JP2009092654A - Screening kit including fluorescent labeling agent, and screening method - Google Patents

Screening kit including fluorescent labeling agent, and screening method Download PDF

Info

Publication number
JP2009092654A
JP2009092654A JP2008240242A JP2008240242A JP2009092654A JP 2009092654 A JP2009092654 A JP 2009092654A JP 2008240242 A JP2008240242 A JP 2008240242A JP 2008240242 A JP2008240242 A JP 2008240242A JP 2009092654 A JP2009092654 A JP 2009092654A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
screening
fluorescent labeling
peptide
amino acid
fluorescent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2008240242A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Masahiko Shishido
昌彦 宍戸
Mizuo Kitamatsu
瑞生 北松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Okayama University NUC
Original Assignee
Okayama University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Okayama University NUC filed Critical Okayama University NUC
Priority to JP2008240242A priority Critical patent/JP2009092654A/en
Publication of JP2009092654A publication Critical patent/JP2009092654A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a screening kit executable in solution environment similar to a living body in screening probe molecules that can be bound to or interact with specific protein or cells, from a candidate compound group, and a screening method executable in the solution environment similar to the living body. <P>SOLUTION: This screening is carried out by the kit containing multiple kinds of fluorescent labeling agents different in fluorescent wavelength and/or exciting wavelength. The screening is carried out using the kit by a method including processes for (1) adding the fluorescent labeling agent to the candidate compound, (2) mixing the specific protein or cell with an object compound with the fluorescent labeling agent added in (1), in an aqueous solution, (3) fractioning a material mixed in (2), (4) measuring a two-dimensional fluorescent spectrum on each fraction, and (5) analyzing the measured result of the two-dimensional fluorescent spectrum. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、特定の細胞や特定のタンパク質に結合若しくは相互作用しうるプローブ分子を、候補化合物群からスクリーニングするためのスクリーニング用キットに関し、更には該スクリーニング用キットを用いたスクリーニング方法に関する。   The present invention relates to a screening kit for screening a candidate molecule group for a probe molecule that can bind to or interact with a specific cell or a specific protein, and further relates to a screening method using the screening kit.

薬剤探索方法としては、多数の化合物ライブラリー中から特定のプローブ分子を選択する方法が有用である。従来、これらの方法には例えば、リボソームセレクション（非特許文献１〜３参照）、特開２００４−５０６８９８公報（特許文献１）や特開２００７−８９４９０（特許文献２）にあるようなファージディスプレイ、特開平９−１０１３０６（特許文献３）のような１ビーズ−１ペプチドライブラリー、その他にも特開２００２−１０７３６４（特許文献４）のような基板や特開２００４−５３７９７５（特許文献５）にあるような細胞をライブラリーの担体として利用したものなどが使われている。   As a drug search method, a method of selecting a specific probe molecule from a large number of compound libraries is useful. Conventionally, these methods include, for example, ribosome selection (see Non-Patent Documents 1 to 3), phage display as described in JP-A-2004-506898 (Patent Document 1) and JP-A-2007-89490 (Patent Document 2), 1-bead-1 peptide library as disclosed in JP-A-9-101306 (Patent Document 3), other substrates such as JP-A-2002-107364 (Patent Document 4) and JP-A 2004-537975 (Patent Document 5). Some cells are used as a library carrier.

従来技術では、ＲＮＡ共存下、基板上、あるいは固体ビーズ上などで標的タンパク質や細胞と結合する分子を探索していた。これらの方法では、標的タンパク質とプローブ分子との結合を、ＲＮＡ共存下、基板上又は固体ビーズ上などで検出しなければならなかった。そのためにこの方法で見出された分子は、それらを基板、ＲＮＡ又はビーズから切り離すと標的タンパク質には結合しなくなることが多かった。プローブ分子のスクリーニングを生体類似の水溶液環境で行うことができれば、この問題は解決する。しかし水溶液中で多くの成分を同時に定量する方法が今まで見出されていなかったために、これは不可能であった。
L.C. Mattheakis et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9022-9026 (1994). J. Hanes et. al. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4939-4942 (1997). J. Hanes et. al. Methods Enzymol., 328, 404-430 (2000). 特開２００４−５０６８９８号公報 特開２００７−８９４９０号公報 特開平９−１０１３０６号公報 特開２００２−１０７３６４号公報 特開２００４−５３７９７５号公報 In the prior art, molecules that bind to target proteins or cells in the presence of RNA, on a substrate, or on solid beads have been searched. In these methods, the binding between the target protein and the probe molecule must be detected on a substrate or a solid bead in the presence of RNA. For this reason, molecules found in this way often did not bind to the target protein when they were detached from the substrate, RNA or beads. This problem can be solved if screening of probe molecules can be carried out in an aqueous solution environment similar to that of a living body. However, this has not been possible because no method has been found for quantifying many components simultaneously in an aqueous solution.
LC Mattheakis et. Al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9022-9026 (1994). J. Hanes et. Al. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4939-4942 (1997). J. Hanes et.al.Methods Enzymol., 328, 404-430 (2000). JP 2004-506898 A JP 2007-89490 A JP-A-9-101306 JP 2002-107364 A JP 2004-537975 A

本発明は、特定のタンパク質又は細胞と結合若しくは相互作用しうるプローブ分子を候補化合物群からスクリーニングするに際し、生体類似の溶液環境で実施可能なスクリーニング用キットを提供することを課題とし、更には生体類似の溶液環境で実施可能なスクリーニング方法を提供することを課題とする。   An object of the present invention is to provide a screening kit that can be carried out in a solution environment similar to a living body when screening a probe molecule that can bind to or interact with a specific protein or cell from a group of candidate compounds. It is an object of the present invention to provide a screening method that can be performed in a similar solution environment.

蛍光波長及び／又は励起波長が異なる複数種の蛍光標識用非天然アミノ酸を含むキットによる。さらには、該キットを用いて、以下の工程を含む方法による。１）候補化合物に蛍光標識用非天然アミノ酸ユニットを付加する工程；２）特定のタンパク質又は細胞と、上記１）の蛍光標識用非天然アミノ酸ユニットを付加した対象化合物を水溶液中で混合する工程；３）上記２）で混合した物質を分画する工程；４）上記３）で得た、各分画について、２次元蛍光スペクトルを測定する工程；５）２次元蛍光スペクトルの測定結果を解析する工程。   According to a kit containing a plurality of types of non-natural amino acids for fluorescent labeling having different fluorescence wavelengths and / or excitation wavelengths. Furthermore, it is based on the method including the following processes using this kit. 1) a step of adding a fluorescent labeling unnatural amino acid unit to a candidate compound; 2) a step of mixing a specific protein or cell and the target compound to which the fluorescent labeling unnatural amino acid unit of 1) above is added in an aqueous solution; 3) Step of fractionating the substance mixed in 2) above; 4) Step of measuring the two-dimensional fluorescence spectrum for each fraction obtained in 3) above; 5) Analyzing the measurement result of the two-dimensional fluorescence spectrum Process.

すなわち本発明は以下よりなる。
１．蛍光波長及び／又は励起波長が各々異なる少なくとも３種類の蛍光標識剤を構成要素とし、２次元蛍光スペクトル解析を用いて、候補化合物群から、特定のタンパク質又は細胞と結合若しくは相互作用しうる物質をスクリーニングするためのスクリーニング用キット。
２．蛍光標識剤が蛍光標識非天然アミノ酸である前項１に記載のスクリーニング用キット。
３．蛍光標識剤の両端に水溶性物質が付加されている構造からなる蛍光標識用ユニットを含む前項１又は２に記載のスクリーニング用キット。
４．蛍光標識用ユニットが、蛍光標識用非天然アミノ酸ユニットであり、蛍光標識非天然アミノ酸の両端に水溶性アミノ酸が付加されているペプチド配列を含む前項３に記載のスクリーニング用キット。
５．蛍光標識用非天然アミノ酸ユニットが、蛍光標識非天然アミノ酸の両端に水溶性アミノ酸が付加されているペプチド配列と、そのＮ側、Ｃ側または両側にさらに水溶性リンカー化合物を含むことを特徴とする前項４に記載のスクリーニング用キット。
６．前項１〜５のいずれか１に記載のキットを用いて、候補化合物群から、特定のタンパク質又は細胞と結合若しくは相互作用しうる物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。
７．少なくとも以下の工程を含む、前項６に記載のスクリーニング方法：
１）候補化合物に蛍光標識剤を付加する工程；
２）特定のタンパク質又は細胞と、上記１）の蛍光標識剤を付加した対象化合物を水溶液中で混合する工程；
３）上記２）で混合した物質を分画する工程；
４）上記３）で得た、各分画について、２次元蛍光スペクトルを測定する工程；
５）２次元蛍光スペクトルの測定結果を解析する工程。
８．候補化合物が、アミノ酸残基数が３〜５０の長さからなるペプチドである、前項６又は７に記載のスクリーニング方法。 That is, this invention consists of the following.
1. A substance capable of binding to or interacting with a specific protein or cell from a group of candidate compounds using at least three types of fluorescent labeling agents each having a different fluorescence wavelength and / or excitation wavelength as components, and using two-dimensional fluorescence spectrum analysis Screening kit for screening.
2. 2. The screening kit according to item 1 above, wherein the fluorescent labeling agent is a fluorescently labeled unnatural amino acid.
3. 3. The screening kit according to item 1 or 2, comprising a fluorescent labeling unit having a structure in which a water-soluble substance is added to both ends of the fluorescent labeling agent.
4). 4. The screening kit according to item 3, wherein the fluorescent labeling unit is a non-natural amino acid unit for fluorescent labeling, and includes a peptide sequence in which water-soluble amino acids are added to both ends of the fluorescently labeled nonnatural amino acid.
5). The non-natural amino acid unit for fluorescent labeling includes a peptide sequence in which water-soluble amino acids are added to both ends of the fluorescently labeled non-natural amino acid and a water-soluble linker compound on the N side, C side or both sides thereof. 5. The screening kit according to item 4.
6). 6. A screening method comprising screening a substance capable of binding to or interacting with a specific protein or cell from the candidate compound group using the kit according to any one of 1 to 5 above.
7). The screening method according to item 6 above, comprising at least the following steps:
1) adding a fluorescent labeling agent to a candidate compound;
2) A step of mixing a specific protein or cell and a target compound to which the fluorescent labeling agent of 1) above is added in an aqueous solution;
3) A step of fractionating the substance mixed in 2) above;
4) A step of measuring a two-dimensional fluorescence spectrum for each fraction obtained in 3) above;
5) A step of analyzing the measurement result of the two-dimensional fluorescence spectrum.
8). 8. The screening method according to item 6 or 7 above, wherein the candidate compound is a peptide having a length of 3 to 50 amino acid residues.

本発明のスクリーニング用キットを用いて、特定のタンパク質又は細胞と結合若しくは相互作用しうるプローブ分子を候補化合物群からのスクリーニングを行うに際し、（１）スクリーニングが水溶液中で行われること、（２）一挙に２０種類、あるいは位置スキャン法を適用すれば1013種類もの混合物から適切なプローブ分子を見出すことが可能であること、（３）操作が簡単で、迅速であること、の優れた効果を有する。本発明のスクリーニング方法は、生体類似の溶液環境で実施可能であり、化合物ライブラリーからプローブ分子を見出す最も簡便な方法であるといえる。 When screening from a candidate compound group for a probe molecule that can bind to or interact with a specific protein or cell using the screening kit of the present invention, (1) screening is performed in an aqueous solution, (2) By applying the position scanning method at once, it is possible to find an appropriate probe molecule from a mixture of 10 13 types, and (3) the excellent effects of being easy and quick to operate. Have. The screening method of the present invention can be performed in a biologically similar solution environment, and can be said to be the simplest method for finding a probe molecule from a compound library.

本発明のスクリーニング用キットには、複数種（多成分）の蛍光標識剤が含まれる。蛍光標識剤は、自体公知のものであっても良いし、今後開発される新たなものであっても良いが、複数種の蛍光標識剤各々について、蛍光波長及び／又は励起波長が異なるものであればよい。スクリーニング用キットに含まれる蛍光標識剤の種類は、多ければ多いほど多様なスクリーニングが可能であるが、少なくとも３種類以上であればよく、好ましくは６〜２０種類である。なお、本発明のスクリーニング用キットを用いて、候補化合物に各々異なる種類の蛍光標識剤を付加し、多成分蛍光標識化合物ライブラリーを作製することができる。従って、本発明のスクリーニング用キットは、多成分蛍光標識化合物ライブラリー作製用キットとしての意義を有する。   The screening kit of the present invention includes multiple types (multicomponent) of fluorescent labeling agents. The fluorescent labeling agent may be known per se or may be a new one that will be developed in the future. However, the fluorescent wavelength and / or the excitation wavelength is different for each of the multiple types of fluorescent labeling agents. I just need it. The more kinds of fluorescent labeling agents contained in the screening kit, the more diverse the screening is possible, but there should be at least 3 kinds, preferably 6 to 20 kinds. In addition, by using the screening kit of the present invention, different types of fluorescent labeling agents can be added to the candidate compounds to prepare a multi-component fluorescently labeled compound library. Therefore, the screening kit of the present invention has significance as a kit for preparing a multicomponent fluorescently labeled compound library.

該蛍光標識剤は、蛍光検出部としての発色団を含み、該発色団はベンゼン環又はヘテロ環を有する。該発色団に含まれるヘテロ環の数は特に制限されるものではないが、例えば２〜６個、好ましくは２〜４個、更に好ましくは３個である。   The fluorescent labeling agent includes a chromophore as a fluorescence detection unit, and the chromophore has a benzene ring or a heterocycle. The number of heterocycles contained in the chromophore is not particularly limited, but is, for example, 2 to 6, preferably 2 to 4, and more preferably 3.

蛍光標識剤は、蛍光標識した非天然アミノ酸であることが好ましい。蛍光標識剤が、蛍光標識非天然アミノ酸である場合、いずれのアミノ酸も、そのN末端にはFmoc基（9-フルオレニルメトキシカルボニル基）が１つ修飾されていることが好ましい。具体的には、例えば以下に示すいずれかの蛍光標識用非天然アミノ酸から選択される。また、図１に蛍光標識用非天然アミノ酸の構造を示した。   The fluorescent labeling agent is preferably a fluorescently labeled unnatural amino acid. When the fluorescent labeling agent is a fluorescently labeled unnatural amino acid, it is preferable that one of the amino acids has one Fmoc group (9-fluorenylmethoxycarbonyl group) modified at the N-terminus thereof. Specifically, for example, it is selected from any of the following unnatural amino acids for fluorescent labeling. FIG. 1 shows the structure of an unnatural amino acid for fluorescent labeling.

1 ：Ant = 3-(2-アンスリル)アラニン
2 ：Pyr = 3-(1-ピレニル)アラニン
3 ：Acd = 3-(9-オキソ-9,10-ジヒドロ-アクリジン-2-イル)アラニン
4 ：Bacd = 3-(12-オキソ-5,12-ジヒドロ-ベンゾ[b]アクリジン-2-イル)アラニン
5 ：EDANS = γ[β-(5-ナフチルスルホン酸)-エチレンジアミン]グルタミン酸
6 ：Cmr = 3-(7-メトキシ-クマリン-4-イル)アラニン
7 ：FAM = N-ε-(フルオルセイン-5,6-イル)カルボニル-リシン
8 ：RhoB = N-ε-(テトラエチルローダミン-5,6-イル)チオウレイド-リシン
9 ：HOMCmr = N-ε-(7-ヒドロキシ-4-メチル-クマリン-3-イル)アセチル-リシン
10：DMACmr = N-ε-(7-ジメチルアミノ-クマリン-4-イル)アセチル-リシン
11：DEACmr = N-ε-(7-ジエチルアミノ-クマリン-3-イル)カルボニル-リシン
12：DMAMCmr = N-ε-(7-ジメチルアミノ-4-メチル-クマリン-3-イル)チオウレイド-リシン
13：MeONaph = 3-(6-メトキシ-ナフタレン-2-イル)アラニン
14：DBD = N-ε-(7-ジメチルスルファモイル-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾル-4-イル)チオウレイド-リシン
15：DMANaph = N-ε-(4-ジメチルアミノ-ナフタレン-1-イル)チオウレイド-リシン
16：HOCmr = N-ε-(7-ヒドロキシ-クマリン-3-イル)カルボニル-リシン
17：MeOCmr = N-ε-(7-メトキシ-クマリン-3-イル)カルボニル-リシン
18：TAMRA = N-ε-(テトラメチルローダミン-5,6-イル)カルボニル-リシン
19：Acr = 3-(1-アクリジン-9-イル-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル)システイン
20：Bn3Imd = N-ε-(4,5-ジフェニル-1H-イミダゾール-2-イル)ベンゾイル-リシン
21：Nap = 3-(ナフタレン-2-イル)アラニン
22：Phen = 3-(フェナンスレン-9-イル)アラニン
23：PheNap = 3-(4-ナフタレン-2-イル-フェニル)アラニン
24：Psl = N-ε-[4-(7-オキソ-7H-フロ[3,2-γ]クロメン-9-イルオキシ)]ブチリル-リシン
25：Dns = N-ε-(5-ジメチルアミノ-ナフタレン-1-スルホニル)-リシン
26：DMOBcC = N,N'-δ-[tert-ブトキシカルボニル-(6,7-ジメトキシ-クマリン-4-イルメチル)]-オルニチン
27：DMOAcC = N,N'-δ-[アセチル-(6,7-ジメトキシ-クマリン-4-イルメチル)]-オルニチン
28：CDOCA = N-δ-[2-(6-オキソ-6H-フロ[1,3-γ]クロメン-8-イル)]アセチル-リシン
29：MOCA = N-ε-(7-メトキシ-クマリン-4-イル)アセチル-リシン
30：AcrMe = 3-(アクリジン-9-イル)アラニン
31：AcrAc = N,N'-δ-(アセチル-アクリジン-9-イルメチル)-オルニチン
32：AntSO = N-ε-(アンスラセン-2-スルホニル)-リシン
33：Qui = 3-(キノリン-2-イル)アラニン
34：NDACN = N-ε-(1-シアノ-ベンゾ[φ]イソインドール-2-イル)-リシン
35：C343 = N -δ-(10-オキソ-2,3,5,6-テトラヒドロ-1H,4H,10H-11-オキサ-3 -アザ-ベンゾ[de]アンスラセン-9-カルボニル)-オルニチン 1: Ant = 3- (2-anthryl) alanine
2: Pyr = 3- (1-pyrenyl) alanine
3: Acd = 3- (9-oxo-9,10-dihydro-acridin-2-yl) alanine
4: Bacd = 3- (12-oxo-5,12-dihydro-benzo [b] acridin-2-yl) alanine
5: EDANS = γ [β- (5-naphthylsulfonic acid) -ethylenediamine] glutamic acid
6: Cmr = 3- (7-methoxy-coumarin-4-yl) alanine
7: FAM = N-ε- (Fluorescein-5,6-yl) carbonyl-lysine
8: RhoB = N-ε- (tetraethylrhodamine-5,6-yl) thioureido-lysine
9: HOMCmr = N-ε- (7-hydroxy-4-methyl-coumarin-3-yl) acetyl-lysine
10: DMACmr = N-ε- (7-dimethylamino-coumarin-4-yl) acetyl-lysine
11: DEACmr = N-ε- (7-diethylamino-coumarin-3-yl) carbonyl-lysine
12: DMAMCmr = N-ε- (7-dimethylamino-4-methyl-coumarin-3-yl) thioureido-lysine
13: MeONaph = 3- (6-Methoxy-naphthalen-2-yl) alanine
14: DBD = N-ε- (7-dimethylsulfamoyl-benzo [1,2,5] oxadiazol-4-yl) thioureido-lysine
15: DMANaph = N-ε- (4-Dimethylamino-naphthalen-1-yl) thioureido-lysine
16: HOCmr = N-ε- (7-hydroxy-coumarin-3-yl) carbonyl-lysine
17: MeOCmr = N-ε- (7-methoxy-coumarin-3-yl) carbonyl-lysine
18: TAMRA = N-ε- (tetramethylrhodamine-5,6-yl) carbonyl-lysine
19: Acr = 3- (1-acridin-9-yl-2,5-dioxo-pyrrolidin-3-yl) cysteine
20: Bn3Imd = N-ε- (4,5-diphenyl-1H-imidazol-2-yl) benzoyl-lysine
21: Nap = 3- (Naphthalen-2-yl) alanine
22: Phen = 3- (phenanthrene-9-yl) alanine
23: PheNap = 3- (4-Naphthalen-2-yl-phenyl) alanine
24: Psl = N-ε- [4- (7-oxo-7H-furo [3,2-γ] chromen-9-yloxy)] butyryl-lysine
25: Dns = N-ε- (5-dimethylamino-naphthalene-1-sulfonyl) -lysine
26: DMOBcC = N, N'-δ- [tert-butoxycarbonyl- (6,7-dimethoxy-coumarin-4-ylmethyl)]-ornithine
27: DMOAcC = N, N'-δ- [acetyl- (6,7-dimethoxy-coumarin-4-ylmethyl)]-ornithine
28: CDOCA = N-δ- [2- (6-oxo-6H-furo [1,3-γ] chromen-8-yl)] acetyl-lysine
29: MOCA = N-ε- (7-methoxy-coumarin-4-yl) acetyl-lysine
30: AcrMe = 3- (acridin-9-yl) alanine
31: AcrAc = N, N'-δ- (acetyl-acridin-9-ylmethyl) -ornithine
32: AntSO = N-ε- (anthracene-2-sulfonyl) -lysine
33: Qui = 3- (quinolin-2-yl) alanine
34: NDACN = N-ε- (1-cyano-benzo [φ] isoindol-2-yl) -lysine
35: C343 = N-δ- (10-oxo-2,3,5,6-tetrahydro-1H, 4H, 10H-11-oxa-3-benzo- [de] anthracene-9-carbonyl) -ornithine

本発明における蛍光標識剤は、特定の細胞や特定のタンパク質に対して、該蛍光標識剤の非特異的結合を防ぐように、蛍光標識剤に水溶性物質を付加した蛍光標識用ユニットであってもよい。蛍光標識用ユニットとしては、上述の蛍光標識非天然アミノ酸を含むものが好適であり、水溶性物質としては、水溶性アミノ酸であることが好適である。具体的には、蛍光標識非天然アミノ酸の両端に水溶性アミノ酸を結合していても良い。水溶性アミノ酸の例として、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニンなどが挙げられるが、より好適にはグルタミン酸である。さらには、蛍光標識用非天然アミノ酸ユニットを候補化合物に効果的に付加するために、水溶性のリンカー化合物を含んでいてもよい。水溶性のリンカー化合物としては、水溶性であり、蛍光標識用非天然アミノ酸ユニットと候補化合物を結合しうる構造であれば良く、特に制限されないが、例えば-NH-(CH2CH2O)6-(CH2)2-CO-が挙げられる。 The fluorescent labeling agent in the present invention is a fluorescent labeling unit in which a water-soluble substance is added to a fluorescent labeling agent so as to prevent nonspecific binding of the fluorescent labeling agent to specific cells or specific proteins. Also good. As the unit for fluorescent labeling, those containing the above-mentioned fluorescently labeled unnatural amino acid are suitable, and as the water-soluble substance, water-soluble amino acids are suitable. Specifically, a water-soluble amino acid may be bonded to both ends of the fluorescently labeled unnatural amino acid. Examples of water-soluble amino acids include glutamic acid, aspartic acid, lysine, arginine, and the like, but glutamic acid is more preferable. Furthermore, in order to effectively add the non-natural amino acid unit for fluorescent labeling to the candidate compound, a water-soluble linker compound may be included. The water-soluble linker compound is not particularly limited as long as it is water-soluble and can bind a non-natural amino acid unit for fluorescent labeling to a candidate compound. For example, —NH— (CH 2 CH 2 O) 6 -(CH 2 ) 2 -CO-.

本発明のスクリーニング用キットに含まれる構成物は、上述の蛍光標識剤の他、スクリーニングに必要な試薬や容器などを含んでいても良い。さらには、スクリーニングの解析に必要な解析ソフトを含んでいても良く、解析用機器を含んでいても良い。上述の試薬、容器、ソフト及び機器等は、本発明のスクリーニングに利用可能であれば、自体公知の既存のものであっても良いし、今後開発されるより好適なものであってもよい。   The composition contained in the screening kit of the present invention may contain reagents and containers necessary for screening in addition to the fluorescent labeling agent described above. Furthermore, analysis software necessary for the analysis of screening may be included, and an analysis device may be included. The above-described reagents, containers, software, equipment, and the like may be existing ones known per se as long as they can be used for the screening of the present invention, or may be more suitable to be developed in the future.

上述のスクリーニング用キットを用いて、候補化合物群から、特定のタンパク質又は細胞と結合若しくは相互作用しうる物質をスクリーニングすることができる。そのスクリーニング方法は、少なくとも以下の工程を含む。   Using the above-described screening kit, a substance capable of binding to or interacting with a specific protein or cell can be screened from a group of candidate compounds. The screening method includes at least the following steps.

１）候補化合物に蛍光標識剤を付加する工程；
２）特定のタンパク質又は細胞と、上記１）の蛍光標識剤を付加した対象化合物を水溶液中で混合する工程；
３）上記２）で混合した物質を分画する工程；
４）上記３）で得た、各分画について、２次元蛍光スペクトルを測定する工程；
５）２次元蛍光スペクトルの測定結果を解析する工程。 1) adding a fluorescent labeling agent to a candidate compound;
2) A step of mixing a specific protein or cell and a target compound to which the fluorescent labeling agent of 1) above is added in an aqueous solution;
3) A step of fractionating the substance mixed in 2) above;
4) A step of measuring a two-dimensional fluorescence spectrum for each fraction obtained in 3) above;
5) A step of analyzing the measurement result of the two-dimensional fluorescence spectrum.

本発明において、候補化合物に各々異なる種類の蛍光標識剤を付加したものを、蛍光標識化合物ライブラリーとすることができる。蛍光標識化合物ライブラリーは、候補化合物群から、特定のタンパク質又は細胞と結合若しくは相互作用しうるプローブ機能を有する化合物をスクリーニングするために作製される。本発明において、該蛍光標識化合物ライブラリーをスクリーニング用キットに含めてもよい。   In the present invention, those obtained by adding different types of fluorescent labeling agents to candidate compounds can be used as a fluorescently labeled compound library. A fluorescently labeled compound library is prepared for screening compounds having a probe function capable of binding to or interacting with a specific protein or cell from a group of candidate compounds. In the present invention, the fluorescently labeled compound library may be included in a screening kit.

前記蛍光標識化合物ライブラリーを構成する候補化合物は、カルボン酸若しくはアミノ基と結合することのできる化合物を好適に用いることができる。このような化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、糖、ＤＮＡ、ＲＮＡ、低分子有機化合物、脂質及び／又は高分子材料等が例示され、好適にはペプチドを挙げることができる。   As the candidate compound constituting the fluorescently labeled compound library, a compound capable of binding to a carboxylic acid or an amino group can be preferably used. Examples of such compounds include peptides, proteins, sugars, DNA, RNA, low molecular weight organic compounds, lipids and / or polymer materials, and preferred examples include peptides.

前記候補化合物にペプチドが含まれる場合、ペプチドを構成するアミノ酸の残基数は、特定のタンパク質又は細胞と結合若しくは相互作用し、プローブ機能を有する長さであれば良く、特に制限されないが、例えば６〜５０個、好ましくは８〜２０個、さらに好ましくは８個程度が挙げられる。   When the candidate compound includes a peptide, the number of amino acid residues constituting the peptide is not particularly limited as long as it is a length that binds or interacts with a specific protein or cell and has a probe function. 6 to 50, preferably 8 to 20, more preferably about 8.

候補化合物と各々異なる種類の蛍光標識剤の組合せは、スクリーニングの目的に応じて適宜決定することができる。例えば、複数回のスクリーニングを行う場合に、各々のスクリーニングの目的、例えば類似するペプチド化合物やＤＮＡ、ＲＮＡの場合、変異するアミノ酸若しくは核酸の位置や、配列の特徴等、あるいは低分子化合物の場合は構造の特徴点等に応じて、異なる種類の蛍光標識剤を付加することができる。   The combination of the candidate compound and a different type of fluorescent labeling agent can be appropriately determined according to the purpose of screening. For example, when multiple screenings are performed, the purpose of each screening, for example, in the case of similar peptide compounds, DNA, RNA, the position of amino acids or nucleic acids to be mutated, sequence characteristics, etc., or in the case of low molecular compounds Different types of fluorescent labeling agents can be added depending on the structural features and the like.

候補化合物に蛍光標識剤を付加する方法は、特に限定されず、自体公知の方法を適用することができる。例えば、蛍光標識用非天然アミノ酸ユニットを候補化合物であるペプチドに付加する場合は、Fmocペプチド固相合成法によることも可能であるし、その他の一般的な合成方法によることも可能である。   The method for adding the fluorescent labeling agent to the candidate compound is not particularly limited, and a method known per se can be applied. For example, when adding a non-natural amino acid unit for fluorescent labeling to a peptide that is a candidate compound, it can be performed by the Fmoc peptide solid phase synthesis method, or by other general synthesis methods.

複数の蛍光標識剤を各々付加した蛍光標識化合物群、すなわち多成分蛍光標識化合物ライブラリーと、特定のタンパク質又は細胞を水溶液中で混合する。ここにおいて、特定のタンパク質又は細胞は特に限定されず、候補化合物の目的用途や必要に応じて適宜決定される。また、混合のために用いる水溶液は、リン酸緩衝液やトリス緩衝液など一般的に用いられる溶液を用いることができる。   A group of fluorescent labeling compounds each having a plurality of fluorescent labeling agents added thereto, that is, a multi-component fluorescent labeling compound library, and a specific protein or cell are mixed in an aqueous solution. Here, the specific protein or cell is not particularly limited, and is appropriately determined depending on the intended use and necessity of the candidate compound. Further, as the aqueous solution used for mixing, a commonly used solution such as a phosphate buffer or a Tris buffer can be used.

また、特定のタンパク質又は細胞は、蛍光標識を行わなくともスクリーニング操作上問題ないが、より正確に検出するために部分的に蛍光標識を行っても良い。標識しうる蛍光物質は特に限定されないが、例えばフルオレセイン、テトラメチルローダミンなどを用いることができる。   In addition, a specific protein or cell does not have a problem in screening operation even if it is not fluorescently labeled, but may be partially fluorescently labeled for more accurate detection. The fluorescent substance that can be labeled is not particularly limited. For example, fluorescein, tetramethylrhodamine, and the like can be used.

前記多成分蛍光標識化合物ライブラリーから、特定のタンパク質及び／又は特定の細胞と結合若しくは相互作用しうるプローブ機能を有する物質を検出する方法として、蛍光スペクトルを利用することができるが、情報量の多さの観点から、２次元蛍光スペクトルを用いて測定するのがより好適である。具体的には、多成分蛍光標識化合物ライブラリーと特定のタンパク質又は細胞を混合した水溶液について、通常の方法で各種励起波長と蛍光波長を測定することができる。   As a method for detecting a substance having a probe function capable of binding to or interacting with a specific protein and / or a specific cell from the multi-component fluorescently labeled compound library, a fluorescence spectrum can be used. From the viewpoint of quantity, it is more preferable to measure using a two-dimensional fluorescence spectrum. Specifically, various excitation wavelengths and fluorescence wavelengths can be measured by an ordinary method for an aqueous solution in which a multicomponent fluorescently labeled compound library and a specific protein or cell are mixed.

２次元蛍光スペクトルの解析のために、多成分蛍光標識化合物ライブラリーの各標識化合物及び化合物と結合していない各蛍光標識用非天然アミノ酸ユニットについて、予め２次元蛍光スペクトルを測定しておくことが必要である。蛍光標識化合物ライブラリー中の各候補化合物に関する２次元蛍光スペクトルの解析は、自体公知の方法により解析することができる。例えば最小二乗法や多変量解析法の原理を利用した解析用ソフトを用いて解析することができる。   In order to analyze the two-dimensional fluorescence spectrum, it is possible to measure the two-dimensional fluorescence spectrum in advance for each labeled compound in the multi-component fluorescence labeled compound library and each unnatural amino acid unit for fluorescent label that is not bound to the compound. is necessary. Analysis of the two-dimensional fluorescence spectrum for each candidate compound in the fluorescently labeled compound library can be analyzed by a method known per se. For example, analysis can be performed using analysis software using the principle of least squares or multivariate analysis.

特定のタンパク質及び／又は特定の細胞と結合若しくは相互作用しうるプローブ分子を検出するために、２次元蛍光スペクトルの測定前に、特定のタンパク質及び／又は特定の細胞と特定のタンパク質及び／又は特定の細胞に結合した多成分蛍光標識化合物ライブラリーを分画することが必要である。該分画する方法は特に限定されないが、物理化学的性質や免疫学的性質を利用したものが挙げられる。具体的には、例えばゲル濾過、HPLC、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、蛍光顕微鏡等が例示される。各々分画した画分について、２次元蛍光スペクトルを測定し、通常の方法に従って解析することができる。例えばゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した各試料の測定結果について、特定のタンパク質及び／又は特定の細胞から得られるピークから最も近いピークを有する画分に含まれる候補化合物が、特定のタンパク質及び／又は特定の細胞と結合若しくは相互作用しうるプローブ分子であると考えられる。   To detect a specific protein and / or a probe molecule that can bind to or interact with a specific cell, the specific protein and / or the specific cell and the specific protein and / or specific before measuring the two-dimensional fluorescence spectrum It is necessary to fractionate a multicomponent fluorescently labeled compound library bound to the cells. The method for fractionation is not particularly limited, and examples thereof include those utilizing physicochemical properties and immunological properties. Specific examples include gel filtration, HPLC, hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, electrophoresis, and fluorescence microscope. For each fraction, a two-dimensional fluorescence spectrum can be measured and analyzed according to a normal method. For example, with respect to the measurement result of each sample fractionated by gel filtration chromatography, a candidate compound contained in a fraction having a peak closest to a peak obtained from a specific protein and / or a specific cell may be a specific protein and / or It is thought to be a probe molecule that can bind or interact with specific cells.

以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。これらの実施例は、単なる例示であり、本発明を限定するものではない。   Examples are given below to illustrate the present invention in more detail. These examples are illustrative only and do not limit the invention.

（実施例１）種類の異なる蛍光標識用非天然アミノ酸を含む多成分蛍光標識化合物ライブラリーの合成 (Example 1) Synthesis of a multicomponent fluorescently labeled compound library containing unnatural amino acids for different types of fluorescent labels

本実施例における多成分蛍光標識化合物ライブラリーのもととなる化合物、すなわちペプチド群は、いずれもFmocペプチド固相合成法により得られた。Fmocアミノ酸モノマー及びFmoc蛍光アミノ酸、ペプチド合成に必要な溶媒とその他の試薬類はいずれも渡辺化学工業より購入した。FmocのO(6)リンカーはNeo MPS社より購入した。   The compounds that serve as the basis of the multicomponent fluorescently labeled compound library in this example, that is, peptide groups, were all obtained by the Fmoc peptide solid phase synthesis method. Fmoc amino acid monomers, Fmoc fluorescent amino acids, solvents and other reagents necessary for peptide synthesis were all purchased from Watanabe Chemical Industry. Fmoc O (6) linker was purchased from Neo MPS.

具体的には、合成は以下のように行なった。合成にはFmoc-NH-SAL-PEG-resin の樹脂を用い、該樹脂を膨潤させるためジクロロメタン／ジメチルホルムアミド(DMF) 混合溶媒で室温３時間撹拌した。樹脂をDMF溶液で洗浄後、２０％ピペリジンを含むDMF溶液で４０℃にて１０分間撹拌し、その後DMF溶液で洗浄した（この操作を以下「脱保護」と表記する）。   Specifically, the synthesis was performed as follows. Fmoc-NH-SAL-PEG-resin resin was used for the synthesis, and the mixture was stirred with a mixed solvent of dichloromethane / dimethylformamide (DMF) for 3 hours at room temperature in order to swell the resin. The resin was washed with DMF solution, stirred with DMF solution containing 20% piperidine at 40 ° C. for 10 minutes, and then washed with DMF solution (this operation is hereinafter referred to as “deprotection”).

次に、目的ペプチドの配列を作るのに対応するFmocアミノ酸、HATU（O-（ベンゾトリアゾール-1-イル）-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩)、及びDIPEA（N,N-ジイソプロピルエチルアミン）をDMF溶液に溶解した後、上記膨潤させた樹脂に加えた。４０℃にて６０分間撹拌した後、DMF溶液で洗浄した（この操作を以下「カップリング」と表記する）。   Next, the Fmoc amino acid corresponding to making the sequence of the target peptide, HATU (O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate), And DIPEA (N, N-diisopropylethylamine) were dissolved in the DMF solution and then added to the swollen resin. The mixture was stirred at 40 ° C. for 60 minutes and then washed with a DMF solution (this operation is hereinafter referred to as “coupling”).

続いて、５％無水酢酸及び６％ルチジンを含むDMF溶液で４０℃にて５分間撹拌した後、DMF溶液で洗浄した（この操作を以下「キャッピング」と表記する）。   Subsequently, the mixture was stirred for 5 minutes at 40 ° C. in a DMF solution containing 5% acetic anhydride and 6% lutidine, and then washed with the DMF solution (this operation is hereinafter referred to as “capping”).

樹脂表面上に、目的の配列のペプチドが伸長するまで、脱保護、カップリング、キャッピングの操作を繰り返した。最後のアミノ酸のFmoc基を脱保護した後、樹脂にトリフルオロ酢酸／水／トリイソプロピルシラン（= 95/2.5/2.5 v/v/v）を加えて、室温にて６０分間撹拌した。これにより樹脂から切り出された目的のペプチドの溶液はジエチルエーテルを加えることで沈殿物を得た。これらのペプチドはメタノール溶液として冷凍庫に保管した。   Deprotection, coupling, and capping operations were repeated until the peptide of the target sequence was extended on the resin surface. After deprotecting the Fmoc group of the last amino acid, trifluoroacetic acid / water / triisopropylsilane (= 95 / 2.5 / 2.5 v / v / v) was added to the resin and stirred at room temperature for 60 minutes. As a result, diethyl ether was added to the target peptide solution cut out from the resin to obtain a precipitate. These peptides were stored in a freezer as a methanol solution.

本実施例では６種類のペプチドを作製した。合成したペプチド群の構造を以下に示す。
Bacd-ペプチド ：H-E-Bacd-E-O(6)-DYKADDDK-NH2（配列番号１）
Cmr-ペプチド ：H-E-Cmr-E-O(6)-DYDKDDDK-NH2（配列番号２）
Pyr-ペプチド ：H-E-Pyr-E-O(6)-DYKEEDDK-NH2（配列番号３）
EDANS-ペプチド：H-E-EDANS-E-O(6)-DYDDDDDK-NH2（配列番号４）
Ant-ペプチド ：H-E-Ant-E-O(6)-DYAAADDK-NH2（配列番号５）
Acd-ペプチド ：H-E-Acd-E-O(6)-DYKDDDDK-NH2（配列番号６） In this example, six types of peptides were prepared. The structure of the synthesized peptide group is shown below.
Bacd-peptide: HE-Bacd-EO (6) -DYKADDDK-NH 2 (SEQ ID NO: 1)
Cmr-peptide: HE-Cmr-EO (6) -DYDKDDDK-NH 2 (SEQ ID NO: 2)
Pyr-peptide: HE-Pyr-EO (6) -DYKEEDDK-NH 2 (SEQ ID NO: 3)
EDANS-peptide: HE-EDANS-EO (6) -DYDDDDDK-NH 2 (SEQ ID NO: 4)
Ant-peptide: HE-Ant-EO (6) -DYAAADDK-NH 2 (SEQ ID NO: 5)
Acd-peptide: HE-Acd-EO (6) -DYKDDDDK-NH 2 (SEQ ID NO: 6)

E、D、Y、K、及びAは一文字表記法によるアミノ酸ユニットを示す。O(6)の化学構造は-NH-(CH2CH2O)6-(CH2)2-CO-である。例えばE-Bacd-E-O(6)のように、グルタミン酸(E)及びO(6)を付加した非天然アミノ酸は、蛍光標識用非天然アミノ酸ユニットを示しており、Bacd、Cmr、Pyr、EDANS、Ant、及びAcdはいずれも蛍光標識用非天然アミノ酸であり、それぞれ3-(12-オキソ-5,12-ジヒドロ-ベンゾ[b]アクリジン-2-イル)アラニン、3-(7-メトキシ-クマリン-4-イル)アラニン、3-(1-ピレニル)アラニン、γ[β-(5-ナフチルスルホン酸)-エチレンジアミン]グルタミン酸、3-(2-アンスリル)アラニン、及び3-(9-オキソ-9,10-ジヒドロ-アクリジン-2-イル)アラニンを示している。上記化合物内の左端のH及び右端のNH2はそれぞれ化合物のN末端がフリーアミンであること、C末端が第一アミドであることを示している。本実施例及び以降の実施例において、候補化合物に該当する部分を、成分ペプチドと呼ぶ。 E, D, Y, K, and A represent amino acid units by a single letter notation. The chemical structure of O (6) is —NH— (CH 2 CH 2 O) 6 — (CH 2 ) 2 —CO—. For example, an unnatural amino acid to which glutamic acid (E) and O (6) are added, such as E-Bacd-EO (6), indicates an unnatural amino acid unit for fluorescent labeling, and Bacd, Cmr, Pyr, EDANS, Ant and Acd are both non-natural amino acids for fluorescent labeling, which are 3- (12-oxo-5,12-dihydro-benzo [b] acridin-2-yl) alanine and 3- (7-methoxy-coumarin, respectively. -4-yl) alanine, 3- (1-pyrenyl) alanine, γ [β- (5-naphthylsulfonic acid) -ethylenediamine] glutamic acid, 3- (2-anthryl) alanine, and 3- (9-oxo-9 , 10-dihydro-acridin-2-yl) alanine. It N-terminus of each NH 2 of the leftmost H and the right end of the above compounds are compounds is free amines, indicating that the C-terminus is the primary amide. In this example and the following examples, the portion corresponding to the candidate compound is referred to as a component peptide.

上記のうち、Acd-ペプチド中の成分ペプチドのアミノ酸配列はFLAGペプチドの配列と同じである。これ以外の５種類の成分ペプチドはいずれもFLAGペプチドの配列中、１〜３個のアミノ酸配列が異なる。蛍光標識用非天然アミノ酸の両端のグルタミン酸は、蛍光標識用非天然アミノ酸ユニットにより減少すると予想される水溶性を獲得するのと同時に、立体障害による蛍光標識用非天然アミノ酸の非特異的吸着を防ぐ役割がある。   Among the above, the amino acid sequence of the component peptide in the Acd-peptide is the same as the sequence of the FLAG peptide. All of the other five types of component peptides differ in the sequence of 1 to 3 amino acids in the sequence of the FLAG peptide. Glutamic acid at both ends of the non-natural amino acid for fluorescent labeling acquires the water solubility expected to be reduced by the non-natural amino acid unit for fluorescent labeling, and at the same time, prevents non-specific adsorption of the non-natural amino acid for fluorescent labeling due to steric hindrance There is a role.

（実施例２）多成分蛍光標識化合物ライブラリー中の各成分ペプチドの２次元蛍光スペクトルの測定及び自作の最小二乗法をもちいた解析ソフトウェアによる成分解析 (Example 2) Measurement of two-dimensional fluorescence spectrum of each component peptide in multi-component fluorescence labeled compound library and component analysis by analysis software using self-made least squares method

実施例１で作製された多成分蛍光標識化合物ライブラリーの溶液中の各成分ペプチドの同定、定量を行うために、はじめに各成分ペプチドの２次元蛍光スペクトルを測定した。Bacd-ペプチド、Cmr-ペプチド、Pyr-ペプチド、EDANS-ペプチド、Ant-ペプチド、及びAcd-ペプチドを含むメタノール溶液をHEPES緩衝溶液（pH=7.4）/メタノール（1/1 v/v）で希釈した。各溶液中のペプチドのモル濃度は２次元蛍光スペクトル装置の検出限界を超えないように設定し、Bacd-ペプチド、Cmr-ペプチド、EDANS-ペプチド、Ant-ペプチドでは 5.0 μM、Pyr-ペプチドでは2.0μM、及びAcd-ペプチドでは4.0μMに調整した。また、後ほどの実施例３，４で使用するCy-3 標識抗FLAG 抗体（Sigma社製、以下anti-FLAG-Cy3と表記する）についても、同様に3.8nMのモル濃度で測定した。   In order to identify and quantify each component peptide in the solution of the multicomponent fluorescence-labeled compound library prepared in Example 1, first, a two-dimensional fluorescence spectrum of each component peptide was measured. Diluted methanol solution containing Bacd-peptide, Cmr-peptide, Pyr-peptide, EDANS-peptide, Ant-peptide, and Acd-peptide with HEPES buffer solution (pH = 7.4) / methanol (1/1 v / v) . The molar concentration of the peptide in each solution is set so as not to exceed the detection limit of the two-dimensional fluorescence spectrometer, and 5.0 μM for Bacd-peptide, Cmr-peptide, EDANS-peptide, Ant-peptide and 2.0 μM for Pyr-peptide. , And Acd-peptide was adjusted to 4.0 μM. Similarly, the Cy-3 labeled anti-FLAG antibody (manufactured by Sigma, hereinafter referred to as anti-FLAG-Cy3) used in Examples 3 and 4 later was also measured at a molar concentration of 3.8 nM.

これらの溶液2.7mLを光路長が1cmの石英セルに加え、２次元蛍光スペクトル（日本分光社製、FP-6600）を用いて測定した。測定条件はいずれも励起バンド幅が3nm、蛍光バンド幅が2nm、レスポンスが0.1秒、データ取り込み間隔が励起側で1nm、蛍光側で1nm、走査速度は2000nm/分で行なった。   2.7 mL of these solutions were added to a quartz cell having an optical path length of 1 cm and measured using a two-dimensional fluorescence spectrum (manufactured by JASCO Corporation, FP-6600). In all the measurement conditions, the excitation bandwidth was 3 nm, the fluorescence bandwidth was 2 nm, the response was 0.1 seconds, the data acquisition interval was 1 nm on the excitation side, 1 nm on the fluorescence side, and the scanning speed was 2000 nm / min.

図２に結果を示した。各図の横軸は励起波長、縦軸は蛍光波長を示した。蛍光強度は図内の等高線に従った。
Bacd-ペプチドでは極大励起波長が300nm、極大蛍光波長が518nmであった。また励起波長が487nmのときにも519nmに強い蛍光発光が見られた。見た目に台形の特徴的なパターンを示した。
Cmr-ペプチドでは極大励起波長が330nm、極大蛍光波長が390nmであった。楕円形の特徴的なパターンを示した。
Pyr-ペプチドでは極大励起波長が330nm、極大蛍光波長が390nmであった。4つのピークをもつ非常に狭いパターンを示した。
EDANS-ペプチドでは極大励起波長が343nm、極大蛍光波長が468nmであった。卵形で比較的幅の広いパターンを示した。
Ant-ペプチドでは極大励起波長が358nm、極大蛍光波長が408nmであった。9つのピークをもつパターンが得られた。
Acd-ペプチドでは極大励起波長が406nm、極大蛍光波長が421nmであった。4つのピークをもつパターンが得られた。また、anti-FLAG-Cy3では極大励起波長が555nm、極大蛍光波長が570nmの十字型の特徴的なパターンを示した。これらはいずれも特徴的なパターンを示した。 The results are shown in FIG. In each figure, the horizontal axis represents the excitation wavelength, and the vertical axis represents the fluorescence wavelength. The fluorescence intensity followed the contour lines in the figure.
In the Bacd-peptide, the maximum excitation wavelength was 300 nm and the maximum fluorescence wavelength was 518 nm. Strong fluorescence was also observed at 519 nm when the excitation wavelength was 487 nm. It shows a characteristic trapezoidal pattern.
For the Cmr-peptide, the maximum excitation wavelength was 330 nm, and the maximum fluorescence wavelength was 390 nm. An elliptical characteristic pattern is shown.
The Pyr-peptide had a maximum excitation wavelength of 330 nm and a maximum fluorescence wavelength of 390 nm. A very narrow pattern with four peaks was shown.
The EDANS-peptide had a maximum excitation wavelength of 343 nm and a maximum fluorescence wavelength of 468 nm. It was oval and showed a relatively wide pattern.
Ant-peptide had a maximum excitation wavelength of 358 nm and a maximum fluorescence wavelength of 408 nm. A pattern with 9 peaks was obtained.
The Acd-peptide had a maximum excitation wavelength of 406 nm and a maximum fluorescence wavelength of 421 nm. A pattern with four peaks was obtained. Anti-FLAG-Cy3 showed a cross-shaped characteristic pattern with a maximum excitation wavelength of 555 nm and a maximum fluorescence wavelength of 570 nm. All of these showed a characteristic pattern.

このように２次元蛍光スペクトルは各成分ペプチドの成分解析を容易にすることが期待できる。また例えば、Ant-ペプチドとAcd-ペプチドの極大蛍光波長はそれぞれ408nmと421 nmと非常に近い位置にあるが、これらの極大励起波長はそれぞれ358nmと406nmであり、非常に幅があり、２次元蛍光スペクトルにおいてこれらを同定することは容易である。その他にもPyr-ペプチドとEDANS-ペプチドの極大励起波長はいずれも343nmであるが極大蛍光波長はそれぞれ378nmと486nmと全く異なるので、２次元蛍光スペクトルにおいてこれらを同定することは容易である。結論として２次元蛍光スペクトルを用いることで各蛍光基はそれぞれに特徴なパターンを表示するので、後に示すように各成分ペプチドを分離し、解析、定量するのに非常に有用である。   Thus, the two-dimensional fluorescence spectrum can be expected to facilitate the component analysis of each component peptide. For example, the maximum fluorescence wavelengths of Ant-peptide and Acd-peptide are very close to 408 nm and 421 nm, respectively, but these maximum excitation wavelengths are 358 nm and 406 nm, respectively, which are very wide and two-dimensional. It is easy to identify these in the fluorescence spectrum. In addition, the maximum excitation wavelengths of Pyr-peptide and EDANS-peptide are both 343 nm, but the maximum fluorescence wavelengths are completely different from 378 nm and 486 nm, respectively. Therefore, it is easy to identify them in the two-dimensional fluorescence spectrum. In conclusion, by using a two-dimensional fluorescence spectrum, each fluorescent group displays a characteristic pattern, so that it is very useful for separating, analyzing and quantifying each component peptide as will be shown later.

（実施例３）多成分蛍光ペプチドライブラリーの定量
実施例１で行なった各ペプチドの２次元蛍光スペクトルを成分スペクトルとして用い、６種類の各ペプチドの等モル混合物の２次元スペクトルを測定した後、解析した。６種類の各ペプチドの最終モル濃度はそれぞれ0.1μM、anti-FLAG-Cy3の最終モル濃度は0.001μMにした。しかし、このままではどの化合物がどの程度含まれているかはわからない。この２次元蛍光スペクトルを自作の解析ソフトウェアを用いて計算し、各成分のモル濃度を算出した。 (Example 3) Quantification of multi-component fluorescent peptide library Using the two-dimensional fluorescence spectrum of each peptide performed in Example 1 as a component spectrum, after measuring the two-dimensional spectrum of an equimolar mixture of six types of peptides, Analyzed. The final molar concentration of each of the six peptides was 0.1 μM, and the final molar concentration of anti-FLAG-Cy3 was 0.001 μM. However, it is not known how much compound is contained in this state. This two-dimensional fluorescence spectrum was calculated using self-made analysis software, and the molar concentration of each component was calculated.

理論上はBacd-ペプチド、Cmr-ペプチド、Pyr-ペプチド、EDANS-ペプチド、Ant-ペプチド、及びAcd-ペプチドの全体に対する割合はそれぞれ16.7%、anti-FLAG-Cy3は0.2%となる。解析ソフトウェアを用いて２次元蛍光スペクトルを解析した結果を表１にした。Bacd-ペプチド、Cmr-ペプチド、Pyr-ペプチド、Pyr-ペプチド、EDANS-ペプチド、Ant-ペプチド、及びAcd-ペプチドではモル濃度はそれぞれ0.0824 μM、0.0784 μM、0.0650 μM、0.0860 μM、0.0729 μM、及び0.0651 μMとなった。またこれらより全体の割合はそれぞれ18.3 %、17.4 %、14.4 %、19.1 %、16.2 %、及び14.5 %とであった。またanti-FLAG-Cy3のモル濃度は0.0010 μMで全体に対する割合は0.2 %となった。これらの結果は、今回の解析ソフトウェアによる成分解析が良好に行なえたことを示している。
Theoretically, the ratio of Bacd-peptide, Cmr-peptide, Pyr-peptide, EDANS-peptide, Ant-peptide, and Acd-peptide to the whole is 16.7%, and anti-FLAG-Cy3 is 0.2%. The results of analyzing the two-dimensional fluorescence spectrum using analysis software are shown in Table 1. For Bacd-peptide, Cmr-peptide, Pyr-peptide, Pyr-peptide, EDANS-peptide, Ant-peptide, and Acd-peptide, the molar concentrations are 0.0824 μM, 0.0784 μM, 0.0650 μM, 0.0860 μM, 0.0729 μM, and 0.0651, respectively. μM. Moreover, the ratio of the whole was 18.3%, 17.4%, 14.4%, 19.1%, 16.2%, and 14.5%, respectively. The molar concentration of anti-FLAG-Cy3 was 0.0010 μM, and the ratio to the total was 0.2%. These results show that the component analysis by this analysis software was successfully performed.

（実施例４）多成分蛍光標識化合物ライブラリー中から抗FLAG抗体に結合するプローブ分子を同定する手法 (Example 4) Technique for identifying a probe molecule that binds to an anti-FLAG antibody from a multicomponent fluorescently labeled compound library

各ペプチドの1 μM、anti-FLAG-Cy3 0.01 μM、及びCy3で標識されていない抗FLAG抗体9.9 μMの水溶液(HEPES緩衝水溶液、pH=7.4)を室温で１時間インキュベートした後、SephadexTM G-50(Pharmacia製)にて、ゲル濾過を行なった。このとき得られた各フラクション（画分）に同量のメタノールを加えた後、実施例２、３と同様に２次元蛍光スペクトルを測定し、さらに実施例３と同様に自作の解析ソフトにより、各フラクション中に含まれる各ペプチド及びFLAG抗体のモル濃度を算出した。
図４に各フラクションにおける２次元蛍光スペクトルを示す。各フラクションによりスペクトルパターンが異なる。これらの結果を自作の解析ソフトウェアより成分解析を行なった。 After incubating 1 μM of each peptide, 0.01 μM anti-FLAG-Cy3 and 9.9 μM anti-FLAG antibody not labeled with Cy3 (HEPES buffer, pH = 7.4) for 1 hour at room temperature, Sephadex ™ G- Gel filtration was performed at 50 (Pharmacia). After adding the same amount of methanol to each fraction (fraction) obtained at this time, a two-dimensional fluorescence spectrum was measured in the same manner as in Examples 2 and 3, and also in the same manner as in Example 3, The molar concentration of each peptide and FLAG antibody contained in each fraction was calculated.
FIG. 4 shows a two-dimensional fluorescence spectrum in each fraction. Each fraction has a different spectral pattern. Component analysis of these results was carried out using our own analysis software.

図５ではその成分解析によって得られた各フラクションにおける成分ペプチド及び抗FLAG抗体の各フラクション中のモル濃度を示した。各成分ペプチドは各フラクションによって濃度が異なることがわかった。各ペプチド及び抗体は特定のピークを持っており、今回の実験がうまくいっていることを示している。Bacd-ペプチドではフラクション１８でその濃度が極大になった。Cmr-ペプチドではフラクション１４でその濃度が極大になった。Pyr-ペプチドではフラクション１７でその濃度が極大になった。EDAN-ペプチドでは多少ばらつきがあるもののフラクション１４でその濃度が極大になった。Ant-ペプチドではフラクション１７でその濃度が極大になった。Acd-ペプチドではフラクション１４でその濃度が極大になり、またフラクション９でも比較的濃度が高くなった。抗FLAG抗体はフラクション８でその濃度が極大になった。Acd-ペプチドが抗FLAG抗体の濃度の極大付近に比較的濃度の高い部分をもつことはAcd-ペプチドが抗FLAG抗体に結合していることを強く示している。その他のペプチドではフラクション９付近に濃度の高い部分をもたない。Acd-ペプチドは実施例１にも示したようにFLAGペプチドの配列である。
これらのことから、本方法が溶液中で、２次元蛍光スペクトルと解析ソフトウェアを併用することにより、特定のタンパク質に結合若しくは相互作用しうるプローブ分子を、複数のプローブ分子群の中から特に何ら精製をする必要もなく同定しうることが明らかとなった。 FIG. 5 shows the molar concentration of each component peptide and anti-FLAG antibody in each fraction obtained by the component analysis. Each component peptide was found to have a different concentration depending on each fraction. Each peptide and antibody has a specific peak, indicating that this experiment is successful. The concentration of Bacd-peptide reached a maximum in fraction 18. The concentration of Cmr-peptide reached a maximum in fraction 14. The concentration of Pyr-peptide reached its maximum in fraction 17. Although there was some variation in EDAN-peptide, its concentration reached a maximum in fraction 14. The concentration of Ant-peptide reached a maximum in fraction 17. In the case of Acd-peptide, the concentration was maximized in fraction 14, and the concentration was also relatively high in fraction 9. The concentration of the anti-FLAG antibody reached a maximum in fraction 8. The fact that the Acd-peptide has a relatively high concentration near the maximum concentration of the anti-FLAG antibody strongly indicates that the Acd-peptide is bound to the anti-FLAG antibody. Other peptides do not have a high concentration portion in the vicinity of fraction 9. The Acd-peptide is a FLAG peptide sequence as shown in Example 1.
From these facts, this method uses a two-dimensional fluorescence spectrum in combination with analysis software in a solution, so that a probe molecule that can bind to or interact with a specific protein is particularly purified from a plurality of probe molecule groups. It became clear that it was possible to identify without having to do.

本発明は、特定の疾病についての薬剤を開発することを目的にするものではなく、一般的な薬剤開発の方法を提供するものである。この方法の従来技術よりも優れている画期的な点は、（１）スクリーニングが水溶液中で行われること、（２）一挙に２０種類、あるいは位置スキャン法を適用すれば1013種類もの混合物から適切なプローブ分子を見出すことが可能であること、（３）操作が簡単で、迅速であること、にある。この方法は、化合物ライブラリーからプローブ分子を見出す最も簡便な方法であり、国内外の製薬企業を中心に莫大な需要が見込まれる。 The present invention is not intended to develop a drug for a specific disease, but provides a general method for drug development. The ground-breaking points of this method over the prior art are: (1) that screening is performed in aqueous solution, (2) 20 types at once, or 10 13 types of mixtures if the position scan method is applied. (3) The operation is simple and quick. This method is the simplest method for finding a probe molecule from a compound library, and enormous demand is expected mainly by domestic and foreign pharmaceutical companies.

本発明は（１）種々の蛍光性非天然アミノ酸誘導体、（２）２次元蛍光測定装置あるいは２次元リアルタイム蛍光モニター、（３）２次元蛍光スペクトル解析ソフトウェアを組み合わせて実現できる。   The present invention can be realized by combining (1) various fluorescent unnatural amino acid derivatives, (2) a two-dimensional fluorescence measurement device or a two-dimensional real-time fluorescence monitor, and (3) a two-dimensional fluorescence spectrum analysis software.

蛍光性非天然アミノ酸誘導体の例を示す図であり、具体的な構造を示す図である。It is a figure which shows the example of a fluorescent non-natural amino acid derivative, and is a figure which shows a specific structure. 実施例２において、実施例１で合成した６種類の成分ペプチド及びanti-FLAG-Cy3の水（pH=7.4）/メタノール 1/1混合溶液中における各２次元蛍光スペクトルの結果を示す図である。In Example 2, it is a figure which shows the result of each two-dimensional fluorescence spectrum in water (pH = 7.4) / methanol 1/1 mixed solution of 6 types of component peptides and anti-FLAG-Cy3 which were synthesize | combined in Example 1. FIG. . 実施例３において、実施例１で得た６種類の成分ペプチドを等モル混合物とCy3標識FLAG抗体との水（pH=7.4）/メタノール 1/1混合溶液中の２次元蛍光スペクトルの結果を示す図である。In Example 3, the results of two-dimensional fluorescence spectra in an equimolar mixture of the six component peptides obtained in Example 1 and a Cy3 labeled FLAG antibody in water (pH = 7.4) / methanol 1/1 mixed solution are shown. FIG. 実施例４において、実施例１で得た６種類の成分ペプチドを等モル量混合物と抗FLAG抗体との混合物のゲルろ過後の各フラクションにおける水（pH=7.4）/メタノール 1/1混合溶液中の２次元蛍光スペクトルの結果を示す図である。In Example 4, water (pH = 7.4) / methanol 1/1 in a mixed solution of each of the six component peptides obtained in Example 1 after gel filtration of an equimolar mixture and anti-FLAG antibody mixture It is a figure which shows the result of two-dimensional fluorescence spectrum. 実施例４において、図３の各フラクションにおける２次元蛍光スペクトルを解析し、各フラクションにおける各ペプチド成分量を示す図である。In Example 4, it is a figure which analyzes the two-dimensional fluorescence spectrum in each fraction of FIG. 3, and shows each peptide component amount in each fraction.

Claims (8)

蛍光波長及び／又は励起波長が各々異なる少なくとも３種類の蛍光標識剤を構成要素とし、２次元蛍光スペクトル解析を用いて、候補化合物群から、特定のタンパク質又は細胞と結合若しくは相互作用しうる物質をスクリーニングするためのスクリーニング用キット。 A substance capable of binding to or interacting with a specific protein or cell from a group of candidate compounds using at least three types of fluorescent labeling agents each having a different fluorescence wavelength and / or excitation wavelength as components, and using two-dimensional fluorescence spectrum analysis Screening kit for screening. 蛍光標識剤が蛍光標識非天然アミノ酸である請求項１に記載のスクリーニング用キット。 The screening kit according to claim 1, wherein the fluorescent labeling agent is a fluorescently labeled unnatural amino acid. 蛍光標識剤の両端に水溶性物質が付加されている構造からなる蛍光標識用ユニットを含む請求項１または２に記載のスクリーニング用キット。 The screening kit according to claim 1 or 2, comprising a fluorescent labeling unit having a structure in which a water-soluble substance is added to both ends of the fluorescent labeling agent. 蛍光標識用ユニットが、蛍光標識用非天然アミノ酸ユニットであり、蛍光標識非天然アミノ酸の両端に水溶性アミノ酸が付加されているペプチド配列を含む請求項３に記載のスクリーニング用キット。 The screening kit according to claim 3, wherein the fluorescent labeling unit is a non-natural amino acid unit for fluorescent labeling, and includes a peptide sequence in which water-soluble amino acids are added to both ends of the fluorescently labeled unnatural amino acid. 蛍光標識用非天然アミノ酸ユニットが、蛍光標識非天然アミノ酸の両端に水溶性アミノ酸が付加されているペプチド配列と、そのＮ側、Ｃ側または両側にさらに水溶性リンカー化合物を含むことを特徴とする請求項４に記載のスクリーニング用キット。 The non-natural amino acid unit for fluorescent labeling includes a peptide sequence in which water-soluble amino acids are added to both ends of the fluorescently labeled non-natural amino acid and a water-soluble linker compound on the N side, C side or both sides thereof. The screening kit according to claim 4. 請求項１〜５のいずれか１に記載のキットを用いて、候補化合物群から、特定のタンパク質又は細胞と結合若しくは相互作用しうる物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。 A screening method comprising screening a substance capable of binding to or interacting with a specific protein or cell from a group of candidate compounds using the kit according to any one of claims 1 to 5. 少なくとも以下の工程を含む、請求項６に記載のスクリーニング方法：
１）候補化合物に蛍光標識剤を付加する工程；
２）特定のタンパク質又は細胞と、上記１）の蛍光標識剤を付加した対象化合物を水溶液中で混合する工程；
３）上記２）で混合した物質を分画する工程；
４）上記３）で得た、各分画について、２次元蛍光スペクトルを測定する工程；
５）２次元蛍光スペクトルの測定結果を解析する工程。 The screening method according to claim 6, comprising at least the following steps:
1) adding a fluorescent labeling agent to a candidate compound;
2) A step of mixing a specific protein or cell and a target compound to which the fluorescent labeling agent of 1) above is added in an aqueous solution;
3) A step of fractionating the substance mixed in 2) above;
4) A step of measuring a two-dimensional fluorescence spectrum for each fraction obtained in 3) above;
5) A step of analyzing the measurement result of the two-dimensional fluorescence spectrum. 候補化合物が、アミノ酸残基数が３〜５０の長さからなるペプチドである、請求項６又は７に記載のスクリーニング方法。 The screening method according to claim 6 or 7, wherein the candidate compound is a peptide having a length of 3 to 50 amino acid residues.
JP2008240242A 2007-09-20 2008-09-19 Screening kit including fluorescent labeling agent, and screening method Pending JP2009092654A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008240242A JP2009092654A (en) 2007-09-20 2008-09-19 Screening kit including fluorescent labeling agent, and screening method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007244403 2007-09-20
JP2008240242A JP2009092654A (en) 2007-09-20 2008-09-19 Screening kit including fluorescent labeling agent, and screening method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2009092654A true JP2009092654A (en) 2009-04-30

Family

ID=40664767

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008240242A Pending JP2009092654A (en) 2007-09-20 2008-09-19 Screening kit including fluorescent labeling agent, and screening method

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2009092654A (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012072075A (en) * 2010-09-28 2012-04-12 Okayama Univ Novel branched amino acid and conjugate between novel branched amino acid and fluorescent amino acid
JP2020076612A (en) * 2018-11-06 2020-05-21 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 Component extraction method, fluorescence fingerprint measuring device, and program executable by computer

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005315862A (en) * 2004-03-30 2005-11-10 Sysmex Corp Method for screening cervical carcinoma and diagnostic drug for the same
WO2006132335A1 (en) * 2005-06-10 2006-12-14 National University Corporation Okayama University Fluorescent amino acid derivative

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005315862A (en) * 2004-03-30 2005-11-10 Sysmex Corp Method for screening cervical carcinoma and diagnostic drug for the same
WO2006132335A1 (en) * 2005-06-10 2006-12-14 National University Corporation Okayama University Fluorescent amino acid derivative
JP2006342299A (en) * 2005-06-10 2006-12-21 Okayama Univ Fluorescent amino acid derivative

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012064059; Ｍｉｄｏｒｉ　Ｆｕｔａｍｉ（外２名）: 'Ｍｕｌｔｉ-Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　（２）　-Ｓｃｒ' Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００７ , 200703, ｐ．　３８３-３８６ *
JPN6012064062; Ｍｉｄｏｒｉ　Ｆｕｔａｍｉ（外２名）: 'Ｍｕｌｔｉ-Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　（１）　-Ｓｃｒ' Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００７ , 200703 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012072075A (en) * 2010-09-28 2012-04-12 Okayama Univ Novel branched amino acid and conjugate between novel branched amino acid and fluorescent amino acid
JP2020076612A (en) * 2018-11-06 2020-05-21 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 Component extraction method, fluorescence fingerprint measuring device, and program executable by computer
JP7207702B2 (en) 2018-11-06 2023-01-18 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 Component extraction method, fluorescence fingerprint measurement device, and computer executable program

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11162952B2 (en) Single molecule peptide sequencing
US11268963B2 (en) Protein sequencing methods and reagents
Jia et al. Folding dynamics of single GCN-4 peptides by fluorescence resonant energy transfer confocal microscopy
Kodadek et al. Optimized protocols for the isolation of specific protein-binding peptides or peptoids from combinatorial libraries displayed on beads
Qian et al. Synthesis and screening of one-bead-one-compound cyclic peptide libraries
US20230107647A1 (en) Single molecule peptide sequencing
Vaijayanthi et al. Design of a new fluorescent probe: pyrrole/imidazole hairpin polyamides with pyrene conjugation at their γ-turn
EP3384041B1 (en) Method for identification of protease substrates
Uttamchandani et al. Site-specific peptide immobilization strategies for the rapid detection of kinase activity on microarrays
JP2009092654A (en) Screening kit including fluorescent labeling agent, and screening method
EP3137898A2 (en) Fluorescent molecular sensor for targeting changes in protein surfaces, and methods of use thereof
WO2007072973A1 (en) Novel capture agents for binding a ligand
Kunys et al. Specificity Profiling of Protein‐Binding Domains Using One‐Bead‐One‐Compound Peptide Libraries
Hein et al. Protocol for peptide synthesis on spectrally encoded beads for MRBLE-pep assays
US9075070B2 (en) HTS fluorescence polarization assay for inhibitors of Keap1-Nrf2 interaction
Tang et al. Single-bead quantification of peptide loading distribution for one-bead one-compound library synthesis using confocal Raman spectroscopy
WO2023100976A1 (en) Peptide-immobilized bead library
US20220243360A1 (en) Peptide libraries having enhanced subsequence diversity and methods for use thereof
Hinson Development of tools for single molecule peptide fluorosequencing
US6689568B2 (en) Capture arrays using polypeptide capture agents
Zhao et al. A split ligand for lanthanide binding: facile evaluation of dimerizing proteins
US10641778B2 (en) System and method for analysis of peptide synthesis fidelity
WO2024076928A1 (en) Fluorophore-polymer conjugates and uses thereof
JPH11127862A (en) Detection of target nucleic acid
Schirwitz zur Erlangung der Doktorwürde der Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät der

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20110907

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20121211

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20130606