JP2009096766A - Composition comprising compound promoting nucleic acid synthesis and utilization thereof, and method for producing the compound - Google Patents
Composition comprising compound promoting nucleic acid synthesis and utilization thereof, and method for producing the compound Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009096766A JP2009096766A JP2007270700A JP2007270700A JP2009096766A JP 2009096766 A JP2009096766 A JP 2009096766A JP 2007270700 A JP2007270700 A JP 2007270700A JP 2007270700 A JP2007270700 A JP 2007270700A JP 2009096766 A JP2009096766 A JP 2009096766A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- alkynylene
- alkenylene
- contain
- arylene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Abstract
Description
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応法（以下「ＰＣＲ法」という）をはじめとする核酸合成法において、核酸合成効率を向上させることができる化合物を含む組成物、および当該組成物を用いた核酸の変性方法、核酸の合成方法、並びに当該化合物の効率的な製造方法に関する。 The present invention relates to a composition comprising a compound capable of improving the efficiency of nucleic acid synthesis in a nucleic acid synthesis method including a polymerase chain reaction method (hereinafter referred to as “PCR method”), and denaturation of nucleic acid using the composition. The present invention relates to a method, a nucleic acid synthesis method, and an efficient production method of the compound.
ＰＣＲ法をはじめとする核酸合成法は、分子生物学のみならず、臨床検査、ＤＮＡ鑑定、食品分析などの様々な分野においてきわめて有用な技術である。例えば、ＰＣＲ法については例えば非特許文献１に記載されている。 Nucleic acid synthesis methods such as the PCR method are extremely useful techniques not only in molecular biology but also in various fields such as clinical examination, DNA analysis, and food analysis. For example, the PCR method is described in Non-Patent Document 1, for example.
ＰＣＲ法は、(1)一般的には約９０〜１００℃における鋳型ＤＮＡの熱変性、(2)約３７〜７５℃における鋳型ＤＮＡとプライマーとのアニーリング、および(3)約５５〜８０℃におけるプライマーの伸長反応からなる反応サイクルを繰り返すことで、プライマーに区切られた領域のＤＮＡを高度に増幅する技術である。 PCR methods include (1) thermal denaturation of template DNA generally at about 90-100 ° C, (2) annealing of template DNA and primers at about 37-75 ° C, and (3) at about 55-80 ° C. This is a technique for highly amplifying DNA in a region delimited by primers by repeating a reaction cycle consisting of primer extension reactions.
ところでＤＮＡの熱安定性は２つの塩基対（Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）−Ｃ（シトシン））の含量に依存して変化することが知られている。ＧＣ含量が増大するとその熱安定性は高くなる、つまり融解温度が高くなることが一般的に知られている。 By the way, it is known that the heat stability of DNA changes depending on the contents of two base pairs (A (adenine) -T (thymine), G (guanine) -C (cytosine)). It is generally known that as the GC content increases, its thermal stability increases, that is, its melting temperature increases.
このようにＧＣ含量が高いＤＮＡ領域をＰＣＲ法によって増幅する場合、融解温度が熱変性温度よりも高い場合がある。かかる場合、通常の熱変性温度では鋳型ＤＮＡの熱変性が十分に起こらない。また熱変性温度をいたずらに高くすれば、ＤＮＡポリメラーゼが失活してしまう。よって、ＧＣ含量の高いＤＮＡ領域を、ＰＣＲ法で増幅することは困難な場合が多々見られた。特に鋳型ＤＮＡとして用いられるゲノムＤＮＡ上にはＧＣ含量が高い領域が多く、かかる領域を増幅することは困難であった。 When a DNA region having a high GC content is amplified by the PCR method, the melting temperature may be higher than the heat denaturation temperature. In this case, the heat denaturation of the template DNA does not occur sufficiently at the normal heat denaturation temperature. Further, if the heat denaturation temperature is increased unnecessarily, the DNA polymerase is deactivated. Therefore, it was often difficult to amplify a DNA region having a high GC content by PCR. In particular, there are many regions having a high GC content on the genomic DNA used as the template DNA, and it has been difficult to amplify such regions.
上記問題点を解決するために、これまでに耐熱性のＤＮＡポリメラーゼが種々開発され利用されている。また、上記問題を解決するために、高いＧＣ含量のＤＮＡ領域の融解温度を低下させるための添加剤（「融解温度調整剤」という）が種々開発され、利用されるようになった。ここで上記融解温度調整剤としては、グリシンベタイン、メチルグリシン、サルコシン、グリシン、プロリン、グリセロール、エクトイン、アミン−Ｎ−オキシド、スルホキシド（ＤＭＳＯなど）、多糖、ＰＥＧ、非イオン性界面活性剤（Tween20、NP40など）、アミド（ＤＭＦ、ホルムアミドなど）、カルボン酸誘導体（クエン酸、シュウ酸など）、ＳＳＢタンパク質、ＢＳＡなどが報告されている。これらの融解温度調整剤は、単独または混合物として、ＰＣＲの反応バッファー中へ調整剤に固有の最適濃度となるように（例えばグリシンベタインの場合、０．５〜３．０Ｍの濃度となるように）添加される。そして、ＤＮＡの融解温度を熱変性温度以下に降下させている。例えば、特許文献１〜５には、核酸合成の反応溶液中に上記で例示した各種融解温度調整剤を添加することが開示されている。融解温度調整剤としては、グリシンベタインが一般的に利用されている。
しかし、ホルムアミド、ＤＭＳＯなどの溶剤系融解温度調整剤は融解温度を降下させる効果が比較的高い。ただし、それと同時にＤＮＡポリメラーゼを失活させてしまうという問題点を溶剤系融解温度調整剤は有している。よって結果として、ＧＣ含量高いＤＮＡ領域を合成することは依然困難な場合が多い。また、グリセロール、エクトイン、グリシンベタイン、ポリエチレングリコールなどの非溶剤系融解温度調整剤はＤＮＡポリメラーゼを失活させることはほとんどないが、融解温度を降下させる効果が低いという問題点を有しており、非溶剤系融解温度調整剤を高濃度添加しなければならない。また融解温度調整剤を種々混合する場合であっても、融解温度を効果的に降下させるために、ＤＮＡやポリメラーゼ等の反応条件に応じて、融解温度調整剤の配合割合を変化させなければならない。よって従来公知の融解温度調整剤は、十分に満足が得られるものではなかった。 However, solvent-based melting temperature adjusting agents such as formamide and DMSO have a relatively high effect of lowering the melting temperature. However, the solvent-based melting temperature adjusting agent has a problem that DNA polymerase is deactivated at the same time. As a result, it is still often difficult to synthesize DNA regions with high GC content. In addition, non-solvent melting temperature adjusting agents such as glycerol, ectoine, glycine betaine, and polyethylene glycol hardly inactivate DNA polymerase, but have a problem that the effect of lowering the melting temperature is low. A non-solvent melting temperature regulator must be added at a high concentration. Even when various melting temperature adjusting agents are mixed, in order to effectively lower the melting temperature, the blending ratio of the melting temperature adjusting agent must be changed according to the reaction conditions such as DNA and polymerase. . Therefore, the conventionally known melting temperature adjusting agent has not been sufficiently satisfactory.
ところで、グリシンベタインをはじめとするベタインは、双性イオン化合物であるため、極性が高くベタインを液相で合成しても分離精製が極めて困難である。例えば、ベタインの液相合成については非特許文献２および３に記載されている。よってベタインは、固相合成で製造されている（例えば非特許文献４および５参照）。そのため、ベタインを大量に合成することができないという問題点もある。
さらに本発明は上記化合物の効率的な製造方法を提供することを目的とした。より具体的には効率的なベタインをはじめとする双性イオン化合物の製造方法を本発明は提供する。 Furthermore, this invention aimed at providing the efficient manufacturing method of the said compound. More specifically, the present invention provides an efficient method for producing zwitterionic compounds including betaine.
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、特定の構造を有するベタインが融解温度調整剤として顕著に優れているということを本発明者らが発見し、本発明を完成させるに至った。さらに、本発明者らはベタインをはじめとする双性イオン化合物を簡便かつ効率的に製造できる方法を見出すことに成功した。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。 The present inventors have intensively studied to solve the above problems. As a result, the present inventors have found that betaine having a specific structure is remarkably excellent as a melting temperature adjusting agent, and has completed the present invention. Furthermore, the present inventors have succeeded in finding a method capable of easily and efficiently producing zwitterionic compounds including betaine. That is, the present invention includes the following inventions.
本発明にかかる組成物は、核酸を合成する際に使用される組成物であって、
当該組成物が、以下の一般式（１）および一般式（２）で表される化合物からなる群から選択される１つ以上の化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴としている：
The composition according to the present invention is a composition used when synthesizing nucleic acids,
The composition contains one or more compounds selected from the group consisting of the compounds represented by the following general formula (1) and general formula (2), or salts or derivatives thereof:
ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ａ1は長周期型周期表における５Ｂ族元素、かつ、
Ｚ1は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表し、かつ、
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である；
Here, R 1 , R 2 , and R 3 are independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and an aryl group, excluding hydrogen, and may be the same or different The alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group is a group that may contain a functional group, and
R 6 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, or arylene group is a group that may contain a functional group, and
A 1 is a group 5B element in the long-period periodic table, and
Z 1 represents —COO, —SO 3 , —NO 3 , or —HPO 4 , and
Satisfy one or more of the following (I) or (II):
(I) any one or more of R 1 , R 2 , and R 3 is a group having 2 or more carbon atoms,
(II) R 6 is a group having 3 or more carbon atoms;
ここで、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ15およびＲ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、また２つのＲ16は同一であっても異なっていてもよく、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ａ11およびＡ12は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、同一であっても異なっていてもよく、かつ、
Ｚ11は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表し、２つのＺ11は同一であっても異なっていてもよく、かつ、
下記の（III）または（IV）の１つ以上を満たす：
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。
Here, R 11 , R 12 , R 13 , and R 14 are independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and an aryl group, excluding hydrogen, and are the same or different. And the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group is a group that may contain a functional group, and
R 15 and R 16 are independently selected from the group consisting of an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, and an arylene group, and may be the same or different, and two R 16 are the same. And the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, and arylene group are groups that may contain a functional group, and
A 11 and A 12 represent Group 5B elements in the long-period periodic table, which may be the same or different, and
Z 11 represents —COO, —SO 3 , —NO 3 , or —HPO 4 , and two Z 11 may be the same or different, and
Satisfy one or more of the following (III) or (IV):
(III) any one or more of R 11 , R 12 , R 13 and R 14 is a group having 2 or more carbon atoms,
(IV) Any one or more of R 15 and R 16 is a group having 3 or more carbon atoms.
また本発明にかかる組成物は、核酸を合成する際に使用される組成物であって、
当該該組成物が、以下の一般式（１’）および一般式（２’）で表される化合物からなる群から選択される１つ以上の化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴とする組成物であってもよい：
The composition according to the present invention is a composition used when synthesizing a nucleic acid,
The composition comprises one or more compounds selected from the group consisting of compounds represented by the following general formula (1 ′) and general formula (2 ′), or salts or derivatives thereof: The composition may be:
ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である；
Here, R 1 , R 2 , and R 3 are independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and an aryl group, excluding hydrogen, and may be the same or different The alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group is a group that may contain a functional group, and
R 6 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, or arylene group is a group that may contain a functional group, and
Satisfy one or more of the following (I) or (II):
(I) any one or more of R 1 , R 2 , and R 3 is a group having 2 or more carbon atoms,
(II) R 6 is a group having 3 or more carbon atoms;
ここで、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ15およびＲ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、また２つのＲ16は同一であっても異なっていてもよく、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
下記の（III）または（IV）の１つ以上を満たす：
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。
Here, R 11 , R 12 , R 13 , and R 14 are independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and an aryl group, excluding hydrogen, and are the same or different. And the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group is a group that may contain a functional group, and
R 15 and R 16 are independently selected from the group consisting of an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, and an arylene group, and may be the same or different, and two R 16 are the same. And the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, and arylene group are groups that may contain a functional group, and
Satisfy one or more of the following (III) or (IV):
(III) any one or more of R 11 , R 12 , R 13 and R 14 is a group having 2 or more carbon atoms,
(IV) Any one or more of R 15 and R 16 is a group having 3 or more carbon atoms.
また本発明にかかる組成物は、上記Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14が、末端に極性官能基を含まない基であることが好ましい。 In the composition according to the present invention, R 1 , R 2 , R 3 , R 11 , R 12 , R 13 , and R 14 are preferably groups that do not contain a polar functional group at the terminal.
また本発明にかかるキットは、核酸を合成する際に使用されるキットであって、上記本発明にかかる組成物を含むことを特徴としている。 Moreover, the kit concerning this invention is a kit used when synthesize | combining a nucleic acid, Comprising: It is characterized by including the composition concerning the said invention.
また本発明にかかる核酸の熱変性方法は、上記本発明にかかる組成物と核酸とを少なくとも含む混合物を、加熱する工程を含むことを特徴としている。 The nucleic acid thermal denaturation method according to the present invention is characterized by including a step of heating a mixture containing at least the composition according to the present invention and the nucleic acid.
また本発明にかかる核酸の合成方法は、上基本発明にかかる組成物、鋳型となる核酸分子、核酸合成酵素、少なくとも一対のプライマー、および１種類以上のヌクレオチドを少なくとも含む混合物を、加熱する工程を含むことを特徴としている。 The method for synthesizing a nucleic acid according to the present invention includes a step of heating the composition according to the above basic invention, a nucleic acid molecule to be a template, a nucleic acid synthase, at least a pair of primers, and at least one kind of nucleotides. It is characterized by including.
また本発明にかかる核酸の合成方法は、ポリメラーゼ連鎖反応により行われることが好ましい。 The nucleic acid synthesis method according to the present invention is preferably carried out by polymerase chain reaction.
一方、本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、以下の一般式（３）で表される化合物と一般式（４）で表される化合物とを、エステル系溶媒の存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴としている： On the other hand, in the method for producing a zwitterionic compound according to the present invention, a compound represented by the following general formula (3) and a compound represented by the general formula (4) are reacted in the presence of an ester solvent. It is characterized by including reaction steps:
ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、Ａ1は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、； Here, R 1 , R 2 , and R 3 are independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and an aryl group, excluding hydrogen, and may be the same or different , The alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group is a group that may contain a functional group, A 1 represents a Group 5B element in the long-period periodic table;
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ1はハロゲンを表し、
Ｚ1は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表す。
R 6 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, or arylene group is a group that may contain a functional group,
R 7 is an alkyl group, an aryl group, an alkenyl group, or an alkynyl group, and X 1 represents a halogen,
Z 1 represents —COO, —SO 3 , —NO 3 , or —HPO 4 .
また本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、以下の一般式（３）で表される化合物と一般式（４）で表される化合物とを、エステル系溶媒の存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴としている： In addition, the method for producing a zwitterionic compound according to the present invention includes a reaction in which a compound represented by the following general formula (3) and a compound represented by the general formula (4) are reacted in the presence of an ester solvent. It is characterized by including steps:
ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、Ａ1は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、； Here, R 1 , R 2 , and R 3 are independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and an aryl group, excluding hydrogen, and may be the same or different , The alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group is a group that may contain a functional group, A 1 represents a Group 5B element in the long-period periodic table;
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ1は、ハロゲンを表し、Ｚ1は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表し、
さらに下記の（I）または（II）の１つ以上の条件を満たす：
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である。
R 6 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, or arylene group is a group that may contain a functional group,
R 7 is an alkyl group, aryl group, alkenyl group, or alkynyl group, and X 1 represents halogen, Z 1 represents —COO, —SO 3 , —NO 3 , or —HPO 4 ;
Furthermore, one or more of the following conditions (I) or (II) is satisfied:
(I) any one or more of R 1 , R 2 , and R 3 is a group having 2 or more carbon atoms,
(II) R 6 is a group having 3 or more carbon atoms.
また上記本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、上記エステル系溶媒が酢酸エチルであることが好ましい。 In the method for producing a zwitterionic compound according to the present invention, the ester solvent is preferably ethyl acetate.
また本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、以下の一般式（５）で表される化合物と、一般式（６）で表される化合物とを、アルコールの存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴としている： Moreover, the manufacturing method of the zwitterionic compound concerning this invention is a reaction process with which the compound represented by the following General formula (5) and the compound represented by General formula (6) are made to react in presence of alcohol. It is characterized by including:
ここで、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、Ａ11およびＡ12は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、同一であっても異なっていてもよく；
Here, R 11 , R 12 , R 13 , and R 14 are independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and an aryl group, excluding hydrogen, and are the same or different. And the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group is a group that may contain a functional group, and
R 15 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, and arylene group are groups that may contain a functional group, and A 11 and A 12 Represents a group 5B element in the long-period periodic table, which may be the same or different;
Ｒ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ11はハロゲンを表し、
Ｚ11は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表す。
R 16 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, and arylene group are groups that may contain a functional group,
R 17 is an alkyl group, aryl group, alkenyl group, or alkynyl group, and X 11 represents halogen,
Z 11 represents —COO, —SO 3 , —NO 3 , or —HPO 4 .
また本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、以下の一般式（５）で表される化合物と、一般式（６）で表される化合物とを、アルコールの存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴とする双性イオン化合物の製造方法： Moreover, the manufacturing method of the zwitterionic compound concerning this invention is a reaction process with which the compound represented by the following General formula (5) and the compound represented by General formula (6) are made to react in presence of alcohol. A method for producing a zwitterionic compound comprising:
ここで、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ａ11およびＡ12は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、同一であっても異なっていてもよく；
Here, R 11 , R 12 , R 13 , and R 14 are independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and an aryl group, excluding hydrogen, and are the same or different. And the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group is a group that may contain a functional group, and
R 15 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, and arylene group are groups that may contain a functional group,
A 11 and A 12 represent Group 5B elements in the long-period periodic table, which may be the same or different;
Ｒ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、
Ｘ11は、ハロゲンを表し、
Ｚ11は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表し、
さらに下記の（III）または（IV）の１つ以上を満たす：
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。
R 16 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, and arylene group are groups that may contain a functional group,
R 17 is an alkyl group, an aryl group, an alkenyl group, or an alkynyl group,
X 11 represents halogen,
Z 11 represents —COO, —SO 3 , —NO 3 , or —HPO 4 ;
Furthermore, one or more of the following (III) or (IV) is satisfied:
(III) any one or more of R 11 , R 12 , R 13 and R 14 is a group having 2 or more carbon atoms,
(IV) Any one or more of R 15 and R 16 is a group having 3 or more carbon atoms.
また本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、上記アルコールがエタノールであることが好ましい。 In the method for producing a zwitterionic compound according to the present invention, the alcohol is preferably ethanol.
また上記本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、上記反応工程によって得られた沈殿物から双性イオン化合物を精製する工程を含む方法であってもよい。 The method for producing a zwitterionic compound according to the present invention may be a method including a step of purifying the zwitterionic compound from the precipitate obtained by the reaction step.
一方、本発明にかかるベタインの製造方法は、以下の一般式（３’）で表される化合物と一般式（４’）で表される化合物とを、エステル系溶媒の存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴としている： On the other hand, the method for producing betaine according to the present invention comprises reacting a compound represented by the following general formula (3 ′) with a compound represented by the general formula (4 ′) in the presence of an ester solvent. It is characterized by including steps:
ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり； Here, R 1 , R 2 , and R 3 are independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and an aryl group, excluding hydrogen, and may be the same or different The alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group is a group that may contain a functional group;
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ1はハロゲンを表す。
R 6 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, or arylene group is a group that may contain a functional group,
R 7 is an alkyl group, an aryl group, an alkenyl group, or an alkynyl group, and X 1 represents a halogen.
また本発明にかかるベタインの製造方法は、以下の一般式（３’）で表される化合物と一般式（４’）で表される化合物とを、エステル系溶媒の存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴とする方法であってもよい： Moreover, the method for producing betaine according to the present invention includes a reaction step in which a compound represented by the following general formula (3 ′) and a compound represented by the general formula (4 ′) are reacted in the presence of an ester solvent. It may be a method characterized by including:
ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり； Here, R 1 , R 2 , and R 3 are independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and an aryl group, excluding hydrogen, and may be the same or different The alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group is a group that may contain a functional group;
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ1は、ハロゲンを表し、
さらに下記の（I）または（II）の１つ以上の条件を満たす：
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である。
R 6 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, or arylene group is a group that may contain a functional group,
R 7 is an alkyl group, aryl group, alkenyl group, or alkynyl group, and X 1 represents halogen,
Furthermore, one or more of the following conditions (I) or (II) is satisfied:
(I) any one or more of R 1 , R 2 , and R 3 is a group having 2 or more carbon atoms,
(II) R 6 is a group having 3 or more carbon atoms.
また上記本発明にかかるベタインの製造方法は、上記エステル系溶媒が酢酸エチルであることが好ましい。 In the method for producing betaine according to the present invention, the ester solvent is preferably ethyl acetate.
また本発明にかかるベタインの製造方法は、以下の一般式（５’）で表される化合物と、一般式（６’）で表される化合物とを、アルコールの存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴とする方法であってもよい： Moreover, the method for producing betaine according to the present invention comprises a reaction step of reacting a compound represented by the following general formula (5 ′) with a compound represented by the general formula (6 ′) in the presence of an alcohol. It may be a method characterized by including:
ここで、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり；
Here, R 11 , R 12 , R 13 , and R 14 are independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and an aryl group, excluding hydrogen, and are the same or different. And the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group is a group that may contain a functional group, and
R 15 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, and arylene group are groups that may contain a functional group;
Ｒ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ11は、ハロゲンを表す。
R 16 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, and arylene group are groups that may contain a functional group,
R 17 represents an alkyl group, an aryl group, an alkenyl group, or an alkynyl group, and X 11 represents a halogen.
また本発明にかかるベタインの製造方法は、以下の一般式（５’）で表される化合物と、一般式（６’）で表される化合物とを、アルコールの存在下で反応させる反応工程を含む方法であってもよい： Moreover, the method for producing betaine according to the present invention comprises a reaction step of reacting a compound represented by the following general formula (5 ′) with a compound represented by the general formula (6 ′) in the presence of an alcohol. The method may include:
ここで、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり；
Here, R 11 , R 12 , R 13 , and R 14 are independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and an aryl group, excluding hydrogen, and are the same or different. And the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group is a group that may contain a functional group, and
R 15 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, and arylene group are groups that may contain a functional group;
Ｒ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、
Ｘ11は、ハロゲンを表し、
さらに下記の（III）または（IV）の１つ以上を満たす：
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。
R 16 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group, and the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, and arylene group are groups that may contain a functional group,
R 17 is an alkyl group, an aryl group, an alkenyl group, or an alkynyl group,
X 11 represents halogen,
Furthermore, one or more of the following (III) or (IV) is satisfied:
(III) any one or more of R 11 , R 12 , R 13 and R 14 is a group having 2 or more carbon atoms,
(IV) Any one or more of R 15 and R 16 is a group having 3 or more carbon atoms.
また上記本発明にかかるベタインの製造方法は、上記アルコールがエタノールであることが好ましい。 In the method for producing betaine according to the present invention, the alcohol is preferably ethanol.
また本発明にかかるベタインの製造方法は、上記反応工程によって得られた沈殿物からベタインを精製する工程を含む方法であってもよい。 Moreover, the method of producing betaine according to the present invention may include a step of purifying betaine from the precipitate obtained by the reaction step.
上記本発明にかかる組成物は、ＤＮＡの融解温度を低下させる効果に関し、融解温度調整剤として一般的に利用されており、かつその効果が高いとされているグリシンベタインと比較して１０倍以上の効果を奏するものである。また本発明の組成物は、タンパク質の高次構造に影響を与えない、すなわちタンパク質を変性させないものである。よって、本発明にかかる組成物を用いることによって、ＰＣＲ等の核酸合成の反応液中に対する融解温度調整剤の添加量を少なくすることができる。また、本発明にかかる組成物はＤＮＡポリメラーゼ等の核酸合成酵素を失活させないために、核酸合成反応を効率よく、継続的に行うことができる。 The composition according to the present invention is 10 times or more compared to glycine betaine which is generally used as a melting temperature adjusting agent and is considered to be highly effective with respect to the effect of lowering the melting temperature of DNA. The effect of this is achieved. The composition of the present invention does not affect the higher order structure of the protein, that is, does not denature the protein. Therefore, by using the composition according to the present invention, the amount of the melting temperature adjusting agent added to the reaction solution for nucleic acid synthesis such as PCR can be reduced. In addition, since the composition according to the present invention does not inactivate nucleic acid synthesizing enzymes such as DNA polymerase, the nucleic acid synthesis reaction can be carried out efficiently and continuously.
したがって、本発明によれば、これまで困難であったＧＣ含量の高い核酸領域を熱変性させることが可能となり、当該ＧＣ含量の高い核酸領域を効率よく合成することができるという効果を享受できる。 Therefore, according to the present invention, a nucleic acid region having a high GC content, which has been difficult until now, can be thermally denatured, and the effect of efficiently synthesizing a nucleic acid region having a high GC content can be enjoyed.
また本発明にかかる分子内に１組の双性イオンを持つ双性イオン化合物（例えばベタイン）の製造方法は、反応溶媒として酢酸エチルをはじめとするエステル系溶媒を用いて行うことを特徴としている。そうすることで、前駆体（例えばベタイン前駆体）が生成と共に沈殿する。それゆえ、前駆体（例えばベタイン前駆体）を濾過のみで簡便に分離精製することができる。さらに前駆体（例えばベタイン前駆体）を水に溶解させ、陰イオン交換樹脂に通過させて乾燥させると、目的物である双性イオン化合物（例えばベタイン）へ定量的に転化することができる。 In addition, the method for producing a zwitterionic compound (for example, betaine) having a pair of zwitterions in the molecule according to the present invention is characterized by using an ester solvent such as ethyl acetate as a reaction solvent. . By doing so, precursors (eg betaine precursors) precipitate with formation. Therefore, a precursor (for example, a betaine precursor) can be easily separated and purified only by filtration. Further, when a precursor (for example, a betaine precursor) is dissolved in water, passed through an anion exchange resin and dried, it can be quantitatively converted into a target zwitterionic compound (for example, betaine).
また本発明にかかる分子内に２組の双性イオンを持つ双性イオン化合物（例えばベタイン）の製造方法は、反応溶媒としてアルコール（例えばエタノール）を用いて行うことを特徴としている。そうすることで、反応中間体であるモノ付加体が沈殿することなく、反応の進行と共に目的物である前駆体（例えばベタイン前駆体）のみが沈殿する。その後、前駆体（例えばベタイン前駆体）を水に溶解させ、陰イオン交換樹脂に通過させ乾燥させると、目的物である双性イオン化合物（例えばベタイン）へ定量的に転化することができる。それゆえ、目的物である双性イオン化合物（例えばベタイン）を簡便に分離精製することができる。 In addition, the method for producing a zwitterionic compound (for example, betaine) having two pairs of zwitterions in the molecule according to the present invention is characterized by using an alcohol (for example, ethanol) as a reaction solvent. By doing so, only the precursor (for example, betaine precursor) which is a target object precipitates with the progress of reaction, without the monoadduct which is a reaction intermediate precipitating. Then, when a precursor (for example, a betaine precursor) is dissolved in water, passed through an anion exchange resin and dried, it can be quantitatively converted into a target zwitterionic compound (for example, betaine). Therefore, the target zwitterionic compound (for example, betaine) can be easily separated and purified.
したがって、本発明にかかる双性イオン化合物（例えばベタイン）の製造方法によれば、これまで大量製造が困難であった双性イオン化合物（例えばベタイン）を簡便かつ効率的に製造することができるという効果を享受することができる。 Therefore, according to the method for producing a zwitterionic compound (for example, betaine) according to the present invention, it is possible to easily and efficiently produce a zwitterionic compound (for example, betaine), which has been difficult to mass-produce until now. You can enjoy the effect.
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りである。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り「☆☆〜★★」は、「☆☆以上、★★以下」を意味する。 An embodiment of the present invention will be described as follows. However, the present invention is not limited to this, and can be implemented in a mode in which various modifications are made within the described range. Moreover, all the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated herein by reference. Unless otherwise specified in this specification, “☆☆ to ★★” means “more than or equal to ☆☆ and less than or equal to ★★”.
＜本発明にかかる組成物＞
本発明にかかる組成物は、核酸を合成する際に使用される組成物に関する。ここで「核酸を合成する」とは、ＰＣＲをはじめとする核酸増幅、逆転写反応、および塩基配列決定反応等の核酸合成反応を意味する。また上記「核酸」にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ただし本発明にかかる組成物は、これまで融解温度が高いことが原因でＰＣＲ等の合成反応が困難であった核酸の融解温度を低下させることを原理として効果を奏するものであるため、本発明の説明における「核酸」は特に二本鎖を意味する。また本発明にかかる組成物は、特にＧＣ含量の高い核酸を合成する際に有効である。ここで「ＧＣ含量が高い」とは、ＧＣ含量が５０％以上、より好ましくは６０％以上であることを意味する。
<Composition according to the present invention>
The composition concerning this invention is related with the composition used when synthesize | combining a nucleic acid. Here, “synthesize nucleic acid” means nucleic acid synthesis reaction such as nucleic acid amplification including PCR, reverse transcription reaction, and base sequence determination reaction. The “nucleic acid” includes DNA and RNA. However, the composition according to the present invention is effective on the principle of lowering the melting temperature of nucleic acid, which has been difficult to carry out synthesis reactions such as PCR, because of its high melting temperature. In the description of “Nucleic acid”, it particularly means a double strand. The composition according to the present invention is particularly effective when synthesizing a nucleic acid having a high GC content. Here, “the GC content is high” means that the GC content is 50% or more, more preferably 60% or more.
本発明にかかる組成物は、既述の一般式（１）および一般式（２）で表される化合物からなる群から選択される１つ以上の化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含む組成物である。一般式（１）および（２）で表される化合物は、その構造から双性イオン化合物であることがわかる。特に記述の一般式（１’）および一般式（２’）で表される化合物は、ベタインに属することがわかる。なお、一般に「グリシンベタイン＝トリメチルグリシン」のことを単に「ベタイン」と称する場合があるが、本発明の説明においては「グリシンベタイン＝トリメチルグリシン」を「ベタイン」の下位概念であるとして、それぞれを区別する。 The composition according to the present invention is a composition comprising one or more compounds selected from the group consisting of the compounds represented by the general formula (1) and the general formula (2), or salts or derivatives thereof. It is. It can be seen that the compounds represented by the general formulas (1) and (2) are zwitterionic compounds from their structures. In particular, it can be seen that the compounds represented by the general formula (1 ') and the general formula (2') described belong to betaine. In general, “glycine betaine = trimethylglycine” is sometimes simply referred to as “betaine”, but in the description of the present invention, “glycine betaine = trimethylglycine” is a subordinate concept of “betaine”. Distinguish.
一般式（１）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択される基である。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は全て同一であっても、異なっていてもよい。また上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基には、エーテル、エステル、カルボニル、アミド、アミノ、ハロ、ニトロ、ニトリル、スルホン、スルフィド等の官能基が含まれていてもよい。ただし、上記Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3の末端には、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン酸基、リン酸基、アミド基、エポキシ基をはじめとする極性官能基が含まれないことが好ましい。上記Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3の末端に極性官能基が含まれない方が、核酸の融解温度を降下させる効果が高い場合があるからである。 In the general formula (1), R 1 , R 2 , and R 3 are groups independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and an aryl group, excluding hydrogen. R 1 , R 2 and R 3 may all be the same or different. The alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group may contain functional groups such as ether, ester, carbonyl, amide, amino, halo, nitro, nitrile, sulfone, and sulfide. However, polar terminals such as hydroxyl group, carboxyl group, amino group, sulfonic acid group, phosphoric acid group, amide group and epoxy group may not be included at the ends of R 1 , R 2 and R 3. preferable. This is because if the terminal of R 1 , R 2 , or R 3 does not contain a polar functional group, the effect of lowering the melting temperature of the nucleic acid may be higher.
また一般式（１）において、Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基である。そして上記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基には、エーテル、エステル、カルボニル、アミド、アミノ、ハロ、ニトロ、ニトリル、スルホン、スルフィド等の官能基が含まれていてもよい。 In the general formula (1), R 6 is an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, or an arylene group. The alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, or arylene group may contain functional groups such as ether, ester, carbonyl, amide, amino, halo, nitro, nitrile, sulfone, and sulfide.
また一般式（１）においてＡ1は、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）をはじめとする長周期型周期表における５Ｂ族元素を表す。 In the general formula (1), A 1 represents a group 5B element in the long-period periodic table including nitrogen (N) and phosphorus (P).
また一般式（１）において、Ｚ1は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表す。 In the general formula (1), Z 1 represents —COO, —SO 3 , —NO 3 , or —HPO 4 .
さらに一般式（１）において下記の（I）または（II）の１つ以上が満たされる。
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である。
Further, in the general formula (1), one or more of the following (I) or (II) is satisfied.
(I) any one or more of R 1 , R 2 , and R 3 is a group having 2 or more carbon atoms,
(II) R 6 is a group having 3 or more carbon atoms.
なお、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ6の炭素数は、一般式（１）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体（以下「化合物等」という）が核酸合成を行う反応溶液中に溶解する程度の条件であれば、炭素数の上限は特に限定されるものではない。 The number of carbon atoms of R 1 , R 2 , R 3 and R 6 is the reaction solution in which the compound represented by the general formula (1) or a salt or derivative thereof (hereinafter referred to as “compound etc.”) performs nucleic acid synthesis. The upper limit of the carbon number is not particularly limited as long as it dissolves in the inside.
また一般式（２）において、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択される基であり、これらは同一であっても異なっていてもよい。また上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基には、エーテル、エステル、カルボニル、アミド、アミノ、ハロ、ニトロ、ニトリル、スルホン、スルフィド等の官能基が含まれていてもよい。ただし、上記Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14の末端には、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン酸基、リン酸基、アミド基、エポキシ基をはじめとする極性官能基が含まれないことが好ましい。上記Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14の末端に極性官能基が含まれない方が、核酸の融解温度を降下させる効果が高い場合があるからである。 In the general formula (2), R 11 , R 12 , R 13 and R 14 are groups independently selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group and an aryl group, excluding hydrogen. These may be the same or different. The alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, or aryl group may contain functional groups such as ether, ester, carbonyl, amide, amino, halo, nitro, nitrile, sulfone, and sulfide. However, polar terminals such as hydroxyl group, carboxyl group, amino group, sulfonic acid group, phosphoric acid group, amide group and epoxy group are included at the ends of R 11 , R 12 , R 13 and R 14. Preferably not. This is because if the terminal of R 11 , R 12 , R 13 and R 14 does not contain a polar functional group, the effect of lowering the melting temperature of the nucleic acid may be higher.
また一般式（２）におけるＲ15、Ｒ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよい。なお、一般式（２）において２つ存在するＲ16同士についても、同一であっても異なっていてもよい。また上記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基には、エーテル、エステル、カルボニル、アミド、アミノ、ハロ、ニトロ、ニトリル、スルホン、スルフィド等の官能基が含まれていてもよい。 R 15 and R 16 in the general formula (2) are independently selected from the group consisting of an alkylene group, an alkenylene group, an alkynylene group, and an arylene group, and may be the same or different. In the general formula (2), two R 16 s may be the same or different. The alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, and arylene group may contain functional groups such as ether, ester, carbonyl, amide, amino, halo, nitro, nitrile, sulfone, and sulfide.
また一般式（２）におけるＡ11およびＡ12は、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）をはじめとする長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、同一であっても異なっていてもよい。 A 11 and A 12 in the general formula (2) represent Group 5B elements in the long-period periodic table including nitrogen (N) and phosphorus (P), and may be the same or different.
また一般式（２）におけるＺ11は、−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表す。なお一般式（２）において２つ存在するＺ11同士についても、同一であっても異なっていてもよい。 Z 11 in the general formula (2) represents —COO, —SO 3 , —NO 3 , or —HPO 4 . Incidentally regard to Z 11 each other there are two in the general formula (2), it may be the same or different.
そして一般式（２）において下記の（III）または（IV）の１つ以上が満たされる。
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。
In the general formula (2), at least one of the following (III) or (IV) is satisfied.
(III) any one or more of R 11 , R 12 , R 13 and R 14 is a group having 2 or more carbon atoms,
(IV) Any one or more of R 15 and R 16 is a group having 3 or more carbon atoms.
なお、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15およびＲ16の炭素数は、一般式（２）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体（以下「化合物等」という）が核酸合成を行う反応溶液中に溶解する程度の条件であれば、炭素数の上限は特に限定されるものではない。 The carbon number of R 11 , R 12 , R 13 , R 14 , R 15 and R 16 is the same as that of the compound represented by the general formula (2), or a salt or derivative thereof (hereinafter referred to as “compound etc.”). The upper limit of the carbon number is not particularly limited as long as it is a condition that dissolves in a reaction solution for nucleic acid synthesis.
本発明にかかる組成物は、上記一般式（１）および一般式（２）で表される化合物かららなる群から選択される１つ以上の化合物が含まれていればよい。また本発明にかかる組成物には上記一般式（１）および一般式（２）で表される化合物の塩、またはそれらの誘導体であってもよい。また２つ以上の化合物等が組成物に含まれる場合の配合比率は特に限定されるものではなく、核酸の合成反応に適した配合比率を適宜検討のうえ、採用すればよい。 The composition concerning this invention should just contain 1 or more compounds selected from the group which consists of a compound represented by the said General formula (1) and General formula (2). The composition according to the present invention may be a salt of the compound represented by the general formula (1) or the general formula (2) or a derivative thereof. In addition, the blending ratio when two or more compounds are included in the composition is not particularly limited, and a blending ratio suitable for a nucleic acid synthesis reaction may be appropriately determined and adopted.
なお本発明にかかる組成物に含まれる一般式（１）および一般式（２）で表される化合物は、分子内に少なくとも１組以上のカチオンとアニオンとの双性イオンを有する双性イオン化合物（例えばベタイン）であって、(a)カチオンとアニオンと間のスペーサー長が少なくともＣ3以上である、および／または（b）アンモニウム基の置換基がＣ2以上である双性イオン化合物（例えばベタイン）であるとも表現できる。 The compound represented by the general formula (1) and the general formula (2) contained in the composition according to the present invention is a zwitterionic compound having zwitterions of at least one pair of cations and anions in the molecule. (e.g. betaine) a, (a) cation and an anion and the spacer length between is at least C 3 or higher, and / or (b) a zwitterionic compound substituent is C 2 or more ammonium groups (e.g. (Betaine).
また本発明にかかる組成物には、核酸合成時に好適に使用されている緩衝剤または塩類が含まれていてもよい。上記、緩衝剤としては特に限定されるものではないが、トリス（ＴＲ１Ｓ）、トリジン（ＴＲｌＣ１ＮＥ）、ビスートリシン（ＢｌＳ-ＴＲ１Ｃ１ＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（Ｐ１ＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。また上記塩としては特に限定されるものではないが、例えば塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウ七、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、酢酸リチウム等が挙げられる。 Further, the composition according to the present invention may contain a buffer or a salt that is suitably used during nucleic acid synthesis. The buffering agent is not particularly limited, but Tris (TR1S), Tolidine (TR1C1NE), Bistolycin (B1S-TR1C1NE), Hepes (HEPES), Mops (MOPS), Tes (TES), Tapus ( TAPS), pipes (P1PES), caps (CAPS), and the like. The salt is not particularly limited. For example, potassium chloride, potassium acetate, potassium sulfate, ammonium sulfate 7, ammonium chloride, ammonium acetate, magnesium chloride, magnesium acetate, magnesium sulfate, manganese chloride, manganese acetate, sulfuric acid Manganese, sodium chloride, sodium acetate, lithium chloride, lithium acetate and the like can be mentioned.
さらに本発明にかかる組成物には、融解温度調整剤として公知である、グリシンベタイン、メチルグリシン、サルコシン、グリシン、プロリン、グリセロール、エクトイン、アミン−Ｎ−オキシド、スルホキシド（ＤＭＳＯなど）、多糖、ＰＥＧ、非イオン性界面活性剤（Tween20、NP40など）、アミド（ＤＭＦ、ホルムアミドなど）、カルボン酸誘導体（クエン酸、シュウ酸など）、ＳＳＢタンパク質、ＢＳＡ等が、補助成分として含まれていてもよい。 Further, the composition according to the present invention includes glycine betaine, methylglycine, sarcosine, glycine, proline, glycerol, ectoine, amine-N-oxide, sulfoxide (such as DMSO), polysaccharide, PEG, which are known as melting temperature adjusting agents. , Nonionic surfactants (Tween 20, NP40, etc.), amides (DMF, formamide, etc.), carboxylic acid derivatives (citric acid, oxalic acid, etc.), SSB protein, BSA, etc. may be included as auxiliary components .
さらに本発明にかかる組成物には、核酸合成活性を有する酵素（「核酸合成酵素」という）が含まれていてもよい。上記核酸合成酵素は、ＤＮＡポリメラーゼであっても、ＲＮＡポリメラーゼであっても、逆転写酵素であってもよい。 Furthermore, the composition according to the present invention may contain an enzyme having nucleic acid synthesis activity (referred to as “nucleic acid synthase”). The nucleic acid synthetase may be a DNA polymerase, an RNA polymerase, or a reverse transcriptase.
さらに本発明にかかる組成物には、核酸合成に必要なヌクレオチド成分（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、α−チオ−ｄＮＴＰ類、ビオチン−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、シゴキシゲニン−ｄＵＴＰ等）が含まれていてもよい。 Further, the composition according to the present invention includes nucleotide components necessary for nucleic acid synthesis (for example, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dITP, dUTP, α-thio-dNTPs, biotin-dUTP, fluorescein-dUTP, sigoxygenin-dUTP). Etc.) may be included.
また本発明にかかる組成物の状態は、特に限定されるものではなく、液体であっても、固体の状態であってもよい。 The state of the composition according to the present invention is not particularly limited, and may be a liquid or a solid state.
また上記本発明にかかる組成物を用いて、核酸を合成する際に使用されるキット（「核酸合成キット」という）を構成することができる。本発明にかかる核酸合成キットには、本発明の組成物の他に、既述の緩衝剤、塩類、核酸合成酵素、ヌクレオチド成分等が含まれていてもよい。また本発明にかかる核酸合成キットには、核酸合成に必要なプライマー、鋳型となる核酸が含まれていてもよい。また上記核酸合成キットを構成する成分を格納するための１つ以上の容器（例えば、バイアル、管、アンプル、ビンなど）が含まれていてもよい。 In addition, a kit (referred to as “nucleic acid synthesis kit”) used when nucleic acid is synthesized can be constituted using the composition according to the present invention. In addition to the composition of the present invention, the nucleic acid synthesis kit according to the present invention may contain the aforementioned buffer, salt, nucleic acid synthase, nucleotide component and the like. In addition, the nucleic acid synthesis kit according to the present invention may contain a primer necessary for nucleic acid synthesis and a nucleic acid that serves as a template. One or more containers (for example, vials, tubes, ampoules, bottles, etc.) for storing the components constituting the nucleic acid synthesis kit may be included.
＜本発明にかかる組成物の製造方法＞
上記で説示した、本発明にかかる組成物の製造方法は、特に限定されるものではなく、当業者が通常行い得る合成方法を用い、一般式（１）または（２）、あるいは一般式（１’）または一般式（２’）で表される化合物等を製造することによって達成される。なお、以後の説明において、一般式（１’）で表される化合物、および一般式（２’）で表される化合物の製造方法を一実施形態として説明するが、一般式（１）または（２）で表される他の化合物についても同様に製造することができる。なお、一般式（１’）で表される化合物のことを「ベタイン１」と称し、一般式（２’）で表される化合物のことを「ベタイン２」と便宜上称する。ベタイン１および２は、例えば、非特許文献２や３に記載された方法（液相合成）、または非特許文献４や５に記載された方法（固相合成）にしたがって合成され得る。ただし、目的とするベタイン１および２は双性イオン化合物であるため、極性が高い。よって上記液相合成でベタイン１および２を合成しても、分離精製が極めて困難である。一方、固相合成では、ベタイン１および２を大量に合成することができないという問題点もある。
<The manufacturing method of the composition concerning this invention>
The method for producing the composition according to the present invention described above is not particularly limited, and a synthesis method that can be generally performed by those skilled in the art is used to formula (1) or (2), or (1) It is achieved by producing a compound represented by ') or general formula (2'). In the following description, a method for producing a compound represented by the general formula (1 ′) and a compound represented by the general formula (2 ′) will be described as an embodiment. Other compounds represented by 2) can be similarly produced. The compound represented by the general formula (1 ′) is referred to as “betaine 1”, and the compound represented by the general formula (2 ′) is referred to as “betaine 2” for convenience. Betaines 1 and 2 can be synthesized, for example, according to the methods described in Non-Patent Documents 2 and 3 (liquid phase synthesis) or the methods described in Non-Patent Documents 4 and 5 (solid phase synthesis). However, since the target betaines 1 and 2 are zwitterionic compounds, their polarity is high. Therefore, even if betaines 1 and 2 are synthesized by the liquid phase synthesis, separation and purification are extremely difficult. On the other hand, in the solid phase synthesis, betaines 1 and 2 cannot be synthesized in large quantities.
そこで、本発明者らは、ベタイン１およびベタイン２を効率よく合成し得る方法（以下「本方法」という）を独自に完成させた。本方法によれば、目的物であるベタイン１の前駆体およびベタイン２の前駆体が反応液中に沈殿する。よって、目的物の分離精製が極めて簡便に行うことができる。なお、本方法は、ベタイン１およびベタイン２のみに適用されるわけではなく、ベタイン全般の合成に利用可能であるということを当業者は容易に理解する。 Therefore, the present inventors independently completed a method (hereinafter referred to as “the present method”) capable of efficiently synthesizing betaine 1 and betaine 2. According to this method, the precursor of betaine 1 and the precursor of betaine 2, which are target products, are precipitated in the reaction solution. Therefore, separation and purification of the target product can be performed very simply. It should be noted that those skilled in the art easily understand that this method is not applied only to betaine 1 and betaine 2, but can be used for synthesis of betaine in general.
以下に本方法の一実施形態を、図２を用いて説明する。なお本方法はこれに限定されるものではない。図２（ａ）はベタイン１の製造方法を示し、同図（ｂ）はベタイン２の製造方法を示す図である。 Hereinafter, an embodiment of the present method will be described with reference to FIG. The method is not limited to this. 2A shows a method for producing betaine 1, and FIG. 2B shows a method for producing betaine 2. FIG.
図２（ａ）に示される方法では、まず既述の一般式（３’）で表される化合物（便宜上「化合物III」と称する）と、既述の一般式（４’）で表される化合物（便宜上「化合物IV」と称する）とを、酢酸エチルの存在下で反応させる反応工程を経て前駆体１を製造している。そして反応工程によって得られた前駆体１を水に溶解し、陰イオン交換カラム（陰イオン交換樹脂：Amberlite（アンバーライト：登録商標）IR-402、ローム アンド ハース社製）を用いてベタイン１を取得している。より具体的に説明すれば以下の通りである。
(a)化合物IIIを酢酸エチルに溶解して溶液とし、化合物IVを当該溶液に滴下し反応させることによって前駆体１が溶液中に沈殿物として生成させる（反応工程）。
(b)反応工程で得られた前駆体１を濾別し、これを蒸留水（またはイオン交換水）に溶解する。この前駆体１の水溶液を、陰イオン交換カラム（陰イオン交換樹脂：Amberlite（アンバーライト：登録商標）IR-402、ローム アンド ハース社製）に通液する。陰イオン交換カラムに吸着したベタイン１を、蒸留水またはイオン交換水を用いて溶離させる。その後、溶離液を真空乾燥させて最終的にベタイン１を取得する（精製工程）。
In the method shown in FIG. 2A, the compound represented by the general formula (3 ′) described above (referred to as “compound III” for convenience) and the general formula (4 ′) described above are first used. Precursor 1 is produced through a reaction step in which a compound (referred to as “compound IV” for convenience) is reacted in the presence of ethyl acetate. Then, the precursor 1 obtained by the reaction process is dissolved in water, and betaine 1 is obtained using an anion exchange column (anion exchange resin: Amberlite (registered trademark) IR-402, manufactured by Rohm and Haas). Have acquired. More specifically, it is as follows.
(a) Compound III is dissolved in ethyl acetate to form a solution, and compound IV is added dropwise to the solution to cause reaction, whereby precursor 1 is produced as a precipitate in the solution (reaction step).
(b) The precursor 1 obtained in the reaction step is filtered off and dissolved in distilled water (or ion exchange water). The aqueous solution of the precursor 1 is passed through an anion exchange column (anion exchange resin: Amberlite (registered trademark) IR-402, manufactured by Rohm and Haas). The betaine 1 adsorbed on the anion exchange column is eluted using distilled water or ion exchange water. Thereafter, the eluent is vacuum-dried to finally obtain betaine 1 (purification step).
上記反応工程において化合物IIIを酢酸エチルに溶解する際の比率は特に限定されるものではなく適宜設定され得る。また反応工程において化合物IVを、化合物IIIの酢酸エチル溶液に滴下し、反応させる際には、反応効率の観点から、溶液を撹拌することが好ましい。撹拌は従来公知の撹拌手段を用いればよい。また上記反応時間は、特に限定されるものではく、前駆体１の生成量を指標に適宜設定すればよい。また反応温度についても特に限定されるものではないが、安全性の観点から室温で行うことが好ましい。 In the above reaction step, the ratio at which compound III is dissolved in ethyl acetate is not particularly limited and may be appropriately set. In addition, in the reaction step, when the compound IV is dropped into the ethyl acetate solution of the compound III and reacted, it is preferable to stir the solution from the viewpoint of reaction efficiency. For the stirring, a conventionally known stirring means may be used. The reaction time is not particularly limited, and may be set as appropriate using the amount of precursor 1 produced as an index. The reaction temperature is not particularly limited, but it is preferably performed at room temperature from the viewpoint of safety.
一方、精製工程においては、Amberlite（アンバーライト：登録商標）IR-402が充填されたカラムを使用しているが、本方法はこれに限定されるものではなく、ベタインを吸着し得る陰イオン交換樹脂が利用可能である。Amberlite（アンバーライト：登録商標）IR-402の他に、本方法に適用可能なイオン交換樹脂としては例えば、DOW社製 Dowex1x8が挙げられる。ベタイン１の溶離条件はイオン交換樹脂に応じて最適な条件を適宜採用すればよい。 On the other hand, in the purification process, a column packed with Amberlite (registered trademark) IR-402 is used, but this method is not limited to this, and anion exchange capable of adsorbing betaine is performed. Resin is available. In addition to Amberlite (registered trademark) IR-402, ion exchange resins applicable to this method include, for example, Dowex1x8 manufactured by DOW. As the elution conditions for betaine 1, optimum conditions may be adopted as appropriate according to the ion exchange resin.
なお図２（ａ）では一般式（４’）のＲ7がエチル基（図２（ａ）中「Ｅｔ」で示す）である場合、および酢酸エチル（図２（ａ）中「ＡｃＯＥｔ」で示す）を溶媒として用いる場合について示しているが、本方法はこれに限定されない。また、一般式（３’）および一般式（４’）におけるＲ1〜Ｒ6の説明は、一般式（１’）の説明と共通するために省略する。一般式（４’）におけるＲ7は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基であれば特に限定されるものではない。アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基の炭素数は、１〜１２であることが好ましい。またアルキル基は直鎖であっても分岐鎖であってもよい。 In FIG. 2A, when R 7 in the general formula (4 ′) is an ethyl group (indicated by “Et” in FIG. 2A), and ethyl acetate (“AcOEt” in FIG. 2A) Is shown) as a solvent, but the present method is not limited to this. In addition, descriptions of R 1 to R 6 in the general formula (3 ′) and the general formula (4 ′) are omitted because they are the same as the description of the general formula (1 ′). R 7 in the general formula (4 ′) is not particularly limited as long as it is an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, or an aryl group. It is preferable that carbon number of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, or an aryl group is 1-12. The alkyl group may be linear or branched.
ベタイン１を製造する際に利用可能な溶媒は、上記酢酸エチルに限られず、酢酸メチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒が適用可能である。そして、製造する化合物に応じて適宜最適な溶媒を選択すればよい。 The solvent that can be used when producing betaine 1 is not limited to the above ethyl acetate, and ester solvents such as methyl acetate and butyl acetate are applicable. Then, an optimal solvent may be selected as appropriate according to the compound to be produced.
一方、一般式（４’）におけるＸ1はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハロゲンを表す。上記Ｘ1としては、特にＢｒが好ましい。 On the other hand, X 1 in the general formula (4 ′) represents a halogen such as F, Cl, Br, or I. As X 1 , Br is particularly preferable.
また本方法を、本発明にかかる組成物を構成する化合物以外に利用し得る。この場合、例えば、一般式（３’）および一般式（４’）は、下記（I）および（II）の条件を満たす必要はない。
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である。
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である。
Moreover, this method can be utilized besides the compound which comprises the composition concerning this invention. In this case, for example, the general formula (3 ′) and the general formula (4 ′) do not need to satisfy the following conditions (I) and (II).
(I) Any one or more of R 1 , R 2 , and R 3 is a group having 2 or more carbon atoms.
(II) R 6 is a group having 3 or more carbon atoms.
一方、図２（ｂ）は既述の一般式（５’）で表される化合物（便宜上「化合物V」と称する）と、既述の一般式（６’）で表される化合物（便宜上「化合物VI」と称する）とを、エタノールの存在下で反応させる反応工程を経て、前駆体２を製造している。そして反応工程によって得られた前駆体２を水に溶解し、陰イオン交換カラム（陰イオン交換樹脂：Amberlite（アンバーライト：登録商標）IR-402、ローム アンド ハース社製）を用いてベタイン２を取得している。より具体的に説明すれば以下の通りである。
(c)化合物Vをエタノールに溶解して溶液とし、化合物VIを当該溶液に滴下し反応させることによって前駆体２が溶液中に沈殿物として生成させる（反応工程）。
(d)反応工程で得られた前駆体２を濾別し、これを蒸留水（またはイオン交換水）に溶解する。この前駆体２の水溶液を、陰イオン交換カラム（陰イオン交換樹脂：Amberlite（アンバーライト：登録商標）IR-402、ローム アンド ハース社製）に通液する。陰イオン交換カラムに吸着したベタイン２を、蒸留水またはイオン交換水を用いて溶離させる。その後、溶離液を真空乾燥させて最終的にベタイン２を取得する（精製工程）。
On the other hand, FIG. 2B shows a compound represented by the general formula (5 ′) described above (referred to as “compound V” for convenience) and a compound represented by the general formula (6 ′) described above (for convenience “ The precursor 2 is produced through a reaction step in which the compound VI is referred to as “compound VI” in the presence of ethanol. Then, the precursor 2 obtained by the reaction step is dissolved in water, and betaine 2 is obtained using an anion exchange column (anion exchange resin: Amberlite (registered trademark) IR-402, manufactured by Rohm and Haas). Have acquired. More specifically, it is as follows.
(c) The compound V is dissolved in ethanol to form a solution, and the compound VI is dropped into the solution and reacted to form the precursor 2 as a precipitate in the solution (reaction step).
(d) The precursor 2 obtained in the reaction step is filtered off and dissolved in distilled water (or ion exchange water). The aqueous solution of the precursor 2 is passed through an anion exchange column (anion exchange resin: Amberlite (registered trademark) IR-402, manufactured by Rohm and Haas). The betaine 2 adsorbed on the anion exchange column is eluted using distilled water or ion exchange water. Thereafter, the eluent is vacuum-dried to finally obtain betaine 2 (purification step).
ベタイン１の製造方法と共通する事項については、ベタイン２の製造方法の説明においてそれを援用する。 The matters common to the method for producing betaine 1 are incorporated in the description of the method for producing betaine 2.
上記反応工程において化合物Vをエタノールに溶解する際の比率は特に限定されるものではなく、適宜設定され得る。 The ratio at which compound V is dissolved in ethanol in the reaction step is not particularly limited, and can be set as appropriate.
なお図２（ｂ）では一般式（６’）のＲ7がエチル基（図２（ｂ）中「Ｅｔ」で示す）である場合、およびエタノール（図２（ｂ）中「ＥｔＯＨ」で示す）を溶媒として用いる場合について示しているが、本方法はこれに限定されない。また、一般式（５’）および一般式（６’）におけるＲ11〜Ｒ16の説明は、一般式（２’）の説明と共通するために省略する。一般式（６’）におけるＲ17は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基であれば特に限定されるものではない。アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基の炭素数は、１〜１２であることが好ましい。またアルキル基は直鎖であっても分岐鎖であってもよい。 In FIG. 2B, R 7 in the general formula (6 ′) is an ethyl group (indicated by “Et” in FIG. 2B), and ethanol (indicated by “EtOH” in FIG. 2B). ) Is used as a solvent, but the present method is not limited to this. In addition, descriptions of R 11 to R 16 in the general formula (5 ′) and the general formula (6 ′) are omitted because they are the same as the description of the general formula (2 ′). R 17 in the general formula (6 ′) is not particularly limited as long as it is an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, or an aryl group. It is preferable that carbon number of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, or an aryl group is 1-12. The alkyl group may be linear or branched.
ベタイン２を製造する際に利用可能な溶媒は、上記エタノールに限られず、メタノール、ブタノール等のアルコールが適用可能である。そして、製造する化合物に応じて適宜最適な溶媒を選択すればよい。 The solvent that can be used when producing betaine 2 is not limited to the above ethanol, and alcohols such as methanol and butanol are applicable. Then, an optimal solvent may be selected as appropriate according to the compound to be produced.
一方、一般式（６’）におけるＸ11はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハロゲンを表す。上記Ｘ1としては、特にＢｒが好ましい。 On the other hand, X 11 in the general formula (6 ′) represents a halogen such as F, Cl, Br, or I. As X 1 , Br is particularly preferable.
なお、一般式（１）で表される双性イオン化合物は、一般式（３）および一般式（４）で表される化合物を用いて製造され得る。この場合は、上記ベタイン１の製造方法における化合物IIIを一般式（３）で表される化合物と読み替え、化合物IVを一般式（４）で表される化合物と読み替えればよい。また一般式（３）および一般式（４）において一般式（１）と共通する官能基に関する説明については、一般式（１）のそれを援用する。 In addition, the zwitterionic compound represented by the general formula (1) can be produced using the compounds represented by the general formula (3) and the general formula (4). In this case, the compound III in the method for producing betaine 1 may be read as the compound represented by the general formula (3), and the compound IV may be read as the compound represented by the general formula (4). Moreover, about description regarding the functional group which is common in General formula (1) in General formula (3) and General formula (4), that of General formula (1) is used.
また、一般式（２）で表される双性イオン化合物は、一般式（５）および一般式（６）で表される化合物を用いて製造され得る。この場合は、上記ベタイン２の製造方法における化合物Vを一般式（５）で表される化合物と読み替え、化合物VIを一般式（６）で表される化合物と読み替えればよい。また一般式（５）および一般式（６）において一般式（２）と共通する官能基に関する説明については、一般式（２）のそれを援用する。 Moreover, the zwitterionic compound represented by the general formula (2) can be produced using the compounds represented by the general formula (5) and the general formula (6). In this case, the compound V in the method for producing betaine 2 may be read as the compound represented by the general formula (5), and the compound VI may be read as the compound represented by the general formula (6). Moreover, about description regarding the functional group which is common in General formula (2) in General formula (5) and General formula (6), that of General formula (2) is used.
＜本発明にかかる組成物の利用＞
本発明にかかる組成物は、核酸の融解温度を降下させる効果が極めて高いものである。それゆえ、これまで融解温度が高く熱変性させることが困難であった核酸、特にＧＣ含量の高い核酸領域を容易に熱変性させることが可能である。融解温度が高く熱変性させることが困難であった核酸、特にＧＣ含量の高い核酸領域を容易に熱変性させることが可能となることで、これまで熱変性させることができなかったことが原因で合成することが困難であった核酸領域を合成することが可能となる。ここで「熱変性させる」とは、二本鎖の核酸を熱作用によって一本鎖にすることを意味する。また「核酸の溶解温度を降下させる」とは、熱変性する温度を降下させる効果のことを意味する。
<Use of composition according to the present invention>
The composition according to the present invention has an extremely high effect of lowering the melting temperature of nucleic acids. Therefore, it is possible to easily heat denature a nucleic acid, which has been difficult to be heat denatured so far, particularly a nucleic acid region having a high GC content. Nucleic acids that have a high melting temperature and were difficult to heat denature, especially nucleic acid regions with a high GC content, can be easily heat denatured. It becomes possible to synthesize nucleic acid regions that were difficult to synthesize. Here, “thermally denatured” means that a double-stranded nucleic acid is made into a single strand by thermal action. Further, “lowering the nucleic acid dissolution temperature” means an effect of lowering the temperature for heat denaturation.
ここで核酸が熱変性したどうかについては、核酸溶液中の紫外線吸収スペクトルを測定することによって判断できる。溶液中において核酸は二本鎖を形成することで紫外可視吸収スペクトルにおける極大吸収波長（おおよそ２６０ｎｍ付近）の吸光度の減少（「淡色効果」という）が確認される。この淡色効果の消失を確認することによって、核酸が二本鎖から一本鎖になった（熱変性した）ことを判断することができる。また、温度−吸光度からなるシグモイド状の曲線（融解曲線）における変曲点（融解温度）の変化を確認することによって、核酸の融解温度の変化を確認することができる。 Here, whether the nucleic acid is thermally denatured can be determined by measuring an ultraviolet absorption spectrum in the nucleic acid solution. The nucleic acid forms a double strand in the solution, thereby confirming a decrease in absorbance (referred to as a “light color effect”) at the maximum absorption wavelength (approximately 260 nm) in the ultraviolet-visible absorption spectrum. By confirming the disappearance of this light color effect, it can be determined that the nucleic acid has changed from double-stranded to single-stranded (heat-denatured). Moreover, the change of the melting temperature of a nucleic acid can be confirmed by confirming the change of the inflection point (melting temperature) in the sigmoid curve (melting curve) which consists of temperature-absorbance.
本発明にかかる組成物を用いて核酸を熱変性させる場合、本発明にかかる組成物と熱変性させようとする核酸とを少なくとも含む混合物（反応液）に含まれていることが好ましい双性イオン化合物（例えばベタイン１、ベタイン２）またはそれらの塩もしくは誘導体の濃度は、変性させようとする核酸の種類や濃度によって異なるために特に限定されるものではないが、通常、ＧＣ含量が６０％を超えるものでは、０．０００１〜３．０Ｍの濃度で含まれていることが好ましく、０．００１〜１．０Ｍの濃度で含まれていることがさらに好ましく、０．０１〜０．１Ｍの濃度で含まれていることが最も好ましい。また、ＧＣ含量が６０％未満のものに関してはさらに低い濃度で適宜、調整を行う。本発明にかかる組成物は、核酸の融解温度を降下させる効果が極めて高いために、上記のごとく低い濃度であっても十分な効果が得られる。 When nucleic acid is heat-denatured using the composition according to the present invention, zwitterions that are preferably contained in a mixture (reaction solution) containing at least the composition according to the present invention and the nucleic acid to be heat-denatured. The concentration of the compound (for example, betaine 1, betaine 2) or a salt or derivative thereof is not particularly limited because it varies depending on the type and concentration of the nucleic acid to be denatured. Usually, the GC content is 60%. If it exceeds, it is preferably contained at a concentration of 0.0001 to 3.0M, more preferably contained at a concentration of 0.001 to 1.0M, and a concentration of 0.01 to 0.1M. It is most preferable that it is contained. For those having a GC content of less than 60%, adjustment is appropriately made at a lower concentration. Since the composition according to the present invention has a very high effect of lowering the melting temperature of nucleic acid, a sufficient effect can be obtained even at a low concentration as described above.
また本発明にかかる組成物を用いて核酸を合成する場合は、ＰＣＲ等の核酸増幅反応、逆転転写反応、塩基配列決定時の核酸合成反応における反応溶液中に本発明にかかる組成物が含まれるようにすればよい。よって、核酸を合成する反応の詳細については特に限定されるものではない。例えば、ＰＣＲ法による核酸合成において本発明にかかる組成物を用いる場合は、当該組成物、鋳型となる核酸、核酸合成酵素、少なくとも１対のプライマー、および１種類以上のヌクレオチドを少なくとも含む混合物を反応溶液として、熱変性→アニーリング→伸長のサーマルサイクルを繰り返し実施すればよい。この反応溶液中に含まれていることが好ましい双性イオン化合物（例えばベタイン１、ベタイン２）またはそれらの塩もしくは誘導体の濃度については既述の通りである。 In addition, when nucleic acid is synthesized using the composition according to the present invention, the composition according to the present invention is included in a reaction solution in nucleic acid amplification reaction such as PCR, reverse transcription reaction, and nucleic acid synthesis reaction at the time of base sequence determination. What should I do? Therefore, the details of the reaction for synthesizing the nucleic acid are not particularly limited. For example, when the composition according to the present invention is used in nucleic acid synthesis by PCR, a reaction comprising the composition, a nucleic acid as a template, a nucleic acid synthase, at least one pair of primers, and at least one kind of nucleotide is reacted. The solution may be repeatedly subjected to a thermal cycle of thermal denaturation → annealing → extension. The concentration of the zwitterionic compound (for example, betaine 1, betaine 2) or a salt or derivative thereof preferably contained in the reaction solution is as described above.
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited to this.
〔合成例１〕前駆体１の合成
分子内に１組の双性イオンを持つベタイン（「ベタイン１」という）は、アルキル鎖長や組み合わせによらず、図２（ａ）に示すスキームに従って合成することが可能である。ここでは、一例として図２（ａ）のＲ1、Ｒ2、Ｒ3がエチル基で、Ｒ6がメチレン基である前駆体１（2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-酢酸エチルエステル臭化物塩）の合成例を示す。なお、その他の前駆体１の合成は、下記に準じて行われた。
Synthesis Example 1 Synthesis of Precursor 1 Betaine having a pair of zwitterions in the molecule (referred to as “betaine 1”) is synthesized according to the scheme shown in FIG. Is possible. Here, as an example, precursor 1 (2- (N, N, N-triethylammonium) -ethyl acetate in which R 1 , R 2 and R 3 in FIG. 2A are ethyl groups and R 6 is a methylene group is shown. Synthesis examples of ester bromide salts are shown. In addition, the synthesis | combination of the other precursor 1 was performed according to the following.
トリエチルアミン１００ｍｌを酢酸エチル１００ｍｌに溶解させた。この溶液に対してブロモ酢酸エチル（３７．５ｇ）をゆっくりと滴下した。滴下後、この溶液を室温で一晩攪拌した。その後、生成した沈殿を濾別した。得られた沈殿を真空乾燥して、前駆体１（2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-酢酸エチルエステル臭化物塩）を得た（収量５０．２ｇ、収率８６％）。 100 ml of triethylamine was dissolved in 100 ml of ethyl acetate. To this solution, ethyl bromoacetate (37.5 g) was slowly added dropwise. After the addition, the solution was stirred overnight at room temperature. Thereafter, the produced precipitate was filtered off. The obtained precipitate was vacuum-dried to obtain Precursor 1 (2- (N, N, N-triethylammonium) -acetic acid ethyl ester bromide salt) (yield 50.2 g, yield 86%).
上記で得られた化合物の同定は、ＩＲ、および1Ｈ ＮＭＲによって行われた。表１にＩＲ解析の結果を、表２に1Ｈ ＮＭＲ解析の結果を示す。 The compound obtained above was identified by IR and 1 H NMR. Table 1 shows the results of IR analysis, and Table 2 shows the results of 1 H NMR analysis.
ＩＲ、および1Ｈ ＮＭＲの結果、目的物である2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-酢酸エチルエステル臭化物塩（すなわち、図１における化合物４の前駆体）が合成されたことが確認できた。 As a result of IR and 1 H NMR, it was confirmed that 2- (N, N, N-triethylammonium) -acetic acid ethyl ester bromide salt (ie, precursor of compound 4 in FIG. 1) was synthesized. did it.
図１における化合物２の前駆体を合成した結果を、表３（ＩＲ）および表４（1Ｈ ＮＭＲ）に示す。表３および４によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。 The result of synthesizing the precursor of compound 2 in FIG. 1 is shown in Table 3 (IR) and Table 4 ( 1 H NMR). According to Tables 3 and 4, it was confirmed that the target compound was synthesized.
図１における化合物３の前駆体を合成した結果を、表５（ＩＲ）および表６（1Ｈ ＮＭＲ）に示す。表５および６によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。 The results of synthesizing the precursor of compound 3 in FIG. 1 are shown in Table 5 (IR) and Table 6 ( 1 H NMR). According to Tables 5 and 6, it was confirmed that the target compound was synthesized.
図１における化合物５の前駆体を合成した結果を、表７（ＩＲ）および表８（1Ｈ ＮＭＲ）に示す。表７および８によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。 The result of synthesizing the precursor of compound 5 in FIG. 1 is shown in Table 7 (IR) and Table 8 ( 1 H NMR). According to Tables 7 and 8, it was confirmed that the target compound was synthesized.
図１における化合物６の前駆体を合成した結果を、表９（ＩＲ）および表１０（1Ｈ ＮＭＲ）に示す。表９および１０によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。 The result of synthesizing the precursor of compound 6 in FIG. 1 is shown in Table 9 (IR) and Table 10 ( 1 H NMR). According to Tables 9 and 10, it was confirmed that the target compound was synthesized.
図１における化合物７の前駆体を合成した結果を、表１１（ＩＲ）および表１２（1Ｈ ＮＭＲ）に示す。表１１および１２によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。 The result of synthesizing the precursor of compound 7 in FIG. 1 is shown in Table 11 (IR) and Table 12 ( 1 H NMR). According to Tables 11 and 12, it was confirmed that the target compound was synthesized.
図１における化合物８の前駆体を合成した結果を、表１３（ＩＲ）および表１４（1Ｈ ＮＭＲ）に示す。表１３および１４によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。 The results of synthesizing the precursor of compound 8 in FIG. 1 are shown in Table 13 (IR) and Table 14 ( 1 H NMR). According to Tables 13 and 14, it was confirmed that the target compound was synthesized.
〔合成例２〕前駆体２の合成
分子内に２組の双性イオンを持つベタイン（「ベタイン２」という）は、アルキル鎖長や組み合わせによらず、図２（ｂ）のスキームに従って合成することが可能である。ここでは、一例として図２（ｂ）のＲ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14がメチル基で、Ｒ15がエチレン基、Ｒ16がメチレン基である前駆体２（1,2-ビス{[N,N-ジメチル-N-(酢酸エチルエステル-2-イル)]-アンモニウム-N-イル}エタン二臭化物塩）の合成例を示す。なお、その他の前駆体２の合成は、下記に準じて行われた。
[Synthesis Example 2] Synthesis of Precursor 2 Betaine having two zwitterions in the molecule (referred to as “betaine 2”) is synthesized according to the scheme of FIG. 2B regardless of the alkyl chain length or combination. It is possible. Here, as an example, the precursor 2 (1,2-bis {1,2) in FIG. 2 (b) in which R 11 , R 12 , R 13 and R 14 are methyl groups, R 15 is an ethylene group and R 16 is a methylene group. A synthesis example of [N, N-dimethyl-N- (acetic acid ethyl ester-2-yl)]-ammonium-N-yl} ethane dibromide salt) is shown. In addition, the synthesis | combination of the other precursor 2 was performed according to the following.
N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン２５．０ｇをエタノール４００ｍｌに溶解させ、ブロモ酢酸エチル（１００ｍｌ）をゆっくりと滴下した。滴下後、この溶液を室温で４日間攪拌を続け、生成した沈殿を濾別した。得られた沈殿を真空乾燥して、前駆体２2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-酢酸エチルエステル臭化物塩を得た（収量６６．６ｇ、収率６９％）。 25.0 g of N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine was dissolved in 400 ml of ethanol, and ethyl bromoacetate (100 ml) was slowly added dropwise. After the dropwise addition, the solution was continuously stirred at room temperature for 4 days, and the formed precipitate was separated by filtration. The resulting precipitate was vacuum-dried to obtain precursor 22- (N, N, N-triethylammonium) -acetic acid ethyl ester bromide salt (yield 66.6 g, yield 69%).
上記で得られた化合物の同定は、ＩＲ、および1Ｈ ＮＭＲによって行われた。表１５にＩＲ解析の結果を、表１６に1Ｈ ＮＭＲ解析の結果を示す。 The compound obtained above was identified by IR and 1 H NMR. Table 15 shows the results of IR analysis, and Table 16 shows the results of 1 H NMR analysis.
表１５および１６によれば、ＩＲ、および1Ｈ ＮＭＲの結果、目的物である1,2-ビス{[N,N-ジメチル-N-(酢酸エチルエステル-2-イル)]-アンモニウム-N-イル}エタン二臭化物塩（すなわち、図１における化合物９の前駆体）が合成されたことを確認することができた。 According to Tables 15 and 16, as a result of IR and 1 H NMR, 1,2-bis {[N, N-dimethyl-N- (acetic acid ethyl ester-2-yl)]-ammonium-N It was confirmed that -yl} ethane dibromide salt (ie, the precursor of compound 9 in FIG. 1) was synthesized.
〔実施例１〕ベタインの合成
ベタイン１およびベタイン２は、共通の方法で定量的に合成することができる。ここでは、一例としてＲ1、Ｒ2、Ｒ3がエチル基でＲ6がメチレン基であるベタイン１（2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-アセテート）の合成方法を示す。
[Example 1] Synthesis of betaine Betaine 1 and betaine 2 can be quantitatively synthesized by a common method. Here, as an example, a synthesis method of betaine 1 (2- (N, N, N-triethylammonium) -acetate) in which R 1 , R 2 and R 3 are ethyl groups and R 6 is a methylene group is shown.
合成例１にて得られた前駆体１（2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-酢酸エチルエステル臭化物塩）１．０ｇを蒸留水１０ｍｌに溶解した。この溶液を陰イオン交換カラム（アンバーライト：登録商標IR-402、ローム アンド ハース社製）を充てんしたカラムに通した。溶離液をエバポレーターで減圧濃縮し、五酸化二リンの共存下、減圧乾燥し、ベタイン１（2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-アセテート）を得た（０．５９ｇ、１００％）。 1.0 g of the precursor 1 (2- (N, N, N-triethylammonium) -acetic acid ethyl ester bromide salt) obtained in Synthesis Example 1 was dissolved in 10 ml of distilled water. This solution was passed through a column packed with an anion exchange column (Amberlite: registered trademark IR-402, manufactured by Rohm and Haas). The eluent was concentrated under reduced pressure with an evaporator and dried under reduced pressure in the presence of diphosphorus pentoxide to obtain betaine 1 (2- (N, N, N-triethylammonium) -acetate) (0.59 g, 100%). .
上記で得られた化合物の同定は、ＩＲおよび1Ｈ ＮＭＲによるエステルピークの消失確認と、Ｃ、Ｈ、Ｎ元素分析による塩の混入の有無を確認することで行った。表１７にＩＲ解析の結果を、表１８に1Ｈ ＮＭＲ解析の結果を、表１９に元素分析の結果を示す。 Identification of the compound obtained above was performed by confirming disappearance of the ester peak by IR and 1 H NMR and confirming the presence or absence of salt contamination by C, H, and N elemental analysis. Table 17 shows the results of IR analysis, Table 18 shows the results of 1 H NMR analysis, and Table 19 shows the results of elemental analysis.
表１７〜１９の結果、目的物である2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-アセテート（すなわち、図１における化合物４）が得られたことが確認された。 As a result of Tables 17 to 19, it was confirmed that the desired product, 2- (N, N, N-triethylammonium) -acetate (that is, compound 4 in FIG. 1) was obtained.
図１における化合物２を合成した結果を、表２０（ＩＲ）、表２１（1Ｈ ＮＭＲ）、および表２２（元素分析）に示す。表２０〜２２によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。 The results of synthesizing compound 2 in FIG. 1 are shown in Table 20 (IR), Table 21 ( 1 H NMR), and Table 22 (elemental analysis). According to Tables 20 to 22, it was confirmed that the target compound was synthesized.
図１における化合物３を合成した結果を、表２３（ＩＲ）、表２４（1Ｈ ＮＭＲ）、および表２５（元素分析）に示す。表２３〜２５によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。 The results of synthesizing compound 3 in FIG. 1 are shown in Table 23 (IR), Table 24 ( 1 H NMR), and Table 25 (elemental analysis). According to Tables 23 to 25, it was confirmed that the target compound was synthesized.
図１における化合物５を合成した結果を、表２６（ＩＲ）、表２７（1Ｈ ＮＭＲ）、および表２８（元素分析）に示す。表２６〜２８によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。 The result of synthesizing compound 5 in FIG. 1 is shown in Table 26 (IR), Table 27 ( 1 H NMR), and Table 28 (elemental analysis). According to Tables 26 to 28, it was confirmed that the target compound was synthesized.
図１における化合物６を合成した結果を、表２９（ＩＲ）、表３０（1Ｈ ＮＭＲ）、および表３１（元素分析）に示す。表２９〜３１によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。 The results of the synthesis of compound 6 in FIG. 1 are shown in Table 29 (IR), Table 30 ( 1 H NMR), and Table 31 (elemental analysis). According to Tables 29 to 31, it was confirmed that the target compound was synthesized.
図１における化合物７を合成した結果を、表３２（ＩＲ）、表３３（1Ｈ ＮＭＲ）、および表３４（元素分析）に示す。表３２〜３４によれば目的とする化合物が合成されたことが確認できた。 The results of synthesizing compound 7 in FIG. 1 are shown in Table 32 (IR), Table 33 ( 1 H NMR), and Table 34 (elemental analysis). According to Tables 32-34, it was confirmed that the target compound was synthesized.
図１における化合物８を合成した結果を、表３５（ＩＲ）、表３６（1Ｈ ＮＭＲ）、および表３７（元素分析）に示す。表３５〜３７によれば目的とする化合物が合成されたことが確認できた。 The results of the synthesis of compound 8 in FIG. 1 are shown in Table 35 (IR), Table 36 ( 1 H NMR), and Table 37 (elemental analysis). According to Tables 35 to 37, it was confirmed that the target compound was synthesized.
〔試験例１〕ベタインのカチオンとアニオンと間のスペーサー長が二本鎖ＤＮＡの安定性に与える影響
図１に示す化合物２（スペーサー長：Ｃ3）および化合物３（スペーサー長：Ｃ5）を用いて、ベタインのカチオンとアニオンと間のスペーサー長が二本鎖ＤＮＡの安定性に与える影響を評価した。
[Test Example 1] Effect of spacer length between cation and anion of betaine on stability of double-stranded DNA Compound 2 (spacer length: C 3 ) and compound 3 (spacer length: C 5 ) shown in FIG. The effect of spacer length between betaine cation and anion on the stability of double-stranded DNA was evaluated.
比較例として、市販のグリシンベタイン（化合物１、スペーサー長：Ｃ1）を用いた。また、二本鎖ＤＮＡとしては、ＤＮＡ１（５’−ＣＧＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号１）／５’−ＣＧＧＣＧＣＣＧ−３’（自己相補鎖、配列番号２））を用いた。 As a comparative example, commercially available glycine betaine (compound 1, spacer length: C 1 ) was used. As double-stranded DNA, DNA1 (5′-CGGGCGCG-3 ′ (SEQ ID NO: 1) / 5′-CGGCGCCG-3 ′ (self-complementary strand, SEQ ID NO: 2)) was used.
融解温度の測定は、１００ｍＭ ＮａＣｌ存在下、１０ｍＭトリス緩衝溶液中（ｐＨ８．０）に、３種類のベタイン（化合物１、化合物２、化合物３）のそれぞれ、およびＤＮＡ１を添加し、融解温度の測定を行った。ＤＮＡの濃度は、ＤＮＡ１が４０μＭとなるように反応液に添加した。また、ベタインの濃度は０．５Ｍで行った。またベタインを添加していない場合の融解温度の測定を行った。融解温度は下記の通り行われた。ＵＶ融解曲線は、ペルチェ素子でサンプルセル内の温度を自動制御できるUV-1700（島津社製）を用いて測定された。融解曲線を測定するためのサンプル溶液は、測定前に一度９０℃まで加熱し一本鎖ＤＮＡに完全に融解させた後、２℃／分の速度で０℃までゆっくりと降温させ、二本鎖ＤＮＡを完全に形成させた。その後、０℃で３０分放置し、０．５℃／分の速度でサンプル溶液の温度を昇温させながら各温度における２６０ｎｍの吸光度を測定し、ＵＶ融解曲線を得た。ＵＶ融解曲線の変曲点より融解温度を算出した。 Melting temperature was measured by adding each of three types of betaine (compound 1, compound 2, compound 3) and DNA 1 in 10 mM Tris buffer solution (pH 8.0) in the presence of 100 mM NaCl, and measuring melting temperature. Went. The concentration of DNA was added to the reaction solution so that DNA1 was 40 μM. The concentration of betaine was 0.5M. In addition, the melting temperature was measured when betaine was not added. Melting temperatures were performed as follows. The UV melting curve was measured using UV-1700 (manufactured by Shimadzu Corporation) that can automatically control the temperature in the sample cell with a Peltier device. The sample solution for measuring the melting curve was heated to 90 ° C. once before melting and completely melted into single-stranded DNA, and then slowly cooled to 0 ° C. at a rate of 2 ° C./min. DNA was completely formed. Thereafter, the sample was allowed to stand at 0 ° C. for 30 minutes, and the absorbance at 260 nm at each temperature was measured while raising the temperature of the sample solution at a rate of 0.5 ° C./minute, to obtain a UV melting curve. The melting temperature was calculated from the inflection point of the UV melting curve.
図３に化合物１を反応液に添加した場合の融解温度の変化量を示す。図３の縦軸は、化合物を反応液に添加しない場合の融解温度に対して化合物を添加した場合の融解温度の変化量を示す。図３よりスペーサー長が長くなるにつれて融解温度が低下することがわかる。グリシンベタイン（化合物１、スペーサー長：Ｃ1）の場合、０．５Ｍの添加濃度ではほとんど融解温度を降下させる効果（不安定化効果）を奏さない。これに対して化合物２（スペーサー長：Ｃ3）および化合物３（スペーサー長：Ｃ5）を用いた場合、０．５Ｍの添加濃度であっても十分な不安定化効果があることがわかった。またスペーサー長が長くなるにつれて、不安定化効果が高くなることが確認された。特に化合物３（スペーサー長：Ｃ5）を用いた場合は、特に顕著な不安定化効果が確認された。 FIG. 3 shows the amount of change in melting temperature when Compound 1 is added to the reaction solution. The vertical axis in FIG. 3 shows the amount of change in melting temperature when the compound is added to the melting temperature when the compound is not added to the reaction solution. FIG. 3 shows that the melting temperature decreases as the spacer length increases. In the case of glycine betaine (compound 1, spacer length: C 1 ), the effect of degrading the melting temperature (stabilization effect) is hardly exhibited at an addition concentration of 0.5 M. On the other hand, when compound 2 (spacer length: C 3 ) and compound 3 (spacer length: C 5 ) were used, it was found that there was a sufficient destabilizing effect even at an addition concentration of 0.5M. . It was also confirmed that the destabilizing effect increased as the spacer length increased. In particular, when compound 3 (spacer length: C 5 ) was used, a particularly remarkable destabilizing effect was confirmed.
〔試験例２〕ベタインのカチオン基の特性が二本鎖ＤＮＡの安定性に与える影響
アンモニウム基に連結した置換基の化学構造の効果を、図１に示す化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物８を用いて検討した。
[Test Example 2] Effect of cationic group properties of betaine on the stability of double-stranded DNA The effects of the chemical structure of the substituent linked to the ammonium group are shown in compound 4, compound 5, compound 6, and compound shown in FIG. 7 and Compound 8 were examined.
比較例として、市販のグリシンベタイン（化合物１、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝ＣＨ3）を用いた。また、二本鎖ＤＮＡとしては、ＧＣ含量および鎖長が異なる３つの配列（ＤＮＡ１：５’−ＣＧＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号１）／５’−ＣＧＧＣＧＣＣＧ−３’（自己相補鎖、配列番号２）、ＤＮＡ２：５’−ＡＴＧＣＧＣＡＴ−３’（配列番号３）／５’−ＡＴＧＣＧＣＡＴ−３’（自己相補鎖、配列番号４）、ＤＮＡ３：５’−ＧＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧ−３’（配列番号５）／５’−ＣＧＡＴＣＧＴＡＴＣＡＡＧＡＣＡＴＧＧＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号６））を用いた。 As a comparative example, commercially available glycine betaine (Compound 1, R 1 = R 2 = R 3 = CH 3 ) was used. The double-stranded DNA includes three sequences (DNA1: 5′-CGGCGCCG-3 ′ (SEQ ID NO: 1) / 5′-CGGCGCCG-3 ′ (self-complementary strand, SEQ ID NO: 2) having different GC contents and chain lengths. ), DNA2: 5′-ATGCCGCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 3) / 5′-ATGCCGCAT-3 ′ (self-complementary strand, SEQ ID NO: 4), DNA3: 5′-GAAACCCAACGGGTTACCTGACCATGTCTTGATACGGATG-3 ′ (SEQ ID NO: 5) / 5 '-CGATCGTATCAAGACAGGGTCAGGTAACCGTGTGTGTTT-3' (SEQ ID NO: 6)) was used.
融解温度の測定は、１００ｍＭ ＮａＣｌ存在下、１０ｍＭトリス緩衝溶液中（ｐＨ８．０）に、３種類のベタイン（化合物１、化合物２、化合物３）のそれぞれ、および上記３種類のＤＮＡ（ＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３）のそれぞれを添加し、融解温度の測定を行った。ＤＮＡの濃度は、ＤＮＡ１＝４０μＭ、ＤＮＡ２＝４０μＭ、ＤＮＡ３＝２０μＭとなるように反応液に添加した。また、ベタインの濃度は０．５Ｍで行った。またベタインを添加していない場合の融解温度の測定を行った。その他の融解温度の測定方法については試験例１と同様にした。 Melting temperature was measured in the presence of 100 mM NaCl in 10 mM Tris buffer solution (pH 8.0), each of the three types of betaine (compound 1, compound 2, compound 3) and the above three types of DNA (DNA1, DNA2). Each of DNA 3) was added and the melting temperature was measured. The DNA concentrations were added to the reaction solution so that DNA1 = 40 μM, DNA2 = 40 μM, and DNA3 = 20 μM. The concentration of betaine was 0.5M. In addition, the melting temperature was measured when betaine was not added. Other melting temperature measurement methods were the same as in Test Example 1.
図４に化合物１、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、または化合物８を反応液に添加した場合の融解温度の変化量を示す。図４の化合物４、化合物５、化合物６の不安定化効果を比較した結果、アンモニウム基の構造が嵩高くなればなるほど、その効果は高くなることが示された。特に化合物６を用いた場合の不安定化効果は、比較例（化合物１）を用いた場合の１０倍を超えるものであった。また、置換基の末端に極性官能基を持つ化合物７と、置換基の末端に極性官能基を持たない化合物８との不安定化効果を比較したところ、アンモニウム基の構造の嵩高さだけでなく、置換基の末端には親水性の置換基（極性官能基）を持たないことが重要であるということがわかった。 FIG. 4 shows the amount of change in melting temperature when Compound 1, Compound 4, Compound 5, Compound 6, Compound 7, or Compound 8 is added to the reaction solution. As a result of comparing the destabilizing effects of Compound 4, Compound 5, and Compound 6 in FIG. 4, it was shown that the higher the structure of the ammonium group, the higher the effect. In particular, the destabilizing effect when using Compound 6 exceeded 10 times that when using Comparative Example (Compound 1). Further, when the destabilizing effect of the compound 7 having a polar functional group at the end of the substituent and the compound 8 having no polar functional group at the end of the substituent was compared, not only the bulkiness of the structure of the ammonium group was found. It was found that it is important that the end of the substituent does not have a hydrophilic substituent (polar functional group).
〔試験例３〕ベタインのイオン対の数が二本鎖ＤＮＡの安定性に与える影響
ベタインの分子内に存在する双性イオンの数の効果を、図１に示す化合物９を用いて検討した。測定条件は試験例１の条件と同一の条件で行った。比較例として、市販のグリシンベタイン（化合物１、双性イオン数：１）を用いた。
[Test Example 3] Effect of the number of betaine ion pairs on the stability of double-stranded DNA The effect of the number of zwitterions present in the molecule of betaine was examined using Compound 9 shown in FIG. The measurement conditions were the same as those in Test Example 1. As a comparative example, commercially available glycine betaine (compound 1, number of zwitterions: 1) was used.
図５に化合物１または化合物９を反応液に添加した場合の融解温度の変化量を示す。図５より、類似したスペーサー長およびアンモニウム基の化学構造を持つベタイン同士を比較すると、双性イオンの数が多い方が不安定化効果が高くなるということが示された。 FIG. 5 shows the amount of change in melting temperature when Compound 1 or Compound 9 is added to the reaction solution. FIG. 5 shows that when betaines having similar spacer lengths and chemical structures of ammonium groups are compared with each other, the effect of destabilization becomes higher as the number of zwitterions increases.
〔試験例４〕ベタインの添加濃度と不安定化効果の検討
図１に示す化合物６を用いて添加濃度と融解温度を降下させる効果と関係を検討した。ＤＮＡ３を使用し、化合物の添加濃度を種々変化させる以外は、試験例１と同一の条件下で行った。比較例として、市販のグリシンベタイン（化合物１）を用いた。
Test Example 4 Examination of Betaine Addition Concentration and Destabilizing Effect The relationship between the addition concentration and the effect of lowering the melting temperature was examined using Compound 6 shown in FIG. The test was performed under the same conditions as in Test Example 1 except that DNA 3 was used and the concentration of the compound added was variously changed. As a comparative example, commercially available glycine betaine (Compound 1) was used.
図６に化合物１または化合物６を反応液に添加した場合の融解温度の変化量を示す。図６における直線の傾きがＤＮＡに対する不安定化効果を示すものである。図６よれば市販のグリシンベタイン（化合物１）の直線の傾きが−２．１（℃／Ｍ）であったのに対して、化合物６の直線の傾きは−２３．２（℃／Ｍ）であった。すなわち、化合物６の直線の傾きは、市販のグリシンベタイン（化合物１）の直線の傾きに対して１１倍であるということがわかった。この結果は、化合物６を用いてグリシンベタイン（化合物１）と同様の効果を得るためには、グリシンベタイン（化合物１）の１１分の１の添加量で足りるということを示している。 FIG. 6 shows the amount of change in melting temperature when Compound 1 or Compound 6 is added to the reaction solution. The slope of the straight line in FIG. 6 shows the destabilizing effect on DNA. According to FIG. 6, the slope of the straight line of commercially available glycine betaine (Compound 1) was −2.1 (° C./M), whereas the slope of the straight line of Compound 6 was −23.2 (° C./M). Met. That is, it was found that the slope of the straight line of Compound 6 was 11 times that of the commercially available glycine betaine (Compound 1). This result shows that an addition amount of 1/11 of glycine betaine (compound 1) is sufficient to obtain the same effect as glycine betaine (compound 1) using compound 6.
〔試験例５〕ベタインがタンパク質の高次構造に与える影響
本発明にかかる組成物を構成するベタインのタンパク質の高次構造に与える影響を、図１に示す化合物６を用いて検討した。タンパク質としては、αへリックス、βシートなどの高次構造の含量の異なる３つの一般的なタンパク質（γグロブリン、コンカナバリンＡ、牛血清アルブミン）を用いて評価した。評価は、１００ｍＭ ＮａＣｌ存在下、１０ｍＭトリス緩衝溶液中（ｐＨ８．０）に、化合物６（添加濃度：０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５Ｍ）、および上記３種類のタンパク質（γグロブリン、コンカナバリンＡ、または牛血清アルブミン）を添加し、円二色性スペクトルを測定することにより行われた。タンパク質の添加濃度は、[γグロブリン]＝１．０ｍｇ／ｍｌ、[コンカナバリンＡ]＝０．８ｍｇ／ｍｌ、[牛血清アルブミン]＝０．２ｍｇ／ｍｌであった。
[Test Example 5] Effect of betaine on protein conformation The effect of betaine constituting the composition of the present invention on the protein conformation was examined using Compound 6 shown in FIG. As proteins, three general proteins (γ globulin, concanavalin A, bovine serum albumin) having different high-order structure contents such as α helix and β sheet were evaluated. Evaluation was made in the presence of 100 mM NaCl in 10 mM Tris buffer solution (pH 8.0), compound 6 (addition concentrations: 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 M), and The above three types of proteins (γ globulin, concanavalin A, or bovine serum albumin) were added, and the circular dichroism spectrum was measured. The addition concentrations of protein were [γ globulin] = 1.0 mg / ml, [concanavalin A] = 0.8 mg / ml, and [bovine serum albumin] = 0.2 mg / ml.
図７に円二色性スペクトルの結果を示す。図７（ａ）はγグロブリンの結果、（ｂ）はコンカナバリンＡの結果、（ｃ）は牛血清アルブミンの結果を示す。図７に示すいずれの結果においても、ベタイン濃度の上昇に伴って円二色性スペクトルの強度が変化することはなかった。よって、本発明にかかる組成物を構成するベタイン（化合物６）はタンパク質の高次構造を変化させない、すなわちタンパク質を変性させないということが明らかとなった。 FIG. 7 shows the results of the circular dichroism spectrum. FIG. 7 (a) shows the results for gamma globulin, (b) shows the results for concanavalin A, and (c) shows the results for bovine serum albumin. In any of the results shown in FIG. 7, the intensity of the circular dichroism spectrum did not change as the betaine concentration increased. Therefore, it became clear that betaine (compound 6) constituting the composition according to the present invention does not change the higher order structure of the protein, that is, does not denature the protein.
〔試験例６〕本発明にかかる組成物を構成するベタインがＰＣＲに与える効果
本発明にかかる組成物を構成するベタインを添加することによって、高いＧＣ含量を有し、一般的なＰＣＲ条件下では増幅されないＤＮＡ配列を増幅し得るかどうかについて、図１に示す化合物６を用いて検討した。比較例として、市販のグリシンベタイン（化合物１）を用いた。
[Test Example 6] Effect of betaine constituting the composition according to the present invention on PCR By adding betaine constituting the composition according to the present invention, it has a high GC content, and under general PCR conditions. Whether or not a DNA sequence that is not amplified can be amplified was examined using Compound 6 shown in FIG. As a comparative example, commercially available glycine betaine (Compound 1) was used.
上記検討は、ヒトゲノム中のＤＩＰ２Ａ（アンプリコンのＧＣ含量は７１％、１１８５ｂｐ）をＰＣＲ増幅することによって行われた。当該ＤＮＡ配列は融解温度が極めて高く非常に安定である。よって、添加剤を添加しない通常の条件下でのＰＣＲでは、当該ＤＮＡ配列を全く増幅することができない。ＤＩＰ２ＡおよびそのＰＣＲについては「M. Ralser, R. Querfurth, H. - J. Warnatz, H. Lehrach, M. - L. Yaspo, S. Krobitsch, Biocem. Biophys. Chem. Commun., 347, 747-751 (2006)」を参照のこと。 The above examination was performed by PCR amplification of DIP2A (GC content of amplicon was 71%, 1185 bp) in the human genome. The DNA sequence has a very high melting temperature and is very stable. Accordingly, the DNA sequence cannot be amplified at all by PCR under normal conditions where no additive is added. For DIP2A and its PCR, see "M. Ralser, R. Querfurth, H.-J. Warnatz, H. Lehrach, M.-L. Yaspo, S. Krobitsch, Biocem. Biophys. Chem. Commun., 347, 747- 751 (2006).
ゲノムＤＮＡは発明者の口腔粘膜細胞を採取し、DNeasy Tissue Kit（キアゲン社製、登録商標）にて精製した。プライマーは５‘−ａｇｇｇｇａａｇｇａａｇｃａｇｇａｃｔ−３’（配列番号７）、５‘−ｃａｇｃｔｃａｇｃｃａｇｇｃｔｃｔｃ−３’（配列番号８）を用いた。ＰＣＲは３０μｌのvolumeで行い、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡社製、登録商標）を使用した。またプライマー濃度は０．６μＭ、ｄＮＴＰ濃度は２５μＭ、ＤＮＡポリメラーゼは０．５Ｕに調整し、鋳型となるゲノムＤＮＡは５０ｎｇの濃度で添加した。サイクルは９４℃で４分の後、９４℃で１分→７２℃で２分を４０回繰り返し、最後に７２℃で９分間、伸長反応を行った。 Genomic DNA was collected from the oral mucosa cells of the inventor and purified with DNeasy Tissue Kit (Qiagen, registered trademark). As the primer, 5'-aggggaaggaagcaggact-3 '(SEQ ID NO: 7) and 5'-cagctcaccccggctctc-3' (SEQ ID NO: 8) were used. PCR was performed in a volume of 30 μl, and KOD-Plus-ver. 2 (registered trademark, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used. The primer concentration was adjusted to 0.6 μM, the dNTP concentration was adjusted to 25 μM, the DNA polymerase was adjusted to 0.5 U, and the genomic DNA serving as a template was added at a concentration of 50 ng. The cycle was 94 ° C. for 4 minutes, then 94 ° C. for 1 minute → 72 ° C. for 2 minutes 40 times, and finally the extension reaction was performed at 72 ° C. for 9 minutes.
図８に化合物１または６を１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、４００ｍＭ、８００ｍＭ、１０００ｍＭの濃度添加してＰＣＲを行った場合の増幅産物の電気泳動図を示す。図８の結果より、添加剤（化合物１または６）を加えることによって、目的とするアンプリコンが増幅するということが確認された。アンプリコンの増幅は、比較例として用いた化合物１の場合でも、化合物６の場合でも確認されたが、化合物１では４００ｍＭ以上を添加しなければ増幅されないのに対して、本発明にかかる組成物を構成する化合物６ではその２０分の１の濃度である２０ｍＭであっても増幅が確認された。よって、本発明にかかる組成物を構成する化合物６によれば、低濃度であっても、これまで増幅が困難であった高いＧＣ含量のＤＮＡを十分増幅できるということがわかった。 FIG. 8 shows an electrophoretogram of the amplification product when PCR is carried out with compound 1 or 6 added at a concentration of 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM, 800 mM, or 1000 mM. From the results of FIG. 8, it was confirmed that the target amplicon was amplified by adding the additive (compound 1 or 6). The amplification of the amplicon was confirmed in the case of Compound 1 used as a comparative example and in the case of Compound 6, but in Compound 1, it was not amplified unless 400 mM or more was added, whereas the composition according to the present invention was Amplification was confirmed even in the case of 20 mM, which is a concentration of 1/20 of the compound 6 that constitutes. Therefore, it was found that the compound 6 constituting the composition according to the present invention can sufficiently amplify DNA having a high GC content that has been difficult to amplify even at a low concentration.
上記の通り本発明によれば、これまで困難であったＧＣ含量の高い核酸領域を熱変性させることが可能となり、当該ＧＣ含量の高い核酸領域であっても効率よく合成することができるという効果を享受できる。また本発明によれば、ＧＣ含量の高い核酸領域の合成を可能にするベタインを、簡便かつ効率的に製造することができるという効果を享受できる。 As described above, according to the present invention, a nucleic acid region having a high GC content, which has been difficult until now, can be thermally denatured, and even a nucleic acid region having a high GC content can be efficiently synthesized. Can be enjoyed. Further, according to the present invention, it is possible to enjoy the effect that betaine that enables synthesis of a nucleic acid region having a high GC content can be produced simply and efficiently.
ＰＣＲをはじめとする核酸合成技術は、分子生物学等の学術分野のみならず、(a)髪の毛、口腔粘膜細胞から抽出したゲノムＤＮＡを使った遺伝子鑑定、(b)遺伝子診断、(c)食品の原産地検査や品種鑑定、(d)犯罪捜査における遺伝子鑑定、(e)細胞内におけるｍＲＮＡの産生を調査するＲＴ−ＰＣＲ等、広範な分野においてに利用可能である。それゆえ本発明は、ＰＣＲ等の核酸合成を利用する全ての産業（医薬品産業、農業、食品産業、水産業、畜産業等）において利用可能である。 Nucleic acid synthesis technology such as PCR is not only applied to academic fields such as molecular biology, but also (a) gene identification using genomic DNA extracted from hair and oral mucosal cells, (b) genetic diagnosis, (c) food It can be used in a wide range of fields, such as inspection of origin and cultivar identification, (d) gene identification in criminal investigations, and (e) RT-PCR that investigates production of mRNA in cells. Therefore, the present invention can be used in all industries (pharmaceutical industry, agriculture, food industry, fishery industry, livestock industry, etc.) using nucleic acid synthesis such as PCR.
Claims (21)
当該組成物が、以下の一般式（１）および一般式（２）で表される化合物からなる群から選択される１つ以上の化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴とする組成物：
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ａ1は長周期型周期表における５Ｂ族元素、かつ
Ｚ1は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表し、かつ
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である；
Ｒ15およびＲ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、また２つのＲ16は同一であっても異なっていてもよく、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ａ11およびＡ12は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、同一であっても異なっていてもよく、かつ
Ｚ11は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表し、２つのＺ11は同一であっても異なっていてもよく、かつ
下記の（III）または（IV）の１つ以上を満たす：
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。 A composition used in the synthesis of nucleic acid,
The composition comprises one or more compounds selected from the group consisting of compounds represented by the following general formula (1) and general formula (2), or salts or derivatives thereof: object:
(I) any one or more of R 1 , R 2 , and R 3 is a group having 2 or more carbon atoms,
(II) R 6 is a group having 3 or more carbon atoms;
(III) any one or more of R 11 , R 12 , R 13 and R 14 is a group having 2 or more carbon atoms,
(IV) Any one or more of R 15 and R 16 is a group having 3 or more carbon atoms.
当該該組成物が、以下の一般式（１’）および一般式（２’）で表される化合物からなる群から選択される１つ以上の化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴とする組成物：
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である；
Ｒ15およびＲ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、また２つのＲ16は同一であっても異なっていてもよく、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
下記の（III）または（IV）の１つ以上を満たす：
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。 A composition used in the synthesis of nucleic acid,
The composition comprises one or more compounds selected from the group consisting of compounds represented by the following general formula (1 ′) and general formula (2 ′), or salts or derivatives thereof: Composition to:
(I) any one or more of R 1 , R 2 , and R 3 is a group having 2 or more carbon atoms,
(II) R 6 is a group having 3 or more carbon atoms;
(III) any one or more of R 11 , R 12 , R 13 and R 14 is a group having 2 or more carbon atoms,
(IV) Any one or more of R 15 and R 16 is a group having 3 or more carbon atoms.
Ａ1は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、；
Ｒ7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ1はハロゲンを表し、
Ｚ1は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表す。 Production of a zwitterionic compound comprising a reaction step of reacting a compound represented by the following general formula (3) and a compound represented by the general formula (4) in the presence of an ester solvent: Method:
A 1 represents a group 5B element in the long-period periodic table;
R 7 is an alkyl group, an aryl group, an alkenyl group, or an alkynyl group, and X 1 represents a halogen,
Z 1 represents —COO, —SO 3 , —NO 3 , or —HPO 4 .
Ａ1は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、；
Ｒ7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ1は、ハロゲンを表し、
Ｚ1は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表し、
さらに下記の（I）または（II）の１つ以上の条件を満たす：
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である。 Production of a zwitterionic compound comprising a reaction step of reacting a compound represented by the following general formula (3) and a compound represented by the general formula (4) in the presence of an ester solvent: Method:
A 1 represents a group 5B element in the long-period periodic table;
R 7 is an alkyl group, aryl group, alkenyl group, or alkynyl group, and X 1 represents halogen,
Z 1 represents —COO, —SO 3 , —NO 3 , or —HPO 4 ;
Furthermore, one or more of the following conditions (I) or (II) is satisfied:
(I) any one or more of R 1 , R 2 , and R 3 is a group having 2 or more carbon atoms,
(II) R 6 is a group having 3 or more carbon atoms.
Ｒ15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ａ11およびＡ12は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、同一であっても異なっていてもよく；
Ｒ17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ11はハロゲンを表し、
Ｚ11は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表す。 A method for producing a zwitterionic compound comprising a reaction step of reacting a compound represented by the following general formula (5) with a compound represented by the general formula (6) in the presence of an alcohol: :
A 11 and A 12 represent Group 5B elements in the long-period periodic table, which may be the same or different;
R 17 is an alkyl group, aryl group, alkenyl group, or alkynyl group, and X 11 represents halogen,
Z 11 represents —COO, —SO 3 , —NO 3 , or —HPO 4 .
Ｒ15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ａ11およびＡ12は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、同一であっても異なっていてもよく；
Ｒ17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、
Ｘ11は、ハロゲンを表し、
Ｚ11は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表し、
さらに下記の（III）または（IV）の１つ以上を満たす：
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。 A method for producing a zwitterionic compound comprising a reaction step of reacting a compound represented by the following general formula (5) with a compound represented by the general formula (6) in the presence of an alcohol: :
A 11 and A 12 represent Group 5B elements in the long-period periodic table, which may be the same or different;
R 17 is an alkyl group, an aryl group, an alkenyl group, or an alkynyl group,
X 11 represents halogen,
Z 11 represents —COO, —SO 3 , —NO 3 , or —HPO 4 ;
Furthermore, one or more of the following (III) or (IV) is satisfied:
(III) any one or more of R 11 , R 12 , R 13 and R 14 is a group having 2 or more carbon atoms,
(IV) Any one or more of R 15 and R 16 is a group having 3 or more carbon atoms.
Ｒ7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ1はハロゲンを表す。 A method for producing betaine, comprising a reaction step of reacting a compound represented by the following general formula (3 ′) and a compound represented by the general formula (4 ′) in the presence of an ester solvent. :
R 7 is an alkyl group, an aryl group, an alkenyl group, or an alkynyl group, and X 1 represents a halogen.
Ｒ7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ1は、ハロゲンを表し、
さらに下記の（I）または（II）の１つ以上の条件を満たす：
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である。 A method for producing betaine, comprising a reaction step of reacting a compound represented by the following general formula (3 ′) and a compound represented by the general formula (4 ′) in the presence of an ester solvent. :
R 7 is an alkyl group, aryl group, alkenyl group, or alkynyl group, and X 1 represents halogen,
Furthermore, one or more of the following conditions (I) or (II) is satisfied:
(I) any one or more of R 1 , R 2 , and R 3 is a group having 2 or more carbon atoms,
(II) R 6 is a group having 3 or more carbon atoms.
Ｒ15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり；
Ｒ17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ11は、ハロゲンを表す。 A method for producing betaine, comprising a reaction step of reacting a compound represented by the following general formula (5 ′) with a compound represented by the general formula (6 ′) in the presence of an alcohol:
R 17 represents an alkyl group, an aryl group, an alkenyl group, or an alkynyl group, and X 11 represents a halogen.
Ｒ15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり；
Ｒ17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、
Ｘ11は、ハロゲンを表し、
さらに下記の（III）または（IV）の１つ以上を満たす：
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。 A method for producing betaine, comprising a reaction step of reacting a compound represented by the following general formula (5 ′) with a compound represented by the general formula (6 ′) in the presence of an alcohol:
R 17 is an alkyl group, an aryl group, an alkenyl group, or an alkynyl group,
X 11 represents halogen,
Furthermore, one or more of the following (III) or (IV) is satisfied:
(III) any one or more of R 11 , R 12 , R 13 and R 14 is a group having 2 or more carbon atoms,
(IV) Any one or more of R 15 and R 16 is a group having 3 or more carbon atoms.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007270700A JP4761265B2 (en) | 2007-10-17 | 2007-10-17 | COMPOSITION CONTAINING COMPOUND FOR PROMOTING NUCLEIC ACID SYNTHESIS, USE THEREOF, AND METHOD FOR PRODUCING THE COMPOUND |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007270700A JP4761265B2 (en) | 2007-10-17 | 2007-10-17 | COMPOSITION CONTAINING COMPOUND FOR PROMOTING NUCLEIC ACID SYNTHESIS, USE THEREOF, AND METHOD FOR PRODUCING THE COMPOUND |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009096766A true JP2009096766A (en) | 2009-05-07 |
| JP4761265B2 JP4761265B2 (en) | 2011-08-31 |
Family
ID=40700101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007270700A Active JP4761265B2 (en) | 2007-10-17 | 2007-10-17 | COMPOSITION CONTAINING COMPOUND FOR PROMOTING NUCLEIC ACID SYNTHESIS, USE THEREOF, AND METHOD FOR PRODUCING THE COMPOUND |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4761265B2 (en) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011048201A1 (en) | 2009-10-22 | 2011-04-28 | Grindeks, A Joint Stock Company | Use of 4-[ethyl(dimethyl)ammonio]butanoate in the treatment of cardiovascular disease |
| WO2012146737A1 (en) | 2011-04-27 | 2012-11-01 | Grindeks, A Joint Stock Company | 4-[(haloalkyl)(dimethyl)ammonio]butanoates and use thereof in the treatment of cardiovascular disease |
| WO2012146736A1 (en) | 2011-04-27 | 2012-11-01 | Grindeks, A Joint Stock Company | Use of 3-carboxy-n-ethyl-n,n-dimethylpropan-1-aminium salts in the treatment of cardiovascular disease |
| WO2013035856A1 (en) * | 2011-09-09 | 2013-03-14 | 学校法人甲南学園 | Enzyme reaction method using hydrolase and achieving enhanced reaction efficiency |
| JP2015093843A (en) * | 2013-11-11 | 2015-05-18 | 株式会社タピック | Method of synthesizing betaine |
| EP2934572A4 (en) * | 2012-12-20 | 2016-11-23 | Biomatrica Inc | Formulations and methods for stabilizing pcr reagents |
| US9845489B2 (en) | 2010-07-26 | 2017-12-19 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing DNA, RNA and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
| US9999217B2 (en) | 2010-07-26 | 2018-06-19 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing DNA, RNA, and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
| US10064404B2 (en) | 2014-06-10 | 2018-09-04 | Biomatrica, Inc. | Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures |
| US10568317B2 (en) | 2015-12-08 | 2020-02-25 | Biomatrica, Inc. | Reduction of erythrocyte sedimentation rate |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09511133A (en) * | 1994-01-31 | 1997-11-11 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | Method for removal of DNA sequencing artifacts |
| US6114150A (en) * | 1995-11-29 | 2000-09-05 | Yale University | Amplification of nucleic acids |
| JP2002505886A (en) * | 1998-03-13 | 2002-02-26 | ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド | Compositions and methods for enhancing the synthesis of nucleic acid molecules |
-
2007
- 2007-10-17 JP JP2007270700A patent/JP4761265B2/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09511133A (en) * | 1994-01-31 | 1997-11-11 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | Method for removal of DNA sequencing artifacts |
| US6114150A (en) * | 1995-11-29 | 2000-09-05 | Yale University | Amplification of nucleic acids |
| JP2002505886A (en) * | 1998-03-13 | 2002-02-26 | ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド | Compositions and methods for enhancing the synthesis of nucleic acid molecules |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011048201A1 (en) | 2009-10-22 | 2011-04-28 | Grindeks, A Joint Stock Company | Use of 4-[ethyl(dimethyl)ammonio]butanoate in the treatment of cardiovascular disease |
| US9845489B2 (en) | 2010-07-26 | 2017-12-19 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing DNA, RNA and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
| US9999217B2 (en) | 2010-07-26 | 2018-06-19 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing DNA, RNA, and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
| WO2012146737A1 (en) | 2011-04-27 | 2012-11-01 | Grindeks, A Joint Stock Company | 4-[(haloalkyl)(dimethyl)ammonio]butanoates and use thereof in the treatment of cardiovascular disease |
| WO2012146736A1 (en) | 2011-04-27 | 2012-11-01 | Grindeks, A Joint Stock Company | Use of 3-carboxy-n-ethyl-n,n-dimethylpropan-1-aminium salts in the treatment of cardiovascular disease |
| WO2013035856A1 (en) * | 2011-09-09 | 2013-03-14 | 学校法人甲南学園 | Enzyme reaction method using hydrolase and achieving enhanced reaction efficiency |
| JPWO2013035856A1 (en) * | 2011-09-09 | 2015-03-23 | 学校法人甲南学園 | Enzyme reaction method to increase the reaction efficiency of hydrolase |
| EP2934572A4 (en) * | 2012-12-20 | 2016-11-23 | Biomatrica Inc | Formulations and methods for stabilizing pcr reagents |
| JP2015093843A (en) * | 2013-11-11 | 2015-05-18 | 株式会社タピック | Method of synthesizing betaine |
| US10064404B2 (en) | 2014-06-10 | 2018-09-04 | Biomatrica, Inc. | Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures |
| US10772319B2 (en) | 2014-06-10 | 2020-09-15 | Biomatrica, Inc. | Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures |
| US11672247B2 (en) | 2014-06-10 | 2023-06-13 | Biomatrica, Inc. | Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures |
| US10568317B2 (en) | 2015-12-08 | 2020-02-25 | Biomatrica, Inc. | Reduction of erythrocyte sedimentation rate |
| US11116205B2 (en) | 2015-12-08 | 2021-09-14 | Biomatrica, Inc. | Reduction of erythrocyte sedimentation rate |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4761265B2 (en) | 2011-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4761265B2 (en) | COMPOSITION CONTAINING COMPOUND FOR PROMOTING NUCLEIC ACID SYNTHESIS, USE THEREOF, AND METHOD FOR PRODUCING THE COMPOUND | |
| JP6454243B2 (en) | Production of closed linear DNA | |
| ES2813324T3 (en) | Production of closed linear DNA | |
| US9012183B2 (en) | Use of template switching for DNA synthesis | |
| CN113795579A (en) | RNA polymerase variants for co-transcriptional capping | |
| EP2692870A1 (en) | Method for nucleic acid amplification | |
| BR112021002779A2 (en) | compositions and methods to improve library enrichment | |
| KR20220159966A (en) | Improve DNA synthesis yield | |
| JP2021530479A (en) | Enzymatic synthesis of 4'-ethylnucleoside analogs | |
| CN116615560A (en) | Reagents for large-scale parallel nucleic acid sequencing | |
| JP2018506989A (en) | Nucleic acid amplification and library preparation | |
| WO2001075139A1 (en) | Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization | |
| WO2020214589A1 (en) | Modified nucleotides and methods for dna and rna polymerization and sequencing | |
| JP2009221168A (en) | Nucleoside or nucleotide derivative, nucleic acid derivative, target substance-capturing material, method for capturing and/or releasing target substance, and hemin aptamer | |
| CA3175780A1 (en) | Terminal deoxynucleotidyl transferase variants and uses thereof | |
| JP5652843B2 (en) | DNA amplification method | |
| KR20210084431A (en) | Improved yield of DNA synthesis | |
| NZ335426A (en) | Stabilized aqueous nucleoside triphosphate solution | |
| JP4942160B2 (en) | Method for isothermal amplification of nucleic acid using RecA protein | |
| JP5618227B2 (en) | Nucleic acid amplification method and gene mutation detection method | |
| WO2024024583A1 (en) | Fragmentation and tagmentation method for next-generation sequence analysis and like | |
| EP4314314A1 (en) | Methods and kits for enzymatic synthesis of g4-prone polynucleotides | |
| JP6176694B2 (en) | Method for detecting guanine and abasic sites in DNA | |
| KR20240047357A (en) | Compositions and methods for pairwise sequencing | |
| JP2015139426A (en) | METHOD FOR PRODUCING NOVEL β-AMINO ACID |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100907 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20101019 |
|
| A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20101111 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101124 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110124 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110215 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110302 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110517 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110530 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140617 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 4761265 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |