¹⁴ C, ³² P etc.) and other substances. Such as avidin or streptavidin, biotin, glutathione-S-transferase (GST) and the like.

上記の蛍光物質としては、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びその誘導体、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリン、Ｑｄｏｔ（登録商標）、ローダミン及びその誘導体、Ｃｙ色素及びその誘導体のような、当該分野で公知の物質が挙げられる。また、蛍光物質として、ＨＰＬＣ用の誘導化試薬を用いることができ、そのような試薬としては、以下のようなものが挙げられる：
DPS-Cl（4-（5,6-ジメトキシ-N-フタルイミジニル）ベンゼンスルホニルクロリド）
NBD-Cl（4-クロロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール）
NBD-F（4-フルオロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール）
Dansyl-Cl（5-（ジメチルアミノ）ナフタレン-1-スルホニルクロリド）
Dansyl-F（5-（ジメチルアミノ）ナフタレン-1-スルホニルフロリド）
Fluorescamin（4-フェニルスピロ[フラン-2-(3H),1'-フタラン]-3,3'-ジオン）
Dabsyl-Cl（4-（4-ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリド）
Dabcyl-Cl（4-[[（4-ジメチルアミノ）フェニル]アゾ]安息香酸スクシンイミジルエステル）
ABD-F（4-アミノスルホニル-7-フルオロ-2,1-,3-ベンゾキサジアゾール）
NAM（N-(9-アクリジニル)マレイミド）
SBD-F（アンモニウム4-フルオロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール-7-スルホネート）
DDB（1,2-ジアミノ-4,5-ジメトキシベンゼン二塩酸塩）
MDB（1,2-ジアミノ-4,5-メチレンジオキシベンゼン二塩酸塩）
Br-DMEQ（3-ブロモメチル-6,7-ジメトキシ-1-メチル-1,2-ジヒドロキノキサリン-2-オン）
Br-Mmc（4-ブロモメチル-7-メトキシクマリン）
DMEQ-COCl（3-クロロカルボニル-6,7-ジメトキシ-1-メチル-2(1H)-キノキサリノン） Examples of the fluorescent material include fluorescein isothiocyanate (FITC) and derivatives thereof, green fluorescent protein (GFP), luciferin, Qdot (registered trademark), rhodamine and derivatives thereof, Cy dyes and derivatives thereof in the art. Known substances can be mentioned. In addition, a derivatizing reagent for HPLC can be used as the fluorescent substance, and examples of such a reagent include the following:
DPS-Cl (4- (5,6-Dimethoxy-N-phthalimidinyl) benzenesulfonyl chloride)
NBD-Cl (4-chloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole)
NBD-F (4-Fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole)
Dansyl-Cl (5- (dimethylamino) naphthalene-1-sulfonyl chloride)
Dansyl-F (5- (Dimethylamino) naphthalene-1-sulfonyl fluoride)
Fluorescamin (4-phenylspiro [furan-2- (3H), 1'-phthalane] -3,3'-dione)
Dabsyl-Cl (4- (4-Dimethylaminophenylazo) benzenesulfonyl chloride)
Dabcyl-Cl (4-[[(4-Dimethylamino) phenyl] azo] benzoic acid succinimidyl ester)
ABD-F (4-aminosulfonyl-7-fluoro-2,1-, 3-benzoxadiazole)
NAM (N- (9-acridinyl) maleimide)
SBD-F (Ammonium 4-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-7-sulfonate)
DDB (1,2-diamino-4,5-dimethoxybenzene dihydrochloride)
MDB (1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene dihydrochloride)
Br-DMEQ (3-bromomethyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-1,2-dihydroquinoxalin-2-one)
Br-Mmc (4-bromomethyl-7-methoxycoumarin)
DMEQ-COCl (3-Chlorocarbonyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-2 (1H) -quinoxalinone)

上記のアミノ酸修飾デンドリマーと標識物質との結合は、標識物質の種類に応じて、当該分野で公知の方法により行うことができる。標識物質は、デンドリマーのコアに結合してもよいし、末端基に結合してもよい。好ましくは、デンドリマーのコアに標識物質が結合することである。   The binding between the amino acid-modified dendrimer and the labeling substance can be performed by a method known in the art depending on the type of the labeling substance. The labeling substance may be bound to the dendrimer core or to the end group. Preferably, a labeling substance is bound to the dendrimer core.

例えば、デンドリマーのコアに反応可能なアミノ基が存在する場合、このアミノ基を、標識物質に結合させた反応性官能基、例えばイソチオシアネート基、ＮＨＳ（N-ヒドロキシスクシンイミド）基をもつ標識物質をアミノ酸修飾デンドリマーに結合させることができる。
なお、標識物質と結合しているアミノ酸修飾デンドリマーは、デンドリマーと標識物質を先に反応させ、その後、アミノ酸でデンドリマーを修飾してもよいが、操作が簡便であるので、デンドリマーをアミノ酸で修飾した後に、アミノ酸修飾デンドリマーに標識物質を結合させることが好ましい。 For example, when there is a reactive amino group in the core of the dendrimer, a labeling substance having a reactive functional group, such as an isothiocyanate group or NHS (N-hydroxysuccinimide) group, bonded to the labeling substance is added to the amino group. It can be conjugated to an amino acid modified dendrimer.
As for the amino acid-modified dendrimer bound to the labeling substance, the dendrimer and the labeling substance may be reacted first, and then the dendrimer may be modified with an amino acid. However, since the operation is simple, the dendrimer was modified with an amino acid. It is preferable to bind a labeling substance to the amino acid-modified dendrimer later.

本発明は、上記の擬似ペプチドライブラリーを用いて、標的分子と結合可能な擬似ペプチドを選択する方法も提供する。
よって、本発明は、上記の擬似ペプチドライブラリーを、標的分子と接触させ、標的分子と結合したアミノ酸修飾デンドリマーを検出する工程を含む、標的分子に結合可能なアミノ酸修飾デンドリマーを検出する方法でもある。 The present invention also provides a method for selecting a pseudopeptide capable of binding to a target molecule using the above-described pseudopeptide library.
Therefore, the present invention is also a method for detecting an amino acid-modified dendrimer capable of binding to a target molecule, comprising the step of contacting the above-mentioned pseudo peptide library with a target molecule and detecting the amino acid-modified dendrimer bound to the target molecule. .

上記の標的分子は、標的分子に結合するペプチドを検出することが所望される分子であれば特に限定されず、ペプチド、受容体などのタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、脂質、糖鎖などが挙げられる。   The target molecule is not particularly limited as long as it is desired to detect a peptide that binds to the target molecule, and includes peptides, proteins such as receptors, nucleic acids such as DNA and RNA, lipids, sugar chains, and the like. Can be mentioned.

上記の擬似ペプチドライブラリーと標的分子との接触は、標的分子とそれに結合可能な擬似ペプチドとの結合が可能となる条件下で行うことができる。このような条件は、標的分子の種類に応じて適宜決定できる。   The above-mentioned pseudo peptide library and the target molecule can be contacted under conditions that allow binding between the target molecule and the pseudo peptide that can bind to the target molecule. Such conditions can be appropriately determined according to the type of target molecule.

標的分子と結合したアミノ酸修飾デンドリマーを検出する工程は、従来公知のタンパク質の相互作用を測定する方法により行うことができる。当該相互作用測定方法としては、溶液中で相互作用を測定する方法、担体上で相互作用を測定する方法などが挙げられる。溶液中で相互作用を測定する方法は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）、流体力学的方法（例えば沈降平衡法、電気泳動法、ゲルろ過法など）、光学的方法（吸光度、蛍光強度などの測定、円偏光二色性スペクトルの測定などに基づく方法）アフィニティクロマトグラフィー、電場中での分子の配向の変化を測定する方法などが挙げられる。また、担体上で相互作用を測定する方法としては、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ）などが挙げられる。
本発明の方法で用いる擬似ペプチドライブラリーは、好ましくは親水性の高いデンドリマーにアミノ酸が結合しているので、溶液中で相互作用を測定する方法であっても有利に測定を行うことができる。 The step of detecting the amino acid-modified dendrimer bound to the target molecule can be performed by a conventionally known method for measuring protein interaction. Examples of the interaction measuring method include a method of measuring an interaction in a solution and a method of measuring an interaction on a carrier. Methods for measuring interactions in solution include fluorescence correlation spectroscopy (FCS), isothermal titration calorimetry (ITC), hydrodynamic methods (eg sedimentation equilibrium, electrophoresis, gel filtration, etc.), optical Methods (methods based on measurement of absorbance, fluorescence intensity, circular dichroism spectrum, etc.) Affinity chromatography, methods of measuring changes in molecular orientation in an electric field, and the like. Examples of the method for measuring the interaction on the carrier include a surface plasmon resonance method (SPR) and a quartz resonator microbalance method (QCM).
In the pseudo peptide library used in the method of the present invention, since amino acids are preferably bound to a highly hydrophilic dendrimer, even a method of measuring an interaction in a solution can be advantageously measured.

本発明の方法により得られた知見は、標的分子に結合可能なタンパク質のモチーフを同定するための情報として用いることができる。すなわち、本発明により検出されたアミノ酸修飾デンドリマーの末端基のアミノ酸の配列に基づいて、標的分子、例えば疾患に関与する受容体に結合できる医薬品の開発のための情報を提供できる。   The knowledge obtained by the method of the present invention can be used as information for identifying a motif of a protein that can bind to a target molecule. That is, based on the amino acid sequence of the terminal group of the amino acid-modified dendrimer detected by the present invention, information for development of a pharmaceutical that can bind to a target molecule, for example, a receptor involved in a disease can be provided.

本発明を、以下の実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
実施例１
（１）コアにアミノ基を有するポリアミドアミンデンドロンの製造
デンドリマーとしてのコアにアミノ基を有するポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドロンは、Haradaら（Bioconjugate Chem. 2006, 17, p.3-5）に記載される方法に従って合成した。
具体的には、Ｎ−（２−アミノエチル）カルバミン酸ｔ−ブチルエステル（4.889 g, 3.05×10^-2 mol）を、アクリル酸メチル（300 mL, 3.35 mol）に溶解し、混合物をアルゴン雰囲気下に還流させた。７日後に、未反応のアクリル酸メチルを減圧除去し、残渣を、CHCl₃：メタノール（MeOH）＝10：1（容量比）の混液で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（０．５世代）を得た。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
Example 1
(1) Production of polyamidoamine dendron having an amino group in the core Polyamidoamine (PAMAM) dendron having an amino group in the core as a dendrimer is described in Harada et al. (Bioconjugate Chem. 2006, 17, p. 3-5). It was synthesized according to the method.
Specifically, N- (2-aminoethyl) carbamic acid t-butyl ester (4.889 g, 3.05 × 10 ^-2 mol) was dissolved in methyl acrylate (300 mL, 3.35 mol), and the mixture was placed in an argon atmosphere. Refluxed down. After 7 days, unreacted methyl acrylate was removed under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography eluting with a mixture of CHCl ₃ : methanol (MeOH) = 10: 1 (volume ratio) to give Boc protection. PAMAM dendron (0.5 generation) was obtained.

０．５世代のPAMAMデンドロン（3.38 g, 1.02×10^-2 mol）を、メタノール（6 ml）に溶解し、混合物を、シアン化ナトリウム（100mg, 2.04×10^-3 mol）を含むエチレンジアミン（300 ml, 4.50 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に40℃にて撹拌した。5日後に、メタノール及び未反応のエチレンジアミンを反応混合物から真空下で除去した。得られた生成物を、メタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第１世代）を得た。 0.5 generation PAMAM dendron (3.38 g, 1.02 x 10 ^-2 mol) was dissolved in methanol (6 ml) and the mixture was dissolved in ethylenediamine (300 mg, 2.04 x 10 ^-3 mol) with ethylene diamine (300 mg ml, 4.50 mol) and stirred at 40 ° C. under an argon atmosphere. After 5 days, methanol and unreacted ethylenediamine were removed from the reaction mixture under vacuum. The resulting product was purified using a Sephadex LH-20 column eluting with methanol to give a Boc protected PAMAM dendron (first generation).

メタノール（6 ml）に溶解した第1世代のPAMAMデンドロン（2.75 g, 7.08×10^-3 mol）を、アクリル酸メチル（450 ml, 5.02 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に35℃にて4日間撹拌した。メタノール及び未反応のアクリル酸メチルを、減圧下に除去した。得られた生成物を、CHCl₃： MeOH＝10：1（容量比）の混液で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィー、及びメタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第1.5世代）を得た。 First-generation PAMAM dendron (2.75 g, 7.08 × 10 ^-3 mol) dissolved in methanol (6 ml) is added to methyl acrylate (450 ml, 5.02 mol) and at 35 ° C for 4 days under argon atmosphere Stir. Methanol and unreacted methyl acrylate were removed under reduced pressure. The resulting product was purified using silica gel column chromatography eluting with a mixture of CHCl ₃ : MeOH = 10: 1 (volume ratio) and Sephadex LH-20 column eluting with methanol to be Boc protected. PAMAM dendron (1.5th generation) was obtained.

メタノール（6 ml）に溶解した第1.5世代のPAMAMデンドロン（2.10 g, 2.87×10^-3 mol）を、シアン化ナトリウム（90 mg, 1.84×10^-3 mol）を含むエチレンジアミン（300 ml, 4.50 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に45℃にて撹拌した。3日後に、メタノール及び未反応のエチレンジアミンを減圧除去した。得られた生成物を、メタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第２世代）を得た。 1.5th generation PAMAM dendron (2.10 g, 2.87 × 10 ^-3 mol) dissolved in methanol (6 ml) and ethylenediamine (300 ml, 4.50 mol) containing sodium cyanide (90 mg, 1.84 × 10 ^-3 mol) ) And stirred at 45 ° C. under an argon atmosphere. Three days later, methanol and unreacted ethylenediamine were removed under reduced pressure. The resulting product was purified using a Sephadex LH-20 column eluting with methanol to give a Boc protected PAMAM dendron (2nd generation).

メタノール（4 ml）に溶解した第２世代のPAMAMデンドロン（2.00 g, 2.37×10-3 mol）を、アクリル酸メチル（500 ml, 5.58 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に35℃にて3日間撹拌した。メタノール及び未反応のアクリル酸メチルを、減圧下に除去した。得られた生成物を、メタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第2.5世代）を得た。   Second-generation PAMAM dendron (2.00 g, 2.37 × 10-3 mol) dissolved in methanol (4 ml) is added to methyl acrylate (500 ml, 5.58 mol) and at 35 ° C. for 3 days under an argon atmosphere. Stir. Methanol and unreacted methyl acrylate were removed under reduced pressure. The resulting product was purified using a Sephadex LH-20 column eluting with methanol to give a Boc protected PAMAM dendron (generation 2.5).

メタノール（4 ml）に溶解した第2.5世代のPAMAMデンドロン（3.27 g, 2.13×10^-3 mol）を、シアン化ナトリウム（60 mg, 1.20×10^-3 mol）を含むエチレンジアミン（200 ml, 3.00 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に45℃にて撹拌した。5日後に、メタノール及び未反応のエチレンジアミンを減圧除去した。得られた生成物を、メタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第３世代；Ｇ３）を得た。
PAMAMデンドロンの製造のスキームを、以下に示す。 2.5th generation PAMAM dendron (3.27 g, 2.13 × 10 ^-3 mol) dissolved in methanol (4 ml) and ethylenediamine (200 ml, 3.00 mol) containing sodium cyanide (60 mg, 1.20 × 10 ^-3 mol) ) And stirred at 45 ° C. under an argon atmosphere. After 5 days, methanol and unreacted ethylenediamine were removed under reduced pressure. The resulting product was purified using a Sephadex LH-20 column eluting with methanol to give a Boc protected PAMAM dendron (3rd generation; G3).
A scheme for producing PAMAM dendron is shown below.

（上記の式中、Ｘは−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＮＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｎ＜を表す。）

(In the above formula, X represents —CH ₂ CH ₂ CONHCH ₂ CH ₂ N <).

（２）アセチル化アミノ酸の調製
Ｌ−フェニルアラニン（1.2g, 10mmol）又はＬ−アラニン（5.5g, 56mmol）を、ＮａＯＨ水溶液（4M）に溶解した。過剰量の無水酢酸と同時に、過剰量のＮａＯＨ水溶液（4M）を滴下し、この溶液のｐＨを９．５〜１１．５に保って氷上で一晩撹拌した。その後、6N ＨＣｌを加えて、ｐＨを２．５に調整した。酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を用いて抽出したアセチル化アミノ酸を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンから再結晶化した。アセチル化フェニルアラニン（Ac-Phe）及びアセチル化アラニン（Ac-Ala）の収率は、それぞれ７７％及び５４％であった。これらの生成物を、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ₄ナトリウム塩含有Ｄ₂Ｏに溶解し、¹Ｈ及び¹³Ｃ ＮＭＲで分析した。 (2) Preparation of acetylated amino acid L-phenylalanine (1.2 g, 10 mmol) or L-alanine (5.5 g, 56 mmol) was dissolved in an aqueous NaOH solution (4M). Simultaneously with an excess amount of acetic anhydride, an excess amount of aqueous NaOH solution (4M) was added dropwise, and the pH of this solution was kept at 9.5 to 11.5 and stirred overnight on ice. Thereafter, 6N HCl was added to adjust the pH to 2.5. The acetylated amino acid extracted with ethyl acetate (EtOAc) was recrystallized from EtOAc / hexane. The yields of acetylated phenylalanine (Ac-Phe) and acetylated alanine (Ac-Ala) were 77% and 54%, respectively. These products were dissolved in D ₂ O containing 3- (trimethylsilyl) propionic acid-d ₄ sodium salt and analyzed by ¹ H and ¹³ C NMR.

Ac-Alaについての¹H NMR: δ1.39 (d, Hβ), 2.01 (s, CH ₃ CO) and 4.29 (q, Hα).
Ac-Alaについての¹³C NMR: δ19.3 (Cβ), 24.6 (CH₃CO), 52.1 (Cα) and 176.9 (CO).
Ac-Pheについての¹H NMR: δ1.91 (s, CH ₃ CO), 2.92 and 3.19 (m, Hβ), 4.46 (m, Hα), and 7.29 and 7.36 (m, phenyl).
Ac-Pheについての¹³C NMR: δ24.7 (CH₃CO), 40.5 (Cβ), 59.1 (Cα), 129.8, 131.5, 132.2 and 140.7 (phenyl) and 176.3 (CO). ¹ H NMR for Ac-Ala: δ1.39 (d, Hβ), 2.01 (s, C H ₃ CO) and 4.29 (q, Hα).
¹³ C NMR for Ac-Ala: δ19.3 (Cβ), 24.6 ( C H ₃ CO), 52.1 (Cα) and 176.9 ( C O).
¹ H NMR for Ac-Phe: δ1.91 (s, C H ₃ CO), 2.92 and 3.19 (m, Hβ), 4.46 (m, Hα), and 7.29 and 7.36 (m, phenyl).
¹³ C NMR for Ac-Phe: δ24.7 ( C H ₃ CO), 40.5 (Cβ), 59.1 (Cα), 129.8, 131.5, 132.2 and 140.7 (phenyl) and 176.3 ( C O).

（３）アミノ酸修飾デンドリマーの作製
（２）で調製したアセチル化アミノ酸を異なる混合比（モル比）で混合した混合アミノ酸（Ac-Ala/Ac-Phe＝０／１０，１／９，３／７，５／５，７／３，９／１及び１０／０）を、それぞれ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（２．４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２．６ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）（3.0mmol）と、蒸留したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、氷上で４時間反応させた。蒸留ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した（１）で得られたBoc保護PAMAMデンドロン（Ｇ３世代）（30mg）を加え、反応混合物を室温にて２日間撹拌した。アセチル化アミノ酸で修飾されたBoc保護PAMAMデンドロンを、溶離液としてメタノール（ＭｅＯＨ）を用いてSephadex LH-20カラムで精製した。生成物を、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ₄ナトリウム塩含有Ｄ₂Ｏに溶解し、¹Ｈ ＮＭＲで分析した。 (3) Preparation of amino acid-modified dendrimer Mixed amino acids (Ac-Ala / Ac-Phe = 0/10, 1/9, 3/7) prepared by mixing the acetylated amino acids prepared in (2) at different mixing ratios (molar ratios) , 5/5, 7/3, 9/1 and 10/0), respectively, N-hydroxysuccinimide (NHS) (2.4 mmol), N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (2.6 mmol), And triethylamine (TEA) (3.0 mmol) in distilled N, N-dimethylformamide (DMF) for 4 hours on ice. Boc-protected PAMAM dendron (G3 generation) (30 mg) obtained in (1) dissolved in distilled dimethyl sulfoxide (DMSO) was added and the reaction mixture was stirred at room temperature for 2 days. Boc-protected PAMAM dendrons modified with acetylated amino acids were purified on Sephadex LH-20 columns using methanol (MeOH) as the eluent. The product was dissolved in D ₂ O containing 3- (trimethylsilyl) propionic acid-d ₄ sodium salt and analyzed by ¹ H NMR.

例えば、Ac-Ala/Ac-Phe＝５／５のアミノ酸混合物を用いて修飾されたアミノ酸修飾デンドリマーについて: δ1.34 (m, Hβ of Ala), 1.42 (s, Boc), 1.95 (s, CH ₃ CO of Phe) and 2.02 (s, CH ₃ CO of Ala), 2.24 (br, CH₂CH₂NHCOCH ₂ CH₂N), 2.63 (br, CH₂CH₂NHCOCH₂CH ₂ N), 2.81 (br, CH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N), 3.06 (br, NCH ₂ CH₂N (core)), 3.36 (br, CH₂CH ₂ NHCOCH₂CH₂N and CONHCH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N (terminal)), 4.21 (br, Hα of Ala), 4.49 (br, Hα of Phe) and 7.31 (m, phenyl).
その他のアミノ酸修飾デンドリマーのＮＭＲは、図１に示す。 For example, for an amino acid modified dendrimer modified with an amino acid mixture of Ac-Ala / Ac-Phe = 5/5: δ1.34 (m, Hβ of Ala), 1.42 (s, Boc), 1.95 (s, C H ₃ CO of Phe) and 2.02 (s, C H ₃ CO of Ala), 2.24 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOC H ₂ CH ₂ N), 2.63 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ C H ₂ N) , 2.81 (br, C H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N), 3.06 (br, NC H ₂ CH ₂ N (core)), 3.36 (br, CH ₂ C H ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N and CONHC H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N (terminal)), 4.21 (br, Hα of Ala), 4.49 (br, Hα of Phe) and 7.31 (m, phenyl).
NMR of other amino acid modified dendrimers is shown in FIG.

（４）標識アミノ酸修飾デンドリマーの作製
（３）で得られたアミノ酸修飾デンドリマーに、2mlのＴＦＡを加えて氷上で４時間反応させてＢｏｃ基を脱保護した。溶媒を蒸発させた後に、過剰量のＴＥＡを加え、ＭｅＯＨ及びエーテルで再沈殿させた。残渣をエタノールに溶解し、過剰量の４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｃｌ）を加えて１時間撹拌した。その後、Sephadex LH-20カラムを用いて精製した。Ac-Ala/Ac-Phe＝０／１０，１／９，３／７，５／５，７／３，９／１及び１０／０の混合比のアミノ酸混合物で修飾したＮＢＤ標識デンドリマーの収率は、それぞれ出発物質の５５、４７、５４、５７、６５、３３及び６９％であった。これらの生成物を、ＣＤ₃ＯＤに溶解して、¹Ｈ ＮＭＲで分析した。 (4) Preparation of labeled amino acid-modified dendrimer 2 ml of TFA was added to the amino acid-modified dendrimer obtained in (3) and reacted on ice for 4 hours to deprotect the Boc group. After evaporating the solvent, an excess of TEA was added and reprecipitated with MeOH and ether. The residue was dissolved in ethanol, an excess amount of 4-chloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-Cl) was added, and the mixture was stirred for 1 hour. Then, it refine | purified using the Sephadex LH-20 column. Ac-Ala / Ac-Phe = yield of NBD-labeled dendrimer modified with a mixture of amino acids of 0/10, 1/9, 3/7, 5/5, 7/3, 9/1 and 10/0 Were 55, 47, 54, 57, 65, 33 and 69% of the starting material, respectively. These products were dissolved in CD ₃ OD and analyzed by ¹ H NMR.

例えば、Ac-Ala/Ac-Phe＝５／５のアミノ酸混合物を用いて得られた標識アミノ酸修飾デンドリマーについて: δ1.32 (d, Hβ of Ala), 1.90 (s, CH ₃ CO of Phe) and 2.08 (s, CH ₃ CO of Ala), 2.40 (br, CH₂CH₂NHCOCH ₂ CH₂N), 2.64 (br, CH₂CH₂NHCOCH₂CH ₂ N), 2.87 (br, CH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N), 3.08 (br, NCH ₂ CH ₂ N (core)), 3.41 (br, CH₂CH ₂ NHCOCH₂CH₂N and CONHCH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N (terminal)), 4.23 (br, Hα of Ala), 4.50 (br, Hα of Phe) and 7.24 (m, phenyl and NBD).
その他のアミノ酸修飾デンドリマーのＮＭＲは、図２に示す。 For example, for a labeled amino acid modified dendrimer obtained using an amino acid mixture of Ac-Ala / Ac-Phe = 5/5: δ1.32 (d, Hβ of Ala), 1.90 (s, C H ₃ CO of Phe) and 2.08 (s, C H ₃ CO of Ala), 2.40 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOC H ₂ CH ₂ N), 2.64 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ C H ₂ N), 2.87 (br, C H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N), 3.08 (br, NC H ₂ C H ₂ N (core)), 3.41 (br, CH ₂ C H ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N and CONHC H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N (terminal)), 4.23 (br, Hα of Ala), 4.50 (br, Hα of Phe) and 7.24 (m, phenyl and NBD).
The NMR of other amino acid modified dendrimers is shown in FIG.

上記の各比率のアミノ酸と反応させて得られたアミノ酸修飾デンドリマーについて得られたＮＭＲスペクトルを図１及び２に示す。これらのスペクトルに基づいて、Ala又はPheのデンドリマーに対する積分値を求め、この値から、実際にデンドリマーの末端基に結合した各アミノ酸の数を推定した。この結果を、表１に示す。   1 and 2 show NMR spectra obtained for the amino acid-modified dendrimers obtained by reacting with the above-mentioned ratios of amino acids. Based on these spectra, the integral value for the dendrimer of Ala or Phe was determined, and from this value, the number of each amino acid actually bound to the end group of the dendrimer was estimated. The results are shown in Table 1.

表１の結果から、デンドリマーの実質的に全ての末端基にアミノ酸分子が結合していることがわかる。また、デンドリマーの末端基に結合した２種のアミノ酸の割合は、反応させた２種のアミノ酸の混合比とほぼ等しいことがわかる。よって、デンドリマーに反応させる種々のアミノ酸の混合比を調節することにより、擬似ペプチドライブラリー中の擬似ペプチドのアミノ酸の比を調節できることが示唆される。   From the results in Table 1, it can be seen that amino acid molecules are bonded to substantially all terminal groups of the dendrimer. It can also be seen that the ratio of the two amino acids bonded to the terminal group of the dendrimer is almost equal to the mixing ratio of the two amino acids reacted. Therefore, it is suggested that the ratio of the amino acids of the pseudopeptides in the pseudopeptide library can be adjusted by adjusting the mixing ratio of various amino acids to be reacted with the dendrimer.

（４）で得られた標識アミノ酸修飾デンドリマーを、以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（トーソー社製）、
検出器：ＵＶ検出器（ＵＶ−２０７５Ｐｌｕｓ；日本分光社製）、及び蛍光検出器（λｅｘ＝４５０ｎｍ，λｅｍ＝５３０ｎｍ；ＦＲ−２０２０Ｐｌｕｓ；日本分光社製）、
ポンプ：ＰＵ−２０８９Ｐｌｕｓ（日本分光社製）、
流速：１．０ｍｌ／分
サンプル溶液：１０％メタノール（Ａ）及びアセトニトリル（Ｂ）含有２０ｍＭリン酸緩衝液、
グラジエント：０分：１００％（Ａ）含有２０ｍＭリン酸緩衝液、３０分：（Ａ）１０％及び（Ｂ）９０％含有２０ｍＭリン酸緩衝液。 The labeled amino acid-modified dendrimer obtained in (4) was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) under the following conditions.
Column: Cosmosil 5C18-MS-II (manufactured by Tosoh Corporation),
Detector: UV detector (UV-2075Plus; manufactured by JASCO Corporation), and fluorescence detector (λex = 450 nm, λem = 530 nm; FR-2020Plus; manufactured by JASCO Corporation),
Pump: PU-2089Plus (manufactured by JASCO),
Flow rate: 1.0 ml / min Sample solution: 20 mM phosphate buffer containing 10% methanol (A) and acetonitrile (B),
Gradient: 0 min: 100% (A) -containing 20 mM phosphate buffer, 30 min: (A) 10% and (B) 90 mM-containing 20 mM phosphate buffer.

ＨＰＬＣの結果を、図３に示す。   The result of HPLC is shown in FIG.

図３の結果から、標識アミノ酸結合デンドリマーは、Ac-Ala/Ac-Pheの比が１０／０のときは約９．１分で、Ac-Ala/Ac-Pheの比が０／１０のときは約１７．１分で、それぞれＨＰＬＣのカラムから溶出され、Ac-Ala/Ac-Pheの比がこれらの間である場合は、複数のピーク又はブロードなピークを示すことがわかる。例えば、Ac-Ala/Ac-Pheの比が７／３のときは、約９．１分、約１０．９分、約１２．２分、約１３．６分にピークが見られた。これらのピークは、それぞれAc-Ala 8/Ac-Phe 0、Ac-Ala 7/Ac-Phe 1、Ac-Ala 6/Ac-Phe 2、Ac-Ala 5/Ac-Phe 3に対応すると考えられる。このことから、様々な比で結合した種々の分子が得られたことがＨＰＬＣによって確認された。   From the results of FIG. 3, the labeled amino acid-bound dendrimer is about 9.1 minutes when the ratio of Ac-Ala / Ac-Phe is 10/0, and the ratio of Ac-Ala / Ac-Phe is 0/10. Is eluted from the HPLC column at about 17.1 minutes, and when the ratio of Ac-Ala / Ac-Phe is between these, it can be seen that multiple peaks or broad peaks are shown. For example, when the ratio of Ac-Ala / Ac-Phe was 7/3, peaks were observed at about 9.1 minutes, about 10.9 minutes, about 12.2 minutes, and about 13.6 minutes. These peaks are thought to correspond to Ac-Ala 8 / Ac-Phe 0, Ac-Ala 7 / Ac-Phe 1, Ac-Ala 6 / Ac-Phe 2, and Ac-Ala 5 / Ac-Phe 3, respectively. . From this, it was confirmed by HPLC that various molecules bound at various ratios were obtained.

実施例２
（１）ポリアミドアミンデンドロンの製造
実施例１の（１）と同様にして、Boc保護されたPAMAMデンドロンを製造した。また、実施例１の（１）の第２世代から第３世代のデンドリマーの製造と同様にして、Boc保護された第４世代（Ｇ４）のPAMAMデンドロンを製造した。 Example 2
(1) Production of polyamidoamine dendron In the same manner as in Example 1 (1), a Boc-protected PAMAM dendron was produced. In addition, a Boc-protected fourth generation (G4) PAMAM dendron was produced in the same manner as the production of the second to third generation dendrimers in Example 1 (1).

（２）アセチル化アミノ酸の調製
実施例１の（２）と同様にして、アセチル化したＬ−プロリン及びＬ−アラニン（それぞれAc-Pro及びAc-Ala）を得た。３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ₄ナトリウム塩含有Ｄ₂Ｏに溶解し、¹Ｈ及び¹³C ＮＭＲで分析した。
Ac-Proについての¹H NMR: δ1.86-1.91 and 2.24-2.29 (m, Hβ), 1.97 (m, Hγ), 2.10 (s, CH ₃ CO), 3.44-3.65 (m, Hδ) and 4.31-4.37 (m, Hα).
Ac-Proについての¹³C NMR: δ24.2 (CH₃CO), 27.2 (Cγ), 32.4 (Cβ), 51.5 (Cδ), 62.2 (Cα) and 175.9 (CO). (2) Preparation of acetylated amino acid In the same manner as in (2) of Example 1, acetylated L-proline and L-alanine (Ac-Pro and Ac-Ala, respectively) were obtained. 3- (trimethylsilyl) was dissolved in propionic acid -d ₄ sodium salt containing D ₂ O, was analyzed by ¹ H and ¹³ C NMR.
¹ H NMR for Ac-Pro: δ1.86-1.91 and 2.24-2.29 (m, Hβ), 1.97 (m, Hγ), 2.10 (s, C H ₃ CO), 3.44-3.65 (m, Hδ) and 4.31-4.37 (m, Hα).
¹³ C NMR for Ac-Pro: δ24.2 ( C H ₃ CO), 27.2 (Cγ), 32.4 (Cβ), 51.5 (Cδ), 62.2 (Cα) and 175.9 ( C O).

また、Boc及びTos（ｐ−トルエンスルホニル）基で保護されたアルギニン（Boc-Arg (Tos)）（1.0g, 2.2mmol）を、氷上で５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で４時間処理した。溶媒を蒸発させた。蒸留水を加えて蒸発させる操作を２回行った。得られた生成物を、実施例１の（１）と同様にして、アセチル化されたＬ−アルギニン（Ac-Arg (Tos)）を得た。収率：５０％。３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ₄ナトリウム塩含有Ｄ₂Ｏに溶解し、¹Ｈ及び¹³C ＮＭＲで分析した。
¹H NMR: δ1.49-1.65 (m, Hβ and Hα), 1.99 (s, CH ₃ CO), 2.40 (s, CH ₃ (Tos)), 3.18 (br, Hδ), 4.08 (m, Hα) and 7.40 and 7.75 (d, phenyl (Tos)).
¹³C NMR: δ24.2 (CH₃CO), 27.2 (Cγ), 32.4 (Cβ), 51.5 (Cδ), 62.2 (Cα) and 175.9 (CO). In addition, arginine (Boc-Arg (Tos)) (1.0 g, 2.2 mmol) protected with Boc and Tos (p-toluenesulfonyl) group was treated with 5 ml of trifluoroacetic acid (TFA) on ice for 4 hours. The solvent was evaporated. The operation of adding distilled water and evaporating was performed twice. The obtained product was obtained in the same manner as in Example 1 (1) to obtain acetylated L-arginine (Ac-Arg (Tos)). Yield: 50%. 3- (trimethylsilyl) was dissolved in propionic acid -d ₄ sodium salt containing D ₂ O, was analyzed by ¹ H and ¹³ C NMR.
¹ H NMR: δ1.49-1.65 (m, Hβ and Hα), 1.99 (s, C H ₃ CO), 2.40 (s, C H ₃ (Tos)), 3.18 (br, Hδ), 4.08 (m, Hα) and 7.40 and 7.75 (d, phenyl (Tos)).
¹³ C NMR: δ24.2 ( C H ₃ CO), 27.2 (Cγ), 32.4 (Cβ), 51.5 (Cδ), 62.2 (Cα) and 175.9 ( C O).

（３）アミノ酸修飾デンドリマーの作製
（２）で調製したアセチル化アミノ酸をAc-Pro/Ac-Arg(Tos)＝３／１の比で混合した混合アミノ酸、又は（２）で調製したAc-Ala（2.0mmol）を、ＮＨＳ（2.4mmol）、ＤＣＣ（2.6mmol）及びＴＥＡ（3.0mmol）と、蒸留したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、氷上で４時間反応させた。蒸留ＤＭＳＯに溶解したＧ３世代又はＧ４世代の（１）で得られたBoc保護PAMAMデンドロン（300mg）を加え、反応混合物を室温にて２日間撹拌した。アセチル化アミノ酸で修飾されたBoc保護PAMAMデンドロンを、溶離液としてメタノール（ＭｅＯＨ）を用いてSephadex LH-20カラムで精製した。Ac-Pro/Ac-Arg(Tos)で修飾されたＧ３及びＧ４世代のデンドリマーの収率は、それぞれ８３及び８０％であった。Ac-Alaで修飾されたＧ３及びＧ４世代のデンドリマーの収率は、それぞれ９１及び９３％であった。生成物を、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ₄ナトリウム塩含有Ｄ₂Ｏに溶解して¹Ｈ及び¹³Ｃ ＮＭＲで分析した。 (3) Preparation of amino acid-modified dendrimer Mixed amino acid prepared by mixing the acetylated amino acid prepared in (2) at a ratio of Ac-Pro / Ac-Arg (Tos) = 3/1, or Ac-Ala prepared in (2) (2.0 mmol) was reacted with NHS (2.4 mmol), DCC (2.6 mmol) and TEA (3.0 mmol) in distilled N, N-dimethylformamide (DMF) on ice for 4 hours. Boc-protected PAMAM dendron (300 mg) obtained in G3 generation or G4 generation (1) dissolved in distilled DMSO was added and the reaction mixture was stirred at room temperature for 2 days. Boc-protected PAMAM dendrons modified with acetylated amino acids were purified on Sephadex LH-20 columns using methanol (MeOH) as the eluent. The yields of G3 and G4 generation dendrimers modified with Ac-Pro / Ac-Arg (Tos) were 83 and 80%, respectively. The yields of G3 and G4 generation dendrimers modified with Ac-Ala were 91 and 93%, respectively. The product was dissolved in D ₂ O containing 3- (trimethylsilyl) propionic acid-d ₄ sodium salt and analyzed by ¹ H and ¹³ C NMR.

Ac-Pro/Ac-Arg(Tos)で修飾されたアミノ酸修飾デンドリマー（Ｇ３）についての¹H NMR: δ1.41 (s, Boc), 1.53-1.68 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.89 and 2.21 (br, Hβ), 1.97 (br, Hγ of Pro), 2.03 and 2.13 (s, CH ₃ CO), 2.42 (br, CH₂CH₂NHCOCH ₂ CH₂N and CH ₃ of Tos group), 2.64 (br, CH₂CH₂NHCOCH₂CH ₂ N), 2.83 (br, CH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N), 3.18 (br, NCH ₂ CH ₂ N (core) and Hδ of Arg), 3.33 (br, CH₂CH ₂ NHCOCH₂CH₂N and CONHCH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N (terminal)), 3.53 and 3.67 (m, Hδ of pro), 4.14 (m, Hα of Arg), 4.32 and 4.48 (m, Hα of Pro) and 7.40 and 7.75 (br, phenyl of Tos group). ¹ H NMR for the amino acid modified dendrimer (G3) modified with Ac-Pro / Ac-Arg (Tos): δ1.41 (s, Boc), 1.53-1.68 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.89 and 2.21 (br, Hβ), 1.97 (br, Hγ of Pro), 2.03 and 2.13 (s, C H ₃ CO), 2.42 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOC H ₂ CH ₂ N and C H ₃ of Tos group) , 2.64 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ C H ₂ N), 2.83 (br, C H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N), 3.18 (br, NC H ₂ C H ₂ N (core) and Hδ of Arg), 3.33 (br, CH ₂ C H ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N and CONHC H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N (terminal)), 3.53 and 3.67 (m, Hδ of pro), 4.14 (m, Hα of Arg), 4.32 and 4.48 (m, Hα of Pro) and 7.40 and 7.75 (br, phenyl of Tos group).

Ac-Pro/Ac-Arg(Tos)で修飾されたアミノ酸修飾デンドリマー（Ｇ４）についての¹H NMR: δ1.41 (s, Boc), 1.53-1.68 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.89 and 2.21 (br, Hβ), 1.97 (br, Hγ of Pro), 2.03 and 2.13 (s, CH ₃ CO), 2.42 (br, CH₂CH₂NHCOCH ₂ CH₂N and CH ₃ of Tos group), 2.64 (br, CH₂CH₂NHCOCH₂CH ₂ N), 2.83 (br, CH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N), 3.18 (br, NCH ₂ CH ₂ N (core) and Hδ of Arg), 3.33 (br, CH₂CH ₂ NHCOCH₂CH₂N and CONHCH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N (terminal)), 3.53 and 3.67 (m, Hδ of pro), 4.14 (m, Hα of Arg), 4.32 and 4.48 (m, Hα of Pro) and 7.40 and 7.75 (br, phenyl of Tos group). ¹ H NMR for the amino acid modified dendrimer (G4) modified with Ac-Pro / Ac-Arg (Tos): δ1.41 (s, Boc), 1.53-1.68 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.89 and 2.21 (br, Hβ), 1.97 (br, Hγ of Pro), 2.03 and 2.13 (s, C H ₃ CO), 2.42 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOC H ₂ CH ₂ N and C H ₃ of Tos group) , 2.64 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ C H ₂ N), 2.83 (br, C H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N), 3.18 (br, NC H ₂ C H ₂ N (core) and Hδ of Arg), 3.33 (br, CH ₂ C H ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N and CONHC H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N (terminal)), 3.53 and 3.67 (m, Hδ of pro), 4.14 (m, Hα of Arg), 4.32 and 4.48 (m, Hα of Pro) and 7.40 and 7.75 (br, phenyl of Tos group).

Ac-Alaで修飾されたアミノ酸修飾デンドリマー（Ｇ３）についての¹H NMR: δ1.35 (d, Hβ), 1.43 (s, Boc), 2.03 (s, CH ₃ CO), 2.42 (br, CH₂CH₂NHCOCH ₂ CH₂N), 2.65 (br, CH₂CH₂NHCOCH₂CH ₂ N), 2.84 (br, CH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N), 3.18 (br, NCH ₂ CH ₂ N (core)), 3.33 (br, CH₂CH ₂ NHCOCH₂CH₂N and CONHCH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N (terminal)), 4.21 (m, Hα).
Ac-Alaで修飾されたアミノ酸修飾デンドリマー（Ｇ４）についての¹H NMR: δ1.35 (d, Hβ), 1.43 (s, Boc), 2.03 (s, CH ₃ CO), 2.42 (br, CH₂CH₂NHCOCH ₂ CH₂N), 2.64 (br, CH₂CH₂NHCOCH₂CH ₂ N), 2.82 (br, CH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N), 3.17 (br, NCH ₂ CH ₂ N (core)), 3.32 (br, CH₂CH ₂ NHCOCH₂CH₂N and CONHCH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N (terminal)), 4.22 (m, Hα). ¹ H NMR for Ac-Ala modified amino acid modified dendrimer (G3): δ1.35 (d, Hβ), 1.43 (s, Boc), 2.03 (s, C H ₃ CO), 2.42 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOC H ₂ CH ₂ N), 2.65 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ C H ₂ N), 2.84 (br, C H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N), 3.18 (br, NC H ₂ C H ₂ N (core)), 3.33 (br, CH ₂ C H ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N and CONHC H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N (terminal)), 4.21 (m, Hα).
¹ H NMR for Ac-Ala modified amino acid modified dendrimer (G4): δ1.35 (d, Hβ), 1.43 (s, Boc), 2.03 (s, C H ₃ CO), 2.42 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOC H ₂ CH ₂ N), 2.64 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ C H ₂ N), 2.82 (br, C H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N), 3.17 (br, NC H ₂ C H ₂ N (core)), 3.32 (br, CH ₂ C H ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N and CONHC H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N (terminal)), 4.22 (m, Hα).

（４）標識アミノ酸修飾デンドリマーの作製
（３）で得られたアミノ酸修飾デンドリマーを、実施例１の（４）と同様にして、ＮＢＤで標識した。Ac-Pro/Ac-Arg(Tos)で修飾されたＧ３及びＧ４世代の標識デンドリマーの収率は、それぞれ８３及び８０％であった。これらにトリフルオロ酢酸、1.85ml、チオアニソール、0.222ml、トリフルオロメタンスルホン酸、0.02mlを加えて室温で8時間反応させることで、結合したアルギニンの保護基を除去した。反応混合物にエーテルを加えて再沈させた後、残渣にトリエチルアミン１ｍｌとメタノール１ｍｌを加え、溶離液としてメタノール（ＭｅＯＨ）を用いてSephadex LH-20カラムで精製したものを、最終生成物とした。一方、Ac-Alaで修飾されたＧ３及びＧ４世代の標識デンドリマーの収率は、それぞれ８３及び８５％であった。生成物を、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ₄ナトリウム塩含有Ｄ₂Ｏに溶解して¹Ｈ ＮＭＲで分析した。 (4) Preparation of labeled amino acid-modified dendrimer The amino acid-modified dendrimer obtained in (3) was labeled with NBD in the same manner as in (4) of Example 1. The yields of G3 and G4 generation labeled dendrimers modified with Ac-Pro / Ac-Arg (Tos) were 83 and 80%, respectively. To these were added trifluoroacetic acid, 1.85 ml, thioanisole, 0.222 ml, trifluoromethanesulfonic acid, 0.02 ml and reacted at room temperature for 8 hours to remove the protective group of the bound arginine. Ether was added to the reaction mixture to cause reprecipitation, and then 1 ml of triethylamine and 1 ml of methanol were added to the residue, and the product was purified by Sephadex LH-20 column using methanol (MeOH) as an eluent to obtain a final product. On the other hand, the yields of G3 and G4 generation dendrimers modified with Ac-Ala were 83 and 85%, respectively. The product was dissolved in D ₂ O containing 3- (trimethylsilyl) propionic acid-d ₄ sodium salt and analyzed by ¹ H NMR.

Ac-Pro/Ac-Argで修飾された標識デンドリマー（Ｇ３）についての¹H NMR: δ1.67-1.85 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.91-2.13 (br, Hβand Hγ of Pro), 1.99, 2.06 and 2.14 (s, CH ₃ CO), 2.47 (br, CH₂CH₂NHCOCH ₂ CH₂N), 2.73 (br, CH₂CH₂NHCOCH₂CH ₂ N), 2.90 (br, CH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N), 3.12 (br, NCH ₂ CH ₂ N (core)), 3.33 (br, CH₂CH ₂ NHCOCH₂CH₂N and CONHCH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N (terminal)), 3.51 (m, Hδ of Arg) and 3.66 (m, Hδ of Pro), 4.23 (m, Hα of Arg) and 4.34 and 4.50 (m, Hα of Pro). ¹ H NMR for a labeled dendrimer (G3) modified with Ac-Pro / Ac-Arg: δ1.67-1.85 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.91-2.13 (br, Hβand Hγ of Pro), 1.99 , 2.06 and 2.14 (s, C H ₃ CO), 2.47 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOC H ₂ CH ₂ N), 2.73 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ C H ₂ N), 2.90 (br, C H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N), 3.12 (br, NC H ₂ C H ₂ N (core)), 3.33 (br, CH ₂ C H ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N and CONHC H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N (terminal)), 3.51 (m, Hδ of Arg) and 3.66 (m, Hδ of Pro), 4.23 (m, Hα of Arg) and 4.34 and 4.50 (m, Hα of Pro).

Ac-Pro/Ac-Argで修飾された標識デンドリマー（Ｇ４）についての¹H NMR: δ1.65-1.84 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.92-2.13 (br, Hβand Hγ of Pro), 1.98, 2.05 and 2.13 (s, CH ₃ CO), 2.27 (br, CH₂CH₂NHCOCH ₂ CH₂N), 2.45 (br, CH₂CH₂NHCOCH₂CH ₂ N), 2.87 (br, CH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N), 3.21 (br, NCH ₂ CH ₂ N (core)), 3.33 (br, CH₂CH ₂ NHCOCH₂CH₂N and CONHCH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N (terminal)), 3.53 (m, Hδ of Arg) and 3.66 (m, Hδ of Pro), 4.24 (m, Hα of Arg) and 4.33 and 4.49 (m, Hα of Pro). ¹ H NMR for labeled dendrimer (G4) modified with Ac-Pro / Ac-Arg: δ1.65-1.84 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.92-2.13 (br, Hβand Hγ of Pro), 1.98 , 2.05 and 2.13 (s, C H ₃ CO), 2.27 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOC H ₂ CH ₂ N), 2.45 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ C H ₂ N), 2.87 (br, C H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N), 3.21 (br, NC H ₂ C H ₂ N (core)), 3.33 (br, CH ₂ C H ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N and CONHC H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N (terminal)), 3.53 (m, Hδ of Arg) and 3.66 (m, Hδ of Pro), 4.24 (m, Hα of Arg) and 4.33 and 4.49 (m, Hα of Pro).

Ac-Alaで修飾された標識デンドリマー（Ｇ３）についての¹H NMR: δ1.35 (d, Hβ), 2.03 (s, CH ₃ CO), 2.43 (br, CH₂CH₂NHCOCH ₂ CH₂N), 2.65 (br, CH₂CH₂NHCOCH₂CH ₂ N), 2.77 (br, CH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N), 3.08 (br, NCH ₂ CH ₂ N (core)), 3.32 (br, CH₂CH ₂ NHCOCH₂CH₂N and CONHCH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N (terminal)), and 4.22 (q, Hα).
Ac-Alaで修飾された標識デンドリマー（Ｇ４）についての¹H NMR: δ1.35 (d, Hβ), 2.04 (s, CH ₃ CO), 2.43 (br, CH₂CH₂NHCOCH ₂ CH₂N), 2.65 (br, CH₂CH₂NHCOCH₂CH ₂ N), 2.77 (br, CH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N), 3.08 (br, NCH ₂ CH ₂ N (core)), 3.32 (br, CH₂CH ₂ NHCOCH₂CH₂N and CONHCH ₂ CH₂NHCOCH₂CH₂N (terminal)), and 4.22 (q, Hα).
NBD部分に由来するシグナルは、その不溶性のためにNMRで検出されなかった。 ¹ H NMR for labeled dendrimer (G3) modified with Ac-Ala: δ1.35 (d, Hβ), 2.03 (s, C H ₃ CO), 2.43 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOC H ₂ CH ₂ N), 2.65 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ C H ₂ N), 2.77 (br, C H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N), 3.08 (br, NC H ₂ C H ₂ N (core)) , 3.32 (br, CH ₂ C H ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N and CONHC H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N (terminal)), and 4.22 (q, Hα).
¹ H NMR for labeled dendrimer (G4) modified with Ac-Ala: δ1.35 (d, Hβ), 2.04 (s, C H ₃ CO), 2.43 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOC H ₂ CH ₂ N), 2.65 (br, CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ C H ₂ N), 2.77 (br, C H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N), 3.08 (br, NC H ₂ C H ₂ N (core)) , 3.32 (br, CH ₂ C H ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N and CONHC H ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ N (terminal)), and 4.22 (q, Hα).
The signal derived from the NBD moiety was not detected by NMR due to its insolubility.

（５）結合アッセイ
最小の共通ペプチド配列Pro-X-X-Proを認識して結合することが知られているSrc-homology 3（ＳＨ３）ドメインを用いて、実施例２で作製した擬似ペプチドライブラリーが、ＳＨ３ドメインとの結合活性を有するかについて調べた。
ＧＳＴタグをＮ末端に融合したAmphiphysin (Bin1)のＳＨ３ドメイン（３７４番目から４５４番目までのアミノ酸）を、以下のようにして調製した。該当部分のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、pGEX-6P-1（Amersham Pharmacia）に組み込んだベクターで大腸菌（DH5α）を形質転換させた。次に、100mg/Lのアンピシリンを含む25mlのLuria-Bertani（LB）培地で一晩培養した大腸菌を500mlのLB培地で２時間培養し、続いて室温にてイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を1mMまで加えてさらに２時間培養した。遠心によって集菌し、細胞溶解バッファー（1% NP-40, 100mM EDTA, 1mM PMSF, 5μg/ml Apr, 2μg/ml Leu, 3μg/ml PepAを添加したリン酸緩衝食塩水(PBS)）に懸濁し、超音波照射によって細胞膜を粉砕した。このようにして得た細胞抽出液から、グルタチオンビーズを用いてＧＳＴ融合ＳＨ３ドメインを精製した。コントロールとして用いるためのＧＳＴ蛋白質は、pGEXベクターを用いて同様に作製した。 (5) Binding assay Using the Src-homology 3 (SH3) domain, which is known to recognize and bind to the smallest common peptide sequence Pro-XX-Pro, the pseudo peptide library prepared in Example 2 is It was investigated whether it has binding activity with the SH3 domain.
The SH3 domain (amino acids from 374th to 454th) of Amphiphysin (Bin1) fused with the GST tag at the N-terminus was prepared as follows. Escherichia coli (DH5α) was transformed with a vector in which the DNA encoding the amino acid sequence of the relevant portion was incorporated into pGEX-6P-1 (Amersham Pharmacia). Next, E. coli cultured overnight in 25 ml Luria-Bertani (LB) medium containing 100 mg / L ampicillin was cultured in 500 ml LB medium for 2 hours, followed by isopropyl-β-D-thiogalactopyra at room temperature. Noside (IPTG) was added to 1 mM and further cultured for 2 hours. Cells are collected by centrifugation and suspended in cell lysis buffer (phosphate buffered saline (PBS) supplemented with 1% NP-40, 100 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5 μg / ml Apr, 2 μg / ml Leu, 3 μg / ml PepA). It became cloudy and the cell membrane was crushed by ultrasonic irradiation. The GST-fused SH3 domain was purified from the cell extract thus obtained using glutathione beads. A GST protein for use as a control was similarly prepared using a pGEX vector.

Ac-Pro/Ac-Arg修飾標識デンドリマー（Ｇ３）又はAc-Ala修飾標識デンドリマー（Ｇ３）(500nmol)と、グルタチオンビーズに結合したＧＳＴ融合ＳＨ３ドメイン（10nmol）を、Trisバッファー中（20mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.005% Tween20）で4℃、2時間インキュベーションした。その後、ビーズをTrisバッファー1 mlで4回洗浄し、50％酢酸水溶液を200μl加え、2時間インキュベーションした。15000rpmで20分遠心し、上清の蛍光量(ex.450nm, em.530nm)を測定した。
比較として、GSTのみとアミノ酸修飾標識デンドリマーを用いて同様に結合実験を行った。 Ac-Pro / Ac-Arg modified labeled dendrimer (G3) or Ac-Ala modified labeled dendrimer (G3) (500 nmol) and GST fused SH3 domain (10 nmol) bound to glutathione beads in Tris buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.005% Tween20), and incubated at 4 ° C. for 2 hours. Thereafter, the beads were washed 4 times with 1 ml of Tris buffer, 200 μl of 50% aqueous acetic acid was added, and incubated for 2 hours. After centrifugation at 15000 rpm for 20 minutes, the fluorescence amount (ex. 450 nm, em. 530 nm) of the supernatant was measured.
For comparison, binding experiments were similarly performed using only GST and amino acid-modified labeled dendrimers.

結果を、図４に示す。縦軸は、結合率（×１０^-3）＝（測定された蛍光量）／（ＧＳＴ融合タンパク質を加えなかった（アミノ酸修飾標識デンドリマーのみ）場合の蛍光量）を示す。また、ＳＨ３−Ｐｒｏは、ＧＳＴ融合ＳＨ３ドメインとAc-Pro/Ac-Arg修飾標識デンドリマーとを混合した場合、ＳＨ３−Ａｌａは、ＧＳＴ融合ＳＨ３ドメインとAc-Ala修飾標識デンドリマーとを混合した場合、ＧＳＴ−Ｐｒｏは、ＧＳＴタンパク質とAc-Pro/Ac-Arg修飾標識デンドリマーとを混合した場合、ＧＳＴ−Ａｌａは、ＧＳＴタンパク質とAc-Ala修飾標識デンドリマーとを混合した場合の結果を示す。
この結果から、本発明のアミノ酸修飾デンドリマーの混合物からなる擬似ペプチドライブラリーは、標的分子に結合する能力を有する擬似ペプチドを含むことがわかる。 The results are shown in FIG. The vertical axis represents the binding rate (× 10 ⁻³ ) = (measured fluorescence) / (fluorescence when no GST fusion protein was added (amino acid-modified dendrimer only)). Further, when SH3-Pro is mixed with a GST-fused SH3 domain and an Ac-Pro / Ac-Arg modified labeled dendrimer, SH3-Ala is when a GST-fused SH3 domain is mixed with an Ac-Ala modified labeled dendrimer, GST-Pro shows the results when GST protein and Ac-Pro / Ac-Arg modified labeled dendrimer are mixed, and GST-Ala shows the results when GST protein and Ac-Ala modified labeled dendrimer are mixed.
From this result, it can be seen that the pseudopeptide library comprising the mixture of the amino acid-modified dendrimers of the present invention contains a pseudopeptide having the ability to bind to the target molecule.

末端基に異なる混合比でアラニンとフェニルアラニンを結合させたアミノ酸修飾デンドリマー（Boc保護PAMAMデンドロン（Ｇ３世代））の¹H NMRスペクトルである。A ¹ H NMR spectrum in different mixing ratios to the end groups were bound alanine and phenylalanine amino acid modifications dendrimer (Boc protection PAMAM dendron (G3 generation)). 末端基に異なる混合比でアラニンとフェニルアラニンを結合させた蛍光標識アミノ酸修飾デンドリマー（PAMAMデンドロン（Ｇ３世代））の¹H NMRスペクトルである。It is a ¹ H NMR spectrum of a fluorescence-labeled amino acid-modified dendrimer (PAMAM dendron (G3 generation)) in which alanine and phenylalanine are bonded to the terminal group at different mixing ratios. 異なる混合比で混合したアラニンとフェニルアラニンを用いて作製した本発明の擬似ペプチドライブラリーのＨＰＬＣのチャートである。It is a HPLC chart of the pseudo peptide library of the present invention prepared using alanine and phenylalanine mixed at different mixing ratios. 本発明の擬似ペプチドライブラリーと、ＧＳＴ融合ＳＨ３ドメインとの結合実験の結果を示す棒グラフである。It is a bar graph which shows the result of the binding experiment of the pseudo peptide library of this invention, and a GST fusion SH3 domain.

Claims (4)

デンドリマー及びその誘導体の末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの２種以上の混合物からなる擬似ペプチドライブラリー。   A pseudo-peptide library comprising a mixture of two or more amino acid-modified dendrimers in which the terminal groups of the dendrimer and its derivatives are modified with the same or different amino acid molecules. 前記デンドリマーが、ポリアミドアミンデンドリマーである請求項１に記載の擬似ペプチドライブラリー。   The pseudo peptide library according to claim 1, wherein the dendrimer is a polyamidoamine dendrimer. 前記アミノ酸修飾デンドリマーが、標識物質と結合している請求項１又は２に記載の擬似ペプチドライブラリー。   The pseudo peptide library according to claim 1 or 2, wherein the amino acid-modified dendrimer is bound to a labeling substance. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の擬似ペプチドライブラリーを、標的分子と接触させ、標的分子と結合したアミノ酸修飾デンドリマーを検出する工程を含む、標的分子に結合可能なアミノ酸修飾デンドリマーを検出する方法。   An amino acid modified dendrimer capable of binding to a target molecule, comprising the step of contacting the pseudopeptide library according to any one of claims 1 to 3 with the target molecule and detecting the amino acid modified dendrimer bound to the target molecule. How to detect.

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