JP2008546373A - ヒトglp−1ミメティボディ、組成物、方法および用途 - Google Patents
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Abstract
Description
ド(Exenatide)はGLP−1受容体を結合しかつGLP−1(7−37)に帰されている多数の活性の原因のシグナル伝達カスケードを開始し得る。今日までに、それは、2型糖尿病を伴う患者のHbA1cレベルおよび血清フルクトサミンレベルを低下させることが示された。加えて、それは健康志願者で胃排出を遅らせかつ食物摂取を阻害した。
本発明は、当該技術分野で既知であるものと組合せの、本明細書に記述かつ/若しくは可能にされるところの、改変された免疫グロブリン、切断生成物ならびにそれらの他の指定された部分およびバリアントを包含するヒトGLP−1ミメティボディ、ならびにGLP−1ミメティボディの組成物、コードする若しくは相補的な核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、装置、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、ならびにそれらの作成および使用方法を提供する。
a.(P(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、
[式中、Pは最低1種の生物活性GLP−1ペプチド、バリアント若しくは誘導体であり、Lは該ミメティボディが代替の方向および結合特性を有することを可能にすることにより構造の柔軟性を提供するポリペプチドであり得る最低1種のリンカー配列であり、Vは免疫グロブリン可変領域のC末端の少なくとも一部分であり、Hは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、CH2は免疫グロブリンCH2定常領域の少なくとも一部分であり、CH3は免疫グロブリンCH3定常領域の少なくとも一部分であり、nは1から10までの整数であり、ならびに、o、p、q、r、sおよびtは独立に0から10までの整数であり得る]、
またはそれらのいずれかの組合せを含んでなる。
ィボディまたは指定された部分若しくはバリアントは、最低1〜3を含んでなる最低1個のエピトープ、最低1種のリガンド(例えば、限定されるものでないがGLP−1受容体)のアミノ酸配列全体、またはそれらのフラグメントへの、最低1種のGLP−1ペプチド若しくは式(I)中のミメティボディのP部分に対応するポリペプチドの結合を模倣し、該リガンドは、配列番号1の、または本明細書に記述されるか若しくは当該技術分野で既知のところの1個若しくはそれ以上の置換、欠失若しくは挿入を場合によっては伴う少なくとも一部分に結合する。該最低1種のGLP−1ミメティボディは、場合によっては、最低10−9M、最低10−10M、最低10−11M若しくは最低10−12Mの親和性でGLP−1受容体を結合し得る。GLP−1ミメティボディは、従って、限定されるものでないが受容体若しくはそのフラグメントに対する結合活性を挙げることができる対応する活性について既知の方法に従ってスクリーニングし得る。
メティボディ若しくはGLP−1ミメティボディ抗イディオタイプ抗体が検出可能な若しくは回収可能な量で発現されるようなin vitro、in vivo若しくはin situ条件下で、GLP−1ミメティボディ若しくはGLP−1ミメティボディ抗イディオタイプ抗体をコードする核酸を翻訳することを含んでなる、最低1種のGLP−1ミメティボディ若しくはGLP−1ミメティボディ抗イディオタイプ抗体の製造方法もまた提供される。
せるための調節のために治療上有効な量で投与される場合の方法若しくは組成物における最低1種のGLP−1ミメティボディ、指定された部分若しくはバリアントを提供する。
与することを場合によってはさらに含み得る。
本発明は、単離された、組換えのかつ/若しくは合成のミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアント、ならびに最低1種のGLP−1ミメティボディをコードする最低1種のポリヌクレオチドを含んでなる組成物およびコードする核酸分子を提供する。本発明のこうしたミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアントは、特定のGLP−1ミメティボディ配列、それらのドメイン、フラグメントおよび指定されたバリアント、ならびに、治療的組成物、方法および装置を包含する、前記核酸およびミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアントの作成および使用方法を含んでなる。
((P(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、またはそれらのいずれかの組合せを含んでなり、式中、Pは最低1種の生物活性GLP−1ポリペプチドであり、Lは、該ミメティボディが代替の方向および結合特性を有することを可能にすることにより構造の柔軟性を提供するポリペプチドであり得る最低1種のリンカー配列であり、Vは免疫グロブリン可変領域のC末端の少なくとも一部分であり、Hは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、CH2は免疫グロブリンC
H2定常領域の少なくとも一部分であり、CH3は免疫グロブリンCH3定常領域の少なくとも一部分であり、m、n、o、p、q、r、sおよびtは独立に0と10の間かつそれらを包含する整数であり得る。
に重要ではない。リンカーは、好ましくは、ペプチド結合により一緒に連結されたアミノ酸から構成される。従って、好ましい態様において、リンカーはペプチド結合により連結された1から20個までのアミノ酸から構成され、該アミノ酸は20種の天然に存在するアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸の数種は、当業者により十分に理解されるとおりグリコシル化されうる。より好ましい一態様において、該1ないし20個のアミノ酸はグリシン、アラニン、セリン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリシンから選択される。なおより好ましくは、リンカーは、グリシンおよびアラニンのような立体障害のない大多数のアミノ酸から構成される。従って、好ましいリンカーは、ポリ(Gly−Ser)、ポリグリシン(とりわけ(Gly)4、(Gly)5)、ポリ(Gly−Ala)およびポリアラニンである。リンカーの他の特定の例は:(Gly)3Lys(Gly)4(配列番号65)、(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(配列番号66)、(Gly)3Cys(Gly)4(配列番号67)およびGlyProAsnGlyGly(配列番号68)である。
His−Ala−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Ser−Tyr−Leu−Glu−Gly−Gln−Ala−Ala−Lys−Glu−Phe−Ile−Ala−Trp−Leu−Val−Lys−Gly−Arg−Gly
のアミノ酸配列を有する。
ミノ基若しくは末端カルボン酸基の1個若しくはそれ以上の化学修飾を付加的に有する分子と定義される。
Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons,Inc.、ニューヨーク州ニューヨーク(1987−2003);Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory
Manual、第2版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1989);HarlowとLane、Antibodies,a Laboratory Manual、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1989);Colliganら編、Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons,Inc.、ニューヨーク(1994−2003);Colliganら、Current Protocols in Protein Science、John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク(1997−2003)。
細書に記述されるところの酵素的切断、合成若しくは組換え技術により製造し得る。ミメティボディはまた、1個若しくはそれ以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して、多様な切断型でも製造し得る。ミメティボディの多様な部分を慣習的技術により化学的に一緒に結合し得るか、若しくは遺伝子工学技術を使用して連続した一タンパク質として製造し得る。例えば、ヒト抗体鎖の定常領域の少なくとも1つをコードする核酸を発現させて、本発明のミメティボディでの使用のための連続したタンパク質を製造し得る。例えば、一本鎖抗体に関して、Ladnerら、米国特許第4,946,778号明細書およびBird,R.E.ら、Science、242:423−426(1988)を参照されたい。
finity)すなわち親和性(avidity)を測定するのに使用されるところのいずれかの適する方法を使用して実験的に測定し得る。(例えば、Fundamental
Immunology、Paul,W.E.編、Raven Press:ニューヨーク州ニューヨーク(1984)中、Berzofskyら、“Antibody−Antigen Interactions,”;Kuby,Janis Immunology、W.H.Freeman and Company:ニューヨーク州ニューヨーク(1992);およびその中に記述される方法を参照されたい)。特定のGLP−1ミメティボディとリガンドの相互作用の測定される親和性は、異なる条件(例えば塩濃度、pH)下で測定される場合に変動し得る。従って、親和性および他のリガンド結合パラメータ(例えばKD、Ka、Kd)の測定は、好ましくは、GLP−1ミメティボディおよびリガンドの標準化された溶液、ならびに本明細書に記述されるか若しくは当該技術分野で既知の緩衝液のような標準化された緩衝液を用いて行う。
種のイントロンのような前述の付加的なコーディング配列を伴う若しくは伴わない融合ペプチドのコーディング配列のような付加的な配列;付加的な機能性を提供するもののような付加的なアミノ酸をコードする付加的なコーディング配列を挙げることができる。従って、GLP−1ミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアントをコードする配列は、融合されたGLP−1ミメティボディ、またはGLP−1ミメティボディフラグメント若しくは部分を含んでなる指定された部分若しくはバリアントの精製を容易にするペプチドをコードする配列のようなマーカー配列に融合させ得る。
組合せのような本発明の単離された核酸組成物は、当業者に既知のいずれかの数のクローニングの方法論を使用して生物学的供給源から得ることができる。いくつかの態様において、適する緊縮性の条件下で本発明のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用して、cDNA若しくはゲノムDNAライブラリー中の所望の配列を同定する。RNAの単離ならびにcDNAおよびゲノムライブラリーの構築は当業者に公知である。(例えば、Ausubel、上記;若しくはSambrook、上記を参照されたい)。
細胞などを包含し、これらは例えばAmerican Type Culture Collection、バージニア州マナサスから容易に入手可能である。好ましい宿主細胞は骨髄腫およびリンパ腫細胞のようなリンパ系起源の細胞を包含する。とりわけ好ましい宿主細胞は、P3X63Ag8.653細胞(ATCC受託番号CRL−1580)およびSP2/0−Ag14細胞(ATCC受託番号CRL−1851)である。
Protocols in Immunology、若しくはCurrent Protocols in Protein Science、John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク(1997−2003)、例えば第1、4、6、8、9、10章(それぞれ引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
全部は引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる)のような多くの標準的実験室手引書に記述されている。
ys、Asn、Arg、His、Glu若しくはAspであり;Xaa29はGly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Trp、Tyr、Phe、Pro、His、Glu、Asp若しくはLysであり;Xaa30はArg、His、Thr、Ser、Trp、Tyr、Phe、Glu、Asp若しくはLysであり;およびXaa31はGly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Trp、Tyr、Phe、His、Glu、Asp、Lysである)として現れる。
し得、また、κ若しくはλ L鎖の少なくとも一部分を含み得る。一態様において、ヒトGLP−1ミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアントは、アイソタイプ例えばIgG1、IgG2、IgG3若しくはIgG4の最低1種のIgG H鎖可変フラグメント、ヒンジ領域、CH2およびCH3を含んでなる。
(1種若しくは複数)
A Ala アラニン GCA、GCC、GCG、GCU
C Cys システイン UGC、UGU
D Asp アスパラギン酸 GAC、GAU
E Glu グルタミン酸 GAA、GAG
F Phe フェニルアラニン UUC、UUU
G Gly グリシン GGA、GGC、GGG、GGU
H His ヒスチジン CAC、CAU
I Ile イソロイシン AUA、AUC、AUU
K Lys リシン AAA、AAG
L Leu ロイシン UUA、UUG、CUA、CUC、
CUG、CUU
M Met メチオニン AUG
N Asn アスパラギン AAC、AAU
P Pro プロリン CCA、CCC、CCG、CCU
Q Gln グルタミン CAA、CAG
R Arg アルギニン AGA、AGG、CGA、CGC、
CGG、CGU
S Ser セリン AGC、AGU、UCA、UCC、
UCG、UCU
T Thr トレオニン ACA、ACC、ACG、ACU
V Val バリン GUA、GUC、GUG、GUU
W Trp トリプトファン UGG
Y Tyr チロシン UAC、UAU
255:306−312(1992))。
み得る。上の列挙された活性の最低1種を高め得るか若しくは維持し得る制限しないバリアントは、限定されるものでないが、前記GLP−1ミメティボディの適する生物学的活性若しくは機能に有意に影響を及ぼさない最低1個の置換、挿入若しくは欠失に対応する最低1個の突然変異をさらに含んでなる上のポリペプチドのいずれかを挙げることができる。
いる1個若しくはそれ以上の有機部分を含み得る。本発明のGLP−1ミメティボディ若しくはリガンド結合フラグメントに結合されている各有機部分は、独立に、親水ポリマー基、脂肪酸基若しくは脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用されるところの「脂肪酸」という用語はモノカルボン酸およびジカルボン酸を包含する。該用語が本明細書で使用されるところの「親水ポリマー基」は、オクタン中でよりも水中でより溶解性である有機ポリマーを指す。例えば、ポリリシンはオクタン中でよりも水中でより溶解性である。従って、ポリリシンの共有結合により修飾されたGLP−1ミメティボディは本発明により包含される。本発明のミメティボディを修飾するのに適する親水ポリマーは直鎖状若しくは分枝状であり得、そして、例えばポリアルカングリコール(例えばPEG、モノメトキシポリエチレングリコール(mPEG)、PPGなど)、炭水化物(例えばデキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など)、親水性アミノ酸のポリマー(例えばポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸など)、ポリアルカンオキシド(例えばポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど)およびポリビニルピロリドンを包含する。好ましくは、本発明のGLP−1ミメティボディを修飾する親水ポリマーは、別個の分子実体として約800ないし約150,000ダルトンの分子量を有する。例えば、PEG2500、PEG5000、PEG7500、PEG9000、PEG10000、PEG12500、PEG15000およびPEG20,000(ここで下付き数字はポリマーの平均分子量(ダルトン)である)を使用し得る。
反応させてホスホルアミデート若しくはホスホルイミド結合を形成させ得る。分子中への活性化基の適する導入方法は当該技術分野で既知である(例えば、Hermanson,G.T.、Bioconjugate Techniques、Academic Press:カリフォルニア州サンディエゴ(1996)を参照されたい)。活性化基は、有機基(例えば親水ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル)に直接、または、リンカー部分、例えば、1個若しくはそれ以上の炭素原子が酸素、窒素若しくはイオウのようなヘテロ原子により置換され得る二価のC1−C12基により結合し得る。適するリンカー部分は、例えば、テトラエチレングリコール、−(CH2)3−、−NH−(CH2)6−NH−、−(CH2)2−NH−および−CH2−O−CH2−CH2−O−CH2−CH2−O−CH−NH−を包含する。リンカー部分を含んでなる修飾剤は、例えば、モノ−Boc−アルキルジアミン(例えばモノ−Boc−エチレンジアミン、モノ−Boc−ジアミノヘキサン)を、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)の存在下に脂肪酸と反応させて、遊離アミンと脂肪酸のカルボキシレートの間でアミド結合を形成させることにより製造し得る。Boc保護基は、一級アミンを露出させるためのトリフルオロ酢酸(TFA)での処理により生成物から除去することができ、一級アミンは記述されるとおり別のカルボキシレートに結合させ得るか、若しくは、無水マレイン酸と反応させ得、そして生じる生成物を環化させて脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生じさせ得る(例えば、Thompsonら、第WO 92/16221号明細書(その教示全体は引用することにより本明細書に組み込まれる)を参照されたい。)。
気体若しくは乾燥溶液、混合物、懸濁液、乳液またはコロイドとして0.00001〜99.9999重量、容量、濃度、モル濃度若しくは重量モル濃度パーセントを含むことができ、その中のいずれかの範囲若しくは値で、例えば、限定されるものでないが0.00001、0.00003、0.00005、0.00009、0.0001、0.0003、0.0005、0.0009、0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9%を挙げることができる。本発明のこうした組成物は、従って、限定されるものでないが0.00001〜100mg/mlおよび/若しくは0.00001〜100mg/gを包含する。
、抗狭心症薬、降圧薬、抗高脂血症薬および雑多な心血管薬から選択される最低1種であり得る。CNS薬は、非麻薬性鎮痛薬から選択される最低1種、または解熱薬、非ステロイド性抗炎症薬、麻薬性若しくはオピオイド鎮痛薬、鎮痛睡眠薬、抗痙攣薬、抗うつ薬、抗不安薬、抗精神病薬、中枢神経系興奮薬、抗パーキンソン病薬および雑多な中枢神経系薬から選択される最低1種であり得る。ANS薬は、コリン作動薬(副交感神経興奮薬)、抗コリン薬、アドレナリン作動薬(交感神経興奮薬)、アドレナリン遮断薬(交感神経遮断薬)、骨格筋弛緩薬および神経筋遮断薬から選択される最低1種であり得る。気道薬は、抗ヒスタミン薬、気管支拡張薬、去痰薬若しくは鎮咳薬、および雑多な呼吸器官用薬から選択される最低1種であり得る。GI管薬は、制酸剤、吸着剤、抗鼓腸薬、消化酵素、胆石溶解剤、止瀉薬、緩下剤、制吐剤および抗潰瘍薬から選択される最低1種であり得る。ホルモン薬は、コルチコステロイド、アンドロゲン、蛋白同化ステロイド、エストロゲン、プロゲスチン、ゴナドトロピン、抗糖尿病薬、最低1種のグルカゴン、甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアンタゴニスト、下垂体ホルモンおよび副甲状腺様薬物から選択される最低1種であり得る。液体および電解質バランスのための薬物は、利尿薬、電解質、補給溶液(replacement solution)、酸性化薬およびアルカリ性化薬から選択される最低1種であり得る。血液製剤は、造血剤、抗凝固薬、血液誘導体および血栓溶解酵素から選択される最低1種であり得る。抗腫瘍薬は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗生物質性抗腫瘍薬、ホルモンバランスを変える抗腫瘍薬および雑多な抗腫瘍薬から選択される最低1種であり得る。免疫調節薬は、免疫抑制薬、ワクチン、類毒素、抗毒素、抗蛇毒、免疫血清および生物学的応答調節剤から選択される最低1種であり得る。眼、耳および鼻の薬物は、眼の抗感染薬、眼の抗炎症薬、縮瞳薬、散瞳薬、眼血管収縮薬および雑多な眼科用薬、耳用薬、鼻用薬から選択される最低1種であり得る。局所薬は、局所抗感染薬、抗疥癬薬、殺シラミ薬および局所コルチコステロイドから選択される最低1種であり得る。栄養薬はビタミン、ミネラルおよび熱素から選択される最低1種であり得る。例えば、Nursing 2001 Drug Handbook、上記の内容を参照されたい。
シリン二ナトリウム/クラブラン酸カリウムから選択される最低1種であり得る。最低1種のセファロスポリンは、セファクロル、セファドロキシル、セファゾリンナトリウム、セフジニル、塩酸セフェピム、セフィキシム、セフメタゾールナトリウム、セフォニシドナトリウム、セフォペラゾンナトリウム、セフォタキシムナトリウム、セフォテタン二ナトリウム、セフォキシチンナトリウム、セフポドキシムプロキセチル、セフプロジル、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシムナトリウム、セフトリアキソンナトリウム、セフロキシムアキセチル、セフロキシムナトリウム、塩酸セファレキシン、セファレキシン一水和物、セフラジン、ロラカルベフの最低1種から選択される最低1種であり得る。最低1種のテトラサイクリンは、塩酸デメクロサイクリン、ドキシサイクリンカルシウム、ドキシサイクリンヒクラート、塩酸ドキシサイクリン、ドキシサイクリン一水和物、塩酸ミノサイクリン、塩酸テトラサイクリンから選択される最低1種であり得る。最低1種のスルホンアミドは、コトリモオキサゾール(co−trimoxazole)、スルファジアジン、スルファメトオキサゾール、スルフイソオキサゾール、スルフイソオキサゾールアセチルから選択される最低1種であり得る。最低1種のフルオロキノロンは、メシル酸アラトロフロキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、レボフロキサシン、塩酸ロメフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、メシル酸トロバフロキサシンから選択される最低1種であり得る。最低1種のフルオロキノロンは、メシル酸アラトロフロキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、レボフロキサシン、塩酸ロメフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、メシル酸トロバフロキサシンから選択される最低1種であり得る。最低1種の抗ウイルス薬は、硫酸アバカビル、アシクロビルナトリウム、塩酸アマンタジン、アンプレナビル、シドフォビル、メシル酸デラビルジン、ジダノシン、エファビレンズ、ファムシクロビル、フォミビルセンナトリウム、ホスカルネットナトリウム、ガンシクロビル、硫酸インジナビル、ラミブジン、ラミブジン/ジドブジン、メシル酸ネルフィナビル、ネビラピン、リン酸オセルタミビル、リバビリン、塩酸リマンタジン、リトナビル、サキナビル、メシル酸サキナビル、スタブジン、塩酸バラシクロビル、ザルシタビン、ザナミビル、ジドブジンから選択される最低1種であり得る。最低1種のマクロライン抗感染薬は、アジトロマイシン、クラリスロマイシン、ジリトロマイシン、エリスロマイシン塩基、エリスロマイシンエストレート、エチルコハク酸エリスロマイシン、ラクトビオン酸エリスロマイシン、ステアリン酸エリスロマイシンから選択される最低1種であり得る。最低1種の雑多な抗感染薬は、アズトレオナム、バシトラシン、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、塩酸クリンダマイシン、塩酸パルミチン酸クリンダマイシン、リン酸クリンダマイシン、イミペネムおよびシラスタチンナトリウム、メロペネム、ニトロフラントイン大結晶、ニトロフラントイン微結晶、キヌプリスチン/ダルホプリスチン、塩酸スペクチノマイシン、トリメトプリム、塩酸バンコマイシンから選択される最低1種であり得る(例えばNursing 2001 Drug Handbookのpp.24〜214を参照されたい。)。
酸ベナゼプリル、塩酸ベタキソロール、フマル酸ビソプロロール、カンデサルタンシレキセチル、カプトプリル、塩酸カルテオロール、カルベジロール、クロニジン、塩酸クロニジン、ジアゾキシド、塩酸ジルチアゼム、メシル酸ドキサゾシン、エナラプリラート、マレイン酸エナラプリル、メシル酸エプロサルタン、フェロジピン、メシル酸フェノルドパム、ホシノプリルナトリウム、酢酸グアナベンズ、硫酸グアナドレル、塩酸グアンファシン、塩酸ヒドララジン、イルベサルタン、イスラジピン、塩酸ラベタロール、リシノプリル、ロサルタンカリウム、メチルドパ、メチルドペート(methyldopate)塩酸塩、コハク酸メトプロロール、酒石酸メトプロロール、ミノキシジル、塩酸モエキシプリル、ナドロール、塩酸ニカルジピン、ニフェジピン、ニソルジピン、ニトロプルシドナトリウム、硫酸ペンブトロール、ペリンドプリルエルブミン、メシル酸フェントラミン、ピンドロール、塩酸プラゾシン、塩酸プロプラノロール、塩酸キナプリル、ラミプリル、テルミサルタン、塩酸テラゾシン、マレイン酸チモロール、トランドラプリル、バルサルタン、塩酸ベラパミルから選択される最低1種であり得る。最低1種の抗高脂血症薬は、アトロバスタチンカルシウム、セリバスタチンナトリウム、コレスチラミン、塩酸コレスチポール、フェノフィブラート(微粉末)、フルバスタチンナトリウム、ゲムフィブロジル、ロバスタチン、ナイアシン、プラバスタチンナトリウム、シンバスタチンから選択される最低1種であり得る。最低1種の雑多なCV薬は、アブシキシマブ、アルプロスタジル、塩酸アルブタミン、シロスタゾール、重硫酸クロピドグレル、ジピリダモール、エプチフィバチド、塩酸ミドドリン、ペントキシフィリン、塩酸チクロピジン、塩酸チロフィバンから選択される最低1種であり得る(例えば、Nursing 2001 Drug
Handbookのpp.215〜336を参照されたい。)。
ジン、塩酸セルトラリン、硫酸トラニルシプロミン、マレイン酸トリミプラミン、塩酸ベンラファキシンから選択される最低1種であり得る。最低1種の抗不安薬は、アルプラゾラム、塩酸ブスピロン、クロルジアズGLP−1キシド(chlordiazGLP−1xide)、塩酸クロルジアズGLP−1キシド(chlordiazGLP−1xide)、クロラゼプ酸二カリウム、ジアゼパム、塩酸ドキセピン、ヒドロキシジンエンボネート、塩酸ヒドロキシジン、パモ酸ヒドロキシジン、ロラゼパム、メフロバメート、塩酸ミダゾラム、オキサゼパムから選択される最低1種であり得る。最低1種の抗精神病薬は、塩酸クロルプロマジン、クロザピン、デカン酸フルフェナジン、エナント酸フルエフェナジン、塩酸フルフェナジン、ハロペリドール、デカン酸ハロペリドール、乳酸ハロペリドール、塩酸ロキサピン、コハク酸ロキサピン、ベシル酸メソリダジン、塩酸モリンドン、オランザピン、ペルフェナジン、ピモジド、プロクロルペラジン、フマル酸ケチアピン、リスペリドン、塩酸チオリダジン、チオチキセン、塩酸チオチキセン、塩酸トリフロペラジンから選択される最低1種であり得る。最低1種の中枢神経系興奮薬は、硫酸アンフェタミン、カフェイン、硫酸デキストロアンフェタミン、塩酸ドキサプラム、塩酸メタンフェタミン、塩酸メチルフェニデート、モダフィニル、ペモリン、塩酸フェンテルミンから選択される最低1種であり得る。最低1種の抗パーキンソン病薬は、塩酸アマンタジン、メシル酸ベンズトロピン、塩酸ビペリデン、乳酸ビペリデン、メシル酸ブロモクリプチン、カルビドパ−レボドパ、エンタカポン、レボドパ、メシル酸ペルゴリド、二塩酸プラミペキソール(pramipexole dihydrochloride)、塩酸ロピニロール、塩酸セレギリン、トルカポン、塩酸トリヘキシフェニジルから選択される最低1種であり得る。最低1種の雑多な中枢神経系薬は、塩酸ブプロピオン、塩酸ドネペジル、ドロペリドール、マレイン酸フルボキサミン、炭酸リチウム、クエン酸リチウム、塩酸ナラトリプタン、ニコチンポラクリレックス、ニコチン経皮系、プロポフォール、安息香酸リザトリプタン、塩酸シブトラミン一水和物、コハク酸スマトリプタン、塩酸タクリン、ゾルミトリプタンから選択される最低1種であり得る(例えば、Nursing 2001 Drug Handbookのpp.337〜530を参照されたい。)。
拡張薬は、アルブテロール、硫酸アルブテロール、アミノフィリン、硫酸アトロピン、硫酸エフェドリン、エピネフリン、酒石酸水素エピネフリン、塩酸エピネフリン、臭化イプラトロピウム、イソプロテレノール、塩酸イソプロテレノール、硫酸イソプロテレノール、塩酸レバルブテロール、硫酸メタプロテレノール、オキシトリフィリン、酢酸ピルブテロール、キシナホ酸サルメテロール、硫酸テルブタリン、テオフィリンから選択される最低1種であり得る。最低1種の去痰薬若しくは鎮咳薬は、ベンゾナテート、リン酸コデイン、硫酸コデイン、臭化水素酸デキストラメトルファン、塩酸ジフェンヒドラミン、グアイフェネシン、塩酸ヒドロモルホンから選択される最低1種であり得る。最低1種の雑多な呼吸器官用薬は、アセチルシステイン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ベラクタント、ブデソニド、カルファクタント、クロモリンナトリウム、ドルナーゼα、GLP−1プロステノールナトリウム(GLP−1prostenol sodium)、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、モンテルカストナトリウム、ネドクロミルナトリウム、パリビズマブ、トリアムシノロンアセトニド、ザフィルルカスト、ジロートンから選択される最低1種であり得る(例えば、Nursing 2001 Drug Handbookのpp.585〜642を参照されたい。)。
経皮系から選択される最低1種であり得る。最低1種のエストロゲン若しくはプロゲスチンは、エステル化エストロゲン、エストラジオール、エストラジオールシピオナート、エストラジオール/酢酸ノルエチンドロン経皮系、吉草酸エストラジオール、エストロゲン(抱合)、エストロピペート、エチニルエストラジオール、エチニルエストラジオールとデソゲストレル、エチニルエストラジオールと酢酸エチノジオール、エチニルエストラジオールとデソゲストレル、エチニルエストラジオールと酢酸エチノジオール、エチニルエストラジオールとレボノルゲストレル、エチニルエストラジオールとノルエチンドロン、エチニルエストラジオールと酢酸ノルエチンドロン、エチニルエストラジオールとノルゲスチメート、エチニルエストラジオールとノルゲストレル、エチニルエストラジオールとノルエチンドロンならびに酢酸およびフマル酸鉄、レボノルゲストレル、酢酸メドロキシプロゲステロン、メストラノールとノルエチンドロン、ノルエチンドロン、酢酸ノルエチンドロン、ノルゲストレル、プロゲステロンから選択される最低1種であり得る。最低1種のゴナドロプトロピンは、酢酸ガニレリックス、酢酸ゴナドレリン、酢酸ヒストレリン、メノトロピンから選択される最低1種であり得る。最低1種の抗糖尿病薬若しくはグルカオンは、アカルボース、クロルプロパミド、グリメピリド、グリピジド、グルカゴン、グリブリド、インスリン、塩酸メトフォルミン、ミグリトール、塩酸ピオグリタゾン、レパグリニド、マレイン酸ロシグリタゾン、トログリタゾンから選択される最低1種であり得る。最低1種の甲状腺ホルモンは、レボチロキシンナトリウム、リオチロニンナトリウム、リオトリックス、甲状腺製剤から選択される最低1種であり得る。最低1種の甲状腺ホルモンアンタゴニストは、メチマゾール、ヨウ化カリウム、ヨウ化カリウム(飽和溶液)、プロピルチオウラシル、放射活性ヨウ素(ヨウ化ナトリウム131I)、濃ヨウ素溶液(strong iodine solution)から選択される最低1種であり得る。最低1種の下垂体ホルモンは、コルチコトロピン、コシントロピン、酢酸デスモフレシン、酢酸リュープロリド、rGLP−1シトリー(rGLP−1sitory)コルチコトロピン、ソマトレム、ソマトロピン、バソプレシンから選択される最低1種であり得る。最低1種の副甲状腺様薬物は、カルシフェジオール、カルシトニン(ヒト)、カルシトニン(サケ)、カルシトリオール、ジヒドロタキステロール、エチドロン酸二ナトリウムから選択される最低1種であり得る(例えば、Nursing 2001 Drug Handbookのpp.696〜796を参照されたい。)。
Drug Handbookのpp.797〜833を参照されたい。)。
薬(anti−inhibitor coagulant)複合体、アンチトロンビンIII(ヒト)、第IX因子(ヒト)、第IX因子複合体、血漿タンパク質画分から選択される最低1種であり得る。最低1種の血栓溶解酵素は、アルテプラーゼ、アニストレプラーゼ、レテプラーゼ(組換え)、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼから選択される最低1種であり得る(例えば、Nursing 2001 Drug Handbookのpp.834〜66を参照されたい。)。
蛇毒は、クロゴケグモ抗蛇毒、マムシ科(Crotalidae)抗蛇毒(多価)、ジフテリア抗毒素(ウマ)、アメリカサンゴヘビ(Micrurus fulvius)抗蛇毒から選択される最低1種であり得る)。最低1種の免疫血清は、サイトメガロウイルス免疫グロブリン(静脈内)、B型肝炎免疫グロブリン(ヒト)、免疫グロブリン筋肉内、免疫グロブリン静脈内、狂犬病免疫グロブリン(ヒト)、RSウイルス免疫グロブリン静脈内(ヒト)、Rh0(D)免疫グロブリン(ヒト)、Rh0(D)免疫グロブリン静脈内(ヒト)、破傷風免疫グロブリン(ヒト)、水痘・帯状ヘルペス免疫グロブリンから選択される最低1種であり得る。最低1種の生物学的応答調節物質は、アルデスロイキン、GLP−1エチンα(GLP−1etin alfa)、フィルグラスチム、注射用酢酸グラチラマー、インターフェロンアルファコン−1、インターフェロンα−2a(組換え)、インターフェロンα−2b(組換え)、インターフェロンβ−1a、インターフェロンβ−1b(組換え)、インターフェロンγ−1b、塩酸レバミソール、オプレルベキン、サルグラモスチムから選択される最低1種であり得る(例えば、Nursing 2001 Drug Handbookのpp.964〜1040を参照されたい。)。
ン、リンダン、ペルメトリンおよびピレトリンから選択される最低1種であり得る。最低1種の局所コルチコステロイドは、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメサゾン、リン酸デキサメサゾンナトリウム、酢酸ジフロラゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルランドレノリド、プロピオン酸フルチカゾン、ハルシオニド、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、吉草酸ヒドロコルチゾン、フロ酸モメタゾン、トリアムシノロンアセトニドから選択される最低1種であり得る(例えば、Nursing 2001 Drug Handbookのpp.1098〜1136を参照されたい。)。
したサイトカインの制限しない例は、限定されるものでないがIL−1ないしIL−23のいずれかを挙げることができる。適する投薬量は当該技術分野で公知である。例えば、Wellsら編、Pharmacotherapy Handbook、第2版、Appleton and Lange、コネチカット州スタンフォード(2000);PDR
Pharmacopoeia,Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000、豪華版、Tarascon Publishing、カリフォルニア州ロマリンダ(2000)(それらの参考文献のそれぞれは引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
属(Klebsiella)スピーシーズ、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)および連鎖球菌(Streptococci)の株を挙げることができる。例えば、Stein編、INTERNAL MEDICINE、第3版、pp 1−13、Little,Brown and Co.、ボストン、(1990);Evansら編、Bacterial Infections of Humans:Epidemiology and Control、第2版、pp 239−254、Plenum
Medical Book Co.、ニューヨーク(1991);Mandellら、Principles and Practice of Infectious Diseases、第3版、Churchill Livingstone、ニューヨーク(1990);Berkowら編、The Merck Manual、第16版、Merck and Co.、ニュージャージー州ローウェー、1992;Woodら、FEMS Microbiology Immunology、76:121−134(1991);Marrackら、Science、248:705−711(1990)(それらの参考文献の内容は引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸若しくはフタル酸の塩のような有機酸の塩;トリス、塩酸トロメタミン若しくはリン酸緩衝液を包含する。本組成物での使用に好ましい緩衝剤はクエン酸塩のような有機酸塩である。
75、0.9、1.0%)などを包含する。
アルコール、他のブロックコポリマーのような非イオン性界面活性剤、ならびにEDTAおよびEGTAのようなキレート剤のような他の添加物を、凝集を低下させるために該製剤若しくは組成物に場合によっては添加し得る。これらの添加物は、ポンプ若しくはプラスチック容器を使用して製剤を投与する場合にとりわけ有用である。製薬学的に許容できる界面活性剤の存在は、タンパク質が凝集する傾向を緩和する。
た部分若しくはバリアントのバイアルを含んでなる2本のバイアルとして、患者に提供し得る。単一の溶液バイアル若しくは再構成を必要とする2本のバイアルのいずれも複数回再使用し得、かつ、単一若しくは複数周期の患者処置に十分であり得、そして従って現在利用可能よりも便宜的な処置レジメンを提供する。
物の有効量を、こうした調節、処置若しくは治療の必要な細胞、組織、器官、動物若しくは患者に投与することを場合によっては含み得る。
用量はGLP−1に対する活性において同等であることができ、0.1単位/mlから20単位/mlまで、好ましくは0.5単位/mlから2単位/mlまで、またはその中のいずれかの範囲若しくは値で使用し得る。
Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1988;Colliganら編、Current Protocols in Immunology、Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience、ニューヨーク、(1992−2003);Kozborら、Immunol.Today、4:72−79(1983);Ausubelら編 Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience、ニューヨーク(1987−2003);およびMuller、Meth.Enzymol.、92:589−601(1983)(それらの参考文献は引用することによりそっくりそのまま本明細書
に組み込まれる)に見出し得る。
G融合タンパク質である。TNF免疫受容体融合分子およびそれらの製造方法は、当該技術分野(Lesslauerら、Eur.J.Immunol.21:2883−2886(1991);Ashkenaziら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535−10539(1991);Peppelら、J.Exp.Med.174:1483−1489(1991);Kollsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:215−219(1994);Butlerら、Cytokine 6(6):616−623(1994);Bakerら、Eur.J.Immunol.24:2040−2048(1994);Beutlerら、米国特許第5,447,851号明細書;および米国特許出願第08/442,133号明細書(1995年5月16日出願)(それらの参考文献のそれぞれは引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる))で記述されている。免疫受容体融合分子の製造方法は、Caponら、米国特許第5,116,964号明細書;Caponら、米国特許第5,225,538号明細書;およびCaponら、Nature 337:525−531(1989)(それらの参考文献は引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる)にもまた見出し得る。
Wiley−Interscience、ニューヨーク(1987−2003)を参照されたい。
および好ましくは単回若しくは複数回投与あたりに患者1キログラムあたり最低約0.001から100ミリグラムまでのGLP−1ミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアントの範囲になる最低1種のGLP−1ミメティボディ組成物の有効量若しくは投薬量を投与することにより遂げられる。あるいは、有効血清濃度は、単回若しくは複数回投与あたり0.001〜5000μg/mlの血清濃度を含み得る。適する投薬量は医学実務者に既知であり、そしてもちろん、特定の疾患状態、投与されている組成物の比活性、および処置を受ける特定の患者に依存することができる。いくつかの例において、所望の治療量を達成するために、反復投与、すなわち所望の毎日の用量若しくは効果が達成されるまで個々の投与を反復する特定のモニター若しくは計測された用量の反復個別投与を提供することが必要であり得る。
、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39若しくは40日の最低1つ、または、あるいは、第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20週の最低1つ、あるいはそれらのいずれかの組合せでの、本発明の最低1種のGLP−1ミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアントを1日あたり0.0002、0.0003、0.0004、0.0005.0.0006、0.0007、0.0008、00009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05.0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10mg/kgのような0.0001ないし100mg/kgの一時若しくは定期的投薬量として提供し得る。
りそのまま本明細書に組み込まれる)に記述されるところのレーザー穿孔器装置を挙げることができる。
ま本明細書に組み込まれる)のようなネブライザーは溶液からエアゾルを生じさせる一方、計量式吸入器、乾燥粉末吸入器などは小粒子エアゾルを生成させる。商業的に入手可能な吸入装置のこれらの特定の例は、本発明の実務に適する特定の装置の代表例であることを意図しており、そして本発明の範囲を制限するとして意図していない。好ましくは、最低1種のGLP−1ミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアントを含んでなる組成物は、乾燥粉末吸入器若しくは噴霧器により送達される。本発明の最低1種のGLP−1ミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアントを投与するための吸入装置のいくつかの望ましい特徴が存在する。例えば、吸入装置による送達は有利に信頼でき、再現可能かつ正確である。吸入装置は、場合によっては、良好な呼吸可能性のため小さな乾燥粒子、例えば約10μm未満、好ましくは約1〜5μmを送達し得る。
使用してオリフィスを通して高速の空気ジェットを創製する。ガスがノズルを超えて膨脹する際に低圧領域が創製され、それが液体リザーバに接続された毛細管を通してGLP−1ミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアント組成物タンパク質の溶液を引き出す。毛細管からの液体流は、それが管を出る際に不安定な糸状体および液滴に剪断されてエアゾルを創製する。ある範囲の構成、流速およびバッフル型を使用して、所定のジェットネブライザーから所望の性能の特徴を達成し得る。超音波ネブライザーにおいては、高周波電気エネルギーを使用して、典型的には圧電トランスを使用して、振動性の力学的エネルギーを創製する。このエネルギーが、直接若しくはカップリング液によるかのいずれかでGLP−1ミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアント組成物タンパク質の製剤に伝播されて、GLP−1ミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアント組成物タンパク質を包含するエアゾルを創製する。有利には、ネブライザーにより送達されるGLP−1ミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアント組成物タンパク質の粒子は、約10μm未満、好ましくは約1μmないし5μm未満、および最も好ましくは約2μmないし約3μmの範囲の粒子径を有する。
つハイドロフルオロカーボン噴射剤を使用するものを包含する。
典型的な哺乳動物発現ベクターは、mRNAの転写の開始を媒介する最低1個のプロモーター要素、GLP−1ミメティボディまたは指定された部分若しくはバリアントのコーディング配列、ならびに転写の終止および転写物のポリアデニル化に必要とされるシグナルを含有する。付加的な要素は、エンハンサー、コザック配列、ならびにRNAスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位により隣接される介在配列を包含する。高度に効率的な転写は、SV40からの初期および後期プロモーター、レトロウイルス、例えばRSV、HTLVI、HIVIからの末端反復配列(LTRS)、ならびにサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーターで達成し得る。しかしながら細胞要素もまた使用し得る(例えばヒトアクチンプロモーター)。本発明の実施における使用に適する発現ベクターは、例えば、pIRES1neo、pRetro−Off、pRetro−On、PLXSN若しくはpLNCX(Clonetech Labs、カリフォルニア州パロアルト)、pcDNA3.1(+/−)、pcDNA/Zeo(+/−)若しくはpcDNA3.1/Hygro(+/−)(Invitrogen)、PSVLおよびPMSG(Pharmacia、スウェーデン・ウプサラ)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)ならびにpBC12MI(ATCC 67109)のようなベクターを包含する。使用し得る哺乳動物宿主細胞は、ヒトHela 293、H9およびJurkat細胞、マウスNIH3T3およびC127細胞、Cos 1、Cos 7およびCV 1、ウズラQC1−3細胞、マウスL細胞ならびにチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を包含する。
スター卵巣若しくは他の細胞は、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択培地(例えばα−MEM、Life Technologies、メリーランド州ゲイタースバーク)中で細胞を増殖させることにより選択し得る。メトトレキサート(MTX)に耐性の細胞中でのDHFR遺伝子の増幅は十分に報告されている(例えば、F.W.Altら、J.Biol.Chem.253:1357−1370(1978);J.L.HamlinとC.Ma、Biochem.et Biophys.Acta 1097:107−143(1990);およびM.J.PageとM.A.Sydenham、Biotechnology 9:64−68(1991)を参照されたい)。増大する濃度のMTX中で増殖させた細胞は、DHFR遺伝子の増幅の結果として標的酵素DHFRを過剰産生することにより該薬物に対する耐性を発生する。第二の遺伝子がDHFR遺伝子に連結される場合、それは通常共増幅かつ過剰発現される。1,000コピー以上の増幅された遺伝子(1種若しくは複数)を保有する細胞株を開発するのにこのアプローチを使用し得ることが当該技術分野で既知である。その後、メトトレキサートを取り去る場合に、宿主細胞の1個若しくはそれ以上の染色体に組込まれた増幅された遺伝子を含有する細胞株が得られる。
41:521−530(1985))を含有する。プロモーターの下流に、遺伝子の組込みを可能にするBamHI、XbaIおよびAsp7l8制限酵素切断部位がある。これらのクローニング部位の後ろに、該プラスミドは3’イントロンおよびラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化部位を含有する。他の高効率プロモーター、例えばヒトb−アクチンプロモーター、SV40初期若しくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス例えばHIVおよびHTLVIからの末端反復配列もまた発現に使用し得る。ClontechのTet−OffおよびTet−On遺伝子発現系ならびに類似の系を、GLP−1を哺乳動物細胞中で調節された方法で発現させるのに使用し得る(M.GossenとH.Bujard、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547−5551(1992))。mRNAのポリアデニル化のため、例えばヒト成長ホルモン若しくはグロビン遺伝子からの他のシグナルを同様に使用し得る。染色体中に組込まれた目的の遺伝子を保有する安定細胞株は、gpt、G418若しくはハイグロマイシンのような選択可能なマーカーとのコトランスフェクションに際してもまた選択し得る。初めに1種以上の選択可能なマーカー、例えばG418およびメトトレキサートを使用することが有利である。
GLP−1は経口グルコース投与後に腸のL細胞から分泌される37アミノ酸のペプチドである。生物学的に活性のGLP−1(7−37)ペプチド、バリアント若しくは誘導体を組込むミメティボディ構築物は、該ペプチドのin vivo寿命を延長しかつ2型糖尿病患者において血糖を低下させるための新規療法を提供すると期待される。天然のGLP−1(7−37)ペプチド若しくはDPP−IV抵抗性アナログをコードするペプチドをミメティボディの足場構造中に組込み得る。これらの分子のいくつかを作成し、そして、生じるミメティボディは機能的なin vitroの細胞に基づくアッセイで活性を示した。多様なin vitroアッセイおよびin vivoモデルをこれらの研究で使用し得、そして効力は相互に若しくは本明細書に提示される結果と比較可能でないかもしれないことに注意すべきである。
の変形物)を使用し得る。
((P(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、[式中、Pは1コピーの生物活性GLP−1ペプチド(7−36)であり、LはGly−Ser若しくはGly−Gly−Gly−Serいずれかのフレキシブルリンカーのタンデム反復であり、VはVH配列のC末端すなわち天然に存在するIgGのJ領域であり、Hは完全なIgG1ヒンジ領域であり、そしてCH2およびCH3はIgG1アイソタイプサブクラスのものである]
のGLP−1ミメティボディ構築物(配列番号2)である。この構築物の半減期は、GLP−1ペプチド単独またはそのバリアント若しくは誘導体のものの多数倍でありかつIgGのものに類似であろうことが期待される。
して細胞のプロセシングの間に集成されてホモ二量体を形成することが公知である。改変されたペプチド間でもまたこれが生じて集成されたGLP−1ミメティボディ構築物を形成するであろうことが期待される。加えて、GLP−1ペプチド中の2個のシステイン間の鎖内ジスルフィド結合もまた生じるであろうことが期待される。GLP−1ミメティボディの期待される構造は2個のGLP−1ペプチドを含有する。結合する配列の柔軟性と一緒のN末端のペプチドの空間的配置が、該ペプチドが生物活性二量体を形成することを可能にするはずである。
GLP−1ミメティボディの活性をin vitro FACS結合アッセイで試験した。GLP−1 MMBがGLP−1Rを結合するかどうかを決定するため、GLP−1Rを過剰発現するHEK293細胞(1×106細胞)をGLP−1 MMB(20nM)と4℃で2時間インキュベートした。細胞を洗浄し、そして蛍光標識した二次検出抗体(1μg/mLヤギ抗ヒトIgG、Fc γ特異的)を4℃で30分間添加した。フローサイトメトリーを介して細胞の蛍光強度をモニターした。図2Aは、GLP−1 MMBがGLP−1Rを過剰発現するHEK293細胞に結合することを示す(灰色、GLP−1 MMBしかし二次なし;黒色、二次のみ;赤色、陰性対照MMBおよび二次;青色、GLP−1 MMBおよび二次)。図2Bは、GLP−1 MMBが対照HEK293細胞に結合しないことを示す(灰色、GLP−1 MMBしかし二次なし;黒色、二次のみ;青色、GLP−1 MMBおよび二次)。図2Cは、GLP−1ペプチドアナログ(A2S)がGLP−1Rを過剰発現するHEK293細胞への結合についてGLP−1 MMBと競合することが可能であることを示す(灰色、GLP−1 MMBしかし二次なし;黒色、GLP−1 MMBおよび二次;橙色、GLP−1 MMB、0.2nM競合体、二次;青色、GLP−1 MMB、20nM競合体、二次;赤色、GLP−1 MMB、100nM競合体、二次)。
GLP−1は、その受容体、Gタンパク質共役型受容体に結合してシグナル伝達分子3’,5’−環状AMP(cAMP)の用量依存性の増加をもたらす。cAMPはGLP−1Rを発現する細胞中でのin vitroアッセイ(Applied Biosystems)で測定し得る。簡潔には、Rinm細胞(100,000細胞)を、増大する濃度のGLP−1ペプチド(0〜30nM)若しくはGLP−1 MMB(0〜100nM)とともにインキュベートした。細胞を溶解し、そして、アルカリホスファターゼ標識cAMP複合物および化学発光基質(Tropix(R) CDPD(R))を使用する競合アッセイを使用して、cAMPの量を測定した。wt GLP−1 MMBの濃度依存性のcAMP活性(図3A)はGLP−1ペプチド(図3B)に匹敵する(それぞれ、EC50=11nM対0.4nM)。類似の実験において、IgG4の足場構造中のGLP−1(A2G)MMB(図3C)およびIgG4の足場構造中のGLP−1(A2S)MMB(図3D)は、双方とも、Rinm細胞中のcAMPレベルをIgG4の足場構造中のwt
GLP−1 MMBよりも有意により高レベルまで増大させた。
GLP−1はDPP−IVにより急速に不活性化されるため、無傷の(すなわち切断されない)GLP−1 MMBを定量するためのin vitroアッセイを確立した。簡潔には、GLP−1 MMB若しくはペプチド(1.2nM)をDPP−IV(1μg/mL、R&D Systems)と室温でインキュベートした。多様な時間(0、5、10、15、20、30、40分)後に、DPP−IV阻害剤(100μM、Linco)
を添加して反応をクエンチした。無傷のGLP−1 MMB若しくはペプチドの量を、GLP−1 Active ELISA(Linco)、およびそれぞれの標準曲線についてのGLP−1 MMB若しくはペプチドを使用して測定した。図4は、GLP−1 MMBがGLP−1ペプチドに関してDPP−IVによる切断に対し有意により抵抗性であったことを示す。
他の血清プロテアーゼがGLP−1 MMBを切断かつ不活性化することが可能でなかったことを確認するために、血清中でのGLP−1 MMBの安定性もまた測定した。簡潔には、GLP1ペプチド若しくはGLP1 MMB(30nM)をヒト血清中37℃でインキュベートした。多様な時間後に、反応をDPP−IV阻害剤(100μM、Linco)でクエンチし、そしてLincoからのGLP−1 Active ELISAを使用してサンプルを分析した。図5は、GLP−1 MMBがヒト血清中で24時間安定である一方、ペプチドは迅速に崩壊されることを示す。
インスリン分泌におけるGLP−1 MMBの効果を試験するため、RINm細胞を、増大する濃度のGLP−1(7−36)ペプチド(0〜5nM)、エキセンジン−4ペプチド(0〜5nM)、または多様なGLP−1ミメティボディ(5若しくは50nM)で処理し、そして分泌されるインスリンの量をELISAを介して測定した。試験した全部のGLP−1 MMBは、RINm細胞中のインスリン分泌の刺激において活性を有した(図6)。50nMで、MMBは野性型GLP−1(7−36)ペプチドのものに匹敵する活性を有した。
6週齢のdb/dbマウスを2時間絶食させ、そしてその後、ベヒクル、GLP−1ペプチド若しくはGLP−1(A2S)MMBを静脈内投与した。血糖を投与後0.5、1、2、3および4時間にモニターした。GLP−1ペプチドは30分で血糖を低下させたが、しかし、60分までに、ありそうにはGLP−1ペプチドの短い半減期により血糖が再度増大し始めた。相対的に、GLP−1ペプチドの用量より100倍より低い用量のGLP−1(A2S)MMBは、4時間全体を通じて血糖の低下を誘発した(図7A)。加えて、血糖の低下は用量依存的であった(図7B)。
4種のGLP−1ミメティボディ(A2G、A2S、エキセジン(exedin)−capおよびwt)の薬物動態を測定するため、C57/Bl6マウスに1mg/kgのMMBを静脈内投与した。多様な時点でマウスを殺した後に心穿刺を介して血漿を得た。多様なELISAを使用して、Fc、全MMB、活性MMB、およびそれらが動物中で代謝されたところの活性ペプチドを測定した。活性のMMBは、ミメティボディのFc領域になお結合されている該ペプチドの無傷のN末端を反映する。該ペプチド中の第二のアミノ酸(アラニン)のセリン若しくはグリシンいずれかでの置換は、循環中の活性のMMBの寿命を延長した。
るとおり、全4種のMMBは、急速な分布期、次いでよりゆっくりとした消失期を表す。薬物動態定数を構築物のそれぞれについて計算し、T=0からT=120時間までのAUCにより決定される類似の曝露を伴い、およそ3日のT1/2を示した。
8週齢の糖尿病db/dbマウスを、GLP−1 MMB(0.02ないし2mg/kg)の皮下注入前に6時間絶食させた。投与後にマウスを追加の6時間絶食させ、そして基礎の空腹時血糖を測定した。t=0に、マウスに1.0mg/gグルコースの経口胃管栄養を与え、そして多様な時点に血糖を測定した。図9に示される結果は、GLP−1 MMBが試験した全用量で経口耐糖能試験の間にグルコース逸脱の低下において有効であったことを示す。
10週齢の糖尿病db/dbマウスに、ベヒクル若しくはGLP−1 MMB(1mg/kg)を連日6週間皮下投与した。試験の経過の間に空腹時血糖を週2回測定した。空腹時血糖は、試験を通じて、処置した動物で対照に関して低下し(図10)、そして、6週までに、該差違は200mg/dL(466対221mg/dL、それぞれ対照および処置動物)以上となった。
実施例11でのとおり、10週齢の糖尿病db/dbマウスにベヒクル若しくはGLP−1 MMB(1mg/kg)を連日6週間投与した。投与40日後に、マウスに経口耐糖能試験を行った。簡潔には、t=0、に、マウスに1.0mg/gグルコースの経口胃管栄養を与え、そして多様な時点で血糖を測定した。図11に示される結果は、GLP−1 MMBが経口耐糖能試験の間のグルコース逸脱の低下において有効であったことを示し、GLP−1 MMBで慢性に処置したマウスが対照動物に関してより効率的にグルコース負荷を消失させることが可能であることを示唆する。
実施例11および12でのとおり、10週齢の糖尿病db/dbマウスにベヒクル若しくはGLP−1 MMB(1mg/kg)を連日6週間投与した。6週の投与の前および後に全血サンプルを採取し、そしてHbA1cパーセントについて分析した。図12に示されるとおり、GLP−1処置動物のHbA1Cは6週間に109パーセント増大した一方、対照処置動物は142パーセント増大した。このデータは、処置動物が、慢性期にわたりそれらの血糖を調節することが対照に関してより良好に可能であることを示唆する。
経口耐糖能試験(OGTT)を、GLP−1 MMB(1mg/kg)の単回用量前および6日後に正常カニクイザルで行った。簡潔には、t=0に、サルに2.0mg/gグルコースの経口胃管栄養を与え、そして多様な時点で血糖を測定した。血糖値は投与6日後に行ったOGTTで有意に低下され(図13A)、また、インスリンレベルは有意に増大された(図13B)。これは、GLP−1 MMBが、上昇されたグルコース濃度で膵からのインスリン分泌を引き起こしていることを示唆する。
MMBの効果
12週齢の糖尿病マウス(db/db)をGLP−1MMB(1.5mg/kg)の単回皮下用量で処置し、そして膵を4週後に収集した。膵を切断し、そしてインスリンの存在について染色した。図14に示されるとおり、処置動物で対照動物に関して有意により多いインスリン染色が存在した。
胃カニュ―レを全身麻酔下に雌性ビーグル犬(10〜15kg)に外科的に移植し、そして最低2週間回復させた。イヌを24時間絶食させ、その後水は自由に入手可能であった。胃カニューレを開放し、そして胃液および食物の残りを40〜50mlの微温湯で除去した。6匹のイヌの群に、食餌の60分前にα2アゴニスト、リダミジン(0.63mg/kg)を皮下投与した(胃排出の遅延の陽性対照)。ベヒクル対照若しくはGLP−1 MMB(0.1mg/kg)を投与したイヌに、食餌の15分前に橈側皮静脈に静脈内投与した。食餌の5分前に胃カニューレを開放して、基礎値の胃中に存在する液体の量を測定し、そして液体を迅速に再導入した。その後、250mlのグルコース溶液(5g/l)よりなる試験食を、カニューレを介して投与し、そして胃中に30分間留まらせた。30分後に胃内容物を胃から排出させて総容量を測定した。1mlの胃内容物を分析のため保持し、そして残りの容量はカニューレを介して胃に再導入した。胃内容物の容量の評価およびサンプルの回収を、60、90および120分に反復した。収集したサンプルについてグルコース濃度を評価し、そして各時点で胃中に残存するグルコースの絶対量を決定するのに使用した。胃中に保持されるグルコースのパーセンテージを出発値および各時点のグルコースの濃度から決定し、そして時間の関数としてプロットした。胃内容物の50%が保持された時間を、単指数関数への曲線の当てはめにより決定した。図15に示されるとおり、胃内容物の50%は、ベヒクルを投与したイヌで12.35±3.69分後に排出された一方、リダミジン陽性対照およびGLP−1 MMBを投与したイヌは胃排出の有意の遅延(それぞれ30.60±6.47および59.23±14.46)を示した。
食餌誘発性肥満のマウスモデルを開発するため、マウスを高脂肪食で最低27週間維持した。マウスは肥満となり、そして空腹時血糖値が120mg/dlを超えた場合に糖尿病であると決定した。食後血糖値に対するGLP−1 MMB療法の効果を評価するため、食餌誘発性肥満マウスを一夜絶食させ、そして0.02、0.2若しくは2mg/kgのGLP−1 MMBまたはベヒクル対照を皮下投与した。投与6時間後に、マウスに1.5mg/gのグルコースの胃管栄養を与えた。血糖値を、MMB投与の前、t=0、15、30、60、90、120、150および180分に尾静脈血を使用して測定した。図16に示されるとおり、空腹時血糖値のGLP−1 MMB用量依存性の低下がt=0および全部のその後の時点で観察された。曲線下面積をt=0とt=180の間で計算し、全用量でグルコース配置(glucose disposal)の有意の低下を示した。
およそ13〜15週齢の雄性db/dbマウスを、空腹時血糖値に基づき6匹のマウスの処置群に無作為化した。マウスに、0.02mg/kg若しくは0.1mg/kgのG
LP−1 MMB、または0.1mg/kgの陰性対照MMBのいずれかを、耐糖能試験の6時間前に投与した。耐糖能試験の5分前に、グルコース測定値を尾静脈血から携帯式血糖計で測定した。マウスにその後、1mg/gのD−グルコースを腹腔内投与し、そして、血糖値を10分、20分、30分、60分、90分、120分、150分および180分にモニターした。図17Aに具体的に説明されるとおり、血糖値は、GLP−1 MMBで処置した双方の群で、時間経過全体にわたり有意により低かった。同一の様式で処置した付加的な動物群を、インスリンレベルの測定のためt=10分に殺した。GLP−1 MMB投与10分後に放出されるインスリンの量の用量依存性の増大が存在する。
RIN−m細胞を96ウェルプレートに50,000細胞/ウェルで播種し、そして37℃で一夜インキュベートした。翌日、細胞を、サイトカインTNFα(10ng/mL)若しくはIL−1β(4ng/mL)の添加前に、ある用量範囲のGLP−1 MMB(100nMから連続希釈した)で30分間処理した。プレートを37℃で16時間インキュベートした。アポトーシスをアッセイするため、Cell Death ELISA−Plusアッセイキット(Roche Applied Science、カタログ番号11920685001)を使用した。培地をウェルから吸引し、200μLの溶解緩衝液を各ウェルに添加し、そしてプレートを室温で30分間インキュベートした。インキュベーション後に、20μLのライセートを、ストレプトアビジン被覆した96ウェルマイクロタイタープレートに移した。80μLの免疫試薬(提供されるインキュベーション緩衝液での抗ヒストン−ビオチンおよび抗DNA−ペルオキシダーゼの20倍希釈)もまた各ウェルに添加した。100μLの懸濁液をその後、穏やかに振とうしながら室温で2時間インキュベートした。2時間後にプレートをインキュベーション緩衝液で3回洗浄し、そして発色溶液をプレートに添加した。およそ5分後に吸光度を405nmで読み取った。データは、GLP−1 MMBがTNF−α若しくはIL−1βにより誘発されるアポトーシスからRIN−m細胞を保護することを示す(図18)。
る。進行中のアポトーシスにもかかわらずのβ細胞の存在は、定義により、付随する新たなβ細胞形成が、長年のT1D後でさえ起こりつつあるはずであることを意味する。われわれは、β細胞破壊の標的を定められたGLP−1 MMB阻害によりT1Dを予防若しくは無効にしうると結論づける。
INS−1E細胞を、RPMI 1640+10%FBS+1%L−グルタミン+1%ピルビン酸ナトリウム+1%非必須アミノ酸+50μM β−メルカプトエタノール培地中、200,000細胞/ウェルの細胞密度で24ウェルプレートにプレーティングした。細胞を37℃および5%CO2で7日間増殖させ、そして第3若しくは4日に供給した(fed)。細胞を0.4mlのKRBH緩衝液/3mMグルコースで2回洗浄し、そしてこの緩衝液中で30〜60分間インキュベートさせた。培地を細胞から除去し、そして、適切な量のグルコースを含むKEBH中の被験物質0.4mlをウェルあたりに添加した。20マイクロリットルの上清を、T=0時点、および37℃、5%CO2で60分間インキュベーション後に、インスリン測定のためウェルから取り出した。インスリン濃度は、超高感度ラットインスリンELISAキット(Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA kit)(Crystal Chem)を用いたラット標準曲線(12.8〜0.1ng/ml)を使用して測定した。時間点上清の50倍希釈5マイクロリットルを、標準曲線上にあった値を得るためにアッセイで使用した。ELISAプレートは、Milecular Devices SpectraMax 340PCプレートリーダーにて、OD630を差し引き、OD450で読み取った。図19に示されるとおり、GLP−1 MMBは、用量依存性の様式で、しかし上昇されたグルコースの存在下でのみ、インスリン分泌を増大させた。
ラット膵島は、コラゲナーゼ消化、次いでFicoll勾配精製により得た。ヒト膵島は、Ricordiら、Diabetes(1998)37;4、413−420に詳述される酵素消化および密度勾配精製を使用して単離した。膵島を、CMRL−1066(Gibco)、ペニシリン/ストレプトマイシン(5,000単位/5,000μg)、10%FBS、1%L−グルタミン 25mM HEPES、pH7.2〜7.4の培地中で20×100mmペトリ皿に一夜プレーティングし、そして5%CO2中37℃で18ないし24時間培養した。翌日、膵島を皿の中心にかき混ぜ、そして50mL円錐管に収集した。膵島を、およそ10〜15分間、重力により管の底に沈殿させた。上清を除去し、機能性/生存率培地(MediaTech、カタログ番号99−786−CV)を添加し、そして膵島を重力により管の底に沈殿させた。膵島を合計3回洗浄した。上清を除去し、そして、膵島を、1%BSA、1%L−グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび0.5mMグルコース溶液を含有する機能性/生存率培地に、1mLあた
り20膵島の密度で再懸濁した。1mLの細胞懸濁液(約20膵島)を24ウェルプレートの各ウェルに添加し、そして5%CO2中37℃で2時間インキュベートした。2時間後に、1%BSA、1%L−グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、GLP−1 MMB(50nM最終濃度;100nM初期濃度)、および3.5mM(n=12)若しくは15mM(n=12)の最終濃度のグルコースを含有する1mLの機能性/生存率培地を添加した。25μLの上清を、時間0(インスリンの基礎)および処置の添加4時間後として収集した。上清はインスリンELISAを実施するまで−20℃で保存した。ラットインスリンは、Crystal Chem(イリノイ州ダウナーズグローブ)の超高感度ELISAアッセイキット(カタログ番号90060)を使用して定量した。ヒトインスリンは、Linco ResearchからのヒトインスリンELISAキット(ミシガン州セントチャールズ、カタログ番号EZHI−14K)を使用して定量した。図20は、GLP−1 MMBが、ラット(図20A)およびヒト膵島(図20B)からのインスリン分泌を有意に増大させることを示す。
正常C57BLK/6マウスを2群に無作為化し、各群は13動物を有した。群1はPBSベヒクル若しくはGLP−1 MMB(0.5mg/kg)の連日腹腔内(IP)投与を受領した。両群を10日間処置した。マウスを体重について連日モニターし、また、血糖を32日間(この時点で試験を終了した)モニターした(LifeScan、カリフォルニア州)。
マウス(12週齢db/db)を一夜絶食させた。試験の第1日に、マウス(4群;n=5/群)にGLP−1 MMB(1.5mg/kg)若しくは陰性対照ミメティボディをs.c.投与した。試験の第4日に、空腹時血糖を測定しかつOGTT(経口耐糖能試験)を実施した。血糖値は、尾静脈血を使用して15、30、60、90、120、150および180分に測定した。マウスを安楽死させ、そして膵を取り出しかつ10%中性緩衝ホルマリン中の浸積により固定した。各マウスからの膵をパラフィンに包埋し、そしてヘマトキシリン・エオシンによる染色および免疫組織化学のため薄片にした。インスリン染色の形態計測学的分析は、対照に対するGLP−1 MMB処置マウスでのインスリン染色の有意により高い強度を示した。実験を、GLP−1 MMBの単回投与の寿命を評価するため、投与14日後に殺したマウスで反復した。再度、インスリン染色の形態計測学的分析は、単回投与2週後のGLP−1 MMB処置マウスでインスリン染色のより高い強度を示した。インスリン染色の強度は、膵島内の貯蔵されたインスリンの量に直接関係し、GLP−1 MMB処置がこの糖尿病動物モデルの膵島でのインスリン分泌および貯蔵を増大させることを示唆する。
無胸腺nu/nu(ヌード)マウスをHarlan Laboratorisから購入した。動物を、無ウイルス抗体室中、無菌食および水への自由な到達を伴う微小隔離ケージに収容した。全部の実験は、実験動物の管理と使用に関する指針(Guide for
the Care and Use of Laboratory Animals)に示される基準に従って実施した。
MMB処置が、移植されたヒト膵島の生着、生存可能性および機能を改善し、そして膵
島移植処置を受けるドナー(生存および脳死を包含する)ならびにレシピエント双方でのGLP−1 MMBの使用を裏付けることを強く示唆する。これらの結果は、糖尿病レシピエントに移植されたヒト膵島に対しGLP−1 MMBが有する有益な効果を示す。さらに、該データは、GLP−1 MMBでの処置が膵島の生着、生存および機能を改善し、かつ、膵島移植の状況で価値のある付属療法となるとみられることを示唆する。
MMBの効果
ヒト以外の霊長類の膵島を、酵素消化および密度勾配精製を使用して単離し、そして2群に分割し、そして、組織培養処理していない175cm2フラスコ(Corning、マサチューセッツ州)中、約20,000IEの密度で、加湿混合95%空気/5%CO2中37℃で培養した。一群の膵島は単独で培養し、そして他群は50nM GLP−1
MMBを補充したMM1中で培養した。
ヒト以外の霊長類の最低限量モデルの使用は、低下された数の膵島での糖尿病の反転を見込む可能性を有する移植アプローチを研究することを可能にする。最低限量モデルでは、およそ5,000IEQ/kg、すなわち正常血糖を達成するのに必要とされる数の半分(通常10,000IEQ/kg)を移植する。同一の同種ドナーから得た膵島を利用することにより、ドナーおよび単離の変数を排除する。類似の移植前インスリン要求を有するサルの対を移植することにより、膵島機能を高めるよう設計された剤を受領しないサルに比較して、該剤で処置したサルでの高められた膵島の生着を観察しかつ早期の膵島喪失を制限することが可能である。
4歳超であった。1250mg/m2のストレプトゾトシンで糖尿病を誘発した。糖尿病動物は、血糖値を150〜300mg/dlの間に維持しようとして、朝食前にNPHインスリンおよび昼食前にNPH/Lantusで処置した。糖尿病誘発4週後に、サルは、刺激されたc−ペプチドが産生されないことを確認するためグルカゴン投与を受けた。
Claims (49)
- 配列番号2若しくは4のアミノ酸配列をコードする最低1種のポリヌクレオチド、またはそれらに相補的なポリヌクレオチドを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディ核酸。
- 配列番号7〜14から選択される最低1種を含んでなるアミノ酸配列をコードする最低1種のポリヌクレオチド、若しくはそれらに相補的なポリヌクレオチドを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディ核酸。
- 式(I):
(Pep(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、
式中、Pは最低1種の生物活性GLP−1ペプチド、バリアント若しくは誘導体であり、Lは、該ミメティボディが代替の方向および結合特性を有することを可能にすることにより構造の柔軟性を提供するポリペプチドであり得る最低1種のリンカー配列であり、Vは、免疫グロブリン可変領域のC末端の少なくとも一部分であり、Hは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、CH2は免疫グロブリンCH2定常領域の少なくとも一部分であり、CH3は免疫グロブリンCH3定常領域の少なくとも一部分であり、nは1から10までの整数であり、ならびに、o、p、q、r、sおよびtは独立に0から10までの整数であり得る、
のポリペプチドをコードする最低1種のポリヌクレオチドを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディ核酸。 - 配列番号2若しくは4の連続するアミノ酸の全部を含んでなる、最低1種のGLP−1
CH1欠失ミメティボディポリペプチド。 - 配列番号7〜14の最低1種の連続するアミノ酸の全部を含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド。
- 式(I):
(Pep(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、
式中、Pは配列番号1および6から選択される最低1種の生物活性GLP−1ペプチドであり、Lは、GS、GGS、GGGS(配列番号16)、GSGGGS(配列番号17)、GGSGGGS(配列番号18)、GGSGGGSGG(配列番号19)およびGGGSGGGSGG(配列番号20)から選択され;Vは、GTLVTVSS(配列番号21)、GTLVAVSS(配列番号22)、GTAVTVSS(配列番号23)、TVSS(配列番号24)およびAVSS(配列番号25)から選択され;HはEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(配列番号26)であり、CH2はSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(配列番号43)であり、CH3はGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号44)であり、nは1から10までの整数であり、ならびに、o、p、q、r、sおよびtは独立に0から10までの整数であり得る、
のポリペプチドを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド。 - 式(I):
(Pep(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、
式中、Pは配列番号6の最低1種の生物活性GLP−1ペプチドであり、Lは、GS、GGS、GGGS(配列番号16)、GSGGGS(配列番号17)、GGSGGGS(配列番号18)、GGSGGGSGG(配列番号19)およびGGGSGGGSGG(配列番号20)から選択され;Vは、GTLVTVSS(配列番号21)、GTLVAVSS(配列番号22)、GTAVTVSS(配列番号23)、TVSS(配列番号24)およびAVSS(配列番号25)から選択され;HはESKYGPPCPSCPAPEFLGGP(配列番号27)であり、CH2はSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(配列番号45)であり、CH3はGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号46)であり、nは1から10までの整数であり、ならびに、o、p、q、r、sおよびtは独立に0から10までの整数であり得る、
のポリペプチドを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド。 - 式(I):
(Pep(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、
式中、Pは配列番号6の最低1種の生物活性GLP−1ペプチドであり、Lは、GS、GGS、GGGS(配列番号16)、GSGGGS(配列番号17)、GGSGGGS(配列番号18)、GGSGGGSGG(配列番号19)およびGGGSGGGSGG(配列番号20)から選択され;Vは、GTLVTVSS(配列番号21)、GTLVAVSS(配列番号22)、GTAVTVSS(配列番号23)、TVSS(配列番号24)およびAVSS(配列番号25)から選択され;HはESKYGPPCPPCPAPEAAGGP(配列番号28)であり、CH2はSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(配列番号45)であり、CH3はGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号46)であり、nは1から10までの整数であり、ならびに、o、p、q、r、sおよびtは独立に0から10までの整数であり得る、
のポリペプチドを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド。 - 式(I):
(Pep(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、
式中、Pは最低1種の生物活性GLP−1ペプチド、バリアント若しくは誘導体であり、Lは、該ミメティボディが代替の方向および結合特性を有することを可能にすることにより構造の柔軟性を提供するポリペプチドであり得る最低1種のリンカー配列であり、Vは免疫グロブリン可変領域のC末端の少なくとも一部分であり、Hは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、CH2はSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(配列番号43)であり、CH3はGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号44)であり、nは1から10までの整数であり、ならびに、o、p、q、r、sおよびtは独立に0から10までの整数であり得る、
のポリペプチドを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド。 - 式(I):
(Pep(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、
式中、Pは最低1種の生物活性GLP−1ペプチド、バリアント若しくは誘導体であり、Lは、該ミメティボディが代替の方向および結合特性を有することを可能にすることにより構造の柔軟性を提供するポリペプチドであり得る最低1種のリンカー配列であり、Vは免疫グロブリン可変領域のC末端の少なくとも一部分であり、Hは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、CH2はSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(配列番号45)であり、CH3はGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号46)であり、nは1から10までの整数であり、ならびに、o、p、q、r、sおよびtは独立に0から10までの整数であり得る、
のポリペプチドを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド。 - 式(I):
(Pep(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、
式中、Pは配列番号6の最低1種の生物活性GLP−1ペプチドであり、Lは、該ミメティボディが代替の方向および結合特性を有することを可能にすることにより構造の柔軟性を提供するポリペプチドであり得る最低1種のリンカー配列であり、Vは免疫グロブリン可変領域のC末端の少なくとも一部分であり、Hは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、CH2は免疫グロブリンCH2定常領域の少なくとも一部分であり、CH3は免疫グロブリンCH3定常領域の少なくとも一部分であり、nは1から10までの整数であり、ならびに、o、p、q、r、sおよびtは独立に0から10までの整数であり得る、
のポリペプチドを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド。 - 式(I):
(Pep(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、
式中、Pは最低1種の生物活性GLP−1ペプチド、バリアント若しくは誘導体であり、Lは、GS、GGS、GGGS(配列番号16)、GSGGGS(配列番号17)、GGSGGGS(配列番号18)、GGSGGGSGG(配列番号19)およびGGGSGGGSGG(配列番号20)から選択され;Vは免疫グロブリン可変領域のC末端の少なくとも一部分であり、Hは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、CH2は免疫グロブリンCH2定常領域の少なくとも一部分であり、CH3は免疫グロブリン
CH3定常領域の少なくとも一部分であり、nは1から10までの整数であり、ならびに、o、p、q、r、sおよびtは独立に0から10までの整数であり得る、
のポリペプチドを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド。 - 式(I):
(Pep(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、
式中、Pは最低1種の生物活性GLP−1ペプチド、バリアント若しくは誘導体であり;Lは、該ミメティボディが代替の方向および結合特性を有することを可能にすることにより構造の柔軟性を提供するポリペプチドであり得る最低1種のリンカー配列であり;Vは、GTLVTVSS(配列番号21)、GTLVAVSS(配列番号22)、GTAVTVSS(配列番号23)、TVSS(配列番号24)およびAVSS(配列番号25)から選択され;Hは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり;CH2は免疫グロブリンCH2定常領域の少なくとも一部分であり;CH3は免疫グロブリンCH3定常領域の少なくとも一部分であり;nは1から10までの整数であり、ならびに、o、p、q、r、sおよびtは独立に0から10までの整数であり得る、
のポリペプチドを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド。 - 式(I):
(Pep(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、
式中、Pは最低1種の生物活性GLP−1ペプチド、バリアント若しくは誘導体であり、Lは、該ミメティボディが代替の方向および結合特性を有することを可能にすることにより構造の柔軟性を提供するポリペプチドであり得る最低1種のリンカー配列であり、Vは免疫グロブリン可変領域のC末端の少なくとも一部分であり、Hは、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(配列番号26)、ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP(配列番号27)およびESKYGPPCPPCPAPEAAGGP(配列番号28)から選択され、CH2は免疫グロブリンCH2定常領域の少なくとも一部分であり、CH3は免疫グロブリンCH3定常領域の少なくとも一部分であり、nは1から10までの整数であり、ならびに、o、p、q、r、sおよびtは独立に0から10までの整数であり得る、
のポリペプチドを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド。 - 式(I):
(Pep(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、
式中、Pは最低1種の生物活性GLP−1ペプチド、バリアント若しくは誘導体であり、Lは、該ミメティボディが代替の方向および結合特性を有することを可能にすることにより構造の柔軟性を提供するポリペプチドであり得る最低1種のリンカー配列であり、Vは免疫グロブリン可変領域のC末端の少なくとも一部分であり、Hは、EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGP(配列番号29)、EPKSADKTHTCPPCPAPELAGGP(配列番号30)、EPKSADKTHTCPPCPAPEALGGP(配列番号31)、EPKSADKTHTCPPCPAPELEGGP(配列番号32)、EPKSSDKTHTCPPCPAPEFLGGP(配列番号33)、EPKSADKTHACPPCPAPELLGGP(配列番号34)、EPKSADKAHTCPPCPAPELLGGP(配列番号35)およびEPKSADKTHTCPPCPAPELLGGP(配列番号36)、ADKTHTCPPCPAPELLGGP(配列番号37)、THT
CPPCPAPELLGGP(配列番号38)、ESKYGPPCPSCPAPEAAGGP(配列番号39)、ESKYGPPCPPCPAPELLGGP(配列番号40)、CPPCPAPELLGGP(配列番号41)ならびにCPPCPAPEAAGGP(配列番号42)から選択され、CH2は免疫グロブリンCH2定常領域の少なくとも一部分であり、CH3は免疫グロブリンCH3定常領域の少なくとも一部分であり、nは1から10までの整数であり、ならびに、o、p、q、r、sおよびtは独立に0から10までの整数であり得る、
のポリペプチドを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド。 - 式(I):
(Pep(n)−L(o)−V(p)−H(q)−CH2(r)−CH3(s))(t)、
式中、Pは最低1種の生物活性GLP−1ペプチド、バリアント若しくは誘導体であり、Lは、該ミメティボディが代替の方向および結合特性を有することを可能にすることにより構造の柔軟性を提供するポリペプチドであり得る最低1種のリンカー配列であり、Vは免疫グロブリン可変領域のC末端の少なくとも一部分であり、Hは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、CH2は免疫グロブリンCH2定常領域の少なくとも一部分であり、CH3は免疫グロブリンCH3定常領域の少なくとも一部分であり、nは1から10までの整数であり、ならびに、o、p、q、r、sおよびtは独立に0から10までの整数であり得る、
の最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド。 - 請求項1〜16のいずれかに記載のCLP−1 CH1欠失ミメティボディ核酸、若しくは、GLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド(前記ポリペプチドは最低1種のPポリペプチドの最低1種の活性を有する)。
- 請求項4〜16のいずれかに記載の最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチドを特異的に結合する、抗イディオタイプモノクローナル若しくはポリクローナル抗体、融合タンパク質またはそれらのフラグメント。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の、または請求項4〜18のいずれかに記載の最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド若しくはCLP−1 CH1欠失ミメティボディ抗体をコードする、GLP−1 CH1欠失ミメティボディ核酸、あるいはそれらに相補的なポリヌクレオチド。
- 請求項19に記載の最低1種の単離された核酸を含んでなる、GLP−1 CH1欠失ミメティボディベクター。
- 請求項19に記載の単離された核酸を含んでなる、GLP−1 CH1欠失ミメティボディ宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、COS−1、COS−7、HEK293、BHK21、CHO、BSC−1、Hep G2、653、SP2/0、293、NSO、DG44 CHO、CHO K1、HeLa、骨髄腫若しくはリンパ腫細胞、またはそれらのいずれかの誘導体、不死化若しくは形質転換細胞から選択される最低1種である、請求項21に記載のGLP−1 CH1欠失ミメティボディ宿主細胞。
- GLP−1 CH1欠失ミメティボディ若しくは抗体が検出可能な若しくは回収可能な量で発現されるようなin vitro、in vivo若しくはin situ条件下
で請求項19に記載の核酸を翻訳することを含んでなる、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド若しくはGLP−1 CH1欠失ミメティボディ抗体の製造方法。 - 請求項1〜19のいずれかに記載の最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディ核酸、GLP−1 CH1欠失ミメティボディポリペプチド、若しくはGLP−1 CH1欠失ミメティボディ抗体を含んでなる組成物。
- 前記組成物が最低1種の製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤をさらに含んでなる、請求項24に記載の組成物。
- 糖尿病若しくはインスリン代謝に関連する薬物、検出可能な標識若しくはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗感染症薬、心血管(CV)系薬、中枢神経系(CNS)薬、自律神経系(ANS)薬、気道薬、胃腸(GI)管薬、ホルモン薬、液体若しくは電解質バランスのための薬物、血液製剤、抗腫瘍薬、免疫調節薬、眼、耳若しくは鼻の薬物、局所薬、栄養薬、サイトカイン若しくはサイトカインアンタゴニストの最低1種から選択される最低1種の化合物、組成物若しくはポリペプチドの治療上有効な量を含んでなる最低1種の組成物をさらに含んでなる、請求項24に記載の組成物。
- 液体、気体、若しくは乾燥物、溶液、混合物、懸濁液、乳液若しくはコロイド、凍結乾燥調製物または粉末から選択される最低1種の形態の、請求項24に記載の組成物。
- (a)請求項1〜19のいずれかに記載の最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディの核酸、ポリペプチド若しくは抗体の有効量を含んでなる組成物を、細胞、組織、器官若しくは動物と接触させるか若しくはそれらに投与すること
を含んでなる、前記細胞、組織、器官若しくは動物におけるGLP−1関連の状態の診断若しくは処置方法。 - GLP−1関連の状態が糖尿病若しくはうっ血性心不全である、請求項28に記載の方法。
- 前記有効量が、前記細胞、組織、器官若しくは動物1キログラムあたり、0.0001〜50mgのGLP−1 CH1欠失ミメティボディ抗体;0.1〜500mgの前記GLP−1 CH1欠失ミメティボディ;若しくは0.0001〜100μgの前記GLP−1 CH1欠失ミメティボディ核酸である、請求項28に記載の方法。
- 前記接触させること若しくは前記投与することが、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹腔内(intraabdominal)、関節包内、軟骨内、洞内、腹腔内(intracelial)、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内(intraperitoneal)、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病変内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮から選択される最低1様式による、請求項28に記載の方法。
- 前記(a)の接触若しくは投与することの前、同時に若しくは後に、糖尿病若しくはインスリン代謝に関連する薬物、検出可能な標識若しくはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗感染症薬、心血管(CV)系薬、中枢神経系(CNS)薬、自律神経系(ANS)薬、気道薬、胃腸(GI)管薬、ホルモン薬、液体若しくは電解質バランスのための薬物、血液製剤、抗腫瘍薬、免疫調節薬、眼、耳若しくは鼻の薬物、局所薬、栄養薬、サイトカイン若しくはサイトカインアンタゴニストの最低1種から選択される最低1種の化合物
若しくはポリペプチドの有効量を含んでなる最低1種の組成物を投与することをさらに含んでなる、請求項28に記載の方法。 - 前記有効量が、それの必要な動物で血糖値を低下させる、請求項28に記載の方法。
- 前記有効量が、インスリン産生細胞からのインスリン分泌を増大させる、請求項28に記載の方法。
- 前記有効量が、インスリン産生細胞のアポトーシスを予防する、請求項28に記載の方法。
- 前記有効量が、インスリン産生細胞の増殖を増大させる、請求項28に記載の方法。
- 請求項1〜19のいずれかに記載の最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディの核酸、ポリペプチド若しくは抗体の有効量を含んでなる組成物を、細胞、組織、器官若しくは動物と接触させるか若しくはそれらに投与することを含んでなる、前記細胞、組織、器官若しくは動物の処置方法。
- 前記有効量が、前記細胞、組織、器官若しくは動物1キログラムあたり、0.0001〜50mgのGLP−1 CH1欠失ミメティボディ抗体;0.1〜500mgの前記GLP−1 CH1欠失ミメティボディ;若しくは0.0001〜100μgの前記GLP−1 CH1欠失ミメティボディ核酸である、請求項37に記載の方法。
- 前記接触させること若しくは前記投与することが、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹腔内(intraabdominal)、関節包内、軟骨内、洞内、腹腔内(intracelial)、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内(intraperitoneal)、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病変内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮から選択される最低1様式による、請求項37に記載の方法。
- 前記(a)の接触若しくは投与することの前、同時に若しくは後に、糖尿病若しくはインスリン代謝に関連する薬物、検出可能な標識若しくはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗感染症薬、心血管(CV)系薬、中枢神経系(CNS)薬、自律神経系(ANS)薬、気道薬、胃腸(GI)管薬、ホルモン薬、液体若しくは電解質バランスのための薬物、血液製剤、抗腫瘍薬、免疫調節薬、眼、耳若しくは鼻の薬物、局所薬、栄養薬、サイトカイン若しくはサイトカインアンタゴニストの最低1種から選択される最低1種の化合物若しくはポリペプチドの有効量を含んでなる最低1種の組成物を投与することをさらに含んでなる、請求項37に記載の方法。
- 前記有効量が、それの必要な動物で血糖値を低下させる、請求項37に記載の方法。
- 前記有効量が、インスリン産生細胞からのインスリン分泌を増大させる、請求項37に記載の方法。
- 前記有効量が、インスリン産生細胞のアポトーシスを予防する、請求項37に記載の方法。
- 前記有効量が、インスリン産生細胞の増殖を増大させる、請求項37に記載の方法。
- 請求項1〜19のいずれかに記載の、最低1種の単離されたGLP−1 CH1欠失ミメティボディのポリペプチド、抗体若しくは核酸を含んでなる装置であって、前記装置が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹腔内(intraabdominal)、関節包内、軟骨内、洞内、腹腔内(intracelial)、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内(intraperitoneal)、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病変内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮から選択される最低1様式により前記GLP−1 CH1欠失ミメティボディのポリペプチド、抗体若しくは核酸の前記最低1種を接触若しくは投与するのに適する、上記装置。
- 包装資材、および請求項1〜19のいずれかに記載の最低1種の単離されたGLP−1
CH1欠失ミメティボディのポリペプチド、抗体若しくは核酸を含んでなる容器を含んでなる、ヒトの製薬学的若しくは診断的使用のための製品。 - 前記容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹腔内(intraabdominal)、関節包内、軟骨内、洞内、腹腔内(intracelial)、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内(intraperitoneal)、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病変内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮送達装置若しくは系の一成分である、請求項46に記載の製品。
- 前記ポリペプチド、抗体若しくは核酸を検出可能な若しくは回収可能な量で発現することが可能な最低1種の宿主細胞、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、植物細胞を提供することを含んでなる、請求項1〜19のいずれかに記載の最低1種の単離されたGLP−1 CH1欠失ミメティボディのポリペプチド、抗体若しくは核酸の製造方法。
- 請求項48に記載の方法により製造される、最低1種のGLP−1 CH1欠失ミメティボディのポリペプチド、抗体若しくは核酸。
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