JP2009073765A - Ace (angiotensin converting enzyme) inhibitor composition and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、燕麦タンパク質画分又は燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物（以下、「ＡＣＥ阻害剤組成物」という場合がある）、該ＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法、及び該ＡＣＥ阻害剤組成物を配合した食品に関する。 The present invention relates to an angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor composition (hereinafter sometimes referred to as “ACE inhibitor composition”) containing an oat protein fraction or an oat protein-derived peptide fraction, and the ACE inhibitor composition And a food containing the ACE inhibitor composition.
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は、血圧の調整においてレニン・アンジオテンシン系に作用する酵素である。レニン・アンジオテンシン系では、肝臓から分泌されるアンジオテンシノーゲンが、腎臓から分泌されるレニンによってアンジオテンシンIに変換される。アンジオテンシンIは更にＡＣＥによってアンジオテンシンIIに変換されるが、このアンジオテンシンIIは血管の収縮、血管透過性の増大などの作用があり、血圧を上昇させる。また、血管拡張作用により血圧降下作用を示すブラジキニンは、ＡＣＥにより分解されるため、このブラジキニンの分解によっても結果的に血圧が上昇する。ＡＣＥ阻害活性をもつ物質は、上記のＡＣＥの作用を阻害することから、有効な血圧降下作用をもつ成分として着目されている。 Angiotensin converting enzyme (ACE) is an enzyme that acts on the renin-angiotensin system in regulating blood pressure. In the renin-angiotensin system, angiotensinogen secreted from the liver is converted to angiotensin I by renin secreted from the kidney. Angiotensin I is further converted to angiotensin II by ACE, and this angiotensin II has effects such as vasoconstriction and increased vascular permeability, and increases blood pressure. In addition, bradykinin, which exhibits a blood pressure lowering action due to a vasodilatory action, is decomposed by ACE, and as a result, the blood pressure increases as a result of this bradykinin decomposition. A substance having an ACE inhibitory activity has been attracting attention as a component having an effective blood pressure lowering action because it inhibits the action of the ACE.
近年、メタボリック症候群に代表される成人病の増加により、血圧降下作用をもつ物質が着目されているが、高血圧に関連する疾病は特に食事による影響が強いと言われており、高血圧の予防効果を持つ食品素材やその抽出物に対して期待がもたれている。食品素材に含まれているＡＣＥ阻害物質としては、特に食品素材中のタンパク質の酵素分解物であるペプチドについて、ＡＣＥ阻害活性があることが報告されている。例えば、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物（例えば、特許文献１参照）、牛由来カゼインのトリプシン分解物（参考文献２〜５参照）、ゴマの加水分解物（例えば、特許文献６参照）、トウモロコシ蛋白質のサーモライシン分解物（例えば、特許文献７参照）、海苔やヒジキのペプシン分解物（例えば、特許文献８，９参照）、米、小麦、大麦、オート麦、ゴマ等に由来する蛋白のサーモライシン分解物（例えば、特許文献１０参照）、植物種子等の加水分解物（例えば、特許文献１１参照）等、或いは、いちじく樹木もしくは果肉の固液分離液を分別して得られるペプチド（例えば、特許文献１２参照）等、多数の報告がなされている。これらのペプチドがもつＡＣＥ阻害活性効果は、ＡＣＥ阻害活性に対する強さに違いはあるものの、それぞれが特定のアミノ酸配列を持つペプチド類がもたらす効果である。 In recent years, due to an increase in adult diseases represented by metabolic syndrome, substances that have a blood pressure lowering effect have attracted attention. Expectation is expected for the food material and its extract. As an ACE inhibitor contained in a food material, it has been reported that a peptide which is an enzyme degradation product of a protein in the food material has ACE inhibitory activity. For example, a collagenase digest of gelatin (see, for example, Patent Document 1), a trypsin degradation product of bovine casein (see References 2 to 5), a hydrolyzate of sesame (see, for example, Patent Document 6), and a thermolysin of corn protein Decomposed products (for example, see Patent Document 7), laver and hijiki pepsin decomposed products (for example, see Patent Documents 8 and 9), rice, wheat, barley, oats, sesame and other proteins derived from thermolysin (for example, , Patent Document 10), hydrolyzate of plant seeds (for example, see Patent Document 11), etc., or peptides obtained by fractionating the solid-liquid separation liquid of fig tree or pulp (for example, see Patent Document 12), etc. Many reports have been made. The ACE inhibitory activity effect of these peptides is an effect brought about by peptides each having a specific amino acid sequence, although there is a difference in strength against the ACE inhibitory activity.
前述のような食品素材由来のＡＣＥ阻害活性をもつペプチドは、副作用、毒性などの安全性の面において問題が少なく、通常の食品として摂取できるという利点があるが、原料の値段が高い、調製方法が複雑である、大量生産が難しい、体内に摂取した際に消化酵素によって分解され効果が出にくい場合がある、ＡＣＥ阻害活性を持つペプチドは苦味を伴うことが多く、食用として扱うのに難しい、等といった様々な問題を抱えている。本発明の課題は、ＡＣＥ阻害活性に優れ、抗高血圧効果を奏し、副作用・毒性などの安全性の面において問題がなく、食品に添加した場合に官能評価に優れ、調製方法が複雑でなく、大量生産が可能なＡＣＥ阻害剤組成物や、該ＡＣＥ阻害剤組成物を有効成分とする抗高血圧薬剤や、該ＡＣＥ阻害剤組成物を配合した機能性食品等を提供することにある。 Peptides having ACE inhibitory activity derived from food materials as described above have the advantage that they can be ingested as normal foods with few problems in terms of safety such as side effects and toxicity, but the cost of raw materials is high. Is complex, difficult to mass-produce, may be degraded by digestive enzymes when ingested in the body and may not be effective, peptides with ACE inhibitory activity often have a bitter taste and are difficult to handle as edible, I have various problems such as. The subject of the present invention is excellent in ACE inhibitory activity, has an antihypertensive effect, has no problems in safety such as side effects and toxicity, is excellent in sensory evaluation when added to foods, and the preparation method is not complicated, An object of the present invention is to provide an ACE inhibitor composition capable of mass production, an antihypertensive drug containing the ACE inhibitor composition as an active ingredient, and a functional food containing the ACE inhibitor composition.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行ない、本発明者らが独自に開発した検索手法により、タンパク質データバンクに登録されている食品タンパク質のアミノ酸配列の検索と統計処理を行なった結果、主に飼料用として使用され非常に安価である燕麦のグロブリンタンパク質に強いＡＣＥ阻害活性を示す可能性のあるアミノ酸配列を有するペプチド画分の存在を予測した。５５１個のアミノ酸から構成され、分子サイズは約６１ｋＤａの燕麦グロブリンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５）を図３に示す。そして、図３に示す燕麦グロブリンタンパク質をペプシン及びキモトリプシンで消化した場合、図４のようなペプチドが生成されることをＢＩＯＰＥＰ解析（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/）によって確認した。それら生成ペプチド画分は、ペプシンやトリプシンといったヒトの消化酵素による基質認識部位を持っていないことから、体内に摂取されてから胃や小腸内で消化を受け、失活することはないと判断された。そこで、燕麦タンパク質画分や該タンパク質由来のペプチド画分について、ＡＣＥ阻害活性、抗高血圧作用、副作用・毒性などの安全性、食品に添加した場合の官能評価について検討し、優れた効果を奏することを確認し、本発明を完成するに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted intensive research, and by using a search method originally developed by the present inventors, search and statistical processing of amino acid sequences of food proteins registered in the protein data bank. As a result, the presence of a peptide fraction having an amino acid sequence that may have strong ACE inhibitory activity on the globulin protein of buckwheat that is mainly used for feed and is very inexpensive was predicted. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of oat globulin protein composed of 551 amino acids and having a molecular size of about 61 kDa is shown in FIG. And when the oat globulin protein shown in FIG. 3 is digested with pepsin and chymotrypsin, it is confirmed by BIOPEP analysis (http://www.uwm.edu.pl/biochemia/) that a peptide as shown in FIG. 4 is produced. did. Since these peptide fractions do not have a substrate recognition site by human digestive enzymes such as pepsin and trypsin, they are considered to be inactivated by digestion in the stomach and small intestine after ingestion. It was. Therefore, to examine the ACE inhibitory activity, antihypertensive action, safety such as side effects and toxicity, and sensory evaluation when added to food for the buckwheat protein fraction and peptide fraction derived from the protein, and exhibit excellent effects As a result, the present invention was completed.
すなわち本発明は、（１）粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、及び、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ、のタンパク質分画ステップを順次備えたことを特徴とする燕麦タンパク質画分を含むアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物の製造方法や、（２）粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ、のタンパク質分画ステップ、及び燕麦タンパク質画分をペプシン及びトリプシンを用いて分解して、ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を得る燕麦タンパク質分解ステップを順次備えたことを特徴とする燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物の製造方法や、（３）有機溶媒として、ヘキサン又はアセトンを用いることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法や、（４）アルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液として、塩化ナトリウム又は塩化カルシウムを用いることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法や、（５）燕麦タンパク質分解ステップにおいて、ペプシン及びトリプシン分解処理後に、透析膜もしくは限外濾過膜を用いて分子篩処理を施してペプチド画分を得ることを特徴とする前記（２）〜（４）のいずれか記載のＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法に関する。 That is, the present invention includes (1) a powdered buckwheat defatting step in which pulverized buckwheat is defatted using an organic solvent; Protein fractionation step or (b) Protein fractionation step in which alkaline salt or alkaline earth salt solution was added to homogenized defatted buckwheat flour and desalting treatment was applied to the eluted fraction, which was sequentially provided A method for producing an angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor composition containing an oat protein fraction characterized by the following: (2) a powdered oat defatting step in which a defatted treatment is performed on the ground oat using an organic solvent, (a) defatting Protein fractionation step in which buckwheat flour is treated with amylase and then ethanol is added to precipitate the protein fraction or (b) defatted buckwheat Homogenize by adding an alkali salt or alkaline earth salt solution to the end, and digest the elution fraction with the protein fractionation step, and the oat protein fraction with pepsin and trypsin. An angiotensin-converting enzyme (ACE) comprising a peptide fraction derived from oat protein, characterized by sequentially comprising a buckwheat proteolysis step for obtaining a peptide fraction comprising peptides having amino acid sequences of VIEPQGL, NIVQMSATR, VQVVNNNGQTVF, and IVPQHF Method for producing inhibitor composition, (3) Method for producing ACE inhibitor composition according to (1) or (2), wherein hexane or acetone is used as the organic solvent, and (4) alkali As a salt or alkaline earth salt solution, sodium chloride or The method for producing an ACE inhibitor composition according to any one of (1) to (3), wherein calcium chloride is used, and (5) a dialysis membrane after pepsin and trypsin degradation in the buckwheat proteolysis step Alternatively, the present invention relates to a method for producing an ACE inhibitor composition according to any one of (2) to (4), wherein a peptide fraction is obtained by performing molecular sieving using an ultrafiltration membrane.
また本発明は、（６）前記（１）、（３）又は（４）記載の製造方法により得られる燕麦タンパク質画分を含有するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物や、（７）前記（２）〜（５）の記載の製造方法により得られるＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を含有するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物に関する。 The present invention also relates to (6) an angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor composition containing an oat protein fraction obtained by the production method described in (1), (3) or (4) above, (7) The present invention relates to an angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor composition containing a peptide fraction containing peptides having amino acid sequences of VIEPQGL, NIVQMSATR, VQVVNNNGQTVF, and IVPQHF obtained by the production method described in (2) to (5).
さらに本発明は、（８）ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドや、（９）ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドからなるアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤や、（１０）前記（６）又は（７）記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物を有効成分とする抗高血圧薬剤や、（１１）前記（９）記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤を有効成分とする抗高血圧薬剤や、（１２）前記（６）又は（７）記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物を配合した食品や、（１３）前記（９）記載のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤を配合した食品に関する。 Furthermore, the present invention relates to (8) a peptide having the amino acid sequence of VIEPQGL, NIVQMSATR, VQVVNNNGQTVF, or IVPQHF; An antihypertensive agent comprising as an active ingredient an agent, (10) the angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor composition described in (6) or (7), and (11) an angiotensin converting enzyme (ACE) described in (9) ) An antihypertensive drug containing an inhibitor as an active ingredient, (12) a food containing the angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor composition described in (6) or (7), and (13) the description in (9) Angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitor Agent relates to a food product formulated with.
本発明のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤組成物の製造方法によれば、食品レベルでの安全性、強いＡＣＥ阻害活性、優れた抗高血圧作用を有する燕麦タンパク質画分や燕麦タンパク質由来のペプチド画分を、燕麦より安価で、簡易に製造することができ、かつ、大量生産を可能とすることができる。かかるＡＣＥ阻害剤組成物を含む抗高血圧薬剤や食品は、飲食に適した苦味等のない風味を有するものである。 According to the method for producing an angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor composition of the present invention, a buckwheat protein fraction or a buckwheat protein-derived peptide fraction having food-level safety, strong ACE inhibitory activity, and excellent antihypertensive activity. It is cheaper than buckwheat, can be easily manufactured, and can be mass-produced. Antihypertensive drugs and foods containing such an ACE inhibitor composition have a taste without bitterness suitable for eating and drinking.
本発明の燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法としては、粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、及び、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ；を順次備えたものであれば特に制限されるものではなく、また、本発明の燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造方法としては、粉砕した燕麦に有機溶媒を用いて脱脂処理を施す粉末燕麦脱脂ステップ、（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；又は（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ；及び、燕麦タンパク質画分をペプシン及びトリプシンを用いて分解して、ＶＩＥＰＱＧＬ（Val-Ile-Glu-Pro-Gln-Gly-Leu）（配列番号１）、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ（Asn-Ile-Val-Gln-Met-Ser-Ala-Thr-Arg）（配列番号２）、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ（Val-Gln-Val-Val-Asn-Asn-Asn-Gly-Gln-Thr-Val-Phe）（配列番号３）、ＩＶＰＱＨＦ（Ile-Val-Pro-Gln-His-Phe）（配列番号４）のアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチド画分を得る燕麦タンパク質分解ステップを順次備えたものであれば特に制限されるものではなく、上記燕麦（学名：Avena sativa）はイネ科ウシノケグサ亜科カラスムギ属に属する１年生または越年生草本の穀物であり、別名、オートムギ、オート、マカラスムギともいい、また、同属の野生種と同名でカラスムギとも呼ばれ、主成分は澱粉であるが、穀類中ではタンパク質、脂質、食物繊維も多く、アミノ酸組成はリシンが第１制限アミノ酸（必須アミノ酸のうち最も不足する）であるが、アミノ酸スコアは比較的高い。 As a method for producing an ACE inhibitor composition containing the buckwheat protein fraction of the present invention, a powdered buckwheat degreasing step for subjecting the pulverized buckwheat to a degreasing treatment using an organic solvent, and (a) an amylase treatment of the defatted buckwheat powder. A protein fractionation step in which ethanol is then added to precipitate the protein fraction; or (b) a protein fraction that is subjected to homogenization by adding an alkali salt or alkaline earth salt solution to the defatted oat powder and subjecting the eluted fraction to desalting treatment The step of preparing the ACE inhibitor composition containing the peptide fraction derived from the buckwheat protein of the present invention includes an organic solvent in the ground buckwheat. Degreased powder oat degreasing step using (a) amylase treatment of the defatted oat powder, ethanol was added to precipitate the protein fraction Or (b) a protein fractionation step in which an alkaline salt or alkaline earth salt solution is added to the defatted oat powder and homogenized, and the elution fraction is subjected to a desalting treatment; and the oat protein fraction is treated with pepsin. And trypsin, and VIEPQGL (Val-Ile-Glu-Pro-Gln-Gly-Leu) (SEQ ID NO: 1), NIVQMSATR (Asn-Ile-Val-Gln-Met-Ser-Ala-Thr-Arg) ) (SEQ ID NO: 2), VQVVNNNGQTVF (Val-Gln-Val-Val-Asn-Asn-Asn-Gly-Gln-Thr-Val-Phe) (SEQ ID NO: 3), IVPQHF (Ile-Val-Pro-Gln-His) -Phe) It is not particularly limited as long as it sequentially comprises a buckwheat proteolysis step for obtaining a peptide fraction containing a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the above buckwheat (scientific name: Avena sativa) is One year belonging to the genus Oataceae Or a grain of perennial herb, also known as oats, oats, macarus wheat, also called wild oats of the same genus and called oats, the main ingredient is starch, but in cereals proteins, lipids, dietary fiber The amino acid composition is that lysine is the first restricted amino acid (the shortest of essential amino acids), but the amino acid score is relatively high.
上記粉末燕麦脱脂ステップにおいて、原料燕麦を、摩擦式、せん断式、衝撃式などの公知の粉砕機を用いて粉砕することにより、粉砕燕麦を得ることができる。粉砕の程度は、平均粒径が４５０μｍ以下（４０メッシュパス）、特に３００μｍ以下（６０メッシュパス）となるように粉砕することが好ましい。次に粉砕した燕麦にアルコール類、ヘキサン、アセトン等の有機溶媒を加え、ホモゲナイザーを用いてホモゲナイズを所定回数繰り返し行って、粉砕燕麦を脱脂処理して脱脂燕麦粉末を得る。脱脂処理に使用する前記有機溶媒として、ヘキサン又はアセトンを用いることが好ましく、ヘキサンがより好ましい。また脱脂に際してはソックスレー脂肪抽出装置を用いることもできる。 In the powdered buckwheat degreasing step, the raw buckwheat can be obtained by grinding the raw buckwheat using a known grinder such as a friction type, a shearing type or an impact type. The degree of pulverization is preferably such that the average particle size is 450 μm or less (40 mesh pass), particularly 300 μm or less (60 mesh pass). Next, an organic solvent such as alcohols, hexane and acetone is added to the pulverized buckwheat and homogenization is repeated a predetermined number of times using a homogenizer, and the pulverized buckwheat is degreased to obtain a defatted oat powder. As the organic solvent used for the degreasing treatment, hexane or acetone is preferably used, and hexane is more preferable. In addition, a Soxhlet fat extraction device can be used for degreasing.
上記タンパク質分画ステップ（ａ）における脱脂燕麦粉末のアミラーゼ処理は、０．１〜０．３％、好ましくは０．２％のアミラーゼ溶液、好ましくはα−アミラーゼ溶液、特に枯草菌由来のα−アミラーゼ溶液を、脱脂燕麦粉末の５〜１５倍量、好ましくは１０倍量程度用い、使用アミラーゼ量としては、タンパク質画分に対して２〜５％、より好ましくは３％の酵素濃度で用いることができる。また、アミラーゼ処理条件は３５℃〜４０℃、５時間以上が好ましく、３７℃の条件下で６時間のアミラーゼ処理を好適に例示することができる。アミラーゼ分解処理終了後に、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップの処理条件は、１．５〜２．５倍量のエタノールを加えて２０００〜４０００×ｇで１０〜２０分間遠心分離にかけタンパク質画分を沈降させ、より好ましくは、２倍量のエタノールを加えて３０００×ｇで１５分間遠心分離にかけるタンパク質画分沈降条件を例示することができる。沈降させたタンパク質画分はそのまま、又はフリーズドライ処理を施すことにより、本発明の燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物とすることができる。 The amylase treatment of the defatted oat powder in the protein fractionation step (a) is 0.1 to 0.3%, preferably 0.2% amylase solution, preferably α-amylase solution, particularly α-amylase derived from Bacillus subtilis. The amylase solution should be used in an amount of 5 to 15 times, preferably about 10 times the amount of defatted oat powder, and the amount of amylase used should be 2 to 5%, more preferably 3% of the protein fraction. Can do. The amylase treatment conditions are preferably 35 ° C. to 40 ° C. and 5 hours or longer, and a 6 hour amylase treatment can be suitably exemplified under the condition of 37 ° C. After completion of the amylase decomposition treatment, the treatment conditions for the protein fractionation step in which ethanol is added to precipitate the protein fraction are 1.5 to 2.5 times the amount of ethanol and centrifuged at 2000 to 4000 × g for 10 to 20 minutes. Examples of the protein fraction sedimentation conditions include precipitation of the protein fraction through separation, and more preferably addition of 2 volumes of ethanol and centrifugation at 3000 × g for 15 minutes. The precipitated protein fraction can be used as it is or by subjecting it to freeze drying, whereby an ACE inhibitor composition containing the oat protein fraction of the present invention can be obtained.
上記タンパク質分画ステップ（ｂ）において用いられるアルカリ塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができ、好適には、塩化ナトリウムを例示することができ、また、アルカリ土類塩としては、カルシウム塩、マグネシウム塩等を挙げることができ、好適には、塩化カルシウムを例示することができる。脱脂燕麦粉末とアルカリ塩又はアルカリ土類塩との配合は、例えば脱脂燕麦粉末に、５〜２０倍量の０．２５〜１．０Ｍのアルカリ塩又はアルカリ土類塩の溶液が用いられ、より具体的には、１０倍量の０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液もしくは０．５Ｍ塩化カルシウム溶液が加えられる。アルカリ塩又はアルカリ土類塩の溶液を加えた後、３〜１０分間、例えば５分間程度ホモゲナイズする。また、残渣には更にアルカリ塩又はアルカリ土類塩の溶液を加えホモゲナイズを２度以上繰り返し、なるべく多くの溶出画分を集めることが好ましい。この溶出画分に透析、限外濾過等の脱塩処理、例えば、１２〜１４０００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜、もしくはペリコンＸＬを用いた限外濾過による脱塩処理を施す。この脱塩処理物、その濃縮処理物、フリーズドライ処理物を、本発明の燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物とすることができる。 Examples of the alkali salt used in the protein fractionation step (b) include a sodium salt and a potassium salt, preferably sodium chloride, and examples of the alkaline earth salt include A calcium salt, a magnesium salt, etc. can be mentioned, A calcium chloride can be illustrated suitably. The blending of defatted oat powder and alkali salt or alkaline earth salt is, for example, 5-20 times the amount of 0.25 to 1.0 M alkali salt or alkaline earth salt solution used in defatted oat powder, Specifically, 10 times the amount of 0.5 M sodium chloride solution or 0.5 M calcium chloride solution is added. After adding the alkali salt or alkaline earth salt solution, homogenize for 3 to 10 minutes, for example, about 5 minutes. Further, it is preferable to add an alkali salt or alkaline earth salt solution to the residue and repeat homogenization twice or more to collect as many elution fractions as possible. This elution fraction is subjected to a desalting treatment such as dialysis and ultrafiltration, for example, a desalting treatment by ultrafiltration using 12-14000 MW-cut-off dialysis membrane or Pellicon XL. The desalted product, the concentrated product, and the freeze-dried product can be used as an ACE inhibitor composition containing the oat protein fraction of the present invention.
上記燕麦タンパク質分解ステップにおいては、上記燕麦タンパク質画分のｐＨ調整後に、ペプシン及びトリプシンによるタンパク分解酵素処理が行われる。具体的には、ペプシンによる分解方法は、無機酸や有機酸の溶液を用いてｐＨ２．０に調整し、タンパク質量に対して０．１％以上の酵素濃度となるようにペプシンを加え、３７℃〜４０℃、５時間以上インキュベーションを行う。より好ましくは、ペプシン濃度が０．２％で、３７℃、６時間インキュベーションを行なう。次にトリプシンによる分解を行うが、その分解方法は、まずｐＨ調整後トリプシンによるタンパク分解を行う。具体的には、ＮａＯＨ等のアルカリを用いてｐＨ８．０に調整し、ペプシン処理時のタンパク質量に対して、トリプシン濃度０．１％以上、３７℃の条件下で５時間以上インキュベーションを行なう。より好ましくは、０．２％酵素濃度となるようにトリプシンを加え、３７℃、６時間インキュベーションを行なう。インキュベーション終了後、３５００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜やペリコンＸＬを用いた限外濾過を用いて分子篩にかけることが好ましい。インキュベーション終了物、好ましくはその分子篩処理物、より好ましくはそのフリーズドライ処理物を、本発明の燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含む活性組成物とすることができる。 In the buckwheat protein decomposition step, after the pH adjustment of the buckwheat protein fraction, a proteolytic enzyme treatment with pepsin and trypsin is performed. Specifically, the decomposition method using pepsin is adjusted to pH 2.0 using a solution of an inorganic acid or an organic acid, pepsin is added so that the enzyme concentration is 0.1% or more with respect to the amount of protein, and 37 Incubate at -40 ° C for 5 hours or more. More preferably, the incubation is performed at 37 ° C. for 6 hours at a pepsin concentration of 0.2%. Next, degradation with trypsin is performed. As the degradation method, first, after pH adjustment, proteolysis is performed with trypsin. Specifically, the pH is adjusted to 8.0 using an alkali such as NaOH, and the incubation is performed for 5 hours or more under conditions of trypsin concentration of 0.1% or more and 37 ° C. with respect to the amount of protein at the time of pepsin treatment. More preferably, trypsin is added so that the enzyme concentration becomes 0.2%, and incubation is performed at 37 ° C. for 6 hours. After the incubation is completed, it is preferable to pass through a molecular sieve using ultrafiltration using a 3500 MW-cut-off dialysis membrane or Pellicon XL. The product after incubation, preferably the product treated with molecular sieve, more preferably the product subjected to freeze-drying, can be an active composition containing the peptide fraction derived from the buckwheat protein of the present invention.
本発明において、上記（ａ）のタンパク質分画ステップを採用すると、ペプチド画分の純度は低いものの大量調製することができ、（ｂ）のタンパク質分画ステップを採用すると、ペプチド画分の純度は高いものの大量生産には不向きであることから、目的や用途に合わせて上記タンパク質分画ステップを選ぶことが望ましい。 In the present invention, when the protein fractionation step (a) is employed, the peptide fraction can be prepared in large quantities with low purity, and when the protein fractionation step (b) is employed, the purity of the peptide fraction is Since it is unsuitable for mass production of high products, it is desirable to select the protein fractionation step according to the purpose and application.
本発明はまた、ＶＩＥＰＱＧＬのアミノ酸配列を有するペプチド、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲのアミノ酸配列を有するペプチド、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦのアミノ酸配列を有するペプチド、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドに関する。これら新規ペプチドは、ＡＣＥ阻害剤として有用であり、前記燕麦タンパク質由来のペプチド画分から、ＨＰＬＣ等を用いる定法により分離採取することにより、また、アミノ酸配列情報によりペプチド化学合成により得ることができる。 The present invention also relates to a peptide having the amino acid sequence of VIEPQGL, a peptide having the amino acid sequence of NIVQMSATR, a peptide having the amino acid sequence of VQVVNNNGQTVF, or a peptide having the amino acid sequence of IVPQHF. These novel peptides are useful as ACE inhibitors, and can be obtained from the peptide fraction derived from the buckwheat protein by separation and collection by a conventional method using HPLC or the like, or by peptide chemical synthesis based on amino acid sequence information.
本発明の燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物や燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物や、ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、又はＩＶＰＱＨＦのアミノ酸配列を有するペプチドからなるＡＣＥ阻害剤は、常法により錠剤、顆粒、カプセル、シロップ等製剤化して、健康サプリメントや医薬品として用いることができる。サプリメントや医薬品として用いる場合、それらの分野で通常用いられている賦形剤を配合することが好ましい。また、摂取量は、ヒトの体重、年齢、性別、症状等により異なり、特に症状に応じて１日当たりの投与量を決定するが、通常２０〜５００ｍｇ／ｋｇを目安とし、また長期にわたり服用することもできる。 An ACE inhibitor composition comprising the oat protein fraction of the present invention, an ACE inhibitor composition comprising a peptide fraction derived from oat protein, an ACE inhibitor comprising a peptide having the amino acid sequence of VIEPQGL, NIVQMSATR, VQVVNNNGQTVF, or IVPQHF Can be formulated into tablets, granules, capsules, syrups and the like by conventional methods and used as health supplements and pharmaceuticals. When using as a supplement or a pharmaceutical, it is preferable to mix | blend the excipient | filler normally used in those field | areas. The intake varies depending on the human body weight, age, sex, symptoms, etc., and the daily dose is determined according to the particular symptoms, but is usually 20 to 500 mg / kg as a guideline and should be taken for a long time. You can also.
本発明のＡＣＥ阻害剤組成物は、燕麦を原料とし上記特定の処理方法により何ら苦味や薬味を感じることのないものであり、一般食品に含有してもその食品の風味を損なうことがないので、食品に添加・配合して用いることができ、ＡＣＥ阻害作用を奏する食品を容易に提供することができる。添加される食品としては、例えば、麺類、飴、クッキー、シリアル類、菓子類（スナック類）、ふりかけ類、畜産加工品類、魚肉加工品類、缶詰類、牛乳、プレーンヨーグルト等の乳製品飲料、ジュース類、清涼飲料、栄養ドリンク剤等を挙げることができる。 The ACE inhibitor composition of the present invention is made from buckwheat as a raw material and does not feel any bitterness or spiciness by the above-mentioned specific treatment method, and even if it is contained in a general food, it does not impair the flavor of the food. It can be used by being added to and blended with foods, and foods having an ACE inhibitory action can be easily provided. Examples of foods to be added include noodles, strawberries, cookies, cereals, confectionery (snacks), sprinkles, processed livestock products, processed fish products, canned foods, milk, plain yogurt and other dairy drinks, juices , Soft drinks, nutritional drinks, and the like.
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、実施例で記載しているものに限定されるものではない。なお、以下の実施例において、アミラーゼとしては和光純薬工業株式会社製「αアミラーゼ，枯草菌由来，２０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ以上」を、ペプシンとしては和光純薬工業株式会社製「ペプシン１：１０，０００，ブタ胃粘膜由来」を、トリプシンとしては和光純薬工業株式会社製「トリプシン，３０ ＵＳＰ ｕｎｉｔｓ／ｍｇ以上」を、それぞれ使用した。また、「％」は「質量％」を意味する。 Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to those described in the examples. In the following Examples, amylase is “α amylase, derived from Bacillus subtilis, 20 units / mg or more” manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., and pepsin is “Pepsin 1: 10,000” manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. , “Derived from porcine gastric mucosa” and “trypsin, 30 USP units / mg or more” manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. were used as trypsin. “%” Means “% by mass”.
［燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（１）］
粉砕機（ＭｉｌｌｓｅｒＩＦＭ−６００Ｄ）を用いて燕麦を粉砕し、粉砕後６０メッシュの篩にかけて粒径３００μｍ以下の燕麦粉末を得た。次いで燕麦粉末１０ｇにヘキサン５０ｍＬを加え、脱脂燕麦粉末を得た。これに０．２％アミラーゼ溶液１００ｍＬを加え、３７℃で６時間インキュベーションしてアミラーゼ処理物を得た。このアミラーゼ処理物に２倍量のエタノールを加え、３０００×ｇ、１５分間遠心分離するエタノール沈殿処理を行い、タンパク質画分（燕麦グロブリンタンパク質ともいう）を得た。
[Production of ACE inhibitor composition containing oat protein fraction (1)]
The buckwheat was pulverized using a pulverizer (Millser IFM-600D), and after pulverization, it was passed through a 60 mesh sieve to obtain an oat powder having a particle size of 300 μm or less. Next, 50 mL of hexane was added to 10 g of buckwheat flour to obtain defatted buckwheat flour. To this, 100 mL of 0.2% amylase solution was added and incubated at 37 ° C. for 6 hours to obtain an amylase-treated product. To this amylase-treated product, twice the amount of ethanol was added, and an ethanol precipitation treatment was performed by centrifuging at 3000 × g for 15 minutes to obtain a protein fraction (also referred to as oat globulin protein).
［燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（１）］
実施例１で得られたタンパク質画分に１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ２．０に調整した後、ペプシン濃度が０．２％となるようにペプシン溶液を加え、３７℃で６時間インキュベーションしてペプシン処理を行なった。その後１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ８．０に調整した。次いで、ｐＨ調整後のペプシン処理物に、トリプシン濃度が０．２％となるようにトリプシン溶液を加え、３７℃で６時間インキュベーションしてトリプシン処理を行った。最後に３５００ ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜（Spectrum社製「Spectra/Por 3500，再生セルロース製」）を用いて分子篩処理した後、フリーズドライ処理をした。脱脂前の燕麦粉末に対して２３％のペプチド画分を得ることができた。このペプチド画分の窒素化合物含有量は、ケルダール法で確認したところ３０％であった。
[Production of ACE inhibitor composition containing peptide fraction derived from buckwheat protein (1)]
The protein fraction obtained in Example 1 was adjusted to pH 2.0 using 1 M HCl, then added with a pepsin solution so that the pepsin concentration was 0.2%, and incubated at 37 ° C. for 6 hours to pepsin. Processing was performed. Thereafter, the pH was adjusted to 8.0 using 1 M NaOH. Next, a trypsin solution was added to the pepsin-treated product after pH adjustment so that the trypsin concentration was 0.2% and incubated at 37 ° C. for 6 hours. Finally, molecular sieve treatment was performed using a 3500 MW-cut-off dialysis membrane (Spectra / Por 3500, made of regenerated cellulose), and then freeze-dried. A 23% peptide fraction could be obtained with respect to the buckwheat flour before defatting. The nitrogen content of this peptide fraction was 30% as confirmed by the Kjeldahl method.
［燕麦タンパク質画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（２）］
実施例１と同様の方法で得た脱脂燕麦粉末１０ｇに、１０倍量の０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加え、ストマッカー用ポリ袋を用いてホモゲナイザー（オルガノ製Ｌａｂ Ｂｌｅｎｄｅｒ４００）によって５分間ホモゲナイズした。また残渣には更に０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えホモゲナイズを２度以上繰り返し、なるべく多くの溶出画分を集めた。この溶出画分を１２〜１４０００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜（Spectrum社製「Spectra/Por 12〜14,000，再生セルロース製」）にかけ、タンパク質画分を得た。
[Production of ACE inhibitor composition containing buckwheat protein fraction (2)]
10 g of 0.5M sodium chloride solution was added to 10 g of defatted oat powder obtained by the same method as in Example 1, and homogenized with a homogenizer (Lab Blender 400 from Organo) for 5 minutes using a plastic bag for stomacher. Further, 0.5 M sodium chloride solution was further added to the residue, and homogenization was repeated twice or more, and as many elution fractions as possible were collected. This elution fraction was applied to a 12 to 14000 MW-cut-off dialysis membrane (Spectra / Por 12 to 14,000, made by regenerated cellulose, manufactured by Spectrum) to obtain a protein fraction.
［燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（２）］
実施例３で得られたタンパク質画分について１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ２．０に調整した後、ペプシン濃度が０．２％となるようにペプシン溶液を加え３７℃で６時間、インキュベーションしてペプシン処理をした。その後、ペプシン処理物に１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ８．０に調整した。次いで、トリプシン濃度が０．２％となるようにトリプシン溶液を加えて３７℃で６時間インキュベーションしてトリプシン処理を行った。最後に３０００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜を用いて分子ふるいしフリーズドライ処理をし、脱脂前の燕麦粉末に対して４％のペプチド画分を得た。このペプチド画分の窒素化合物含有量は、ケルダール法で確認した所９９％であった。
[Production of ACE inhibitor composition containing peptide fraction derived from buckwheat protein (2)]
The protein fraction obtained in Example 3 was adjusted to pH 2.0 using 1M HCl, then added with a pepsin solution so that the pepsin concentration was 0.2%, and incubated at 37 ° C. for 6 hours to pepsin. Processed. Thereafter, the pepsin-treated product was adjusted to pH 8.0 using 1M NaOH. Next, trypsin treatment was performed by adding a trypsin solution so that the trypsin concentration was 0.2% and incubating at 37 ° C. for 6 hours. Finally, a molecular sieve and freeze-drying treatment were performed using a 3000 MW-cut-off dialysis membrane to obtain a peptide fraction of 4% with respect to the oat powder before defatted. The nitrogen content of this peptide fraction was 99% as confirmed by the Kjeldahl method.
［燕麦タンパク質由来のペプチド画分を含むＡＣＥ阻害剤組成物の製造（３）］
実施例３と同様の方法で得た０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液抽出後の溶出画分に、５０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを加え、一夜攪拌することによって析出させたグロブリンタンパク質を３０００×ｇ、１５分間遠心分離後、沈殿物を少量の純水に溶解させ、これを１２〜１４０００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜（Spectrum社製「Spectra/Por 12〜14,000，再生セルロース製」）にかけ、タンパク質画分を得た。得られたタンパク質画分の純度は９８％に上昇した。ただ、塩析なしで得られた試料（実施例４）の純度は、９５％であったことから、この塩析処理は省略することもできる。また、塩化ナトリウムの代わりに塩化カルシウムを用いて調製した抽出液は、硫酸アンモニウムと反応して不溶性の硫酸カルシウムを形成するためこの精製法を利用することはできないことが明らかにされた。この実施例５によって、半飽和の硫酸アンモニウムによる塩折法を用いることなく、本発明の塩化ナトリウム溶液や塩化カルシウム溶液等を用いるのみでホモジナイズする簡易の方法で一定純度のグロブリンタンパク質を得ることが分った。
[Production of ACE inhibitor composition containing peptide fraction derived from buckwheat protein (3)]
To the elution fraction obtained after extraction with a 0.5 M sodium chloride solution obtained in the same manner as in Example 3, ammonium sulfate was added to 50% saturation, and the globulin protein precipitated by stirring overnight was 3000 × g, 15 After centrifugation for 1 minute, the precipitate is dissolved in a small amount of pure water, and this is applied to a dialysis membrane of 12 to 14,000 MW-cut-off (Spectra / Por 12 to 14,000, made of regenerated cellulose), and the protein fraction. Got. The purity of the obtained protein fraction increased to 98%. However, since the purity of the sample (Example 4) obtained without salting out was 95%, this salting out treatment can be omitted. In addition, it has been clarified that an extraction solution prepared using calcium chloride instead of sodium chloride cannot be used because it reacts with ammonium sulfate to form insoluble calcium sulfate. This Example 5 shows that globulin protein of a certain purity can be obtained by a simple method of homogenization using only the sodium chloride solution or calcium chloride solution of the present invention without using the salt folding method with half-saturated ammonium sulfate. It was.
［比較例１］
実施例１と同様の方法で得た脱脂燕麦粉末１０ｇに、１０倍量の０．０１５ＭのＮａＯＨ溶液を加え、０．１ＭのＮａＯＨでｐＨを９．５に調整後、ストマッカー用ポリ袋を用いてホモゲナイザー（オルガノ製Ｌａｂ Ｂｌｅｎｄｅｒ ４００）によって５分間ホモゲナイズした。また残渣には更に０．０１５ＭのＮａＯＨ溶液を加えてホモゲナイズを２度以上繰り返し、なるべく多くの溶出画分を集めた。この溶出画分のｐＨを２ＭのＨＣｌによって５．５まで下げ、グロブリンタンパク質を等電点沈殿させた。得られたタンパク質画分中には、２％の灰分、０．５％の糖が残存しており、ｐＨ調整に時間がとられる割には純度が低いことが示されたのでこの方法は用いないことにした。
[Comparative Example 1]
To 10 g of defatted oat powder obtained in the same manner as in Example 1, 10 times the amount of 0.015 M NaOH solution was added, and after adjusting the pH to 9.5 with 0.1 M NaOH, a plastic bag for stomacher was used. And homogenized for 5 minutes with a homogenizer (Lab Blender 400 manufactured by Organo). Further, 0.015 M NaOH solution was further added to the residue, and homogenization was repeated twice or more, and as many elution fractions as possible were collected. The pH of the eluted fraction was lowered to 5.5 with 2M HCl, and the globulin protein was isoelectrically precipitated. In the obtained protein fraction, 2% ash and 0.5% sugar remained, and it was shown that the purity was low for the time required for pH adjustment. Decided not to.
［ＡＣＥ阻害活性の測定］
実施例２及び４で得られたペプチド画分等についてＡＣＥ阻害活性を調べた。ＡＣＥ阻害活性の測定は文献（Guan-Hong Li, Huan Liu, Yong-Hui Shi, Guo-Wei Le: Direct spectrophotometric measurement of angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity for screening bioactive peptides, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37巻，219-224ページ，2005）記載の方法に準じて行った。その結果、３５００ＭＷ−ｃｕｔ−ｏｆｆの透析膜を用いて分子ふるいしたペプチド画分は、低分子物質が除去されていることが明らかになった。得られた透析物のＡＣＥ阻害活性は、透析していないものの約３倍の阻害活性能力があることが明らかになった。約４０％が透析液中に排出され、本発明のペプチド画分約６０％が透析チューブの中に残った。ＨＰＬＣ分析（InertsilR ODS-3（４．６ｘ２５０ｍｍ＜分析用＞，１０ｘ２５０ｍｍ＜分析用＞，いずれもＧＬサイエンス社製），アセトニトリル０〜６０％の濃度勾配，流量１ｍＬ／ｍｉｎ）によって２７個のペプチドが確認され、またこれらの中では特に配列番号１〜４で示される、ＶＩＥＰＱＧＬ、ＮＩＶＱＭＳＡＴＲ、ＶＱＶＶＮＮＮＧＱＴＶＦ、ＩＶＰＱＨＦの４つのペプチドが強いＡＣＥ阻害活性を示すことが明らかになった。
[Measurement of ACE inhibitory activity]
The ACE inhibitory activity was examined for the peptide fractions and the like obtained in Examples 2 and 4. ACE inhibitory activity was measured in the literature (Guan-Hong Li, Huan Liu, Yong-Hui Shi, Guo-Wei Le: Direct spectrophotometric measurement of angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity for screening bioactive peptides, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37 Volume, pages 219-224, 2005). As a result, it was revealed that the low molecular weight substance was removed from the peptide fraction obtained by molecular sieving using a 3500 MW-cut-off dialysis membrane. The ACE inhibitory activity of the obtained dialysate was revealed to have an inhibitory activity capacity about 3 times that of the dialyzate that was not dialyzed. About 40% was drained into the dialysate and about 60% of the peptide fraction of the invention remained in the dialysis tube. 27 peptides were obtained by HPLC analysis (Inertsil® ODS-3 (4.6 × 250 mm <analysis>, 10 × 250 mm <analysis>, both manufactured by GL Science), acetonitrile 0-60% concentration gradient, flow rate 1 mL / min). It has been confirmed that, among these, four peptides of VIEPQGL, NIVQMSATR, VQVVNNNGQTVF, and IVPQHF, which are particularly shown in SEQ ID NOs: 1 to 4, have shown strong ACE inhibitory activity.
［インビトロにおけるペプチド画分のＡＣＥ阻害活性比較］
実施例２で得られたペプチド画分のＡＣＥ阻害活性を文献（前出：Guan-Hong Liら, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37巻，219-224ページ，2005）記載の方法に準じて測定し、次に市販されている特定保健用飲料（Ｙ社の有効成分ラクトトリペプチド、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及びＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）のＡＣＥ阻害活性を同様に測定した。両者のペプチド濃度はほぼ同一に揃えてある。本発明のペプチド画分及び市販の特定保健用飲料のＡＣＥ阻害活性の測定結果を図１に示す。図１に示すように、本発明のペプチド画分は、市販の特定保健用飲料に比べてほぼ２倍のＡＣＥ阻害活性を示した。
[Comparison of ACE inhibitory activity of peptide fractions in vitro]
ACE inhibitory activity of the peptide fraction obtained in Example 2 was measured according to the method described in the literature (supra: Guan-Hong Li et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37, 219-224, 2005). Then, the ACE inhibitory activity of specific health beverages (Y company's active ingredient lactotripeptide, Val-Pro-Pro and Ile-Pro-Pro) marketed in the same manner was measured. Both peptide concentrations are almost identical. The measurement results of the ACE inhibitory activity of the peptide fraction of the present invention and the commercially available specified health drink are shown in FIG. As shown in FIG. 1, the peptide fraction of the present invention exhibited almost twice the ACE inhibitory activity as compared with commercially available specific health drinks.
［インビボにおけるペプチド画分の抗高血圧効果］
実施例２で得られたペプチド画分について、高圧発症ラットを用いた動物実験により抗高血圧効果を調べた。すなわち、７週齢の雄ラット（SHR/NCrlCrlj、日本チャールスリバー株式会社）を入手し、１週間馴化後に実験を開始した。２２±３℃、湿度６０±１５％、換気回数１２〜１５回／時間及び照明１２時間 （７〜１９時）／日に設定した飼育室において、１匹／１ケージ（ステンレス製ケージ）で飼育した。飼料には、ＭＦ（オリエンタル酵母工業株式会社製）を、飲料水には水道水を用いてステンレス製給餌器及び給水瓶にて自由摂取させた。生理的食塩水を用いて５０ｍｇ／ｍＬの供試液を要事調製し、本発明のペプチド画分を毎朝１回、体重１ｋｇあたりペプチド含有量として１００ｍｇの投与量になるように、ラット用経口胃ゾンデを用いて強制経口投与した。ペプチド画分のかわりに生理的食塩水を投与したものを対照区とした。血圧測定には、非観血式自動血圧測定装置(BP-98A、株式会社ソフトロン)を用い、１週間に一度、ペプチド試料投与直後と６時間後に心拍数及び血圧（収縮期、拡張期、平均）を測定した。１回の測定に際しては、１匹の動物で連続５回測定し、経時的な収縮期血圧、平均血圧、拡張期血圧、心拍数の変化を追跡した。投与実験は５週間行い、最終日にはペプチド試料投与直後及びそれ以降３時間間隔で３回の合計４回の血圧測定を実施した。その結果を図２に示す。
[Antihypertensive effect of peptide fraction in vivo]
About the peptide fraction obtained in Example 2, the antihypertensive effect was investigated by the animal experiment using the hypertensive rat. That is, a 7-week-old male rat (SHR / NCrlCrlj, Nippon Charles River Co., Ltd.) was obtained, and the experiment was started after acclimatization for 1 week. Breeding in one animal / cage (stainless steel cage) in a breeding room set at 22 ± 3 ° C,
図２には、投与後の収縮期（最高血圧；上の２本）と弛緩期（最低血圧；下の２本）の経時的変化が示され、◆は対照区（ｎ＝６）、■はペプチド画分供試区（ｎ＝６）を示す。図２に示されるように、体重１ｋｇあたり１００ｍｇの供試ペプチド画分を毎朝、５週間強制投与することを続けた高血圧自然発症性の雄ラット（ＳＨＲ／ＮＣｒｌＣｒｌｊ）は、５週間目において、対照区に比べ、有意（ｐ＜０．０５）に血圧を下げることが明らかにされた。 FIG. 2 shows changes over time in the systolic phase (maximum blood pressure; upper two) and the relaxation phase (minimum blood pressure; lower two) after administration, where ◆ is the control group (n = 6), Indicates the peptide fraction test section (n = 6). As shown in FIG. 2, spontaneously hypertensive male rats (SHR / NCrlCrlj) that continued to forcibly administer the test peptide fraction of 100 mg / kg body weight every morning for 5 weeks were tested at 5 weeks. It was revealed that the blood pressure was significantly decreased (p <0.05) compared to the ward.
［インビボにおける燕麦タンパク質画分の抗高血圧効果］
ブリティッシュコロンビア大学医学部の２名の医師の指導の元に、実施例１により得られた燕麦グロブリンタンパク質画分を８０歳男性高血圧症患者（体重６７ｋｇ）に対しての抗高血圧効果が試された。その結果、燕麦グロブリンタンパク質画分を５ｇ経口摂取し、投与後３時間の血圧を測定した結果、通常１８０−２００ｍｍｇの最高血圧が１３２−１３６ｍｍｇとなり、燕麦グロブリンタンパク質画分に有意（ｐ＜０．０５）に血圧を低下させる効果があることが認められた。
[Antihypertensive effect of oat protein fraction in vivo]
Under the guidance of two doctors from the University of British Columbia School of Medicine, the antihypertensive effect of the oat globulin protein fraction obtained in Example 1 on an 80-year-old male hypertension patient (body weight 67 kg) was tested. As a result, 5 g of the oat globulin protein fraction was orally ingested, and the blood pressure was measured for 3 hours after administration. 05) was found to have an effect of lowering blood pressure.
［食品衛生学的安全性試験結果］
実施例２で得られたペプチド画分の食品衛生学的な安全性を評価するために、微生物を用いた変異原性試験とマウスを用いた動物実験を行なった。変異原性試験としては、エイムズテスト及びレックアッセイを行なった。エイムズテストは、プレインキュベーション法によって行なった。すなわち、１％検液０．１ｍＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬ、及び塩基対置換型突然変異株Salmonella typhimurium TA100（ｈｉｓＧ４６）あるいはフレームシフト型突然変異株S.typhimurim TA98（ｈｉｓＤ３０５２）の一夜培養液０．１ｍＬを順次滅菌試験管に加え、３７℃で２０分間振盪した後、これにトップアガー２．０ｍＬを加え混合後、最小グルコース寒天培地（Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ／ブドウ糖寒天培地）平板上に一様に広げ固化させ、３７℃で４８時間培養し、復帰突然変異によって出現したコロニー数をカウントすることによって行なった。出現したコロニー数が、陰性対象区と比較して２倍以下の場合に陰性と判断した。陽性対象区には２−（２−ｆｕｒｙｌ）−３−（５−ｎｉｔｒｏ−２−ｆｕｒｙｌ）ａｃｒｙ ｌａｍｉｄｅ（ＡＦ−２）を用いた。レックアッセイには、Bacillus subtilis H17株（Ｒｅｃ＋）及びB.subtilis M45株（Ｒｅｃ−）を用いた。一夜培養した供試菌液を白金耳を用いてトリプトン酵母エキス寒天平板上に中央で交わるように画線し、交点に滅菌濾紙を乗せ、試験液を１０−３０μＬ注入し、風乾後、３７℃で２４時間培養した。発育阻止帯の長さを測定し、Ｈ１７株とＭ４５株の発育阻止帯の長さの差が１．５ｍｍ以上あれば、陽性と判定した。標準変異原性物質にはＡＦ−２を用いた。動物実験は、ＯＥＣＤ化学物質毒性試験指針（１９８１）に準拠し、１０週齢のＩＣＲ系（Ｃｒｌｊ：ＣＤ１）雄マウスを用いて単純投与による急性毒性試験を行なった。１週間馴化後、投与前には４時間絶食させ、体重ｋｇあたり５ｇの試料をマウス用胃ゾンデによって強制単回投与（ｎ＝６）し、投与後、３日間引き続き飼育し、３日後に体重変化及び活動状況を観察した。対照区には生理的食塩水を用いた。その結果を表１に示す。
[Food hygiene safety test results]
In order to evaluate the food hygiene safety of the peptide fraction obtained in Example 2, mutagenicity tests using microorganisms and animal experiments using mice were performed. As the mutagenicity test, Ames test and Rec assay were performed. The Ames test was performed by the preincubation method. Namely, 0.1 mL of 1% test solution, 0.5 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4), and base pair substitution mutant Salmonella typhimurium TA100 (hisG46) or frameshift mutant S. typhimurim Add 0.1 mL of TA98 (hisD3052) overnight culture solution sequentially to a sterile test tube, shake for 20 minutes at 37 ° C., add 2.0 mL of top agar to this, mix, and then add minimal glucose agar medium (Vogel-Bonner / glucose). Agar medium) It was spread and solidified uniformly on a flat plate, cultured at 37 ° C. for 48 hours, and counted by counting the number of colonies that appeared by reverse mutation. When the number of appearing colonies was 2 times or less compared to the negative control group, it was judged as negative. 2- (2-furyl) -3- (5-nitro-2-furyl) acrylide (AF-2) was used as a positive target group. For the Rec assay, Bacillus subtilis H17 strain (Rec +) and B. subtilis M45 strain (Rec-) were used. The test bacterial solution cultured overnight is streaked so that it crosses the center on a tryptone yeast extract agar plate using a platinum loop, and a sterile filter paper is placed on the intersection, 10-30 μL of the test solution is injected, air-dried, and 37 ° C. For 24 hours. The length of the growth inhibitory zone was measured, and if the difference in the length of the growth inhibitory zone between the H17 strain and the M45 strain was 1.5 mm or more, it was determined as positive. AF-2 was used as a standard mutagenic substance. The animal experiment was conducted according to the OECD chemical substance toxicity test guideline (1981), and an acute toxicity test was conducted by simple administration using 10-week-old ICR strain (Crlj: CD1) male mice. After acclimation for 1 week, fast for 4 hours before administration, 5 g sample per kg of body weight was forcibly administered once by a gastric sonde for mice (n = 6), continued to be raised for 3 days after administration, and body weight was 3 days later Changes and activity status were observed. Physiological saline was used for the control group. The results are shown in Table 1.
表１に示すように、エイムズ法及びレックアッセイはいずれも陰性、マウスに対する急性毒性試験のＬＤ５０は、５ｇ／ｋｇ以上となり、いずれの試験においても供試ペプチドの食品衛生的な安全性が確認された。 As shown in Table 1, the Ames method and the REC assay are both negative, the LD50 of the acute toxicity test for mice is 5 g / kg or more, and the food hygiene safety of the test peptide is confirmed in both tests. It was.
［官能評価］
食品素材として用いるためには味が重要であることから、７名からなるパネリスト（男４名（平均年齢２２歳）、女３名（平均年齢２３歳））による官能検査を行なった。純水を用いて実施例２で得られたペプチド画分の１％水溶液を調整し、その甘味、塩味、苦味、酸味及び旨味についての評価を試みた。また、ペプチド画分を乳及び乳製品へ添加した際の色調、味、食感の変化に関する官能検査についても行なった。すなわち、市販の牛乳（乳脂肪分３．５％以上、乳固形分８．３％以上、１３０℃２秒間殺菌乳）及びプレーンヨーグルト（乳脂肪分３．０％、乳固形分９．５％、発酵乳）を購入し、１％濃度になるようにペプチド試料を添加し、よく混合したものを用いて、７名からなるパネリスト〔男４名（平均年齢２２歳），女３名（平均年齢２３歳）〕による官能検査を行なった。対照区には、ペプチド試料未添加のものを用い、両者間の評価結果に有意差があるか否かについて調べた。その結果、供試ペプチドの１％水溶液の甘味、塩味、苦味、酸味及び旨みについて２点嗜好評価法（二項検定）により調べたところ、純水との間に有意な差（ｐ＜０．０５）は認められなかった。そこで、ペプチド画分を用いた乳・乳製品プロトタイプの作製の可能性について検討した。すなわち、市販の牛乳及びプレーンヨーグルトに１％濃度になるように供試ペプチドを添加し、７名のパネリストによる評価を試みたところ、供試ペプチド添加のものと無添加のものとの間には、色調、味、食感において有意差（ｐ＜０．０５）がないことが示された。
[sensory evaluation]
Since the taste is important for use as a food material, a sensory test was conducted by 7 panelists (4 men (average age 22 years), 3 women (average age 23 years)). A 1% aqueous solution of the peptide fraction obtained in Example 2 was prepared using pure water, and the sweetness, saltiness, bitterness, sourness and umami were evaluated. Moreover, the sensory test regarding the change of the color tone, taste, and food texture when the peptide fraction was added to milk and dairy products was also conducted. That is, commercially available milk (milk fat content 3.5% or more, milk solid content 8.3% or more, pasteurized milk at 130 ° C. for 2 seconds) and plain yogurt (milk fat content 3.0%, milk solid content 9.5% , Fermented milk), peptide samples added to a concentration of 1%, and well mixed, 7 panelists [4 males (average age 22 years), 3 females (average) Sensory test was carried out according to age 23). In the control group, a peptide sample not added was used, and it was examined whether there was a significant difference in the evaluation results between the two. As a result, the sweetness, saltiness, bitterness, sourness and umami of 1% aqueous solution of the test peptide were examined by a two-point preference evaluation method (binary test), and a significant difference (p <0. 05) was not recognized. Therefore, the possibility of producing a milk / dairy product prototype using peptide fractions was examined. That is, when a test peptide was added to commercially available milk and plain yogurt to a concentration of 1% and an evaluation by seven panelists was attempted, there was a difference between a test peptide added and a non-added test peptide. It was shown that there was no significant difference (p <0.05) in color tone, taste and texture.
Claims (13)
（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；
（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ； Angiotensin containing a buckwheat protein fraction characterized by comprising a powdered buckwheat defatting step for subjecting the pulverized buckwheat to a defatting treatment using an organic solvent, and a protein fractionation step of (a) or (b) below: A method for producing a converting enzyme (ACE) inhibitor composition.
(A) a protein fractionation step in which defatted oat powder is treated with amylase and then ethanol is added to precipitate the protein fraction;
(B) a protein fractionation step in which an alkaline salt or alkaline earth salt solution is added to the defatted oat powder and homogenized, and the elution fraction is subjected to a desalting treatment;
（ａ）脱脂燕麦粉末をアミラーゼ処理した後、エタノールを加えてタンパク質画分を沈降させるタンパク質分画ステップ；
（ｂ）脱脂燕麦粉末にアルカリ塩又はアルカリ土類塩溶液を加えてホモゲナイズし、溶出画分に脱塩処理を施すタンパク質分画ステップ； The powdered buckwheat degreasing step in which the ground buckwheat is degreased using an organic solvent, the following (a) or (b) protein fractionation step, and the buckwheat protein fraction is decomposed with pepsin and trypsin, and VIEPQGL , NIVQMSATR, VQVVNNNGQTVF, an angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor composition comprising a peptide fraction derived from oat protein, comprising a step of proteolysis of oat protein to obtain a peptide fraction comprising peptides having amino acid sequences of IVPQHF Manufacturing method.
(A) a protein fractionation step in which defatted oat powder is treated with amylase and then ethanol is added to precipitate the protein fraction;
(B) a protein fractionation step in which an alkaline salt or alkaline earth salt solution is added to the defatted oat powder and homogenized, and the elution fraction is subjected to a desalting treatment;
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