JP2009001557A - Photodynamic therapeutic agent containing carotenoid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、光線力学療法の分野に関する。 The present invention relates to the field of photodynamic therapy.
光線力学療法は、光増感物質を体内に投与し、これに光線を照射し、その光毒性反応により生物学的材料の機能を破壊するもので、新しい化学療法として注目を集めている。これまで、光線力学療法の対象薬剤にはポルフィリン類やその前駆物質が使われてきた（特許文献１および２）。ポルフィリン類は、赤色光で励起すると、一重項第一励起状態（Ｓ１）になる（図１）。これは、大部分蛍光を発して基底状態（Ｓ０）に戻るが、一部は三重項第一励起状態（Ｔ１）に遷移する。Ｔ１状態にあるポルフィリン類は酸素分子と反応して、活性酸素の一種である一重項酸素（１Ｏ２）を生成する。このとき発生した一重項酸素が標的となる生物学的材料に障害を与えると考えられている。 Photodynamic therapy is a new chemotherapeutic therapy that administers a photosensitizer into the body, irradiates it with light, and destroys the function of biological materials by its phototoxic reaction. So far, porphyrins and their precursors have been used as target drugs for photodynamic therapy (Patent Documents 1 and 2). Porphyrins enter a singlet first excited state (S 1 ) when excited with red light (FIG. 1). This mostly emits fluorescence and returns to the ground state (S 0 ), but partly transitions to the triplet first excited state (T 1 ). Porphyrins in the T 1 state react with oxygen molecules to generate singlet oxygen ( 1 O 2 ), which is a kind of active oxygen. The singlet oxygen generated at this time is considered to damage the target biological material.
光線力学療法におけるポルフィリン類の使用において課題となる点は、以下の通りである。
１）親油性が低いため組織との親和がよくない。
２）一重項酸素発生効率が必ずしもよくない（ポルフィリン類のＴ１と１Ｏ２のエネルギー準位はそれほど近接していない）。
３）ヘムに代謝されてしまう。
４）投薬後光線過敏症を起こすことがあるので、治療対象者に対して一定期間厳密な遮光措置を講じる必要がある。
The points which become a subject in use of porphyrins in photodynamic therapy are as follows.
1) Low affinity for tissue due to low lipophilicity.
2) The singlet oxygen generation efficiency is not always good (the energy levels of T 1 and 1 O 2 of porphyrins are not so close).
3) Metabolized into heme.
4) Since photosensitivity may occur after administration, it is necessary to take strict light-shielding measures for a certain period of time for the treatment subject.
カロテノイドは、植物などのつくる黄色ないし赤色または紫色の水不溶のポリエン色素であり、その多くは炭素数４０（Ｃ４０、ときにＣ３０、Ｃ４５、Ｃ５０など）で、左右対称に近い構造のテトラテルペノイドである。
本発明の目的は、ポルフィリン以外の色素を用いる光増感反応を利用した、癌や色素沈着等の生物学的材料に対する新規光線力学療法の提供である。 The object of the present invention is to provide a novel photodynamic therapy for biological materials such as cancer and pigmentation using a photosensitizing reaction using a dye other than porphyrin.
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討した結果、カロテノイドの中に特定の波長の光を吸収することで、一重項酸素を生成させる作用を有するものがあることを見出し、本発明を完成するに至った。一般に、カロテノイドの中に抗酸化剤として活性酸素種を消去する作用を有するものがあることは知られているが、本発明で見出された反応は、かかる活性酸素消去反応とは逆の反応であり、これまでに報告されたことはない。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have found that some carotenoids have an action of generating singlet oxygen by absorbing light of a specific wavelength, and the present invention. It came to complete. In general, it is known that some carotenoids have an action of scavenging reactive oxygen species as an antioxidant. However, the reaction found in the present invention is a reaction opposite to the reactive oxygen scavenging reaction. It has never been reported before. That is, the present invention is as follows.
（１） カロテノイドを有効成分として含有する光線力学療法剤。
（２） カロテノイドがＣ４０Ｈ５６の基本構造を持つ化合物である前記（１）記載の療法剤。
（３） カロテノイドがネオキサンチン、シホナキサンチンまたはフコキサンチンである前記（１）または（２）に記載の療法剤。
（４） 癌細胞を対象とするものである前記（１）〜（３）いずれかに記載の療法剤。
（５） 色素沈着細胞を対象とするものである前記（１）〜（３）いずれかに記載の療法剤。
（６） 前記（１）〜（５）いずれかに記載の光線力学療法剤に３５０〜６００ｎｍの波長を有する励起光を照射する工程を含む、一重項酸素の発生方法。
（７） 照射工程が青色発光ダイオードを用いて行われる、前記（６）記載の方法。
（８） 光線力学療法剤を製造するためのカロテノイドの使用。
(1) A photodynamic therapeutic agent containing carotenoid as an active ingredient.
(2) The therapeutic agent according to the above (1), wherein the carotenoid is a compound having a basic structure of C 40 H 56 .
(3) The therapeutic agent according to (1) or (2) above, wherein the carotenoid is neoxanthine, siphonaxanthin or fucoxanthin.
(4) The therapeutic agent according to any one of (1) to (3), which is intended for cancer cells.
(5) The therapeutic agent according to any one of (1) to (3), which is intended for pigmented cells.
(6) A method for generating singlet oxygen, comprising a step of irradiating the photodynamic therapeutic agent according to any one of (1) to (5) with excitation light having a wavelength of 350 to 600 nm.
(7) The method according to (6), wherein the irradiation step is performed using a blue light emitting diode.
(8) Use of a carotenoid for producing a photodynamic therapeutic agent.
本発明の光線力学療法剤によれば、有効成分としてカロテノイドを含有することから、ポルフィリンを用いた従来の光線力学療法剤に比べて、以下の利点を有する。
１）親油性が高く、組織との親和性がよい。
２）一重項酸素発生効率がよいと考えられる。その理由は、ポルフィリンと比較して、一般にＴ１準位が一重項酸素（１Ｏ２）の準位に近いからである（図１を参照）。
３）多種のカロテノイドがすでに知られており、構造に含まれる共役鎖長からエネルギーが容易に推測できるため、様々な用途に応用しやすい。
４）植物等に大量に含まれる分子であり、入手および精製が容易である。
According to the photodynamic therapy agent of the present invention, since it contains a carotenoid as an active ingredient, it has the following advantages compared to the conventional photodynamic therapy agent using porphyrin.
1) High lipophilicity and good affinity with tissues.
2) It is considered that singlet oxygen generation efficiency is good. This is because the T 1 level is generally closer to the singlet oxygen ( 1 O 2 ) level than porphyrin (see FIG. 1).
3) Various carotenoids are already known, and energy can be easily estimated from the conjugated chain length included in the structure, so that they can be easily applied to various applications.
4) It is a molecule contained in a large amount in plants and the like, and is easy to obtain and purify.
本発明の一重項酸素の発生方法によれば、一重項酸素の発生効率のよいカロテノイドを用いることから、青色光を照射することにより、有効量の一重項酸素の生成が見込まれる。本方法を用いることにより、癌細胞または色素沈着細胞に対して障害を与え、死滅に導くことができる。また、本発明の方法は、一重項酸素を用いる基礎的研究においても、一重項酸素の簡便な供給手段として利用することができる。 According to the method for generating singlet oxygen of the present invention, since a carotenoid with high generation efficiency of singlet oxygen is used, the generation of an effective amount of singlet oxygen is expected by irradiation with blue light. By using this method, it is possible to damage cancer cells or pigmented cells and lead to death. The method of the present invention can also be used as a simple means for supplying singlet oxygen even in basic research using singlet oxygen.
本発明の光線力学療法剤は、カロテノイドを有効成分として含有することを特徴とする。 The photodynamic therapeutic agent of the present invention is characterized by containing a carotenoid as an active ingredient.
本発明において、カロテノイドとは、現在その存在および構造が知られ、あるいは将来その存在が知られる、あらゆるカロテノイドを含む概念である。具体的には、カロテノイドは、カロテノイドハンドブック（Britton, G., Liaaen-Jensen, S., and Pfander, H. eds. Carotenoids Handbook. Birkhauser, Basel, 2004）に記載されたすべての化合物を含むものであり、Ｃ４０Ｈ５６の基本構造を持つ化合物とそのヒドロキシ化合物、エポキシ化合物、ケト化合物、エステル化合物などの修飾体もしくは派生物質（ときにＣ３０、Ｃ４０、Ｃ４５、Ｃ５０等の炭素数を有する化合物になる）を含む天然または非天然の化合物である。一重項酸素の発生効率の観点から、カロテノイドは、共役二重結合の結合鎖長が１０以下であるものが好ましい。 In the present invention, the carotenoid is a concept including all carotenoids whose existence and structure are known at present or whose existence is known in the future. Specifically, carotenoids include all compounds described in the carotenoid handbook (Britton, G., Liaaen-Jensen, S., and Pfander, H. eds. Carotenoids Handbook. Birkhauser, Basel, 2004). Yes, a compound having a basic structure of C 40 H 56 and its modified compounds or derivatives such as hydroxy compounds, epoxy compounds, keto compounds, ester compounds (sometimes carbon numbers such as C 30 , C 40 , C 45 , C 50, etc.) Or a natural or non-natural compound. From the viewpoint of generation efficiency of singlet oxygen, the carotenoid preferably has a conjugated double bond having a bond chain length of 10 or less.
共役二重結合の結合鎖長が１０以下のカロテノイドとしては、ネオキサンチン、シホナキサンチン、ビオラキサンチン、ルテイン、ロロキサンチン、シホナキサンチンエステル、アンセラキサンチン、フコキサンチン、ペリディニン、ディアディノキサンチン、ディノキサンチン、スフェロイデン、クロロキサンチン、ニューロスポレン、ツナキサンチン、ハロシンチアキサンチンなどがあげられる。ネオキサンチンおよびシホナキサンチンの構造を図２に示す。 Carotenoids with a conjugated double bond having a bond chain length of 10 or less include neoxanthine, siphonaxanthin, violaxanthin, lutein, roloxanthine, siphonaxanthin ester, anselaxanthin, fucoxanthin, peridinine, diadinoxanthine, dino Xanthine, spheroidene, chloroxanthine, neurosporene, tunaxanthin, halocinthiaxanthine and the like. The structures of neoxanthine and siphonaxanthin are shown in FIG.
カロテノイドは、植物などに天然に存在するカロテノイドを常法により単離、精製して得ることができ、市販品を利用することも可能である。あるいは、カロテノイドは、自体公知の方法により合成することができる。 Carotenoids can be obtained by isolating and purifying carotenoids naturally present in plants and the like by conventional methods, and commercially available products can also be used. Alternatively, carotenoids can be synthesized by a method known per se.
本発明の光線力学療法剤中に含まれるカロテノイドの含有量は、特に限定されるものでないが、通常０．０００１〜９９．９９重量％であり、０．００１〜９９．９重量％が好ましく、０．０１〜９９重量％がより好ましい。 The content of carotenoid contained in the photodynamic therapeutic agent of the present invention is not particularly limited, but is usually 0.0001 to 99.99% by weight, preferably 0.001 to 99.9% by weight, 0.01 to 99% by weight is more preferable.
本発明の光線力学療法剤は、前記有効成分以外に、薬理学的に許容可能な担体を含有していてもよい。かかる担体としては、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、粘稠剤、溶解補助剤またはその他の添加剤等があげられる。 The photodynamic therapeutic agent of the present invention may contain a pharmacologically acceptable carrier in addition to the active ingredient. Such carriers include excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, thickeners, solubilizers or other additives.
本発明の光線力学療法剤を標的組織または細胞に到達させるためには、カロテノイドを任意のターゲッティング剤に結合させた形態で含有することも可能である。ターゲッティング剤としては、抗体、受容体、受容体−リガンド複合体、リポソーム、分子ミセルなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。 In order to allow the photodynamic therapeutic agent of the present invention to reach a target tissue or cell, it is possible to contain a carotenoid in a form bound to an arbitrary targeting agent. Targeting agents include, but are not limited to, antibodies, receptors, receptor-ligand complexes, liposomes, molecular micelles, and the like.
本発明の光線力学療法剤の投与方法としては、当該療法剤中に含まれるカロテノイドが最終的に標的組織または細胞に到達するのであれば、特に限定はされない。投与経路として、経口または非経口があげられる。好ましくは、非経口である。非経口的投与形態としては、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経粘膜投与、経皮投与（皮膚パッチ、軟膏等による）などがあげられる。 The administration method of the photodynamic therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as the carotenoid contained in the therapeutic agent finally reaches the target tissue or cells. The administration route includes oral and parenteral. Preferably, it is parenteral. Examples of parenteral dosage forms include intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, transmucosal administration, transdermal administration (through skin patches, ointments, etc.) and the like.
本発明の光線力学療法剤は、必要に応じて、製薬学的に許容され得る添加剤と共に、投与に適した剤型に製剤化される。経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などがあげられ、非経口投与に適した剤型としては、例えば、注射剤、貼付剤、ローション剤、軟膏、クリーム剤などがあげられる。これらは当該分野で汎用されている通常の技術を用い、調製することができる。 The photodynamic therapeutic agent of the present invention is formulated into a dosage form suitable for administration together with a pharmaceutically acceptable additive as necessary. Examples of dosage forms suitable for oral administration include tablets, capsules, granules, powders, etc. Examples of dosage forms suitable for parenteral administration include injections, patches, lotions, ointments, Examples include creams. These can be prepared using conventional techniques widely used in the field.
本発明の光線力学療法剤の適用対象としては、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）があげられる。 Examples of the application target of the photodynamic therapeutic agent of the present invention include mammals (eg, humans, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, horses, sheep, monkeys, etc.).
本発明の光線力学療法剤の投与量は、対象の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該剤に含有される有効成分の種類などにより異なるが、通常成人（体重６０ｋｇとして）一人当たり、一回につき１０μｇから１０００ｍｇの範囲、好ましくは、１００μｇから５００ｍｇの範囲で投与することができる。なお、他の哺乳動物の場合も、当該哺乳動物の体重で換算した量を投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。 The dose of the photodynamic therapeutic agent of the present invention varies depending on the age, sex, weight and symptoms of the subject, therapeutic effect, administration method, treatment time, type of active ingredient contained in the agent, etc. It can be administered in the range of 10 μg to 1000 mg, preferably in the range of 100 μg to 500 mg per person, per person (with a body weight of 60 kg). In the case of other mammals, an amount converted based on the body weight of the mammal can be administered. However, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient, or a dose exceeding the above range may be required.
本発明の光線力学療法剤が対象とする生物材料は、生体内または生体外のあらゆる細胞または組織であってもよい。好ましくは、癌細胞または色素沈着細胞である。癌細胞としては、治療効果が期待できる固形癌由来の細胞が好ましく、肺癌細胞、食道癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、皮膚癌等があげられるが、これらに限定されるものではない。色素沈着細胞としては、ニキビ、アザ、シミによる色素沈着細胞があげられるが、これらに限定されるものではない。 The biological material targeted by the photodynamic therapy agent of the present invention may be any cell or tissue in vivo or in vitro. Preferred are cancer cells or pigmented cells. The cancer cells are preferably solid cancer-derived cells that can be expected to have a therapeutic effect, and include lung cancer cells, esophageal cancer cells, gastric cancer cells, uterine cancer cells, prostate cancer cells, bladder cancer cells, pancreatic cancer cells, skin cancer and the like. However, it is not limited to these. Pigmented cells include, but are not limited to, acne, aza, and pigmented cells.
本発明の光線力学療法剤は、有効成分であるカロテノイドが正常細胞に比べて癌細胞に取り込まれやすい性質を有する。したがって、癌治療を目的とする場合に正常細胞に対するダメージが低いので好ましい。 The photodynamic therapeutic agent of the present invention has a property that carotenoids which are active ingredients are more easily taken up by cancer cells than normal cells. Therefore, it is preferable because damage to normal cells is low when aiming at cancer treatment.
本発明の光線力学療法剤は、生体内または生体外で酸素の存在下、励起光を照射することにより、一重項酸素を発生させることができる。本発明は、かかる一重項酸素の発生方法を提供する。 The photodynamic therapy agent of the present invention can generate singlet oxygen by irradiating excitation light in the presence of oxygen in vivo or in vitro. The present invention provides a method for generating such singlet oxygen.
前記励起光とは、有効成分であるカロテノイドのエネルギー準位を基底状態（Ｓ０）から一重項第二励起状態（Ｓ２）に励起可能な光線をいう。一重項第二励起状態（Ｓ２）に励起したカロテノイドが内部変換によって一重項第一励起状態（Ｓ１）に緩和した後、内部変換によって基底状態（Ｓ０）に戻る過程で、その一部は三重項第一励起状態（Ｔ１）に遷移して、Ｔ１状態にあるカロテノイドは酸素分子と反応して、活性酸素の一種である一重項酸素（１Ｏ２）を生成する（図１参照）。これら一連の反応を光増感反応という。多光子吸収によってカロテノイドをＳ０からＳ２に励起する場合の長波長光も励起光に含める。 The excitation light refers to a light beam capable of exciting the energy level of carotenoid, which is an active ingredient, from the ground state (S 0 ) to the singlet second excited state (S 2 ). A part of the carotenoid excited in the singlet second excited state (S 2 ) is relaxed to the singlet first excited state (S 1 ) by internal conversion and then returns to the ground state (S 0 ) by internal conversion. Transitions to the triplet first excited state (T 1 ), and the carotenoid in the T 1 state reacts with oxygen molecules to generate singlet oxygen ( 1 O 2 ) which is a kind of active oxygen (FIG. 1). reference). These series of reactions are called photosensitized reactions. Long-wavelength light when the carotenoid is excited from S 0 to S 2 by multiphoton absorption is also included in the excitation light.
励起光は、カロテノイドの種類に応じて適する波長の光を選択すればよいが、３５０〜６００ｎｍの波長の光が好ましく、より好ましくは４００〜５５０ｎｍの波長である。なお、多光子吸収によってカロテノイドのＳ２状態を作り出す場合はさらに長い波長の光線を使うこともあるが、その際も同時に照射された光子のエネルギーの合計は、これらの波長に対応するエネルギー値の範囲に収まっている必要がある。すなわち、３５０〜６００ｎｍに対応するエネルギー値として２．１〜３．５ｅＶが例示され、４００〜５５０ｎｍに対応するエネルギー値として２．３〜３．１ｅＶが例示される。かかる条件を有し、本発明の目的に適する励起光としては、電球や重水素ランプの光を青色フィルターで単色化したもの、青色発光ダイオードが発する光（以下、「青色ＬＥＤ光」と称する）、赤外線レーザー（多光子吸収に用いる）などがあげられる。
青色ＬＥＤ光は、熱放出が少ない、消費電力が少ない、小型、軽量、安価、回路の簡便性という特性を有するため、好ましく用いられる。
As the excitation light, light having a suitable wavelength may be selected according to the type of carotenoid, but light having a wavelength of 350 to 600 nm is preferable, and a wavelength of 400 to 550 nm is more preferable. Incidentally, also the use of longer wavelength rays when creating the S 2 state of carotenoids by multiphoton absorption but, in this case also is simultaneously irradiated photon total energy, energy values corresponding to these wavelengths Must be within range. That is, 2.1 to 3.5 eV is exemplified as an energy value corresponding to 350 to 600 nm, and 2.3 to 3.1 eV is exemplified as an energy value corresponding to 400 to 550 nm. Excitation light having such conditions and suitable for the purpose of the present invention includes light from a light bulb or deuterium lamp monochromatic with a blue filter, light emitted from a blue light emitting diode (hereinafter referred to as “blue LED light”). And an infrared laser (used for multiphoton absorption).
Blue LED light is preferably used because it has characteristics of low heat release, low power consumption, small size, light weight, low cost, and circuit simplicity.
励起光の照射エネルギー密度は、対象とする生物材料の種類、生物材料の生体内での位置、動物の種類、治療目的などにより異なり、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、生体外で一重項酸素を発生する目的の場合、約１０〜５００Ｊ/ｃｍ2が例示される。また、ヒトを対象とする色素沈着の治療目的の場合、約２〜１０Ｊ/ｃｍ2（例えば５Ｊ/ｃｍ2）を１〜１０回（例えば８回程度）照射が例示される。ヒトを対象とする癌の治療目的の場合、２００Ｊ/ｃｍ2以上の照射が必要と考えられるが、これに限定されるものではない。 The irradiation energy density of the excitation light varies depending on the type of the target biological material, the position of the biological material in the living body, the type of animal, the therapeutic purpose, and the like, and can be set as appropriate according to the purpose. For example, in the case of generating singlet oxygen in vitro, about 10 to 500 J / cm 2 is exemplified. Also, if the therapeutic purposes of pigmentation of human subjects, about 2~10J / cm 2 (e.g., 5 J / cm 2) from 1 to 10 times (for example, about 8 times) irradiation are exemplified. In the case of cancer treatment intended for humans, irradiation of 200 J / cm 2 or more is considered necessary, but is not limited thereto.
本発明の方法により生成した一重項酸素および一重項酸素を起点に発する種々の活性酸素種は、カロテノイドが到達した周辺の癌細胞や色素沈着細胞等に障害を与えたり死滅させたりする作用を有する。これにより、癌（皮膚癌を含む）または皮膚疾患（皮膚癌を除く）の治療のみならず、美容目的にも効果が期待される。 Singlet oxygen generated by the method of the present invention and various reactive oxygen species originating from singlet oxygen have the effect of damaging or killing surrounding cancer cells or pigmented cells to which carotenoids have reached. . This is expected to be effective not only for the treatment of cancer (including skin cancer) or skin diseases (excluding skin cancer) but also for cosmetic purposes.
次に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。なお、本実施例において市販のキットまたは試薬を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。 EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited to these Examples at all. In addition, about the part which used the commercially available kit or reagent in the present Example, it experimented according to the attached protocol unless there is particular notice.
[実施例１]
カロテノイド光増感反応による細胞死
本実施例では、カロテノイドを培養中の癌細胞に添加し、同時にカロテノイドに対する励起光を照射した後、培養を続けて癌細胞の生育を観察した。カロテノイドの培地中の濃度は２μＭで、２００μmol photons・m-2・s-1の青色光（青色ＬＥＤによる）照射下で、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の環境下で培養した。カロテノイドとしてネオキサンチンおよびシホナキサンチンを用いた（ＥおよびＦ）。ネオキサンチンおよびシホナキサンチンは、ホウレンソウおよび緑藻（ミル）からそれぞれ抽出し、精製した。比較実験として、Ａ)カロテノイド添加なし・青色光照射なし、Ｂ)ネオキサンチン添加あり・青色光照射なし、Ｃ)シホナキサンチン添加あり・青色光照射なし、ならびにＤ)カロテノイド添加なし・青色光照射ありの各条件でも培養した。癌細胞としてヒト悪性黒色腫（A375、ATCCCRL-1619）を使用し、９６ウエルプレート上でＤＭＥＭ培地を用いて培養した。細胞の生育観察は、光学顕微鏡を用いて行った（図３）。また、細胞活性はalamarBlueＴＭ法(Sorotec, Oxford, UK)を用いて測定した（図４）。
[Example 1]
Cell death due to carotenoid photosensitization reaction In this example, carotenoids were added to cancer cells in culture, and simultaneously irradiated with excitation light for carotenoids, the culture was continued to observe the growth of cancer cells. The concentration of carotenoid in the medium was 2 μM, and the cells were cultured for 24 hours under an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 under 200 μmol photons · m −2 · s −1 blue light irradiation (by a blue LED). Neoxanthine and siphonaxanthin were used as carotenoids (E and F). Neoxanthine and siphonaxanthin were extracted and purified from spinach and green algae (mills), respectively. As comparative experiments, A) no carotenoid addition, no blue light irradiation, B) neoxanthine addition, no blue light irradiation, C) siphonaxanthin addition, no blue light irradiation, and D) no carotenoid addition, blue light irradiation Culture was also performed under each condition. Human malignant melanoma (A375, ATCCCRL-1619) was used as a cancer cell and cultured on a 96-well plate using a DMEM medium. Cell growth was observed using an optical microscope (FIG. 3). The cell activity was measured using the alamarBlue ™ method (Sorotec, Oxford, UK) (FIG. 4).
図３より、比較実験（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）では細胞は仮足をのばし、活発に増殖しているのに対し、カロテノイド添加および青色光照射を行った細胞では著しく形態が変化し、仮足が定着しない球状体になっていた（Ｅ、Ｆ）。図４より、alamarBlueＴＭ法による細胞活性測定の結果から、比較実験（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）に比べ、カロテノイド添加および青色光照射を行った細胞では細胞活性が明らかに下がっていた（Ｅ、Ｆ）。比較実験Ａでの細胞生存率を１００％としたとき、カロテノイドを添加し青色光照射を行った細胞（ＥおよびＦ）では顕著に細胞生存率が低下している（両側Ｔ検定p<0.001）が、比較実験（Ａ、Ｄ）では細胞生存率の有意差はなかった。また、カロテノイドを添加し青色光照射を行った細胞（ＥおよびＦ）での細胞生存率の低下は、比較実験（Ｂ、Ｃ）に対し有意に大きかった（両側Ｔ検定p<0.001）。このことから、カロテノイド類に対する光照射により、光増感反応が起こり、これにより細胞が障害を受けたことが明らかである。なお、図４において、カロテノイドを添加しただけでも細胞生存率の低下が見られた（Ａに対するＢはｐ＜0.001、Ａに対するＣはｐ＜0.05）が、カロテノイド添加のみの細胞よりも、カロテノイド添加後青色光照射の細胞の方が、さらに細胞生存率が低下していた（Ｂに対するＥ、Ｃに対するＦはともにｐ＜0.001）。 From FIG. 3, in the comparative experiments (A, B, C, D), the cells stretched temporarily and actively proliferated, whereas in the cells subjected to carotenoid addition and blue light irradiation, the morphology changed significantly. The temporary foot was a spherical body that did not settle (E, F). From FIG. 4, the cell activity was clearly decreased in the cells subjected to the addition of carotenoid and irradiated with blue light as compared with the comparative experiments (A, B, C, D) from the result of the cell activity measurement by the alamarBlue TM method (E F). When the cell survival rate in Comparative Experiment A is 100%, the cell survival rate is significantly decreased in the cells (E and F) that were added with carotenoid and irradiated with blue light (two-sided T test p <0.001). However, there was no significant difference in cell viability in comparative experiments (A, D). In addition, the decrease in cell viability in the cells (E and F) that were subjected to blue light irradiation with the addition of carotenoids was significantly greater than the comparative experiments (B, C) (two-sided T test p <0.001). From this, it is clear that the photosensitization reaction occurred by light irradiation to the carotenoids, and the cells were damaged by this. In FIG. 4, even when carotenoids were added, cell viability was reduced (B for A was p <0.001 and C for A was p <0.05). However, the addition of carotenoids was higher than that of cells containing only carotenoids. Cells with post-blue light irradiation had a further decreased cell viability (both E for B and F for C were both p <0.001).
[実施例２]
カロテノイド光増感反応によって生じる活性酸素の検出
本実施例では、光励起したカロテノイドによる活性酸素種発生を明らかにするために、活性酸素種に特異的に反応する蛍光プローブ(Hyper, Evrogen社)を発現する細胞株（Hyper発現HeLa細胞：HeLa Hyper cell、MARINPHARM社）を用いて活性酸素種発生状況を調査した。
Hela Hyper cellを２μＭネオキサンチン含有ＤＭＥＭ培地（invitrogen社）で３時間培養し、
１)ネオキサンチンを含まない培地に交換（Ｄ１）、または
２)培地交換なし（Ｄ２）
のそれぞれについて２時間青色光（青色ＬＥＤによる、実施例１と同様）照射した後、蛍光顕微鏡観察を行った。また、比較実験として、
Ａ）カロテノイド添加なし・青色光照射なし、
Ｂ１）カロテノイド添加あり・青色光照射なし、
Ｃ）カロテノイド添加なし・青色光照射あり
の各条件でも培養した。結果を図５に示す。
[Example 2]
Detection of active oxygen generated by carotenoid photosensitization reaction In this example, in order to clarify the generation of reactive oxygen species by photoexcited carotenoid, a fluorescent probe (Hyper, Evrogen) that reacts specifically with reactive oxygen species was developed. The state of reactive oxygen species generation was investigated using a cell line (Hyper-expressing HeLa cell: HeLa Hyper cell, MARINPHARM).
Hela Hyper cell was cultured in DMEM medium (invitrogen) containing 2 μM neoxanthin for 3 hours,
1) Change to medium without neoxanthin (D1), or 2) No medium change (D2)
Each of these was irradiated with blue light (similar to Example 1 with a blue LED) for 2 hours, and then observed with a fluorescence microscope. As a comparative experiment,
A) No carotenoid added, no blue light irradiation,
B1) Carotenoid added, no blue light irradiation,
C) The cells were cultured under various conditions with no carotenoid added and with blue light irradiation. The results are shown in FIG.
図５より、Ｄ１およびＤ２のいずれの場合も比較実験（Ａ、Ｂ１、Ｃ）に比べて細胞質において強い蛍光が見られた。これは、青色光励起したカロテノイドによる活性酸素種生成を示すのみならず、カロテノイドが細胞膜親和性を持ち細胞によく取り込まれていることを示している。このような励起カロテノイドによる光増感反応は、カロテノイド類を用いた光線力学療法への応用に発展するものと期待される。 From FIG. 5, in both cases of D1 and D2, strong fluorescence was observed in the cytoplasm as compared with the comparative experiments (A, B1, C). This indicates not only the generation of reactive oxygen species by carotenoids excited with blue light, but also that carotenoids have cell membrane affinity and are well taken up by cells. Such photosensitized reaction by excited carotenoids is expected to develop for photodynamic therapy using carotenoids.
[実施例３]
カロテノイドの癌細胞集積性
カロテノイドの癌集積性を、培養細胞を用いて調べた。カロテノイドとして、フコキサンチンを用いた。フコキサンチンは、褐藻（カヤモノリ）から抽出し、精製した。実験には、癌細胞（A375：ヒト悪性黒色腫）および正常細胞（Met-5A：中皮細胞）を用いた。細胞をそれぞれ９x106個回収し、３０ｍＬの２μＭカロテノイド含有ＤＭＥＭ培地に懸濁した。懸濁した細胞を３７℃、３時間振とうしながらカロテノイドを取り込ませた後、遠心分離し、細胞を回収した。回収した細胞をアセトンで溶解し、再び遠心分離して上清を色素抽出液として得た。色素抽出液を吸光度測定し、カロテノイド濃度を求めた。また、それぞれの細胞につき同時にタンパク質量を求めた。結果を図６に示す。図６より、癌細胞（A375）では、正常細胞(Met-5A)に比べ、カロテノイドの細胞集積量が多いことが明らかになった。
[Example 3]
Carotenoid cancer cell accumulation The carotenoid cancer accumulation was examined using cultured cells. Fucoxanthin was used as the carotenoid. Fucoxanthin was extracted from brown algae and purified. In the experiment, cancer cells (A375: human malignant melanoma) and normal cells (Met-5A: mesothelial cells) were used. Each 9 × 10 6 cells were collected and suspended in 30 mL of DMEM medium containing 2 μM carotenoids. The suspended cells were shaken at 37 ° C. for 3 hours to incorporate carotenoids, and then centrifuged to collect the cells. The collected cells were lysed with acetone and centrifuged again to obtain a supernatant as a dye extract. The absorbance of the dye extract was measured to determine the carotenoid concentration. In addition, the amount of protein was simultaneously determined for each cell. The results are shown in FIG. FIG. 6 revealed that the amount of carotenoids accumulated in cancer cells (A375) was higher than that in normal cells (Met-5A).
本発明によれば、新規な光線力学療法剤を提供し、癌、皮膚疾患を始めとする様々な疾患を非侵襲的に治療または改善することができる。 According to the present invention, a novel photodynamic therapeutic agent can be provided, and various diseases such as cancer and skin diseases can be treated or improved noninvasively.
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