JP2009034046A - Method for producing hydrogen, and hydrogen-producing bacteria utilizing acetic acid - Google Patents

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毅 上村
Hitoshi Konishi
仁 小西
Shoei Kobayashi
梢栄 小林
Miki Kubo
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing hydrogen by using microorganisms equipped with a capacity of producing the hydrogen from acetic acid without using light energy, and the microorganisms equipped with such the capacity. <P>SOLUTION: This method for producing the hydrogen by a fermentation method is provided by using the microorganisms equipped with the capacity of producing the hydrogen from the acetic acid without using the light energy, and the microorganisms equipped with the capacity of producing the hydrogen from the acetic acid without using the light energy is also provided. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物を利用して水素を製造する方法に関する。更に、本発明は、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物に関する。 The present invention relates to a method for producing hydrogen using a microorganism having the ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy. Furthermore, the present invention relates to a microorganism having the ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy.

水素はエネルギー変換効率が高く、燃焼しても二酸化炭素を発生しないことから、化石資源代替エネルギーとして、燃料電池や自動車燃料等への利用及び普及が期待されている。   Since hydrogen has high energy conversion efficiency and does not generate carbon dioxide when burned, it is expected to be used and spread as a fossil resource alternative energy in fuel cells and automobile fuels.

水素の生成方法には、メタンと水蒸気を高温高圧下で反応させて水素を発生する方法や、石炭を高温で燃焼する事により水素を発生する方法、微生物を利用してバイオマスから水素を生成する方法などが知られている。   Hydrogen generation methods include the method of generating hydrogen by reacting methane and water vapor at high temperature and pressure, the method of generating hydrogen by burning coal at high temperature, and the generation of hydrogen from biomass using microorganisms. Methods are known.

これらのうち、前２者の方法は、水素生成の原材料やエネルギー源として化石資源を大量に消費するという問題がある。一方、微生物を利用する方法は必要なエネルギーが比較的少なく、エネルギー収支も比較的良いという利点がある。またバイオマスを原材料として水素を生成することから資源循環の点でも優れている。このため、微生物による水素生成の高効率化が試みられ、様々な水素生成菌の研究がなされている。   Among these, the former two methods have a problem of consuming a large amount of fossil resources as raw materials and energy sources for hydrogen generation. On the other hand, the method using microorganisms has the advantage that it requires relatively little energy and has a relatively good energy balance. In addition, it is excellent in terms of resource recycling because it produces hydrogen from biomass. For this reason, attempts have been made to increase the efficiency of hydrogen production by microorganisms, and various hydrogen-producing bacteria have been studied.

現在、水素生成菌として報告されているものには、グルコース解糖系からNADHとヒドロゲナーゼにより水素を生成するClostridium属の細菌（非特許文献１）、ギ酸からギ酸水素リアーゼにより水素を生成するEnterobacter属の細菌など(非特許文献２）の発酵により水素を生成する微生物が知られている。   Currently reported as hydrogen producing bacteria are bacteria belonging to the genus Clostridium that produce hydrogen from glucose glycolysis by NADH and hydrogenase (Non-patent Document 1), Enterobacter that produces hydrogen from formic acid by hydrogen formate lyase. Microorganisms that produce hydrogen by fermentation of bacterium (Non-patent Document 2) are known.

しかし、グルコース等の発酵により水素を生成する方法では、発酵が進むにつれ、酢酸を主とする有機酸が蓄積するため、pHが低下し、水素生成菌の生育が阻害される。また、原料の一部が酢酸となることにより、原料からの水素収率が低下する。   However, in the method of producing hydrogen by fermentation of glucose or the like, as fermentation proceeds, organic acids mainly containing acetic acid accumulate, so the pH is lowered and the growth of hydrogen producing bacteria is inhibited. Moreover, the hydrogen yield from a raw material falls because a part of raw material turns into acetic acid.

このように水素収率が低下する問題に対し、水素生成菌と光合成細菌を組み合わせ、残存する有機酸を水素に変換する方法（非特許文献３）や、メタン発酵菌と組み合わせ、残存する酢酸をメタンに変換し、得られたメタンを水蒸気改質により水素に変換する方法（非特許文献４）なども知られている。しかしながら、光合成細菌により酢酸を水素に変換するには、光の照射が必要である。また、メタン発酵菌により酢酸をメタンに変換し、得られたメタンを水素に水蒸気改質する手法は、新たに投入エネルギーが必要になるという問題がある。   For the problem that the hydrogen yield is reduced in this way, a combination of hydrogen producing bacteria and photosynthetic bacteria to convert the remaining organic acid into hydrogen (Non-patent Document 3), or a combination with methane fermentation bacteria, A method of converting to methane and converting the obtained methane to hydrogen by steam reforming (Non-Patent Document 4) is also known. However, in order to convert acetic acid into hydrogen by photosynthetic bacteria, light irradiation is necessary. Further, the method of converting acetic acid into methane by methane fermentation bacteria and steam reforming the obtained methane to hydrogen has a problem that new input energy is required.

また、有機酸を基質として微生物により水素を製造する方法も報告されているが、当該方法においては、水素化触媒を必要とし、水素化触媒に水素を付加させ、この水素化触媒から水素を取り出している（特許文献１）。
特開２００７−６８４３８号公報 Kaushik N. and Debabrata D.: Improvement of fermentative hydrogen production: various approaches. Appl. Microbiol. Biotechnol. 65: 520-529（2004） Yoshida A., Nishimura T., Kawaguchi H., Inui M., and Yukawa H.: Enhanced hydrogen production from formic acid by formate hydrogen lyase-overexpressing Escherichia coli strains. Appl. Environ. Microbiol. 71: 6762-6768（2005）. Kim M., Baek J., Yun Y., Jun S., Park S., Kim S.: Hydrogen production from Chlamydomonas reinhardtii biomass using a two-step conversion process: Anaerobic conversion and photosynthetic fermentation. Int. Hydrogen Energy. 31:812-816 (2006) . 最首公司 バイオマスの現状と課題 バイオマスの可能性と限界.: 産業と環境. 35:33-35 (2006). In addition, a method for producing hydrogen by a microorganism using an organic acid as a substrate has been reported. However, in this method, a hydrogenation catalyst is required, hydrogen is added to the hydrogenation catalyst, and hydrogen is taken out from the hydrogenation catalyst. (Patent Document 1).
JP 2007-68438 A Kaushik N. and Debabrata D .: Improvement of fermentative hydrogen production: various approaches. Appl. Microbiol. Biotechnol. 65: 520-529 (2004) Yoshida A., Nishimura T., Kawaguchi H., Inui M., and Yukawa H .: Enhanced hydrogen production from formic acid by formate hydrogen lyase-overexpressing Escherichia coli strains. Appl. Environ. Microbiol. 71: 6762-6768 (2005 ). Kim M., Baek J., Yun Y., Jun S., Park S., Kim S .: Hydrogen production from Chlamydomonas reinhardtii biomass using a two-step conversion process: Anaerobic conversion and photosynthetic fermentation. Int. Hydrogen Energy. 31 : 812-816 (2006). Saigami Ltd. Biomass Current Status and Challenges Biomass Possibilities and Limitations: Industry and Environment. 35: 33-35 (2006).

本発明は、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物を用いて水素を製造する方法を提供すること、及び、当該能力を備えた微生物を提供することを主な目的とする。   The main object of the present invention is to provide a method for producing hydrogen using a microorganism having the ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy, and to provide a microorganism having the ability. To do.

本発明者は、酢酸を微生物単独で水素に変換することができれば、pHの低下を防ぐことができるとともに、酢酸からも水素が得られ、水素の収率が向上し得ると考え、鋭意検討を行った。   The present inventor believes that if acetic acid can be converted to hydrogen by a microorganism alone, the pH can be prevented from decreasing, and hydrogen can also be obtained from acetic acid, and the yield of hydrogen can be improved. went.

その結果、驚くべきことに酢酸から水素を気相に直接生成する能力を有する微生物を見出し、更に検討を重ねて、本発明を完成するに至った。   As a result, surprisingly, a microorganism having an ability to directly generate hydrogen from acetic acid in the gas phase was found, and further investigations were made to complete the present invention.

即ち、本発明は、以下の微生物、及び、当該微生物を利用した水素の製造方法に関する。   That is, the present invention relates to the following microorganisms and a method for producing hydrogen using the microorganisms.

項１：光エネルギーを用いず酢酸から水素を生産する能力を備えた微生物を用いて発酵法により水素を製造する方法。   Item 1: A method for producing hydrogen by fermentation using a microorganism having the ability to produce hydrogen from acetic acid without using light energy.

好ましくは、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生産する能力を備えた微生物を用いて、水素化物質の非存在下、発酵法により水素を製造する方法。   Preferably, a method for producing hydrogen by fermentation using a microorganism having the ability to produce hydrogen from acetic acid without using light energy in the absence of a hydrogenated substance.

好ましくは、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を有する微生物を、有機性基質を含む培地中で培養する工程を備えた水素の製造方法。   Preferably, a method for producing hydrogen comprising a step of culturing a microorganism having an ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy in a medium containing an organic substrate.

項２：光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物に加えて、炭素源から有機酸又は有機酸及び水素を生成する能力を備えた微生物を用いる
項１に記載の水素の製造方法。 Item 2: In addition to a microorganism having the ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy, a microorganism having the ability to generate an organic acid or an organic acid and hydrogen from a carbon source is used. Production method.

好ましくは、炭素源から酢酸又は酢酸及び水素を生成する能力を備えた微生物を、炭素源を含む培地中で培養する工程、及び、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物を、酢酸を含む培地中で培養する工程
を備えた水素の製造方法。 Preferably, a step of culturing a microorganism having an ability to produce acetic acid or acetic acid and hydrogen from a carbon source in a medium containing the carbon source, and a microorganism having an ability to produce hydrogen from acetic acid without using light energy Is produced in a medium containing acetic acid.

尚、この場合、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物を培養する工程と、炭素源から酢酸又は酢酸と水素を生成する微生物を培養する工程を同時に行う場合が含まれる。換言すると、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を有する微生物、及び炭素源から酢酸又は酢酸及び水素を生成する能力を有する炭素源利用微生物を、炭素源を含む培地中で混合培養する工程を備えた水素の製造方法が含まれる。   In this case, the step of culturing a microorganism having the ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy and the step of culturing a microorganism that generates acetic acid or acetic acid and hydrogen from a carbon source are included. . In other words, a microorganism having the ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy, and a carbon source-utilizing microorganism having the ability to generate acetic acid or acetic acid and hydrogen from a carbon source are mixed and cultured in a medium containing the carbon source. A method for producing hydrogen comprising the steps is included.

好ましくは、前記光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物が、バチルス属に属する微生物である項１又は2に記載の製造方法。   The production method according to Item 1 or 2, wherein the microorganism having the ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy is a microorganism belonging to the genus Bacillus.

好ましくは、前記光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物が、バチルス・スピーシーズ（Bacillus sp.）HPA1株（受領番号 FERM AP−21330 ）である項１又は２に記載の製造方法。   Preferably, the microorganism according to item 1 or 2, wherein the microorganism capable of generating hydrogen from acetic acid without using light energy is Bacillus sp. HPA1 strain (reception number FERM AP-21330). Method.

項3：光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物。   Item 3: Microorganisms capable of producing hydrogen from acetic acid without using light energy.

好ましくは、バチルス属に属する項3に記載の微生物。   The microorganism according to Item 3, preferably belonging to the genus Bacillus.

好ましくは、酢酸から水素を生成する能力を備えた新規微生物バチルス・スピーシーズ（Bacillus sp.）HPA1株（受領番号 FERM AP−21330）。   Preferably, the novel microorganism Bacillus sp. HPA1 strain (reception number FERM AP-21330) having the ability to generate hydrogen from acetic acid.

以下、本発明について、更に詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

1．水素製造方法
本発明は、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を有する微生物を利用して、発酵法により水素を製造することのできる方法を提供する。 1． Hydrogen production method The present invention provides a method capable of producing hydrogen by fermentation using a microorganism having the ability to produce hydrogen from acetic acid without using light energy.

即ち、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を有する微生物により、有機性基質を含む培地で培養することにより、光エネルギー、更には水素化触媒等も要せずに、直接水素を生成することが可能な方法を提供する。   In other words, microorganisms that have the ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy can produce hydrogen directly without the need for light energy or a hydrogenation catalyst by culturing in a medium containing an organic substrate. Provide a possible way.

培地は、本発明の微生物が生育可能な成分を備えたものであれば、特に限定されない。例えば、酢酸を基質の一つとして含む培地や、グルコース等の炭素源を含む培地中で炭素源から酢酸又は酢酸及び水素を生成する微生物を培養することによって、酢酸が生成された培地を使用することができる。   The medium is not particularly limited as long as it includes a component capable of growing the microorganism of the present invention. For example, a medium in which acetic acid is produced by culturing a microorganism that produces acetic acid or acetic acid and hydrogen from a carbon source in a medium containing acetic acid as one of the substrates or a carbon source such as glucose is used. be able to.

また、本発明の製造方法には、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を有する微生物を単独で用いる場合に加えて、他の微生物を更に用いる場合も含まれる。   Further, the production method of the present invention includes a case where another microorganism is further used in addition to a case where a microorganism capable of generating hydrogen from acetic acid without using light energy is used alone.

他の微生物の種類は特に限定されないが、例えば、炭素源から有機酸や水素を生成する能力を有する微生物が挙げられる。   Although the kind of other microorganisms is not specifically limited, For example, the microorganisms which have the capability to produce | generate an organic acid and hydrogen from a carbon source are mentioned.

例えば、本発明の製造方法は、炭素源から酢酸又は酢酸及び水素を生成する能力を備えた微生物を、炭素源を含む培地中で培養する工程、及び、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物を、酢酸を含む培地中で培養する工程を備えた方法とすることができる。   For example, the production method of the present invention includes a step of culturing a microorganism having an ability to produce acetic acid or acetic acid and hydrogen from a carbon source in a medium containing the carbon source, and produces hydrogen from acetic acid without using light energy. It is possible to provide a method comprising a step of culturing a microorganism having the ability to perform in a medium containing acetic acid.

この場合、炭素源から酢酸又は酢酸及び水素を生成する工程は、酢酸から水素を生成する工程に先立って行ってもよく、同時に行うものであってもよい。   In this case, the step of generating acetic acid or acetic acid and hydrogen from the carbon source may be performed prior to the step of generating hydrogen from acetic acid, or may be performed simultaneously.

例えば、前者の場合は、炭素源から酢酸又は酢酸及び水素を生成する能力を備えた微生物を、炭素源を含む培地中で培養する工程と、上記工程後、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を有する微生物を、得られた酢酸を含む培地中で培養する工程を備えた方法とすることができる。   For example, in the former case, a step of culturing a microorganism having an ability to produce acetic acid or acetic acid and hydrogen from a carbon source in a medium containing the carbon source, and after the above step, hydrogen from acetic acid is used without using light energy. A method comprising a step of culturing a microorganism having the ability to be produced in a medium containing the obtained acetic acid can be provided.

また、後者の場合は、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を有する微生物、及び炭素源から酢酸又は酢酸及び水素を生成する能力を有する炭素源利用微生物を、炭素源を含む培地中で混合培養する工程を備えた方法とすることができる。この場合、酢酸から水素を生成する能力を有する微生物は、炭素源から酢酸又は酢酸及び水素を生成する能力を有する微生物により炭素源から生成された酢酸を含む培地中で培養されることとなる。   In the latter case, a microorganism that has the ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy, and a carbon source-utilizing microorganism that has the ability to generate acetic acid or acetic acid and hydrogen from a carbon source in a medium containing the carbon source. The method can include a step of mixed culture. In this case, the microorganism having the ability to produce hydrogen from acetic acid is cultured in a medium containing acetic acid produced from the carbon source by the microorganism having the ability to produce acetic acid or acetic acid and hydrogen from the carbon source.

炭素源から酢酸又は酢酸及び水素を生成する能力を有する微生物は、特定の属或いは特定の種に限定されず、そのような性質を有することが知られた公知の微生物を用いることができる。また、微生物は１種でなく、２種以上組み合わせて用いることもできる。例えば、炭素源から酢酸以外の有機酸を生成する微生物と、前記有機酸から酢酸を生成する能力を有する微生物を組み合わせて用いることができる。   The microorganism having the ability to generate acetic acid or acetic acid and hydrogen from a carbon source is not limited to a specific genus or a specific species, and a known microorganism known to have such properties can be used. Moreover, microorganisms can be used in combination of two or more instead of one. For example, a microorganism that produces an organic acid other than acetic acid from a carbon source and a microorganism that has the ability to produce acetic acid from the organic acid can be used in combination.

例えば、炭素源を基質として有機酸又は有機酸及び水素を生成する能力を有する微生物を利用する工程としては、Clostridium属の細菌をグルコース又は糖質バイオマスを含む培地に培養する工程や、Clostridium属の細菌をピルビン酸を含む培地に培養する工程などを挙げることができる。   For example, as a process using a microorganism having an ability to generate an organic acid or an organic acid and hydrogen using a carbon source as a substrate, a process of culturing a bacterium of the genus Clostridium in a medium containing glucose or carbohydrate biomass, Examples thereof include a step of culturing bacteria in a medium containing pyruvic acid.

また、本発明には、本発明の効果を阻害しない範囲であれば、炭素源から他の経路により水素を生成する工程を更に設けることもできる。例えば、Enterobacter属及び／又はEscherichia属の細菌を、ギ酸を含む培地に培養して、水素を生成する工程等を更に設けることもできる。   In addition, the present invention may further include a step of generating hydrogen from the carbon source by another route as long as the effects of the present invention are not impaired. For example, a step of culturing bacteria of the genus Enterobacter and / or Escherichia in a medium containing formic acid to generate hydrogen can be further provided.

微生物の培養方法及び培養条件は、水素の生成が可能な範囲で適宜設定することができるが、好ましくは、嫌気条件下で行う。   The culture method and culture conditions of the microorganism can be set as appropriate as long as hydrogen can be generated, but are preferably anaerobic.

また生成された水素は気相から直接利用することもでき、また公知の方法に従って分離又は回収して利用することもできる。   The produced hydrogen can be used directly from the gas phase, or can be separated or recovered according to a known method.

光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を有する微生物は、酢酸を基質として、微生物単独で酢酸から水素を生成し得る微生物であれば、特に限定されないが、下記に記載された本発明の酢酸利用水素生産菌が好ましく用いられる。なお、微生物単独で酢酸から水素を生成可能とは、光や水素化物質等の非存在下に、基質から水素を直接気相に生成可能であることを意味する。従って、水素の生成工程において他の微生物が共存することを妨げる趣旨ではない。   The microorganism having the ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of generating hydrogen from acetic acid alone using acetic acid as a substrate, but the microorganism of the present invention described below is used. An acetic acid utilizing hydrogen producing bacterium is preferably used. In addition, that microorganisms can produce hydrogen from acetic acid alone means that hydrogen can be produced directly from the substrate in the gas phase in the absence of light or a hydrogenated substance. Therefore, it is not intended to prevent other microorganisms from coexisting in the hydrogen production process.

また、酢酸から水素を生成する能力を有する微生物とは、酢酸だけでなく、酢酸以外の有機物から水素を生成する能力を備えたものであってもよい。   The microorganism having the ability to generate hydrogen from acetic acid may be one having the ability to generate hydrogen from organic substances other than acetic acid as well as acetic acid.

2．酢酸利用水素生成菌
本発明は、上記製造方法において用いることのできる、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物、換言すると、光エネルギーを用いず酢酸を水素に変換する能力を備えた微生物を提供する。以下、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物を、「酢酸利用水素生成菌」とも称する。 2． Acetic acid-utilizing hydrogen-producing bacterium The present invention can be used in the above production method, a microorganism having the ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy, in other words, the ability to convert acetic acid into hydrogen without using light energy. Provided with a microorganism. Hereinafter, a microorganism having an ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy is also referred to as an “acetic acid utilizing hydrogen-producing bacterium”.

本発明の酢酸利用水素生成菌は、酢酸から水素を生成する工程において光を要せず、光合成反応を利用せずに水素生成が可能である。また、水素生成のために他の菌株との共生を要さず、分離した単一菌株として、水素生成が可能である。また、培地中で酢酸から水素を生成する際に、水素化物質や他のエネルギーを必要とせず、微生物単独で水素を気相に直接生成することが可能である。尚、水素生成において、他の菌株等との共生乃至共存を妨げる趣旨ではない。   The acetic acid-utilizing hydrogen-producing bacterium of the present invention does not require light in the process of generating hydrogen from acetic acid, and can generate hydrogen without using a photosynthesis reaction. Further, hydrogen generation is possible as a single isolated strain without requiring symbiosis with other strains for hydrogen generation. In addition, when hydrogen is generated from acetic acid in the culture medium, hydrogen can be directly generated in the gas phase by a microorganism alone without requiring a hydrogenated substance or other energy. In addition, in the hydrogen production, it is not intended to prevent the symbiosis or coexistence with other strains.

2-1）水素生成能力
本発明の微生物における酢酸から水素を生成する能力は、例えば、以下のように確認することができる。 2-1) Hydrogen production ability The ability to produce hydrogen from acetic acid in the microorganism of the present invention can be confirmed, for example, as follows.

a）水素生成の確認
酢酸又は酢酸イオンを主な基質として含む培地に、色素及び水素化触媒と、対象となる微生物を加えて培養する。培養後、色素の脱色により水素の発生の有無を確認する。 a) Confirmation of hydrogen generation A medium containing acetic acid or acetate ions as a main substrate is added with a dye, a hydrogenation catalyst, and a target microorganism and cultured. After incubation, the presence or absence of hydrogen generation is confirmed by decolorization of the pigment.

色素としては、例えば、エバンスブルーなどのアゾ化合物及び水素化触媒としては、例えばウィルキンソン触媒や金属ナノコロイドが挙げられる。当該色素は水素が存在しない条件下で青色を呈するが、微生物により水素が生成されると水素化触媒により水素が付加され脱色する。   Examples of the dye include an azo compound such as Evans Blue, and examples of the hydrogenation catalyst include a Wilkinson catalyst and a metal nanocolloid. The dye exhibits a blue color in the absence of hydrogen, but when hydrogen is generated by microorganisms, hydrogen is added by the hydrogenation catalyst and decolorized.

b）酢酸減少量と水素生成量の解析
酢酸又は酢酸イオンを主な基質として含む培地に、対象となる微生物を加えて培養し、酢酸イオン濃度の経時的変化を測定すると共に、同じ系内のガス濃度の変化を測定する。酢酸又は酢酸イオン濃度の減少と共に、水素の発生又は増加が見られるかを確認する。 b) Analysis of acetic acid reduction and hydrogen production amount Incubate the target microorganisms in a medium containing acetic acid or acetate ions as the main substrate, measure the change over time in the concentration of acetate ions, Measure changes in gas concentration. Confirm whether hydrogen generation or increase is observed with decreasing acetic acid or acetate ion concentration.

酢酸又は酢酸イオン濃度は、例えば、HPLC分析により測定することができる。   The acetic acid or acetate ion concentration can be measured by, for example, HPLC analysis.

またガス濃度の変化、及びガス中の水素の発生及び増加は、例えば、ガスクロマトグラフィー（GC）分析によって測定することができる。   The change in gas concentration and the generation and increase of hydrogen in the gas can be measured by, for example, gas chromatography (GC) analysis.

2-2）酢酸利用水素生成菌の取得
上記能力を有する微生物は、例えば、以下のような探索を行って、得ることができる。 2-2) Acquisition of acetic acid-utilizing hydrogen-producing bacterium A microorganism having the above-mentioned ability can be obtained, for example, by conducting the following search.

環境中から取得した土壌サンプルを滅菌水に懸濁した土壌懸濁液として調製した試料に、色素及び水素化触媒を酢酸ナトリウムを含む培地に加えて、嫌気条件下で培養する。培養後、色素の脱色が確認されたサンプルを、培地上でシングルコロニーアイソレーションし、1次スクリーニング取得菌株とする。   A sample prepared as a soil suspension obtained by suspending a soil sample obtained from the environment in sterile water is added to a medium containing sodium acetate and cultured under anaerobic conditions. After culturing, the sample confirmed to be decolorized is subjected to single colony isolation on the medium to obtain a primary screening strain.

1次スクリーニングで取得した単離菌株を、色素及び水素化触媒を加えた酢酸ナトリウムを含む培地に一白金耳植菌して、嫌気条件下で培養する。培養後、色素の脱色が確認されたサンプルを2次スクリーニング取得菌株とする。   The isolated strain obtained in the primary screening is inoculated with one platinum ear in a medium containing sodium acetate to which a pigment and a hydrogenation catalyst are added, and cultured under anaerobic conditions. After culturing, a sample in which decolorization of the pigment is confirmed is used as a strain obtained for secondary screening.

2次スクリーニングで取得した菌株を、酢酸ナトリウムを含む培地にて培養する。生育が十分確認できたプレートを用いて、菌懸濁液を作製する。嫌気ボックス内で、適当な容器を用いて、基質として酢酸ナトリウムを含む培地に、色素及び水素化触媒を加え、更に作製した菌懸濁液を添加して、培養し、色素の色変化を確認する。色素が脱色したサンプルについて、ヘッドスペース中のガス組成をガスクロマトグラフィー（GC）分析し、水素の生成が確認された菌株を取得する。   The strain obtained by the secondary screening is cultured in a medium containing sodium acetate. Using a plate whose growth has been sufficiently confirmed, prepare a bacterial suspension. In an anaerobic box, using a suitable container, add dye and hydrogenation catalyst to a medium containing sodium acetate as a substrate, add the prepared bacterial suspension, culture, and check the color change of the dye To do. A gas chromatographic (GC) analysis of the gas composition in the head space is performed on the sample from which the dye has been decolored to obtain a strain in which hydrogen production has been confirmed.

このように取得された菌株の一つとして、バチルス・スピーシーズ（Bacillus sp.）HPA1株を挙げることができる。   As one of the strains thus obtained, Bacillus sp. HPA1 strain can be mentioned.

2-3）Bacillus sp.HPA1株
Bacillus sp.HPA1株は、下記のような菌学的性質を有する。 2-3) Bacillus sp.HPA1 strain
Bacillus sp. HPA1 strain has the following mycological properties.

（形態学的性質）
通性嫌気性のグラム染色陽性の桿菌。培養温度37℃の好気条件下で生育性を示し、LB Agar培地上でのコロニー色はクリーム色を呈する。 (Morphological properties)
Facultative anaerobic gram-positive bacilli. It exhibits viability under aerobic conditions at a culture temperature of 37 ° C., and the colony color on the LB Agar medium is creamy.

また、後述の実施例に示される簡易形態観察結果を有する。   Moreover, it has the simple form observation result shown by the below-mentioned Example.

（分類学的性質）
HPA1株の16S rDNA部分配列は、BLASTを用いたアポロンDB-BA3.0に対する相同性検索の結果、Bacillus由来の16S rDNAに対し高い相同性を示し、B. licheniformisDSM13株およびB. aeriusK24株の16S rDNAに対し、相同率99.4 %の高い相同性を示す。 (Taxonomic properties)
The 16S rDNA partial sequence of HPA1 strain showed high homology to 16S rDNA derived from Bacillus as a result of homology search with APOLON DB-BA3.0 using BLAST, B. licheniformis DSM13 strain and 16S r of B. aeriusK24 strain It shows a high homology with rDNA of 99.4%.

またBLASTを用いた国際塩基配列データベースGenBank/DDBJ/EMBLに対する相同性検索の結果においても、B. licheniformisおよびB. aerius由来の16S rDNAに対し、高い相同性を示す。   Moreover, also in the result of the homology search with respect to the international nucleotide sequence database GenBank / DDBJ / EMBL using BLAST, it shows high homology to 16S rDNA derived from B. licheniformis and B. aerius.

当該相同性検索結果に基づき、16SrDNAを用いて行った簡易分子系統解析の結果、HPA1株はB. licheniformis、B. aeriusおよびB. stratosphericusの16S rDNAと系統枝を形成し、枝の長さからB. licheniformisおよびB. aeriusに最も近縁であることが示された。しかし、HPA1株とB. licheniformisおよびB. aeriusの16S rDNAは完全には一致しない。   As a result of simple molecular phylogenetic analysis using 16S rDNA based on the homology search results, HPA1 strain formed a phylogenetic branch with B. licheniformis, B. aerius and B. stratosphericus 16S rDNA. It was shown to be closest to B. licheniformis and B. aerius. However, HPA1 strain and B. licheniformis and B. aerius 16S rDNA do not completely match.

また、簡易形態観察の結果は、Bacillusの一般性状を示していると考えられるが、今回の観察では芽胞形成は確認できなかった。   Moreover, although it is thought that the result of simple form observation has shown the general property of Bacillus, spore formation was not able to be confirmed by this observation.

以上の諸性質から本菌株はBacillus属に属すると考えられるが、該当種が判明しないことから、バチルス・スピーシーズ（Bacillus sp.）に属せしめるのが適当であると認められた。そのため、本菌を新菌株と認定し、バチルス・スピーシーズ（Bacillus sp.）HPA１株と命名した。尚、本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に、受領番号 FERM AP−21330として、平成19年7月30日に寄託された。以下、本菌株を「HPA1株」とも称する。   From the above properties, this strain is considered to belong to the genus Bacillus, but since the corresponding species is not known, it was recognized that it is appropriate to belong to Bacillus sp. Therefore, this bacterium was recognized as a new strain and named Bacillus sp. HPA1 strain. In addition, this strain was registered with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (Higashi 1-1-1 Higashi 1-1-1 Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 305-8566) as a receipt number FERM AP-21330 in July 2007. Deposited on Monday 30th. Hereinafter, this strain is also referred to as “HPA1 strain”.

HPA１株は、例えば、LB培地（ペプトン10 g/L、乾燥酵母エキス5 g/L、塩化ナトリウム5 g/L）で培養可能である。但し、当該培地に限定されることはなく、通常の微生物の生育に必要であって、菌株が資化可能な栄養源を備えた培地であれば、培養可能である。   The HPA1 strain can be cultured in, for example, LB medium (peptone 10 g / L, dry yeast extract 5 g / L, sodium chloride 5 g / L). However, it is not limited to the said culture medium, It can culture | cultivate if it is a culture medium provided with the nutrient source which is required for growth of a normal microorganism, and a strain can assimilate.

また、HPA１株の培養方法及び条件は、菌株が生育する範囲で適宜設定することができ、好気条件下、静置培養により行うことができる。また嫌気条件下で培養可能である。   Moreover, the culture method and conditions of HPA1 strain | stump | stock can be suitably set in the range in which a strain grows, and can be performed by stationary culture under aerobic conditions. It can be cultured under anaerobic conditions.

培養温度は、菌株が良好に生育出来る温度範囲で適宜設定できるが、通常２０〜４０℃、好ましくは、３０〜３７℃程度である。   Although culture | cultivation temperature can be suitably set in the temperature range in which a strain can grow favorably, it is 20-40 degreeC normally, Preferably, it is about 30-37 degreeC.

また、培養において、光は、要しない。   Moreover, light is not required in culture.

HPA１株は、凍結乾燥法及び凍結法により保管可能である。例えば、室温で、保護剤として10％スキムミルクを用いて、凍結乾燥法により保管できる。また、-80℃で、保護剤として20% グリセロールを用いて、凍結法により保管できる。但し、当該条件に限定されることはない。   The HPA1 strain can be stored by freeze drying and freezing. For example, it can be stored at room temperature by freeze-drying using 10% skim milk as a protective agent. Moreover, it can be stored by freezing method at -80 ° C. using 20% glycerol as a protective agent. However, it is not limited to the said conditions.

HPA1株は、後述する実施例にも示されるように、酢酸から水素を生成する能力に特に優れている。   The HPA1 strain is particularly excellent in the ability to generate hydrogen from acetic acid, as shown in the examples described later.

尚、本発明の水素製造方法及び酢酸利用水素生成菌の利用においては、微生物を用いた水素製造における公知の技術を、必要に応じて付加し得るものである。   In the hydrogen production method of the present invention and the utilization of acetic acid-utilizing hydrogen-producing bacteria, known techniques in hydrogen production using microorganisms can be added as necessary.

本発明は、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を有する微生物を利用した水素の製造方法を提供する。本発明の方法によれば、発酵法において副生成物として蓄積していた酢酸等の有機酸からも水素を得ることが可能になる。また、発酵法において菌体の生育や酵素の活性阻害の要因となっていたpH低下を抑制することができる。これにより、微生物を用いた水素生成の収率を一層向上させることが可能となる。   The present invention provides a method for producing hydrogen using a microorganism having the ability to produce hydrogen from acetic acid without using light energy. According to the method of the present invention, hydrogen can be obtained from an organic acid such as acetic acid accumulated as a by-product in the fermentation method. In addition, it is possible to suppress a decrease in pH that has been a factor in the growth of bacterial cells and the inhibition of enzyme activity in the fermentation method. This makes it possible to further improve the yield of hydrogen production using microorganisms.

また本発明は、光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物を提供する。当該微生物によれば、これまで発酵法による直接の変換が不可能と考えられていた酢酸から水素を得ることが可能になる。   The present invention also provides a microorganism having the ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy. According to the microorganism, hydrogen can be obtained from acetic acid, which has been considered impossible to be directly converted by fermentation.

以下、本発明をより詳細に説明するために、実施例や試験例を用いて説明するが、本発明はこれらの例に制限されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and test examples, but the present invention is not limited to these examples.

酢酸利用水素生成菌のスクリーニング
1．スクリーニング手順
酢酸利用水素生成菌を以下のようにスクリーニングした。 Screening for hydrogen-producing bacteria using acetic acid
1． Screening procedure Acetic acid utilizing hydrogen producing bacteria were screened as follows.

i）１次スクリーニング
滅菌済み96穴マイクロプレートに36.5 mM 酢酸ナトリウムを含む改変Wolfe培地140μl、水素検出薬(色素：エバンスブルー、水素化触媒：ウィルキンソン触媒)を各20μl、及び土壌サンプルを滅菌水に懸濁した土壌懸濁液20μlを加えて嫌気条件下（窒素100 ％）で37℃、3日間静置培養した。培養後、色素の脱色が確認されたサンプルを改変Wolfe寒天培地上でシングルコロニーアイソレーションし、1次スクリーニング取得菌株とした。 i) Primary screening Sterilized 96-well microplate 140μl modified Wolfe medium containing 36.5 mM sodium acetate, hydrogen detection agent (dye: Evans blue, hydrogenation catalyst: Wilkinson catalyst) 20μl each, and soil sample in sterile water 20 μl of the suspended soil suspension was added and static culture was carried out at 37 ° C. for 3 days under anaerobic conditions (100% nitrogen). After culturing, the sample confirmed to be decolorized was subjected to single colony isolation on a modified Wolfe agar medium to obtain a primary screening strain.

ii）2次スクリーニング
滅菌済み96穴マイクロプレートに基質として36.5 mM酢酸ナトリウムを含む改変Wolfe培地140μl、水素検出薬(色素：エバンスブルー、水素化触媒：ウィルキンソン触媒)を各20μl入れ、1次スクリーニングで単離した取得菌株を一白金耳植菌して37℃、3日間嫌気条件下（窒素100 ％）で静置培養した。培養後、色素の脱色が確認されたサンプルを2次スクリーニング取得菌株とした。 ii) Secondary screening 140 μl of modified Wolfe medium containing 36.5 mM sodium acetate as a substrate and 20 μl each of hydrogen detection agent (dye: Evans blue, hydrogenation catalyst: Wilkinson catalyst) in a sterile 96-well microplate as substrate The isolated acquired strain was inoculated with one platinum ear and statically cultured at 37 ° C. for 3 days under anaerobic conditions (nitrogen 100%). After culturing, the sample in which decolorization of the pigment was confirmed was used as the secondary screening-acquired strain.

iii）3次スクリーニング
2次スクリーニング取得菌株を、基質として36.5 mM酢酸ナトリウムを含む改変Wolfe寒天培地にて培養した。生育が十分確認できたプレートに滅菌済み嫌気水1.5 mlを加えて懸濁し、菌懸濁液を作製した。嫌気ボックス内で、10 ml容バイアル瓶にYeast Extractを含まない改変Wolfe培地7 ml、水素検出薬(色素：エバンスブルー、水素化触媒：ウィルキンソン触媒)を各1 ml、菌懸濁液1 mlをそれぞれ添加して、ブチルゴム栓で密栓した。基質には12.2 mM酢酸ナトリウムを用いた。これを37℃で静置培養し、水素指示薬の色変化を確認した。指示薬が脱色したサンプルは、色素が脱色してから2日後にヘッドスペース中のガス組成をガスクロマトグラフィー（GC）分析した。 iii) Third screening
The strain obtained by the secondary screening was cultured on a modified Wolfe agar medium containing 36.5 mM sodium acetate as a substrate. 1.5 ml of sterilized anaerobic water was added to and suspended in a plate whose growth was sufficiently confirmed to prepare a bacterial suspension. Inside the anaerobic box, 7 ml of modified Wolfe medium without Yeast Extract in a 10 ml vial, 1 ml each of hydrogen detection agent (dye: Evans blue, hydrogenation catalyst: Wilkinson catalyst), 1 ml of bacterial suspension Each was added and sealed with a butyl rubber stopper. The substrate used was 12.2 mM sodium acetate. This was incubated at 37 ° C. to confirm the color change of the hydrogen indicator. The sample in which the indicator was decolored was subjected to gas chromatography (GC) analysis of the gas composition in the headspace two days after the dye was decolorized.

1-2）材料
Wolfe培地（/L）の組成を表１に示す。またWolfe培地に用いたSolution B（g/L）の組成を表２に、Solution C（mg/L）の組成を表３に示す。 1-2) Material
The composition of the Wolfe medium (/ L) is shown in Table 1. Table 2 shows the composition of Solution B (g / L) used in the Wolfe medium, and Table 3 shows the composition of Solution C (mg / L).

尚、改変Wolfe培地は、Wolfe培地（/L）の組成において、Yeast extractを0.2 g/Lとし、酢酸を用いてpHを7.0に調整して作製した。また、寒天プレート作製時には寒天末を20 g/ L添加して調製した。また、Wolfe＋LB培地を作製する際はYeast extract 4.8 g/L（最終濃度 5.0 g/L）、Polypeptone 10.0 g/Lを追加した。   The modified Wolfe medium was prepared by adjusting the pH to 7.0 using acetic acid in the composition of the Wolfe medium (/ L) with a yeast extract of 0.2 g / L. Moreover, 20 g / L of agar powder was added when preparing the agar plate. When preparing Wolfe + LB medium, Yeast extract 4.8 g / L (final concentration 5.0 g / L) and Polypeptone 10.0 g / L were added.

1-3）スクリーニング結果
環境中から土壌200サンプルを採取して1次スクリーニングに供した結果、154サンプルで色素の脱色が確認された。 1-3) Screening results 200 samples of soil were collected from the environment and subjected to primary screening. As a result, 154 samples were confirmed to be decolorized.

1次スクリーニングを通過した各サンプル培養液をシングルコロニーアイソレーションし、2次スクリーニングを行った結果、65菌株で色素の脱色が確認された。   Each sample culture solution that passed the primary screening was subjected to single colony isolation and subjected to secondary screening. As a result, decolorization of the pigment was confirmed in 65 strains.

これらの2次スクリーニング取得菌株に関して、3次スクリーニングを行い、色素の脱色が確認され、GC分析で水素が確認された菌株を取得した。   With regard to these secondary screening-acquired strains, tertiary screening was performed to obtain strains in which pigment decolorization was confirmed and hydrogen was confirmed by GC analysis.

3次スクリーニングの取得菌株のうち、HPA1株の培養1週間後の色素の色変化の結果を図１に示す。図１中、Aは植菌なしの系、BはHPA1株植菌、酢酸ナトリウム未添加の系、CはHPA1株植菌、酢酸ナトリウム添加の系における結果を示す。   Among the acquired strains of the third screening, the result of color change of the pigment after 1 week of culture of HPA1 strain is shown in FIG. In FIG. 1, A shows the results in the system without inoculation, B in the HPA1 strain inoculation and the system without sodium acetate, and C in the HPA1 strain inoculation and sodium acetate addition.

またHPA1株の培養1週間後のヘッドスペースをGCで分析した結果を図2に示す。   Fig. 2 shows the results of GC analysis of the headspace after 1 week of culture of HPA1 strain.

この結果、図1に示されるように、HPA1株を植菌し、酢酸ナトリウムを添加した系（C）では指示薬の脱色が確認されたが、植菌していない系（A)、および植菌したが酢酸ナトリウムを含まない系（B）では色素の脱色は確認されなかった。   As a result, as shown in Fig. 1, HPA1 strain was inoculated, and in the system to which sodium acetate was added (C), decolorization of the indicator was confirmed, but the inoculated system (A) and inoculated However, in the system (B) containing no sodium acetate, no decolorization of the dye was confirmed.

また、図2に示されるように、GC分析の結果、水素のピークが確認された。   Further, as shown in FIG. 2, as a result of GC analysis, a hydrogen peak was confirmed.

このことから、HPA1株が培地中の酢酸イオンを利用して水素を生成した可能性が示唆された。   This suggested that the HPA1 strain may have generated hydrogen using acetate ions in the medium.

水素生成量の評価
3次スクリーニングにおけるGC分析の結果、水素濃度が高かった上位10菌株についてより正確な水素生成量を評価するため、水素定量装置を用いて水素生成を行った。装置の概略を図3に示す。 Evaluation of hydrogen production
As a result of GC analysis in the third screening, hydrogen generation was performed using a hydrogen quantification device in order to evaluate more accurate hydrogen production for the top 10 strains with high hydrogen concentration. An outline of the apparatus is shown in FIG.

菌株を121℃、15分間オートクレーブ滅菌したWolfe+LB培地100 mlに植菌し、37℃、24時間前培養した。この前培養液を遠心集菌し、O.D.660＝1.0になるように0.9 %生理食塩水で調整後、Wolfe培地 200 mlに20 ml添加した。これを37℃、3日間培養した。培養は穏やかに撹拌しながら行った（スターラー回転数：200 rpm）。基質には酢酸ナトリウム（60.9 mM）を用いた。培養3日後に系内のヘッドスペースのガス濃度をGC分析した。当該GC分析条件を分析条件１として以下に示す。 The strain was inoculated into 100 ml of Wolfe + LB medium autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes and pre-cultured at 37 ° C. for 24 hours. This preculture was collected by centrifugation, adjusted with 0.9% physiological saline so that OD 660 = 1.0, and then added to 20 ml of Wolfe medium. This was cultured at 37 ° C. for 3 days. The culture was performed with gentle agitation (stirrer rotation speed: 200 rpm). Sodium acetate (60.9 mM) was used as a substrate. After 3 days of culture, the gas concentration in the headspace in the system was analyzed by GC. The GC analysis conditions are shown as analysis conditions 1 below.

＜分析条件１＞
GC ：HITACHI G-3900（日立ハイテクノロジーズ、東京）
Injector temp ：50℃
Detector ：TCD
Detector temp ：50℃
Column ：Molecular Sieve 5A（80/100 mesh）、Stainless column（2 m）
Oven temp ：50℃
Carrier gas ：N2
流量 ：20 ml/min
アプライ量 ：50μl <Analysis condition 1>
GC: HITACHI G-3900 (Hitachi High Technologies, Tokyo)
Injector temp: 50 ℃
Detector: TCD
Detector temp: 50 ℃
Column: Molecular Sieve 5A (80/100 mesh), Stainless column (2 m)
Oven temp: 50 ℃
Carrier gas: N 2
Flow rate: 20 ml / min
Apply amount: 50μl

菌株ごとの水素生成量の結果を図4に示す。その結果、図4に示されるように、HPA1株が最も高い水素生成量を示した。   The results of hydrogen production for each strain are shown in FIG. As a result, as shown in FIG. 4, the HPA1 strain showed the highest hydrogen production.

水素定量装置を用いた水素生成量と酢酸減少量の解析
3-1）解析手順
実施例2において最も高い値を示したHPA1株に関して、酢酸消費量と水素生成の関係を解析するために、酢酸イオン減少量の経時的な解析を行った。
酢酸利用水素生成菌を121℃、15分間オートクレーブ滅菌したLB培地に植菌し、37℃、24時間前培養した。この前培養液2 mlをA培地 200 mlに添加して37℃、3日間培養した。培養は穏やかに撹拌しながら行った（スターラー回転数：200 rpm）。基質には酢酸ナトリウム（1 mM）を用いた。LB培地の組成を表４に示す。また、A培地の組成を表５に、A培地に用いた微量要素の組成を表６に示す。 Analysis of hydrogen production and acetic acid reduction using a hydrogen determination device
3-1) Analysis procedure For the HPA1 strain showing the highest value in Example 2, in order to analyze the relationship between the amount of acetic acid consumed and hydrogen production, the amount of acetate ion decrease over time was analyzed.
The acetic acid-utilizing hydrogen-producing bacterium was inoculated into an LB medium autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes and pre-cultured at 37 ° C. for 24 hours. 2 ml of this preculture was added to 200 ml of medium A and cultured at 37 ° C. for 3 days. The culture was performed with gentle agitation (stirrer rotation speed: 200 rpm). Sodium acetate (1 mM) was used as the substrate. Table 4 shows the composition of the LB medium. Table 5 shows the composition of medium A, and Table 6 shows the composition of trace elements used in medium A.

また、培養24時間ごとに培養液を採取して系内の酢酸イオン濃度をHPLC分析し、培養3日後に系内のヘッドスペースのガス濃度をGC分析した。HPLC分析の条件を分析条件２として下記に示す。またGC分析の条件を分析条件3として下記に示す。   In addition, the culture solution was collected every 24 hours, and the acetate ion concentration in the system was analyzed by HPLC, and the gas concentration in the headspace in the system was analyzed by GC after 3 days of culture. The conditions for HPLC analysis are shown below as analysis condition 2. The GC analysis conditions are shown below as analysis conditions 3.

また、酢酸イオン濃度の変化量及び水素生成量に基づき、酢酸１モルから生成された水素モル量（以下、水素収率とも称する）を、下記計算式１により、算出した。   Further, based on the amount of change in the acetate ion concentration and the amount of hydrogen produced, the amount of hydrogen produced from 1 mol of acetic acid (hereinafter also referred to as hydrogen yield) was calculated by the following formula 1.


＜分析条件2＞
HPLC ：HITACHI L-2130（日立ハイテクノロジーズ、東京）
Column ：TSKgel IC-Anion-PWxl (4.6 mm × 7.5 cm)（東ソー、東京）
Column temp：30℃
移動相 ：1 mM フタル酸(pH3.4)
流速 ：1.0 ml/min
Detector：HITACHI L-2470 Conductimetry Detector（日立ハイテクノロジーズ、東京） <Analysis condition 2>
HPLC: HITACHI L-2130 (Hitachi High Technologies, Tokyo)
Column: TSKgel IC-Anion-PW xl (4.6 mm x 7.5 cm) (Tosoh, Tokyo)
Column temp: 30 ℃
Mobile phase: 1 mM phthalic acid (pH 3.4)
Flow rate: 1.0 ml / min
Detector: HITACHI L-2470 Conductimetry Detector (Hitachi High Technologies, Tokyo)

＜分析条件3＞
GC ：HITACHI G-3900（日立ハイテクノロジーズ、東京）
Injector temp ：50℃
Detector ：TCD
Detector temp ：50℃
Column ：Molecular Sieve 5A（80/100 mesh）、Stainless column（2 m）
Oven temp ：50℃
Carrier gas ：N2
流量 ：20 ml/min
アプライ量 ：50μl <Analysis condition 3>
GC: HITACHI G-3900 (Hitachi High Technologies, Tokyo)
Injector temp: 50 ℃
Detector: TCD
Detector temp: 50 ℃
Column: Molecular Sieve 5A (80/100 mesh), Stainless column (2 m)
Oven temp: 50 ℃
Carrier gas: N2
Flow rate: 20 ml / min
Apply amount: 50μl

計算式１
水素収率(mol / mol-酢酸ナトリウム)＝水素生成量／（酢酸イオン濃度減少量×培地体積） Formula 1
Hydrogen yield (mol / mol-sodium acetate) = hydrogen production / (decrease in acetate ion concentration x medium volume)

3-2）解析結果
A培地＋1 mM酢酸ナトリウムの系における酢酸イオン減少量の結果を表7に示す。また、培養3日目における水素生成量および水素収率を表8に示す。 3-2) Analysis results
Table 7 shows the results of the decrease in acetate ion in the system of medium A + 1 mM sodium acetate. In addition, Table 8 shows the amount of hydrogen produced and the hydrogen yield on the third day of culture.

表7に示されるように、培養0日目から1日目にかけて酢酸イオン濃度が0.09 mM減少している事が確認された。 As shown in Table 7, it was confirmed that the acetate ion concentration decreased by 0.09 mM from the 0th day to the 1st day of culture.

また、表8に示されるように、3日間の培養で0.64μmolの水素生成が確認できた。   In addition, as shown in Table 8, 0.64 μmol of hydrogen was confirmed after 3 days of culture.

これらの事より、HPA1株は酢酸イオンを水素に変換していることが示唆された。また減少した酢酸イオンがすべて水素に変換されて水素生成量が増加したと仮定する場合、水素収率は0.042 mol/mol−酢酸ナトリウムとなった。   These facts suggested that HPA1 strain converted acetate ion into hydrogen. Further, assuming that the reduced acetate ions were all converted to hydrogen and the hydrogen production increased, the hydrogen yield was 0.042 mol / mol-sodium acetate.

HPA1株の同定
HPA１株を同定するため、簡易形態観察および16S rDNA（16S rRNA遺伝子）の部分塩基配列（約500 bp）に基づく解析を行った。 Identification of HPA1 strain
In order to identify the HPA1 strain, simple morphological observation and analysis based on a partial base sequence (about 500 bp) of 16S rDNA (16S rRNA gene) were performed.

4-1）解析手段
培養条件
HPA1株を以下の条件で培養し、解析に用いた。 4-1) Analytical means
Culture conditions
The HPA1 strain was cultured under the following conditions and used for analysis.

・培地 LB Agar（Becton Dickinson、MD、USA）
・培養温度 37℃
・培養時間 24時間
・その他条件 好気培養 ・ Media LB Agar (Becton Dickinson, MD, USA)
・ Culture temperature 37 ℃
・ Culture time 24 hours ・ Other conditions Aerobic culture

簡易形態観察
HPA1株の簡易形態観察は以下を用いた。 Simple form observation
The simple morphology observation of HPA1 strain was as follows.

・グラム染色 フェイバーG「ニッスイ」（日水製薬、東京）
・光学顕微鏡 BX50F4（オリンパス、東京）
・実体顕微鏡 SZH10（オリンパス、東京） ・ Gram dyeing Faber G "Nissui" (Nissui Pharmaceutical, Tokyo)
・ Optical microscope BX50F4 (Olympus, Tokyo)
-Stereo microscope SZH10 (Olympus, Tokyo)

16S rDNA配列の決定及び相同性検索
抽出からサイクルシークエンスまでの操作は各プロトコールに従った。また、決定したHPA１株の16SrDNAの部分塩基配列（約500 bp）を配列表の配列番号１に示す。 The procedures from 16S rDNA sequence determination and homology search extraction to cycle sequencing were in accordance with each protocol. Further, the determined partial base sequence (about 500 bp) of 16S rDNA of HPA1 strain is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

・DNA抽出 InstaGene Matrix（BIO RAD、CA、USA）
・PCR MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit
（Applied Biosystems、CA、USA）
・サイクルシークエンス
MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Identification Sequencing Kit
（Applied Biosystems、CA、USA）
・シークエンス ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System
（Applied Biosystems、CA、USA）
・配列決定 ChromasPro 1.34（Technelysium Pty Ltd.、Tewantin、AUS）
・相同性検索および簡易分子系統解析
ソフトウェア
アポロン2.0（テクノスルガ・ラボ、静岡）
データベース
アポロンDB-BA3.0（テクノスルガ・ラボ、静岡）
国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL） ・ DNA extraction InstaGene Matrix (BIO RAD, CA, USA)
PCR MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit
(Applied Biosystems, CA, USA)
・ Cycle sequence
MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Identification Sequencing Kit
(Applied Biosystems, CA, USA)
・ Sequence ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System
(Applied Biosystems, CA, USA)
・ Sequencing ChromasPro 1.34 (Technelysium Pty Ltd., Tewantin, AUS)
・ Homology search and simple molecular phylogenetic analysis
software
Apollon 2.0 (Techno Suruga Lab, Shizuoka)
The database
Apollon DB-BA3.0 (Techno Suruga Lab, Shizuoka)
International nucleotide sequence database (GenBank / DDBJ / EMBL)

4-2）HPA1株の解析結果
1）簡易形態観察
簡易形態観察の結果、HPA1株はグラム染色陽性、好気条件下での生育性を示す桿菌で、LB Agar培地上でのコロニー色はクリーム色を呈した。表9に簡易形態観察の結果を示す。また、図5にコロニー像を示す。図6にグラム染色像を示す。 4-2) Analysis results of HPA1 strain
1) Simple morphology observation As a result of simple morphology observation, HPA1 strain was positive for Gram staining and was a koji mold exhibiting viability under aerobic conditions, and the colony color on LB Agar medium was creamy. Table 9 shows the results of simple morphology observation. FIG. 5 shows a colony image. Fig. 6 shows a Gram-stained image.

2）相同性検索
BLASTを用いたアポロンDB-BA3.0に対する相同性検索の結果、HPA1株の16S rDNA部分配列はBacillus由来の16S rDNAに対し高い相同性を示し、B. licheniformisDSM13株およびB. aeriusK24株の16S rDNAに対し、相同率99.4 %の高い相同性を示した。表10にアポロンDB-BAの検索結果を示す。 2) Homology search
As a result of homology search for Apollon DB-BA3.0 using BLAST, 16S rDNA partial sequence of HPA1 strain showed high homology to 16S rDNA derived from Bacillus, and 16S rDNA of B. licheniformis DSM13 strain and B. aeriusK24 strain On the other hand, it showed high homology with a homology rate of 99.4%. Table 10 shows the search results for Apollon DB-BA.

また、GenBank/DDBJ/EMBLに対する相同性検索の結果においても、HPA1株の16S rDNAはB. licheniformisおよびB. aerius由来の16S rDNAに対し、高い相同性を示した。表11に国際塩基配列データベース 検索の結果を示す。 Moreover, also in the result of homology search against GenBank / DDBJ / EMBL, 16S rDNA of HPA1 strain showed high homology to 16S rDNA derived from B. licheniformis and B. aerius. Table 11 shows the results of the international nucleotide sequence database search.

上記相同性検索の結果から、HPA1株の16S rDNAとアポロンDB-BA3.0に対する相同性検索上位10株の16S rDNAを用いて簡易分子系統解析を行った。結果を図7に示す。 From the results of the above homology search, simple molecular phylogenetic analysis was performed using 16S rDNA of HPA1 strain and 16S rDNA of the top 10 homology searches against Apollon DB-BA3.0. The results are shown in FIG.

その結果、HPA1株はB. licheniformis、B. aeriusおよびB. stratosphericusの16S rDNAと系統枝を形成し、枝の長さからB. licheniformisおよびB. aeriusに最も近縁であることが示された。   As a result, HPA1 strain formed a phylogenetic branch with 16S rDNA of B. licheniformis, B. aerius and B. stratosphericus, and the length of the branch was shown to be closest to B. licheniformis and B. aerius .

3-3）解析結果に基づく同定
系統解析の結果、HPA1株はBacillusに含まれ、B. licheniformisまたはB. aeriusに帰属する可能性もあると考えられた。そこで、HPA1株とB. licheniformisおよびB. aeriusの16S rDNAの配列を比較した（表12）。 3-3) Based on the results of the analysis of the identified lines based on the analysis results, it was considered that HPA1 strain is included in Bacillus and may belong to B. licheniformis or B. aerius. Therefore, the sequences of 16A rDNA of HPA1 strain and B. licheniformis and B. aerius were compared (Table 12).

配列比較の結果、表12に示されるように、HPA1株とB. licheniformisおよびB. aeriusの16S rDNA間には、それぞれ3塩基の相違が認められた。 As a result of the sequence comparison, as shown in Table 12, a difference of 3 bases was observed between the HPA1 strain and the 16S rDNA of B. licheniformis and B. aerius.

これらのうち、2塩基はHPA1株における混合塩基（IUBコード Y ＝ CまたはTを意味する）であることから、ほぼ一致するとも考えられる。しかし、残りの1塩基はHPA株とB. licheniformis間ではAとG、HPA1株とB. aerius間ではGとCで明らかに異なり、HPA1株とこれら2種の16S rDNAは完全には一致しなかった。   Of these, the two bases are mixed bases in the HPA1 strain (IUB code Y = means C or T), and are considered to be almost identical. However, the remaining one base is clearly different between A and G between HPA strain and B. licheniformis, and between G and C between HPA1 strain and B. aerius, and HPA1 strain and these two types of 16S rDNA are completely identical. There wasn't.

このことから、HPA1株がこれら2種と近縁であるものの、種として異なる菌株である可能性も否定できない。   From this, although the HPA1 strain is closely related to these two species, the possibility that it is a different strain as a species cannot be denied.

よって、今回の解析結果から、HPA1株をB. licheniformisおよびB. aeriusに近縁なBacillus sp.とすることが妥当であると考えられた。   Therefore, based on the results of this analysis, it was considered appropriate to use the HPA1 strain as a Bacillus sp. Closely related to B. licheniformis and B. aerius.

HPA1株の水素検出薬の色変化の結果を示す。Aは植菌なしの系、BはHPA1株植菌及び酢酸ナトリウム未添加の系、CはHPA1株植菌及び酢酸ナトリウム添加の系の結果を示す。The result of the color change of the hydrogen detection agent of HPA1 strain is shown. A shows the results of the system without inoculation, B shows the results of the HPA1 strain inoculation and the system without addition of sodium acetate, and C shows the results of the HPA1 strain inoculation with sodium acetate addition. HPA1株が生成した水素のGC分析の結果を示す。The results of GC analysis of hydrogen produced by HPA1 strain are shown. 実施例2で用いた水素定量装置の模式図を示す。FIG. 2 shows a schematic diagram of a hydrogen determination apparatus used in Example 2. FIG. 実施例2における水素生成量の測定結果を示す。The measurement result of the hydrogen production amount in Example 2 is shown. HPA1株の簡易形態観察におけるコロニー像を示す。The colony image in the simple form observation of HPA1 strain | stump | stock is shown. HPA1株の簡易形態観察におけるグラム染色像を示す。The Gram-stained image in the simple form observation of HPA1 strain | stump | stock is shown. HPA1株の16S rDNAとアポロンDB-BA3.0に対する相同性検索上位10株の16S rDNAを用いて行った簡易分子系統解析における系統樹を示す。図中、左下の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾のTはその種の基準株（Type strain）を示す。BSLはバイオセーフティーレベル（レベル2以上を表記）であることを示す。The phylogenetic tree in the simple molecular phylogenetic analysis performed using 16S rDNA of HPA1 strain and 16S rDNA of the top 10 homology search to Apollon DB-BA3.0 is shown. In the figure, the lower left line indicates a scale bar. The number located at the branch of the system branch indicates the bootstrap value. T at the end of the strain name indicates the type strain of that species. BSL indicates a biosafety level (level 2 or higher).

Claims (3)

光エネルギーを用いず酢酸から水素を生産する能力を備えた微生物を用いて発酵法により水素を製造する方法。 A method for producing hydrogen by fermentation using a microorganism having the ability to produce hydrogen from acetic acid without using light energy. 光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物に加えて、炭素源から有機酸又は有機酸及び水素を生成する能力を備えた微生物を用いる
請求項１に記載の水素の製造方法。 The method for producing hydrogen according to claim 1, wherein a microorganism having an ability to produce an organic acid or an organic acid and hydrogen from a carbon source is used in addition to a microorganism having an ability to produce hydrogen from acetic acid without using light energy. . 光エネルギーを用いず酢酸から水素を生成する能力を備えた微生物。 A microorganism with the ability to generate hydrogen from acetic acid without using light energy.
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