JP2009067678A - Antibody against connective tissue growth factor or composition containing the same - Google Patents

Antibody against connective tissue growth factor or composition containing the same Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an antibody having an ability for specifically recognizing a connective tissue growth factor (CTGF) and for inhibiting a biological activity thereof. <P>SOLUTION: The antibody can specifically recognize CTGF, especially a high-order structure of the natural type of CTGF, and is prepared by the immunization of DNA, including immunizing a non-human animal with an expression vector containing a DNA encoding CTGF or its functional fragment in an expressible state. The antibody is usable as a composition for treating, preventing or diagnosing diseases relating to the antibody, such as fibrosis or cell proliferative diseases. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、結合組織増殖因子（Connective Tissue Growth Factor; CTGF）を特異的に認識することができる抗体に関する。   The present invention relates to an antibody capable of specifically recognizing connective tissue growth factor (CTGF).

本発明はまた、上記抗体の作製方法、並びに、上記抗体を含む医薬組成物又は診断用組成物に関する。   The present invention also relates to a method for producing the antibody, and a pharmaceutical composition or diagnostic composition containing the antibody.

ヒトCTGFは、322アミノ酸（但し、シグナルペプチドを含むとき349アミノ酸）からなる、39個のシステイン残基を有する結合組織増殖因子であり、そのアミノ酸及び塩基配列は1991年以来知られている(非特許文献１〜２)。このタンパク質は創傷治癒作用があることが知られる一方、細胞増殖性疾患、線維性疾患、アテローム性硬化症、緑内障などの疾患や障害に関係することが知られている（特許文献1〜７、非特許文献２〜４）。このような疾患や障害の治療又は診断のために、ヒトCTGFに対する抗体の使用が提案されている（特許文献１〜７、非特許文献４）。   Human CTGF is a connective tissue growth factor with 39 cysteine residues consisting of 322 amino acids (but 349 amino acids when including a signal peptide), and its amino acid and base sequence have been known since 1991 (non- Patent Documents 1-2). While this protein is known to have a wound healing action, it is known to be related to diseases and disorders such as cell proliferative diseases, fibrotic diseases, atherosclerosis, glaucoma (Patent Documents 1 to 7, Non-patent documents 2 to 4). For the treatment or diagnosis of such diseases and disorders, the use of antibodies against human CTGF has been proposed (Patent Documents 1 to 7, Non-Patent Document 4).

一般に、抗体の作製のために、タンパク質またはペプチドを抗原として動物に免疫し抗体を作製する方法が使用される。In vivoでの抗体産生は、免疫される動物が、その抗原を異物として認識することによって、抗原提示細胞に抗原を提示し、T細胞にシグナル伝達されこれを活性化し、活性化されたT細胞はさらにB細胞を刺激し、抗体産生細胞へと導くことによって行われる。   In general, a method of producing an antibody by immunizing an animal with a protein or peptide as an antigen is used to produce the antibody. In vivo antibody production is achieved by the immunized animal recognizing the antigen as a foreign substance, presenting the antigen to the antigen-presenting cell, signaling it to the T cell, and activating it. Is further performed by stimulating B cells and directing them to antibody producing cells.

しかし、ヒトCTGFを抗原として動物に直接免疫する従来の抗体産生法で抗体を作製する試みは、本発明者らの経験では、多くの場合、失敗するか、或いは非常に抗体価の低いものであった。これは、例えばヒトCTGFを哺乳動物でけでなくニワトリに免疫した場合にも同様に認められた。その原因は明らかではないが、CTGFは本来粘着性の強い蛋白であるため、種々の表面に付着し、その結果十分な免疫化が行われなかったことが原因の１つとして推定される。   However, attempts by the present inventors to produce antibodies using conventional antibody production methods that directly immunize animals with human CTGF as an antigen have often failed or have very low antibody titers. there were. This was also observed when, for example, human CTGF was immunized not only in mammals but also in chickens. The cause is not clear, but CTGF is inherently a strong protein, so it is presumed that it adhered to various surfaces and as a result, sufficient immunization was not performed.

ヒトCTGFはまた、この蛋白が固有にもつ特殊な構造、すなわち39個のシステイン残基を有し、少なくとも５個のジスルフィド結合が存在する構造のために、分子内ジスルフィド結合の組み換えを起こしやすい特性を抱えている。そのため、この蛋白が非天然環境（例えば精製環境）に晒されたときには、そのような組み換えを起こし、それによって蛋白本来の高次構造が変化し、その結果、蛋白の変性が生じることが推定される。このような特殊な構造特性のために、ヒトCTGFの天然型高次構造を特異的に認識する抗体を得ることを可能にすることも、今後の課題の１つである。   Human CTGF also has the unique structure inherent to this protein, that is, it has 39 cysteine residues and has at least 5 disulfide bonds, making it susceptible to recombination of intramolecular disulfide bonds. Have Therefore, when this protein is exposed to a non-natural environment (for example, a purification environment), it is presumed that such recombination occurs, thereby changing the protein's original higher-order structure, resulting in protein denaturation. The One of the future tasks is to make it possible to obtain an antibody that specifically recognizes the natural higher-order structure of human CTGF due to such special structural characteristics.

ヒトCTGFに対する抗体に関する上記のような特許文献や刊行物は存在するが、大量に該抗体を作製するための方法は皆無であるし、また、その天然型高次構造を特異的に認識する抗体を実際に得ることが難しいため、それが望まれているにも拘らず実用的な抗体は未だ出現していないのが現状である。   Although there are patent documents and publications related to antibodies against human CTGF as described above, there is no method for producing such antibodies in large quantities, and antibodies that specifically recognize their natural higher-order structures. Since it is difficult to actually obtain the antibody, no practical antibody has yet appeared even though it is desired.

本願ではDNA免疫法（又は遺伝子免疫法）を利用して抗体を作製する方法を提供するが、DNA免疫法については、例えば特許文献８、非特許文献５〜８などに記載されている。DNA免疫法は、in vivoで、ある種の抗原に対する抗体が産生するように、該抗原をコードするDNAをベクターに発現可能に挿入し、このベクターをヒトなどの動物に接種する、いわゆる遺伝子ワクチン接種を指す。そのような抗原には、例えばウイルス抗原、腫瘍関連抗原、原虫抗原、微生物抗原が含まれる。接種後、DNAが発現され、抗原が生成し、生体内の免疫系に取り込まれて抗体が生じる。   In the present application, a method for producing an antibody using a DNA immunization method (or gene immunization method) is provided. The DNA immunization method is described in, for example, Patent Document 8 and Non-Patent Documents 5-8. The DNA immunization method is a so-called genetic vaccine in which a DNA encoding an antigen is inserted into a vector so that an antibody against a certain antigen is produced in vivo, and the vector is inoculated into an animal such as a human. Refers to inoculation. Such antigens include, for example, viral antigens, tumor associated antigens, protozoan antigens, microbial antigens. After inoculation, DNA is expressed, antigens are generated, and taken up into the in vivo immune system to produce antibodies.

DNA免疫の応用として、非特許文献９は、DNA免疫法を利用したポリクローナル抗体の作製を記載している。この方法は、抗原蛋白のN末端側に分泌リーダーと抗原性タグを連結したような融合蛋白をコードするDNAを発現可能にベクターに組込み、そのベクターにて動物を免疫することを含む。抗原性タグはアジュバントのような役割をもち、in vivoではタグに対する抗体も生成する。
特表平11-507332号公報 特開平11-180895号公報 特開2004-132974号公報 特表2002-529066号公報 特表2002-504332号公報 特表2005-505757号公報 特表2002-524422号公報 特表2000-582427号公報 D.M. Bradhamら, J. Cell Biol. 114:1285-1294 (1991) A. Igarashiら, Mol. Biol. Cell 4:637-645 (1993) M. Minatoら, J. Biochem. 135:347-354 (2004) T. Moriら, J. Cellular Physiology 181:153-159 (1999) J.S. Boyleら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:14626-14631 (1997) S. Gurunathanら, Annu. Rev. Immunol.18:927-974 (2000) D.C. Tangら, Nature 356:152-154 (1992) H. Tigheら, Immunol. Today 19:89-97(1998) R.S. Chambers及びS.A. Johnston, Nature Biotechnology 21(9):1088-1092 (2003) As an application of DNA immunization, Non-Patent Document 9 describes the production of polyclonal antibodies using DNA immunization. This method includes incorporating a DNA encoding a fusion protein such as a secretory leader and an antigenic tag linked to the N-terminal side of the antigen protein into a vector so as to allow expression, and immunizing the animal with the vector. Antigenic tags act like adjuvants and generate antibodies against the tags in vivo.
Japanese National Patent Publication No. 11-507332 Japanese Patent Laid-Open No. 11-180895 JP 2004-132974 A Special table 2002-529066 gazette Special Table 2002-504332 Special Table 2005-505757 Special Table 2002-524422 Special Table 2000-582427 DM Bradham et al., J. Cell Biol. 114: 1285-1294 (1991) A. Igarashi et al., Mol. Biol. Cell 4: 637-645 (1993) M. Minato et al., J. Biochem. 135: 347-354 (2004) T. Mori et al., J. Cellular Physiology 181: 153-159 (1999) JS Boyle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 14626-14631 (1997) S. Gurunathan et al., Annu. Rev. Immunol. 18: 927-974 (2000) DC Tang et al., Nature 356: 152-154 (1992) H. Tighe et al., Immunol. Today 19: 89-97 (1998) RS Chambers and SA Johnston, Nature Biotechnology 21 (9): 1088-1092 (2003)

ヒトCTGFは、CCNファミリーに属し、４つのモジュールにより形成されている増殖因子の一つとして多彩な生体機能をもつことが知られている。特に、CTGFは皮膚線維症などの線維症における前硬化性分子として注目されており、特異抗体の開発はこの分子の発現と病態進行との関係を調べる研究および線維症をはじめとするCTGF過剰生産と関連した疾病に対する分子標的治療法開発にとって重要な鍵になると考えられる。しかし、活性を保持した抗原タンパク質を確保する目的で該分子を組換えタンパク質として大量に生産および精製することは難しいうえに、CTGF分子に対して従来の抗体作製法で抗体を作製することは非常に難しかった。実際、市販のCTGF抗体は存在するが、特異性が低いため使用に適さない。   Human CTGF belongs to the CCN family and is known to have various biological functions as one of growth factors formed by four modules. In particular, CTGF is attracting attention as a pre-curing molecule in fibrosis such as dermal fibrosis, and the development of specific antibodies is a study to investigate the relationship between the expression of this molecule and the progression of disease state, and overproduction of CTGF including fibrosis It is considered to be an important key for the development of molecular targeted therapy for diseases related to the disease. However, it is difficult to produce and purify the molecule as a recombinant protein in large quantities for the purpose of securing an antigenic protein that retains its activity, and it is extremely difficult to produce antibodies against CTGF molecules by conventional antibody production methods. It was difficult. In fact, commercially available CTGF antibodies exist but are not suitable for use due to their low specificity.

このような状況において、本発明の目的は、天然型CTGFを特異的に認識することができる抗体を提供することである。   Under such circumstances, an object of the present invention is to provide an antibody capable of specifically recognizing natural CTGF.

本発明の別の目的は、上記抗体を含む医薬組成物又は診断用組成物を提供することである。   Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition or a diagnostic composition comprising the antibody.

本発明のさらに別の目的は、上記抗体の作製方法を提供することである。   Still another object of the present invention is to provide a method for producing the above antibody.

本発明者らは、当初、ヒトCTGFをコードするDNAを組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を用いて発現し、アフィニティカラムによって精製した組換えヒトCTGFを作製し、この組換え蛋白を抗原としてマウス及びニワトリに免疫したが、期待された抗体は産生されなかった。もとより天然型高次構造を保持した該蛋白を認識する抗体を得るために、次にDNA免疫によるマウスでの抗体作製を試みたが、フローサイトメトリーによるマウスの抗血清解析の結果、抗体価が低いことが確認された。   The present inventors initially produced recombinant human CTGF that was expressed using insect cells infected with recombinant baculovirus, and that expressed DNA encoding human CTGF, and purified using an affinity column. Mice and chickens were immunized but the expected antibody was not produced. In order to obtain an antibody that recognizes the protein having the natural higher-order structure, the antibody production in mice was next attempted by DNA immunization. As a result of antiserum analysis of the mice by flow cytometry, the antibody titer was It was confirmed to be low.

本発明者らはさらに、DNA免疫法において免疫増強シグナルペプチドをコードするDNAを発現ベクターに挿入し、免疫による抗体価上昇を調べた。しかしながら、顕著なCTGF抗体価上昇は認められなかった。その原因として、発現産物であるCTGF抗原濃度が非常に低濃度であったため、免疫系の誘起に十分でないことが予想された。CTGFは粘着性の高い蛋白であり、このような特性が影響したかもしれない。そこで、細胞表面に一定時間高濃度でCTGFを留まらせることを考え、免疫増強シグナルの直前に局在シグナルをコードするDNAを付加したプラスミドを作製し、同様に免疫したところ、CTGF抗体価が顕著に上昇し、実用的なCTGF抗体の作製に成功するとともに、従来にないほどに高親和性で天然型ヒトCTGF構造を特異的に認識する抗体を提供することを可能にした。ヒトCTGFは、構造的にも、また高粘着性という性質の点でも、特異な特性をもつ蛋白である。これまで、CTGFに対する抗体が市販されているが、使用に耐えないほどに特異性の低い抗体である。また、CTGFは、その特異な性質のために、抗体が極めて得られ難いという特性を有しているため、従来特許文献や刊行物等で開示される方法では、抗体が得られないか、或いは非常に低い抗体価で実用性のない抗体が得られるだけであった。これに対して、本発明の方法は、再現よくかつ特異的なヒトCTGF抗体を作製することを可能にする。このような方法は、これまで当業者が想到しえなかったものであり、実用的レベルで生産を可能にし、かつ天然型ヒトCTGFを特異的に認識する抗体を供給可能にしたことは、CTGFに関して画期的なことである。   Furthermore, the present inventors inserted DNA encoding an immunopotentiating signal peptide into an expression vector in the DNA immunization method, and examined the increase in antibody titer due to immunization. However, no significant increase in CTGF antibody titer was observed. The cause was expected to be insufficient for the induction of the immune system because the CTGF antigen concentration as an expression product was very low. CTGF is a highly sticky protein, and these characteristics may have influenced it. Therefore, considering that CTGF stays on the cell surface at a high concentration for a certain period of time, a plasmid with a DNA encoding a localization signal added just before the immune enhancement signal was prepared and immunized in the same way. In addition to succeeding in producing a practical CTGF antibody, it has become possible to provide an antibody that specifically recognizes the natural human CTGF structure with a higher affinity than ever before. Human CTGF is a protein with unique properties both in terms of structure and high adhesiveness. Until now, antibodies against CTGF have been commercially available, but they are antibodies that are so low in specificity that they cannot be used. In addition, because of its unique properties, CTGF has the property that antibodies are extremely difficult to obtain, so that the methods disclosed in conventional patent documents and publications do not yield antibodies, or Only a very low antibody titer and an impractical antibody were obtained. In contrast, the method of the present invention makes it possible to produce human CTGF antibodies that are reproducible and specific. Such a method has not been conceived by those skilled in the art until now, and it has become possible to produce antibodies at a practical level and to supply antibodies that specifically recognize natural human CTGF. Is groundbreaking.

したがって、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
本発明は、第１の態様において、結合組織増殖因子（CTGF）を特異的に認識することができる、DNA免疫によって作製された抗体又はその断片を提供する。 Therefore, in summary, the present invention has the following features.
In the first aspect, the present invention provides an antibody produced by DNA immunization or a fragment thereof capable of specifically recognizing connective tissue growth factor (CTGF).

その一の実施態様において、上記CTGFがヒトCTGFである。
その別の実施形態において、本発明の抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である。 In one embodiment thereof, the CTGF is human CTGF.
In another embodiment thereof, the antibody of the present invention is a human antibody or a humanized antibody.

本明細書中、ヒト抗体は、完全ヒト型抗体を指し、ヒト抗体遺伝子が産生する抗体と同一の抗体である。また、ヒト化抗体は、ヒト抗体の一部と他の動物の抗体の一部とに由来するキメラ抗体であり、例えばヒト抗体のうち超可変領域のCDRの一部又は全部が、非ヒト動物（例えばマウス）の対応物と置換されたような抗体である。   In this specification, a human antibody refers to a fully human antibody and is the same antibody as the antibody produced by a human antibody gene. The humanized antibody is a chimeric antibody derived from a part of a human antibody and a part of an antibody of another animal. For example, a part or all of the CDR of the hypervariable region of a human antibody is a non-human animal. An antibody that is substituted for its counterpart (eg mouse).

その別の実施形態において、上記DNA免疫が、上記CTGFをコードするDNA又はその機能性断片を発現可能に含む発現ベクターを非ヒト動物に免疫することを含むものである。   In another embodiment thereof, the DNA immunization includes immunizing a non-human animal with an expression vector that can express the DNA encoding the CTGF or a functional fragment thereof.

上記ベクターは、分泌シグナルペプチドをコードするDNAをさらに含むことができる。
上記ベクターは、局在シグナル及び免疫増強シグナルを含むペプチドをコードするDNAをさらに含むことができる。 The vector can further include DNA encoding a secretory signal peptide.
The vector can further include DNA encoding a peptide that includes a localization signal and an immune enhancement signal.

好ましくは、上記ベクターは、分泌シグナルペプチド、局在シグナルペプチド、免疫増強シグナルペプチド、CTGFタンパク質の各々をコードするDNAを、５'末端側からこの順序で含む。   Preferably, the vector contains a DNA encoding each of a secretion signal peptide, a localization signal peptide, an immune enhancement signal peptide, and a CTGF protein in this order from the 5 ′ end side.

本明細書中で使用される分泌シグナルペプチドは、細胞内で発現、翻訳されたCTGFを細胞膜に輸送する働きのあるペプチドであって、シグナルペプチダーゼによるプロセシングによって切断されるペプチドである。このとき、CTGFは細胞外に分泌される。好ましいペプチドは、CTGFのシグナルペプチドである。   As used herein, a secretory signal peptide is a peptide that functions to transport CTGF expressed and translated in cells to the cell membrane, and is a peptide that is cleaved by processing with a signal peptidase. At this time, CTGF is secreted extracellularly. A preferred peptide is the CTGF signal peptide.

本明細書中で使用される局在シグナルペプチドは、細胞内で発現、翻訳されたCTGFを細胞膜に移行し、かつ分泌されたCTGFを細胞膜上にアンカーする働きを有する任意のペプチドである。   As used herein, a localized signal peptide is any peptide having a function of transferring CTGF expressed and translated in cells to the cell membrane and anchoring secreted CTGF on the cell membrane.

本明細書中で使用される免疫増強シグナルペプチドは、CTGFの免疫原活性又は抗原活性を高めるための任意のペプチドである。   As used herein, an immunoenhancing signal peptide is any peptide that enhances the immunogenic or antigenic activity of CTGF.

本発明において、上記機能性断片の例は、CTGFのモジュールである。ここで、モジュールとは、CTGF蛋白において、機能、働き又は作用をもつ構成要素を指す。そのようなモジュールの例は、インスリン様成長因子結合要素、フォンヴィルブラントC型要素、トロンボスポンジン1型リピート要素、Ｃ末端システインノット要素、ヘパリン結合要素、などである。具体的には、図１に示されるような、ヒトCTGFのモジュール１、モジュール２、モジュール３又はモジュール４をを含む。   In the present invention, an example of the functional fragment is a CTGF module. Here, the module refers to a component having a function, function or action in CTGF protein. Examples of such modules are insulin-like growth factor binding elements, von Willebrand C type elements, thrombospondin type 1 repeat elements, C-terminal cysteine knot elements, heparin binding elements, and the like. Specifically, it includes module 1, module 2, module 3 or module 4 of human CTGF as shown in FIG.

本明細書中で使用されるDNAという用語には、cDNA及びゲノムDNAの両方が含まれる。cDNAは、動物の組織又は細胞内のmRNAからcDNAクローニングによって合成されうる。   As used herein, the term DNA includes both cDNA and genomic DNA. cDNA can be synthesized by cDNA cloning from mRNA in animal tissues or cells.

その別の実施形態において、上記全長ヒトCTGFをコードするDNA又はその機能性断片が、配列番号２、４、６、８又は10によって示される塩基配列を含むものである。
その別の実施形態において、上記動物が哺乳動物である。
その別の実施形態において、上記哺乳動物がマウスである。 In another embodiment thereof, the DNA encoding the full-length human CTGF or a functional fragment thereof comprises a base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10.
In another embodiment thereof, the animal is a mammal.
In another embodiment thereof, the mammal is a mouse.

好ましくは、上記マウスはヒト抗体産生トランスジェニックマウスである。このマウスは、ヒト人工染色体を用いる遺伝子組換え技術によってマウス染色体上のマウス抗体遺伝子に代えてヒト抗体遺伝子が導入され、これによって完全ヒト抗体を産生することが可能なトランスジェニックマウスである。   Preferably, the mouse is a human antibody-producing transgenic mouse. This mouse is a transgenic mouse in which a human antibody gene is introduced in place of the mouse antibody gene on the mouse chromosome by a gene recombination technique using a human artificial chromosome, whereby a fully human antibody can be produced.

その別の実施形態において、本発明の抗体が上記CTGF分子の天然型高次構造を特異的に認識することができる。   In another embodiment thereof, the antibody of the present invention can specifically recognize the natural conformation of the CTGF molecule.

本明細書中、CTGFの天然型高次構造は、そのアミノ酸配列中のリッチなシステイン残基間で形成される天然位置でのジスルフィド結合によって形成されるCTGFが生体内で採るネイティブな高次構造（コンフォメーションとも称する）を意味する。   In this specification, the natural higher-order structure of CTGF is the native higher-order structure taken in vivo by CTGF formed by disulfide bonds at natural positions formed between rich cysteine residues in the amino acid sequence. (Also referred to as conformation).

また、本明細書中、CTGFの天然型高次構造を特異的に認識するとは、本発明の抗体が、天然型高次構造をもつCTGFの連続的又は不連続的な表面抗原エピトープを、天然CTGFの精製又は遺伝子組換えの際に分子内ジスルフィド結合組換えによる構造的変性が生じたような変性型CTGFの表面抗原エピトープと比べて、より良く認識することを意味する。ここで、特異的とは、天然型高次構造をもつCTGFを認識するが上記変性型CTGFを認識しないか、或いは上記変性型CTGFよりも天然型高次構造をもつCTGFを相対的に認識しやすいことを意味する。このように相対的に高い認識度（又は免疫学的反応性）、言い換えれば10倍以上、好ましくは100倍以上、さらに好ましくは1,000倍以上高い結合能を、本明細書中では、特異的に認識するという。   Further, in the present specification, the specific recognition of CTGF's natural conformation means that the antibody of the present invention represents a continuous or discontinuous surface antigen epitope of CTGF having a natural conformation. It means better recognition compared to the surface antigen epitope of denatured CTGF that has undergone structural modification by intramolecular disulfide bond recombination during the purification or gene recombination of CTGF. Here, specific means that CTGF having a natural higher-order structure is recognized but the above-mentioned modified CTGF is not recognized, or CTGF having a natural higher-order structure is relatively recognized than the above-mentioned modified CTGF. Means easy. Such a relatively high recognition degree (or immunological reactivity), in other words, a binding ability that is 10 times or more, preferably 100 times or more, more preferably 1,000 times or more is specifically mentioned in the present specification. Recognize.

本明細書中、DNA免疫は、CTGFをコードするDNA又はその機能性断片を発現可能に組み込んだ発現ベクターを非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、の皮下に注入し、細胞内で発現し分泌された該タンパク質の異種性のために、動物内でそのタンパク質に対する抗体が産生することを含む一連の手法を意味する。   In the present specification, DNA immunity is expressed and secreted intracellularly by injecting an expression vector incorporating a CTGF-encoding DNA or a functional fragment thereof into a non-human animal, preferably a mammal, subcutaneously. Furthermore, due to the heterogeneity of the protein, it means a series of procedures including the production of antibodies against the protein in animals.

本発明の抗体は、タンパク質性又はペプチド性抗原を動物の皮下に直接注入する従来の抗体作製法ではなく上記のDNA免疫法を使用することによって得ることができるという知見は、本発明の特徴の１つでもあり、本願出願前、当業者が全く予想していなかったことである。   The finding that the antibody of the present invention can be obtained by using the above-described DNA immunization method rather than the conventional antibody production method in which a proteinaceous or peptide antigen is directly injected subcutaneously into an animal is the feature of the present invention. It is also one, which was not anticipated by those skilled in the art before filing this application.

本明細書中、発現可能にとは、調節配列の制御下で、上記CTGFをコードするDNA又はその機能性断片が発現されて、対応するタンパク質又はペプチドがin vivoで生成することを意味する。   In the present specification, “expressible” means that the DNA encoding CTGF or a functional fragment thereof is expressed under the control of a regulatory sequence, and a corresponding protein or peptide is generated in vivo.

その別の実施形態において、本発明の抗体は、上記ヒトCTGFのモジュール１、モジュール２、モジュール３又はモジュール４のいずれか１つを特異的に認識することができる。   In another embodiment thereof, the antibody of the present invention can specifically recognize any one of the module 1, module 2, module 3 or module 4 of the human CTGF.

その別の実施形態において、本発明の抗体が、前記CTGFに対する結合定数(KA)3.0×107M-1以上及び/又は解離定数(KD)5.6×10-9M以下を有するものである。 In another embodiment thereof, the antibody of the present invention has a binding constant (KA) for CTGF of 3.0 × 10 7 M −1 or more and / or a dissociation constant (KD) of 5.6 × 10 −9 M or less.

従来の免疫法によって作製された（ポリクローナル又はモノクローナル）抗体の天然型ヒトCTGFに対する結合定数はこれまで具体的に報告されていないが、そのような抗体がヒトCTGFと交差反応しにくく低親和性であることが知られている（例えばJ. Biochem, 2004, 135:347-354）。本発明の抗体はいずれも、従来の免疫法によって作製された抗体と比べてより高いヒトCTGFに対する結合定数、或いはより低い解離定数、をもつことによって特徴付けられる。   The binding constants of antibodies produced by conventional immunization methods (polyclonal or monoclonal) to native human CTGF have not been specifically reported so far, but such antibodies are difficult to cross-react with human CTGF and have low affinity. It is known (eg J. Biochem, 2004, 135: 347-354). All of the antibodies of the invention are characterized by having a higher binding constant for human CTGF or a lower dissociation constant than antibodies produced by conventional immunization methods.

本発明はまた、第２の態様において、上で説明したような本発明の抗体又はその断片を含む医薬組成物を提供する。   The present invention also provides, in a second aspect, a pharmaceutical composition comprising an antibody of the present invention or a fragment thereof as described above.

その一の実施形態において、本発明の抗体がモノクローナル抗体である。
その別の実施形態において、本発明の抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である。
その別の実施形態において、本発明の抗体が治療用薬剤と結合されている。 In one embodiment thereof, the antibody of the present invention is a monoclonal antibody.
In another embodiment thereof, the antibody of the present invention is a human antibody or a humanized antibody.
In another embodiment thereof, the antibody of the invention is conjugated to a therapeutic agent.

このような抗体と治療用薬剤とのコンジュゲートは、いわゆる分子標的を目的とした医薬である。本発明の抗体と治療用薬剤は、該抗体によって疾患標的部位に輸送され、CTGFが関係する疾患の治療又は予防のために作用することができる。   Such a conjugate of an antibody and a therapeutic agent is a medicine intended for so-called molecular targeting. The antibody and therapeutic agent of the present invention are transported to a disease target site by the antibody and can act for the treatment or prevention of diseases related to CTGF.

そのような疾患の例には、線維症又は線維化に伴う硬化症、或いは細胞増殖性疾患がある。具体的には、上記線維症又は線維化に伴う硬化症は、例えば腎線維症、肺線維症、肝線維症、又は強皮症（又は皮膚線維症）を含む。また、上記細胞増殖性疾患は、例えば癌である。   Examples of such diseases include fibrosis or sclerosis associated with fibrosis, or cell proliferative diseases. Specifically, the sclerosis associated with fibrosis or fibrosis includes, for example, renal fibrosis, pulmonary fibrosis, liver fibrosis, or scleroderma (or dermal fibrosis). The cell proliferative disease is, for example, cancer.

本発明はさらに、第３の態様において、上で説明したような本発明の抗体又はその断片を含む診断用組成物を提供する。   In the third aspect, the present invention further provides a diagnostic composition comprising the antibody of the present invention or a fragment thereof as described above.

その一の実施形態において、本発明の抗体がモノクローナル抗体である。
その別の実施形態において、本発明の組成物は線維症又は線維化に伴う硬化症、或いは細胞増殖性疾患の診断のために使用される。 In one embodiment thereof, the antibody of the present invention is a monoclonal antibody.
In another embodiment thereof, the composition of the present invention is used for diagnosis of fibrosis or sclerosis associated with fibrosis, or cell proliferative disease.

上記線維症又は線維化に伴う硬化症は、例えば腎線維症、肺線維症、肝線維症又は強皮症（又は皮膚線維症）である。また、上記細胞増殖性疾患が癌である。   The fibrosis associated with fibrosis or fibrosis is, for example, renal fibrosis, pulmonary fibrosis, liver fibrosis or scleroderma (or dermal fibrosis). The cell proliferative disease is cancer.

その別の実施形態において、本発明の抗体が、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11(FERM ABP-10454)、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12(FERM ABP-10455) 又はMouse-Mouse hybridoma CTGF-m21(FERM ABP-10456)のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体である。   In another embodiment thereof, the antibody of the present invention is mouse-mouse hybridoma CTGF-m11 (FERM ABP-10454), mouse-mouse hybridoma CTGF-m12 (FERM ABP-10455) or mouse-mouse hybridoma CTGF-m21 (FERM ABP-10456) is a monoclonal antibody derived from a hybridoma.

本発明はさらに、第４の態様において、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11(FERM ABP-10454)ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を提供する。   In the fourth aspect, the present invention further provides a monoclonal antibody derived from a Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11 (FERM ABP-10454) hybridoma.

本発明はさらに、第５の態様において、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12(FERM ABP-10455)ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を提供する。   In the fifth aspect, the present invention further provides a monoclonal antibody derived from a Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12 (FERM ABP-10455) hybridoma.

本発明はさらに、第６の態様において、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m21(FERM ABP-10456)ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を提供する。   In the sixth aspect, the present invention further provides a monoclonal antibody derived from a Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m21 (FERM ABP-10456) hybridoma.

本発明はさらに、第７の態様において、CTGFをコードするDNA又はその機能性断片を発現可能に含む発現ベクターを非ヒト動物に免疫し、該CTGFを認識する抗体を含む体液、或いは該抗体を産生する細胞、を取り出し、該CTGFを認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体を得ることを含む、上記の本発明抗体の作製方法を提供する。   In the seventh aspect, the present invention further provides a method for immunizing a non-human animal with an expression vector containing a CTGF-encoding DNA or a functional fragment thereof so as to express the antibody and recognizing the CTGF, or the antibody. There is provided a method for producing the above-described antibody of the present invention, which comprises taking out a producing cell and obtaining a polyclonal or monoclonal antibody recognizing the CTGF.

その実施形態において、上記CTGFがヒトCTGFである。
その別の実施形態において、上記非ヒト哺乳動物がげっ歯類又は有蹄類である。
その別の実施形態において、上記げっ歯類がマウスである。
その別の実施形態において、上記マウスがヒト抗体産生トランスジェニックマウスである。 In that embodiment, the CTGF is human CTGF.
In another embodiment thereof, the non-human mammal is a rodent or ungulate.
In another embodiment thereof, the rodent is a mouse.
In another embodiment thereof, the mouse is a human antibody-producing transgenic mouse.

その別の実施形態において、上記ベクターが分泌シグナルペプチドをコードするDNAをさらに含むことができる。
その別の実施形態において、上記ベクターが局在シグナル及び免疫増強シグナルを含むペプチドをコードするDNAをさらに含むことができる。 In another embodiment thereof, the vector can further comprise DNA encoding a secretory signal peptide.
In another embodiment thereof, the vector can further comprise DNA encoding a peptide comprising a localization signal and an immune enhancement signal.

好ましくは、上記ベクターは、分泌シグナルペプチド、局在シグナルペプチド、免疫増強シグナルペプチド、CTGFタンパク質の各々をコードするDNAを、５'末端側からこの順序で含む。   Preferably, the vector contains a DNA encoding each of a secretion signal peptide, a localization signal peptide, an immune enhancement signal peptide, and a CTGF protein in this order from the 5 ′ end side.

その別の実施形態において、上記抗体を産生する細胞が脾臓細胞、Ｂ細胞又はリンパ細胞である。
その別の実施形態において、上記有蹄類がウシである。
その別の実施形態において、上記体液が血清又は乳汁である。 In another embodiment thereof, the cell producing the antibody is a spleen cell, B cell or lymphocyte.
In another embodiment thereof, the ungulate is a cow.
In another embodiment thereof, the body fluid is serum or milk.

その別の実施形態において、上記ポリクローナル又はモノクローナル抗体が、前記ヒトCTGFに対する結合定数(KA)3.0×107M-1以上及び/又は解離定数(KD)5.6×10-9M以下を有することによって特徴付けられる。 In another embodiment thereof, the polyclonal or monoclonal antibody has a binding constant (KA) of 3.0 × 10 7 M −1 or more and / or a dissociation constant (KD) of 5.6 × 10 −9 M or less for the human CTGF. Characterized.

また、上記機能性断片の例は、ヒトCTGFのモジュール１、モジュール２、モジュール３又はモジュール４をコードするDNAである。   An example of the functional fragment is DNA encoding module 1, module 2, module 3 or module 4 of human CTGF.

その別の実施形態において、本発明の方法は、上記抗体を産生する細胞或いは前記ハイブリドーマをフローサイトメトリーにて選抜することをさらに含む。   In another embodiment thereof, the method of the present invention further comprises selecting cells producing the antibody or the hybridoma by flow cytometry.

本発明により、抗原を動物に直接免疫する従来の抗体産生法によって得られた抗体と比較して、天然型高次構造を有するCTGFに対する結合親和性が顕著に高い及び該CTGFの生物活性を特異的かつ高度に阻害する抗体が提供される。このような抗体を見出したことは、当該分野の当業者にとって非常に驚くべきことである。本発明の抗体が、特にヒト抗体産生トランスジェニック動物においてin vivoで産生されるときは、ヒト抗体が得られ、これは、ヒトにおいてCTGFが関連する疾患、例えば線維症や細胞増殖性疾患、の有効な治療のために、拒絶反応なしに使用可能である。このように、本発明は、従来の抗体産生法で作製された抗体では十分な効果が期待できなかった上記のような新規な特性の抗体を提供しうる点で、上記疾患の治療、診断等のために産業上有益かつ有用である。   According to the present invention, compared with an antibody obtained by a conventional antibody production method for directly immunizing an animal with an antigen, the binding affinity to CTGF having a natural higher-order structure is remarkably high and the biological activity of the CTGF is specific. And highly inhibitory antibodies are provided. The discovery of such antibodies is very surprising to those skilled in the art. When the antibodies of the present invention are produced in vivo, particularly in human antibody-producing transgenic animals, human antibodies are obtained, which are related to CTGF-related diseases in humans, such as fibrosis and cell proliferative diseases. It can be used without rejection for effective treatment. As described above, the present invention can provide an antibody having the above-mentioned novel characteristics that could not be expected to have a sufficient effect with an antibody produced by a conventional antibody production method. Is industrially beneficial and useful for.

以下、本発明をさらに詳細に説明する。
CTGF
CTGFは、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシなどの哺乳動物、ニワトリなどの鳥類で同定されており、細胞から分泌され、その特異的細胞表面受容体と相互作用し、これによって、特に結合組織細胞の増殖及び細胞外マトリックスの合成に関与する活性をもつ増殖因子の１つである。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
CTGF
CTGF has been identified in mammals such as humans, mice, rats, pigs and cows, and birds such as chickens, and is secreted from cells and interacts with its specific cell surface receptors, thereby making connective tissue particularly It is one of the growth factors with activities involved in cell growth and extracellular matrix synthesis.

本発明において、CTGFは動物、特に脊椎動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒト由来のCTGFである。例えば哺乳動物由来のCTGFのアミノ酸及び塩基配列は、GenBankデータベース(NCBI)から入手可能である。例えばCTGF配列は、ヒトでは受託番号CAA63267, X92511, P29279, NM001554, NM001901；マウスではNP034347；ラットではNP071602, NM022266；ウシではNP776455, NM174030；ブタではAAD00174として登録されている。   In the present invention, CTGF is CTGF derived from animals, particularly vertebrates, preferably mammals, more preferably humans. For example, the amino acid and base sequence of CTGF derived from a mammal can be obtained from the GenBank database (NCBI). For example, the CTGF sequence is registered under the accession numbers CAA63267, X92511, P29279, NM001554, NM001901 in humans; NP034347 in mice; NP071602, NM022266 in rats; NP776455, NM174030 in cattle; AAD00174 in pigs.

ヒトCTGFは、322アミノ酸（但し、シグナルペプチドを含むとき349アミノ酸）からなる糖タンパク質であり、ヒト由来の糖鎖に加えて、39個のリッチなシステイン残基を有し、少なくとも５個のジスルフィド結合が存在することを特徴とする。また、図１に示すように、このタンパク質は、４つの機能性ドメイン、すなわちインスリン様成長因子結合タンパク質であるモジュール１、フォンヴィルブラントＣ型因子であるモジュール２、トロンボスポンジン１型リピートであるモジュール３、Ｃ末端システインノット様ドメイン(CTCK)であるモジュール４を含む。   Human CTGF is a glycoprotein consisting of 322 amino acids (349 amino acids when including a signal peptide), has 39 rich cysteine residues in addition to human-derived sugar chains, and at least 5 disulfides. It is characterized by the presence of bonds. In addition, as shown in FIG. 1, this protein is composed of four functional domains, namely module 1 which is an insulin-like growth factor binding protein, module 2 which is a von Willebrand type C factor, and thrombospondin type 1 repeat. Module 3 includes module 4, which is a C-terminal cysteine knot-like domain (CTCK).

ヒトCTGFのアミノ酸配列、並びにそれをコードする塩基配列は、後述の配列表に配列番号１及び配列番号２、配列番号11として示されている。また、モジュール１〜４のアミノ酸配列及びそれらをコードする塩基配列はそれぞれ、モジュール１について配列番号３及び４、モジュール２について配列番号５及び６、モジュール３について配列番号７及び８、モジュール４について配列番号９及び10に示されている。   The amino acid sequence of human CTGF and the base sequence encoding it are shown as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 11 in the sequence listing described below. The amino acid sequences of modules 1 to 4 and the base sequences encoding them are respectively SEQ ID NOs: 3 and 4 for module 1, SEQ ID NOs: 5 and 6 for module 2, SEQ ID NOS: 7 and 8 for module 3, and SEQ ID NO: 7 The numbers 9 and 10 are shown.

本発明では、CTGFの突然変異体、例えば多型性やスプライス変異などの変異のために個体内で生じる突然変異体が存在する場合、そのような突然変異体もCTGFと同様に本発明の対象となりうる。そのような突然変異体は、CTGF又は機能性断片（例えばモジュール、好ましくはヒトCTGFのモジュール１〜４）で示されるアミノ酸配列又は塩基配列において、１若しくは複数、例えば数個、のアミノ酸又はヌクレオチドの置換、欠失又は付加を含むことができる。ここで、数個とは２〜10個の整数を表す。或いは、そのような突然変異体は、上記アミノ酸配列又は塩基配列と80％以上、90％以上、95％以上、98％以上の同一性を有するものである。ここで、％同一性は、ギャップの導入を考慮しうるBLASTプログラムなどの公知のプログラムを用いて容易に決定できる(S. Karlinら, Proceedings of the Natinal Academic Sciences USA 90:5873-5877 (1993))。   In the present invention, when there is a mutant of CTGF, for example, a mutant that occurs within an individual due to a mutation such as a polymorphism or a splice mutation, such a mutant is also subject to the present invention in the same manner as CTGF. It can be. Such a mutant is composed of one or more, for example several amino acids or nucleotides in the amino acid sequence or base sequence shown by CTGF or a functional fragment (eg module, preferably modules 1-4 of human CTGF). Substitutions, deletions or additions can be included. Here, “several” represents 2 to 10 integers. Alternatively, such a mutant has 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more identity with the amino acid sequence or base sequence. Here,% identity can be readily determined using known programs such as the BLAST program that can take into account the introduction of gaps (S. Karlin et al., Proceedings of the Natinal Academic Sciences USA 90: 5873-5877 (1993)). ).

以下の説明では、CTGF及びその突然変異体を総称的にCTGFと称する。
DNA免疫法による抗体の産生
本発明の抗体の作製は、DNA免疫法を使用することによって達成される。
DNA免疫法では、ヒトなどの動物の組織又は細胞（例えば皮膚繊維芽細胞、内皮細胞）からCTGFタンパク質をコードするDNAをクローニングし、得られたcDNAを動物用発現ベクターに挿入し、このベクターを動物に免疫する。このとき、動物体内で該DNAの発現により得られたヒトCTGFに対する抗体が産生される。 In the following description, CTGF and its mutants are generically referred to as CTGF.
Production of antibodies by DNA immunization Production of the antibodies of the present invention is accomplished by using DNA immunization techniques.
In DNA immunization, DNA encoding CTGF protein is cloned from tissue or cells of animals such as humans (for example, skin fibroblasts, endothelial cells), and the resulting cDNA is inserted into an animal expression vector. Immunize animals. At this time, an antibody against human CTGF obtained by expression of the DNA in the animal is produced.

本発明は、DNA免疫法を使用することによって、CTGFがin vivoでネイティブな状態で産生され、それに対する抗体が産生されることを特徴とする。ネイティブな状態とは、CTGFの天然型高次構造（ジスルフィド結合、糖鎖など）を採ることを意味する。したがって、本発明で作製される抗体は、天然型CTGFに対する抗体である。好ましい抗体は、天然型ヒトCTGFに対する抗体である。   The present invention is characterized in that by using DNA immunization, CTGF is produced in a native state in vivo, and antibodies against it are produced. The native state means adopting the natural higher-order structure (disulfide bond, sugar chain, etc.) of CTGF. Therefore, the antibody produced in the present invention is an antibody against natural CTGF. A preferred antibody is an antibody against native human CTGF.

CTGFをコードするDNAのクローニングは、次のように行うことができる。
データバンク又は文献記載のCTGFのcDNA塩基配列に基づいて、その５'末端及び３'末端側の配列からなるプライマーを設計し合成する。プライマーは、通常、15〜25塩基程度のサイズを有しており、該CTGFのセンス鎖及びアンチセンス鎖に対してアニーリングすることができる２つのプライマーを用意する。プライマーの合成は、市販のDNA自動合成機を用いて行うことができる。 Cloning of DNA encoding CTGF can be performed as follows.
Based on the cDNA base sequence of CTGF described in the data bank or in the literature, a primer consisting of sequences at the 5 ′ end and 3 ′ end is designed and synthesized. The primer usually has a size of about 15 to 25 bases, and two primers are prepared that can be annealed to the sense strand and the antisense strand of the CTGF. Primer synthesis can be performed using a commercially available DNA automatic synthesizer.

ヒトなどの動物の組織又は細胞（例えば皮膚繊維芽細胞、内皮細胞）から全RNAをクロロホルム/フェノール法にて調製し、オリゴdTセルロースカラムクロマトグラフィー処理にてポリA(+)RNA(mRNA)を取得し、逆転写酵素の存在下でcDNA合成を行う。ｃDNA合成及びクローニングキットは例えばAmersham社、Invitrogen社などから市販されているので、これらのキットを利用すると便利である。このようにして合成されたcDNAを鋳型にし、上記のように作製されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、CTGFをコードするcDNAを増幅する。   Total RNA was prepared from animal tissues such as humans or cells (eg, skin fibroblasts, endothelial cells) by the chloroform / phenol method, and poly A (+) RNA (mRNA) was obtained by oligo dT cellulose column chromatography. Obtain and perform cDNA synthesis in the presence of reverse transcriptase. Since cDNA synthesis and cloning kits are commercially available from, for example, Amersham and Invitrogen, it is convenient to use these kits. The cDNA synthesized in this way is used as a template, and a polymerase chain reaction (PCR) is performed using the primers prepared as described above to amplify the cDNA encoding CTGF.

PCRは、市販のサーマルサイクラー（例えばPerkin Elmer-9600,Eppendorf-Master cycler gradientなど）を使用して実施するのがよい。PCR条件として、例えば10×PCR buffer （100mM Tris (pH 8.3),500mM KCl,15mM MgCl2及び0.1% (W/V)ゼラチン）、dNTPs 2mM、プラーマー2.5μM〜10μM中、Taqポリメラーゼなどの耐熱性DNAポリメラーゼ(1〜2.5単位；rTaq (Takara), Ampli Taq(Promega)など)を添加して反応を行う。PCRは、例えば95℃、２〜５分での1回の変性サイクルの後、95℃、0.2〜１分での変性、50〜65℃、0.5〜１分でのアニーリング、及び72℃、0.5〜２分での伸長を１サイクルとして15〜40サイクルを行い、最後に、72℃、５分の伸長を行うことを含む。 PCR is preferably performed using a commercially available thermal cycler (eg, Perkin Elmer-9600, Eppendorf-Master cycler gradient). As PCR conditions, for example, 10 × PCR buffer (100 mM Tris (pH 8.3), 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 and 0.1% (W / V) gelatin), dNTPs 2 mM, plumer 2.5 μM to 10 μM, heat resistance such as Taq polymerase DNA polymerase (1 to 2.5 units; rTaq (Takara), Ampli Taq (Promega), etc.) is added to carry out the reaction. PCR may be performed, for example, at 95 ° C, 2 to 5 minutes, followed by denaturation at 95 ° C, 0.2 to 1 minute, annealing at 50 to 65 ° C, 0.5 to 1 minute, and 72 ° C, 0.5 It includes 15 to 40 cycles, with extension at ˜2 minutes as one cycle, and finally extension at 72 ° C. for 5 minutes.

cDNAクローニング及びPCRについては、Sambrookら、Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory (1989)、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology (1989)などに記載されており参照可能である。   cDNA cloning and PCR are described in Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989), and can be referred to.

ある種のCTGFの機能性断片の配列は、すでに機能及び配列が公知のCTGFとの同一性の比較に基づいて決定しうる。比較は、上記のBLASTプログラムを使用して行うことができる。また、公知のCTGFの機能性断片は、例えばヒトCTGFのモジュール１〜４である。機能性断片をコードするDNAは、自動DNA合成機を用いて合成することができる。   The sequence of certain functional fragments of CTGF can be determined based on comparison of identity with CTGF whose function and sequence are already known. The comparison can be performed using the BLAST program described above. Known functional fragments of CTGF are, for example, human CTGF modules 1 to 4. DNA encoding the functional fragment can be synthesized using an automatic DNA synthesizer.

上記のようにして得られたCTGF又はその機能性断片（例えばヒトCTGFやそのモジュール1〜４）をコードするDNAは、次いで、発現ベクターに挿入される。   The DNA encoding CTGF obtained as described above or a functional fragment thereof (for example, human CTGF and its modules 1 to 4) is then inserted into an expression vector.

ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス、ファージなどの形態をとることができる。好ましいベクターは、動物細胞発現ベクター、例えば昆虫細胞発現ベクター又は哺乳動物細胞発現ベクター、好ましくは哺乳動物細胞発現ベクターである。ベクターは市販されており、本発明で使用できる。哺乳動物細胞発現ベクターの例は、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどのウイルスベクター、pcDNA3.1(Invitrogen)、pCI(Promega)などのプラスミドベクターなどである。   The vector can take the form of, for example, a plasmid, virus, phage or the like. Preferred vectors are animal cell expression vectors such as insect cell expression vectors or mammalian cell expression vectors, preferably mammalian cell expression vectors. Vectors are commercially available and can be used in the present invention. Examples of mammalian cell expression vectors include adenovirus vectors, viral vectors such as vaccinia virus vectors, plasmid vectors such as pcDNA3.1 (Invitrogen) and pCI (Promega).

発現ベクターは、プロモーター、エンハンサー、複製開始点、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、又はターミネーター、などの調節配列を含むことができる。宿主の細胞内でプロモーターにRNAポリメラーゼが結合することによって転写が開始され、目的のタンパク質又はペプチドに翻訳される。好ましいプロモーターの例は、ウイルスプロモーター、例えばCMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、EBV(Epstein-Barrウイルス)などである。   Expression vectors can contain regulatory sequences such as promoters, enhancers, origins of replication, ribosome binding sites, polyadenylation sites, or terminators. Transcription is initiated by the binding of RNA polymerase to the promoter in the host cell and translated into the target protein or peptide. Examples of preferred promoters are viral promoters such as CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, EBV (Epstein-Barr virus) and the like.

本発明において、上記ベクターには、局在シグナル及び免疫増強シグナルを含むペプチドをコードするDNAを含むことが好ましい。   In the present invention, the vector preferably contains DNA encoding a peptide containing a localization signal and an immune enhancement signal.

免疫増強シグナルは、上記定義のとおり、CTGFの免疫原活性又は抗原活性を高めるための任意のペプチドである。このようなぺプチドは、免疫アジュバント活性を有するペプチド、T細胞エピトープなどを含む。T細胞エピトープは、T細胞レセプターを認識し、これに結合することができるものである。免疫増強シグナルは、例えば種々のウイルス抗原、種々の細菌毒素などのエピトープ、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、オボアルブミン(OVA)、ウシ血清アルブミン(BSA)などのT細胞依存性抗原のエピトープなどを含む。   An immunopotentiating signal is any peptide that enhances the immunogenic or antigenic activity of CTGF, as defined above. Such peptides include peptides having immunoadjuvant activity, T cell epitopes, and the like. A T cell epitope is one that can recognize and bind to a T cell receptor. Immunopotentiation signals include, for example, various viral antigens, epitopes of various bacterial toxins, epitopes of T cell-dependent antigens such as keyhole limpet hemocyanin (KLH), ovalbumin (OVA), bovine serum albumin (BSA), etc. including.

免疫増強シグナルの例は、以下のものであるが、これらに限定されないものとする(R.S. Chambers及びS.A. Johnston, Nature Biotechnology 21(9):1088-1092 (2003))。   Examples of immune enhancement signals include, but are not limited to, the following (R.S. Chambers and S.A. Johnston, Nature Biotechnology 21 (9): 1088-1092 (2003)).

GlnAlaValHisAlaAlaHisAlaGluIleAsnGlu(配列番号12)；
GlnTyrIleLysAlaAsnSerLysPheIleGlyIleThrGluLeu(配列番号13)；
PheAsnAsnPheThrValSerPheTrpLeuArgValProLysValSerAlaSerHisLeuGluGlnTyr(配列番号14)；及び
AsnGlnArgGlyThrGluLeuArgSerProSerValAspLeuAsnLysProGlyArgHis（配列番号15）。 GlnAlaValHisAlaAlaHisAlaGluIleAsnGlu (SEQ ID NO: 12);
GlnTyrIleLysAlaAsnSerLysPheIleGlyIleThrGluLeu (SEQ ID NO: 13);
PheAsnAsnPheThrValSerPheTrpLeuArgValProLysValSerAlaSerHisLeuGluGlnTyr (SEQ ID NO: 14); and
AsnGlnArgGlyThrGluLeuArgSerProSerValAspLeuAsnLysProGlyArgHis (SEQ ID NO: 15).

本発明において、免疫増強シグナルは、１つ又は複数を組み合わせて使用できる。
局在シグナルは、細胞内で発現、翻訳されたCTGFを細胞膜に移行し、かつ分泌されたCTGFを細胞膜上にアンカーする働きを有する任意のペプチドである。本発明においては、局在シグナルは重要な構成要素の１つであり、高抗体価のCTGF抗体が産生されるように、発現されたCTGFを細胞表面に一定時間高濃度で留まらせるために必要である。局在シグナルの例は、MetGlyCys及びMetGlyCysCys(配列番号16)であり、ミリストイル化された１位のGly残基を介して細胞膜への移行を可能とするとともに、パルミチン化された3位,4位のCys残基を介してターゲットタンパクを細胞膜上にアンカーさせることを可能とする（Zuber, M. X., Strittmater, S. M及びFishman, M. C. (1989) Nature 341, 345-348； Skene, J. H. P.及びVirag, I. (1989) J. Cell Biol. 108, 613-624； Liu, Y.ら, (1993) Biochemistry 72, 10714-10719）。本発明で使用可能な局在シグナルは、上記の例に限定されないものとし、同様のアンカー作用があればいずれのシグナルも使用できる。 In the present invention, one or more immune enhancement signals can be used in combination.
The localization signal is any peptide having a function of transferring CTGF expressed and translated in cells to the cell membrane and anchoring secreted CTGF on the cell membrane. In the present invention, the localization signal is one of the important components and is necessary for the expressed CTGF to remain on the cell surface at a high concentration for a certain period of time so that a high antibody titer CTGF antibody is produced. It is. Examples of localization signals are MetGlyCys and MetGlyCysCys (SEQ ID NO: 16), allowing translocation to the cell membrane via the myristoylated 1-position Gly residue, as well as palmiticated 3- and 4-positions Allows target proteins to be anchored on the cell membrane via the Cys residues (Zuber, MX, Strittmater, SM and Fishman, MC (1989) Nature 341, 345-348; Skene, JHP and Virag, I. (1989) J. Cell Biol. 108, 613-624; Liu, Y. et al. (1993) Biochemistry 72, 10714-10719). Localization signals that can be used in the present invention are not limited to the above examples, and any signals can be used as long as they have the same anchoring action.

局在シグナルと免疫増強シグナルは、N末端側からこの順序で連結されることが好ましい。これら２つのシグナル間に１〜数個の任意のアミノ酸からなるリンカーが結合されてもよい。また、局在シグナル及び免疫増強シグナルを含むペプチドのC末端側に、場合により１〜数個の任意のアミノ酸からなるリンカーを介在させて、CTGF又はその機能性断片を連結するように配置される。   The localization signal and the immune enhancement signal are preferably linked in this order from the N-terminal side. A linker consisting of one to several arbitrary amino acids may be bound between these two signals. In addition, CTGF or a functional fragment thereof is linked to the C-terminal side of a peptide containing a localization signal and an immune enhancement signal, optionally via a linker consisting of one to several arbitrary amino acids. .

ベクターはさらに、細胞内で発現したCTGF又はその機能性断片を細胞膜に輸送するための分泌シグナルペプチドをコードするDNAを連結することが好ましい。このようなシグナルペプチドの好適な例は、CTGFのシグナルペプチド、例えばヒトCTGFのシグナルペプチド（配列番号１の１位〜27位の配列）である。   It is preferable that the vector further links DNA encoding a secretory signal peptide for transporting CTGF expressed in the cell or a functional fragment thereof to the cell membrane. A suitable example of such a signal peptide is a signal peptide of CTGF, for example, a signal peptide of human CTGF (sequences at positions 1 to 27 of SEQ ID NO: 1).

本発明において、好ましいベクターは、プロモーターの下流に、分泌シグナルペプチド、局在シグナルペプチド、免疫増強シグナルペプチド及びCTGFをN末端側からこの順序で含む融合蛋白が発現されるように、該融合蛋白をコードするDNAを含む。細胞内で発現された融合蛋白は、細胞膜に移行し、シグナルペプチドから切断されて分泌され、細胞膜にアンカーとして留まる。その結果、CTGFに対する抗体が生成しやすくなる。   In the present invention, a preferred vector is a fusion protein containing a secretion signal peptide, a localization signal peptide, an immune enhancement signal peptide, and CTGF in this order from the N-terminal side in the order downstream from the promoter. Contains the encoding DNA. The fusion protein expressed in the cell moves to the cell membrane, is cleaved from the signal peptide and secreted, and remains as an anchor in the cell membrane. As a result, an antibody against CTGF is easily generated.

ベクターにはさらに、必要に応じて、目的のDNAの発現を検出するためのタグ、例えばFLAGタグ、ヒスチジンタグ(例えばHis6〜His10)などをコードする塩基配列を、目的DNAの５'端又は３'端に結合することができる。特にFLAGタグなどの蛍光性タグは、目的タンパク質の発現の検出のために役立つ。   The vector further contains a base sequence encoding a tag for detecting the expression of the target DNA, such as a FLAG tag, a histidine tag (for example, His6 to His10), if necessary, at the 5 ′ end or 3 of the target DNA. 'Can be joined to the end. In particular, a fluorescent tag such as a FLAG tag is useful for detecting the expression of the target protein.

CTGF又はその機能性断片をコードするDNAを含む発現ベクターは、動物の身体部分、例えば皮下、に注入される。注入は、約１〜２週間置きに数回、例えば約１〜２ヶ月にわたって行うことができる。ベクターの注入量は、例えば17.5μg抗原/回である。   An expression vector containing DNA encoding CTGF or a functional fragment thereof is injected into an animal body part, for example, subcutaneously. The infusion can occur several times, about every 1-2 weeks, for example, over about 1-2 months. The injection amount of the vector is, for example, 17.5 μg antigen / time.

動物は、脊椎動物（魚類、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類）を指し、好ましい動物は鳥類及び非ヒト哺乳動物である。より好ましい動物は非ヒト哺乳動物、例えばげっ歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、有蹄類（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギなど）、ウサギなどである。   Animals refer to vertebrates (fish, reptiles, amphibians, birds, mammals), with preferred animals being birds and non-human mammals. More preferred animals are non-human mammals such as rodents (eg mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), ungulates (eg cows, horses, sheep, pigs, goats etc.), rabbits and the like.

本発明は、抗体の産生を目的とするため、ヒト抗体又はヒト化抗体を産生可能な動物（ヒトを除く）が好ましく使用される。そのような動物は、ヒト抗体産生トランスジェニック動物であり、例えばマウスやウシなどで知られている（特表平4-504365号公報、特表平6-500233号公報、米国特許第5,545,806号、米国特許第5,569,825号、L.L. Green, J. Immunol. Methods 231:11-23 (1999)など）。特に、KMマウス（キリンビール社）、Xenomouse (Abjenix社)などは、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスとして知られている。これらのマウスでは、マウスの本来の抗体遺伝子の全部又は一部がヒト由来の抗体遺伝子と置換されており、これによってマウスはヒト抗体又はヒト化抗体を産生することができる。すなわち、ヒト抗体は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域及び定常領域がいずれもヒト免疫グロブリン遺伝子に由来するものである。また、ヒト化抗体（又はキメラ抗体）は、ヒト抗体分子において、ヒト免疫グロブリン遺伝子に由来する重鎖又は軽鎖の可変領域及び定常領域の一部、好ましくは超可変領域のCDRの一部又は全部が、マウスなどのヒト以外の動物の免疫グロブリン遺伝子に由来する対応する重鎖又は軽鎖の可変領域及び定常領域の一部、好ましくは超可変領域のCDRの一部又は全部、によって置換されたようなキメラ免疫グロブリンである。   Since the present invention aims to produce antibodies, animals (except humans) capable of producing human antibodies or humanized antibodies are preferably used. Such animals are human antibody-producing transgenic animals, and are known, for example, from mice and cows (Japanese Patent Publication No. 4-504365, Japanese Patent Publication No. 6-500233, US Pat. No. 5,545,806, US Pat. No. 5,569,825, LL Green, J. Immunol. Methods 231: 11-23 (1999)). In particular, KM mice (Kirin Brewery), Xenomouse (Abjenix) and the like are known as transgenic mice producing human antibodies. In these mice, all or part of the original antibody gene of the mouse is replaced with a human-derived antibody gene, whereby the mouse can produce a human antibody or a humanized antibody. That is, in the human antibody, both the variable region and the constant region of the immunoglobulin heavy chain and light chain are derived from a human immunoglobulin gene. A humanized antibody (or chimeric antibody) is a part of a variable region and constant region of a heavy chain or light chain derived from a human immunoglobulin gene, preferably a part of CDR of a hypervariable region or a human antibody molecule. All replaced by part of the corresponding heavy or light chain variable and constant regions derived from immunoglobulin genes of non-human animals such as mice, preferably part or all of the CDRs of the hypervariable region Such a chimeric immunoglobulin.

ヒト化抗体の作製については、例えば動物を使わないでヒト化抗体を作製する手法もある。すなわち、ヒト化抗体は、例えば、チェーンシャフリング法により、またはファージディスプレイ技術を用いて得ることができる。例えば、CTGFに特異的な非ヒト抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドを、ヒト補体（軽もしくは重）鎖可変ドメインのレパートリーと結合させる。目的の抗原に特異的なハイブリッド対合を選択する。続いて選択した対合からのヒトの鎖を、ヒト補体可変ドメイン（重もしくは軽）のレパートリーと結合させ、そしてヒト化抗体ポリペプチド二量体を、抗原に対する結合特異性について選択し得る。本発明の方法に使用し得るヒト化抗体の作製について記載された技法は、例えば、米国特許第5,565,332号、第5,585,089号、第5,694,761号、および第5,693,762号に開示されている。   As for the production of a humanized antibody, for example, there is a technique for producing a humanized antibody without using an animal. That is, humanized antibodies can be obtained, for example, by chain shuffling or using phage display technology. For example, a polypeptide comprising a heavy or light chain variable domain of a non-human antibody specific for CTGF is conjugated to a repertoire of human complement (light or heavy) chain variable domains. A hybrid pairing specific for the antigen of interest is selected. The human chain from the selected pairing can then be combined with a repertoire of human complement variable domains (heavy or light) and humanized antibody polypeptide dimers can be selected for binding specificity for the antigen. Techniques described for the production of humanized antibodies that can be used in the methods of the invention are disclosed, for example, in US Pat. Nos. 5,565,332, 5,585,089, 5,694,761, and 5,693,762.

本発明によりDNA免疫法で免疫された動物では、一過的に発現されたCTGF又はその機能性断片対する抗体の産生が誘発される。抗体の産生後、動物の体液、例えば血清、血漿、乳汁などから目的の抗体を回収する。ここで得られる抗体は、ポリクローナル抗体である。抗体のアイソタイプはIgG、IgM、IgA、IgD、IgEなどのいずれでもよい。また、抗体のクラスは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2などであり、軽鎖はκ鎖、λ鎖などである。このような抗体の種類は、モノクローナル抗体でも同様である。   In animals immunized by DNA immunization according to the present invention, production of antibodies against transiently expressed CTGF or functional fragments thereof is induced. After production of the antibody, the desired antibody is collected from animal body fluids such as serum, plasma, milk and the like. The antibody obtained here is a polyclonal antibody. The antibody isotype may be any of IgG, IgM, IgA, IgD, IgE and the like. The antibody class is IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, etc., and the light chain is κ chain, λ chain, or the like. The same kind of antibody is used for monoclonal antibodies.

本発明はさらに、上記抗体又は下記のモノクローナル抗体の断片も包含する。このような断片の例は、Fc、Fd、Fab、Fab'、(Fab')2などを含む。例えばパパイン、トリプシン、ペプシンなどのプロテアーゼによる分解によって断片を得ることができる。 The present invention further includes the above-mentioned antibody or the following monoclonal antibody fragment. Examples of such fragments include Fc, Fd, Fab, Fab ′, (Fab ′) 2 and the like. For example, fragments can be obtained by degradation with a protease such as papain, trypsin, pepsin.

本発明のモノクローナル抗体は、以下のようにして一般的なモノクローナル抗体の作製方法によって調製することができる。   The monoclonal antibody of the present invention can be prepared by a general method for producing a monoclonal antibody as follows.

上記のDNA免疫法で免疫された動物（ヒトを除く）、好ましくはマウス、さらに好ましくはヒト抗体産生トランスジェニックマウス、から脾臓細胞、B細胞又はリンパ細胞（もしくはリンパ節）を取り出し、これらの細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞ともいう）、好ましくはマウス骨髄腫細胞、とを融合させてハイブリドーマを作製する。細胞融合のためには、例えばポリエチレングリコールなどの細胞凝集性媒体が使用される。   Spleen cells, B cells or lymphocytes (or lymph nodes) are removed from animals (excluding humans) immunized by the above DNA immunization method, preferably mice, more preferably human antibody-producing transgenic mice, and these cells are extracted. And myeloma cells (also called myeloma cells), preferably mouse myeloma cells, are fused to produce a hybridoma. For cell fusion, a cell-aggregating medium such as polyethylene glycol is used.

その結果得られたハイブリドーマの中から、天然型CTGF、好ましくはCTGFの天然型高次構造、を特異的に認識する抗体を選抜する。選抜には、フローサイトメトリーが好ましく使用できる。検出のために、ヒト又はマウスの免疫グロブリンと特異的に結合する蛍光標識二次抗体を使用することができる。   From the resulting hybridoma, an antibody that specifically recognizes natural CTGF, preferably the natural higher-order structure of CTGF, is selected. For the selection, flow cytometry can be preferably used. For detection, fluorescently labeled secondary antibodies that specifically bind to human or mouse immunoglobulins can be used.

樹立したハイブリドーマをヌードマウスに腹腔内注射し、腹水を採取し、腹水をプロテインA又はプロテインGセファロースカラムに通して、高純度の目的のモノクローナル抗体を回収することができる。   The established hybridoma is injected intraperitoneally into a nude mouse, ascites is collected, and the ascites is passed through a protein A or protein G sepharose column, and the target monoclonal antibody with high purity can be recovered.

モノクローナル抗体の作製法については、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology (1989)、Kozborら, Immunology Today 4:72 (1983)、Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96 (1985)、 Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 8,1988などに記載されており、本発明の実施のために参照することができる。   For methods of producing monoclonal antibodies, see Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989), Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983), Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96 (1985), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988, and the like, which can be referred to for carrying out the present invention.

したがって、本発明により、CTGFをコードするDNA又はその機能性断片（例えばCTGFを構成するモジュールをコードするDNA）を発現可能に含む発現ベクターを非ヒト動物に免疫し、該CTGFを認識する抗体を含む体液、或いは該抗体を産生する細胞、を取り出し、該CTGFを認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体を得ることを含む、上記の抗体の作製方法が提供される。   Therefore, according to the present invention, an antibody that recognizes CTGF by immunizing a non-human animal with an expression vector capable of expressing DNA encoding CTGF or a functional fragment thereof (for example, DNA encoding a module constituting CTGF) is provided. There is provided a method for producing the above-mentioned antibody, which comprises removing a body fluid containing the cell or a cell producing the antibody, and obtaining a polyclonal or monoclonal antibody recognizing the CTGF.

本発明の実施形態によれば、上記非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはげっ歯類又は有蹄類である。げっ歯類の例はマウス、好ましくはヒト抗体産生トランスジェニックマウスである。また、有蹄類は、ウシ、ヤギ、ヒツジなど、好ましくはヒト抗体産生トランスジェニックウシである。
上記方法において、体液は、例えば血清又は乳汁である。 According to an embodiment of the present invention, the non-human animal is preferably a mammal, more preferably a rodent or ungulate. An example of a rodent is a mouse, preferably a human antibody-producing transgenic mouse. The ungulates are preferably bovine, goat, sheep, etc., preferably human antibody-producing transgenic cattle.
In the above method, the body fluid is, for example, serum or milk.

また、本発明の実施形態によれば、上記抗体を産生する細胞は脾臓細胞、Ｂ細胞又はリンパ細胞である。これらの細胞は、上記のとおり、骨髄腫細胞と融合しハイブリドーマを形成し、本発明のモノクローナル抗体を作製するために使用される。   According to an embodiment of the present invention, the cell producing the antibody is a spleen cell, a B cell or a lymphocyte. As described above, these cells are fused with myeloma cells to form hybridomas, which are used to produce the monoclonal antibodies of the present invention.

さらに、本発明の実施形態によれば、本発明の方法は、上記抗体を産生する細胞或いは前記ハイブリドーマをフローサイトメトリーにて選抜することをさらに含む。検出のために、ヒト又はマウスの免疫グロブリンと特異的に結合する蛍光標識二次抗体を使用することができる。この選抜法によって得られる抗体の中から、ヒトに対し副作用を及ぼすような有害な抗体は排除される。   Furthermore, according to an embodiment of the present invention, the method of the present invention further comprises selecting cells producing the antibody or the hybridoma by flow cytometry. For detection, fluorescently labeled secondary antibodies that specifically bind to human or mouse immunoglobulins can be used. From the antibodies obtained by this selection method, harmful antibodies that cause side effects on humans are excluded.

抗モジュール抗体は、DNA免疫法により全長CTGF遺伝子発現によってin vivoで誘発された抗CTGFポリクローナル又はモノクローナル抗体群の中から免疫吸収法又はフローサイトメトリーなどの選択手法を用いて選抜することによっても得ることができる。   Anti-module antibodies can also be obtained by selecting from a group of anti-CTGF polyclonal or monoclonal antibodies induced in vivo by full-length CTGF gene expression by DNA immunization using a selection technique such as immunoabsorption or flow cytometry. be able to.

抗体の特徴
本発明により、上記のようなDNA免疫法によって、天然型高次構造を保持するCTGF又はその機能性断片（例えばモジュール）を特異的に認識する抗体（すなわち、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）が得られる。特に、ヒト抗体産生トランスジェニック動物（例えばマウス、ウシ）に対してDNA免疫を実施するときには、天然型高次構造を保持するヒトCTGF又はその各モジュールを特異的に認識するヒト抗体又はヒト化抗体を得ることができる。 Antibody Features According to the present invention, an antibody that specifically recognizes CTGF or its functional fragment (eg, module) having a natural higher-order structure by the DNA immunization method as described above (ie, polyclonal antibody or monoclonal antibody) Is obtained. In particular, when DNA immunization is performed on a human antibody-producing transgenic animal (eg, mouse, bovine), a human antibody or a humanized antibody that specifically recognizes human CTGF retaining its higher-order structure or each module thereof Can be obtained.

そのような抗体として、例えばヒトCTGFのモジュール１及びモジュール２の各々に対するモノクローナル抗体、すなわちMouse-Mouse hybridoma CTGF-m11(FERM ABP-10454)由来のモノクローナル抗体、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12(FERM ABP-10455)及びMouse-Mouse hybridoma CTGF-m21(FERM ABP-10456)由来のモノクローナル抗体などを作製した。しかし、本発明は、これらの特定の抗体に制限されるものではなく、例えばヒト抗体産生トランスジェニック動物を使用してヒトCTGF又はモジュール１〜４の各々に対するヒト抗体の作製を実施し、同様に目的のヒト抗体を取得することも可能である。   As such an antibody, for example, a monoclonal antibody against each of modules 1 and 2 of human CTGF, that is, a monoclonal antibody derived from Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11 (FERM ABP-10454), Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12 (FERM ABP -10455) and Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m21 (FERM ABP-10456) -derived monoclonal antibodies and the like. However, the present invention is not limited to these particular antibodies. For example, human antibody-producing transgenic animals are used to produce human antibodies against human CTGF or each of modules 1 to 4, and similarly, It is also possible to obtain a target human antibody.

本発明の抗体は、BIAcore（登録商標）の表面プラズモン共鳴法で測定するとき、天然型CTGFに対する結合定数3.0×107M-1以上、5.0×107M-1以上、好ましくは1.0×108M-1以上、1.8×108M-1以上、3.0×108M-1以上、さらに好ましくは5.0×108M-1以上、特に好ましくは1.0×109M-1以上、並びに/或いは、天然型CTGFに対する解離定数5.6×10-9M以下、好ましくは3.5×10-9M以下、3.0×10-9M以下、さらに好ましくは2,5×10-9M以下、2,0×10-9M以下、特に好ましくは1.0×10-9M以下、5.0×10-10M以下を有することを特徴とする。 The antibody of the present invention has a binding constant for natural CTGF of 3.0 × 10 7 M-1 or more, 5.0 × 10 7 M-1 or more, preferably 1.0 × 10 5 when measured by the surface plasmon resonance method of BIAcore (registered trademark). 8 M -1 or more, 1.8 x 10 8 M -1 or more, 3.0 x 10 8 M -1 or more, more preferably 5.0 x 10 8 M -1 or more, particularly preferably 1.0 x 10 9 M -1 or more, and / or Alternatively, the dissociation constant for natural CTGF is 5.6 × 10 −9 M or less, preferably 3.5 × 10 −9 M or less, 3.0 × 10 −9 M or less, more preferably 2,5 × 10 −9 M or less, 2,0 × 10 -9 M or less, particularly preferably 1.0 × 10 -9 M or less, 5.0 × 10 -10 M or less.

本発明の抗体は、CTGF、好ましくはヒトCTGF、の天然型高次構造を特異的に認識することができる。ここで特異的とは、天然型高次構造をもつCTGFを認識するが上記変性型CTGFを認識しないか、或いは上記変性型CTGFよりも天然型高次構造をもつCTGFを相対的に認識しやすいことを意味する。このように相対的に高い認識度（又は免疫学的反応性）、言い換えれば10倍以上、好ましくは100倍以上、さらに好ましくは1,000倍以上高い結合能を、本明細書中では、特異的に認識するという。従来の免疫法では達成されなかった天然型ヒトCTGFに対する高い結合親和性のために、in vivoでヒトCTGFの生物活性を実用的レベルで有意に阻害又は抑制することが可能になる。ここで、生物活性とは、線維性結合組織の増殖、血管新生を含む細胞増殖亢進などを含む。   The antibody of the present invention can specifically recognize the natural higher-order structure of CTGF, preferably human CTGF. Here, specific means that CTGF having a natural higher-order structure is recognized but the modified CTGF is not recognized, or CTGF having a natural higher-order structure is more easily recognized than the modified CTGF. Means that. Such a relatively high recognition degree (or immunological reactivity), in other words, a binding ability that is 10 times or more, preferably 100 times or more, more preferably 1,000 times or more is specifically mentioned in the present specification. Recognize. The high binding affinity for native human CTGF that has not been achieved by conventional immunization methods makes it possible to significantly inhibit or suppress the biological activity of human CTGF at a practical level in vivo. Here, the biological activity includes proliferation of fibrous connective tissue, enhanced cell proliferation including angiogenesis, and the like.

医薬組成物
本発明はさらに、有効量の上記の本発明の抗体を含む医薬組成物も提供する。
本発明の医薬組成物で使用される抗体は、好ましくはヒトCTGF又はその機能性断片（例えばモジュール１〜４）に対する抗体であり、好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体であり、特に好ましくはヒト抗体である。また、抗体はポリクローナル抗体でもよいし、或いはモノクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。 Pharmaceutical Composition The present invention further provides a pharmaceutical composition comprising an effective amount of the above-described antibody of the present invention.
The antibody used in the pharmaceutical composition of the present invention is preferably an antibody against human CTGF or a functional fragment thereof (for example, modules 1 to 4), preferably a human antibody or a humanized antibody, particularly preferably a human antibody. It is. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.

フローサイトメトリーによって、正常細胞又は組織に実質的に悪影響を与えずに、疾患細胞や組織に対してのみ有効に作用するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜することができる。   By flow cytometry, a hybridoma that produces a monoclonal antibody that effectively acts only on diseased cells or tissues without substantially adversely affecting normal cells or tissues can be selected.

本発明の組成物は、線維症又は線維化に伴う硬化症、或いは細胞増殖性疾患の治療又は予防のために使用することができる。   The composition of the present invention can be used for the treatment or prevention of fibrosis or sclerosis associated with fibrosis, or cell proliferative disease.

上記線維症又は線維化に伴う硬化症は、例えば腎臓、肺、肝臓、眼球、心臓などの臓器の線維症、強皮症、間質性線維症、硬膜外線維症などである。CTGFの異常な発現は、一般的な組織瘢痕化、皮膚の腫瘍様増殖、血管の持続的瘢痕化に伴ってみられ、それは血液運搬能の悪化、高血圧症、肥大などを導く。また、CTGFが関係する他の疾患には、皮膚線維腫を含む癌、内皮細胞異常発現に関連する症状、乳癌線維形成性腫、血管脂肪腫、血管平滑筋腫、アテローム性動脈硬化症、全身性硬化症（アテローム硬化性斑、炎症性腸疾患、クローン病、血管新生など）、関節炎、及びその他の疾患症状、緑内障に関与する血管新生、炎症（関節炎など）、腫瘍増殖転移、間質性疾患、皮膚疾患、関節炎（慢性関節リウマチなど）、動脈硬化症、糖尿病（糖尿病性神経障害など）、高血圧症、その他の腎障害、外科手術、化学療法、放射線処理、同種異系移植片拒絶反応、移植拒絶反応など多様な疾患、障害又は症状が含まれる。   Examples of the sclerosis associated with fibrosis or fibrosis include fibrosis of organs such as kidney, lung, liver, eyeball, heart, scleroderma, interstitial fibrosis, epidural fibrosis and the like. Abnormal expression of CTGF is associated with general tissue scarring, tumor-like growth of the skin, and persistent scarring of blood vessels, leading to poor blood carrying capacity, hypertension, hypertrophy, etc. Other diseases related to CTGF include cancers including cutaneous fibroma, symptoms related to abnormal expression of endothelial cells, breast cancer fibrosis, angiolipoma, angioleiomyoma, atherosclerosis, systemic Sclerosis (eg, atherosclerotic plaque, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, angiogenesis), arthritis and other disease symptoms, angiogenesis involving glaucoma, inflammation (eg, arthritis), tumor growth metastasis, interstitial disease , Skin diseases, arthritis (such as rheumatoid arthritis), arteriosclerosis, diabetes (such as diabetic neuropathy), hypertension, other renal disorders, surgery, chemotherapy, radiation treatment, allograft rejection, Various diseases, disorders or symptoms such as transplant rejection are included.

線維症は、上記のような臓器又は器官に線維性結合組織の増殖が起こり組織の硬化と萎縮をきたし、正常の臓器又は器官構造の破壊と荒廃が生じた状態をいう。線維症は種々の損傷又は疾患によって生じ得るが、種々の器官の移植に関係する慢性移植拒絶反応により生じることが多い。線維症は、一般には、細胞間質マトリックス成分の異常な産生、蓄積又は沈着が含まれ、例えばコラーゲンとフィブロネクチンの過剰産生及び沈着増加を引き起す。   Fibrosis refers to a state in which fibrous connective tissue has proliferated in the organ or organ as described above, causing tissue hardening and atrophy, and destruction and devastation of a normal organ or organ structure. Fibrosis can be caused by various injuries or diseases, but is often caused by chronic transplant rejection associated with transplantation of various organs. Fibrosis generally involves abnormal production, accumulation or deposition of cellular stromal matrix components, causing, for example, overproduction and increased deposition of collagen and fibronectin.

上記細胞増殖性疾患は、異常増殖性の癌である。CTGFは、血管新生を亢進する作用があり、特に悪性腫瘍（すなわち癌）での血管新生に関与していると言われている（特許文献４）。癌には、例えば急性リンパ芽球性白血病、皮膚線維腫、乳癌、乳癌腺異形成、血管脂肪腫、血管平滑筋腫、癒着性癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌、胃腸系癌、肝臓癌、他の腫瘍増殖及び転移を含む癌などが含まれる。   The cell proliferative disorder is an abnormally proliferative cancer. CTGF has an effect of enhancing angiogenesis and is said to be involved in angiogenesis particularly in malignant tumors (that is, cancer) (Patent Document 4). Examples of cancer include acute lymphoblastic leukemia, dermal fibroma, breast cancer, breast cancer gland dysplasia, angiolipoma, angioleiomyoma, adhesion cancer, prostate cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, gastrointestinal cancer , Liver cancer, other cancers including tumor growth and metastasis, and the like.

CTGFがその細胞表面受容体に結合し増殖シグナルを伝達するのを阻害又は抑制することができれば、線維症又は線維化に伴う硬化症、血管新生などのCTGFが関係する種々の疾患又は障害の治療又は予防に役立つと考えられる。このための阻害剤又は抑制剤の１つが、ヒトCTGF又はその表面抗原エピトープに対する抗体である。   Treatment of various diseases or disorders related to CTGF such as fibrosis or sclerosis associated with fibrosis, angiogenesis, etc., if CTGF can inhibit or suppress the binding of its cell surface receptors and transmission of proliferation signals Or it may be useful for prevention. One inhibitor or suppressor for this is an antibody against human CTGF or its surface antigen epitope.

本発明の実施形態により、上記抗体に治療用薬剤を結合させることができる。抗体は、CTGFが存在する標的疾患部位又はその近傍に薬剤を運搬するとともに、CTGFの機能を阻害又は抑制し、一方、薬剤は、疾患の症状を治癒、軽減又は改善する。このような形態の医薬は、いわゆる分子標的薬である。   According to an embodiment of the present invention, a therapeutic agent can be bound to the antibody. The antibody delivers the drug to or near the target disease site where CTGF is present and inhibits or suppresses the function of CTGF, while the drug cures, reduces or ameliorates the symptoms of the disease. Such a form of medicine is a so-called molecular targeted drug.

薬剤は、上記疾患の治療薬剤として使用されている、又は使用されようとする、すべての薬剤を含む。そのような薬剤は、例えば合成又は天然の、低分子量又は高分子量の、タンパク質性又は非タンパク質性の、或いは核酸又はヌクレオチド性の物質である。例えば、線維症の治療薬剤の例は、プロスタグランジンE1、ステロイド剤、PPARリガンド、アンアンギオテンシンII型 I 受容体アンタゴニスト、可溶性TGFII型受容体、HGFなど、また、抗癌剤の例は、アルキル化剤、例えばイホスファミド、ニムスチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ラニムスチンなど、代謝拮抗剤、例えばゲムシタビン、フルオロウラシルなど、抗癌性抗生物質、例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンCなど、植物アルカロイド、例えばパクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチンなど、白金錯体、例えばシスプラチンなどを含む。   Drugs include all drugs that are or are being used as therapeutic drugs for the above diseases. Such agents are, for example, synthetic or natural, low or high molecular weight, proteinaceous or nonproteinaceous, or nucleic acid or nucleotide substances. For example, examples of therapeutic agents for fibrosis include prostaglandin E1, steroids, PPAR ligands, angiotensin II type I receptor antagonists, soluble TGF type II receptors, HGF, etc., and examples of anticancer agents include alkylating agents. For example, ifosfamide, nimustine, cyclophosphamide, dacarbazine, ranimustine, etc., antimetabolite such as gemcitabine, fluorouracil, etc., anticancer antibiotics such as daunorubicin, doxorubicin, bleomycin, mitomycin C, etc. And platinum complexes such as vinblastine, such as cisplatin.

抗体と薬剤との結合は、好ましくはリンカーを介して行われる。リンカーは、例えば置換又は未置換の脂肪族性アルキレン鎖を含み、その両末端に、抗体又は薬剤の官能基と結合可能な基、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド基、エステル基、チオール基、イミドカルボネート基、アルデヒド基などを含むものである（抗体工学入門、地人書館、1994年）。   The binding between the antibody and the drug is preferably performed via a linker. The linker includes, for example, a substituted or unsubstituted aliphatic alkylene chain, and a group capable of binding to a functional group of an antibody or a drug at both ends, such as an N-hydroxysuccinimide group, an ester group, a thiol group, and an imide carbonate. Group, aldehyde group, etc. (Introduction to antibody engineering, Jinjinshokan, 1994).

必要に応じて、医薬を細胞内に運搬しやすくするために、リポソームに封入することもできる。好ましいリポソームは、正電荷リポソーム、正電荷コレステロール、膜透過性ペプチド結合リポソームなどである（中西守ら,蛋白質核酸酵素44:1590-1596 (1999)、二木史朗,化学と生物43:649-653 (2005)、Clinical Cancer research 59:4325-4333 (1999)など）。   If necessary, it can be encapsulated in liposomes in order to facilitate delivery of the drug into the cell. Preferred liposomes are positively charged liposomes, positively charged cholesterol, membrane-permeable peptide-bonded liposomes, etc. (Nakanishi Mamoru et al., Protein Nucleic Acid Enzyme 44: 1590-1596 (1999), Futaki Shiro, Chemistry and Biology 43: 649-653 ( 2005), Clinical Cancer research 59: 4325-4333 (1999)).

投与は、非経口投与、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮投与などである。
非経口投与のための製剤としては、滅菌された生理食塩水溶液、緩衝塩水溶液、有機溶剤含有水溶液などの水溶液中の、溶液剤、懸濁剤、乳剤などが挙げられる。有機溶剤の例は、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルなどの脂肪酸エステルなどを含む。また、製剤中には、栄養剤、電解質液、保存剤、抗酸化剤などの添加剤が含まれてもよい。 Administration is parenteral, for example, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, transdermal and the like.
Preparations for parenteral administration include solutions, suspensions, emulsions, and the like in aqueous solutions such as sterilized physiological saline solution, buffered salt solution, and organic solvent-containing solution. Examples of the organic solvent include ethanol, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil, fatty acid esters such as ethyl oleate, and the like. Moreover, additives, such as a nutrient, an electrolyte solution, a preservative, and an antioxidant, may be contained in the preparation.

抗体の有効成分量は、１回の用量あたり100〜2,500μｇ/ｍｌである、或いはヒト成人患者体重１ｋｇあたり1.0〜10mgの量であるが、これらに限定されないものとする。   The amount of the active ingredient of the antibody is 100 to 2,500 μg / ml per dose, or 1.0 to 10 mg per kg of human adult patient body weight, but is not limited thereto.

投与回数は、例えば１〜２週間に１回の頻度で数回の投与又は２〜３週間に１回の投与で約２ヶ月間である。   The administration frequency is, for example, several times at a frequency of once every 1 to 2 weeks or once every 2 to 3 weeks for about 2 months.

診断用組成物
本発明はさらに、上記抗体を含む診断用組成物を提供する。
本発明の組成物は、例えば線維症又は線維化に伴う硬化症、或いは細胞増殖性疾患の診断のために使用されるが、これらに限定されず、上記の他の疾患、障害の検出のためにも使用可能である。このような疾患では、CTGFの発現が正常値又は標準値よりも高い状態となり、結合組織の異常増殖、組織の硬化と萎縮、臓器又は器官構造の破壊が生じる。このために、CTGFの存在又は量を、本発明の上記抗体を用いて測定することにより、上記のような疾患を診断することができる。抗体は、ヒトCTGFに対する抗体だけでなく、ヒトを除く動物、好ましくは哺乳動物のCTGFに対する抗体も使用できる。CTGFは哺乳動物間で高い配列同一性を有しており、例えばヒトとマウスではアミノ酸レベルで93.5%の同一性がある。 Diagnostic composition The present invention further provides a diagnostic composition comprising the antibody.
The composition of the present invention is used for diagnosis of, for example, fibrosis or sclerosis associated with fibrosis, or cell proliferative disease, but is not limited thereto, for detection of other diseases and disorders described above. Can also be used. In such diseases, CTGF expression is in a state higher than a normal value or a standard value, resulting in abnormal growth of connective tissue, tissue hardening and atrophy, and destruction of an organ or organ structure. For this purpose, the above-mentioned diseases can be diagnosed by measuring the presence or amount of CTGF using the antibody of the present invention. As the antibody, not only an antibody against human CTGF but also an antibody against CTGF of animals other than humans, preferably mammals, can be used. CTGF has high sequence identity between mammals, for example, human and mouse have 93.5% identity at the amino acid level.

アッセイの例としては、慣用の一般的アッセイ法、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、蛍光抗体アッセイ、放射性免疫アッセイ、放射性免疫沈降法、ドットブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、ラテックスビーズ凝集アッセイなどが挙げられるが、これらに制限されない。   Examples of assays include conventional general assays, such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), fluorescent antibody assays, radioimmunoassays, radioimmunoprecipitation, dot blot assays, inhibition or competition assays, sandwich assays, latex beads Examples include but are not limited to agglutination assays.

本発明の抗体は、天然型CTGF（好ましくはヒトCTGF）を特異的に認識することによって特徴付けられ、特にCTGFの天然型高次構造の連続的又は不連続的な細胞表面抗原エピトープを特異的に認識することができる。   The antibody of the present invention is characterized by specifically recognizing native CTGF (preferably human CTGF), particularly specific to a continuous or discontinuous cell surface antigen epitope of the natural conformation of CTGF. Can be recognized.

高い特異性を達成するためには、モノクローナル抗体が好ましい。疾患の診断又は検出を目的とするため、抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である必要はなく、例えばマウスモノクローナル抗体でよい。このような抗体の例は、以下のものに限定されないが、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11(FERM ABP-10454)、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12(FERM ABP-10455)、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m31、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m32、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m33、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m41のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体である（後述の実施例参照）。   Monoclonal antibodies are preferred in order to achieve high specificity. For the purpose of diagnosing or detecting a disease, the antibody need not be a human antibody or a humanized antibody, and may be, for example, a mouse monoclonal antibody. Examples of such antibodies include, but are not limited to, Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11 (FERM ABP-10454), Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12 (FERM ABP-10455), Mouse-Mouse hybridoma CTGF- It is a monoclonal antibody derived from a hybridoma of m31, Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m32, Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m33, or Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m41 (see Examples below).

本発明の方法で検出可能な線維症又は線維化に伴う硬化症は、例えば腎線維症、肺線維症、肝線維症、又は皮膚線維症（強皮症ともいう）などの線維症、また、細胞増殖性疾患は、例えば癌であるが、これらに限定されない。   Fibrosis detectable by the method of the present invention or sclerosis associated with fibrosis is, for example, fibrosis such as renal fibrosis, pulmonary fibrosis, liver fibrosis, or dermal fibrosis (also referred to as scleroderma), and The cell proliferative disease is, for example, cancer, but is not limited thereto.

サンプルは、生物学的サンプル、例えば、疾患部位の組織又は細胞生検、血液、血清、血漿、リンパ液、尿などの体液、などである。これらのサンプルを、必要に応じて均質化、遠心分離、或いは希釈を行い、適切な緩衝液中で、本発明の抗体を添加し、抗原であるヒトCTGFと抗体との複合体を上記のアッセイ法にて検出する。この場合、本発明の抗体を標識してもよいし、或いは標識二次抗体を使用することもできる。   The sample is a biological sample, such as a tissue or cell biopsy of the disease site, blood, serum, plasma, lymph, body fluid such as urine, and the like. These samples are homogenized, centrifuged, or diluted as necessary, the antibody of the present invention is added in an appropriate buffer, and the complex of human CTGF as an antigen and the antibody is assayed as described above. Detect by method. In this case, the antibody of the present invention may be labeled, or a labeled secondary antibody can be used.

標識は、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、放射性同位元素（例えば32P、35S、3H、125Iなど）、蛍光性物質（例えばローダミン、フルオレサミン、ダンシルクロリド、それらの誘導体など）などである。 Labels include enzymes (eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), radioisotopes (eg, 32 P, 35 S, 3 H, 125 I, etc.), fluorescent substances (eg, rhodamine, fluorescamine, dansyl chloride, derivatives thereof, etc. ) Etc.

以下の実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって制限されないものとする。   The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to these examples.

（１）発現ベクターの構築
ヒトCTGFの全長遺伝子（配列番号２）またはそれを構成する各々のmodule 1（配列番号４）, module 2（配列番号６）, module 3（配列番号８）、およびmodule 4（配列番号10）の各遺伝子断片を、FLAGタグ付の哺乳動物発現ベクター（VV8；Invitrogen社）に組込んだ。発現ベクターはまた、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、局在シグナル配列(MetGlyCys)及び免疫増強シグナル配列(ニワトリOVAエピトープ；R.S. ChambersとS.A. Johnston, Nature Biotechnology 21(9):1088-1092 (2003))からなるペプチドをコードするDNAを含む。 (1) Construction of expression vector Full-length gene (SEQ ID NO: 2) of human CTGF or each of module 1 (SEQ ID NO: 4), module 2 (SEQ ID NO: 6), module 3 (SEQ ID NO: 8), and module Each gene fragment of 4 (SEQ ID NO: 10) was incorporated into a mammalian expression vector (VV8; Invitrogen) with a FLAG tag. Expression vectors also include cytomegalovirus (CMV) promoter, localization signal sequence (MetGlyCys) and immune enhancement signal sequence (chicken OVA epitope; RS Chambers and SA Johnston, Nature Biotechnology 21 (9): 1088-1092 (2003)) DNA encoding a peptide consisting of

ヒトCTGFの高次構造を認識しかつその生物生理活性を阻害するモノクローナル抗体を得るために、ヒトCTGF全長遺伝子が入った構築物であるvv8/CTGFが最適な免疫用抗原遺伝子となるが、そのほか、module 1, module 2, module 3, module 4のいずれかが挿入された構築物も免疫抗原遺伝子として使用できる。   In order to obtain a monoclonal antibody that recognizes the higher-order structure of human CTGF and inhibits its biophysiological activity, vv8 / CTGF, which is a construct containing the full-length human CTGF gene, is the optimal antigen gene for immunization. A construct into which any of module 1, module 2, module 3, and module 4 is inserted can also be used as an immunizing antigen gene.

構築した遺伝子構築物（すなわち、vv8/ヒトCTGF全長遺伝子、vv8/module 1, vv8/module 2, vv8/module 3およびvv8/module 4）が設計した通りに細胞表面に発現されているかどうかについて免疫実施前にヒト腎臓由来哺乳動物細胞（HEK293T）を用いて検証した。すなわち、構築した遺伝子構築物を哺乳細胞に一過性発現導入した。導入した哺乳細胞を 5％CO2インキュベータ中、10％FCS添加D-MEM培地で、24時間、37℃で培養し、フローサイトメトリー(FCM)解析に用いた。FCM解析する際、上記の導入遺伝子に付加しているタグに対するFLAG M2抗体（Sigma-ardrich社）を遺伝子導入した培養細胞懸濁液に加え、30分間静置した。その後、1次抗体を特異的に認識する蛍光標識した抗マウスIg抗体（Beckmancoulter社）を上記反応液に添加し、30分間静置してからFCM解析に使用した。 Immunize whether the constructed gene construct (ie vv8 / human CTGF full-length gene, vv8 / module 1, vv8 / module 2, vv8 / module 3 and vv8 / module 4) is expressed on the cell surface as designed Previously, it was verified using mammalian cells derived from human kidney (HEK293T). That is, the constructed gene construct was transiently introduced into mammalian cells. The introduced mammalian cells were cultured in a D-MEM medium supplemented with 10% FCS in a 5% CO 2 incubator for 24 hours at 37 ° C. and used for flow cytometry (FCM) analysis. When FCM analysis was performed, a FLAG M2 antibody (Sigma-ardrich) against the tag added to the transgene was added to the cultured cell suspension into which the gene was introduced, and allowed to stand for 30 minutes. Thereafter, a fluorescent-labeled anti-mouse Ig antibody (Beckmancoulter) that specifically recognizes the primary antibody was added to the reaction solution, left to stand for 30 minutes, and used for FCM analysis.

その結果、本発明により構築した５つの遺伝子構築物がすべて細胞表面に発現していることが証明された。   As a result, it was proved that all five gene constructs constructed according to the present invention were expressed on the cell surface.

（２）DNA免疫法による抗体の作製
DNA免疫法は、上記遺伝子構築物を単独または混合して、免疫動物に対して様々な遺伝子導入法（例えば筋肉注射、エレクトロポレーション、遺伝子銃など）のいずれかを用いて、動物（マウス又はヒト抗体産生トランスジェニックマウス）の皮下に注入し、細胞内に取り込ませた。 (2) Production of antibodies by DNA immunization
In the DNA immunization method, an animal (mouse or human) can be obtained by using any of various gene transfer methods (for example, intramuscular injection, electroporation, gene gun, etc.) with respect to an immunized animal by singly or mixing the above gene constructs. Antibody-injecting transgenic mice) were injected subcutaneously into cells.

ヒトCTGF全長遺伝子導入細胞を認識する強い特異抗体を産生している動物を解剖し、定法に従いB細胞を単離してモノクローナル抗体を作製した。具体的には、次のように行った。   An animal producing a strong specific antibody that recognizes human CTGF full-length gene-transfected cells was dissected, and B cells were isolated according to a standard method to produce a monoclonal antibody. Specifically, it was performed as follows.

ハイブリドーマは免疫したBalb/cマウスの脾臓もしくはリンパ節から得られた免疫細胞と骨髄腫細胞を融合して作製された。骨髄腫細胞はマウスから得られた株化細胞である、8-アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Eur.J.Immunol.，6,511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature，276，269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J．Immunol.，123,1548(1979)]、P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256，495(1975)]など、イン・ビトロ(in vitro)で増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については、公知の方法[アンチボディズーア・ラボラトリー・マニュアル(Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 8,1988);に従い、細胞融合時までに2×107個以上の細胞数を確保した。 Hybridomas were prepared by fusing immune cells obtained from the spleen or lymph nodes of immunized Balb / c mice with myeloma cells. Myeloma cells are cell lines derived from mice, 8-azaguanine resistant mice (derived from BALB / c) myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Eur. J. Immunol., 6 , 511 (1976)], SP2 / 0-Ag14 (SP-2) [Nature, 276 , 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunol., 123 , 1548 (1979)], P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256 , 495 (1975)], etc. Any myeloma cells that can proliferate in vitro But you can. For culturing and subculture of these cell lines, according to a known method [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988]; × 10 7 or more cells were secured.

免疫したマウスから得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングリコール−1000(PEG-1000)などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸濁させた。細胞の洗浄には、MEM培地またはPBS(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、NaCl 7.65g、蒸留水１リットル、pH7.2)などを用いた。また、融合細胞を懸濁させる培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、HAT培地［グルタミン(4mM)、15％牛胎児血清(FCS)、ヒポキサンチン(10-4Ｍ)、チミジン(1.5×10-5Ｍ)およびアミノプテリン(4×10-7Ｍ)を含むD-MEM培地］を用いた。 After washing the antibody-producing cells and myeloma cells obtained from the immunized mouse, a cell aggregating medium such as polyethylene glycol-1000 (PEG-1000) was added, the cells were fused, and suspended in the medium. . For washing the cells, MEM medium or PBS (1.83 g disodium phosphate, 0.21 g monopotassium phosphate, 7.65 g NaCl, 1 liter distilled water, pH 7.2) or the like was used. As a medium for suspending fused cells, HAT medium [glutamine (4 mM), 15% fetal calf serum (FCS), hypoxanthine (10 −4 M) is used so that only the desired fused cells can be selectively obtained. ), Thymidine (1.5 × 10 −5 M) and aminopterin (4 × 10 −7 M)].

培養後、培養上清の一部をとり、強制発現細胞による酵素免疫測定法（CELISA）およびFCMにより、抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択した。ついで、限界希釈法によりクローニングを行い、安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択した。   After the culture, a part of the culture supernatant was taken, and a sample that reacted with the antigen protein and did not react with the non-antigen protein was selected by enzyme immunoassay (CELISA) using forced expression cells and FCM. Subsequently, cloning was performed by a limiting dilution method, and a stable and high antibody titer was selected as a monoclonal antibody-producing hybridoma strain.

強制発現を用いた酵素免疫測定法は、次のようにして行った。抗原蛋白質を強制発現した細胞を96ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清を第一抗体として反応させ、第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加した。ここで、第二抗体とは、第一抗体のマウスイムノグロブリンを認識できる抗体であり、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で標識した抗体である。反応後、第二抗体を標識した酵素に応じた蛍光基質を添加し、蛍光測定プレートリーダーで解析した。   The enzyme immunoassay using forced expression was performed as follows. Cells in which the antigen protein was forcibly expressed were coated on a 96-well plate, and the hybridoma culture supernatant was reacted as the first antibody. After the first antibody reaction, the plate was washed and the second antibody was added. Here, the second antibody is an antibody that can recognize mouse immunoglobulin of the first antibody, and is an antibody labeled with horseradish peroxidase (HRP). After the reaction, a fluorescent substrate corresponding to the enzyme labeled with the second antibody was added and analyzed with a fluorescence measuring plate reader.

次に、腹水からのモノクローナル抗体の大量調製を次のようにして実施した。プリスタン0.5mlで前処理したBalb/cマウスに0.5mlのリン酸緩衝生理食塩水、pH7.4中の１〜３×106クローン化ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射した。およそ２週間後に、腹水を集め、モノクローナル抗体をプロテインAまたはプロテインGで親和精製した。 Next, large-scale preparation of monoclonal antibodies from ascites was performed as follows. Balb / c mice pretreated with 0.5 ml pristane were injected intraperitoneally with 1-3 × 10 6 cloned hybridoma cells in 0.5 ml phosphate buffered saline, pH 7.4. Approximately 2 weeks later, ascites was collected and monoclonal antibodies were affinity purified with protein A or protein G.

DNA免疫で樹立した数多くのハイブリドーマ細胞株の中から、ヒトCTGFの天然型高次構造を認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を選抜するために、上記（１）と同様にFCM解析系を用いた。   In order to select a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody that recognizes the natural higher-order structure of human CTGF from a number of hybridoma cell lines established by DNA immunization, the FCM analysis system is used in the same manner as in (1) above. Using.

上記の手法によって作製されたモノクローナル抗体は、以下のとおりである。
Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11ハイブリドーマ由来のclone 30D2；
Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12ハイブリドーマ由来のclone 30E9；
Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m21ハイブリドーマ由来のclone 1；
Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m31ハイブリドーマ由来のclone 22D10；
Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m32ハイブリドーマ由来のclone 21C12；
Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m33ハイブリドーマ由来のclone 21H12；
Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m41ハイブリドーマ由来のclone 8E7。 The monoclonal antibody prepared by the above technique is as follows.
Mouse-Mouse hybridoma clone 30D2 from CTGF-m11 hybridoma;
Mouse-Mouse hybridoma clone 30E9 from CTGF-m12 hybridoma;
Mouse-Mouse hybridoma clone 1 from CTGF-m21 hybridoma;
Mouse-Mouse hybridoma clone 22D10 from CTGF-m31 hybridoma;
Mouse-mouse hybridoma clone 21C12 from CTGF-m32 hybridoma;
Mouse-Mouse hybridoma clone 21H12 from CTGF-m33 hybridoma;
Mouse-Mouse hybridoma clone 8E7 derived from CTGF-m41 hybridoma.

clone 30D2及びclone 30E9はヒトCTGF module 1を特異的に認識するモノクローナル抗体(MAb)、clone 1はヒトCTGF module 2を特異的に認識するMAb、clone 22D10、clone 21C12及びclone 21H12はヒトCTGF module 3を特異的に認識するMAb、clone 8E7はヒトCTGF module 4を特異的に認識するMAbである。   clone 30D2 and clone 30E9 are monoclonal antibodies (MAb) that specifically recognize human CTGF module 1, clone 1 is a MAb that specifically recognizes human CTGF module 2, clone 22D10, clone 21C12 and clone 21H12 are human CTGF module 3 Clone 8E7 that specifically recognizes human CTGF module 4 is a MAb that specifically recognizes human CTGF module 4.

作製されたハイブリドーマのうち、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11(FERM ABP-10454)、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12(FERM ABP-10455)及びMouse-Mouse hybridoma CTGF-m21(FERM ABP-10456)の各ハイブリドーマを、平成17年(2005年)11月25日付けで独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地中央第6）に寄託した。   Among the prepared hybridomas, Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11 (FERM ABP-10454), Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12 (FERM ABP-10455) and Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m21 (FERM ABP-10456) The hybridoma was deposited on November 25, 2005 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (Chuo 6-1, 1-chome East, Tsukuba, Ibaraki, Japan).

さらにまた、上記手法において、通常のマウスに代えてヒト抗体産生トランスジェニックマウスを入手し試験的に使用することによって、天然型ヒトCTGF、そのmodule 1、module 2、module 3,及びmodule 4を特異的に認識することができる完全ヒト抗体を作製することができた。   Furthermore, in the above method, a natural human CTGF, its module 1, module 2, module 3, and module 4 are identified by obtaining a human antibody-producing transgenic mouse instead of a normal mouse and using it experimentally. A fully human antibody that can be recognized automatically.

（３）抗体の特徴分析
作製したハイブリドーマの精製免疫グロブリンの詳細解析のために、エピトープ解析、表面プラズモン共鳴法(SPR)解析、in vivo皮膚線維症に対する抑制効果試験(mouse fibrosis model；T. Moriら, J. Cellular Physiology 18:153-159 (1999))を実施した。 (3) Antibody characterization analysis Purified immunoglobulins of the prepared hybridoma For detailed analysis of immunoglobulin, epitope analysis, surface plasmon resonance (SPR) analysis, in vivo skin fibrosis model (mouse fibrosis model; T. Mori) Et al., J. Cellular Physiology 18: 153-159 (1999)).

エピトープ解析は、module 1, module 2, module 3, module 4遺伝子のいずれかを導入した哺乳細胞を、上記(1)と同様に、5％CO2インキュベータに24時間培養して、同様にFCM解析をすることによって行われた(図２〜図９)。図から明らかなように、5,000倍又は10,000倍希釈であっても各モジュールを特異的に認識する高親和性モノクローナル抗体(IgG1)が得られた。 For epitope analysis, mammalian cells into which any of the module 1, module 2, module 3, and module 4 genes are introduced are cultured in a 5% CO 2 incubator for 24 hours in the same manner as in (1) above, and FCM analysis is performed in the same manner. (FIGS. 2 to 9). As is apparent from the figure, a high affinity monoclonal antibody (IgG1) that specifically recognizes each module was obtained even at 5,000-fold or 10,000-fold dilution.

SPRでは、Biacore社のCM5チップ表面に各々の精製免疫グロブリンを固相化した。各種免疫グロブリンを固相化したCM５チップの流路に、精製した組換えヒトCTGF抗原（哺乳動物細胞HEK293Tから慣用法により作製した天然型高次構造をもつCTGF）を流した。この測定系により非変性ヒトCTGFタンパク質と本発明で作製したモノクローナル抗体との解離定数及び結合定数を測定した。   In SPR, each purified immunoglobulin was immobilized on the surface of a Biacore CM5 chip. Purified recombinant human CTGF antigen (CTGF with a natural higher-order structure prepared from mammalian cells HEK293T by a conventional method) was passed through the flow path of a CM5 chip on which various immunoglobulins were immobilized. With this measurement system, the dissociation constant and the binding constant between the non-denatured human CTGF protein and the monoclonal antibody prepared in the present invention were measured.

測定条件は、以下のとおりである。
測定機器：Biacore 2000（ビアコア社）;
リガンド固相化チップ：CM5センサーチップ;
リガンド（抗体）希釈buffer：10mM酢酸緩衝液(pH5.0)（この緩衝液にてリガンドを最終濃度25μｇ/mlに調整した。）;
Running buffer：HBS-EP buffer (10mM HEPES, pH7.5, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% surfactant P20(Tween 20), pH7.4)。
結果を表１に示す。 The measurement conditions are as follows.
Measuring instrument: Biacore 2000 (Biacore);
Ligand immobilized chip: CM5 sensor chip;
Ligand (antibody) dilution buffer: 10 mM acetate buffer (pH 5.0) (with this buffer the ligand was adjusted to a final concentration of 25 μg / ml);
Running buffer: HBS-EP buffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20 (Tween 20), pH 7.4).
The results are shown in Table 1.

Figure 2009067678
Figure 2009067678

上記の表1から明らかなように、本発明の抗体(MAb)は、形質転換哺乳動物細胞HEK293Tから作製した組換えヒトCTGFを抗原とする結合定数及び解離定数はそれぞれ、1.0×108M-1以上、5.6×10-9 M以下となり、非常に高い親和性を示した。 As is clear from Table 1 above, the antibody (MAb) of the present invention has a binding constant and a dissociation constant of 1.0 × 10 8 M − , respectively, using recombinant human CTGF prepared from transformed mammalian cells HEK293T as an antigen. It was 1 or more and 5.6 × 10 −9 M or less, indicating a very high affinity.

なお、汎用の昆虫（カイコ）細胞で作製した組換えヒトCTGFを抗原として用いて本発明の抗体の結合定数及び解離定数を測定したときには、おそらく糖鎖構造の影響のために、module 1、module 2、module 3及びmodule 4の結合定数は3.0〜8.0×107M-1、解離定数は1.0〜3.2×10-8Mとなり、哺乳動物細胞で作製された組換えヒトCTGFと比べて親和性が低下する傾向を示した。 Note that when the binding constant and dissociation constant of the antibody of the present invention were measured using recombinant human CTGF produced in general-purpose insect (silkworm) cells as an antigen, module 1, module 1 2, The binding constant of module 3 and module 4 is 3.0-8.0 × 10 7 M-1 and the dissociation constant is 1.0-3.2 × 10 −8 M. Compared with recombinant human CTGF prepared in mammalian cells Showed a tendency to decrease.

さらに、本発明の抗体の生物学的活性について調べた。具体的には、皮膚線維症モデルを用いて、本発明抗体による該疾患の抑制効果についてin vivoで試験した。   Furthermore, the biological activity of the antibody of the present invention was examined. Specifically, using a dermatofibrosis model, the inhibitory effect of the disease of the present invention was tested in vivo.

Balb/cマウス（生後7日）にTGFβ3 800ngを３日間皮下注射したのち、CTGF 400ngを4日間皮下注射することによって、皮下組織に線維化を誘導した。   Fibrosis was induced in the subcutaneous tissue by subcutaneously injecting 800 ng of TGFβ3 for 3 days into Balb / c mice (7 days after birth) and then injecting 400 ng of CTGF for 4 days.

本発明の抗体（抗module 2抗体）４μｇをCTGFと混和してすぐに皮下注射した。対照区には、マウスIgGを同量同様に皮下注射した。   4 μg of the antibody of the present invention (anti-module 2 antibody) was mixed with CTGF and immediately injected subcutaneously. In the control group, mouse IgG was injected subcutaneously in the same amount.

非免疫したマウスより得た免疫グロブリン（陰性対照）を投与した対照区と比べ、本発明で得たヒトCTGF抗体はマウスにおいてin vivo皮膚線維症に対する有意の抑制効果を示した（図10及び図11）。すなわち、図10は対照区を示しており、図の中央を横に縦断している川のような部分が線維化した組織を表す。図11に示されるように、本発明の抗体で処理された試験区では、線維化された部分は、対照区と比べて約1/3に大きく減少した。このことから、本発明の抗体は、線維症の抑制のために有効であることが証明された。   The human CTGF antibody obtained in the present invention showed a significant inhibitory effect on in vivo dermal fibrosis in mice as compared with the control group administered with immunoglobulin (negative control) obtained from non-immunized mice (FIGS. 10 and 10). 11). That is, FIG. 10 shows a control plot, and represents a tissue in which a river-like portion that vertically cuts the center of the figure is fibrotic. As shown in FIG. 11, in the test group treated with the antibody of the present invention, the fibrotic portion was greatly reduced to about 1/3 as compared with the control group. From this, it was proved that the antibody of the present invention is effective for suppressing fibrosis.

（比較例１）
ヒトCTGFを組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を用いて発現し、アフィニティカラムによって精製した組換えヒトCTGFを作製した。この組換えCTGFをマウス及びニワトリに免疫した結果、ヒトCTGFに対する抗体は産生されなかった。 (Comparative Example 1)
Human CTGF was expressed using insect cells infected with recombinant baculovirus, and recombinant human CTGF purified by affinity column was prepared. As a result of immunizing mice and chickens with this recombinant CTGF, no antibody against human CTGF was produced.

（比較例２）
ヒトCTGFをコードするDNAを発現可能に含むpcDNA3.1プラスミド(Invitrogen社)由来のVV6発現ベクターを用いてDNA免疫法によるマウスでの抗体作製を試みた。FCSによるマウスの抗血清解析の結果、CTGF抗体の抗体価がかなり低いことが判明した。 (Comparative Example 2)
Antibody production in mice by DNA immunization was attempted using a VV6 expression vector derived from pcDNA3.1 plasmid (Invitrogen) which can express DNA encoding human CTGF. As a result of antiserum analysis of mice by FCS, the antibody titer of CTGF antibody was found to be quite low.

本発明により、従来法では抗体を作り難かった、特殊な構造と粘着性をもつ天然型ヒトCTGFを特異的に認識する抗体（ヒト抗体を含む）が容易に作製することができた。これによって、本発明の抗体は、CTGFが関係する線維症や細胞増殖性疾患などの治療又は診断のために有用である。   According to the present invention, antibodies (including human antibodies) that specifically recognize natural human CTGF having a special structure and adhesiveness, which were difficult to produce with conventional methods, could be easily prepared. Thus, the antibody of the present invention is useful for the treatment or diagnosis of fibrosis or cell proliferative disease related to CTGF.

ヒトCTGFの基本構造を示す。The basic structure of human CTGF is shown. mouse polyclonal anti-CTGFポリクローナル抗体(抗原：全長CTGF)のFCM解析結果を示す。The FCM analysis result of a mouse polyclonal anti-CTGF polyclonal antibody (antigen: full-length CTGF) is shown. Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11由来のモノクローナル抗体clone 30D2のFCM解析結果を示す。The FCM analysis result of monoclonal antibody clone 30D2 derived from Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11 is shown. Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12由来のモノクローナル抗体clone 30E9のFCM解析結果を示す。The FCM analysis result of monoclonal antibody clone 30E9 derived from Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12 is shown. Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m21由来のモノクローナル抗体clone 1のFCM解析結果を示す。The FCM analysis result of monoclonal antibody clone 1 derived from Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m21 is shown. Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m31由来のモノクローナル抗体clone 22D10のFCM解析結果を示す。The FCM analysis result of monoclonal antibody clone 22D10 derived from Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m31 is shown. Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m32由来のモノクローナル抗体clone 21C12のFCM解析結果を示す。The FCM analysis result of monoclonal antibody clone 21C12 derived from Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m32 is shown. Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m33由来のモノクローナル抗体clone 21H12のFCM解析結果を示す。The FCM analysis result of monoclonal antibody clone 21H12 derived from Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m33 is shown. Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m41由来のモノクローナル抗体clone 8E7のFCM解析結果を示す。The FCM analysis result of monoclonal antibody clone 8E7 derived from Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m41 is shown. Balb/cマウス（生後7日）のin vivo皮膚線維症に対する抑制効果試験における、非免疫マウス由来の免疫グロブリン（陰性対照）を投与した対照区を示す。The control group which administered the immunoglobulin (negative control) derived from a non-immune mouse | mouth in the inhibitory effect test with respect to the in vivo skin fibrosis of a Balb / c mouse (7 days after birth) is shown. Balb/cマウス（生後7日）のin vivo皮膚線維症に対する抑制効果試験における、本発明の抗体を投与した試験区を示す。The test plot which administered the antibody of this invention in the inhibitory effect test with respect to the in vivo skin fibrosis of a Balb / c mouse (7 days after birth) is shown.

Claims (45)

結合組織増殖因子（CTGF）を特異的に認識することができる、DNA免疫によって作製された抗体又はその断片。   An antibody produced by DNA immunization or a fragment thereof capable of specifically recognizing connective tissue growth factor (CTGF). 前記CTGFがヒトCTGFである、請求項１記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof according to claim 1, wherein the CTGF is human CTGF. 前記抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項１又は２記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof according to claim 1 or 2, wherein the antibody is a human antibody or a humanized antibody. 前記CTGF分子の天然型高次構造を特異的に認識することができる、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof according to any one of claims 1 to 3, which can specifically recognize a natural higher-order structure of the CTGF molecule. 前記DNA免疫が、前記CTGFをコードするDNA又はその機能性断片を発現可能に含む発現ベクターを非ヒト動物に免疫することを含むものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体又はその断片。   The antibody according to any one of claims 1 to 4, wherein the DNA immunization comprises immunizing a non-human animal with an expression vector that can express the DNA encoding CTGF or a functional fragment thereof. fragment. 前記ベクターが分泌シグナルペプチドをコードするDNAをさらに含む、請求項５記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof according to claim 5, wherein the vector further comprises DNA encoding a secretory signal peptide. 前記ベクターが局在シグナル及び免疫増強シグナルを含むペプチドをコードするDNAをさらに含む、請求項５又は６記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof according to claim 5 or 6, wherein the vector further comprises DNA encoding a peptide comprising a localization signal and an immune enhancement signal. 前記機能性断片が、前記CTGFのモジュールをコードするDNAである、請求項５〜７のいずれか１項記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof according to any one of claims 5 to 7, wherein the functional fragment is DNA encoding the CTGF module. 前記CTGFをコードするDNA又はその機能性断片が、配列番号２、４、６、８又は10によって示される塩基配列を含む、請求項５〜８のいずれか１項記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof according to any one of claims 5 to 8, wherein the DNA encoding CTGF or a functional fragment thereof comprises a base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10. 前記動物が哺乳動物である、請求項５記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof according to claim 5, wherein the animal is a mammal. 前記哺乳動物がマウスである、請求項10記載の抗体又はその断片。   11. The antibody or fragment thereof according to claim 10, wherein the mammal is a mouse. 前記マウスがヒト抗体産生トランスジェニックマウスである、請求項11記載の抗体又はその断片。   12. The antibody or fragment thereof according to claim 11, wherein the mouse is a human antibody-producing transgenic mouse. 前記ヒトCTGFのモジュール１、モジュール２、モジュール３又はモジュール４のいずれか１つを特異的に認識することができる、請求項１〜12のいずれか１項記載の抗体又はその断片。   The antibody or fragment thereof according to any one of claims 1 to 12, which can specifically recognize any one of module 1, module 2, module 3 or module 4 of the human CTGF. 前記抗体が、前記CTGFに対する結合定数(KA)3.0×107M-1以上及び/又は解離定数(KD)5.6×10-9M以下を有する、請求項１〜13のいずれか１項記載の抗体又はその断片。 14. The antibody according to claim 1, wherein the antibody has a binding constant (KA) of 3.0 × 10 7 M −1 or more and / or a dissociation constant (KD) of 5.6 × 10 −9 M or less to the CTGF. An antibody or fragment thereof. 請求項１〜14のいずれか１項記載の抗体又はその断片を含む医薬組成物。   A pharmaceutical composition comprising the antibody or fragment thereof according to any one of claims 1 to 14. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項15記載の医薬組成物。   16. The pharmaceutical composition according to claim 15, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 前記抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項15又は16記載の医薬組成物。   17. The pharmaceutical composition according to claim 15 or 16, wherein the antibody is a human antibody or a humanized antibody. 前記抗体が治療用薬剤と結合されている、請求項15〜17のいずれか１項記載の医薬組成物。   18. A pharmaceutical composition according to any one of claims 15 to 17, wherein the antibody is conjugated to a therapeutic agent. 線維症又は線維化に伴う硬化症、或いは細胞増殖性疾患の治療又は予防用である、請求項15〜18のいずれか１項記載の医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to any one of claims 15 to 18, which is used for treatment or prevention of fibrosis or sclerosis associated with fibrosis, or a cell proliferative disease. 前記線維症又は線維化に伴う硬化症が、腎線維症、肺線維症、肝線維症又は強皮症である、請求項19記載の医薬組成物。   20. The pharmaceutical composition according to claim 19, wherein the fibrosis or sclerosis associated with fibrosis is renal fibrosis, pulmonary fibrosis, liver fibrosis or scleroderma. 前記細胞増殖性疾患が癌である、請求項19記載の医薬組成物。   20. The pharmaceutical composition according to claim 19, wherein the cell proliferative disorder is cancer. 請求項１〜14のいずれか１項記載の抗体又はその断片を含む診断用組成物。   A diagnostic composition comprising the antibody or fragment thereof according to any one of claims 1 to 14. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項22記載の診断用組成物。   23. The diagnostic composition according to claim 22, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 線維症又は線維化に伴う硬化症、或いは細胞増殖性疾患の診断用である、請求項22又は23記載の診断用組成物。   24. The diagnostic composition according to claim 22 or 23, which is used for diagnosis of fibrosis or sclerosis associated with fibrosis, or a cell proliferative disease. 前記線維症又は線維化に伴う硬化症が、腎線維症、肺線維症、肝線維症又は強皮症である、請求項24記載の診断用組成物。   25. The diagnostic composition according to claim 24, wherein the fibrosis or sclerosis associated with fibrosis is renal fibrosis, pulmonary fibrosis, liver fibrosis or scleroderma. 前記細胞増殖性疾患が癌である、請求項24記載の診断用組成物。   25. The diagnostic composition according to claim 24, wherein the cell proliferative disease is cancer. 前記抗体が、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11(FERM ABP-10454)、Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12(FERM ABP-10455)又はMouse-Mouse hybridoma CTGF-m21(FERM ABP-10456)のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体である、請求項22〜26のいずれか１項記載の診断用組成物。   The antibody is a monoclonal derived from a hybridoma of Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11 (FERM ABP-10454), Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12 (FERM ABP-10455) or Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m21 (FERM ABP-10456). 27. The diagnostic composition according to any one of claims 22 to 26, which is an antibody. Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m11(FERM ABP-10454)のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体。   Mouse-Mouse hybridoma Monoclonal antibody derived from CTGF-m11 (FERM ABP-10454) hybridoma. Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12(FERM ABP-10455) のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体。   Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m12 (FERM ABP-10455) hybridoma-derived monoclonal antibody. Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m21(FERM ABP-10456) のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体。   Mouse-Mouse hybridoma CTGF-m21 (FERM ABP-10456) hybridoma-derived monoclonal antibody. CTGFをコードするDNA又はその機能性断片を発現可能に含む発現ベクターを非ヒト動物に免疫し、該CTGFを認識する抗体を含む体液、或いは該抗体を産生する細胞、を取り出し、該CTGFを認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体を得ることを含む、請求項１〜14のいずれか１項記載の抗体又はその断片の作製方法。   Immunize a non-human animal with an expression vector that can express the CTGF-encoding DNA or functional fragment thereof, extract a body fluid containing the antibody that recognizes the CTGF, or a cell that produces the antibody, and recognize the CTGF 15. A method for producing an antibody or a fragment thereof according to any one of claims 1 to 14, comprising obtaining a polyclonal or monoclonal antibody. 前記CTGFがヒトCTGFである、請求項31記載の方法。   32. The method of claim 31, wherein the CTGF is human CTGF. 前記非ヒト動物が哺乳動物である、請求項31記載の方法。   32. The method of claim 31, wherein the non-human animal is a mammal. 前記哺乳動物がげっ歯類又は有蹄類である、請求項33記載の方法。   34. The method of claim 33, wherein the mammal is a rodent or ungulate. 前記げっ歯類がマウスである、請求項34記載の方法。   35. The method of claim 34, wherein the rodent is a mouse. 前記マウスがヒト抗体産生トランスジェニックマウスである、請求項35記載の方法。   36. The method of claim 35, wherein the mouse is a human antibody-producing transgenic mouse. 前記ベクターが分泌シグナルペプチドをコードするDNAをさらに含む、請求項31〜36のいずれか1項記載の方法。   37. The method of any one of claims 31 to 36, wherein the vector further comprises DNA encoding a secretory signal peptide. 前記ベクターが局在シグナル及び免疫増強シグナルを含むペプチドをコードするDNAをさらに含む、請求項31〜37のいずれか1項記載の方法。   38. The method of any one of claims 31 to 37, wherein the vector further comprises DNA encoding a peptide comprising a localization signal and an immune enhancement signal. 前記抗体を産生する細胞が、脾臓細胞、Ｂ細胞又はリンパ細胞である、請求項31記載の方法。   32. The method of claim 31, wherein the antibody producing cell is a spleen cell, B cell or lymphocyte. 前記有蹄類がウシである、請求項34記載の方法。   35. The method of claim 34, wherein the ungulate is a cow. 前記体液が血清又は乳汁である、請求項31記載の方法。   32. The method of claim 31, wherein the body fluid is serum or milk. 前記抗体を産生する細胞を骨髄腫細胞と融合しハイブリドーマを形成することをさらに含む、請求項31〜41のいずれか１項記載の方法。   42. The method of any one of claims 31 to 41, further comprising fusing the antibody producing cell with a myeloma cell to form a hybridoma. 前記ポリクローナル又はモノクローナル抗体が、前記CTGFに対する結合定数(KA)3.0×107M-1以上及び/又は解離定数(KD)5.6×10-9M以下を有する、請求項31〜42のいずれか１項記載の方法。 43. Any one of claims 31 to 42, wherein the polyclonal or monoclonal antibody has a binding constant (KA) of 3.0 × 10 7 M −1 or more and / or a dissociation constant (KD) of 5.6 × 10 −9 M or less to the CTGF. The method described in the paragraph. 前記機能性断片が、CTGFのモジュールをコードするDNAである、請求項31記載の方法。   32. The method of claim 31, wherein the functional fragment is DNA encoding a CTGF module. 前記抗体を産生する細胞或いは前記ハイブリドーマをフローサイトメトリーにて選抜することをさらに含む、請求項31〜44のいずれか１項記載の方法。   45. The method according to any one of claims 31 to 44, further comprising selecting the antibody-producing cell or the hybridoma by flow cytometry.
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