JP2009034113A - Method for improving thermal stability of composition containing soluble coenzyme-bonded type glucose dehydrogenase (gdh) - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、フラビン化合物を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼなどの可溶性補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ(本書ではグルコースデヒドロゲナーゼをGDHとも記載する。)を含む組成物の熱安定性を向上する方法および該方法を用いた組成物に関するものである。 The present invention relates to a method for improving the thermal stability of a composition comprising a soluble coenzyme-linked glucose dehydrogenase such as glucose dehydrogenase having a flavin compound as a coenzyme (herein, glucose dehydrogenase is also referred to as GDH) and the method. The present invention relates to a composition using
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ(EC 1.1.3.4)が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に40年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してD−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。 Blood glucose self-measurement is important for diabetics to grasp their normal blood glucose level and use it for treatment. An enzyme using glucose as a substrate is used for a sensor used for blood glucose self-measurement. An example of such an enzyme is glucose oxidase (EC 1.1.3.4). Glucose oxidase has been used as an enzyme for blood glucose sensors for a long time because it has the advantage of high specificity for glucose and excellent thermal stability, and its first announcement dates back to about 40 years ago. . In a blood glucose sensor using glucose oxidase, measurement is performed by passing electrons generated in the process of oxidizing glucose and converting it to D-glucono-δ-lactone to the electrode through a mediator. There is a problem that dissolved oxygen affects the measured value because the protons generated in the above are easily passed to oxygen.
このような問題を回避するために、例えばNAD(P)依存型グルコースデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.47)あるいはピロロキノリンキノン(本書ではピロロキノリンキノンをPQQとも記載する。)依存型グルコースデヒドロゲナーゼ(EC1.1.5.2(旧EC1.1.99.17))が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のNAD(P)依存型グルコースデヒドロゲナーゼ(本書ではNAD(P)依存型グルコースデヒドロゲナーゼをNADGDHとも記載する。)は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のPQQ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ(本書ではPQQ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをPQQGDHとも記載する。)は、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。 In order to avoid such problems, for example, NAD (P) -dependent glucose dehydrogenase (EC 1.1.1.47) or pyrroloquinoline quinone (herein, pyrroloquinoline quinone is also referred to as PQQ) -dependent glucose dehydrogenase. (EC 1.1.5.2 (formerly EC 1.1.9.17)) is used as an enzyme for blood glucose sensors. These are superior in that they are not affected by dissolved oxygen, but the former NAD (P) -dependent glucose dehydrogenase (NAD (P) -dependent glucose dehydrogenase is also referred to as NADGDH in this document) is poor in stability. There is a complication that requires the addition of a coenzyme. On the other hand, the latter PQQ-dependent glucose dehydrogenase (in this document, PQQ-dependent glucose dehydrogenase is also referred to as PQQGDH) has poor substrate specificity and acts on saccharides other than glucose such as maltose and lactose. There is a drawback of losing.
また、特許文献1にはアスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ(本書ではフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをFADGDHとも記載する。)が開示されている。本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で優位である。熱安定性については50℃15分処理で89%程度の活性残存率であり安定性についても優れているとされている。しかし、センサーチップ作製の工程において加熱処理を要する場合があることを考えれば決して十分な安定性とはいえない。
本発明の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素の熱安定性に関する欠点を克服して、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な組成物を提供することである。 An object of the present invention is to provide a composition that can be used as a reagent for measuring blood glucose level, which is advantageous in practical use, by overcoming the drawbacks related to the thermal stability of known enzymes for blood glucose sensor as described above. .
本発明者らは、これまでのPQQGDHの研究で、該酵素の基質特異性を改善した多重変異体を多数取得したが、その一部には、野生型PQQGDHと比べて熱安定性が低減した変異体が見られた。そこで、この課題を解決するため、その原因について鋭意研究したところ、本特許で提示した該酵素にある種の化合物を添加することにより、PQQGDHの立体構造が安定に維持され安定性が改善できることがわかった。
本発明者らはさらに検討を加え、FADGDH、NADGDHについても同様の効果があることを見出し本願発明を完成させた。
これまでPQQGDHの安定性を向上する方策に関する報告としては特許文献2があり、その中では遺伝子レベルでのPQQGDH改変手段を用いた検討が報告されているが、酵素の改変を用いずに安定性を増大させる手段については、その可能性すら触れられていなかった。
The present inventors have further studied and found that FADGDH and NADGDH have the same effect and completed the present invention.
To date, there is
また、本発明者らは、鋭意研究を実施した結果、フラビン化合物を含有するGDHを含む組成物のpHで酸性側pHを保持することにより、該組成物が加熱乾燥可能なレベルの高い熱安定性が得られることを見出した。 In addition, as a result of intensive studies, the inventors of the present invention have maintained the acidic pH at the pH of the composition containing GDH containing a flavin compound, so that the composition can be heated and dried at a high level of heat stability. It was found that sex can be obtained.
加熱乾燥可能なレベルとは、50℃、15分処理後の残存活性が10%以上存在する状態であり、好ましくは45%以上の残存活性が得られる状態であり、更に好ましくは、70%以上の残存活性が得られる状態である。 The heat-dryable level is a state where the remaining activity after treatment at 50 ° C. for 15 minutes is 10% or more, preferably 45% or more, and more preferably 70% or more. In this state, the remaining activity of can be obtained.
さらに、本発明者らは、過去の方策とは異なる視点から、より簡便な熱安定性の改良策を探ることとし、さらなる鋭意研究を実施した結果、GDHを含む組成物で酸性側のpHを利用して、なおかつ、1種類以上のジカルボン酸、塩化合物を共存させることにより組成物全体の安定性を向上できることを明らかにして、遂に本発明を完成するに到った。 Furthermore, the present inventors searched for a simpler measure for improving the thermal stability from a viewpoint different from the past measures, and as a result of further earnest research, as a result, the pH on the acidic side was reduced with the composition containing GDH. Furthermore, it has been clarified that the stability of the whole composition can be improved by coexisting one or more kinds of dicarboxylic acids and salt compounds, and the present invention has been finally completed.
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
[項1]
可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)を含む組成物において、該組成物のpHをpH7以下の酸性側で保持させる工程を含む、該組成物をpH7.3以上にした場合と比べて該組成物の熱安定性を向上させる方法。
[項2]
可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)を含む組成物において、該組成物のpHをpH3.1〜7.0に保持させる工程を含む、該組成物をpH7.4にした場合と比べて該組成物の熱安定性を向上させる方法。
[項3]
可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)が、フラビン化合物を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)である、項1または2に記載の組成物の熱安定性を向上させる方法。
[項4]
フラビン化合物を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)が糸状菌由来であることを特徴とする項3記載の熱安定性を向上する方法。
[項5]
項1〜4のいずれかに記載の方法により熱安定性が向上した組成物。
[項6]
可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)を含む組成物において、4℃で保存した該組成物と比べて、50℃、15分処理した場合でも、10%以上のGDH活性を残存することを特徴とする項5記載のGDH含有組成物。
[項7]
フラビン化合物を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)を含む組成物において、4℃で保存した該組成物と比べて、50℃、15分処理した場合でも、45%以上のGDH活性を残存することを特徴とする項5記載のGDH含有組成物。
[項8]
1種類以上のジカルボン酸、塩化合物を含有する項5記載の組成物。
[項9]
塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウム、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、フタル酸、マレイン酸のうち1種類以上の化合物を含有する項5記載の組成物。
[項10]
項5記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
[項11]
項5記載の組成物を含むグルコースセンサ。
[項12]
可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)を含む組成物において、該組成物のpHをpH7以下の酸性側で保持させる工程を含む、該組成物をpH7.3以上にした場合と比べて該組成物の熱安定性が向上した組成物の製造方法。
[項13]
可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)を含む組成物において、該組成物のpHをpH3.1〜7.0に保持させる工程を含む、該組成物をpH7.4にした場合と比べて該組成物の熱安定性が向上した組成物の製造方法。
That is, the present invention has the following configuration.
[Claim 1]
In a composition containing soluble coenzyme-linked glucose dehydrogenase (GDH), the step of maintaining the pH of the composition on the acidic side of
[Section 2]
In a composition containing soluble coenzyme-linked glucose dehydrogenase (GDH), the step of maintaining the pH of the composition at pH 3.1 to 7.0, compared with the case where the composition is adjusted to pH 7.4 And improving the thermal stability of the composition.
[Section 3]
[Claim 4]
[Section 5]
[Claim 6]
In a composition containing soluble coenzyme-linked glucose dehydrogenase (GDH), 10% or more of GDH activity remains even when treated at 50 ° C. for 15 minutes compared to the composition stored at 4 ° C. The GDH containing composition of claim |
[Claim 7]
In a composition containing glucose dehydrogenase (GDH) containing a flavin compound as a coenzyme, 45% or more of GDH activity remains even when treated at 50 ° C. for 15 minutes compared to the composition stored at 4 ° C. The GDH containing composition of claim |
[Section 8]
[Claim 9]
[Section 10]
6. A method for measuring glucose concentration using the composition according to
[Section 11]
A glucose sensor comprising the composition according to
[Claim 12]
In a composition containing soluble coenzyme-linked glucose dehydrogenase (GDH), the step of maintaining the pH of the composition on the acidic side of
[Claim 13]
In a composition containing soluble coenzyme-linked glucose dehydrogenase (GDH), the step of maintaining the pH of the composition at pH 3.1 to 7.0, compared to the case where the composition is adjusted to pH 7.4 And a method for producing a composition having improved thermal stability.
本発明による熱安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサー作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にする。また、保存安定性に優れたGDHを用いた血糖値測定試薬の提供を可能にする。 The improvement in the thermal stability according to the present invention reduces the heat inactivation of the enzyme during preparation of the glucose measurement reagent, glucose assay kit, and glucose sensor, thereby enabling the use amount of the enzyme to be reduced and the measurement accuracy to be improved. In addition, it is possible to provide a blood sugar level measuring reagent using GDH having excellent storage stability.
GDHは、以下の反応を触媒する酵素である。
D−グルコース + 電子伝達物質(酸化型)
→ D−グルコノ−δ−ラクトン + 電子伝達物質(還元型)
D−グルコースを酸化してD−グルコノ−1,5−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
GDH is an enzyme that catalyzes the following reaction.
D-glucose + electron transfer material (oxidized type)
→ D-glucono-δ-lactone + electron transfer material (reduced form)
It is an enzyme that catalyzes a reaction in which D-glucose is oxidized to produce D-glucono-1,5-lactone, and the origin and structure are not particularly limited.
本発明の方法に適用することができるGDHは、可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)であれば特に限定されない。
補酵素としては、例えばピロロキノンキノリンまたはフラビン化合物またはニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド(NAD)などをとることができる。
The GDH that can be applied to the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a soluble coenzyme-linked glucose dehydrogenase (GDH).
As the coenzyme, for example, pyrroloquinone quinoline or flavin compound or nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) can be used.
本発明の方法に適用することができる、補酵素としてピロロキノンキノリンをとるGDH(PQQGDH)としては、特に限定されるものではないが、例えば、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)LMD79.41由来のもの(A.M.Cleton−Jansenら、J.Bacteriol.,170,2121(1988)およびMol.Gen.Genet.,217,430(1989))、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)由来のもの(A.M.Cleton−Jansenら、J.Bacteriol.,172,6308(1990))、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)由来のもの(Mol.Gen.Genet.,229,206(1991))、及び、特許文献1で報告されているアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumanni) NCIMB11517などの微生物由来のものなどが例示できる。
ただし、エシェリヒア・コリなどに存在する膜型酵素を改変して可溶型にすることは困難であり、起源としてはアシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニなどの可溶性PQQGDHを選択することが好ましい。
なお、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)NCIMB11517株は、以前、Acinetobacter calcoaceticusに分類されていた。
GDH (PQQGDH) taking pyrroloquinone quinoline as a coenzyme that can be applied to the method of the present invention is not particularly limited. For example, Acinetobacter calcoaceticus LMD79.41 From (A.M. Cleton-Jansen et al., J. Bacteriol., 170, 2121 (1988) and Mol. Gen. Genet., 217, 430 (1989)), from Escherichia coli (AM Cleton-Jansen et al., J. Bacteriol., 172, 6308 (1990)), derived from Gluconobacter oxydans. (Mol.Gen.Genet., 229,206 (1991)), and, such as those derived from microorganisms such as patents Acinetobacter baumannii that have been reported in the literature 1 (Acinetobacter baumanni) NCIMB11517 can be exemplified.
However, it is difficult to modify the membrane enzyme present in Escherichia coli to make it soluble, and it is preferable to select soluble PQQGDH such as Acinetobacter calcoaceticus or Acinetobacter baumannii as the origin. .
In addition, Acinetobacter baumannii (Acinetobacter baumannii) NCIMB11517 strain was formerly classified into Acinetobacter calcaceticus.
これらのPQQGDHは、たとえば東洋紡績製GLD−321など市販のものを用いることが出来る。あるいは、当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に製造することが出来る。 As these PQQGDH, for example, commercially available products such as GLD-321 manufactured by Toyobo Co., Ltd. can be used. Alternatively, it can be easily manufactured by those skilled in the art using known techniques in the technical field.
本発明の方法に適用することができる、補酵素としてFADをとるGDH(FAD結合型GDH)としては、特に限定されるものではないが、例えば、真核生物の範疇に属する糸状菌のペニシリウム(Penicillium)属、アスペルギルス(Aspergillus)属などの微生物に由来するものが挙げられる。これら微生物菌株は各菌株保存機関より分譲を依頼することにより容易に入手することができる。例えば、ペニシリウム属のペニシリウム・リラシノエキヌラタムは、寄託番号NBRC6231として製品評価技術基盤機構・生物資源部門に登録されている。 The GDH that takes FAD as a coenzyme that can be applied to the method of the present invention (FAD-binding GDH) is not particularly limited, but for example, Penicillium of a filamentous fungus belonging to the category of eukaryotes ( Examples thereof include those derived from microorganisms such as the genus Penicillium and the genus Aspergillus. These microbial strains can be easily obtained by requesting distribution from each strain storage organization. For example, the Penicillium genus Penicillium Lirashino Echinulatam is registered in the Product Evaluation Technology Foundation / Biological Resources Division under the deposit number NBRC6231.
本発明の方法に適用することができる、補酵素としてNADをとるGDHとしては、特に限定されるものではないが、東洋紡より販売されている市販品(GLD−311)を入手して使用することができる。あるいは、種々の公知の方法により調製することが可能である。 GDH that takes NAD as a coenzyme that can be applied to the method of the present invention is not particularly limited, but a commercial product (GLD-311) sold by Toyobo is obtained and used. Can do. Alternatively, it can be prepared by various known methods.
本発明の方法に適用することができるGDHは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、Sambrookら著、Molecular Cloning; A Laboratory Manual 第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
As long as GDH that can be applied to the method of the present invention has glucose dehydrogenase activity, some of the other amino acid residues may be deleted or substituted with those exemplified above. An amino acid residue may be added.
Such modifications can be easily carried out by those skilled in the art using known techniques in the art. For example, various methods for substituting or inserting a base sequence of a gene encoding a protein in order to introduce a site-specific mutation into the protein are described in Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd edition (1989). Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
例えば、上記のGDHを生産する天然の微生物、あるいは、天然のGDHをコードする遺伝子をそのまま、あるいは、変異させてから、発現用ベクター(多くのものが当該技術分野において知られている。例えばプラスミド。)に挿入し、適当な宿主(多くのものが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。)に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてEDTAなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、GDHを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したGDHを直接培養液中に分泌させることが出来る。 For example, the above-mentioned natural microorganism producing GDH or the gene encoding natural GDH as it is or after being mutated, is a vector for expression (many things are known in the art. For example, plasmids ), And cultivates the transformant transformed into an appropriate host (many are known in the art. For example, E. coli), and recovers the cell from the culture by centrifugation. After that, the bacterial cells are destroyed by a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme, and if necessary, a chelating agent such as EDTA or a surfactant is solubilized, and a water-soluble fraction containing GDH. You can get minutes. Alternatively, the expressed GDH can be secreted directly into the culture medium by using an appropriate host vector system.
上記のようにして得られたGDH含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたGDHを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動(SDS−PAGE)的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。 The GDH-containing solution obtained as described above is precipitated by, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting-out treatment with ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, or fractional precipitation with a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, etc. You just have to let them know. Heat treatment and isoelectric point treatment are also effective purification means. Further, purified GDH can be obtained by performing gel filtration using an adsorbent or a gel filter, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. The purified enzyme preparation is preferably purified to the extent that it shows a single band on electrophoresis (SDS-PAGE).
上記工程と前後して、全GDH酵素タンパク質に対するホロ型GDHの割合を向上させるために、好ましくは25〜50℃、より好ましくは30〜45℃の加熱処理を行っても良い。 Before and after the above step, in order to improve the ratio of holo-type GDH to the total GDH enzyme protein, a heat treatment of preferably 25 to 50 ° C., more preferably 30 to 45 ° C. may be performed.
本発明におけるGDHの濃度は特に制約がない。用いる酵素の特性等によって適切な範囲は異なるが、実用上、当該酵素を用いてグルコースを十分な信頼性をもって測定できると当業者が判断できる濃度であればよい。
例えば、本発明におけるPQQGDHの濃度は特に制約がないが、溶液中の場合、好ましくは、0.1〜100U/mL、さらに好ましくは、1〜50U/mL、さらに好ましくは2〜10U/mLである。粉末あるいは凍結乾燥物中でも同程度の濃度が望ましいが、粉末標品を調製する目的では、100U/mL以上の濃度にすることができる。
例えば、本発明におけるNADGDHの濃度は特に制約がないが、溶液中の場合、好ましくは、10〜1000U/mL、さらに好ましくは、20〜500U/mL、さらに好ましくは50〜150U/mLである。粉末あるいは凍結乾燥物中でも同程度の濃度が望ましいが、粉末標品を調製する目的では、1000U/mL以上の濃度にすることができる。
例えば、本発明におけるFADGDHの濃度は特に制約がないが、溶液中の場合、好ましくは、0.01〜100U/mL、さらに好ましくは、0.1〜50U/mL、さらに好ましくは0.2〜10U/mLである。粉末あるいは凍結乾燥物中でも同程度の濃度が望ましいが、粉末標品を調製する目的では、100U/mL以上の濃度にすることができる。
The concentration of GDH in the present invention is not particularly limited. Although an appropriate range varies depending on the characteristics of the enzyme used, any concentration may be used as long as a person skilled in the art can determine that glucose can be measured with sufficient reliability in practice.
For example, the concentration of PQQGDH in the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 100 U / mL, more preferably 1 to 50 U / mL, and still more preferably 2 to 10 U / mL in the solution. is there. A similar concentration is desirable in powders or lyophilized products, but for the purpose of preparing a powder preparation, the concentration can be 100 U / mL or more.
For example, the NADGDH concentration in the present invention is not particularly limited, but is preferably 10 to 1000 U / mL, more preferably 20 to 500 U / mL, and still more preferably 50 to 150 U / mL in the solution. A similar concentration is desirable in powders or lyophilized products, but for the purpose of preparing a powder preparation, the concentration can be 1000 U / mL or more.
For example, the concentration of FADGDH in the present invention is not particularly limited, but in the solution, it is preferably 0.01 to 100 U / mL, more preferably 0.1 to 50 U / mL, and still more preferably 0.2 to 10 U / mL. A similar concentration is desirable in powders or lyophilized products, but for the purpose of preparing a powder preparation, the concentration can be 100 U / mL or more.
上記微生物を培養する培地としては、微生物が生育し、かつ本発明に示すGDHを生産しうるものであれば特に限定されないが、より好適には微生物の生育に必要な炭素源、無機窒素源及び/または有機窒素源を含有するものがよく、さらに好ましくは通気攪拌に適した液体培地であるのがよい。液体培地の場合、炭素源としては例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、蔗糖などが、窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスティープリカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、脱脂大豆、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素(例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等の無機塩、ビタミン類等)を含んでいてもよい。 The medium for culturing the microorganism is not particularly limited as long as the microorganism grows and can produce the GDH shown in the present invention. More preferably, the carbon source, inorganic nitrogen source, and One containing an organic nitrogen source is preferable, and a liquid medium suitable for aeration stirring is more preferable. In the case of a liquid medium, the carbon source is, for example, glucose, dextran, soluble starch, sucrose, and the nitrogen source is, for example, ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, defatted soybeans, potato An extract etc. are illustrated. Moreover, other nutrients (for example, inorganic salts such as calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, vitamins, etc.) may be contained as desired.
培養方法は、当分野において知られている常法に従う。例えば上記栄養素を含む液体培地に微生物の胞子もしくは生育状態の菌体を植菌し、静置もしくは通気攪拌により菌体を増殖させるが、好ましくは通気攪拌により培養するのがよい。培養液のpHは好ましくは5〜9であり、さらに好ましくは6〜8である。温度は通常14〜42℃、より好ましくは20℃〜40℃で行うのがよい。通常は14〜144時間培養を継続するが、好ましくは各々の培養条件においてGDHの発現量が最大となる時点で培養を終了するのがよい。このような時点を見極める方策としては、培養液のサンプリングを行って培養液中のGDH活性を測定することでその変化をモニタリングし、経時的なGDH活性の上昇がなくなった時点をピークとみなして培養停止すればよい。 The culture method follows a conventional method known in the art. For example, spore of microorganisms or growing cells are inoculated in a liquid medium containing the above nutrients, and the cells are allowed to grow by standing or stirring with aeration. Preferably, the cells are cultured by stirring with aeration. The pH of the culture solution is preferably 5-9, more preferably 6-8. The temperature is usually 14 to 42 ° C, more preferably 20 to 40 ° C. Usually, the culture is continued for 14 to 144 hours. Preferably, the culture is terminated when the expression level of GDH is maximized under each culture condition. As a measure to identify such a time point, the change is monitored by sampling the culture solution and measuring the GDH activity in the culture solution, and the time point when the increase in GDH activity with time is stopped is regarded as a peak. What is necessary is just to stop culture | cultivation.
上記の培養液からGDHを抽出する方法としては、菌体内に蓄積したGDHを回収する場合にあっては遠心分離もしくはろ過等の操作によって菌体のみを集め、この菌体を溶媒、好ましくは水もしくは緩衝液に再懸濁する。再懸濁した菌体は公知の方法により破砕することで菌体中のGDHを溶媒中に抽出することができる。破砕方法としては、溶菌酵素を用いることもでき、また物理的破砕方法を用いてもよい。溶菌酵素としては、真菌細胞壁を消化する能力を有するものであれば特に限定しないが、適用可能な酵素の例としてはシグマ社製「Lyticase」等が挙げられる。また、物理的破砕の方法としては例えば超音波破砕、ガラスビーズ破砕、フレンチプレス破砕等が挙げられる。破砕処理後の溶液は、遠心分離もしくはろ過により残渣を取り除いてGDH粗抽出溶液を得ることができる。 As a method for extracting GDH from the culture solution, when collecting GDH accumulated in the microbial cells, only the microbial cells are collected by an operation such as centrifugation or filtration, and the microbial cells are collected in a solvent, preferably water. Alternatively, resuspend in buffer. The resuspended cells can be crushed by a known method to extract GDH in the cells into a solvent. As a crushing method, a lytic enzyme can be used, or a physical crushing method may be used. The lytic enzyme is not particularly limited as long as it has the ability to digest fungal cell walls. Examples of applicable enzymes include “Lyticase” manufactured by Sigma. Examples of the physical crushing method include ultrasonic crushing, glass bead crushing, and French press crushing. The residue after the crushing treatment can be removed by centrifugation or filtration to obtain a GDH crude extraction solution.
また本発明における培養方法としては固体培養によることもできる。好ましくは温度や湿度等を適宜制御の上で小麦等のふすま上に本発明のGDH生産能を有する真核微生物を生育させる。このとき、培養は静置により行ってもよく、また培養物を攪拌する等して混合してもよい。GDHの抽出は、培養物に溶媒、このましくは水もしくは緩衝液を加えてGDHを溶解させ、遠心分離もしくはろ過により菌体やふすま等の固形物を取り除くことでなされる。 In addition, the culture method in the present invention may be solid culture. Preferably, the eukaryotic microorganism having the ability to produce the GDH of the present invention is grown on bran such as wheat while appropriately controlling temperature, humidity and the like. At this time, the culture may be performed by standing or may be mixed by stirring the culture. GDH extraction is performed by adding a solvent, preferably water or a buffer, to the culture to dissolve GDH, and removing solids such as bacterial cells and bran by centrifugation or filtration.
GDHの精製は、GDH活性の存在する画分に応じて通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。上記GDH抽出液から、例えば塩析、溶媒沈殿、透析、限外ろ過、ゲルろ過、非変性PAGE、SDS−PAGE、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことができる。 Purification of GDH can be performed by appropriately combining various separation techniques that are usually used depending on the fraction in which GDH activity is present. From the GDH extract, for example, salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, non-denaturing PAGE, SDS-PAGE, ion exchange chromatography, hydroxyapatite chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography A known separation method such as isoelectric focusing can be selected appropriately.
本発明のGDHの熱安定性を向上させる方法の一形態は、可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)を含む組成物において、(1)該酵素、と、(2)糖アルコール、カルボキシル基含有化合物、アルカリ金属含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩、タンパク質からなる群より選ばれるいずれか1つ以上の化合物、を共存させる工程を含む。
添加する化合物として好ましいものとして、マンニトール、イノシトール、アラビトール、アドニトール、ガラクチトール、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、イノシトール、グリセリン酸カルシウム、コハク酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、フマル酸、マロン酸、ピメリン酸、3−3’ジメチルグルタル酸、リジン、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、牛血清アルブミン(BSA)からなる群より選ばれるいずれか1つ以上を挙げることができる。
これらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、溶液中の場合、好ましくは、0.001〜30重量%、さらに好ましくは、0.01〜5%、さらに好ましくは0.01〜1%である。粉末あるいは凍結乾燥物中でも同程度の濃度が望ましいが、粉末あるいは凍結乾燥物中では、溶液中の場合と比べて、更に低濃度の化合物添加で有効性を発揮する傾向にある。
なお、実施例で記載されている化合物の濃度は、GDH酵素と共存して保存する時の終濃度である。好ましい組合せとしては、性質が近似する塩化合物中での組合せや、カルボン酸含有化合物同士での組合せなどが挙げられるが、例えば、塩化合物とカルボン酸含有化合物などを組み合わせて、お互いの効果を相補するものが好ましい。
上記形態においてさらに熱安定性を向上させるため、組成物のpHをpH7以下の酸性側で保持させることができる。あるいは、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、フタル酸、マレイン酸などのジカルボン酸、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの塩化合物を含有することができる。
One form of the method for improving the thermal stability of GDH of the present invention is a composition containing soluble coenzyme-linked glucose dehydrogenase (GDH), in which (1) the enzyme, (2) sugar alcohol, carboxyl And a step of coexisting one or more compounds selected from the group consisting of a group-containing compound, an alkali metal-containing compound, an alkaline earth metal compound, an ammonium salt, a sulfate, and a protein.
Preferred compounds to be added include mannitol, inositol, arabitol, adonitol, galactitol, valine, histidine, phenylalanine, leucine, inositol, calcium glycerate, succinic acid, potassium chloride, ammonium chloride, diammonium hydrogen citrate, fumaric acid, Any one or more selected from the group consisting of malonic acid, pimelic acid, 3-3′dimethylglutaric acid, lysine, phthalic acid, maleic acid, glutaric acid, ammonium sulfate, sodium sulfate, sodium chloride, bovine serum albumin (BSA) Can be mentioned.
The concentration of each compound to be coexistent is not particularly limited, but in the solution, it is preferably 0.001 to 30% by weight, more preferably 0.01 to 5%, and still more preferably 0.00. 01 to 1%. The same concentration is desirable in the powder or lyophilized product, but in the powder or lyophilized product, the effectiveness tends to be exhibited by addition of a compound at a lower concentration than in the solution.
In addition, the density | concentration of the compound described in the Example is a final density | concentration when preserve | saving together with a GDH enzyme. Preferred combinations include those in salt compounds with similar properties and combinations of carboxylic acid-containing compounds. For example, a combination of a salt compound and a carboxylic acid-containing compound can complement each other's effects. Those that do are preferred.
In order to further improve the thermal stability in the above form, the pH of the composition can be maintained on the acidic side of
本発明のGDHの熱安定性を向上させる方法の別の一形態は、可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)を含む組成物において、該組成物のpHをpH7以下の酸性側で保持させる工程を含む、該組成物をpH7.3以上にした場合と比べて該組成物の熱安定性を向上させる方法である。
あるいは、本発明のGDHの熱安定性を向上させる方法のさらに別の一形態は、可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)を含む組成物において、該組成物のpHをpH3.1〜7.0に保持させる工程を含む、該組成物をpH7.4にした場合と比べて該組成物の熱安定性を向上させる方法である。
pHは、好ましくは3.1〜7.0、さらに好ましくは4.0〜6.5、さらに好ましくは4.0〜6.0である。
上記の組成物は、4℃で保存した該組成物と比べて、50℃、15分処理した場合でも、10%以上のGDH活性を残存する。あるいは、フラビン化合物を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)を含む組成物において、4℃で保存した該組成物と比べて、50℃、15分処理した場合でも、45%以上のGDH活性を残存する。
上記形態においては、組成物中に、1種類以上のジカルボン酸、塩化合物を含有することが好ましい。ジカルボン酸としてはコハク酸、マロン酸、グルタル酸、フタル酸、マレイン酸、塩化合物としては塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムなどが挙げられる。本発明では、これらのうち1種類以上の化合物を含有することができる。
これらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、溶液中の場合、好ましくは、1mM〜10M、さらに好ましくは、5mM〜5M、さらに好ましくは20mM〜1Mである。粉末あるいは凍結乾燥物を作製する場合には、溶液中の場合と同程度の化合物濃度を含有する組成にて乾燥処理を施すことにより同様の効果を持った乾燥標品を取得することができる。
なお、実施例で記載されている化合物の濃度は、GDH酵素と共存して保存する時の終濃度である。好ましい組合せとしては、性質が近似する塩化合物中での組合せや、カルボン酸含有化合物同士での組合せなどが挙げられるが、例えば、塩化合物とカルボン酸含有化合物などを組み合わせて、お互いの効果を相補するものが好ましい。
上記形態においてさらに熱安定性を向上させるため、糖アルコール、カルボキシル基含有化合物、アルカリ金属含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩、タンパク質、例えば、マンニトール、イノシトール、アラビトール、アドニトール、ガラクチトール、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、イノシトール、グリセリン酸カルシウム、コハク酸、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、フマル酸、マロン酸、ピメリン酸、3−3’ジメチルグルタル酸、リジン、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、牛血清アルブミン(BSA)などの化合物を含有することができる。
Another embodiment of the method for improving the thermal stability of GDH of the present invention is a composition containing soluble coenzyme-linked glucose dehydrogenase (GDH), wherein the pH of the composition is maintained on the acidic side of
Alternatively, still another embodiment of the method for improving the thermal stability of GDH of the present invention is a composition containing soluble coenzyme-linked glucose dehydrogenase (GDH), wherein the pH of the composition is adjusted to pH 3.1 to 3.1. This is a method for improving the thermal stability of the composition as compared with the case where the composition is adjusted to pH 7.4, including the step of maintaining the composition at 7.0.
The pH is preferably 3.1 to 7.0, more preferably 4.0 to 6.5, and even more preferably 4.0 to 6.0.
The composition described above retains 10% or more of GDH activity even when treated at 50 ° C. for 15 minutes, compared to the composition stored at 4 ° C. Alternatively, in a composition containing glucose dehydrogenase (GDH) having a flavin compound as a coenzyme, 45% or more of GDH activity remains even when treated at 50 ° C. for 15 minutes compared to the composition stored at 4 ° C. To do.
In the said form, it is preferable to contain 1 or more types of dicarboxylic acid and a salt compound in a composition. Examples of the dicarboxylic acid include succinic acid, malonic acid, glutaric acid, phthalic acid, maleic acid, and examples of the salt compound include sodium chloride, sodium sulfate, trisodium citrate, and ammonium sulfate. In this invention, 1 or more types of compounds can be contained among these.
The concentration of each compound to be coexisted is not particularly limited, but in the solution, it is preferably 1 mM to 10M, more preferably 5 mM to 5M, and further preferably 20 mM to 1M. When preparing a powder or lyophilized product, a dried preparation having the same effect can be obtained by applying a drying treatment with a composition containing a compound concentration comparable to that in the solution.
In addition, the density | concentration of the compound described in the Example is a final density | concentration when preserve | saving together with a GDH enzyme. Preferred combinations include those in salt compounds with similar properties and combinations of carboxylic acid-containing compounds. For example, a combination of a salt compound and a carboxylic acid-containing compound can complement each other's effects. Those that do are preferred.
In order to further improve the thermal stability in the above form, sugar alcohol, carboxyl group-containing compound, alkali metal-containing compound, alkaline earth metal compound, ammonium salt, sulfate, protein such as mannitol, inositol, arabitol, adonitol, Lactitol, valine, histidine, phenylalanine, leucine, inositol, calcium glycerate, succinic acid, potassium chloride, ammonium chloride, diammonium hydrogen citrate, fumaric acid, malonic acid, pimelic acid, 3-3'dimethylglutaric acid, lysine, phthalate Compounds such as acid, maleic acid, glutaric acid, ammonium sulfate, sodium sulfate, sodium chloride, bovine serum albumin (BSA) can be contained.
また本発明のGDHを含む組成物は液状で供することもできるが、凍結乾燥、真空乾燥あるいはスプレードライ等により粉末化することができる。このとき、GDHは緩衝液等に溶解したものを用いることができ、さらに賦形剤あるいは安定化剤として本発明で用いる上記化合物以外の糖・糖アルコール類、アミノ酸、タンパク質、ペプチド等を添加することができる。また、粉末化後さらに造粒することもできる。このような物質の例としては例えばトレハロース・スクロース・ソルビトール・エリスリトール、グリセロール等に代表される糖・糖アルコール類・グルタミン酸・アルギニン等に代表されるアミノ酸、牛血清アルブミン・卵白アルブミンや各種シャペロン等に代表されるタンパク質・ペプチド類等を挙げることができる。 The composition containing GDH of the present invention can be provided in a liquid state, but can be pulverized by freeze drying, vacuum drying, spray drying or the like. At this time, GDH dissolved in a buffer solution or the like can be used, and sugars / sugar alcohols other than the above compounds used in the present invention, amino acids, proteins, peptides, etc. are added as excipients or stabilizers. be able to. Further, it can be further granulated after pulverization. Examples of such substances include trehalose, sucrose, sorbitol, erythritol, amino acids typified by sugar, sugar alcohols, glutamic acid, arginine and the like typified by glycerol, bovine serum albumin, egg white albumin, and various chaperones. Representative proteins and peptides can be mentioned.
上記に示すGDHの抽出・精製・粉末化、および安定性試験に用いる緩衝液の組成は特に限定しないが、好ましくはpH5〜8の範囲で緩衝能を有するものであればよく、例えばホウ酸、トリス塩酸、リン酸カリウム等の緩衝剤や、BES、Bicine、Bis−Tris、CHES、EPPS、HEPES、HEPPSO、MES、MOPS、MOPSO、PIPES、POPSO、TAPS、TAPSO、TES、Tricineといったグッド緩衝剤が挙げられる。
これらのうち1種のみを適用してもよいし、2種以上を用いてもよい。さらには上記以外を含む1種以上の複合組成であってもよい。
また、これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は100mM以下、より好ましくは50mM以下である。好ましい下限は5mM以上である。
粉末あるいは凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは0.1%(重量比)以上、特に好ましくは0.1〜30%(重量比)の範囲で使用される。
これらは、種々の市販の試薬を用いることが出来る。
The composition of the buffer used for GDH extraction, purification, pulverization, and stability test described above is not particularly limited, but any buffer having a buffering ability in the range of
Of these, only one type may be applied, or two or more types may be used. Furthermore, one or more composite compositions including those other than the above may be used.
In addition, the concentration of these additives is not particularly limited as long as it has a buffer capacity, but the preferable upper limit is 100 mM or less, more preferably 50 mM or less. A preferred lower limit is 5 mM or more.
The content of the buffer in the powder or lyophilized product is not particularly limited, but is preferably 0.1% (weight ratio) or more, particularly preferably 0.1 to 30% (weight ratio). Used in range.
These can use various commercially available reagents.
上記に示す種々の化合物は測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサを作製するときに予め含有させておくこともできる。また、GDHの抽出・精製・粉末化などの各製造工程において工程液に添加することもできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に機能するようにしておけばよい。 The various compounds shown above may be added at the time of measurement, or may be contained in advance when a glucose measuring reagent, a glucose assay kit, or a glucose sensor described later is prepared. Moreover, it can also add to a process liquid in each manufacturing process, such as extraction, refinement | purification, and pulverization of GDH. In this case, the liquid state, the dry state, etc. are not limited, and it is sufficient to function at the time of measurement.
本発明でいう熱安定性の向上とは、GDH酵素を含む組成物をある一定の温度で、一定時間熱処理した後、維持されているGDH酵素の残存率(%)が増大することを意味する。本願発明では、ほぼ完全に活性が維持される4℃保存のサンプルを100%として、これと一定温度で一定時間熱処理した後のGDH溶液の活性値を比較して、その酵素の残存率を算出している。この残存率が該化合物無添加のものと比べて増大していた場合、GDHの熱安定性が向上したと判断した。 The improvement in thermostability as used in the present invention means that the residual ratio (%) of the maintained GDH enzyme increases after heat treatment of the composition containing the GDH enzyme at a certain temperature for a certain time. . In the present invention, a sample stored at 4 ° C. in which the activity is almost completely maintained is assumed to be 100%, and this is compared with the activity value of the GDH solution after heat treatment at a constant temperature for a certain time to calculate the residual ratio of the enzyme. is doing. When this residual ratio was increased as compared with that without addition of the compound, it was judged that the thermal stability of GDH was improved.
具体的に、安定性が向上しているかどうかの判断は、次のように行った。
後述のGDH酵素活性の測定方法に記載の活性測定法において、4℃保存した溶液のGDH活性値(a)と、一定温度で一定時間熱処理した後のGDH活性値(b)を測定し、測定値(a)を100とした場合に対する相対値((b)/(a)×100)を求めた。この相対値を残存率(%)とした。そして、該化合物の添加の有無を比較して、添加により残存率が増大した場合、熱安定性が向上したと判断した。
Specifically, whether or not the stability is improved was determined as follows.
In the activity measurement method described in the method for measuring GDH enzyme activity described below, the GDH activity value (a) of a solution stored at 4 ° C. and the GDH activity value (b) after heat treatment at a constant temperature for a certain time are measured and measured. The relative value ((b) / (a) × 100) with respect to the value (a) of 100 was determined. This relative value was defined as the residual rate (%). And the presence or absence of the addition of the compound was compared, and when the residual ratio increased by the addition, it was determined that the thermal stability was improved.
本発明の効果は、メディエーターを含む系においてより顕著なものとなる。本発明の方法に適用できるメディエーターは特に限定されないが、フェナジンメトサルフェート(PMS)と2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)との組み合わせ、PMSとニトロブルーテトラゾリウム(NBT)との組み合わせ、DCPIP単独、フェリシアン化物イオン(化合物としてはフェリシアン化カリウムなど)単独、フェロセン単独などが挙げられる。中でもフェリシアン化物イオン(化合物としてはフェリシアン化カリウムなど)が好ましい。
これらの各メディエーターは感度に様々な違いが存在するために、添加濃度を一律に規定する必要性はないが、一般的には1mM以上の添加が望ましい。
これらのメディエーターは測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサを作製するときに予め含有させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に反応時に解離してイオンの状態になるようにしておけばよい。
The effect of the present invention becomes more remarkable in a system including a mediator. The mediator applicable to the method of the present invention is not particularly limited, but a combination of phenazine methosulfate (PMS) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DCPIP), a combination of PMS and nitroblue tetrazolium (NBT), or DCPIP alone And ferricyanide ions (such as potassium ferricyanide as a compound) alone, ferrocene alone and the like. Of these, ferricyanide ions (such as potassium ferricyanide) are preferable.
Since each of these mediators has various differences in sensitivity, it is not necessary to uniformly define the addition concentration, but it is generally desirable to add 1 mM or more.
These mediators may be added at the time of measurement, or may be contained in advance when a glucose measuring reagent, a glucose assay kit, or a glucose sensor described later is prepared. In this case, the liquid state, the dry state, and the like are not limited, and it is only necessary to dissociate at the time of the reaction during the measurement so as to be in an ionic state.
本発明においてはさらに必要に応じて種々の成分を共存させることが出来る。例えば、界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
例えば、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、1種または2種以上であってもよい。ここにさらに、牛血清アルブミン(BSA)、卵白アルブミン(OVA)を含有させてもよい。
In the present invention, various components can coexist if necessary. For example, you may add surfactant, a stabilizer, an excipient | filler, etc.
For example, one or more amino acids selected from the group consisting of glutamic acid, glutamine, and lysine may be used. Further, bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) may be added.
PQQGDHの場合は、例えば、カルシウムイオンまたはその塩、およびグルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりPQQGDHをより安定化することができる。
例えば、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、PQQGDHを安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、1×10−4〜1×10−2Mであることが好ましい。
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによるPQQGDHの安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、1種または2種以上であってもよい。ここにさらに卵白アルブミン(OVA)を含有させてもよい。
あるいは、(1)アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた1種または2種以上の化合物および(2)アルブミンを共存せしめることにより、PQQGDHを安定化することができる。
In the case of PQQGDH, for example, PQQGDH can be further stabilized by adding calcium ions or salts thereof, amino acids such as glutamic acid, glutamine, and lysine, and serum albumin.
For example, PQQGDH can be stabilized by containing calcium ions or calcium salts. Examples of calcium salts include calcium chloride, calcium salts of inorganic acids such as calcium acetate and calcium citrate, and organic acids. In the aqueous composition, the content of calcium ions is preferably 1 × 10 −4 to 1 × 10 −2 M.
The stabilizing effect of PQQGDH by containing calcium ions or calcium salts is further improved by containing an amino acid selected from the group consisting of glutamic acid, glutamine and lysine. One or more amino acids selected from the group consisting of glutamic acid, glutamine and lysine may be used. It may further contain ovalbumin (OVA).
Or (1) one or more compounds selected from the group consisting of aspartic acid, glutamic acid, α-ketoglutaric acid, malic acid, α-ketogluconic acid, α-cyclodextrin, and salts thereof; and (2) By coexisting albumin, PQQGDH can be stabilized.
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
本発明のグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサは、液状(水溶液、懸濁液等)、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
In the present invention, glucose can be measured by the following various methods.
The glucose measurement reagent, glucose assay kit, and glucose sensor of the present invention can take various forms such as liquid (aqueous solution, suspension, etc.), powdered by vacuum drying or spray drying, freeze drying, and the like. The drying method is not particularly limited and may be performed according to a conventional method. The composition containing the enzyme of the present invention is not limited to a lyophilized product, and may be in a solution state in which the dried product is redissolved.
In the present invention, glucose can be measured by the following various methods.
グルコース測定用試薬
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、GDH、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のGDHはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
Glucose Measuring Reagent The glucose measuring reagent of the present invention typically includes GDH, a buffer, a mediator, and other necessary reagents for measurement, a glucose standard solution for preparing a calibration curve, and usage guidelines. The kit of the invention can be provided, for example, as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution. Preferably, the GDH of the present invention is provided in a holified form, but may be provided in the form of an apoenzyme and hololated at the time of use.
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うGDHを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うGDHを少なくとも1回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のGDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うGDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のGDHはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
Glucose Assay Kit The present invention also features a glucose assay kit comprising GDH according to the present invention. The glucose assay kit of the present invention comprises GDH according to the present invention in an amount sufficient for at least one assay. Typically, the kit includes the GDH of the present invention, plus buffers necessary for the assay, mediators, glucose standard solution for creating a calibration curve, and directions for use. The GDH according to the present invention can be provided in various forms, for example as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution. Preferably, the GDH of the present invention is provided in a holified form, but may be provided in the form of an apoenzyme and hololated at the time of use.
グルコースセンサ
本発明はまた、本発明に従うGDHを用いるグルコースセンサを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはメディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のGDHはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、補酵素を別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のGDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
Glucose Sensor The present invention also features a glucose sensor that uses the GDH according to the present invention. As the electrode, a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode or the like is used, and the enzyme of the present invention is immobilized on this electrode. As immobilization methods, there are a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, etc. It may be fixed or adsorbed and fixed on the electrode, or a combination of these may be used. Preferably, the GDH of the present invention is immobilized on the electrode in a holo form, but it may be immobilized in the form of an apoenzyme and the coenzyme supplied as a separate layer or in solution. Typically, the GDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。作用電極として本発明のGDHを固定化した電極を用い、対極(例えば白金電極)および参照電極(例えばAg/AgCl電極)を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。 The glucose concentration can be measured as follows. Put the buffer in a thermostatic cell and add a mediator to maintain a constant temperature. An electrode on which the GDH of the present invention is immobilized is used as a working electrode, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode) are used. After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, a sample containing glucose is added and the increase in current is measured. The glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared with a standard concentration glucose solution.
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例1 :PQQ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型PQQ依存型グルコースデヒドロゲナーゼの発現プラスミドpNPG5は、ベクターpBluescript SK(−)のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii) NCIMB115
17株由来のPQQ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする構造遺伝子を挿入したものである。その塩基配列を配列表の配列番号2に、また該塩基配列から推定されるPQQ依存型グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号1に示す。
pNPG5のDNA5μgを制限酵素BamHIおよびXhoI(東洋紡績製)で切断して、変異型PQQ依存型グルコースデヒドロゲナーゼの構造遺伝子部分を単離した。単離したDNAとBamHIおよびXhoIで切断したpTM33(1μg)とT4DNAリガーゼ1単位で16℃、16時間反応させ、DNAを連結した。連結したDNAはエシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをpNPG6と命名した。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples.
Example 1 Construction of PQQ-Dependent Glucose Dehydrogenase Gene Expression Plasmid Wild-type PQQ-dependent glucose dehydrogenase expression plasmid pNPG5 is the Acinetobacter baumannini 115
A structural gene encoding a PQQ-dependent glucose dehydrogenase derived from 17 strains is inserted. The base sequence is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the amino acid sequence of PQQ-dependent glucose dehydrogenase deduced from the base sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
5 μg of DNA of pNPG5 was cleaved with restriction enzymes BamHI and XhoI (manufactured by Toyobo), and the structural gene portion of mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase was isolated. The isolated DNA was reacted with pTM33 (1 μg) cleaved with BamHI and XhoI with 1 unit of T4 DNA ligase at 16 ° C. for 16 hours to ligate the DNA. Ligated DNA was transformed with Escherichia coli DH5α competent cells. The resulting expression plasmid was named pNPG6.
実施例2:シュードモナス属細菌の形質転換体の作製
シュードモナス・プチダTE3493(微工研寄12298号)をLBG培地(LB培地+0.3%グリセロール)で30℃、16時間培養し、遠心分離(12,000rpm、10分間)により菌体を回収し、この菌体に氷冷した300mMシュークロースを含む5mMK−リン酸緩衝液(pH7.0)8mlを加え、菌体を懸濁した。再度遠心分離(12,000rpm、10分間)により菌体を回収し、この菌体に氷冷した300mMシュークロースを含む5mMK−リン酸緩衝液(pH7.0)0.4mlを加え、菌体を懸濁した。
該懸濁液に実施例1で得た発現プラスミドpNPG6を0.5μg加え、エレクトロポレーション法により形質転換した。100μg/mlのストレプトマイシンを含むLB寒天培地に生育したコロニーより、目的とする形質転換体を得た。
Example 2: Preparation of Pseudomonas genus transformant Pseudomonas putida TE3493 (Microtechnical Research No. 12298) was cultured in LBG medium (LB medium + 0.3% glycerol) at 30 ° C. for 16 hours and centrifuged (12 The bacterial cells were collected by 2,000 rpm for 10 minutes, and 8 ml of 5 mM K-phosphate buffer (pH 7.0) containing 300 mM sucrose ice-cooled was added to the bacterial cells to suspend the bacterial cells. The bacterial cells were collected again by centrifugation (12,000 rpm, 10 minutes), and 0.4 ml of 5 mM K-phosphate buffer (pH 7.0) containing 300 mM sucrose ice-cooled was added to the bacterial cells. Suspended.
0.5 μg of the expression plasmid pNPG6 obtained in Example 1 was added to the suspension and transformed by electroporation. A target transformant was obtained from a colony grown on an LB agar medium containing 100 μg / ml streptomycin.
実施例3:PQQ依存型GDH標品の調製
500mlのTerrific brothを2L容坂口フラスコに分注し、121℃、20分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したストレプトマイシンを100μg/mlになるように添加した。この培地に100μg/mlのストレプトマイシンを含むPY培地で予め30℃、24時間培養したシュードモナス・プチダTE3493(pNPG6)の培養液を5ml接種し、30℃で40時間通気攪拌培養した。培養終了時のPQQ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ活性は、前記活性測定において、培養液1ml当たり約30U/mlであった。
上記菌体を遠心分離により集菌し、20mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をHiTrap−SP(アマシャム−ファルマシア)イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製した。次いで10mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)で透析した後に終濃度が1mMになるように塩化カルシウムを添加した。最後にHiTrap−DEAE(アマシャム−ファルマシア)イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、SDS−PAGE的にほぼ単一なバンドを示した。
このようにして取得した精製酵素をPQQ依存型GLD評価標品として使用した。
Example 3 Preparation of PQQ-Dependent GDH Standard 500 ml of terrific broth is dispensed into a 2 L Sakaguchi flask, autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes, allowed to cool and then separately sterile filtered streptomycin to 100 μg / ml. Added to. This medium was inoculated with 5 ml of Pseudomonas putida TE3493 (pNPG6) cultured in PY medium containing 100 μg / ml streptomycin in advance at 30 ° C. for 24 hours, and cultured at 30 ° C. for 40 hours with aeration and stirring. The PQQ-dependent glucose dehydrogenase activity at the end of the culture was about 30 U / ml per 1 ml of the culture solution in the activity measurement.
The cells were collected by centrifugation, suspended in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0), disrupted by sonication, and further centrifuged to obtain a supernatant as a crude enzyme solution. . The obtained crude enzyme solution was separated and purified by HiTrap-SP (Amersham-Pharmacia) ion exchange column chromatography. Next, after dialyzing with 10 mM PIPES-NaOH buffer (pH 6.5), calcium chloride was added to a final concentration of 1 mM. Finally, it was separated and purified by HiTrap-DEAE (Amersham-Pharmacia) ion exchange column chromatography to obtain a purified enzyme preparation. The sample obtained by this method showed an almost single band by SDS-PAGE.
The purified enzyme thus obtained was used as a PQQ-dependent GLD evaluation sample.
実施例4:NAD依存型GDH標品の調製
NAD依存型GDH標品は、東洋紡より販売されている市販品(GLD−311)を入手して使用した。
Example 4 Preparation of NAD-Dependent GDH Standard An NAD-dependent GDH standard was obtained by using a commercial product (GLD-311) sold by Toyobo.
実施例5:FAD依存型GDH標品の調製
FAD依存型GDH生産菌としてAspergillus terreus亜種とPenicillium lilacinoechinulatum NBRC6231(独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入)を用い、それぞれのL乾標本をポテトデキストロース寒天培地(Difco製)に植菌し25℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。2基の10L容ジャーファーメンター中に生産培地(1%麦芽エキス、1.5%大豆ペプチド、0.1%MgSO4・7水和物、2%グルコース、pH6.5)6Lを調製し、120℃15分オートクレーブ滅菌後に上記の菌糸懸濁液をそれぞれ投入、培養を開始した。培養条件は、温度30℃、通気量2L/分、攪拌数380rpmで行った。培養開始から64時間後に培養を停止し、ヌッチェろ過器を用いて吸引ろ過によりろ紙上にそれぞれの菌株の菌体を集めた。培養液5Lを分子量10,000カットの限外ろ過用中空糸モジュールで1/10量に濃縮し、濃縮液にそれぞれ硫酸アンモニウムを終濃度が60%飽和(456g/L)となるように添加、溶解した。続いて日立高速冷却遠心機で8000rpm15分遠心し残渣を沈殿させたのち、上清をOctyl−Sepharoseカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム濃度0.6〜0.0飽和でグラジエント溶出してGDH活性のある画分を回収した。得られたGDH溶液を、G−25セファロースカラムでゲルろ過を行ってタンパク質画分を回収することで脱塩を行い、脱塩液に0.6飽和相当の硫酸アンモニウムを添加して溶解した。これをPhenyl−Sepharoseカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム濃度0.6〜0.0飽和でグラジエント溶出してGDH活性のある画分を回収した。さらに、得られたGDH溶液を、G−25セファロースカラムでゲルろ過を行ってタンパク質画分を回収し、取得した精製酵素をFAD依存型GLD評価標品として使用した。
Example 5: Preparation of FAD-dependent GDH preparation Aspergillus terreus subspecies and Penicillium lilacinoechinatum NBRC6231 (purchased from the National Institute of Technology and Evaluation Technology) were used as FAD-dependent GDH-producing bacteria. It was reconstituted by inoculating agar medium (Difco) and incubating at 25 ° C. The restored mycelium on the plate was collected together with the agar and suspended in filter sterilized water. 6 L of production medium (1% malt extract, 1.5% soybean peptide, 0.1% MgSO4 · 7 hydrate, 2% glucose, pH 6.5) was prepared in two 10 L jar fermenters, After the autoclave sterilization at 15 ° C., the above mycelial suspensions were added, and the culture was started. The culture conditions were a temperature of 30 ° C., an aeration rate of 2 L / min, and a stirring speed of 380 rpm. The culture was stopped 64 hours after the start of the culture, and the cells of each strain were collected on the filter paper by suction filtration using a Nutsche filter. Concentrate 5 L of the culture solution to 1/10 volume using a hollow fiber module for ultrafiltration with a molecular weight of 10,000 cut, and add and dissolve ammonium sulfate in the concentrate so that the final concentration is 60% saturation (456 g / L). did. Subsequently, after centrifuging at 8000 rpm for 15 minutes in a Hitachi high-speed cooling centrifuge, the residue was precipitated, the supernatant was adsorbed on an Octyl-Sepharose column, and gradient elution was performed with an ammonium sulfate concentration of 0.6 to 0.0 saturation. Minutes were collected. The obtained GDH solution was subjected to gel filtration with a G-25 Sepharose column to recover the protein fraction, and desalted to add 0.6 ammonium sulfate equivalent to the desalted solution and dissolved. This was adsorbed on a Phenyl-Sepharose column and eluted with a gradient at an ammonium sulfate concentration of 0.6 to 0.0 to collect a fraction having GDH activity. Further, the obtained GDH solution was subjected to gel filtration with a G-25 Sepharose column to collect a protein fraction, and the obtained purified enzyme was used as a FAD-dependent GLD evaluation preparation.
本発明のグルコース測定用組成物、グルコースアッセイキット、グルコースセンサ、あるいはグルコース測定方法に用いるメディエーターは、特に制限されるものではないが、好ましくは、2,6−dichlorophenol−indophenol(略称DCPIP)、フェロセンあるいはそれらの誘導体(例えばフェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなど)を用いるのがよい。これらのメディエーターは市販のものを入手することができる。 The mediator used in the glucose measurement composition, glucose assay kit, glucose sensor, or glucose measurement method of the present invention is not particularly limited, but preferably 2,6-dichlorophenol-indophenol (abbreviation DCPIP), ferrocene. Alternatively, derivatives thereof (for example, potassium ferricyanide, phenazine methosulfate, etc.) may be used. These mediators can be obtained commercially.
試験例1:PQQ依存型GDH活性の測定方法
本発明において、PQQ依存型GDHの活性測定は以下の条件で行う。
測定原理
D−グルコース+PMS+PQQGDH → D−グルコノ−1,5−ラクトン + PMS(red)
PMS(red) + DCPIP → PMS + DCPIP(red)
フェナジンメトサルフェート(PMS)(red)による2,6−ジクロロフェノール−インドフェノール(DCPIP)の還元により形成されたDCPIP(red)の存在は、600nmで分光光度法により測定した。また、基質特異性の検討では、D−グルコースの部分を他の糖類に変更して、それぞれの基質に対する特異性を測定した。
単位の定義
1単位は、以下に記載の条件下で1分当たりDCPIP(red)を1.0ミリモル形成させるPQQGDHの酵素量をいう。
方法
試薬
A.D−グルコース溶液:1.0M(1.8g D−グルコース(分子量180.16)/10ml H2O)
B.PIPES−NaOH緩衝液, pH6.5:50mM(60mLの水中に懸濁した1.51gのPIPES(分子量302.36)を、5N NaOHに溶解し、2.2mlの10% Triton X−100を加える。5N NaOHを用いて25℃でpHを6.5±0.05に調整し、水を加えて100mlとした。)
C.PMS溶液:24mM(73.52mgのフェナジンメトサルフェート(分子量817.65)/10mlH2O)
D.DCPIP溶液:2.0mM(6.5mgのニトロテトラゾリウムブルー(分子量817.65)/10mlH2O)
E.酵素希釈液:1mM CaCl2, 0.1% Triton X−100, 0.1% BSAを含む50mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)
手順
1. 遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した(用時調製)
4.5ml D−グルコース溶液 (A)
21.9ml PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5) (B)
2.0ml PMS溶液 (C)
1.0ml DCPIP溶液 (D)
上記アッセイ混合物の反応液中の濃度は次のとおり。
PIPES緩衝液 36mM
D−グルコース 148mM
PMS 1.58mM
DCPIP 0.066mM
2. 3.0mlの反応混合液を試験管(プラスチック製)に入れ、37℃で5分間予備加温した。
3. 0.1mlの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
4. 600nmでの水に対する吸光度の減少を37℃に維持しながら分光光度計で4〜5分間記録し、曲線の初期直線部分からの1分当たりのΔODを計算した(ODテスト)。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液(E)加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク(ΔODブランク)を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液(E)で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で0.05−0.10U/mlに希釈した(該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい)。
基質特異性を評価する目的には、上記活性測定操作はグルコース溶液の代わりに他の種類の糖溶液を基質として実施した
計算
活性を以下の式を用いて計算する:
U/ml={ΔOD/min(ΔODテスト− ΔODブランク)×Vt×df}/(16.8×1.0×Vs)
U/mg=(U/ml)×1/C
Vt:総体積(3.1ml)
Vs:サンプル体積(0.1ml)
16.8:上記測定条件でのDCPIPのミリモル分子吸光係数(cm2/マイクロモル)
1.0:光路長(cm)
df:希釈係数
C:溶液中の酵素濃度(c mg/ml)
Test Example 1: Method for measuring PQQ-dependent GDH activity In the present invention, the activity of PQQ-dependent GDH is measured under the following conditions.
Measurement principle D-glucose + PMS + PQQGDH → D-glucono-1,5-lactone + PMS (red)
PMS (red) + DCPIP → PMS + DCPIP (red)
The presence of DCPIP (red) formed by the reduction of 2,6-dichlorophenol-indophenol (DCPIP) with phenazine methosulfate (PMS) (red) was measured spectrophotometrically at 600 nm. In the examination of substrate specificity, the D-glucose part was changed to another saccharide, and the specificity for each substrate was measured.
Definition of Unit One unit refers to the amount of PQQGDH enzyme that forms 1.0 mmol of DCPIP (red) per minute under the conditions described below.
Method Reagent A. D-glucose solution: 1.0 M (1.8 g D-glucose (molecular weight 180.16) / 10 ml H 2 O)
B. PIPES-NaOH buffer, pH 6.5: 50 mM (1.51 g of PIPES (molecular weight 302.36) suspended in 60 mL of water is dissolved in 5N NaOH and 2.2 ml of 10% Triton X-100 is added. The pH was adjusted to 6.5 ± 0.05 at 25 ° C. using 5N NaOH, and water was added to make 100 ml.)
C. PMS solution: 24 mM (73.52 mg phenazine methosulfate (molecular weight 817.65) / 10 ml H 2 O)
D. DCPIP solution: 2.0 mM (6.5 mg of nitrotetrazolium blue (molecular weight 817.65) / 10 ml H 2 O)
E. Enzyme dilution: 50 mM PIPES-NaOH buffer (pH 6.5) containing 1 mM CaCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.1% BSA
Procedure 1. Prepare the following reaction mixture in a light-proof bottle and store on ice (prepared at the time of use)
4.5 ml D-glucose solution (A)
21.9 ml PIPES-NaOH buffer (pH 6.5) (B)
2.0ml PMS solution (C)
1.0 ml DCPIP solution (D)
The concentration of the assay mixture in the reaction solution is as follows.
PIPES buffer 36 mM
D-glucose 148 mM
PMS 1.58mM
DCPIP 0.066 mM
2. 3.0 ml of the reaction mixture was placed in a test tube (made of plastic) and preheated at 37 ° C. for 5 minutes.
3. 0.1 ml enzyme solution was added and mixed by gentle inversion.
4). The decrease in absorbance for water at 600 nm was recorded on a spectrophotometer while maintaining at 37 ° C. for 4-5 minutes, and the ΔOD per minute from the initial linear portion of the curve was calculated (OD test).
At the same time, the same method was repeated except that the enzyme diluent (E) was added instead of the enzyme solution, and a blank (ΔOD blank) was measured.
Immediately before the assay, the enzyme powder was dissolved in ice-cooled enzyme diluent (E) and diluted to 0.05-0.10 U / ml with the same buffer (use of a plastic tube for adhesion of the enzyme) Is preferred).
For the purpose of assessing substrate specificity, the above activity measurement procedure is performed using another type of sugar solution instead of glucose solution as a substrate to calculate the calculated activity using the following formula:
U / ml = {ΔOD / min (ΔOD test−ΔOD blank) × Vt × df} / (16.8 × 1.0 × Vs)
U / mg = (U / ml) × 1 / C
Vt: Total volume (3.1 ml)
Vs: Sample volume (0.1 ml)
16.8: Millimolecular extinction coefficient of DCPIP under the above measurement conditions (cm 2 / micromol)
1.0: Optical path length (cm)
df: Dilution factor C: Enzyme concentration in solution (c mg / ml)
試験例2:NAD依存型GDH活性の測定方法
本発明において、NAD依存型GDHの活性測定は以下の条件で行う。なお、NAD依存型GDH酵素標品として、東洋紡製のグルコース脱水素酵素(GLD311)を使用した。
測定原理
D−グルコース + NAD+ → D−グルコノ−1,5−ラクトン + NADH + H+
NADHの生成量を340nmの吸光度の変化で測定した。
単位の定義
1単位は、以下に記載の条件下で1分当たりNADHを1.0マイクロモル形成させるNADGDHの酵素量をいう。
方法
試薬
A.D−グルコース溶液:1.5M(2.7g D−グルコース(分子量180.16)/10ml H2O)
B.Tris−HCl緩衝液,pH8.0:100mM(90mLの水中に懸濁した1.21gのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(分子量121.14)を、5N HClを用いて25℃でpHを8.0±0.05に調整し、水を加えて100mlとした。)
C.NAD溶液:8%(80mgのNAD(分子量717.48)/1mlH2O)
D.酵素希釈液:リン酸カリウム緩衝液(pH7.2)
手順
1. 遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した(用時調製)
0.9ml D−グルコース溶液 (A)
7.8ml Tris−HCl緩衝液(pH8.0) (B)
0.3ml NAD溶液 (C)
上記アッセイ混合物の反応液中の濃度は次のとおり。
D−グルコース 148mM
Tris−HCl緩衝液 77mM
NAD 0.26%
2. 3.0mlの反応混合液を試験管(プラスチック製)に入れ、37℃で5分間予備加温した。
3. 0.05mlの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
4. 340nmでの水に対する吸光度の変化を37℃に維持しながら分光光度計で4〜5分間記録し、曲線の初期直線部分からの1分当たりのΔODを計算した(ODテスト)。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液(D)加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク(ΔODブランク)を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液(D)で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で0.10−0.70U/mlに希釈した(該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい)。
基質特異性を評価する目的には、上記活性測定操作はグルコース溶液の代わりに他の種類の糖溶液を基質として実施した。
計算
活性を以下の式を用いて計算する:
U/ml={ΔOD/min(ΔODテスト− ΔODブランク)×Vt×df}/(6.22×1.0×Vs)
U/mg=(U/ml)×1/C
Vt:総体積(3.05ml)
Vs:サンプル体積(0.05ml)
6.22:NADHのミリモル分子吸光係数(cm2/マイクロモル)
1.0:光路長(cm)
df:希釈係数
C:溶液中の酵素濃度(c mg/ml)
Test Example 2: Method for Measuring NAD-Dependent GDH Activity In the present invention, NAD-dependent GDH activity is measured under the following conditions. As the NAD-dependent GDH enzyme preparation, glucose dehydrogenase (GLD311) manufactured by Toyobo was used.
Measuring principle D-glucose + NAD + → D-glucono-1,5-lactone + NADH + H +
The amount of NADH produced was measured by the change in absorbance at 340 nm.
Definition of Unit One unit refers to the amount of NADGDH enzyme that forms 1.0 micromolar NADH per minute under the conditions described below.
Method Reagent A. D-glucose solution: 1.5 M (2.7 g D-glucose (molecular weight 180.16) / 10 ml H 2 O)
B. Tris-HCl buffer, pH 8.0: 100 mM (1.21 g of tris (hydroxymethyl) aminomethane (molecular weight 121.14) suspended in 90 mL of water, 5N HCl at 25 ° C., pH 8. Adjusted to 0 ± 0.05 and added water to make 100 ml.)
C. NAD solution: 8% (80 mg NAD (molecular weight 717.48) / 1 ml H 2 O)
D. Enzyme dilution: potassium phosphate buffer (pH 7.2)
Procedure 1. Prepare the following reaction mixture in a light-proof bottle and store on ice (prepared at the time of use)
0.9 ml D-glucose solution (A)
7.8 ml Tris-HCl buffer (pH 8.0) (B)
0.3ml NAD solution (C)
The concentration of the assay mixture in the reaction solution is as follows.
D-glucose 148 mM
Tris-HCl buffer 77 mM
NAD 0.26%
2. 3.0 ml of the reaction mixture was placed in a test tube (made of plastic) and preheated at 37 ° C. for 5 minutes.
3. 0.05 ml enzyme solution was added and mixed by gentle inversion.
4). The change in absorbance for water at 340 nm was recorded for 4-5 minutes on a spectrophotometer while maintaining at 37 ° C., and the ΔOD per minute from the initial linear portion of the curve was calculated (OD test).
At the same time, the same method was repeated except that the enzyme diluent (D) was added instead of the enzyme solution, and a blank (ΔOD blank) was measured.
Immediately before the assay, the enzyme powder was dissolved in an ice-cooled enzyme diluent (D) and diluted to 0.10-0.70 U / ml with the same buffer (use of a plastic tube for adhesion of the enzyme) Is preferred).
For the purpose of evaluating substrate specificity, the above activity measurement procedure was performed using another type of sugar solution as a substrate instead of the glucose solution.
Calculation Activity is calculated using the following formula:
U / ml = {ΔOD / min (ΔOD test−ΔOD blank) × Vt × df} / (6.22 × 1.0 × Vs)
U / mg = (U / ml) × 1 / C
Vt: Total volume (3.05 ml)
Vs: Sample volume (0.05 ml)
6.22: mmol molecular absorption coefficient of NADH (cm 2 / micromol)
1.0: Optical path length (cm)
df: Dilution factor C: Enzyme concentration in solution (c mg / ml)
試験例3:FAD依存型GDH活性の測定方法
本発明において、FAD依存型GDHの活性測定は以下の条件で行う。
<試薬>
50mM PIPES緩衝液pH6.5(0.1%TritonX−100を含む)
14mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)溶液
1M D−グルコース溶液
上記PIPES緩衝液15.8ml、DCPIP溶液0.2ml、D―グルコース溶液4mlを混合して反応試薬とする。
Test Example 3: Method for Measuring FAD-Dependent GDH Activity In the present invention, the activity measurement of FAD-dependent GDH is performed under the following conditions.
<Reagent>
50 mM PIPES buffer pH 6.5 (including 0.1% Triton X-100)
14
<測定条件>
反応試薬2.9mlを37℃で5分間予備加温する。GDH溶液0.1mlを添加しゆるやかに混和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計で、600nmの吸光度変化を5分記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化(ΔODTEST)を測定する。盲検はGDH溶液の代わりにGDHを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔODBLANK)を測定する。これらの値から次の式に従ってGDH活性を求める。ここでGDH活性における1単位(U)とは、濃度200mMのD−グルコース存在下で1分間に1マイクロモルのDCPIPを還元する酵素量として定義している。
活性(U/ml)=
{−(ΔODTEST−ΔODBLANK)×3.0×希釈倍率}/{16.3×0.1×1.0}
なお、式中の3.0は反応試薬+酵素溶液の液量(ml)、16.3は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数(cm2/マイクロモル)、0.1は酵素溶液の液量(ml)、1.0はセルの光路長(cm)を示す。
<Measurement conditions>
Prewarm 2.9 ml of reaction reagent at 37 ° C. for 5 minutes. Add 0.1 ml of GDH solution and mix gently, then record the change in absorbance at 600 nm for 5 minutes using a spectrophotometer controlled at 37 ° C. with water as a control. Change in absorbance per minute from the straight line (ΔODTEST) Measure. In the blind test, a solvent for dissolving GDH is added to the reagent mixture instead of the GDH solution, and the change in absorbance per minute (ΔODBLANK) is measured in the same manner. From these values, the GDH activity is determined according to the following formula. Here, 1 unit (U) in GDH activity is defined as the amount of enzyme that reduces 1 micromole of DCPIP per minute in the presence of 200 mM D-glucose.
Activity (U / ml) =
{-(ΔODTEST-ΔODBLANK) × 3.0 × dilution factor} / {16.3 × 0.1 × 1.0}
In the formula, 3.0 is the amount of the reaction reagent + enzyme solution (ml), 16.3 is the molar molecular extinction coefficient (cm 2 / micromol) under the conditions for this activity measurement, and 0.1 is the enzyme solution solution. Amount (ml), 1.0 indicates the optical path length (cm) of the cell.
3種類の異なる補酵素を利用するGDHは、各々、異なる条件で熱安定性の向上を検討している。例えば、以下の実施例6−8において、PQQGDHでは、pH6.5の緩衝液で5U/mlに調製した酵素液を50℃、16時間熱処理した後、残存するPQQGDH活性を比較して、熱安定性の向上を確認している。同じく、NADGDHでは、pH7.2の緩衝液で85U/mlに調製した酵素液を50℃、1時間熱処理した後、残存するNADGDH活性を比較して、熱安定性の向上を確認している。また、同じく、FADGDHでは、pH7.2の緩衝液で5U/mlに調製した酵素液を50℃または55℃で、15〜30分間熱処理した後、残存するFADGDH活性を比較して、熱安定性の向上を確認した。 GDH using three different types of coenzymes is examining improvement in thermal stability under different conditions. For example, in Examples 6-8 below, in PQQGDH, an enzyme solution prepared to 5 U / ml with a buffer solution of pH 6.5 was heat-treated at 50 ° C. for 16 hours, and then the remaining PQQGDH activity was compared and heat stable. The improvement of sex is confirmed. Similarly, in NADGDH, after the enzyme solution prepared to 85 U / ml with the buffer solution of pH 7.2 was heat-processed at 50 degreeC for 1 hour, the remaining NADGDH activity was compared and the improvement in thermal stability was confirmed. Similarly, in FADGDH, an enzyme solution prepared to 5 U / ml with a buffer solution of pH 7.2 is heat-treated at 50 ° C. or 55 ° C. for 15 to 30 minutes, and then the remaining FADGDH activity is compared to determine the thermal stability. Improved.
また、以下の実施例9および10においては、50mMの各種緩衝液で調製した酵素液組成物(0.4〜5.1U/ml)のpHを実測した後、50℃、15分間、または、50℃、30分間、または、55℃、15分間、または、55℃、30分間の熱処理を行い、GDH活性を測定して活性残存率(%)を算出した。この活性残存率を比較することにより、熱安定性の向上を確認した。 Moreover, in the following Examples 9 and 10, after actually measuring the pH of the enzyme solution composition (0.4 to 5.1 U / ml) prepared with various 50 mM buffers, 50 ° C. for 15 minutes, or Heat treatment was performed at 50 ° C. for 30 minutes, or 55 ° C. for 15 minutes, or 55 ° C. for 30 minutes, and GDH activity was measured to calculate the residual activity rate (%). The improvement in thermal stability was confirmed by comparing the activity residual ratio.
実施例6:グルコース測定系を用いた熱安定性の確認1
検討は、先述の試験例1のPQQGDH活性の測定方法に準じて行った。また、アポ型も含めた形でPQQGDHの酵素活性を測定するために、終濃度860nMのPQQを添加した反応混合液でも活性を測定した。
まず、PQQGDHを約5.0U/mlになるように酵素希釈液(1mM CaCl2, 0.1% Triton X−100, 0.1% BSAを含む50mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5))にて溶解したものを50ml用意した。この酵素溶液0.33mlに、表1,2記載の10倍濃度の各種化合物を0.1ml添加して、同じく表1,2記載のベースバッファーを加え、合計容量を1.0mlとしたものを2本用意した。また、コントロールには、各種化合物の代わりに蒸留水0.1mlを添加したものを2本用意した。2本のうち、1本は4℃,16時間保存し、もう1本は、50℃、16時間処理を施した。処理後、各サンプルを酵素希釈液にて10倍希釈した後、PQQGDH活性を測定した。各々、4℃,16時間保存したものの酵素活性を100として、50℃、16時間処理後の活性値を比較して相対値(%)として算出した。
PQQGDH組成物に、表1,2で示す全ての化合物において、それらを共存させることにより、熱安定性の向上が認められた。リン酸カリウムバッファーをベースにしたものでは、コハク酸、ピメリン酸、ジメチルグルタル酸を添加した場合、ホロ型PQQGLDの熱安定性が低下しているが、これは該酵素からPQQが脱落していることが起因すると思われる。アポ型も含めた熱安定性としては向上が見られており、酵素自体の立体構造の維持にこれら化合物が効果を発揮しているものと思われる。
表1は、PIPESバッファー(pH6.5)をベースとして各種化合物を共存させたPQQGDH組成物の50℃,16時間処理後のPQQGDH活性の残存率(%)を示す。
表2は、フタル酸バッファー(pH7.0)、リン酸カリウムバッファー(pH7.0)をベースとして各種化合物を共存させたPQQGDH組成物の50℃,16時間処理後のPQQGDH活性の残存率(%)を示す。
Example 6: Confirmation of thermal stability using a glucose measurement system 1
The examination was performed according to the method for measuring PQQGDH activity in Test Example 1 described above. In addition, in order to measure the enzyme activity of PQQGDH including the apo type, the activity was also measured in a reaction mixture to which PQQ having a final concentration of 860 nM was added.
First, enzyme dilution solution (50 mM PIPES-NaOH buffer (pH 6.5) containing 1 mM CaCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.1% BSA) so that PQQGDH is about 5.0 U / ml. 50 ml of the product dissolved in was prepared. To 0.33 ml of this enzyme solution, 0.1 ml of 10-fold concentrations of various compounds listed in Tables 1 and 2 were added, and the base buffers listed in Tables 1 and 2 were added to make the total volume 1.0 ml. Two were prepared. In addition, two controls were prepared by adding 0.1 ml of distilled water instead of various compounds. Of the two, one was stored at 4 ° C. for 16 hours, and the other was treated at 50 ° C. for 16 hours. After the treatment, each sample was diluted 10-fold with an enzyme diluent, and then PQQGDH activity was measured. The enzyme activity of each sample stored at 4 ° C. for 16 hours was taken as 100, and the activity values after treatment at 50 ° C. for 16 hours were compared and calculated as a relative value (%).
In all the compounds shown in Tables 1 and 2 in the PQQGDH composition, an improvement in thermal stability was observed by coexisting them. In the case of the one based on potassium phosphate buffer, when succinic acid, pimelic acid and dimethylglutaric acid are added, the thermal stability of holo-type PQQGLD is lowered, but this is because PQQ is dropped from the enzyme. It seems to be caused by this. The thermal stability including the apo type has been improved, and it seems that these compounds are effective in maintaining the three-dimensional structure of the enzyme itself.
Table 1 shows the residual rate (%) of PQQGDH activity after treatment of PQQGDH composition containing PPIES buffer (pH 6.5) in the presence of various compounds at 50 ° C. for 16 hours.
Table 2 shows the residual rate of PQQGDH activity after treatment of PQQGDH composition in the presence of various compounds based on phthalate buffer (pH 7.0) and potassium phosphate buffer (pH 7.0) at 50 ° C. for 16 hours (% ).
実施例7:グルコース測定系を用いた熱安定性の確認2
検討は、先述の試験例2のNADGDH活性の測定方法に準じて行った。
まず、NADGLD(東洋紡製GLD−311)を約250U/mlになるように酵素希釈液にて溶解したものを50ml用意した。この酵素溶液0.33mlに、表3記載の10倍濃度の各種化合物を0.1ml添加して、リン酸カリウム緩衝液(pH7.2)を加え、合計容量を1.0mlとしたものを2本用意した。また、コントロールには、各種化合物の代わりに蒸留水0.1mlを添加したものを2本用意した。2本のうち、1本は4℃で保存し、もう1本は、50℃、1時間処理を施した。処理後、各サンプルを酵素希釈液にて500倍希釈した後、NADGDH活性を測定した。各々、4℃で保存したものの酵素活性を100として、50℃、1時間処理後の活性値を比較して活性残存率(%)として算出した。
その結果、検討した全てのジカルボン酸で効果が見られ、中でもコハク酸またはマレイン酸を添加した時に、最も高い熱安定性の向上効果が認められた。
表3は、各種化合物を共存させたNADGDH組成物の50℃,1時間処理後のNADGDH活性の残存率(%)を示す。
Example 7: Confirmation of thermal stability using
The examination was performed according to the method for measuring NADGDH activity in Test Example 2 described above.
First, 50 ml of NADGLD (Toyobo GLD-311) dissolved in an enzyme diluent so as to be about 250 U / ml was prepared. To 0.33 ml of this enzyme solution, 0.1 ml of various compounds having a 10-fold concentration shown in Table 3 was added, and potassium phosphate buffer (pH 7.2) was added to make the total volume 1.0 ml. I prepared a book. In addition, two controls were prepared by adding 0.1 ml of distilled water instead of various compounds. Of the two, one was stored at 4 ° C and the other was treated at 50 ° C for 1 hour. After the treatment, each sample was diluted 500-fold with an enzyme diluent, and then NADGDH activity was measured. In each case, the enzyme activity of those stored at 4 ° C. was defined as 100, and the activity value after treatment at 50 ° C. for 1 hour was compared to calculate the activity remaining rate (%).
As a result, all dicarboxylic acids examined showed an effect, and the highest thermal stability improvement effect was observed when succinic acid or maleic acid was added.
Table 3 shows the residual ratio (%) of NADGDH activity after treatment for 1 hour at 50 ° C. of the NADGDH composition in which various compounds coexist.
実施例8:グルコース測定系を用いた熱安定性の確認3
検討は、先述の試験例3のFADGDH活性の測定方法に準じて行った。
まず、実施例5で所得したFADGLDを約10U/mlになるように酵素希釈液(50mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.2))にて溶解したものを50ml用意した。この酵素溶液0.5mlに、1%,0.5%のBSAを0.5ml添加して、合計容量を1.0mlとしたものを2本用意した。また、表5、6に記載の各2倍濃度のコハク酸、マロン酸、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムを用意して、同様に0.5ml添加して、合計容量を1.0mlとしたものを2本用意した。コントロールには、各種化合物の代わりに蒸留水0.1mlを添加したものを2本用意した。
2本のうち、1本は4℃で保存し、もう1本は、50℃、30分間処理を施した。処理後、各サンプルを酵素希釈液にて21倍希釈した後、FADGDH活性を測定した。各々、4℃で保存したものの酵素活性を100として、50℃、1時間処理後の活性値を比較して活性残存率(%)として算出した。
これらの検討の結果、タンパク質性の安定化剤(BSA)を添加することにより、FAD−GLDの熱安定性が増大することが明らかとなった(表4)。また、各種ジカルボン酸化合物あるいは各種塩化合物の添加でFAD−GLDの熱安定性の向上効果が見られ、ジカルボン酸化合物の中ではコハク酸、マロン酸が、塩化合物の中では硫酸ナトリウムが最大の効果が見られた(表5、6)。コハク酸、マロン酸、硫酸ナトリウムにおいては、数モル程度の添加でも安定性向上効果が見られるものと思われる。また、塩化ナトリウムのような単純な塩化合物でも十分な効果が見られていることから、FAD−GLDにおいては、単純にイオン強度を上げるだけで熱安定化することがはじめて見出された。
表4は、タンパク質性の安定化剤を共存させたFADGDH組成物の50℃,30分間処理後のFADGDH活性の残存率(%)を示す。
表5は、ジカルボン酸化合物を共存させたFADGDH組成物の50℃,30分間処理後のFADGDH活性の残存率(%)を示す。
表6は、塩化合物を共存させたFADGDH組成物の50℃,15分間処理後のFADGDH活性の残存率(%)を示す。
Example 8: Confirmation of thermal stability using
The examination was performed according to the method for measuring FADGDH activity in Test Example 3 described above.
First, 50 ml of FADGLD obtained in Example 5 dissolved in an enzyme diluent (50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2)) so as to be about 10 U / ml was prepared. Two solutions were prepared by adding 0.5 ml of 1% and 0.5% BSA to 0.5 ml of this enzyme solution to a total volume of 1.0 ml. In addition, succinic acid, malonic acid, phthalic acid, maleic acid, glutaric acid, sodium chloride, sodium sulfate, trisodium citrate, and ammonium sulfate having double concentrations shown in Tables 5 and 6 were prepared. Two bottles were prepared by adding 5 ml to a total volume of 1.0 ml. For control, two were prepared by adding 0.1 ml of distilled water instead of various compounds.
Of the two, one was stored at 4 ° C and the other was treated at 50 ° C for 30 minutes. After the treatment, each sample was diluted 21 times with an enzyme diluent, and then FADGDH activity was measured. In each case, the enzyme activity of those stored at 4 ° C. was defined as 100, and the activity value after treatment at 50 ° C. for 1 hour was compared to calculate the activity remaining rate (%).
As a result of these studies, it has been clarified that the thermal stability of FAD-GLD is increased by adding a proteinaceous stabilizer (BSA) (Table 4). In addition, the addition of various dicarboxylic acid compounds or various salt compounds is effective in improving the thermal stability of FAD-GLD. Among the dicarboxylic acid compounds, succinic acid and malonic acid are the largest, and among the salt compounds, sodium sulfate is the largest. The effect was seen (Tables 5 and 6). In the case of succinic acid, malonic acid, and sodium sulfate, it is considered that the effect of improving the stability can be seen even with the addition of several moles. Moreover, since a sufficient effect is seen even with a simple salt compound such as sodium chloride, it has been found for the first time in FAD-GLD that the thermal stabilization is achieved simply by increasing the ionic strength.
Table 4 shows the residual ratio (%) of FADGDH activity after treatment for 30 minutes at 50 ° C. of the FADGDH composition in the presence of a proteinaceous stabilizer.
Table 5 shows the residual ratio (%) of the FADGDH activity after treatment for 30 minutes at 50 ° C. of the FADGDH composition containing the dicarboxylic acid compound.
Table 6 shows the residual ratio (%) of FADGDH activity after treatment for 15 minutes at 50 ° C. of the FADGDH composition in the presence of a salt compound.
実施例9:酸性側のpHを保持させたGDH組成物の熱安定性の向上効果の検討
検討は、先述の試験例3のFADGDH活性の測定方法に準じて行った。
まず、実施例5で所得した2種類のFADGDHをそれぞれ約10U/mlになるように酵素希釈液(50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5))にて溶解したものを10ml用意した。この酵素溶液0.2mlに、50mMリン酸カリウム緩衝液(pH4.3)、または、50mMリン酸カリウム緩衝液(pH5.6)、または、50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を1.8ml添加して、合計容量を2.0mlにした。それぞれの酵素溶液のpHを実測したところ、pH5.6、6.0、7.2付近に変動していた。1mlずつ分注したものを2本用意して、1本は4℃で保存し、もう1本は、50℃にて熱処理を施した。処理後、各サンプルを酵素希釈液にて2倍希釈した後、FADGDH活性を測定した。各々、4℃で保存したものの酵素活性を100%として、50℃、15分間あるいは30分間処理後の活性値を比較してGDH活性残存率(%)を算出した。
これらの検討の結果、GDH含有組成物のpHを酸性側で保持するとFADGLD含有組成物の熱安定性が増大することが明らかとなった(表7)。
更に、細かくpH条件を検討するため、先の方法と同様に、表8記載の各種バッファーにて酵素液を10倍希釈して、実測pHを確認した後に50℃、15分間熱処理を行い、GDH活性を測定して、その残存率(%)を算出した。
その結果、Aspergillus terreus亜種とPenicillium lilacinoechinulatum NBRC6231株のいずれの由来のFADGLDを含有する組成物でも、pH3.14 〜 6.97の範囲でpH7.4付近の場合と比べて、熱安定性が向上することが明らかになった(表8、図1、図2)。
GDH組成物の汎用用途であるグルコースセンサのセンサチップ作製時には、加熱乾燥する工程があり、FADGDH含有組成物を酸性側で維持することにより該組成物自体の安定性を向上させることは、FADGDHを用いたセンサチップ製品の安定性、測定精度を高める上で、非常に重要である。
Example 9: Examination of the effect of improving the thermal stability of a GDH composition having an acidic pH maintained Examination was performed according to the method for measuring FADGDH activity in Test Example 3 described above.
First, 10 ml prepared by dissolving the two types of FADGDH obtained in Example 5 with an enzyme diluent (50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5)) so as to be about 10 U / ml each was prepared. To 0.2 ml of this enzyme solution, 1. Add 50 mM potassium phosphate buffer (pH 4.3), 50 mM potassium phosphate buffer (pH 5.6), or 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). 8 ml was added to bring the total volume to 2.0 ml. When the pH of each enzyme solution was measured, it varied to around pH 5.6, 6.0, and 7.2. Two aliquots of 1 ml were prepared, one was stored at 4 ° C., and the other was heat-treated at 50 ° C. After the treatment, each sample was diluted 2-fold with an enzyme diluent, and then FADGDH activity was measured. The percentage of remaining GDH activity (%) was calculated by comparing the activity values after treatment at 50 ° C. for 15 minutes or 30 minutes with the enzyme activity of those stored at 4 ° C. as 100%.
As a result of these studies, it has been clarified that the thermal stability of the FADGLD-containing composition increases when the pH of the GDH-containing composition is maintained on the acidic side (Table 7).
Furthermore, in order to examine the pH conditions in detail, as in the previous method, the enzyme solution was diluted 10-fold with various buffers shown in Table 8, and after confirming the measured pH, heat treatment was performed at 50 ° C. for 15 minutes, and GDH was performed. Activity was measured and the residual ratio (%) was calculated.
As a result, in the composition containing FADGLD derived from any of Aspergillus terreus subspecies and Penicillium lilacinoechinatum NBRC6231, the thermal stability is improved in the range of pH 3.14 to 6.97 compared with the vicinity of pH 7.4. (Table 8, FIG. 1 and FIG. 2).
When preparing a sensor chip for a glucose sensor, which is a general purpose use of the GDH composition, there is a step of heating and drying, and maintaining the FADGDH-containing composition on the acidic side improves the stability of the composition itself. It is very important for improving the stability and measurement accuracy of the sensor chip product used.
実施例10:酸性側のpHを保持させたGDH組成物に1種類以上の塩化合物あるいはジカルボン酸を共存させることにより得られる該組成物の熱安定性向上効果の検討
検討は、先述の試験例3のFADGDH活性の測定方法に準じて行った。
まず、50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)にて、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムを、それぞれ1Mとなるように溶解した各種化合物溶液を作製した。また、実施例5で所得した2種類のFADGDHをそれぞれ約10U/mlになるように酵素希釈液(50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5))にて溶解したものを20ml用意した。4種類の化合物溶液のそれぞれに、2種類のFADGDHを1:1で混合した8種類の酵素液サンプル(2ml)を用意した。また、化合物溶液を添加しないコントロールとして、50mMリン酸カリウム緩衝液にてpH6.25、6.65付近に調製したコントロール酵素液サンプルも用意した。それぞれの酵素液サンプルの実測pHを測定して程近いpHが維持されていることを確認した。酵素液サンプルを1mlずつ分注したものを2本用意して、1本は4℃で保存し、もう1本は、55℃、30分間熱処理を施した。処理後、各サンプルを酵素希釈液にて10倍希釈した後、FADGDH活性を測定した。各々、4℃で保存したものの酵素活性を100%として、55℃、30分間処理後の活性値を比較してGDH活性残存率(%)を算出した。
これらの検討の結果、GDH含有組成物のpHを酸性側で保持し、なおかつ、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの塩化合物を添加することにより、pHを酸性側に保持したコントロール酵素液サンプル以上の熱安定性が得られることが明らかになった(表9)。
次に、先の2種類のFADGDHをコハク酸バッファーにてpH5.3に調製した酵素液サンプル(5U/ml)に、等量の2M塩化ナトリウム、または、1M硫酸ナトリウム、または、1Mクエン酸三ナトリウム、または、1M硫酸アンモニウムを添加して、8種類の酵素液サンプル(2ml)を用意した。また、化合物溶液を添加しないコントロールとして、50mMコハク酸ナトリウム緩衝液(pH5.3)にて2倍希釈したコントロール酵素液サンプルも用意した。それぞれの酵素液サンプルの実測pHを測定して、コントロールに程近いpHが維持されていることを確認した。酵素液サンプルを1mlずつ分注したものを2本用意して、1本は4℃で保存し、もう1本は、55℃、30分間熱処理を施した。処理後、各サンプルを酵素希釈液にて5倍希釈した後、FADGDH活性を測定した。各々、4℃で保存したものの酵素活性を100%として、55℃、30分間処理後の活性値を比較してGDH活性残存率(%)を算出した。
これらの検討の結果、pH5前後の低いpHにおいても、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの塩化合物を添加することにより熱安定性が向上できることを確認できた。塩化ナトリウムのようなあまり特徴のない化合物においても添加効果が認められたことは、広く塩化合物全般において、それらを共存させることにより、FADGDH組成物の熱安定性を向上させることができるものと推測する(表10)。
また、コハク酸バッファーを使用した時に、リン酸カリウムバッファーをベースとした場合よりも熱安定性が向上する傾向が見られていたことから、コハク酸バッファーが含まれるジカルボン酸化合物が、先の塩化合物と同じく、熱安定性を向上させる効果があるものと推測した。そこで、GDH含有組成物のpHを酸性側で保持し、なおかつ、ジカルボン酸化合物を添加することにより、熱安定性が変動するか検討した。
まず、ベースバッファーとして、100mM酢酸ナトリウム(pH5.0)と100mMリン酸カリウムバッファー(pH5.6)を準備した。また、実施例5で所得した2種類のFADGDHをそれぞれ約10U/mlになるように酵素希釈液(50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5))にて溶解したものを20ml用意した。次に、0.4Mコハク酸(pH7.0にNaOHで調整)、0.4Mマロン酸(pH7.0にNaOHで調整)、0.4Mグルタル酸(pH7.0にNaOHで調整)を調製した。
ベースバッファー0.8mlと酵素液(10U/ml)0.2mlを混合させた後、各種ジカルボン酸化合物1mlを添加して、それぞれのpHを実測した。また、化合物溶液を添加しないコントロールとして、ジカルボン酸化合物の代わりに蒸留水を添加して、各サンプルのpH実測値付近に調整したものを準備した。酵素液サンプルを1mlずつ分注したものを2本用意して、1本は4℃で保存し、もう1本は、55℃にて熱処理を施した。処理後、各サンプルを酵素希釈液にて2倍希釈した後、FADGDH活性を測定した。各々、4℃で保存したものの酵素活性を100%として、55℃、15分間または30分間処理後の活性値を比較してGDH活性残存率(%)を算出した。
これらの検討の結果、pH5.5あるいは6.0前後のpHにおいて、コハク酸、マロン酸、グルタル酸などのジカルボン酸化合物を添加することにより熱安定性が向上できることを確認できた。以上の結果から、広くジカルボン酸化合物全般において、それらを共存させることにより、FADGDH組成物の熱安定性を向上させることができるものと推測する(表11)
Example 10: Examination of the effect of improving the thermal stability of a composition obtained by allowing one or more salt compounds or dicarboxylic acids to coexist in a GDH composition having an acidic pH maintained. This was carried out according to the method for measuring FADGDH activity of No. 3.
First, various compound solutions were prepared by dissolving sodium sulfate, trisodium citrate, and ammonium sulfate in a 50 mM potassium phosphate buffer solution (pH 6.5) so as to be 1 M each. Further, 20 ml of the two types of FADGDH obtained in Example 5 dissolved in an enzyme diluent (50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5)) so as to be about 10 U / ml was prepared. Eight kinds of enzyme solution samples (2 ml) in which two kinds of FADGDH were mixed 1: 1 were prepared for each of the four kinds of compound solutions. In addition, as a control without adding the compound solution, a control enzyme solution sample prepared in the vicinity of pH 6.25 and 6.65 with 50 mM potassium phosphate buffer was also prepared. The measured pH of each enzyme solution sample was measured, and it was confirmed that a close pH was maintained. Two pieces of enzyme solution sample dispensed by 1 ml were prepared, one was stored at 4 ° C., and the other was heat-treated at 55 ° C. for 30 minutes. After the treatment, each sample was diluted 10-fold with an enzyme diluent, and then FADGDH activity was measured. The percentage of remaining GDH activity (%) was calculated by comparing the activity values after treatment at 55 ° C. for 30 minutes, assuming that the enzyme activity of those stored at 4 ° C. was 100%.
As a result of these studies, the pH of the GDH-containing composition is maintained on the acidic side, and the pH is maintained on the acidic side by adding salt compounds such as sodium sulfate, trisodium citrate, and ammonium sulfate. It became clear that thermal stability more than a sample was obtained (Table 9).
Next, an equal amount of 2M sodium chloride, 1M sodium sulfate, or 1M tricitrate is added to an enzyme solution sample (5 U / ml) prepared by adjusting the above two types of FADGDH with succinate buffer to pH 5.3. Sodium or 1M ammonium sulfate was added to prepare 8 types of enzyme solution samples (2 ml). As a control without adding the compound solution, a control enzyme solution sample diluted twice with 50 mM sodium succinate buffer (pH 5.3) was also prepared. The actually measured pH of each enzyme solution sample was measured, and it was confirmed that the pH close to the control was maintained. Two pieces of enzyme solution sample dispensed by 1 ml were prepared, one was stored at 4 ° C., and the other was heat-treated at 55 ° C. for 30 minutes. After the treatment, each sample was diluted 5-fold with an enzyme diluent, and then FADGDH activity was measured. The percentage of remaining GDH activity (%) was calculated by comparing the activity values after treatment at 55 ° C. for 30 minutes, assuming that the enzyme activity of those stored at 4 ° C. was 100%.
As a result of these studies, it was confirmed that the thermal stability can be improved by adding salt compounds such as sodium chloride, sodium sulfate, trisodium citrate, and ammonium sulfate even at a low pH of about 5. It was speculated that the addition effect was recognized even in a compound having less characteristics such as sodium chloride, and that the thermal stability of the FADGDH composition can be improved by coexisting them in general in general salt compounds. (Table 10).
In addition, when a succinic acid buffer was used, there was a tendency for thermal stability to be improved as compared to the case of using a potassium phosphate buffer as a base. Like the compound, it was speculated that there was an effect of improving the thermal stability. Therefore, it was investigated whether the thermal stability fluctuates by maintaining the pH of the GDH-containing composition on the acidic side and adding a dicarboxylic acid compound.
First, 100 mM sodium acetate (pH 5.0) and 100 mM potassium phosphate buffer (pH 5.6) were prepared as base buffers. Further, 20 ml of the two types of FADGDH obtained in Example 5 dissolved in an enzyme diluent (50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5)) so as to be about 10 U / ml was prepared. Next, 0.4M succinic acid (adjusted to pH 7.0 with NaOH), 0.4M malonic acid (adjusted to pH 7.0 with NaOH), and 0.4M glutaric acid (adjusted to pH 7.0 with NaOH) were prepared. .
After mixing 0.8 ml of base buffer and 0.2 ml of enzyme solution (10 U / ml), 1 ml of various dicarboxylic acid compounds were added, and the pH of each was measured. In addition, as a control in which the compound solution was not added, distilled water was added instead of the dicarboxylic acid compound to prepare a sample adjusted to the vicinity of the measured pH value of each sample. Two pieces of the enzyme solution sample dispensed by 1 ml were prepared, one was stored at 4 ° C., and the other was heat-treated at 55 ° C. After the treatment, each sample was diluted 2-fold with an enzyme diluent, and then FADGDH activity was measured. The percentage of remaining GDH activity (%) was calculated by comparing the activity values after treatment at 55 ° C. for 15 minutes or 30 minutes with the enzyme activity of those stored at 4 ° C. as 100%.
As a result of these studies, it was confirmed that the thermal stability can be improved by adding dicarboxylic acid compounds such as succinic acid, malonic acid, and glutaric acid at a pH of about 5.5 or 6.0. From the above results, it is speculated that the thermal stability of the FADGDH composition can be improved by coexisting them widely in all dicarboxylic acid compounds (Table 11).
検討は、先述の試験例1のPQQGDH活性の測定方法に準じて行った。また、アポ型も含めた形でPQQGDHの酵素活性を測定するために、終濃度860nMのPQQを添加した反応混合液でも活性を測定した。
まず、PQQGDHを約10U/mlになるように酵素希釈液(1mM CaCl2、50mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5))にて溶解したものを10ml用意した。この酵素溶液0.54mlに、表12記載の10倍濃度の各種化合物を0.06ml添加して、合計容量を0.6mlとしたものを3本用意した。また、コントロールには、各種化合物の代わりに蒸留水0.06mlを添加したものを3本用意した。用意したバイアルを凍結乾燥(FDR)して、水分を完全に蒸発させた後、コントロールバイアルは、直ちに、活性測定を行った。一方、検体バイアルでは、25℃、湿度70%で6時間処理した後、37℃で保存して、1週間後または2週間後の残存活性を測定した。活性残存率は、FDR直後の活性値を100%として、各検体の活性値から活性残存率(%)を算出した。活性残存率が高くなっているほど、保存安定性が向上していると判断した。
コハク酸,塩化アンモニウム,マロン酸などを添加することにより、ホロ化率低下の抑制効果が見られ、また、粉末安定性の向上も認められた。化合物添加の有無による粉末時の形状のちがいを比較したところ、添加したものは粉末体が引き締まった形状をしており、吸湿耐性が増大していることが容易に予想された。今回の検討では、資材の関係から限られた種類のカルボン酸含有化合物にて検討したが、広くさまざまな化合物で同様の効果を発揮するものと思われる。また、粉末形状の変化が保存安定性の増大に繋がることが推測できることから、NAD−GLD,FAD−GLDでも同様の効果が得られることは、同様に類推できる。
First, 10 ml of PQQGDH dissolved in an enzyme diluent (1
By adding succinic acid, ammonium chloride, malonic acid, etc., the effect of suppressing the decrease in the holoformation rate was observed, and the powder stability was also improved. When the difference in the shape of the powder depending on whether or not a compound was added was compared, it was easily expected that the added powder had a compacted powder body and increased moisture absorption resistance. In this study, we examined a limited number of carboxylic acid-containing compounds due to the relationship of materials, but it seems that a wide variety of compounds will exhibit the same effect. Moreover, since it can be estimated that the change in powder shape leads to an increase in storage stability, it can be similarly analogized that the same effect can be obtained with NAD-GLD and FAD-GLD.
本発明による熱安定性の改良は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサの保存安定性、測定精度を向上することができる。 The improvement in thermal stability according to the present invention can improve the storage stability and measurement accuracy of the glucose measurement reagent, glucose assay kit and glucose sensor.
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