JP2009055866A - Synovial tissue-derived stem cell and cell line, and method for enrichment culture of the stem cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、哺乳動物における発生工学研究、前臨床試験、安全性試験、疾患研究、免疫研究のモデルまたは再生医療のマテリアルとして有用な、関節滑膜由来幹細胞および細胞株、ならびに該幹細胞または細胞株を高い収率で高純度に得ることが可能な培養方法に関する。 The present invention relates to a synovial synovial stem cell and cell line, and a stem cell or cell line useful as a model for developmental engineering research, preclinical testing, safety testing, disease research, immune research, or regenerative medicine in mammals. The present invention relates to a culture method capable of obtaining a high purity with a high yield.
幹細胞とは、多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞である。また、幹細胞は、損傷後の組織修復力を有することが示唆されている。このため、かかる幹細胞は、各種疾患の治療用物質のスクリーニングおよび再生医療への応用が期待されている。 A stem cell is an undifferentiated cell having multipotency and self-renewal ability. It has also been suggested that stem cells have a tissue repair ability after injury. For this reason, such stem cells are expected to be applied to screening of therapeutic substances for various diseases and regenerative medicine.
現在までに報告のある幹細胞ソースとしては、ヒト受精卵の胚体部分から樹立される胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）、堕胎胎児の生殖腺から樹立される胚性生殖幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ；ＥＧ細胞）、成体にもごく少数存在し、骨髄幹細胞に代表される組織幹細胞、成体マウスの精巣から樹立される多分化能性精源幹細胞（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ Ｇｅｒｍ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｍＧＳ細胞）、複数の遺伝子を同時に導入することで人為的に作成される誘導未分化幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ；ｉＰＳ細胞）があげられる。 Stem cell sources reported to date include embryonic stem cells (ES cells) established from embryonic portions of human fertilized eggs, embryonic germ cells (Embryonic Germ Cells) established from embryonic gonads EG cells), a small number of adults, tissue stem cells typified by bone marrow stem cells, multipotent sperm stem cells established from testes of adult mice (multipotent germ stem cells; mGS cells), multiple genes Induced undifferentiated stem cells (Induced Pluripotent Stem Cells; iPS cells) that are artificially created by simultaneously introducing.
しかし、ＥＳ細胞およびＥＧ細胞は、倫理的な問題に加え、本来的に受容者との間に免疫学的な障壁が存在すること、移植後に高頻度に良性の腫瘍（テラトーマ）を形成することが報告されている。また、ｍＧＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、現在のところマウスでのみ成功例が報告されているに過ぎず、さらにＥＳ細胞同様、移植によってテラトーマを形成することが報告されている。 However, in addition to ethical issues, ES cells and EG cells inherently have an immunological barrier with the recipient, and frequently form benign tumors (teratomas) after transplantation. Has been reported. In addition, mGS cells and iPS cells have only been reported to be successful in mice at present, and it has been reported that teratomas can be formed by transplantation, similar to ES cells.
一方、成体組織に由来する組織幹細胞は、由来する組織が損傷を受けた時にその細胞へ分化し、修復する作用を有していると考えられる。そのため、機能的に成熟した細胞を得られる可能性が高い。しかも、レシピエント自身から分離した細胞である限り、再移植に際して免疫学的な寛容が期待され、重篤な催腫瘍性も報告されていない。しかしながら、組織幹細胞は、ごく少数しか存在していない上、体外での培養は困難である。さらには、実際に分離された組織幹細胞の例は、少数の組織に限定されている。 On the other hand, tissue stem cells derived from adult tissues are considered to have an action of differentiating and repairing the cells when the tissue derived from them is damaged. Therefore, it is highly possible to obtain functionally mature cells. Moreover, as long as the cells are isolated from the recipients themselves, immunological tolerance is expected upon retransplantation, and no serious tumorigenicity has been reported. However, there are only a few tissue stem cells and it is difficult to culture outside the body. Furthermore, examples of tissue stem cells that are actually isolated are limited to a small number of tissues.
近年、関節軟骨の欠損について間葉系幹細胞を使用する再生医療が開発されている（非特許文献１）。間葉系幹細胞は骨髄、臍帯血、脂肪、筋肉から採取することが可能であるが、骨髄中に含まれる間葉系幹細胞を使用する場合、存在率が０．０５％程度であるため、自己骨髄血由来の場合には極めて浸襲的となること、臍帯血由来の場合には、移植に際し提供者となる新生児との間で組織適合性が問題になること、脂肪組織の場合は、細胞成分が含まれる率が低率になるため、摘出組織質量あたりの集率が低率であること、筋組織の場合は、運動機能に対する浸襲性が高いことが問題となる。また、これら間葉系幹細胞の培養に特化した方法すなわち間葉系幹細胞のみが高率に含まれる集団を、本来の性質を損なうことなく培養する方法は確立されていない。 In recent years, regenerative medicine using mesenchymal stem cells for articular cartilage defects has been developed (Non-patent Document 1). Mesenchymal stem cells can be collected from bone marrow, umbilical cord blood, fat, and muscle. However, when mesenchymal stem cells contained in bone marrow are used, the abundance is about 0.05%. If it is derived from bone marrow blood, it becomes extremely invasive.If it is derived from cord blood, tissue compatibility becomes a problem with the newborn baby who is the donor at the time of transplantation. Since the rate at which the components are contained is low, there is a problem that the collection rate per mass of the extracted tissue is low, and in the case of muscle tissue, the invasion property to the motor function is high. Further, a method specialized in culturing these mesenchymal stem cells, that is, a method for culturing a population containing only a high percentage of mesenchymal stem cells without impairing the original properties has not been established.
一方、関節内に含まれる滑膜組織にも同様に間葉系幹細胞が含まれているが、滑膜組織由来間葉系幹細胞は、他組織のものに比べて軟骨を形成する能力が高いことが報告されている（非特許文献２）。加えて、滑膜組織は採取後の再生が良好で、細胞成分を含む率も高い。以上のことから、特に関節軟骨の修復を目的とする再生医療の材料として、滑膜由来間葉系幹細胞は理想的な特性を備えていると言える。しかし、関節滑膜の異常増殖による疾病も知られており、再生医療に際しては目的の幹細胞成分のみを抽出し、必要な細胞に高純度に分化させて使用する必要がある。 On the other hand, the synovial tissue contained in the joint contains mesenchymal stem cells as well, but synovial tissue-derived mesenchymal stem cells have a higher ability to form cartilage than those of other tissues. Has been reported (Non-Patent Document 2). In addition, synovial tissue is well regenerated after collection and has a high rate of cellular components. From the above, it can be said that synovial-derived mesenchymal stem cells have ideal characteristics as a material for regenerative medicine especially for the repair of articular cartilage. However, diseases caused by abnormal proliferation of the synovial membrane are also known, and in regenerative medicine, it is necessary to extract only the target stem cell component and differentiate it into necessary cells for use in high purity.
本発明は、このような現状に鑑みてなされたものであり、哺乳動物における発生学研究、疾患研究、臨床応用、実験モデルなどに有用な、関節滑膜組織に由来する幹細胞および細胞株、ならびに該細胞を高い収率で得ることが可能な濃縮方法および分離細胞を培養する方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of such a current situation, and is useful for embryological research, disease research, clinical application, experimental models, etc. in mammals, stem cells and cell lines derived from joint synovial tissue, and It is an object of the present invention to provide a concentration method and a method for culturing isolated cells that can obtain the cells in high yield.
本発明は、哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の幹細胞を含む画分を培養することを特徴とする培養方法である。 The present invention concentrates stem cells having differentiation pluripotency derived from a synovial tissue present in a joint of a mammal and separated by having the ability to discharge a cell membrane permeable dye in the first seeding. And culturing a fraction containing the stem cells after the separation operation.
本発明はまた、哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、ＭＤＲタンパク質によって排出され得る細胞膜透過性色素に対して色素排出能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞、テロメラーゼ活性を有する細胞、ＣＤ３４陽性細胞、またはｃ-Ｋｉｔ陽性細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の細胞を含む画分を培養することを特徴とする培養方法である。 The present invention also has pluripotency derived from synovial tissue present in mammalian joints and isolated by having pigment effluxing ability against cell membrane permeable dyes that can be excreted by MDR proteins A culture method characterized by concentrating stem cells, cells having telomerase activity, CD34 positive cells, or c-Kit positive cells at the first generation of seeding, and culturing a fraction containing the cells after the separation operation.
本発明はまた、哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）またはＲｈｏｄａｍｉｎｅを排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞、テロメラーゼ活性を有する細胞、ＣＤ３４陽性細胞、またはｃ-Ｋｉｔ陽性細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の幹細胞を含む画分を培養することを特徴とする培養方法である。 The present invention also has pluripotency derived from synovial tissue present in mammalian joints and isolated by having the ability to excrete the cell membrane permeable dye Bis-benzimide (Hoechst 33342) or Rhodamine A culture method characterized by concentrating stem cells, cells having telomerase activity, CD34 positive cells, or c-Kit positive cells at the first seeding and culturing a fraction containing stem cells after the separation operation.
本発明はまた、哺乳動物の関節内から単離した滑膜組織より、細胞膜透過性色素を排出する細胞を含む画分を濃縮することを特徴とする培養方法である。 The present invention also provides a culture method characterized by concentrating a fraction containing cells that excrete a cell membrane-permeable dye from synovial tissue isolated from within a joint of a mammal.
ここで、無血清培地と血清とを含む培養液を用いて画分を培養することを特徴とする。
さらに、濃縮された画分に含まれる細胞を、ＦＡＣＳおよび磁気ビーズ法の少なくとも一方によって分離し、分離した細胞を培養することを特徴とする。
Here, the fraction is cultured using a culture solution containing a serum-free medium and serum.
Furthermore, the cells contained in the concentrated fraction are separated by at least one of FACS and magnetic bead method, and the separated cells are cultured.
さらにまた、分離した細胞を無血清培地と血清とを含む培養液を用いて培養することを特徴とする。 Furthermore, the separated cells are cultured using a culture solution containing a serum-free medium and serum.
本発明はさらに、哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有することを特徴とする幹細胞である。 The present invention further provides a stem cell characterized by having pluripotency derived from a synovial tissue present in a joint of a mammal and separated by having the ability to discharge a cell membrane permeable dye. .
本発明はまた、哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、テロメラーゼ活性を有することを特徴とする細胞である。 The present invention also relates to a cell having telomerase activity, which is derived from a synovial tissue present in a mammalian joint and separated by having the ability to excrete a cell membrane permeable dye.
本発明はまた、哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ受容体ｃ-Ｋｉｔを発現することを特徴とする細胞である。 The present invention is also a cell derived from a synovial tissue present in a mammalian joint and expressing the Stem Cell Factor receptor c-Kit.
ここで、さらに造血幹細胞マーカー分化抗原ＣＤ３４を発現することを特徴とする細胞でもある。 Here, it is also a cell characterized by expressing the hematopoietic stem cell marker differentiation antigen CD34.
本発明はまた、上述の培養方法で培養された画分に含まれる細胞に由来することを特徴とする分化細胞である。 The present invention is also a differentiated cell derived from cells contained in the fraction cultured by the above-described culture method.
本発明は、上述の培養方法において、滑膜組織がウシの滑膜組織であることを特徴とする。 In the culture method described above, the present invention is characterized in that the synovial tissue is bovine synovial tissue.
また、本発明は、上述の培養方法によって培養された画分に含まれる細胞を用いて再構成されることを特徴とするクローンウシである。 In addition, the present invention is a cloned cow characterized by being reconstructed using cells contained in the fraction cultured by the above-described culture method.
本発明はさらに、ＣＡＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＡＡＴＧＣおよびＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴの塩基配列、ＣＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡおよびＡＧＴＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＴＧＴＣの塩基配列、または、ＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＣＣＧＣおよびＴＣＣＡＣＧＴＡＡＴＡＡＧＧＧＴＣＴＴＣＧＣの塩基配列を有し、ウシの滑膜に由来する細胞の評価に用いられることを特徴とするＰＣＲ用プライマー配列である。 The present invention further includes a base sequence of CAAGGAAGGTTTCCGAATGC and CCCACGAGGTCTTTCATGATGT, a base sequence of CCTTGGTTGTCCATGGCTTCA and an AGTCCTGGGCAGAGAGTTTTGCTC, and a base of CTGCTAGCTAGC It is a primer sequence for.
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の幹細胞を含む画分を培養する本発明の培養方法によれば、細胞を播種第一代目において濃縮しておくので、哺乳動物における発生学研究、臨床応用などに有用な幹細胞を、高純度で効率よく提供することができる。 Stem cells with pluripotency stemming from the synovial tissue present in the joints of mammals and separated by having the ability to excrete cell membrane permeable dyes are concentrated and separated in the first seeding. According to the culture method of the present invention for culturing a fraction containing stem cells later, since the cells are concentrated at the first seeding, stem cells useful for embryological research in mammals, clinical application, etc. have high purity. Can be provided efficiently.
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、ＭＤＲタンパク質によって排出され得る細胞膜透過性色素に対して色素排出能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞、テロメラーゼ活性を有する細胞、ＣＤ３４陽性細胞、またはｃ-Ｋｉｔ陽性細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の細胞を含む画分を培養する本発明の培養方法によれば、細胞を播種第一代目において濃縮しておくので、発生学研究、臨床応用などに有用な幹細胞、または幹細胞である可能性の高い細胞を、高純度で効率よく提供することができる。 A pluripotent stem cell, telomerase activity, derived from synovial tissue present in the joints of mammals and isolated by having a pigment excretion ability with respect to a cell membrane permeable dye that can be excreted by MDR protein Cell, CD34-positive cell, or c-Kit-positive cell is concentrated in the first seeding, and the fraction containing the cells after the separation operation is cultured. Therefore, stem cells useful for embryological research, clinical application, etc., or cells that are highly likely to be stem cells can be efficiently provided with high purity.
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）またはＲｈｏｄａｍｉｎｅを排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞、テロメラーゼ活性を有する細胞、ＣＤ３４陽性細胞、またはｃ-Ｋｉｔ陽性細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の幹細胞を含む画分を培養する本発明の培養方法によれば、細胞を播種第一代目において濃縮しておくので、発生学研究、臨床応用などに有用な、幹細胞である可能性の高い細胞を、高純度で効率よく提供することができる。 A pluripotent stem cell, telomerase activity, derived from synovial tissue present in a mammalian joint and isolated by having the ability to excrete the cell membrane permeable dye Bis-benzimide (Hoechst33342) or Rhodamine Cells, CD34 positive cells, or c-Kit positive cells are concentrated at the first seeding, and the fraction containing stem cells after the separation operation is cultured. Therefore, cells that are highly likely to be stem cells that are useful for embryological research, clinical application, and the like can be efficiently provided with high purity.
哺乳動物の関節内から単離した滑膜組織より、細胞膜透過性色素を排出する細胞を含む画分を濃縮する本発明の培養方法によれば、細胞膜透過性色素を排出するという幹細胞の性質を有する細胞を濃縮するので、発生学研究、臨床応用などに有用な、幹細胞である可能性の高い細胞を、高純度で効率よく提供することができる。 According to the culture method of the present invention for concentrating a fraction containing cells that excrete cell membrane permeable dye from synovial tissue isolated from within a joint of a mammal, the property of stem cells that excrete cell membrane permeable dye is Since the cells possessed are concentrated, cells that are highly likely to be stem cells that are useful for embryological research, clinical application, and the like can be efficiently provided with high purity.
特に、無血清培地と血清とを含む培養液を用いて画分を培養することで、幹細胞または幹細胞である可能性の高い細胞の成育および***が促進され、細胞の高度な濃縮が可能になる。 In particular, by culturing a fraction using a culture solution containing a serum-free medium and serum, the growth and division of cells that are likely to be stem cells or stem cells are promoted, and the cells can be highly concentrated. .
さらに、濃縮された画分に含まれる細胞を、ＦＡＣＳまたは磁気ビーズ法によって分離し、分離した細胞を培養することで、純度がさらに高まる。 Furthermore, the purity is further increased by separating the cells contained in the concentrated fraction by FACS or magnetic bead method and culturing the separated cells.
さらにまた、分離した細胞を無血清培地と血清とを含む培養液を用いて培養することによって、幹細胞または幹細胞である可能性の高い細胞を、さらに高純度で効率よく提供することができる。 Furthermore, by culturing the separated cells using a culture solution containing a serum-free medium and serum, it is possible to efficiently provide stem cells or cells that are likely to be stem cells with higher purity and efficiency.
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有する本発明の幹細胞によれば、哺乳動物における発生学研究、疾患研究などに資することができ、関節疾患の治療をはじめとする臨床応用も期待される。 According to the stem cell of the present invention having pluripotency derived from a synovial tissue present in a mammal's joint and separated by having the ability to excrete a cell membrane permeable dye, the embryology in mammals It can contribute to research and disease research, and is expected to be used for clinical applications including treatment of joint diseases.
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、テロメラーゼ活性を有する本発明の細胞は、幹細胞である可能性の高い細胞なので、哺乳動物における発生学研究、疾患研究などに資することができる。 The cell of the present invention having telomerase activity, which is derived from a synovial tissue existing in a mammalian joint and separated by having the ability to excrete a cell membrane-permeable dye, is a cell that is likely to be a stem cell. It can contribute to embryological research and disease research in mammals.
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ受容体ｃ-Ｋｉｔを発現する本発明の細胞も、幹細胞である可能性の高い細胞なので、哺乳動物における発生学研究、疾患研究などに資することができる。 Since cells of the present invention derived from synovial tissue present in the joints of mammals and expressing the Stem Cell Factor receptor c-Kit are also likely to be stem cells, developmental studies in mammals, diseases Can contribute to research.
さらに造血幹細胞マーカー分化抗原ＣＤ３４を発現する本発明の細胞は、幹細胞である可能性がさらに高い細胞なので、哺乳動物における発生学研究、疾患研究などに資することができ、関節疾患の治療をはじめとする臨床応用も期待される。 Furthermore, since the cells of the present invention that express the hematopoietic stem cell marker differentiation antigen CD34 are cells that are more likely to be stem cells, they can contribute to embryological research, disease research, etc. in mammals, including treatment of joint diseases. It is also expected to be applied clinically.
上述の培養方法で培養された画分に含まれる細胞に由来する本発明の分化細胞は、疾患研究などに資することはもとより、臨床応用の期待が一層大きくなる。 The differentiated cells of the present invention derived from the cells contained in the fraction cultured by the above-described culture method contribute not only to disease research and the like, but also have higher expectation for clinical application.
上述の培養方法において、滑膜組織がウシの滑膜組織であると、ウシの疾患の治療に有用な細胞が得られ、またクローンウシの提供も可能になる。 In the culture method described above, when the synovial tissue is bovine synovial tissue, cells useful for treatment of bovine diseases can be obtained, and a cloned bovine can be provided.
上述の培養方法によって培養された画分に含まれる細胞を用いて再構成される本発明のクローンウシによれば、食料として品質のよい牛の複製を得ることが可能である。 According to the cloned cow of the present invention reconstituted using cells contained in the fraction cultured by the above-described culture method, it is possible to obtain a good quality cow replica as food.
ＣＡＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＡＡＴＧＣおよびＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴの塩基配列、ＣＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡおよびＡＧＴＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＴＧＴＣの塩基配列、または、ＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＣＣＧＣおよびＴＣＣＡＣＧＴＡＡＴＡＡＧＧＧＴＣＴＴＣＧＣの塩基配列を有し、ウシの滑膜に由来する細胞の評価に用いられる本発明のＰＣＲ用プライマー配列は、ｃ-Ｋｉｔ、Ａｂｃｇ２すなわちＢｃｒｐ１、またはＣＤ３４をコードする遺伝子の一部を複製するものであり、ウシ滑膜由来の幹細胞または幹細胞である可能性の高い細胞の迅速かつ適確な検出に好適である。 The base sequence of CAAGGAAGGTTTCCGAATGC and CCCAGCAGGTCTTTCATGATGT, the base sequence of CCCTTGGTTCGTGGCTTCA and the base sequence of bovine cells to be used as the base sequence of the bovine cell It replicates a part of the gene encoding Kit, Abcg2, Bcrp1, or CD34, and is suitable for rapid and accurate detection of stem cells derived from bovine synovium or cells that are likely to be stem cells.
本発明の実施の一形態の培養方法における重要な点は、次の［１］〜［３］の工程を含むことである。
［１］関節滑膜組織より細胞を濃縮する工程。
［２］工程［１］で得られた培養細胞に細胞透過性色素による染色操作を行い、セルソーターによって細胞を弱陽性あるいは陰性細胞集団として分離する工程。
［３］分離細胞を培養する工程。
The important point in the culture method of one embodiment of the present invention is that it includes the following steps [1] to [3].
[1] A step of concentrating cells from joint synovial tissue.
[2] A step of subjecting the cultured cells obtained in step [1] to staining with a cell-permeable dye, and separating the cells as a weakly positive or negative cell population by a cell sorter.
[3] A step of culturing isolated cells.
また、この実施の形態で得られる関節滑膜組織由来幹細胞または細胞株は、次の（ｉ）〜（ｖｉ）の特性の少なくとも１つを有する。
（ｉ）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-３４ＳＦＭにウシ胎児血清を添加した培養液で、接着、増殖することができる。
（ｉｉ）細胞透過性色素排出能力を有する。また、このことにより、Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ／Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色後のフローサイトメトリーで、Ｓｉｄｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）として分離される。
（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性を有する。
（ｉｖ）ＣＤ３４陽性細胞を含む。あるいはＣＤ３４陽性細胞に分化することができる。
（ｖ）ｃ-Ｋｉｔ陽性細胞を含む。あるいはｃ-Ｋｉｔ陽性細胞に分化することができる。
（ｖｉ）前記（ｉｖ）および（ｖ）に示す性質を持つ細胞以外に、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などの、他の性質を有する細胞に分化することができる。
Moreover, the joint synovial tissue-derived stem cell or cell line obtained in this embodiment has at least one of the following characteristics (i) to (vi).
(I) It can adhere and proliferate in a culture solution obtained by adding fetal bovine serum to StemPro (registered trademark) -34SFM.
(Ii) It has a cell-permeable dye-discharging ability. Moreover, by this, it isolate | separates as Side Population (SP) by the flow cytometry after Bis-benzimide / Hoechst33342 dyeing | staining.
(Iii) It has telomerase activity.
(Iv) Contains CD34 positive cells. Alternatively, it can differentiate into CD34 positive cells.
(V) Including c-Kit positive cells. Alternatively, it can be differentiated into c-Kit positive cells.
(Vi) In addition to the cells having the properties shown in (iv) and (v), the cells can be differentiated into cells having other properties such as adipocytes, bone cells, and chondrocytes.
本発明において「哺乳動物」とは、ヒト、ウシなどのように、脚部に関節構造を有する恒温性多細胞動物である。マウスやラットのように近交化された実験動物のほか、山羊、羊などの家畜も含まれる。したがって、本発明には、哺乳動物の種に関して、何の制約もない。 In the present invention, a “mammal” is a thermophilic multicellular animal having a joint structure in the leg, such as humans and cows. In addition to laboratory animals inbred like mice and rats, this includes livestock such as goats and sheep. Thus, the present invention has no restrictions with respect to mammalian species.
関節軟骨は外傷などで損傷を受けると、正常には再生しにくく、痛みや歩行障害の原因となる。軟骨損傷に対する治療法として、近年自家軟骨移植による治療法が開発され、実際に利用されるようになってきた。しかし、他の部位から軟骨を採取しなければならないという問題、採取した軟骨細胞を体外で増殖させることが困難であるという問題などがある。 When articular cartilage is damaged by trauma or the like, it is difficult to regenerate normally and causes pain and gait disturbance. In recent years, autologous cartilage transplantation has been developed as a treatment method for cartilage damage and has come to be used in practice. However, there are problems that it is necessary to collect cartilage from other sites, and that it is difficult to proliferate the collected chondrocytes outside the body.
滑膜組織は哺乳動物の関節内に存在する間葉系組織であるが、軟骨に比べ採取が容易で、骨髄に比べて侵襲性が低く、採取後の再生も良い。また、脂肪組織に比べて細胞成分を含む比率が高いことも有用な点であると言える。さらに近年では、滑膜細胞は骨髄、筋肉、脂肪のような他の間葉系組織の細胞に比べて軟骨への分化能力が高く、筋肉、脂肪細胞、筋細胞といった他の機能性細胞への幅広い分化能力を有していることが報告されている。 The synovial tissue is a mesenchymal tissue that exists in the joint of a mammal, but is easier to collect than cartilage, less invasive than bone marrow, and can be regenerated after collection. Moreover, it can be said that it is a useful point that the ratio containing a cell component is high compared with a fat tissue. Furthermore, in recent years, synovial cells have a higher ability to differentiate into cartilage than cells of other mesenchymal tissues such as bone marrow, muscle, and fat, and can be used for other functional cells such as muscle, fat cells, and myocytes. It has been reported to have a wide range of differentiation capabilities.
本発明では、再生医療の材料として上記のように優れた性質をもつ滑膜組織あるいは滑膜組織由来細胞より、幹細胞画分を分離、培養することを可能にする方法を提供する。 The present invention provides a method that enables a stem cell fraction to be separated and cultured from synovial tissue or synovial tissue-derived cells having excellent properties as described above as a material for regenerative medicine.
本発明の関節滑膜幹細胞は、（ａ）関節より滑膜組織を得て、酵素により細胞を乖離する工程、（ｂ）得られた細胞を培養する工程、（ｃ）工程（ａ）で得られた細胞集団から、幹細胞画分を濃縮培養する工程、（ｄ）工程（ｂ）または工程（ｃ）で得られた細胞から、フローサイトメーター（細胞分離装置）を用いて幹細胞画分を分取する工程、（ｅ）分取した幹細胞画分を培養する工程、および、（ｆ）分取した幹細胞画分または培養した細胞の未分化性、発現プロファイルを分子生物学的手法により評価する工程によって得ることが可能である。かかる幹細胞の生産方法や評価方法、またそれに使用した培養液、プライマー配列も本発明の範囲に含まれる。 The joint synovial stem cell of the present invention is obtained in (a) a step of obtaining a synovial tissue from a joint and separating the cells with an enzyme, (b) a step of culturing the obtained cell, and (c) a step of (a). A step of concentrating the stem cell fraction from the obtained cell population, (d) separating the stem cell fraction from the cells obtained in step (b) or step (c) using a flow cytometer (cell separator). (E) a step of culturing the fractionated stem cell fraction, and (f) a step of evaluating the undifferentiation and expression profile of the fractionated stem cell fraction or the cultured cell by a molecular biological technique. Can be obtained by: Such stem cell production methods and evaluation methods, and the culture medium and primer sequences used therein are also included in the scope of the present invention.
本発明におけるフローサイトメーターと蛍光色素を用いた幹細胞の分離方法は、１９９６年、米国で行われたＧｏｏｄｅｌｌ ＭＡ博士らの骨髄幹細胞を用いた研究に基づく（Ｇｏｏｄｅｌｌ ＭＡ ｅｔ ａｌ.，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ，Ｊ. Ｅｘｐ. Ｍｅｄ. １９９６；１８３；１７９７〜１８０６）。この方法は、幹細胞、またはそのうち未分化性の高い一部の画分が強い色素排出能を有しており、細胞透過性色素Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ染色後に赤色蛍光、青色蛍光の２色の波長で展開すると、色素で染色されない幹細胞が、主要画分とは異なる集団（ＳＰ）として観察されるという原理のもとに開発されている。 The method for separating stem cells using a flow cytometer and a fluorescent dye in the present invention is based on a study using bone marrow stem cells of Goodell MA et al. Conducted in the United States in 1996 (Goodell MA et al., Isolation and functional properties). of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo, J. Exp. Med. 1996; 183; 1797-1806). In this method, stem cells, or some fractions of which are highly undifferentiated, have a strong dye excretion ability, and develop with two wavelengths of red fluorescence and blue fluorescence after staining with the cell-permeable dye Bis-benzimide. Then, the stem cell which is not dye | stained with a pigment | dye is developed on the principle that it is observed as a population (SP) different from a main fraction.
同方法を用いて、現在までに、筋組織（Ｊａｃｋｓｏｎ ＭＡ ｅｔ ａｌ.，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｏｔｅｎｃｉａｌ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｕｒｉｎｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ，ＰＮＡＳ １９９９；９６；１４４８２〜１４４８６）、肝臓（Ｓｈｉｍａｎｏ Ｋ ｅｔ ａｌ.，Ｈｅｐａｔｉｃ ｏｖａｌ ｃｅｌｌｓ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｄｉｆｉｎｅｄ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＴＰ-ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＡＢＣＧ２／ＢＣＲＰ１，Ａｍ. Ｊ. Ｐａｔｈｏｌ. ２００３；１６３；３〜９）、肺、角膜上皮組織（Ｕｅｍｏｔｏ Ｔ ｅｔ ａｌ.，Ｌｉｍｂａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｓｉｄｅ-Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ Ｈａｖｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ-ｌｉｋｅ Ｐｒｏｐａｔｉｅｓ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ Ｓｔｅｔｅ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００６；２４；８６〜９４）から、幹細胞が分離されている。 Using the same method, to date, muscle tissue (Jackson MA et al., Hematopoietic potent of stem cells isolated from the murine skeletal muscule, PNAS 1999; 96; 14482-14486p. cells have the side population phenotype differentiated by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2 / BCRP1, Am. J. Pathol. Populat on Cells Have Stem Cell-like Propaties, Including Quiescent Stete, Stem Cells 2006; 24; from 86 to 94), stem cells are separated.
本発明者らは、ＳＰ分離の原理を基に、滑膜組織を対象とした分離方法を開発し、その結果、滑膜組織に由来する細胞集団から幹細胞を得る方法を開発した。 Based on the principle of SP separation, the present inventors developed a separation method for synovial tissue, and as a result, developed a method for obtaining stem cells from a cell population derived from the synovial tissue.
さらに、工程（ｃ）のために、米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より体外で造血幹細胞を培養する目的で市販されているＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-３４ＳＦＭを基本培地とし、改良培養液を作成することでＳＰ細胞画分を著しく増加させることが可能な方法を開発した。 In addition, for the step (c), an SP cell image is prepared by using StemPro (registered trademark) -34SFM, which is commercially available for the purpose of in vitro culturing hematopoietic stem cells from Invitrogen, USA, as a basic medium. A method has been developed that can significantly increase the minutes.
滑膜組織は哺乳動物の関節内に存在する薄い層状の組織であり、滑液の産生、吸収などを行っている。軟骨組織とは異なり、採取後は速やかに増殖し、補填されるため、ヒトをはじめ多くの哺乳動物から容易に採取することが可能である。 The synovial tissue is a thin layered tissue present in the joints of mammals, and produces and absorbs synovial fluid. Unlike cartilage tissue, it rapidly proliferates and is compensated for after collection, so it can be easily collected from many mammals including humans.
（１）滑膜組織の採取（工程（ａ））
本発明における幹細胞の分離を行う工程は、なるべく若齢、例えばウシであれば３ヶ月齢前後、の哺乳動物を対象とするのが望ましい。発明には細胞培養の工程が含まれるため、無菌操作を行う目的で、関節包は無菌環境に至るまで開放されないことが重要である。
(1) Collection of synovial tissue (process (a))
The step of separating stem cells in the present invention is preferably targeted to mammals as young as possible, for example, about 3 months of age for cattle. Since the invention includes a cell culturing step, it is important that the joint capsule is not opened until it reaches a sterile environment for the purpose of performing aseptic operation.
滑膜組織の採取は具体的には次のように行うことができる。ウシ脚部を流水にて洗浄し、約１００ｍＬの消毒液で除染操作を行う。消毒液は、イソジン（登録商標）液のような一般的なものでよい。続いて、滅菌済みメスと滅菌済みのピンセット、ハサミを用いて表皮を剥離し、関節部を露出する。再度約１００ｍＬの消毒液で除染後、滅菌済みメスを用いて関節包を開放し、包の内側に存在する滑膜組織を採取する。採取した滑膜組織は使用するまでＰＢＳ（−）に浸し、冷蔵庫あるいは氷上にて保存する。なお、滅菌済みメスとしては、ディスポーザブルのメスを使用してもよい。 Specifically, the synovial tissue can be collected as follows. The cow leg is washed with running water and decontaminated with about 100 mL of disinfectant. The disinfecting solution may be a common one such as isodine (registered trademark) solution. Subsequently, the epidermis is peeled off using a sterilized scalpel, sterilized tweezers and scissors to expose the joint. After decontamination with about 100 mL of disinfectant again, the joint capsule is opened using a sterilized scalpel and the synovial tissue present inside the capsule is collected. The collected synovial tissue is immersed in PBS (−) until use, and stored in a refrigerator or ice. As the sterilized knife, a disposable knife may be used.
（２）単離組織の処理（工程（ａ））
次に、滅菌メスを用いて滑膜組織を細切し、ＰＢＳ（−）で洗浄する。具体的には、＃１０のメスを２本摺り合わせるように使用し、組織が完全にペースト状になるまで処理を続ける。２５ｍＬ容量ピペットに１５ｍＬ程度ＰＢＳ（−）を吸引し、そのまま滑膜組織のペーストを吸引する。これを５０ｍＬ容量の遠心チューブに移し、回転速度１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心して脂肪組織とそれ以外の組織に分離する。脂肪細胞は比重が軽く、遠心によってペレットとならないので、脂肪細胞を含む上清を吸引除去する。次いで、ペレットを細胞乖離液２０ｍＬに懸濁し、１００ｍｍペトリディッシュに移した後、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２の条件で３０分間反応させる。細胞乖離液は、例えば０．２５％程度のトリプシンと、１ｍＭ濃度のＥＤＴＡの混合液でよい。また、Ａｃｃｕｔａｓｅのような市販品を用いることも可能である。
(2) Treatment of isolated tissue (step (a))
Next, the synovial tissue is minced with a sterile scalpel and washed with PBS (−). Specifically, two # 10 scalpels are used to slide together, and the process is continued until the tissue is completely pasty. Aspirate about 15 mL of PBS (-) into a 25 mL pipette and aspirate the paste of synovial tissue. This is transferred to a 50 mL capacity centrifuge tube and centrifuged at a rotational speed of 1,500 rpm for 10 minutes to separate it into adipose tissue and other tissues. Since fat cells have a low specific gravity and cannot be pelleted by centrifugation, the supernatant containing fat cells is removed by aspiration. Next, the pellet is suspended in 20 mL of cell lysate, transferred to a 100 mm Petri dish, and then reacted for 30 minutes in a CO 2 incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 . The cell lysate may be, for example, a mixture of about 0.25% trypsin and 1 mM EDTA. It is also possible to use a commercial product such as Accutase.
３０分後、ダルベッコ変法イーグル培地に最終濃度１０％以上になるようにウシ胎児血清を添加したものを加え、酵素反応を停止させる。対象がヒト関節滑膜組織であれば、ヒト（提供者）血清を調整し、使用することが望ましい。これを再度５０ｍＬ容量の遠心チューブに移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行う。この操作で、再度上清に脂肪細胞が遊離するので、吸引、除去する。 After 30 minutes, the enzyme reaction is stopped by adding Dulbecco's modified Eagle's medium with fetal bovine serum added to a final concentration of 10% or more. If the subject is human synovial tissue, it is desirable to prepare and use human (provider) serum. This is again transferred to a 50 mL centrifuge tube and centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes. As a result of this operation, fat cells are released again into the supernatant.
（３）組織を処理することにより得られた細胞の培養（工程（ｂ）、（ｃ））
細胞培養を行うにあたり、上記操作で得られた組織を、細胞塊のない状態まで完全に消化する必要がある。この操作は、例えばＩ型コラゲナーゼを用いて行うことができる。０．１〜０．２ｇ程度のコラゲナーゼ粉末を量りとり、血清を含む培養液約１０ｍＬに溶解する。これをポアサイズ０．２〜０．２２μｍの滅菌用フィルターで濾過滅菌し、最終濃度が０．０２ｇ／ｍｌ〜０．０４ｇ／ｍｌとなるようにトリプシン処理済み滑膜組織ペーストに加える。反応を均一に行わせるため、処理中は常にスターラーバーで撹拌する。反応は３７℃、５％ＣＯ２、湿度飽和下のインキュベーター内で５時間〜１５時間行う。
(3) Culture of cells obtained by treating tissue (steps (b) and (c))
In performing cell culture, it is necessary to completely digest the tissue obtained by the above operation to a state where there is no cell mass. This operation can be performed using, for example, type I collagenase. About 0.1 to 0.2 g of collagenase powder is weighed and dissolved in about 10 mL of a culture solution containing serum. This is sterilized by filtration through a sterilizing filter having a pore size of 0.2 to 0.22 μm, and added to the trypsinized synovial tissue paste so that the final concentration is 0.02 g / ml to 0.04 g / ml. Stir with a stirrer bar at all times during processing to ensure a uniform reaction. The reaction is carried out in an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 and humidity saturation for 5 to 15 hours.
反応後、不要な分化を誘起する可能性がある細胞塊および組織片を除去するため、ポアサイズ４０〜１００ｕｍのフィルターで濾過してもよい。反応後の細胞液あるいは濾過後の細胞液は１５ｍＬ容量の遠心チューブに移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行う。上清を除去後、得られた細胞ペレットを培養液たとえば血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地、あるいはＰＢＳ（−）１０ｍＬ程度に懸濁し、再度１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行う。 After the reaction, filtration may be performed with a filter having a pore size of 40 to 100 um in order to remove cell clumps and tissue fragments that may induce unnecessary differentiation. The cell solution after the reaction or the cell solution after filtration is transferred to a 15 mL capacity centrifuge tube and centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes. After removing the supernatant, the obtained cell pellet is suspended in a culture solution such as Dulbecco's modified Eagle medium supplemented with serum or about 10 mL of PBS (−), and centrifuged again at 1,500 rpm for 10 minutes.
培養の開始にあたっては、プラスチック製シャーレあるいは細胞培養用フラスコを使用する。特に接着面にコーティングを行う必要はないが、より多くの細胞を得たい場合などには、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチンなどでコーティングしてから使用してもよい。あるいは、メーカーからコーティング済みのものを購入して使用することも可能である。 At the start of culture, a plastic petri dish or a cell culture flask is used. Although it is not particularly necessary to coat the adhesive surface, it may be used after coating with fibronectin, collagen, gelatin or the like in order to obtain more cells. Or it is also possible to purchase and use the coated one from the manufacturer.
培養液に細胞を懸濁し、上記プラスチック製シャーレに播種する。一般的な細胞培養では、ダルベッコ変法イーグル培地、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンなど）、ピルビン酸ナトリウム、およびウシ胎児血清あるいはヒト血清（最大１５％）から組成され、フィルター滅菌した培養液Ａが使用されるが、本発明では、幹細胞の高度な濃縮のために、次の培養液Ｂを使用する。 Cells are suspended in the culture solution and seeded in the plastic petri dish. In general cell culture, culture medium A is composed of Dulbecco's modified Eagle's medium, antibiotics (penicillin, streptomycin, amphotericin, etc.), sodium pyruvate, and fetal bovine serum or human serum (up to 15%) and filter sterilized. In the present invention, the following culture medium B is used for high concentration of stem cells.
培養液Ｂは、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-３４ＳＦＭに、培養液総量に対して１〜１０％好ましくは１〜５％の濃度となるウシ胎児血清、Ｌ-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンなど）を加え、フィルター滅菌したものである。このような濃度の血清を含む培養液Ｂを使用することで、幹細胞画分の割合を著しく向上させることが可能である。 The culture solution B is obtained by adding StemPro (registered trademark) -34SFM to fetal bovine serum, L-glutamine, sodium pyruvate, and antibiotics having a concentration of 1 to 10%, preferably 1 to 5%, based on the total amount of the culture solution. Penicillin, streptomycin, amphotericin, etc.) and filter sterilized. By using the culture solution B containing serum at such a concentration, the proportion of the stem cell fraction can be significantly improved.
なお、培養液の液量は、プラスチックシャーレの径によって変更し、例えば直径３５ｍｍであれば液量は２〜４ｍＬが望ましく、直径６０ｍｍであれば４〜８ｍＬが望ましい。直径１００ｍｍのものを使用する場合は約８〜１２ｍＬが適当量である。また、培養液に懸濁する細胞の数も使用するシャーレの径に応じて変更する。例えばウシ滑膜細胞の場合、１ｃｍ２あたり１５，０００〜５０，０００細胞が播種されるように調整することが望ましい。 In addition, the liquid volume of a culture solution changes with the diameters of a plastic petri dish, for example, if the diameter is 35 mm, the liquid volume is desirably 2 to 4 mL, and if the diameter is 60 mm, 4 to 8 mL is desirable. When using a 100 mm diameter thing, about 8-12 mL is a suitable quantity. Further, the number of cells suspended in the culture medium is also changed according to the diameter of the petri dish to be used. For example, in the case of bovine synovial cells, it is desirable to adjust so that 15,000 to 50,000 cells are seeded per 1 cm 2 .
培養液に懸濁し、シャーレに播種した細胞は３７℃、５％ＣＯ２、湿度飽和下のインキュベーター内で３〜６日間培養する。培養期間は６日を超えてはならない。培養期間の超過は、幹細胞画分の減少または消失を招く可能性が高い。培養に際しては、培養経過の観察による温度および培養液ｐＨの急激な変化などの不要なストレスを避ける観点から、分離、培養開始から２日間は培養器の扉の開閉を止め密閉することが望ましい。 Cells suspended in a culture medium and seeded in a petri dish are cultured in an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 and humidity saturation for 3 to 6 days. The culture period should not exceed 6 days. Exceeding the culture period is likely to lead to a decrease or disappearance of the stem cell fraction. In culturing, from the viewpoint of avoiding unnecessary stress such as a rapid change in temperature and culture medium pH by observing the culturing process, it is desirable to close and close the door of the incubator for 2 days from the start of the separation and culturing.
培養期間終了後、酵素、キレート剤あるいはその混合液を用いて細胞を乖離する。たとえば、一般的な細胞培養に使用されるトリプシンとＥＤＴＡとの混合液を使用することができる。Ａｃｃｕｔａｓｅのような幹細胞用乖離酵素を使用してもよい。酵素反応は３７℃、５％ＣＯ２、湿度飽和下のインキュベーター内で、細胞の境界が明瞭になり、シャーレ底面から遊離するまで継続する。たとえばウシ滑膜細胞の場合、約５分間の処理時間で十分である。 After completion of the culture period, the cells are detached using an enzyme, a chelating agent or a mixture thereof. For example, a mixed solution of trypsin and EDTA used for general cell culture can be used. A stem cell dissociation enzyme such as Accutase may be used. The enzyme reaction continues in an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 and humidity saturation until the cell boundary becomes clear and is released from the bottom of the petri dish. For example, in the case of bovine synovial cells, a treatment time of about 5 minutes is sufficient.
次いで、血清を含む培養液を酵素液の等量添加し、ピペットにより混合する。この時加える培養液としては、培養液Ａのような１０％以上の濃度で血清を含んでいるものが望ましい。これを１５ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブに移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行う。上清を除去後、得られた細胞ペレットを培養液Ｃに懸濁し、ピペットにより混合した後、一部を取り分け、等量のトリパンブルー液と混和する。これを血球計算版に置き、正立顕微鏡下で生存細胞数を数える。 Next, an equal volume of enzyme solution is added to the culture solution containing serum and mixed with a pipette. As the culture solution added at this time, a culture solution containing serum at a concentration of 10% or more like the culture solution A is desirable. This is transferred to a disposable centrifuge tube having a capacity of 15 mL and centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes. After removing the supernatant, the obtained cell pellet is suspended in the culture medium C, mixed with a pipette, and a part is separated and mixed with an equal amount of trypan blue solution. Place this in a hemocytometer and count the number of viable cells under an upright microscope.
この培養液Ｃは、インキュベーター外での操作を目的とした培養液であり、大気との接触によるｐＨの変化を防ぐような物質が添加されていることが望ましい。また、過剰量の血清は分析機器の汚染や細胞の変質を招く可能性があるので、最終濃度が１〜５％程度のものが望ましい。培養液Ｃとしては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンなど）、ウシ胎児血清あるいはヒト血清、およびＨＥＰＥＳから組成されたものを、フィルター滅菌後に使用する。 This culture solution C is a culture solution intended for operation outside the incubator, and it is desirable to add a substance that prevents pH change due to contact with the atmosphere. Moreover, since an excessive amount of serum may cause the contamination of analytical instruments or the alteration of cells, a final concentration of about 1 to 5% is desirable. As the culture solution C, for example, a composition composed of Dulbecco's modified Eagle medium, antibiotics (such as penicillin, streptomycin, amphotericin), fetal bovine serum or human serum, and HEPES is used after filter sterilization.
トリパンブルー液は生細胞の細胞膜を透過できないが、死細胞の膜を透過し、細胞質を青色に染める。これにより、生細胞であれば透明ないし白色、死細胞であれば青色として顕微鏡下で区別することが可能である。細胞を数えた後、得られた数値をもとに全体の細胞数を算出する。次いで、培養液Ｂを用いて、細胞濃度が５ｘ１０５〜５ｘ１０６細胞／ｍＬとなるように調整する。 Trypan blue solution cannot penetrate the cell membrane of living cells, but it penetrates the membrane of dead cells and stains the cytoplasm blue. Thereby, it is possible to distinguish under a microscope as transparent or white if it is a living cell, and blue if it is a dead cell. After counting the cells, the total number of cells is calculated based on the obtained numerical value. Next, using the culture medium B, the cell concentration is adjusted to 5 × 10 5 to 5 × 10 6 cells / mL.
（４）ＦＡＣＳによる細胞の分離（工程（ｄ））
１５ｍＬ容量の遠心チューブに細胞懸濁液を１ｍＬずつ分注し、蛍光色素Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅを加える。Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅの濃度は１．５〜５μｇ程度が最適範囲であることが多いが、色素の生産ロット変更時および動物種を変更する際には、常に最適化する必要がある。
(4) Separation of cells by FACS (step (d))
Dispense 1 mL of the cell suspension into a 15 mL centrifuge tube and add the fluorescent dye Bis-benzimide. The concentration of Bis-benzimide is often in the optimum range of about 1.5 to 5 μg, but it is always necessary to optimize when changing the pigment production lot and changing the animal species.
次いで、別のチューブに細胞液を等量取り分け、同様に、Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅおよびＶｅｒａｐａｍｉｌを加える。ＶｅｒａｐａｍｉｌはＢｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅを細胞外に排出するポンプタンパク質を阻害する化学物質であり、添加によりＳＰ画分が消失することが知られている。そのため、幹細胞領域となるＳＰ画分の範囲を正確に設定する上で必須である。 Then, aliquot the cell fluid into another tube and add Bis-benzimide and Verapamil as well. Verapamil is a chemical substance that inhibits a pump protein that excretes Bis-benzimide outside the cell, and it is known that the SP fraction disappears upon addition. Therefore, it is indispensable for accurately setting the range of the SP fraction serving as the stem cell region.
細胞の展開、分離はフローサイトメーターを用いて行う。使用する機器は、３５０ｎｍ波長のＵＶレーザーを照射できるものが最適であるが、４０７ｎｍ波長のＶｉｏｌｅｔレーザーを照射する機器も使用することが可能である。３５０ｎｍ波長のＵＶレーザーを使用する場合、検出は４５０／２０ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｂｌｕｅ）および６７０／４０ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｒｅｄ）の２種類のフィルターを通したドットプロットを用いて行う。また、４０７ｎｍ波長のＶｉｏｌｅｔレーザーを照射する場合、４５０／４０ｎｍおよび６９５／４０ｎｍのフィルターを使用する。 Cell development and separation are performed using a flow cytometer. A device that can irradiate a 350 nm wavelength UV laser is optimal, but a device that irradiates a 407 nm wavelength Violet laser can also be used. When using a 350 nm wavelength UV laser, detection is performed using a dot plot through two types of filters: 450/20 nm (Hoechst Blue) and 670/40 nm (Hoechst Red). When irradiating a 407 nm wavelength Violet laser, 450/40 nm and 695/40 nm filters are used.
Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ添加区では認められるが、Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅおよびＶｅｒａｐａｍｉｌ添加区では消失している集団をＳＰ画分とし、ゲーティングを行い、ソーティングを行う。細胞は、例えば培養液Ｃを入れた１．５ｍＬ遠心チューブに受ける。 A population that is recognized in the Bis-benzomide addition group but disappeared in the Bis-benzomide and Verapamil addition group is designated as SP fraction, and gating is performed. Cells are received, for example, in a 1.5 mL centrifuge tube containing culture medium C.
なお、ＦＡＣＳによる分離に代えて、または、ＦＡＣＳによる分離と組み合わせて、磁気ビーズ法によって細胞を分離してもよい。 Note that cells may be separated by the magnetic bead method instead of separation by FACS or in combination with separation by FACS.
（５）分離した細胞の培養（工程（ｅ））
得られた細胞は５００Ｇ（Ｇは重力加速度、１Ｇ＝９．８０６６５ｍ／ｓ２）、４℃で１０分間遠心を行う。細胞ペレットを幹細胞培養用培養液に懸濁し、プラスチックディッシュに播種する。この際使用する培養液としては、幹細胞の培養に適した組成のものが望ましく、例えば、培養液Ｄを用いる。培養液Ｄは、ダルベッコ変法イーグル培地、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンなど）、ピルビン酸ナトリウム、およびウシ胎児血清あるいはヒト血清から組成されたものをフィルター滅菌し、これにインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、塩基性繊維芽細胞成長因子（Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ｂＦＧＦ）、幹細胞成長因子（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦ）を添加した培養液である。
(5) Culture of separated cells (step (e))
The obtained cells are centrifuged at 500 G (G is gravitational acceleration, 1G = 9.80665 m / s 2 ) at 4 ° C. for 10 minutes. The cell pellet is suspended in a culture solution for stem cell culture and seeded on a plastic dish. As the culture solution used at this time, a composition suitable for stem cell culture is desirable. For example, the culture solution D is used. The culture medium D is sterilized by filtration from Dulbecco's modified Eagle's medium, antibiotics (such as penicillin, streptomycin, amphotericin), sodium pyruvate, and fetal bovine serum or human serum. It is a culture solution to which selenate, basic fibroblast growth factor (bFGF), and stem cell factor (SCF) are added.
培養の際、以下に組成される培養液Ｅを使用すると、幹細胞の性質を維持したまま培養することが可能である。培養液Ｅは、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-３４ＳＦＭに、培養液総量に対し１〜５％の濃度となるようにウシ胎児血清、Ｌ-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンなど）を加え、フィルター滅菌した後、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、ｂＦＧＦおよびＳＣＦを添加したものである。また、１〜５μｇ／ｃｍ２濃度でヒトフィブロネクチンをコーティングしたペトリディッシュを用いると、幹細胞画分を選択的に、極めて高率よく増殖させることが可能である。 When culturing, the following culture medium E can be used while maintaining the properties of stem cells. The culture solution E was obtained by adding femtoserum, L-glutamine, sodium pyruvate, and antibiotics (penicillin, streptomycin, amphotericin) to StemPro (registered trademark) -34SFM so as to have a concentration of 1 to 5% of the total culture solution. Etc.) and filter sterilized, and then insulin, transferrin, selenite, bFGF and SCF are added. Moreover, when a petri dish coated with human fibronectin at a concentration of 1 to 5 μg / cm 2 is used, the stem cell fraction can be selectively and proliferated at an extremely high rate.
（６）得られた細胞の評価（工程（ｆ））
工程（ｄ）または工程（ｅ）において得られた幹細胞の性質を検定する方法としては、細胞が発現するＲＮＡを用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、幹細胞で特異的に発現している遺伝子を測定するＲＴ-ＰＣＲが有効であり、これを用いる。
(6) Evaluation of the obtained cells (step (f))
As a method for examining the property of the stem cell obtained in the step (d) or the step (e), a gene is specifically expressed in the stem cell by preparing cDNA by reverse transcriptase using RNA expressed by the cell. RT-PCR for measuring is effective and used.
逆転写反応は、例えばＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｄＮＴＰ混合液、ランダムプライマー、およびＤＥＰＣ処理水に幹細胞から抽出した全ＲＮＡを加え、サーマルサイクラーを使用して３７℃、１２０分、８５℃、５分といった条件で行えばよい。ＰＣＲの条件は、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合液、プライマー、オートクレーブ水の混合液中に目的とするＤＮＡを加え、サーマルサイクラーを使用して、９４℃、２分の変性反応に引き続き、９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、３０秒の増幅反応を３０回繰り返す、といった一般的なものでよい。 The reverse transcription reaction is performed, for example, by adding reverse RNA, RNase Inhibitor, dNTP mixture, random primer, and total RNA extracted from stem cells to DEPC-treated water, and using a thermal cycler at 37 ° C., 120 minutes, 85 ° C., 5 minutes. It may be performed under such conditions. The PCR conditions are, for example, that the target DNA is added to a mixed solution of Taq DNA polymerase, dNTP mixed solution, primer, and autoclave water, followed by a denaturation reaction at 94 ° C. for 2 minutes using a thermal cycler. 30 seconds, 55 ° C., 30 seconds, 72 ° C., 30 seconds of amplification reaction may be repeated 30 times.
またこの時、ＰＣＲ産物が１００ｂｐ前後となるように設計したプライマーを用い、ＳＹＢＲ-Ｇｒｅｅｎあるいは蛍光色素を付加したプローブをＰＣＲ系に混合することで、転写産物を定量的に観察する（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）ことができる。
用いるプライマーには、次の３種が含まれる。
At this time, the transcription product is quantitatively observed by using a primer designed so that the PCR product is about 100 bp and mixing the probe with SYBR-Green or fluorescent dye added to the PCR system (Real Time PCR). )be able to.
The primers used include the following three types.
プライマー１
遺伝子(ＮＣＢＩ ＩＤ)：Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ ｃ-Ｋｉｔ(２８０８３２)
順方向：ＣＡＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＡＡＴＧＣ；エキソン１９上
逆方向：ＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴ；エキソン２０上
増幅反応産物：７４ｂｐ
Primer 1
Gene (NCBI ID): Bos Taurus c-Kit (280832)
Forward direction: CAAGGAAGGTTTCCGAATGC; on exon 19 Reverse direction: CCCAGCAGGTCTTTCATGATGT; on exon 20 Amplification reaction product: 74 bp
プライマー２
遺伝子(ＮＣＢＩ ＩＤ)：Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ Ａｂｃｇ２（Ｂｃｒｐ１）(５３６２０３)
順方向：ＣＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡ；エキソン１４上
逆方向：ＡＧＴＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＴＧＴＣ；エキソン１５上
増幅反応産物：９８ｂｐ
Primer 2
Gene (NCBI ID): Bos Taurus Abcg2 (Bcrp1) (536203)
Forward direction: CCTTGGGTGTCATGGCTTCA; on exon 14 Reverse direction: AGTCCTGGGCAAGGTTTGTC; on exon 15 Amplification product: 98 bp
プライマー３
遺伝子(ＮＣＢＩ ＩＤ)：Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ ＣＤ３４(２８１０５１)
順方向：ＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＣＣＧＣ；エキソン７上
逆方向：ＴＣＣＡＣＧＴＡＡＴＡＡＧＧＧＴＣＴＴＣＧＣ；エキソン８上
増幅反応産物：７４ｂｐ
Primer 3
Gene (NCBI ID): Bos Taurus CD34 (281051)
Forward direction: TCCTATTTCCTGATGACACCGC; on exon 7 Reverse direction: TCCACGTAATAAGGGTCTTTCGC; on exon 8 Amplification product: 74 bp
次に、樹立された幹細胞の評価基準について説明する。
細胞形状
Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅを排出できない画分をＭＰ（Ｍａｊｏｒ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）として採取しておき、これを幹細胞と比較することで形態的、生理学的な特徴の違いを明らかにすることができる。具体的には、ＭＰには大きな細胞質を持ち、同心状に広がるものが多いのに対し、幹細胞は紡錘状で、島状のコロニーを形成しながら増殖する場合が多い。図１に、分離後のＭＰおよびＳＰの細胞形状を示す。
Next, evaluation criteria for established stem cells will be described.
The fraction incapable of discharging the cell shape Bis-benzimide is collected as MP (Major Population), and the difference between the morphological and physiological characteristics can be clarified by comparing this with a stem cell. Specifically, many MPs have a large cytoplasm and spread concentrically, whereas stem cells are spindle-shaped and often proliferate while forming island-like colonies. FIG. 1 shows the cell shapes of MP and SP after separation.
細胞表面マーカー
ＣＤ３４抗原；骨髄造血幹細胞のマーカーとして知られている。本発明で分離した幹細胞の一部はこれを強く発現している。
ｃ-Ｋｉｔ；生殖幹細胞や骨髄造血幹細胞で発現するレセプタータンパク質。ＣＤ１１７抗原と分類される。前記ＳＣＦの受容体であり、本発明で分離、培養した幹細胞で強く発現する。
Cell surface marker CD34 antigen; known as a marker for bone marrow hematopoietic stem cells. Some of the stem cells isolated in the present invention strongly express this.
c-Kit: a receptor protein expressed in germ stem cells and bone marrow hematopoietic stem cells. Classified as CD117 antigen. It is a receptor for the SCF and is strongly expressed in stem cells isolated and cultured according to the present invention.
細胞内／核内マーカー
Ｂｃｒｐ-１；Ａｂｃｇ２ともいう。本発明で使用するＢｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅなどの細胞膜透過性色素を、細胞外へ排出するタンパク質。骨髄間葉系幹細胞で発現する。分化した体細胞では発現あるいは機能を認めないことから、この特性を利用して幹細胞を抽出することができる。
Intracellular / intranuclear marker Bcrp-1; also referred to as Abcg2. Proteins that excrete cell membrane permeable dyes such as Bis-benzimide and Rhodamine used in the present invention out of the cells. It is expressed on bone marrow mesenchymal stem cells. Since differentiated somatic cells have no expression or function, stem cells can be extracted using this property.
ＴＥＲＴ；テロメラーゼ。幹細胞や一部の腫瘍細胞、生殖細胞、株化細胞などで発現し、活性の低下が細胞老化と関連するとされる酵素。 TERT; telomerase. An enzyme that is expressed in stem cells, some tumor cells, germ cells, cell lines, etc., and whose decreased activity is associated with cellular senescence.
本発明の滑膜由来幹細胞、および滑膜幹細胞の濃縮培養法は、具体的には下記の性質を有する。
（ｉ）Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅの染色に対し色素の排出能力を有し、ＳＰとして分離される。また、対照区として取得したＭＰとは明らかに細胞形態を異にする。本発明には、特にウシ以外の滑膜組織に由来する幹細胞の樹立法も含まれる。
（ｉｉ）分離、培養した滑膜幹細胞に関して、骨髄間葉系幹細胞に類似する性質を有する。具体的には、ＣＤ３４を発現する細胞を派生し、ｃ-Ｋｉｔ、ＴＥＲＴを発現する。
（ｉｉｉ）幹細胞濃縮培養液Ｂで有意に濃縮される。本発明には同濃縮培養法も含まれる。
（ｉｖ）分離、培養した滑膜幹細胞は自発的な分化により、ＳＰ、ＭＰを含む多様な細胞集団に分化する。
The synovial stem cell and the synovial stem cell enrichment culture method of the present invention specifically have the following properties.
(I) It has an ability to discharge a pigment with respect to staining of Bis-benzimide and is separated as SP. In addition, the cell morphology is clearly different from MP obtained as a control group. The present invention also includes a method for establishing stem cells derived from synovial tissues other than bovine.
(Ii) The isolated and cultured synovial stem cells have properties similar to bone marrow mesenchymal stem cells. Specifically, a cell expressing CD34 is derived, and c-Kit and TERT are expressed.
(Iii) It is significantly enriched with the stem cell enriched culture medium B. The concentrated culture method is also included in the present invention.
(Iv) The isolated and cultured synovial stem cells differentiate into various cell populations including SP and MP by spontaneous differentiation.
以下、実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例によってなんら限定されるものではない。なお、以下の実施例において、液体または固体についての「％」は、特に記載しない場合は重量％を示すものとする。また、ＣＯ２、Ｏ２などの気体についての「％」は体積％を示すものとする。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the examples. In the following examples, “%” for a liquid or solid indicates weight% unless otherwise specified. Further, “%” for gases such as CO 2 and O 2 represents volume%.
［実施例］ウシ関節滑膜幹細胞の分離と培養
（１）滑膜組織の採取（工程（ａ））
ウシ脚部は、阪南畜産株式会社で屠殺、処理され、無償で提供されたものを使用した。外皮に付着した土などの汚れを流水で洗浄し、約１００ｍＬのイソジン（登録商標）液（明治製菓株式会社）で消毒を行った。続いて、＃１０のディスポーザブルメス（ＦＥＡＴＨＥＲ（登録商標）Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ｓｃａｌｐｅｌ＃１０）と滅菌済みのピンセット、ハサミを用いて表皮を剥離し、関節部を露出した。これに再度約１００ｍＬのイソジン（登録商標）液をスプレーし、クリーンベンチ内に導入した。
[Example] Isolation and culture of bovine joint synovial stem cells (1) Collection of synovial tissue (step (a))
The cow legs were slaughtered and processed by Hannan Livestock Co., Ltd., and provided free of charge. Dirt such as soil adhering to the outer skin was washed with running water, and sterilized with about 100 mL of Isodin (registered trademark) solution (Meiji Seika Co., Ltd.). Subsequently, the epidermis was peeled off using # 10 disposable scalpel (FEATHER (registered trademark) Disposable scalar # 10), sterilized tweezers, and scissors to expose the joint. About 100 mL of isodine (registered trademark) solution was sprayed on this again and introduced into the clean bench.
次いで新しい＃１０のディスポーザブルメスを用いて関節包を開放し、包の内側に存在する滑膜組織を採取した。採取した滑膜組織は抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンカクテル；Ｌｏｎｚａ，Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ-Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ-Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ １００Ｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ，１７-７４５Ｈ）５００μＬを添加したＰＢＳ（−）（ＧＩＢＣＯ，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ，２１６００-０１０）５０ｍＬに浸し洗浄した。 The joint capsule was then opened using a new # 10 disposable scalpel and the synovial tissue present inside the capsule was collected. The collected synovial tissue was PBS (c) (CO) (c) (CO) (B) with an antibiotic (penicillin, streptomycin, amphotericin cocktail; Lonza, Biowhitaker (registered trademark) Penicillin-Streptomycin-Amphothericin 100X concentrated, 17-745H) 's Phosphate Buffered Saline, 21600-010) Dipped in 50 mL and washed.
（２）単離組織の処理（工程（ａ））
次に、＃１０のメスを２本摺り合わせるように使用し、組織が完全にペースト状になるまで細切した。２５ｍＬ容量ディスポーザブルピペット（ＦＡＬＣＯＮ，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｉｐｅｔ ３５７５２５）に１５ｍＬのＰＢＳ（−）を吸引し、そのまま滑膜組織のペーストを吸引した。これを５０ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブ（アシスト，６２.５４８.００４Ｓ）に移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心した後、上清を吸引除去した。次いで、形成されたペレットを０．２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ，Ｔｒｙｐｓｉｎ １：２５０，２７２５０-０１８）-１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ，Ｅｔｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，Ｅ６７５８-１００Ｇ）液２０ｍＬに懸濁し、１００ｍｍペトリディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ，細胞培養ディッシュ，３５３００３）に移した後、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２の条件で３０分間反応させた。
(2) Treatment of isolated tissue (step (a))
Next, two # 10 scalpels were used to rub together, and were minced until the tissue was completely pasty. 15 mL of PBS (−) was sucked into a 25 mL disposable pipette (FALCON, Serological pipette 357525), and the synovial tissue paste was sucked as it was. This was transferred to a 50 mL disposable centrifuge tube (Assist, 62.5548.004S), centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed by suction. Next, the formed pellet was suspended in 20 mL of 0.25% trypsin (GIBCO, Trypsin 1: 250, 27250-018) -1 mM EDTA (SIGMA, Ethylenediamine tetracic acid, E6758-100G), and 100 mm Petri dish (FALCON). , Cell culture dish, 353003), and reacted in a CO 2 incubator for 30 minutes at 37 ° C. and 5% CO 2 .
３０分後、１０％ＦＣＳ-ＤＭＥＭ［ダルベッコ変法イーグル培地（日水製薬株式会社，ダルベッコ変法イーグル培地２，０５９１９）４．７５ｇを５００ｍＬの蒸留水に溶解し、オートクレーブ処理した後、０．２９２ｇ Ｌ-グルタミン（ＧＩＢＣＯ，２１０５１-０２４）、１０％炭酸水素ナトリウム（和光純薬，ＮａＨＣＯ３，１９１-０１３０５）水溶液６ｍＬ，および５０ｍＬウシ胎児血清（Ｐｅｒｂｉｏ，Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標），ＳＨ３０３９６.０３）を添加し撹拌した後、ポアサイズ０．２２μｍのボトルトップフィルター（Ｉｗａｋｉ，ボトルトップフィルター５００ｍＬ，８０２２-０３３）にて滅菌を行ったもの］を加え、トリプシン反応を停止させた。これを再度５０ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブに移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心した。 30 minutes later, 4.75 g of 10% FCS-DMEM [Dulbecco Modified Eagle Medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Dulbecco Modified Eagle Medium 2,05919) was dissolved in 500 mL of distilled water and autoclaved. 292 g L-glutamine (GIBCO, 21051-024), 10 mL of 10% sodium bicarbonate (Wako Pure Chemicals, NaHCO 3 , 191-01305) aqueous solution, and 50 mL fetal calf serum (Perbio, Hyclone (registered trademark), SH30396.03) Was added and stirred, and then sterilized with a bottle top filter (Iwaki, bottle top filter 500 mL, 8022-033) having a pore size of 0.22 μm was added to stop the trypsin reaction. This was again transferred into a 50 mL disposable centrifuge tube and centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes.
上記の工程の間、０．１２５ｇのコラゲナーゼ粉末（ＳＩＧＭＡ，Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｒｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ ｔｙｐｅ Ｉ，Ｃ０１３０-１Ｇ）を量りとり、血清を含む培養液１０ｍＬに溶解した。これをポアサイズ０．２μｍの滅菌用フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｍｉｎｉｓａｒｔ（登録商標），１６５３４）で濾過滅菌し、遠心後に上清を除去した滑膜組織ペーストに加えた。２５ｍＬ容量ディスポーザブルピペットを用いて１００ｍＬ容量アシストチューブ（アシスト，７５.５６２.３００Ｓ）にスターラーバーと共に移し、３７℃、５％ＣＯ２、湿度飽和下のインキュベーター内で撹拌しながら１２時間反応させた。 During the above steps, 0.125 g of collagenase powder (SIGMA, Collagenase from Chrodridium histolyticum type I, C0130-1G) was weighed and dissolved in 10 mL of culture medium containing serum. This was sterilized by filtration through a filter for sterilization having a pore size of 0.2 μm (Sartorius, Minisart (registered trademark), 16534), and added to the synovial tissue paste from which the supernatant was removed after centrifugation. The sample was transferred to a 100 mL capacity assist tube (Assist, 75.562.300S) with a stirrer bar using a 25 mL disposable pipette, and reacted for 12 hours while stirring in an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 and humidity saturation.
反応後、細胞液をポアサイズ１００ｕｍのフィルター（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ，３５２３６０）を設置した５０ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブ内に濾過し、次いで１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行った。上清を除去後、得られた細胞ペレットを培養液１０ｍＬに懸濁し、１５ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）１５ｍＬ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ，４３０７６６）に移した後再度１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行った。 After the reaction, the cell solution was filtered into a 50 mL capacity disposable centrifuge tube equipped with a filter having a pore size of 100 μm (BD FALCON, Cell Strainer, 352360), and then centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes. After removing the supernatant, the obtained cell pellet was suspended in 10 mL of the culture solution, transferred to a 15 mL disposable centrifuge tube (Corning Incorporated, Corning (registered trademark) 15 mL center tube, 430766), and again at 1,500 rpm. Centrifugation was performed for 10 minutes.
（３）細胞の一次培養（濃縮培養）（工程（ｂ）、（ｃ））
ディスポーザブルピペットにより培養液と混合した後、細胞液の一部を取り分け、等量のトリパンブルー液と混和した。これを血球計算版に置き、正立顕微鏡下で生存細胞数を数えた。生存細胞が１ｃｍ２あたり５０，０００個となるように、幹細胞濃縮培養液（培養液Ｂ）［ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-３４ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ，１０６３９-０１１）４８０ｍＬに、ウシ胎児血清５ｍＬ、０．２９２ｇ Ｌ-グルタミン（ＧＩＢＣＯ， ２１０５１-０２４）、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ，Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，１１３６０-０７０）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンカクテル）を加え、ポアサイズ０．２２μｍのボトルトップフィルターで滅菌したもの］で調整し、予め０．１％ゼラチン（ＭＰ ｂｉｏ ｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｇｅｌａｔｉｎ ｔｙｐｅＡ，９０１７７１）で処理した１００ｍｍ径プラスチックディッシュに播種した。なお、培養液の量は１０ｍＬ／枚とした。
(3) Primary cell culture (concentrated culture) (steps (b) and (c))
After mixing with the culture solution using a disposable pipette, a part of the cell solution was separated and mixed with an equal amount of trypan blue solution. This was placed on a hemocytometer and the number of viable cells was counted under an upright microscope. Stem cell concentrated culture solution (culture solution B) [StemPro®-34SFM (GIBCO, 10639-011) 480 mL, fetal bovine serum 5 mL, 0.292 g so that the number of viable cells is 50,000 per cm 2. L-glutamine (GIBCO, 21051-024), 10 mM sodium pyruvate (GIBCO, Sodium Pyruvate solution, 11360-070), antibiotics (penicillin, streptomycin, amphotericin cocktail) were added, and the bottle top with a pore size of 0.22 μm Sterilized with a filter] and seeded on a 100 mm diameter plastic dish previously treated with 0.1% gelatin (MP biomedicals, Gelatin type A, 901771). The amount of the culture solution was 10 mL / plate.
培養期間終了後、２ｍＬ／枚の０．２５％トリプシン-１ｍＭ ＥＤＴＡを加え、３７℃、５％ＣＯ２、湿度飽和下のインキュベーター内で５分間培養した。次いで１０％ＦＣＳ-ＤＭＥＭを２ｍＬ添加し、ディスポーザブルピペットにより混合した。これを１５ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブに移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行った。上清を除去後、得られた細胞ペレットをＦＡＣＳバッファ［ダルベッコ変法イーグル培地(日水製薬株式会社，ダルベッコ変法イーグル培地１，０５９１５）５ｇ、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンカクテル）５ｍＬ、ウシ胎児血清１０ｍＬ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ＳＩＧＭＡ，Ｈ４０３４-２５Ｇ）１ｍＬに、総量５００ｍＬとなるよう蒸留水を加え、ポアサイズ０．２２μｍのボトルトップフィルターで滅菌を行ったもの］に懸濁した後、１０μＬを取り分け、等量のトリパンブルー液と混和し、生存細胞数を数えた。次いで、ＦＡＣＳバッファを用いて細胞濃度が１ｘ１０６細胞／ｍＬとなるように調整した。 After completion of the culture period, 2 mL / plate of 0.25% trypsin-1 mM EDTA was added, and the cells were cultured for 5 minutes in an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 and humidity saturation. Next, 2 mL of 10% FCS-DMEM was added and mixed with a disposable pipette. This was transferred to a disposable centrifuge tube with a capacity of 15 mL and centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes. After removing the supernatant, the obtained cell pellet was subjected to FACS buffer [Dulbecco Modified Eagle Medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Dulbecco Modified Eagle Medium 1,05915), antibiotics (penicillin, streptomycin, amphotericin cocktail). ) 5 mL, fetal bovine serum 10 mL, 1 M HEPES (SIGMA, H4034-25G) 1 mL, distilled water added to a total volume of 500 mL, and suspending in a bottle-top filter with a pore size of 0.22 μm] 10 μL was separated and mixed with an equal volume of trypan blue solution, and the number of viable cells was counted. Next, the cell concentration was adjusted to 1 × 10 6 cells / mL using FACS buffer.
（４）ＦＡＣＳによる細胞の分離（工程（ｄ））
１５ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブに細胞懸濁液を１ｍＬずつ分注し、蛍光色素Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ，２'-（４-Ｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）-５-（４-ｍｅｔｈｙｌ-１-ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）-２，５'-ｂｉ-１Ｈ-ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｂ２２６１-２５ＭＧ）を１．８〜２．０μｇ加えた。次いで別のチューブに細胞液を等量取り分け、同様に１．８〜２．０μｇのＢｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅおよびＶｅｒａｐａｍｉｌ（ＳＩＧＭＡ，Ｒ（＋）-Ｖｅｒａｐａｍｉｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｖ４６２９-１Ｇ）を加えた。ディスポーザブル遠心チューブの蓋部をシールした後、３７℃に設定したウォーターバスに沈め、９０分間培養した。なお、染色にムラが出来ないように、３０分毎に撹拌した。
(4) Separation of cells by FACS (step (d))
Dispense 1 mL of the cell suspension into a 15 mL disposable centrifuge tube, and add the fluorescent dye Bis-benzimide (SIGMA, 2 '-(4-Ethoxyphenyl) -5- (4-methyl-1-piperazinyl) -2,5 '-bi-1H-benzimidazole trihydrochloride, B2261-25MG) was added at 1.8 to 2.0 μg. Next, an equal amount of the cell solution was divided into another tube, and similarly 1.8 to 2.0 μg of Bis-benzimide and Verapamil (SIGMA, R (+)-Verapamil hydrochloride, V4629-1G) were added. After the lid of the disposable centrifuge tube was sealed, it was submerged in a water bath set at 37 ° C. and cultured for 90 minutes. In addition, it stirred every 30 minutes so that a nonuniformity might not be made in dyeing.
染色終了後、氷冷したＦＡＣＳバッファ１０ｍＬを遠心チューブに加え、４℃で１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行った。上清を吸引除去した後、再度１ｍＬのＦＡＣＳバッファに懸濁し、氷上にて保存した。 After completion of the staining, 10 mL of ice-cooled FACS buffer was added to the centrifuge tube and centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes at 4 ° C. After removing the supernatant by aspiration, it was suspended again in 1 mL of FACS buffer and stored on ice.
細胞の展開、分離は３５０ｎｍ波長のＵＶレーザーを照射できるＦＡＣＳ ＶａｎｔａｇｅＳＥを使用した。検出は４５０／２０ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｂｌｕｅ）、６７０／４０ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｒｅｄ）２種類のフィルターを通したドットプロットを用いて行い、Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ添加区では認められるが、Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅおよびＶｅｒａｐａｍｉｌ添加区では消失している集団をＳＰ画分とし、ソーティングを行った。細胞は、ＦＡＣＳバッファを入れた１．５ｍＬ遠心チューブ（アシスト，滅菌サンプリングチューブ，７２.６９０５）に採取した。 FACS VantageSE capable of irradiating with a 350 nm wavelength UV laser was used for cell development and separation. Detection was performed using a dot plot through two types of filters, 450/20 nm (Hoechst Blue) and 670/40 nm (Hoechst Red), and was observed in the Bis-benzimide addition group, but disappeared in the Bis-benzimide and Verapamyl addition groups. The sorting group was used as the SP fraction for sorting. Cells were collected in 1.5 mL centrifuge tubes (assist, sterile sampling tubes, 72.6905) containing FACS buffer.
採取した細胞は一部を液体窒素で凍結し、解析用サンプルとして−８０℃ディープフリーザーに保管した。一部は細胞培養に供試した。 A part of the collected cells was frozen with liquid nitrogen and stored in a -80 ° C deep freezer as a sample for analysis. Some were subjected to cell culture.
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色を用いて展開した生細胞画分Ｐ０全体のドットプロットを図２に示す。図中、Ｐ１で示した画分がＳＰ画分であり、Ｐ２で示した画分はＭＰ画分の一部である。ＦＡＣＳにおいては、定法に従い、予め全イベントを前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）で展開し、細胞の大きさを前方散乱から、内部構造を側方散乱から判断して、生細胞画分Ｐ０を抽出した。ＳＰ画分および生細胞画分Ｐ０全体の前方散乱および側方散乱で展開したドットプロットを、図３（ａ）および図３（ｂ）にそれぞれ示す。なお、図２および図３は、培養液Ｂ中の血清濃度が１％のときのものである。 A dot plot of the entire live cell fraction P0 developed using Hoechst 33342 staining is shown in FIG. In the figure, the fraction indicated by P1 is the SP fraction, and the fraction indicated by P2 is a part of the MP fraction. In FACS, all events are developed in advance by forward scatter (FSC) and side scatter (SSC) in accordance with a standard method, and the size of cells is judged from forward scatter and the internal structure is judged from side scatter. Minute P0 was extracted. The dot plot developed by forward scatter and side scatter of the SP fraction and the whole live cell fraction P0 is shown in FIGS. 3 (a) and 3 (b), respectively. 2 and 3 are obtained when the serum concentration in the culture solution B is 1%.
ＳＰ画分に含まれる細胞の全イベントに対する割合は、図４および以下に示すとおりであった。
培養液Ｂ中の血清濃度 ＳＰ画分割合平均値 標本数
１％ ８．９％ ６
５％ ６．３％ ５
１０％ ４．１％ ４
１５％ ２．８％ ４
The ratio of the cells contained in the SP fraction to all the events was as shown in FIG. 4 and below.
Serum concentration in culture medium B SP fraction ratio average value Number of samples 1% 8.9% 6
5% 6.3% 5
10% 4.1% 4
15% 2.8% 4
異なる血清濃度間でＳＰ画分の細胞の割合に有意差があるか否かを調べるために、等分散を仮定したｔ検定（両側）を行ったところ、濃度１％と濃度１５％の比較ではｔ＝４．４１７１９５（Ｐ（危険率）＝０．００２２３）、濃度１％と濃度１０％の比較ではｔ＝３．４３９０８（Ｐ＝０．００８８３６）、濃度５％と濃度１５％の比較ではｔ＝２．７４５７４（Ｐ＝０．０２８７）であった。このように、血清濃度が１〜５％であるときと１５％であるときとでは、ＳＰ画分の細胞の割合に有意な差がある。 In order to examine whether there is a significant difference in the proportion of cells in the SP fraction between different serum concentrations, a t-test (two-sided) assuming equal variance was performed. t = 4.417195 (P (hazardous rate) = 0.00223), comparison between 1% concentration and 10% concentration is t = 3.443908 (P = 0.38836), comparison between 5% concentration and 15% concentration t = 2.74574 (P = 0.0287). Thus, there is a significant difference in the proportion of cells in the SP fraction when the serum concentration is 1 to 5% and when it is 15%.
工程（ａ）の処理後の単離組織、つまり培養を行っていない単離組織について、上記と同様の方法でＳＰ画分の細胞の割合を求めたところ、２．３８％であった。すなわち、ＳＰ画分の細胞は、培養液Ｂ中の血清濃度を５％にすることによって約２．６倍に、血清濃度を１％にすることによって約３．７倍に濃縮された。 With respect to the isolated tissue after the treatment in step (a), that is, the isolated tissue not cultured, the proportion of cells in the SP fraction was determined by the same method as described above, and was 2.38%. That is, the cells of the SP fraction were concentrated about 2.6 times when the serum concentration in the culture medium B was 5%, and about 3.7 times when the serum concentration was 1%.
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色を用いて展開したドットプロットにおける、Ｖｅｒａｐａｍｉｌの添加によって消失しない領域と、Ｖｅｒａｐａｍｉｌの添加によって消失する領域とを図５に示す。図５において、（ａ）および（ｃ）は、Ｖｅｒａｐａｍｉｌ添加前、（ｂ）および（ｄ）はＶｅｒａｐａｍｉｌ添加後のプロットである。（ａ）における領域ＲＢは、（ｂ）に示すようにＶｅｒａｐａｍｉｌ添加後も消失せず、幹細胞ではないと考えられる。一方、（ｃ）における領域ＲＡは（ｄ）に示すようにＶｅｒａｐａｍｉｌの添加によって消失しており、幹細胞の可能性が高い。本発明ではこの領域ＲＡをＳＰ画分としている。 In the dot plot developed using Hoechst 33342 staining, a region that does not disappear due to the addition of Verapamyl and a region that disappears due to the addition of Verapamyl are shown in FIG. In FIG. 5, (a) and (c) are plots before Verapamil is added, and (b) and (d) are plots after Verapamil is added. The region RB in (a) does not disappear even after the addition of Verapamyl as shown in (b), and is considered not a stem cell. On the other hand, the region RA in (c) has disappeared by the addition of Verapamyl as shown in (d), and the possibility of stem cells is high. In the present invention, this area RA is used as the SP fraction.
領域ＲＡおよび領域ＲＢは、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色でのドットプロットにおいては、重なりがちである。しかし、領域ＲＡおよび領域ＲＢに属する細胞は、前方散乱および側方散乱でのドットプロットにおいては分離する。図６に、前方散乱および側方散乱で展開したドットプロットにおける領域ＲＡおよび領域ＲＢを示す。 Region RA and region RB tend to overlap in a dot plot with Hoechst 33342 staining. However, the cells belonging to the region RA and the region RB are separated in the dot plots in forward scatter and side scatter. FIG. 6 shows a region RA and a region RB in a dot plot developed by forward scattering and side scattering.
（５）分離細胞の培養（工程（ｅ））
上記の方法で分離した幹細胞画分１０，０００個を、幹細胞培養液（培養液Ｅ）［ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-３４ＳＦＭ ４８０ｍＬに、ウシ胎児血清５ｍＬ、０．２９２ｇ Ｌ-グルタミン、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンカクテル）を加え、ポアサイズ０．２２μｍのボトルトップフィルターにて滅菌した後、１０μｇ／ｍＬインスリン、５．５μｇ／ｍＬトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸カクテル（ＧＩＢＣＯ，Ｉｎｓｕｌｉｎ-Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ-Ｓｅｒｅｎｉｕｍ-Ｇ，４１４００-０４５）、１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、および２５ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＳＣＦ，３００-０７）を添加したもの］１ｍＬに懸濁し、１．５μｇ／ｃｍ２濃度でヒトフィブロネクチン（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ，Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，３５４００８）をコーティングした２４ｗｅｌｌ ｄｉｓｈ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）２４ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ ｗｉｔｈ Ｌｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ，Ｎｏｎ-ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ）に播種した。これをＣＯ２インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養を行った。
(5) Culture of isolated cells (step (e))
10,000 stem cell fractions separated by the above method were added to 480 mL of stem cell culture solution (culture solution E) [StemPro (registered trademark) -34SFM, 5 mL of fetal calf serum, 0.292 g L-glutamine, 10 mM sodium pyruvate. , And antibiotics (penicillin, streptomycin, amphotericin cocktail), sterilized with a bottle top filter having a pore size of 0.22 μm, 10 μg / mL insulin, 5.5 μg / mL transferrin, 6.7 ng / mL Add selenate cocktail (GIBCO, Insulin-Transferrin-Serenium-G, 41400-045), 10 ng / mL bFGF, and 25 ng / mL SCF (Peprotech, Recombinant Human SCF, 300-07) 24 well dish (Corning Incorporated, Corning (registered trademark) 24 well Cell Culture Blotter Flat Fraction Blotte Flat Fraction Fraction), suspended in 1 mL and coated with human fibronectin (BD FALCON, Human Fibrinctin, 354008) at a concentration of 1.5 μg / cm 2. culture treated, Non-pyrogenic). This was cultured in a CO 2 incubator under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
約４日間で２４ｗｅｌｌ ｄｉｓｈ一杯まで細胞が増殖するため、ＰＢＳ（−）で洗浄し、０．２５％トリプシン-１ｍＭ ＥＤＴＡで乖離した後、１０％ＦＣＳ-ＤＭＥＭ ２ｍＬを混合して１５ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブに移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行った。上清除去後、細胞ペレットを上記幹細胞培養液４ｍＬに懸濁し、１．５μｇ／ｃｍ２濃度でヒトフィブロネクチンをコーティングした３５ｍｍ径細胞培養用プラスチックディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ，イージーグリップ細胞培養ディッシュ，３５３００１）に継代した。幹細胞は約４日かけて３５ｍｍ径細胞培養用プラスチックディッシュ一杯にまで増殖するため、同様の方法でヒトフィブロネクチンをコーティングした１００ｍｍ径細胞培養用プラスチックディッシュに継代した。 Since cells grow to a full 24 well dish in about 4 days, wash with PBS (-), dissociate with 0.25% trypsin-1 mM EDTA, mix with 2 mL of 10% FCS-DMEM, and disperse in 15 mL volume. It moved to the tube and centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes. After removal of the supernatant, the cell pellet is suspended in 4 mL of the above stem cell culture solution and transferred to a 35 mm diameter cell culture plastic dish (FALCON, Easy Grip Cell Culture Dish, 353001) coated with human fibronectin at a concentration of 1.5 μg / cm 2. I made it. Since stem cells grew to a full 35 mm diameter cell culture plastic dish over about 4 days, they were passaged to a 100 mm diameter cell culture plastic dish coated with human fibronectin in the same manner.
培養液への血清およびｂＦＧＦの添加による細胞への影響を図７に示す。図７において、（ａ）は、血清を添加せずｂＦＧＦを添加したときの、（ｂ）は血清を添加しｂＦＧＦを添加しなかったときの、（ｃ）は、血清を添加しｂＦＧＦも添加したときの、得られた細胞の形状を示す。（ａ）に示すように、培養液に血清を添加しない場合はＳＰ細胞は速やかに分化細胞となり、（ｂ）に示すように、血清を添加した場合は幹細胞と分化細胞が混在する状態となり、（ｃ）に示すように、血清およびｂＦＧＦの双方を添加した場合は幹細胞が大部分を占めている。このように、分離細胞の培養液に血清およびｂＦＧＦを添加することが有効である。 FIG. 7 shows the influence on cells by addition of serum and bFGF to the culture medium. In FIG. 7, (a) is when serum is not added and bFGF is added, (b) is when serum is added and bFGF is not added, (c) is when serum is added and bFGF is also added The shape of the obtained cell is shown. As shown in (a), when serum is not added to the culture solution, SP cells quickly become differentiated cells, and as shown in (b), when serum is added, stem cells and differentiated cells are mixed, As shown in (c), when both serum and bFGF are added, stem cells account for the majority. Thus, it is effective to add serum and bFGF to the culture solution of isolated cells.
接着面へのフィブロネクチンのコーティングによる細胞の増殖速度への影響を図８に示す。図８において、横軸は細胞培養の回数を表し、縦軸は分離後、培養開始時を基準とした細胞数の相対値（対数）を表す。図８より明らかなように、フィブロネクチンのコーティングによって、細胞の増殖速度は著しく向上する。 FIG. 8 shows the influence of the coating of fibronectin on the adhesive surface on the cell growth rate. In FIG. 8, the horizontal axis represents the number of cell cultures, and the vertical axis represents the relative value (logarithm) of the number of cells based on the start of culture after separation. As is apparent from FIG. 8, the growth rate of the cells is remarkably improved by the coating of fibronectin.
分離後の細胞をさらに培養して得られた細胞集団を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色で展開したドットプロットを図９に示す。図９において、（ａ）は分離後の幹細胞を培養した結果を示しており、得られた細胞集団には、幹細胞である領域ＲＣと、幹細胞から派生した分化細胞である領域ＲＤが少数含まれている。（ｂ）は分離したＭＰ細胞をさらに培養した結果を示しており、領域ＲＣに属する細胞は殆ど含まれておらず、領域ＲＤに属する分化細胞が多い。（ｃ）は分離したＳＰ細胞をさらに培養したものである（ａ）にＶｅｒａｐａｍｉｌを添加した結果を示しており、領域ＲＣに属する細胞が（ａ）に比べて著しく減少している。図９に示した結果は、本発明の培養方法および分離方法が、幹細胞の選択的分離に適していることを表している。 FIG. 9 shows a dot plot obtained by developing the cell population obtained by further culturing the separated cells with Hoechst 33342 staining. In FIG. 9, (a) shows the result of culturing the stem cells after separation, and the obtained cell population contains a small number of regions RC that are stem cells and regions RD that are differentiated cells derived from the stem cells. ing. (B) shows the result of further culturing the separated MP cells, almost no cells belonging to the region RC are included, and many differentiated cells belonging to the region RD. (C) shows the result of adding Verapamyl to (a), which is a further culture of isolated SP cells, and the number of cells belonging to region RC is significantly reduced compared to (a). The results shown in FIG. 9 indicate that the culture method and the separation method of the present invention are suitable for selective separation of stem cells.
（６）分離細胞の評価（工程（ｆ））
細胞の性状検査は定量ＲＴ-ＰＣＲを用いて行った。ＲＴ-ＰＣＲは細胞内で発現している遺伝子を検出する方法であり、定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）は発現している遺伝子を定量的に測定する方法である。これにより、目的とする遺伝子が微量でも確実に発現していること、またサンプル間での発現量の比較を行うことが可能となっている。
(6) Evaluation of isolated cells (step (f))
Cell characterization was performed using quantitative RT-PCR. RT-PCR is a method for detecting genes expressed in cells, and quantitative PCR (Real time PCR) is a method for quantitatively measuring expressed genes. This makes it possible to reliably express the target gene even in a small amount, and to compare the expression level between samples.
ＦＡＣＳにより分離した細胞は、液体窒素で瞬間的に凍結し、検査に使用するまで−８０℃の超低温庫に保管した。検査に際して、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１５５９６-０２６）を１ｍＬ加え、氷上に５分間静置した。次いでクロロフォルム（和光純薬工業、０３８-０２６０６）を２００μＬ加え、激しく混和した後、室温に５分間静置した。その後１５，０００ｒｐｍ、４℃の条件にて１０分間遠心を行い、ＴＲＩｚｏｌ層の上部に形成される水層を１．５ｍＬチューブに回収した。 Cells separated by FACS were instantaneously frozen in liquid nitrogen and stored in an ultra-low temperature storage at −80 ° C. until used for examination. At the time of inspection, 1 mL of TRIzol (Invitrogen, 15596-026) was added and left on ice for 5 minutes. Next, 200 μL of chloroform (Wako Pure Chemical Industries, 038-02606) was added and mixed vigorously, and then allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Thereafter, centrifugation was carried out for 10 minutes under the conditions of 15,000 rpm and 4 ° C., and the aqueous layer formed on the TRIzol layer was collected in a 1.5 mL tube.
次いで２-ｐｒｏｐａｎｏｌを５００μＬ加え、再度激しく混和した後、室温に１０分間静置した。これを１５，０００ｒｐｍ、４℃の条件にて１０分間遠心し、底部に形成されたＲＮＡペレットを７５％エタノール（ＤＥＰＣ ｔｒｅａｔｅｄ ｗａｔｅｒ，和光純薬工業，３１４-９０２０５；２５ｍＬに、Ｅｔｈａｎｏｌ，和光純薬工業，０５７-００４５６；７５ｍＬを加える）にて洗浄した。さらに、１５，０００ｒｐｍ、４℃の条件にて５分間遠心し、上清を除去した後、ＲＮＡペレットを自然乾燥させ、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ，ＤＮａｓｅ，ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ，和光純薬工業，１０９７７-０１５）５μＬに溶解した。 Next, 500 μL of 2-propanol was added, and the mixture was vigorously mixed again, and then allowed to stand at room temperature for 10 minutes. This was centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes, and the RNA pellet formed on the bottom was 75% ethanol (DEPC treated water, Wako Pure Chemical Industries, 314-90205; 25 mL, Ethanol, Wako Pure Chemical). Industrial, 057-00456; 75 mL is added). Furthermore, after centrifuging at 15,000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes and removing the supernatant, the RNA pellet was naturally dried and RNase free water (Distilled Water, DNase, RNase Free, Wako Pure Chemical Industries, 10997- 015) Dissolved in 5 μL.
逆転写反応はＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，４３６８８１４）を用いて行った。添付説明書に従い逆転写を行った後、反応済み液１０μＬに４０μＬのＴＥを加え、そのうち１μＬをＲｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ解析に使用した。本実施例では、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ）に公開されているウシＣＤ３４、ｃ-Ｋｉｔ、ＴＥＲＴ、Ａｃｔｉｎ遺伝子の配列を元に、それぞれに特異的なプライマー配列（前述のプライマー１〜プライマー３を含む）を作成し、Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。 The reverse transcription reaction was carried out using High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, 4368814). After reverse transcription according to the attached instructions, 40 μL of TE was added to 10 μL of the reacted solution, and 1 μL of this was used for Real time PCR analysis. In this example, based on the sequences of bovine CD34, c-Kit, TERT, and Actin genes published in Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez), respectively. Specific primer sequences (including Primer 1 to Primer 3 described above) were prepared, and Real time PCR was performed.
ＰＣＲ反応液はＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡバイオ，ＲＲ０４１Ａ）を元に添付説明書に従って作成し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ８-ｔｕｂｅ ｓｔｒｉｐ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，４３１６５６７）に分注した。ＰＣＲ反応はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、９５℃、１０秒の変性反応の後、９５℃、５秒、６０℃、３０秒の増幅反応を４０回繰り返し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）にて結果を解析した。 A PCR reaction solution was prepared based on SYBR (registered trademark) Premix EX Taq (TAKARA Bio, RR041A) according to the attached instructions, and dispensed to MicroAmp Optical 8-tube strip (Applied Biosystems, 4316567). ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) was used for the PCR reaction. After a denaturation reaction at 95 ° C. for 10 seconds, an amplification reaction at 95 ° C., 5 seconds, 60 ° C., and 30 seconds was repeated 40 times, and then Microsoft Excel (Microsoft) was used. The results were analyzed.
異なる個体１〜３から採取した３サンプルについて解析を行ったところ、個体１のＳＰ画分は、ＭＰ画分（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ２；Ｐ２画分）に対し、ＣＤ３４遺伝子の発現量が３６．９倍、ｃ-Ｋｉｔ遺伝子が４．７６倍、Ｂｃｒｐ１遺伝子が１８．９倍、ＴＥＲＴ遺伝子が２６．２倍であった。個体２のＳＰ画分は、ＭＰ画分（Ｐ２画分）に対し、ＣＤ３４遺伝子の発現量が１６７．８倍、ｃ-Ｋｉｔ遺伝子が５３．６倍、Ｂｃｒｐ１遺伝子が４２．８倍、ＴＥＲＴ遺伝子が１４．３倍であった。また、個体３のＳＰ画分は、ＭＰ画分（Ｐ２画分）に対し、ＣＤ３４遺伝子の発現量が２６１．５倍、ｃ-Ｋｉｔ遺伝子が１２８．２倍、Ｂｃｒｐ１遺伝子が９３．４倍、ＴＥＲＴ遺伝子が２４．６倍であった。このように、ＳＰ画分の細胞は幹細胞である。 When analysis was performed on three samples collected from different individuals 1 to 3, the SP fraction of the individual 1 had a CD34 gene expression level of 36.9 times that of the MP fraction (Population 2; P2 fraction). The c-Kit gene was 4.76 times, the Bcrp1 gene was 18.9 times, and the TERT gene was 26.2 times. The SP fraction of individual 2 is 167.8 times the expression level of CD34 gene, 53.6 times the c-Kit gene, 42.8 times the Bcrp1 gene, and the TERT gene relative to the MP fraction (P2 fraction). Was 14.3 times. In addition, the SP fraction of the individual 3 is 261.5 times the expression level of the CD34 gene, 128.2 times the c-Kit gene, and 93.4 times the Bcrp1 gene, compared to the MP fraction (P2 fraction). The TERT gene was 24.6 times. Thus, the cells of the SP fraction are stem cells.
［比較例］
濃縮培養に用いる培養液Ｂの有用性を検証するため、細胞培養で一般に使用されている培養液Ａ（ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地）を用いて、比較試験を行った。培養液Ｂに代えて培養液Ａを使用したこと以外、処理は上記実施例と同様ある。培養液Ａ中の血清の濃度は、実施例に合わせて、１％、５％、１０％および１５％とした。
[Comparative example]
In order to verify the usefulness of the culture medium B used for the concentrated culture, a comparative test was performed using a culture medium A (FCS-containing DMEM medium) generally used in cell culture. The treatment is the same as in the above example except that the culture solution A is used instead of the culture solution B. The concentration of serum in the culture medium A was 1%, 5%, 10% and 15% according to the examples.
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色を用いて展開した生細胞画分Ｐ０全体のドットプロットを図１０に示す。図中、Ｐ１で示した画分がＳＰ画分である。ＳＰ画分および生細胞画分Ｐ０全体の前方散乱および側方散乱で展開したドットプロットを、図１１（ａ）および図１１（ｂ）にそれぞれ示す。なお、図１０および図１１は、培養液Ａ中の血清濃度が１０％のときのものである。 FIG. 10 shows a dot plot of the entire live cell fraction P0 developed using Hoechst 33342 staining. In the figure, the fraction indicated by P1 is the SP fraction. FIG. 11A and FIG. 11B respectively show dot plots developed by forward scatter and side scatter of the entire SP fraction and live cell fraction P0. 10 and 11 are those when the serum concentration in the culture solution A is 10%.
比較例におけるＳＰ画分に含まれる細胞の全イベントに対する割合は、以下に示すとおりであった。
培養液Ａ中の血清濃度 ＳＰ画分割合平均値 標本数
１％ １．８％ ３
５％ １．８８％ ４
１０％ １．５％ ３
１５％ ０．６３％ ３
The ratio of the cells contained in the SP fraction in the comparative example to all events was as shown below.
Serum concentration in culture medium A SP fraction ratio average value Number of samples 1% 1.8% 3
5% 1.88% 4
10% 1.5% 3
15% 0.63% 3
このように、ＳＰ画分に含まれる細胞は２％未満にとどまっている。一方、前述のように、本発明の方法においては、ＳＰ画分に含まれる細胞は平均８．８８％（最大１１．１％）である。生体内に存在するＳＰ細胞の割合が、骨髄で約０．０４〜０．０７％、我々の知見による滑膜組織が２．３８％であることを考慮すると、本発明の培養方法は、ＳＰ細胞の濃縮に非常に有効な方法であるといえる。 Thus, the cells contained in the SP fraction are less than 2%. On the other hand, as described above, in the method of the present invention, the cells contained in the SP fraction average 8.88% (maximum 11.1%). Considering that the proportion of SP cells present in vivo is about 0.04 to 0.07% in bone marrow and 2.38% in synovial tissue according to our knowledge, It can be said that this is a very effective method for concentrating cells.
以上説明したように、本発明の滑膜幹細胞は、分化細胞とすることによって、軟骨再生などに対する新規再生医療材料として非常に有用である。さらに滑膜炎などの疾患のモデルとしても非常に重要なツールである。幹細胞は体外で安定して増殖させることが可能であることから、クローン技術におけるドナー細胞としても注目されており、本発明における幹細胞を利用することによってクローンウシを提供することも可能であり、食料としての質に優れた牛を選択的に提供することもできる。また、本発明における幹細胞画分を濃縮する方法、および培養する方法は、従来非常に微小であると考えられてきた体性幹細胞画分を選択的に増幅するという優れた効果を奏する。また、本発明の方法は滑膜幹細胞以外の組織幹細胞にも応用できる可能性のある極めて有効な方法であり、滑膜幹細胞以外、たとえば脂肪組織、筋組織の幹細胞から本発明の方法によって得られる間葉系幹細胞も、本発明に含まれる。 As described above, the synovial stem cell of the present invention is very useful as a new regenerative medical material for cartilage regeneration and the like by using differentiated cells. Furthermore, it is a very important tool as a model for diseases such as synovitis. Stem cells can be stably propagated outside the body, and thus have attracted attention as donor cells in cloning technology, and it is also possible to provide cloned cattle by using stem cells in the present invention, It is also possible to selectively provide cows with excellent quality. In addition, the method for concentrating and culturing the stem cell fraction in the present invention has an excellent effect of selectively amplifying the somatic stem cell fraction that has been considered to be very small. In addition, the method of the present invention is a very effective method that may be applied to tissue stem cells other than synovial stem cells, and can be obtained from the stem cells of adipose tissue or muscle tissue other than synovial stem cells by the method of the present invention. Mesenchymal stem cells are also included in the present invention.
Ｐ０ 全解析産物中の生細胞画分
Ｐ１ ＳＰ（Ｓｉｄｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）画分
Ｐ２ ＭＰ（Ｍａｊｏｒ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）画分
ＲＡ Ｖｅｒａｐａｍｉｌ添加消失領域
ＲＢ Ｖｅｒａｐａｍｉｌ添加不消失領域
ＲＣ 幹細胞領域
ＲＤ 分化細胞領域
P0 Live cell fraction in all analysis products P1 SP (Side Population) fraction P2 MP (Major Population) fraction RA Verapamil addition disappearance region RB Verapamil addition disappearance region RC Stem cell region RD Differentiation cell region
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