JP2009060859A - Method for detecting gene - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、基板を使用した遺伝子の検出方法に関するものである。 The present invention relates to a gene detection method using a substrate.
近年、遺伝子の特異的ＤＮＡ配列を基板上に高密度に配置した「ＤＮＡチップ」を用いた遺伝子検出が盛んに行われており、疾患関連遺伝子の探索や迅速な臨床診断などの分野における実用化が進んでいる。 In recent years, gene detection using a “DNA chip” in which a specific DNA sequence of a gene is arranged at high density on a substrate has been actively performed, and it has been put into practical use in fields such as searching for disease-related genes and rapid clinical diagnosis. Is progressing.
また、サンプルの前処理から測定・検出までを1チップ上で行うことを目的としたμ-ＴＡＳ（Micro−Total Analysis System）やラボオンチップなど各種のバイオチップも出現しており、これらチップ上で核酸を迅速かつ高感度に解析するためには、検出にかかる技術が重要な要素を占めている（非特許文献１参照）。 In addition, various biochips such as μ-TAS (Micro-Total Analysis System) and lab-on-chip, which aim to perform from sample pretreatment to measurement / detection on one chip, have appeared. In order to analyze nucleic acids quickly and with high sensitivity, detection techniques occupy an important element (see Non-Patent Document 1).
ＤＮＡチップは、プローブＤＮＡが配置されている基板に検体を作用させＤＮＡ検出を行うものが一般的に知られている。検体に存在する標的ＤＮＡは通常微量であるため、この方法を用いる場合、ＰＣＲ法等を利用して標的ＤＮＡを増幅する必要がある。 A DNA chip is generally known that performs DNA detection by acting a sample on a substrate on which a probe DNA is arranged. Since the target DNA present in the specimen is usually a very small amount, when this method is used, it is necessary to amplify the target DNA using the PCR method or the like.
ＰＣＲ法は一般に、標的ＤＮＡ配列を含む2本鎖ＤＮＡを1本鎖ＤＮＡに変性させる反応、解離した1本鎖ＤＮＡにプライマーをアニーリングさせる反応、1本鎖ＤＮＡに結合したプライマーを基点としたＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応、の3段階の反応から成り、それぞれの反応に適した温度、例えば、94℃→50℃→72℃といった温度サイクルを繰り返し行うことでなされる。 In general, PCR is a reaction in which double-stranded DNA containing a target DNA sequence is denatured into single-stranded DNA, a reaction in which a primer is annealed to dissociated single-stranded DNA, or DNA based on a primer bound to single-stranded DNA. It consists of a three-stage reaction of a DNA extension reaction by polymerase, and is performed by repeatedly performing a temperature suitable for each reaction, for example, 94 ° C. → 50 ° C. → 72 ° C.
このＰＣＲ法は、従来、コンピュータ制御能を有する自動化した温度変換装置（サーマルサイクラー）を用いて実施されている。このようなサーマルサイクラーは、反応容器を収容できる凹部を有する1つの金属製ブロックの温度を制御することで収容されている反応容器内の溶液の温度を調整する仕組みとなっている。この方法の場合、各温度変化に数十秒程度を要し、ＰＣＲ法全体では通常６０分から９０分の時間を要する。 This PCR method is conventionally performed using an automated temperature converter (thermal cycler) having computer controllability. Such a thermal cycler has a mechanism for adjusting the temperature of the solution in the reaction vessel accommodated by controlling the temperature of one metal block having a recess capable of accommodating the reaction vessel. In this method, several tens of seconds are required for each temperature change, and the entire PCR method usually requires 60 to 90 minutes.
広く一般に使用されている方法ではないが、予め必要な温度に設定された複数の金属ブロックに反応容器を繰り返し接触させることで、反応に必要な温度に達するまでの時間を短縮する方法も考案されている（特許文献1参照）。 Although it is not a widely used method, a method has been devised to shorten the time required to reach the temperature required for the reaction by repeatedly contacting the reaction vessel with a plurality of metal blocks that have been set to the required temperature in advance. (See Patent Document 1).
従来のＤＮＡチップは予め前記ＰＣＲ法等により標的ＤＮＡを増幅する必要があり、その後、増幅した標的ＤＮＡと基板に固定化されたＤＮＡプローブをハイブリダイゼーションする事で検出が行われる。ハイブリダイゼーション反応には一晩かかる場合もある。また、ＤＮＡ増幅を行う部分とその反応産物を用いた検出を行う部分とがそれぞれ独立していることにより、作業が煩雑になり試料へのコンタミネーションの危険性も上がる。よって、反応から検出までをより簡略化する必要がある。 The conventional DNA chip needs to amplify the target DNA in advance by the PCR method or the like, and then the detection is performed by hybridizing the amplified target DNA and the DNA probe immobilized on the substrate. The hybridization reaction may take overnight. In addition, since the part that performs DNA amplification and the part that performs detection using the reaction product are independent of each other, the operation becomes complicated and the risk of contamination to the sample increases. Therefore, it is necessary to further simplify from reaction to detection.
さらに、ＤＮＡの検出方法も簡便であることが重要である。従来の装置をそのまま使用可能、あるいは装置を全く必要としない可視による検出が行えることが望ましい。 Furthermore, it is important that the DNA detection method is simple. It is desirable that a conventional apparatus can be used as it is, or that visual detection can be performed without requiring any apparatus.
本発明の目的は、従来法よりも圧倒的に短時間に、且つ、簡便な操作で成される遺伝子の検出方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method for detecting a gene that is performed in an overwhelmingly shorter time and with a simple operation than the conventional method.
本発明は、以下の通りである。
（１）基板を使用して検体中の遺伝子を検出する方法であって、
（１）基板の表面に、オリゴＤＮＡプライマーを固定化する工程、
（２）前記基板上に検体、ＰＣＲ用プライマーセット、ヌクレオチド単体、及びＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を供給する工程、
（３）所定の熱サイクルを前記基板に加える工程、
（４）前記オリゴＤＮＡプライマーの伸長を検出する工程、
を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
（２）（３）の工程において、溶液相での遺伝子の増幅、及び基板上での固相プライマーの伸長反応が進行するものである（１）記載の遺伝子の検出方法。
（３）前記基板がプラスチック材料からなるものである（１）又は（２）記載の遺伝子の検出方法。
（４）前記基板の表面にホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有している（１）〜（３）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
（５）前記高分子物質が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基を有する第二単量体と、ブチルメタクリレート基を有する第三単量体との共重合体である（４）記載の遺伝子の検出方法。
（６）（１）の工程において、前記オリゴＤＮＡプライマーを５‘末端側で固定化する（１）〜（５）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
（７）前記基板の表面に開口する凹部を少なくとも１つ以上有し、前記凹部の底部の上面が平面形状であり、前記凹部の底部上面にオリゴＤＮＡプライマーを固定化する（１）〜（６）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
（８）前記凹部の底部の厚みが０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍである（７）記載の遺伝子の検出方法。
（９）（３）の工程において、前記凹部の開口部に蓋を施すことで封止する（７）又は（８）記載の遺伝子の検出方法。
（１０）前記蓋の厚みが０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍである（９）記載の遺伝子の検出方法。
（１１）（３）の工程において、所定温度のヒートブロックに基板を接触させる（１）〜（１０）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
（１２）基板の上下面の両方に所定温度のヒートブロックを接触させる（１１）記載の遺伝子の検出方法。
（１３）（３）の工程において、所定の温度に各々調製された複数のヒートブロックに所定の順番で接触させることにより、熱サイクルを加える（１）〜（１２）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
（１４）前記ヌクレオチド単体に標識されたヌクレオチド単体が含まれている（１）〜（１３）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
（１５）前記標識が蛍光基、ビオチン、又は酵素である（１４）記載の遺伝子の検出方法。
（１６）（４）の工程において、検出方法が発色測定、蛍光測定、又は目視によるものである（１）〜（１５）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
The present invention is as follows.
(1) A method for detecting a gene in a specimen using a substrate,
(1) a step of immobilizing an oligo DNA primer on the surface of the substrate;
(2) supplying a sample, a primer set for PCR, a nucleotide alone, and a solution containing a DNA extending enzyme onto the substrate;
(3) applying a predetermined thermal cycle to the substrate;
(4) detecting the extension of the oligo DNA primer,
A method for detecting a gene comprising:
(2) The method for detecting a gene according to (1), wherein in the step (3), amplification of the gene in the solution phase and extension reaction of the solid phase primer on the substrate proceed.
(3) The gene detection method according to (1) or (2), wherein the substrate is made of a plastic material.
(4) A polymer material including a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid derivative group in which an electron-withdrawing substituent is bonded to a carbonyl group is provided on the surface of the substrate. (1) The detection method of the gene in any one of (3).
(5) The polymer substance has a first monomer having a 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine group, a second monomer having a p-nitrophenyloxycarbonyl polyethylene glycol methacrylate group, and a second monomer having a butyl methacrylate group. The method for detecting a gene according to (4), which is a copolymer with three monomers.
(6) The method for detecting a gene according to any one of (1) to (5), wherein in the step (1), the oligo DNA primer is immobilized on the 5 ′ end side.
(7) It has at least one recess opening on the surface of the substrate, the top surface of the bottom of the recess has a planar shape, and the oligo DNA primer is immobilized on the top surface of the bottom of the recess (1) to (6 ) A method for detecting a gene according to any one of the above.
(8) The method for detecting a gene according to (7), wherein the thickness of the bottom of the recess is 0.05 mm to 0.5 mm.
(9) The method for detecting a gene according to (7) or (8), wherein in the step (3), the opening of the concave portion is sealed by applying a lid.
(10) The method for detecting a gene according to (9), wherein the lid has a thickness of 0.05 mm to 0.5 mm.
(11) The method for detecting a gene according to any one of (1) to (10), wherein in the step (3), the substrate is brought into contact with a heat block having a predetermined temperature.
(12) The method for detecting a gene according to (11), wherein a heat block having a predetermined temperature is brought into contact with both the upper and lower surfaces of the substrate.
(13) In the step of (3), a thermal cycle is applied by bringing a plurality of heat blocks each prepared at a predetermined temperature into contact with each other in a predetermined order, and the gene detection according to any one of (1) to (12) Method.
(14) The method for detecting a gene according to any one of (1) to (13), wherein the nucleotide simple substance includes a labeled nucleotide simple substance.
(15) The method for detecting a gene according to (14), wherein the label is a fluorescent group, biotin, or an enzyme.
(16) The method for detecting a gene according to any one of (1) to (15), wherein in the step (4), the detection method is color development measurement, fluorescence measurement, or visual observation.
本発明の検出方法によれば、ＤＮＡ増幅反応等の酵素反応および反応で得られた物質の検出をワンポットで行うことができ、従来法より短時間に、また簡便な操作で検出が可能となる。反応から検出までにかかる時間は、従来の１０分の１程度まで短縮することが可能である。 According to the detection method of the present invention, an enzyme reaction such as a DNA amplification reaction and the substance obtained by the reaction can be detected in one pot, and the detection can be performed in a shorter time and with a simple operation than the conventional method. . The time taken from the reaction to the detection can be reduced to about 1/10 of the conventional time.
本発明は、基板を使用して検体中の遺伝子を検出する方法であって、（１）基板の表面に、オリゴＤＮＡプライマーを固定化する工程、（２）前記基板上に検体、ＰＣＲ用プライマーセット、ヌクレオチド単体、及びＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を供給する工程、（３）所定の熱サイクルを前記基板に加える工程、（４）前記オリゴＤＮＡプライマーの伸長を検出する工程、を含む遺伝子の検出方法である。 The present invention is a method for detecting a gene in a specimen using a substrate, (1) a step of immobilizing an oligo DNA primer on the surface of the substrate, (2) a specimen, a PCR primer on the substrate Detecting a gene comprising: a step of supplying a solution containing a set, a single nucleotide, and a DNA extension enzyme; (3) a step of applying a predetermined thermal cycle to the substrate; and (4) a step of detecting extension of the oligo DNA primer. Is the method.
本発明に使用する基板は、反応系に悪影響を及ぼさない材質であれば良い。基板の素材としてガラスを用いても良い。しかし、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。 The substrate used in the present invention may be any material that does not adversely affect the reaction system. Glass may be used as the substrate material. However, the use of a plastic material is preferable from the viewpoint of ensuring flexibility in changing the shape and size and providing it at a lower cost than that of a glass substrate. As such a plastic material, a thermoplastic resin can be used from the viewpoint of easy surface treatment and mass productivity.
また、反応検出方法によっても好ましい材質が異なってくる。基板下方より光学検出する場合は透明性が高い方が望ましく、例えば、PC（ポリカーボネート）、ＰＰ（ポリピロピレン）、シクロオレフィン系ポリマーなどの透明樹脂を用いることができる。さらに、蛍光を検出する場合は自家蛍光の小さい材質の基板が好ましく、例えば、シクロオレフィン系ポリマーなどを用いることができる。
また、例えばＰＣＲ法のような１００℃程度の熱を必要とする反応に用いるために、基板は１００℃以上の熱に耐えられる材質であることが好ましい。
透明性、耐熱性、耐薬品性や反応系に対する影響などの点から環状オレフィン系樹脂やメチルペンテン系樹脂を用いることが好ましい。
Moreover, a preferable material changes with reaction detection methods. When optical detection is performed from below the substrate, higher transparency is desirable. For example, a transparent resin such as PC (polycarbonate), PP (polypropylene), or cycloolefin-based polymer can be used. Furthermore, in the case of detecting fluorescence, a substrate made of a material having low autofluorescence is preferable. For example, a cycloolefin polymer or the like can be used.
In addition, the substrate is preferably made of a material that can withstand heat of 100 ° C. or higher, for use in a reaction that requires heat of about 100 ° C., such as PCR.
From the viewpoints of transparency, heat resistance, chemical resistance and influence on the reaction system, it is preferable to use a cyclic olefin resin or a methylpentene resin.
本発明に用いる基板の形状は限定されるものではないが、市販されている蛍光スキャナーで容易に読み取ることができるスライド板形状（２５ｍｍ±５ｍｍ×７５ｍｍ±５ｍｍ程度の寸法）が好ましい。 The shape of the substrate used in the present invention is not limited, but a slide plate shape (dimension of about 25 mm ± 5 mm × 75 mm ± 5 mm) that can be easily read by a commercially available fluorescent scanner is preferable.
本発明に使用する基板には、基板の表面に開口する凹部を少なくとも１つ以上有し、凹部の底部の上面が平面形状であることが好ましい。この凹部の底部上面にオリゴＤＮＡプライマーを固定化することができる。 It is preferable that the substrate used in the present invention has at least one recess opening on the surface of the substrate, and the upper surface of the bottom of the recess has a planar shape. An oligo DNA primer can be immobilized on the upper surface of the bottom of the recess.
本発明における基板の一実施形態を図１に示す。図１は、略長方形の板状の基板２に、試料および試薬を反応させるための凹部３が複数形成されている。
One embodiment of the substrate in the present invention is shown in FIG. In FIG. 1, a plurality of recesses 3 for reacting a sample and a reagent are formed on a substantially rectangular plate-
凹部の底部４の厚みは、（ｉ）熱伝導性が良い、（ｉｉ）凹部底部の上面に固定された蛍光をウェル下方から読み取れる、（ｉｉｉ）底部のゆがみがない、の条件を満たす厚みが望ましい。
このような条件を満たす基板として凹部の底部４の厚みが０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍのものが好ましい。より好ましくは、０．０５ｍｍ〜０．３ｍｍであり、更に好ましくは０．０５ｍｍ〜０．２ｍｍである。厚みが上限値を超えると熱伝導性が悪くなる恐れがあり、下限値未満では底部にゆがみを生じる恐れがある。
The thickness of the bottom 4 of the recess is such that (i) good thermal conductivity, (ii) the fluorescence fixed to the upper surface of the recess bottom can be read from below the well, and (iii) there is no distortion of the bottom. desirable.
A substrate satisfying such conditions preferably has a thickness of the bottom 4 of the recess of 0.05 mm to 0.5 mm. More preferably, it is 0.05 mm-0.3 mm, More preferably, it is 0.05 mm-0.2 mm. If the thickness exceeds the upper limit, the thermal conductivity may be deteriorated, and if it is less than the lower limit, the bottom may be distorted.
基板２の厚みは市販されている検出器で使用できる厚みが好ましく、０．５〜３ mmのものが最も好ましい。
The thickness of the
基板に占める凹部３の割合は、市販の検出器で用いた際ゆがみが生じない程度が好ましく、凹部が基板２の体積に対し０．１〜５０％の空隙を占めるものが最も好ましい。
The proportion of the recesses 3 in the substrate is preferably such that the distortion does not occur when used with a commercially available detector, and the recesses most preferably occupy 0.1 to 50% of the void relative to the volume of the
凹部の形状は円柱形でも多角柱形でも良く特に限定されるものではないが、凹部の開口部から底面まで壁面が傾斜している形状であることが好ましい（図２参照）。 The shape of the recess may be cylindrical or polygonal, and is not particularly limited, but is preferably a shape in which the wall surface is inclined from the opening to the bottom of the recess (see FIG. 2).
凹部の底部上面を表面処理することにより、任意のオリゴＤＮＡプライマーを固定できるようにする必要がある。その一例として、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に塗布する処理方法が挙げられる。 It is necessary to fix an arbitrary oligo DNA primer by surface-treating the bottom upper surface of the recess. As an example, there is a treatment method for coating a surface with a polymer substance containing a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid derivative group in which an electron-withdrawing substituent is bonded to a carbonyl group. Can be mentioned.
表面処理に使用される高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基を有する第二単量体と、ブチルメタクリレート基を有する第三単量体との共重合体等が挙げられる。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の基板表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
この処理を施すことにより、任意のオリゴＤＮＡプライマーをアミド結合等により凹部の底部上面に固定することが可能となる。また、底部上面の親水性も上がり余分な生理活性物質の非特異的吸着を低減できる。
The polymer substance used for the surface treatment may contain other groups in addition to the phosphorylcholine group and the carboxylic acid derivative group. The polymer substance can be a copolymer. Specifically, the polymer substance is preferably a copolymer containing a butyl methacrylate group. For example, a first monomer having a 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine group, a second monomer having a p-nitrophenyloxycarbonyl polyethylene glycol methacrylate group, and a third monomer having a butyl methacrylate group may be used. A polymer etc. are mentioned. By so doing, the polymer substance can be appropriately hydrophobized, and the adsorptivity of the polymer substance to the substrate surface can be more suitably ensured.
By performing this treatment, it is possible to fix an arbitrary oligo DNA primer on the upper surface of the bottom of the recess by an amide bond or the like. In addition, the hydrophilicity of the upper surface of the bottom is increased, and non-specific adsorption of excess physiologically active substance can be reduced.
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。 The substrate including the coating layer made of the polymer material as described above can be obtained by applying a liquid containing the polymer material to the surface of the substrate processed into a predetermined shape and drying it. Alternatively, the substrate may be immersed in a liquid containing a polymer substance and dried.
また、プラズマ処理やその他の活性基を持ったポリマーの塗布などの表面処理を施すことにより任意のオリゴＤＮＡプライマーを固定しても良い。 In addition, an arbitrary oligo DNA primer may be fixed by performing a surface treatment such as plasma treatment or application of a polymer having other active groups.
次に、基板の凹部の底部上面へのオリゴＤＮＡ（オリゴＤＮＡプライマー）の固定化方法について説明する。例えば、（ｉ）基板上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とオリゴＤＮＡとを反応させて共有結合を形成させることにより、基板表面でオリゴＤＮＡを固定化し、続いて（ｉｉ）オリゴＤＮＡを固定化した以外の基板表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、オリゴＤＮＡのみを表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。 Next, a method for immobilizing oligo DNA (oligo DNA primer) to the upper surface of the bottom of the concave portion of the substrate will be described. For example, (i) among a plurality of active ester groups contained in a polymer substance on a substrate, at least some of the active ester groups react with oligo DNA to form a covalent bond, thereby forming oligo DNA on the substrate surface. And then (ii) inactivate the active ester groups on the substrate surface other than the oligo DNA immobilized, that is, inactivate the remaining active ester groups, thereby immobilizing only the oligo DNA on the surface. can do. Hereinafter, each process will be described.
上記工程（ｉ）において、オリゴＤＮＡを溶解または分散した液体を基板の凹部の底部上面に点着する、あるいは、凹部をその液体で満たす方法が好ましい。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がオリゴＤＮＡと反応して共有結合が形成される。 In the step (i), a method in which a liquid in which oligo DNA is dissolved or dispersed is spotted on the upper surface of the bottom of the concave portion of the substrate or the concave portion is filled with the liquid is preferable. A part of the active ester group contained in the polymer substance reacts with the oligo DNA to form a covalent bond.
このオリゴＤＮＡを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。 The liquid in which the oligo DNA is dissolved or dispersed can be neutral to alkaline, for example, pH 7.6 or higher.
また、点着後、基板表面に固定化されなかったオリゴＤＮＡを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。 In addition, after the spotting, in order to remove the oligo DNA not immobilized on the substrate surface, it may be washed with pure water or a buffer solution.
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はオリゴＤＮＡを固定化した以外の表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。 In addition, as shown in the above step (ii), after the washing, the surface of the active ester other than the oligo DNA immobilized thereon is inactivated with an alkali compound or a compound having a primary amino group.
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。 Examples of the alkali compound include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium bicarbonate, disodium hydrogen phosphate, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, sodium borate, lithium hydroxide, and potassium phosphate. it can.
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。 Examples of the compound having a primary amino group include glycine, 9-amino aquadine, aminobutanol, 4-aminobutyric acid, aminocaprylic acid, aminoethanol, 5-amino2,3-dihydro-1,4-pentanol, aminoethanethiol Hydrochloride, aminoethanethiolsulfuric acid, 2- (2-aminoethylamino) ethanol, 2-aminoethyl dihydrogen phosphate, aminoethyl hydrogensulfate, 4- (2-aminoethyl) morpholine, 5-aminofluorescein, 6- Aminohexanoic acid, aminohexyl cellulose, p-aminohippuric acid, 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, 5-aminoisophthalic acid, aminomethane, aminophenol, 2-aminooctane, 2-amino Octanoic acid, 1-amino-2-propanol, 3-amino-1-propyl Lopanol, 3-aminopropene, 3-aminopropionitrile, aminopyridine, 11-aminoundecanoic acid, aminosalicylic acid, aminoquinoline, 4-aminophthalonitrile, 3-aminophthalimide, p-aminopropiophenone, aminophenylacetic acid , Aminonaphthalene and the like can be used. Of these, aminoethanol and glycine are preferably used.
また、基板に固定化するオリゴＤＮＡには、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたオリゴＤＮＡを用いることにより、効率よくかつ強固に担体の表面上にオリゴＤＮＡを固定化することができる。アミノ基の導入位置はオリゴＤＮＡの３´末端あるいは５´末端どちらであってもよいが、５‘末端側に導入して基板と固定化することが好ましい。 Moreover, it is preferable to introduce an amino group into the oligo DNA immobilized on the substrate in order to increase the reactivity with the active ester group. Since the amino group is excellent in reactivity with the active ester group, the oligo DNA can be efficiently and firmly immobilized on the surface of the carrier by using the oligo DNA into which the amino group has been introduced. The amino group may be introduced at the 3 ′ end or the 5 ′ end of the oligo DNA, but it is preferably introduced at the 5 ′ end side and immobilized on the substrate.
以上により、基板の凹部の底部上面にオリゴＤＮＡが固定化された反応チップ用基板が得られる。 Thus, a reaction chip substrate having oligo DNA immobilized on the upper surface of the bottom of the concave portion of the substrate is obtained.
又、基板の凹部の底部上面に複数種類のプローブＤＮＡを点着により固定化することによって、一度に多検体の検出を行うことができる。 Also, multiple samples can be detected at once by immobilizing a plurality of types of probe DNAs by spotting on the upper surface of the bottom of the concave portion of the substrate.
本発明の遺伝子検出方法において、上記オリゴＤＮＡプライマーを固定化した基板の凹部に遺伝子を含む検体、ＰＣＲ用プライマーセット、ヌクレオチド単体、及びＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を供給する。 In the gene detection method of the present invention, a sample containing a gene, a PCR primer set, a nucleotide alone, and a solution containing a DNA extension enzyme are supplied to the recess of the substrate on which the oligo DNA primer is immobilized.
ＰＣＲ用プライマーセットは、フォワードプライマー、リバースプライマーを含むもので、検体中の遺伝子の増幅（ＰＣＲ）に使用される。 The PCR primer set includes a forward primer and a reverse primer, and is used for amplification (PCR) of a gene in a specimen.
ヌクレオチド単体に標識されたヌクレオチド単体が含まれていることが好ましい。標識としては蛍光基、ビオチン、酵素等が挙げられる。これよって、伸長したオリゴＤＮＡプライマーが発色測定、蛍光測定、目視等により検出できる。 It is preferable that the nucleotide simple substance labeled with the nucleotide simple substance is contained. Examples of the label include a fluorescent group, biotin and an enzyme. Accordingly, the extended oligo DNA primer can be detected by color development measurement, fluorescence measurement, visual observation, or the like.
検体を含む溶液を供給した後、所定の熱サイクルを基板全体に加える。この際に、凹部を形成した基板を用いる場合は、凹部の封止のために蓋に用いることが好ましい。蓋の材質は反応系に悪影響を及ぼさないものであれば良い。また、適用する反応に際して与えられる温度で変形や不純物溶出等を生じない程度の耐熱性および耐薬品性等を有するものであればよい。しかし、熱伝導性を向上させるために薄いシートの方が好ましい。厚みは、好ましくは０．０５〜０．５ｍｍであり、更に好ましくは０．０５〜０．２ｍｍである。また、反応検出方法によって好ましい材質が異なってくる。凹部の開口部から光学的測定器で測定する場合は透明ないし半透明のシートを用いる方が良い。例えば、PC（ポリカーボネート）、ＰＰ（ポリピロピレン）、ＰＥ（ポリエチレン）、シクロオレフィン系ポリマーなどの透明樹脂を用いることができる。シートは柔軟なフィルムであってもよいし硬質の板状体であってもよい。 After supplying the solution containing the specimen, a predetermined thermal cycle is applied to the entire substrate. At this time, when a substrate having a recess is used, it is preferably used for the lid for sealing the recess. The lid may be made of any material that does not adversely affect the reaction system. Moreover, what is necessary is just to have heat resistance, chemical resistance, etc. of the grade which does not produce a deformation | transformation or impurity elution at the temperature given in the reaction to apply. However, a thin sheet is preferable in order to improve thermal conductivity. The thickness is preferably 0.05 to 0.5 mm, more preferably 0.05 to 0.2 mm. Moreover, a preferable material changes with reaction detection methods. When measuring with an optical measuring instrument from the opening of the recess, it is better to use a transparent or translucent sheet. For example, transparent resins such as PC (polycarbonate), PP (polypropylene), PE (polyethylene), and cycloolefin polymers can be used. The sheet may be a flexible film or a hard plate.
フィルムシートを基板に接着させる方法として、粘着材を用いることも可能であるが、接着剤により酵素反応が阻害される場合があるので、ヒートシールを用いた方法が好ましい。 As a method for adhering the film sheet to the substrate, an adhesive material can be used. However, since an enzyme reaction may be inhibited by the adhesive, a method using heat sealing is preferable.
本検出方法で行う熱サイクルの温度制御の方法について説明する。任意の温度に調節された熱板（ヒートブロック）に基板を接触させることにより反応溶液の温度を制御することが可能である。複数個の熱板を各々所定の温度状態に予め制御しておき、その上を基板が順次移動していくという方法により格段に速く反応溶液の温度調整を行うことが可能となる。また、熱板は基板下方のみでなく上方からも接触させることでより短時間で反応溶液の温度調整をすることができる。 A method of temperature control of the thermal cycle performed by this detection method will be described. It is possible to control the temperature of the reaction solution by bringing the substrate into contact with a hot plate (heat block) adjusted to an arbitrary temperature. It is possible to adjust the temperature of the reaction solution much faster by controlling each of the plurality of hot plates to a predetermined temperature state in advance and then moving the substrate in sequence. In addition, the temperature of the reaction solution can be adjusted in a shorter time by contacting the hot plate not only from below the substrate but also from above.
本検出方法の熱サイクルに用いる温度制御装置に関して説明する。
予め温度が設定された温調ブロックを２種類以上設けてあり、各ブロックの間を反応基板が行き来できるように搬送路が設けてあるのが良い。３ステップＰＣＲを行う場合は３種類以上の温調ブロックが設けてあるのが望ましい。また、反応基板との接触は下方向のみからでも良いが上下両方向からの接触の方がより効率良く温度制御されるので、上下両方に設けてあるのがさらに望ましい。図３にその一例を示したが、温調ブロック（７〜１２）が上下両方に設けてある。
さらに、単なる接触よりも効率良く温度制御を行い、且つ、基板が傷つくことを回避するために、反応基板を挟み込む、基板から離れるという動作を行えるよう各温調ブロックが上下運動できる構造になっている好ましい
また、搬送路の温調ブロック以外の位置に反応容器の停止位置を設けると共に、この停止位置に例えば光学的検出を行えるような検出器を備え付けることで、反応の進行具合を経時的に測定することが可能となる。
The temperature control apparatus used for the thermal cycle of this detection method will be described.
It is preferable that two or more types of temperature control blocks whose temperature is set in advance are provided, and a conveyance path is provided so that the reaction substrate can move between the blocks. When performing 3-step PCR, it is desirable to provide three or more types of temperature control blocks. Further, the contact with the reaction substrate may be from only the lower direction, but the contact from both the upper and lower directions is more efficiently controlled in temperature, so it is more desirable to provide the contact with both the upper and lower sides. One example is shown in FIG. 3, but temperature control blocks (7 to 12) are provided on both the upper and lower sides.
Furthermore, in order to perform temperature control more efficiently than simple contact and avoid damage to the substrate, each temperature control block can move up and down so that the reaction substrate can be sandwiched and moved away from the substrate. Preferred
In addition, a stop position of the reaction vessel is provided at a position other than the temperature control block of the conveyance path, and a progress of the reaction is measured over time by providing a detector that can perform optical detection, for example, at the stop position. It becomes possible.
本発明の遺伝子の検出方法の原理について、図４を用いて説明する。まずプローブＤＮＡ‘オリゴＤＮＡプライマー）を基板の凹部の底部上面に固定化しておく。その後、標識化したヌクレオチドが含まれている検体溶液を加え、熱サイクルを行なうことによって、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応が液相中で起こる（図４左上）。熱サイクルの際、増幅されている標的ＤＮＡと基板に固定化したプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションが起きる（図４第１ステップ）。続いて、反応溶液中に含まれているＤＮＡポリメラーゼにより標的ＤＮＡを鋳型としてプローブＤＮＡの伸長反応が起こり標識化したヌクレオチドが取り込まれる（図４第２ステップ）。熱をかけることにより２本鎖ＤＮＡが解離する（図４ 第３ステップ）。再度、増幅されている標的ＤＮＡと基板に固定化したプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションが起きる（図４第１ステップ）。このステップを繰り返し行うことでＤＮＡ増幅及び基板に固定化したプローブＤＮＡの伸長を同時に進行する。このようにして取り込まれた標識化ヌクレオチドの有無を検出することにより標的ＤＮＡの検出を行うことができる。 The principle of the gene detection method of the present invention will be described with reference to FIG. First, probe DNA (oligo DNA primer) is immobilized on the upper surface of the bottom of the recess of the substrate. Thereafter, a sample solution containing labeled nucleotides is added and thermal cycling is performed, whereby a DNA amplification reaction by PCR occurs in the liquid phase (upper left of FIG. 4). During the thermal cycle, hybridization between the amplified target DNA and the probe DNA immobilized on the substrate occurs (first step in FIG. 4). Subsequently, the DNA polymerase contained in the reaction solution causes an extension reaction of the probe DNA using the target DNA as a template, and the labeled nucleotide is incorporated (second step in FIG. 4). Double-strand DNA is dissociated by applying heat (FIG. 4, third step). Again, hybridization between the amplified target DNA and the probe DNA immobilized on the substrate occurs (first step in FIG. 4). By repeating this step, DNA amplification and extension of the probe DNA immobilized on the substrate proceed simultaneously. The target DNA can be detected by detecting the presence or absence of the labeled nucleotide incorporated in this manner.
通常は抽出してきたＤＮＡをＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などにて予め増幅させてから、検出系に持って行くのだが、本検出方法を用いた場合、上記に示したようにＤＮＡの増幅反応を行うのと同時に基板凹部の底部上面に固定化したプローブＤＮＡへのターゲットＤＮＡのハイブリダイゼーションを行うことができるので、従来法よりも容易にかつ短時間で検出を行うことが可能となる。この場合、基板上に洗浄液等試薬収容部を別に設けておき、必要な試薬を収容しておいても良い。 Usually, the extracted DNA is amplified in advance by the PCR method or LAMP method and then taken to the detection system. When this detection method is used, the DNA amplification reaction is performed as shown above. At the same time, since the target DNA can be hybridized to the probe DNA immobilized on the upper surface of the bottom of the substrate recess, detection can be performed more easily and in a shorter time than the conventional method. In this case, a reagent storage unit such as a cleaning liquid may be separately provided on the substrate, and necessary reagents may be stored.
本発明の検出方法は、一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）の解析にも用いることができる。
基板に固定する側とは反対側の先端付近にＳＮＰ配列を持つようなプローブＤＮＡを基板の凹部底面に固定する。凹部に標識化したヌクレオチドが含まれている試料溶液を加え、ＤＮＡ増幅反応を行うのと同時にプローブＤＮＡの伸長反応を行なう。プローブＤＮＡと標的ＤＮＡがミスマッチの場合、先端付近のハイブリダイゼーションが完全に成されないためＤＮＡの伸長反応は起きず、完全に一致したときのみ伸長反応が起こる。反応終了後、2本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性させる。この操作により、プローブＤＮＡの伸長反応が起こった場合のみ基板上に標識化ヌクレオチドが残り、これを検出することにより一塩基の違いを検出することができる。
The detection method of the present invention can also be used for analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs).
Probe DNA having an SNP sequence near the tip opposite to the side to be fixed to the substrate is fixed to the bottom surface of the concave portion of the substrate. A sample solution containing nucleotides labeled in the recesses is added to perform a DNA amplification reaction and simultaneously perform an extension reaction of the probe DNA. When the probe DNA and the target DNA are mismatched, hybridization near the tip is not completed completely, so that the DNA elongation reaction does not occur, and the elongation reaction occurs only when they completely match. After completion of the reaction, the double-stranded DNA is denatured into single strands. By this operation, the labeled nucleotide remains on the substrate only when the extension reaction of the probe DNA occurs, and by detecting this, the difference in one base can be detected.
また、逆転写酵素を用いることでｃＤＮＡを基板上に固定することができる。
標的ＲＮＡの一部と相補的な配列のプローブを基板の凹部底面に固定する。標的ＲＮＡ溶液を凹部に加え、プローブとハイブリダイゼーションさせる。その後、逆転写酵素を用いて逆転写反応を行うことで標的ＲＮＡと相補的なｃＤＮＡ鎖が基板に固定される。
Moreover, cDNA can be fixed on a substrate by using reverse transcriptase.
A probe having a sequence complementary to a part of the target RNA is fixed to the bottom surface of the concave portion of the substrate. The target RNA solution is added to the recess and allowed to hybridize with the probe. Thereafter, a reverse transcription reaction is performed using reverse transcriptase to immobilize a cDNA strand complementary to the target RNA on the substrate.
（スライドガラス状基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物
、ＭＦＲ（Ｍｅｌｔ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）を用い、射出成形により凹部（寸法：７ｍｍ×７ｍｍ 底部厚み：２００iｍ）を有したスライドガラス形状の基板（寸法：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ）を得た。
(Production of glass slide substrate)
Saturated cyclic polyolefin resin (5-methyl-2-norbornene ring-opening polymer hydrogenated product, MFR (Melt flow rate): 21 g / 10 min, hydrogenation rate: substantially 100%, heat distortion temperature 123 ° C.) A glass substrate (size: 25 mm × 75 mm × 1 mm) having a concave portion (size: 7 mm × 7 mm, bottom thickness: 200 im) was obtained by injection molding.
（スライドガラス状基板の表面処理）
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンーブチルメタクリレートーｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ―ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）、各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
(Surface treatment of glass slide substrate)
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine-butyl methacrylate-p-nitrophenyloxycarbonylpolyethylene glycol methacrylate copolymer (poly (MPC-co-BMA-co-NPMA) (PMBN), each group in mol% 25:74: A polymer substance having a phosphorylcholine group and an active ester group was introduced onto the substrate surface by dipping in a 0.5 wt% ethanol solution of 1).
（プローブＤＮＡの固定）
本方法を用いてＳＮＰ検出を行った。５’末端がアミノ基で修飾された、（ｉ）標的ＤＮＡ１(wild type)、配列ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＴＴＣ（配列番号１） のプローブＤＮＡ（２２塩基）、（ｉｉ）標的ＤＮＡ２(mutant type)、配列ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＴＴＴ（配列番号２）のＤＮＡプローブ（２２塩基）（ｉｉｉ）ポジティブコントロール用ＤＮＡ、配列ＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＴＧＴＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３）のプローブＤＮＡ（２０塩基）、（ｉｖ）ネガティブコントロール用ＤＮＡ、配列ＣＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣ（配列番号４）のプローブＤＮＡ（２０塩基）を０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液をマイクロピペッターを用いて基板の凹部上面にスポットした。プローブＤＮＡをスポットした各基板を、８０℃のオーブン内にて３０分静置し、プライマーを固定化させ、その後ブロッキング処理を施した。
(Immobilization of probe DNA)
SNP detection was performed using this method. (I) Target DNA1 (wild type), probe DNA of sequence CCACACTCACAGTTTTCACTTC (SEQ ID NO: 1) (22 bases), (ii) Target DNA2 (mutant type), sequence CCACACTCACAGTTTTCACTTT (sequence) No. 2) DNA probe (22 bases) (iii) Positive control DNA, sequence CCCGACATCTTGTAGCCACC (SEQ ID NO: 3) probe DNA (20 bases), (iv) Negative control DNA, sequence CCACCGATGTTCTACAGCCCC (SEQ ID NO: 4) DNA (20 bases) was dissolved using 0.25 M carbonate buffer (pH 9.0) to prepare a 10 μM oligo DNA solution. This solution was spotted on the upper surface of the concave portion of the substrate using a micropipette. Each substrate spotted with the probe DNA was allowed to stand in an oven at 80 ° C. for 30 minutes to immobilize the primer, and then subjected to blocking treatment.
（ＰＣＲおよびプローブＤＮＡの伸長反応）
上記（ｉｉｉ）の配列と（ｉ）あるいは（ｉｉ）の配列を含むＤＮＡを導入したプラスミド溶液に、ＨＳ Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、ヌクレオチド標識ｄＵＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、フォワードプライマー（配列ＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴ（配列番号５、２１塩基））、リバースプライマー（配列ＣＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＣＴＧＧＣ（配列番号６、１９塩基））を添加し、ＰＣＲ反応溶液を調製した。この溶液を上記プローブを固定化した基板ウェル内に供給し、市販のＰＣＲ用プレートシール（厚み１００μｍ、１．５ｃｍ×１．５ｃｍに切断したもの）により密閉状態とした。続いて、図３の温度制御装置を用いて、９４℃で熱変性処理、６０℃でアニール処理、７２℃で伸長反応としたヒートサイクルを３５回繰り返し行うことによりＤＮＡ増幅反応及びプローブの伸長反応を行った。
反応は約１０分程度で終了した。
(PCR and probe DNA extension reaction)
HS Taq polymerase, Taq Buffer, nucleotide-labeled dUTP, dUTP, dATP, dCTP, dGTP, forward primer (sequence CAAATTACAGGGTCCAACTGCT) into the plasmid solution into which the DNA containing the sequence (iii) and (i) or (ii) is introduced (SEQ ID NO: 5, 21 bases)) and reverse primer (sequence CAGGTCCTGAACCTCTGGC (SEQ ID NO: 6, 19 bases)) were added to prepare a PCR reaction solution. This solution was supplied into the substrate well on which the probe was immobilized, and sealed with a commercially available PCR plate seal (thickness 100 μm, cut to 1.5 cm × 1.5 cm). Subsequently, by using the temperature control device of FIG. 3, a heat amplification treatment at 94 ° C., an annealing treatment at 60 ° C., and an extension reaction at 72 ° C. are repeated 35 times to repeat DNA amplification reaction and probe extension reaction. Went.
The reaction was completed in about 10 minutes.
（目視検出）
前記伸長反応の後、反応液を回収し、基板を熱湯及び界面活性剤水溶液によって洗浄した。その後、Alkaliphosphatase-avidinを反応させ、界面活性剤水溶液によって洗浄後、ＢＣＩＰ−ＮＢＴにより可視化した。その結果、反応溶液に添加したプラスミドの配列特異的に検出された。すなわち、前記（ｉ）標的ＤＮＡ１、配列ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＴＴＣ（配列番号１）のプローブＤＮＡ（２２塩基）を導入したプラスミドを用いた場合は（ｉ）の点着部分での染色が観察され（ｉｉ）の点着部分では確認されなかった（図5（a））。逆に、前記（ｉｉ）標的ＤＮＡ２、配列ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＴＴＴ（配列番号２）のプローブＤＮＡ（２２塩基）を導入したプラスミドを用いた場合は（ｉｉ）の点着部分で染色が観察され（ｉ）の点着部分では確認されなかった（図５（b））。どちらの場合においても、（ｉｉｉ）ポジティブコントロール用ＤＮＡ、配列ＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＴＧＴＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３）のプローブＤＮＡ（２０塩基）点着部分での染色が観察でき、ネガティブコントロールである（ｉｖ）配列ＣＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣ（配列番号４）のプローブＤＮＡ（２０塩基）では染色は検出されなかった。
反応から検出まで一連の操作に要した時間は３０分程度であった。
(Visual detection)
After the extension reaction, the reaction solution was recovered, and the substrate was washed with hot water and a surfactant aqueous solution. Thereafter, Alkaliphosphatase-avidin was reacted, washed with an aqueous surfactant solution, and visualized with BCIP-NBT. As a result, the sequence of the plasmid added to the reaction solution was detected specifically. That is, when (i) a plasmid into which the
The time required for a series of operations from reaction to detection was about 30 minutes.
１ 反応用基板
２ 基板
３ 凹部
４ 凹部の底部
５ 反応溶液
６ 凹部開口部の封止用シート
７〜１２ 熱ブロック
DESCRIPTION OF
Claims (16)
（１）基板の表面に、オリゴＤＮＡプライマーを固定化する工程、
（２）前記基板上に検体、ＰＣＲ用プライマーセット、ヌクレオチド単体、及びＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を供給する工程、
（３）所定の熱サイクルを前記基板に加える工程、
（４）前記オリゴＤＮＡプライマーの伸長を検出する工程、
を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。 A method for detecting a gene in a specimen using a substrate,
(1) a step of immobilizing an oligo DNA primer on the surface of the substrate;
(2) supplying a sample, a primer set for PCR, a nucleotide alone, and a solution containing a DNA extending enzyme onto the substrate;
(3) applying a predetermined thermal cycle to the substrate;
(4) detecting the extension of the oligo DNA primer,
A method for detecting a gene comprising:
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