JP2008544742A - IL4R−αに対する組成物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
本出願は、2005年2月25日に出願されたアメリカ合衆国仮出願シリアル番号60/656,760、2005年6月9日に出願された60/688,897、2005年7月19日に出願された60/700,656、および、2005年8月18日に出願された60/709,404に対する優先権を主張し、それらすべては、その全体について本明細書中で参考文献として援用される。
紙およびコンピューター読みとり可能な形式の両方における配列表の複製は、本明細書中で提供され、本明細書中で参考文献として援用される。コンピューター読みとり可能な形式は、RTS0792WOSEQ.txtという名前のファイルを含む3.5''ディスケットで提供される。
アレルギー性鼻炎および喘息は、複雑かつ多面的な病因をもつどこにでもある症状である。その症状の重篤度は、遺伝子、環境的条件、および、疾患の持続時間および重篤度に付随した累積的な呼吸の病状、といった因子に依存して、個体によって、また、個体の中でも大きく変化する。両方の疾患は、無害な環境抗原に対する免疫系の過剰な応答性の結果であり、喘息では主としてアトピー性(すなわち、アレルギー性)の構成要素を含む。
インターロイキン受容体4-αおよび炎症性シグナル経路
アレルギーおよび喘息が、Th2サイトカイン応答の調節異常の結果であることは、一般的に認識されている。喘息患者の気管支肺胞洗浄液中および気道上皮生検において、インターロイキン4(IL 4)、IL 5、およびIL 13サイトカインを産生するCD4+ T細胞が存在することは、明確に立証されている。ヒトにおいて、IL 5の中和により、気道過敏性(AHR)は減少せず、好酸球増多の減少をもたらす。Th2リンパ球分化、Bリンパ球のイプシロン重鎖へのIgアイソタイプスイッチの制御を介した免疫グロブリンE(IgE)産生の誘導、IgE受容体および血管関連接着分子-1(VCAM-1)の発現の上方調節、肺における好酸球浸潤の促進、および粘液過分泌を含む、喘息およびアレルギーの根拠をなす多様な病理学的過程に、IL 4およびIL 13が関係している。IL 13は、コリン作動性刺激に対する気道過敏性(AHR)の進行、肺リモデリング、および炎症を起こした気道上皮の分泌表現型の促進を仲介する。これらの所見より、Th2サイトカイン経路の構成物、特にIL 4およびIL-13が、喘息、アレルギー、および他の気道炎症および/または過敏症の形態への治療的介入のための可能性のある標的となる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)は、肺炎、気道過敏性、および/または喘息の治療剤として推進されている。肺はエアロゾル化したASOにとって、いくつかの理由から理想的な組織を提供する(NyceおよびMetzger、Nature、1997:385:721-725、本明細書中で参考文献として援用される);というのは、肺は非浸襲的かつ特異的に標的とされる事が可能で、それは広い吸収表面を有する;またASOの分布および取り込みを促進させることができるサーファクタントで覆われている。マウスおよび霊長類の両方において、エアロゾルによる肺へのASOの送達は、肺全体への優れた分布をもたらす。標準化しそして炎症をおこしたマウスの肺組織において、吸入されたASOの免疫組織化学染色では、肺胞マクロファージ、好酸球、および上皮が強い染色を、血管内皮が中程度の染色を、そして細気管支上皮が弱い染色を示す。ASOを介する標的の減少は、樹状細胞、マクロファージ、好酸球、および、上皮細胞において、エアロゾル投与後にみとめられる。マウスまたはサルにおいて、エアロゾル投与により送達される2'-メトキシエトキシ(2'-MOE)修飾オリゴヌクレオチドの、推測半減期は、それぞれ約4から7日、または、少なくとも7日間である。さらに、ASOはバックボーンおよびヌクレオチド化学に基づいて、比較的予測可能な毒性および薬物動態を有する。ASOの経肺投与は、最小限の全身性暴露をもたらし、他の分類の薬物と比較すると前記化合物の安全性は潜在的に上昇する。
本発明は、IL 4R-αをコードする核酸を標的とする、化合物、具体的にはオリゴマー化合物、特に核酸および核酸様オリゴマー、を提供する。好ましくは、オリゴマー化合物は、IL 4R-α、特にヒトIL 4R-α(1992年5月26日に登録されたGenBankアクセッション番号 X52425.1(SEQ ID NO: 1);2002年3月1日に登録されたGenBankアクセッション番号 BM738518.1;2004年2月19日に登録されたGenBankアクセッション番号 NT 010393.14の1836000から18689000のヌクレオチド、それぞれは参考文献として援用される)を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、IL 4R-αの発現を調節する。化合物は、表3、4、または5に列挙された配列の、少なくとも12核酸塩基部分、好ましくは少なくとも17核酸塩基部分を含み、確認標的部分または表3、4、または5に列挙された配列と少なくとも90%以上同一である。
喘息、アレルギー、および、肺炎および/またはAHRに関連する多数の他の疾患または症状は、IL 4RとIL 13Rの共通のサブユニットであるIL 4R-αを含む、共通の炎症性メディエーターを共有する。これらの疾患または症状の治療的介入は、化合物の有効性の欠如、および/または望ましくない副作用のため、完全に満足なものではない。本発明は、肺炎および/または気道過敏性の予防、改善、および/または処置のための、オリゴマー化合物、好ましくはASOを提供する。本明細書中で使用される場合、“予防”という用語は、症状または疾患の進行を、数時間から数日、好ましくは、数週間から数ヶ月という期間、遅らせる、または、未然に防ぐことを意味する。本明細書中で使用される場合、“改善”という用語は、症状または疾患の重篤度の少なくとも一つの指標を減少させることを意味する。指標の重篤度は、主観的、または、客観的な測定により、決定され得る。本明細書中で使用される場合、“処置”は疾患または症状の変化、または改善に有効である本発明の組成物を投与することを意味する。予防、改善、および/または治療は、症状または疾患の経過を変化させるため、物質(例えばアレルゲン)への暴露より先に、または、定期的に、複数回の投与を必要とし得る。さらに、症状または疾患の予防、改善、および、治療のそれぞれに、連続的に、または、同時に、一つの物質が一個体に用いられることがある。本発明の好ましい方法において、ASOは、呼吸器管への局所的な送達のためエアロゾルにより送達され、それにより、全身性暴露は制限され、また潜在的な副作用は減少する。
IL 4R-αをコードする核酸分子の発現調節に使用するための、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および、他のアンチセンス化合物を含むオリゴマー化合物が、本明細書中で開示される。これは、IL 4R-αをコードする、1あるいはそれ以上の標的核酸分子とハイブリダイズするオリゴマー化合物の提供により、達成される。本明細書中で使用される場合、“標的核酸”および“IL 4R-αをコードする核酸分子”という用語は、IL 4R-αをコードするDNA、前記DNAから転写されるRNA(前駆mRNAおよびmRNA、またはその一部を含む)、および、前記RNAから派生するcDNAも含むように、便宜上用いられている。好ましい態様において、標的核酸はIL 4R-αをコードするmRNAである。
“オリゴマー化合物”という用語は、核酸分子のある領域とハイブリダイズすることができるポリマー構造をいう。この用語には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオチド模倣物、およびこれらのキメラの組み合わせが含まれる。一般にオリゴマー化合物には、ヌクレオシド間結合基および/またはヌクレオシド間結合模倣物により互いに結合した、複数のモノマーサブユニットが含まれる。それぞれのモノマーサブユニットは、糖、脱塩基糖、修飾された糖、または、糖模倣物、を含み、そして、脱塩基糖を除いては、核酸塩基、修飾された核酸塩基、または、核酸塩基模倣物を含む。好ましいモノマーサブユニットは、ヌクレオシド、および修飾されたヌクレオシドを含む。オリゴマー化合物は、通常、直鎖状に調製されるが、連結することができ、また、そうでなければ、環状に調製することができる。さらに、分岐した構造は当該技術分野において既知である。
化学的修飾
当該技術分野で既知の通り、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である(時々“核酸塩基”または単純に“塩基”と言われる)。前記複素環塩基の最も一般的な2つの分類は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分と共有結合したリン酸基をさらに含んだヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドにおいて、リン酸基は糖の2'、3'、または5'の水酸基に結合され得る。オリゴヌクレオチド形成において、リン酸基は隣のヌクレオシドとお互いに共有結合し、直鎖状のポリマー化合物を形成する。次に、直鎖状のポリマー化合物のそれぞれの末端をさらに連結させて、環状の化合物を形成させることができる。オリゴヌクレオチド内で、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成するものと言われる。RNAおよびDNAの通常の結合またはバックボーンは、3'から5'へのホスホジエステル結合である。オリゴヌクレオチド中に化学的修飾を含んで、その活性を変化させることがしばしば好ましい。化学的修飾は、例えばその標的RNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を上昇させること、ヌクレアーゼ耐性を高めること、および/またはオリゴヌクレオチドの薬物動態を変化させること、により、オリゴヌクレオチドの活性を変化させ得る。オリゴヌクレオチドのその標的への親和性を高める化学の使用により、より短いオリゴヌクレオチド化合物を使用することが可能になる。
修飾および非修飾ヌクレオシドのオリゴマー化は、DNA(Protocols for Oligonucleotides and Analogs、Ed. Agrawal (1993)、Humana Press)および/またはRNA(Scaringe、Methods (2001)、23、206-217、Gaitら、Application of Chemically synthesized RNA in RNA:Protein Interactions、Ed Smith (1998)、1-36、Galloら、Tetrahedron (2001)、57、5707-5713)における文献的手法に従って、日常的に行われ得る。
オリゴヌクレオチド精製の方法および分析は、当業者に既知である。分析方法には、キャピラリー電気泳動(CE)およびエレクトロスプレー質量分析が含まれる。前記合成および分析方法は、マルチウェルプレートにおいても行われ得る。本発明の方法はオリゴマー精製の方法によって限定されない。
“ハイブリダイゼーション”は、オリゴマー化合物の相補鎖の対合を意味する。特定の機構に限定的ではないが、最も一般的な対合の機構には、相補的ヌクレオシド間の、または、オリゴマー化合物の鎖のヌクレオチド塩基(核酸塩基)間の、ワトソンクリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合であり得る、水素結合が関与している。例えば、アデニンおよびチミンは相補的な核酸塩基であり、水素結合の形成により対合する。ハイブリダイゼーションは、環境の変化を受けて生じる可能性がある。
オリゴマー化合物またはその部分は、SEQ ID NOまたは特定のIsis番号を有する化合物に対して決められた%同一性を有し得る。本明細書中で使用する場合、配列は、それが同じ核酸塩基対合能を有するなら、本明細書中で開示される配列と同一である。例えば、本発明で開示される配列中のチミジンの代わりにウラシルを含むRNAは、両方ともアデニンと対合するため、同一であるとみなされる。同様に、G-クランプ修飾複素環塩基はグアニンと対合するため、本出願の配列において、シトシンまたは5-Meシトシンと、同一であると見なされる。この同一性は、オリゴマー化合物長の全体に渡って、または、オリゴマー化合物の一部分であり得る(例えば、27 merの核酸塩基1-20は、オリゴマー化合物とSEQ ID NOとの%同一性を決定するために、20merと比較され得る)。オリゴヌクレオチドは、本明細書中に記述されるオリゴヌクレオチドと同様に機能するために、オリゴヌクレオチドが本明細書中に記述されるものと同一の配列をもつ必要はないことは、当業者により理解される。本明細書中で教示される短くした(すなわち、欠失した、およびそれゆえ同一でない)種類のオリゴヌクレオチド、または、本明細書中で教示される同一でない(例えば、一つの塩基を同一でない核酸塩基対をもつ他のもの、または、脱塩基部位に置換した)種類のオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内に含まれる。%同一性は、比較されるSEQ ID NOまたは化合物と一致する同一の塩基対合を有する塩基の数に従って、計算される。同一でない塩基はお互いに隣接するか、オリゴヌクレオチド全体に分散するか、またはその両方である可能性がある。
特定の標的核酸分子に対してオリゴマー化合物を“標的化すること”は、多段階過程である可能性がある。その過程は通常、その発現が調節されるべき標的核酸の同定により始まる。例えば、標的核酸は、その発現が特定の障害または疾患に関連する細胞遺伝子(またはその遺伝子から転写されるmRNA)、または、感染性病原菌由来の核酸分子である可能性がある。本明細書中で開示される場合、標的核酸はIL 4R-αをコードする。
標的化過程は通常、アンチセンス相互作用が、望ましい効果、例えば発現の調節を結果としてもたらすことを生じさせる、標的核酸内の少なくとも1つの標的領域、部分、または部位の決定をも含む。“領域”は、少なくとも1つの識別可能な構造、機能、または特徴を有する、標的核酸のある部分として、定義される。標的領域には、限定的ではないが、翻訳開始、および終結領域、コード領域、オープンリーディングフレーム、イントロン、エキソン、3'-非翻訳領域(3'-UTR)および5'非翻訳領域(5'-UTR)が含まれる。標的核酸の領域内の部分(segment)である。“部分”は、停止コドンおよび開始コドンといった、標的核酸内の領域の、より小さい、または、下位部分として定義される。本発明で使用される場合、“部位”は、スプライスジャンクションといった、標的核酸内の1つだけの核酸塩基部位として定義される。前記領域、部分、および部位は当業者に周知である。
選択的RNA転写物は、同じゲノム領域のDNAから生産され得ることもまた、当該技術分野において知られている。これらの選択的転写物は、一般に“変異体”として知られている。より具体的には、“前駆mRNA変異体”は、同じゲノムDNAから生産される転写物で、同じゲノムDNAから生産される他の転写物とはその開始または停止部位のどちらかが異なり、また、イントロンおよびエキソン配列の両方を含むものである。変異体は、限定的ではないが、選択的スプライス部位、または、選択的開始および終止コドンをもつものを含むmRNA変異体をもたらし得る。ゲノムおよびmRNA配列の変異体は、疾患をもたらし得る。前記変異体に対するオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内である。
IL 4R-α(インターロイキン4α受容体、CD124、IL-4Ra、インターロキン4受容体α鎖としても知られる)の発現を調節する組成物および方法は、本発明に従っている。表1は、IL 4R-αをコードする核酸分子に対応する配列のGenBankアクセッション番号(nt=ヌクレオチド)、その種類の配列がGenBankに登録された日、および、割り振られているものは、本出願における相当するSEQ ID NOのリストであり、それらのそれぞれは本明細書中で参考文献として援用される。
標的核酸の発現の調節は、あらゆる数の核酸(DNAまたはRNA)の機能を変化させることにより、達せられ得る。“調節”は、機能の摂動、例えば、発現の上昇(刺激または誘導)または低下(阻害または減少)のどちらかを意味する。他の例としては、発現の調節は、前駆mRNAプロセッシングのスプライス部位選択の摂動を含み得る。“発現”には、それによって遺伝子によりコードされた情報が、細胞において、存在し、また動作する構造へと変換される、すべての機能が含まれる。これらの構造には、転写および翻訳産物が含まれる。“発現の調節”は、前記機能の摂動を意味する。調節されるmRNAの機能には、限定的ではないが、タンパク質翻訳部位へのRNAの転位、RNA合成の部位とは遠い細胞内の部位へのRNAの転位を含む転位機能を含み、また、RNAからのタンパク質の翻訳を含むことができる。調節され得るRNAプロセッシング機能には、限定的ではないが、1つあるいはそれ以上のRNA種を得るRNAのスプライシング、RNAのキャッピング、RNAの3'成熟化、および、RNAに携わっている、または、RNAにより促進することができる、RNAが関与する触媒活性または複合体形成が含まれる。発現の調節は、一時的、または、定常レベルのどちらかで、1つあるいはそれ以上の核酸種のレベルの上昇、または、1つあるいはそれ以上の核酸種のレベルの減少という結果となり得る。標的核酸の機能への前記干渉の一つの結果が、IL 4R-αの発現の調節である。従って、一つの態様において、発現の調節は、標的RNAまたはタンパク質レベルの上昇または減少を意味し得る。他の態様において、発現の調節は、1つまたはそれ以上のRNAスプライス産物の上昇または減少、あるいは、2つまたはそれ以上のスプライス産物の比率の変化を意味し得る。
IL 4R-α発現の調節は、当該技術分野において既知の様々な方法によりアッセイされ得る。IL 4R-αmRNAレベルは、例えば、ノザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、またはリアルタイムPCRにより定量され得る。RNA分析は、全細胞RNAまたはpoly(A)+mRNAについて、当該技術分野において既知の方法により行われ得る。RNA単離の方法は、例えばAusubel, F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology、Volume 1、pp4.1.1-4.2.9および4.5.1-4.5.3、John Wiley & Sons、Inc.、1993に教示される。
活性オリゴマー化合物がハイブリダイズする標的核酸の場所は、本明細書中以下において“確認標的部分”といわれる。本明細書中で使用される場合、“確認標的部分”という用語は、活性オリゴマー化合物により標的とされる標的領域の少なくとも8個の核酸塩基部分、好ましくは、標的領域の少なくとも12個の核酸塩基部分として定義される。理論に縛られることを望むものではないが、これらの標的部分が、ハイブリダイゼーションのために接近しやすい標的核酸の部分を示していると現在は考えられている。
他の態様において、本明細書中で同定される確認標的部分は、IL 4R-αの発現を調節する更なる化合物のスクリーニングに使用され得る。“モジュレータ”とは、IL 4R-αの発現を調節し、確認標的部分に相補的な少なくとも8個の核酸塩基部分を含むような化合物である。スクリーニング方法は、IL 4R-αをコードする核酸分子の確認標的部分を、一つまたはそれ以上の候補モジュレータと接触させること、そして、IL 4R-αをコードする核酸分子の発現を摂動させる一つまたはそれ以上の候補モジュレータを選択することという段階を含む。候補モジュレータまたは複数の候補モジュレータが、IL 4R-αをコードする核酸分子の発現を調節することができることが示されると、次にモジュレータはさらなるIL 4R-αの機能の調査研究、または、研究用、診断用、あるいは治療用物質としての使用に用いられ得る。
本発明のオリゴマー化合物は、診断薬のため、および研究用の試薬およびキットとして用いられ得る。さらに、特異性をもつ遺伝子発現を阻害することができる、アンチセンス化合物は、特定の遺伝子機能の解明、または生物学的経路の様々なメンバーの機能の判別のために、当業者によりしばしば使用される。
本発明の化合物は、ヒトなどの動物におけるIL 4R-αの発現を調節するのに使用され得る。1つの限定的ではない態様において、この方法は、IL 4R-αの発現を阻害する、効果的な量のアンチセンス化合物を、前記動物へ投与する段階を含む。1つの態様において、本発明のアンチセンス化合物は、IL 4R-αRNAのレベルまたは機能を効果的に阻害する。IL 4R-αmRNAレベルの減少は、IL 4R-αタンパク質発現産物の変化をもたらすことができるため、そういった変化の結果もまた、測定することができる。IL 4R-αRNAのレベルまたは機能、あるいは、タンパク質発現産物を効果的に阻害する本発明のアンチセンス化合物は、活性アンチセンス化合物であるとみなされる。1つの態様において、本発明のアンチセンス化合物は、IL 4R-αの発現を阻害し、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のRNAの減少を引き起こす。
本発明のオリゴマー化合物は、ヒトを含む動物への投与において、生物学的に活性な代謝物またはその残渣を(直接的または間接的に)提供することができる、すべての医薬的に許容可能な塩、エステル、または前記エステルの塩、またはその他の機能的な化学的に同等物すべてを含む。従って、例えば、開示は、プロドラッグ、および、本発明のオリゴマー化合物の医薬的に許容可能な塩、前記プロドラッグの医薬的に許容可能な塩、および、その他の生物学的同等物についてもまた記述される。
本発明のオリゴマー化合物はまた、他の分子、分子構造または化合物の混合物と、混合され、カプセル化され、結合され、またそうでなければ、付随され得る。
本発明の組成物は、2つあるいはそれ以上のオリゴマー化合物を含み得る。他の関連する態様において、本発明の組成物は、1あるいはそれ以上のアンチセンス化合物、特に、第一の核酸を標的としたオリゴヌクレオチド、および、第二の核酸標的を標的とする1あるいはそれ以上のさらなるアンチセンス化合物を含み得る。または、本発明の組成物は、同じ核酸標的の別の領域を標的とする2つまたはそれ以上のアンチセンス化合物を含み得る。2つまたはそれ以上が組合わさった化合物は、一緒にまたは連続して用いられ得る。本発明の組成物はまた、その他の、オリゴマー化合物でない治療薬と組み合わせられる可能性もある。
本発明の特定の化合物、組成物、および方法は、特定の態様に従って特異的に記述されており、以下の実施例は本発明の化合物を例証するためのみに働き、また、同じものに限定する意図はない。参考文献、GenBankアクセション番号、および本出願中で列挙した同様のものはそれぞれ、本明細書中にそれ全体を参考文献として援用される。
オリゴマー化合物の標的核酸発現に対する作用を、細胞型において試験した。
A549:
ヒト肺癌細胞株A549を、American Type Culture Collection(Manassas, VA)から取得した。A549細胞を、10%ウシ胎仔血清、100ユニット/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシン(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を添加したDMEM、高グルコース(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)中で日常的に培養した。細胞を、細胞がおよそ90%コンフルエントに達した際に、トリプシン処理および希釈により日常的に継代した。細胞を、オリゴマー化合物トランスフェクション実験において使用するために、96-ウェルプレート(Falcon-Prirnaria#3872)に、約5000細胞/ウェルの密度でまいた。
マウス脳内皮細胞株b.ENDを、Max Plank Institute(Bad Nauheim, Germany)のDr. Werner Risauから入手した。b.END細胞を、10%ウシ胎仔血清(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を添加したDMEM、高グルコース(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)中で日常的に培養した。細胞を、細胞がおよそ90%コンフルエントに達した際に、トリプシン処理および希釈により日常的に継代した。細胞を、オリゴマー化合物トランスフェクション実験において使用するために、96-ウェルプレート(Falcon-Primaria #353872, BD Biosciences, Bedford, MA)に、約3000細胞/ウェルの密度でまいた。
細胞が適切なコンフルエントに達した際、細胞を、トランスフェクション脂質および方法、例えばLipofectinTMを本質的に記載された通り製造者の指示により使用して、オリゴヌクレオチドにより処理する。
対照オリゴヌクレオチドを使用して、特定の細胞株についての最適オリゴマー化合物濃度を決定する。さらに、本発明のオリゴマー化合物をオリゴマー化合物スクリーニング実験または表現型アッセイにおいて試験する場合、対照オリゴヌクレオチドを本発明の化合物と平衡して試験する。
IL 4R-αmRNAレベルの定量は、ABI PRISMTM 7600、7700、または7900配列検出システム(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)を製造者の指示に従って使用して、リアルタイム定量PCRにより行った。
一連のオリゴマー化合物を、表1に引用した公開された配列を使用して、マウスIL 4R-αRNAの異なる領域を標的化するように設計した。化合物は、表3に示される。表3中のすべての化合物は、20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)であり、10個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央部“ギャップ”領域、およびその両側(5'および3')に5-ヌクレオチドの“ウィング”が隣接するものから構成される。ウィングは、2'-MOEヌクレオチドとしても知られている2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわたりホスホロチオエートである。すべてのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。これらの化合物を、それらの遺伝子標的mRNAレベルに対する作用について、本明細書中のその他の実施例において記載される様に、表2に示される標的-特異的プライマーおよびプローブを使用して、定量的リアルタイムPCRにより解析した。データは、2回の実験からの平均であり、ここで、b.END細胞はLipofectinTMを使用して150 nMの表3中の化合物により処理した。発現の減少は、表3において%阻害として示される。オリゴマー化合物-処理細胞の標的発現レベルが対照よりも高い場合、%阻害をゼロ阻害として表す。これらのオリゴマー化合物が阻害性である標的領域は、本明細書中において、“確認標的部分(validated target segments)”と呼ばれる。
一連のオリゴマー化合物を、表1において引用した公開された配列を使用して、ヒトIL 4R-αRNAの異なる領域を標的とするように設計した。これらの化合物は、表4および表5に示される。表4および表5中のすべての化合物は、20ヌクレオチドの長さのキメラオリゴヌクレオチド("ギャップマー")であり、10個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央部“ギャップ”領域、その両側(5'および3')に5-ヌクレオチドの“ウィング”が隣接するものから構成される。ウィングは、2'-MOEヌクレオチドとしても知られている2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわたりホスホロチオエートである。すべてのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。これらの化合物を、それらの遺伝子標的mRNAレベルに対する作用について、本明細書中のその他の実施例において記載される様に、表2に示される標的-特異的プライマーおよびプローブを使用して、定量的リアルタイムPCRにより解析した。データは、2回の実験からの平均であり、ここで、A549細胞はLipofectinTMを使用して、85 nMの表4中の化合物により処理し、そして70 nMの表5中の化合物により処理した。発現の減少は、表4および表5において%阻害として示される。オリゴマー化合物-処理細胞の標的発現レベルが対照よりも高い場合、%阻害をゼロ阻害として表す。これらのオリゴマー化合物が阻害性である標的領域は、本明細書中において、“確認標的部分(validated target segments)”と呼ばれる。
上述のスクリーニングに基づき、さらなる研究のためにISIS 231894を選択した。以下の表6に示される1、3、5、および7個のミスマッチ核酸塩基を含有するISIS 231894に基づいて、一連のオリゴヌクレオチドを設計した。ミスマッチは、化合物の末端部分ではなく、化合物の中央部分全体に点在することに注目すべきである。これにより、末端側にミスマッチを有するオリゴヌクレオチドよりも、標的mRNAに対するオリゴヌクレオチドの親和性が低下する。このような概念は周知であり、そして当業者により理解される。オリゴヌクレオチドは、ISIS 231894と同様に、5-10-5 MOE-ギャップマーである。すべてのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。ミスマッチ塩基には下線を引いた。
喘息は、疾患重症度および期間に関して様々なバリエーションを有する複合的疾患である。この点に鑑み、複数の動物モデルを設計し、この疾患の様々な観点を反映させた(図1を参照)。これらのモデルは、感作の日数および治療の日数に関して、いくらかの柔軟性を有すること、そしてもたらされた時系列が本明細書中で使用される日数を反映することが、理解される。ヒト喘息とアレルギー性炎症のマウスモデルとに共通するいくつかの重要な特徴が存在する。これらのうちの一つは、Th2サイトカイン、例えば、IL 4、IL 5、IL 9、およびIL 13、の産生が優勢である肺炎である。別の例は、粘液産生の増加を伴う杯細胞化生である。最後に、気道過敏性(AHR)が生じ、結果としてアセチルコリンまたはメタコリンなどのコリン作動性受容体アゴニストに対する感受性が上昇した。
誘導性アレルギー性炎症の急性モデルは、予防的治療のパラダイムである。動物を全身性投与(すなわち、腹腔内注射)によりアレルゲンに対して感作し、そして治療剤を用いて治療し、その後肺アレルゲンチャレンジの投与を行った(図1Aを参照)。このモデルにおいて、治療剤の投与後には本質的に一例も肺炎が存在しない。
気道反応性は、非侵襲性方法を使用してメタコリンエアロゾルにより気流閉塞を誘導することにより、評価した。使用したこの方法は、意識のあるマウスを拘束せず、プレチスモグラフ(Buxco Electronics, Inc. Troy, NY)の試験チャンバー中で静置する。このチャンバーと参照チャンバーとの間の圧力差を使用して、分用量、呼吸頻度、およびenhanced pause(Penh)を外挿した。Penhは、動物の呼吸サイクルの間のマウスにおける全肺気流の関数(すなわち、上部気道および下部気道における気流の合計)である、無次元パラメータである。Penhが低くなればなるほど、気流は多くなる。このパラメータは、以下に示す用に換気された動物(Hamelmann et al., 1997も参照)を使用した、伝統的で侵襲性の技術により測定した場合、肺抵抗性と非常に相関することが知られている。
炎症性細胞浸潤
ISIS 231894の炎症性細胞プロファイルに対する作用が解析された。細胞の差別化を、致死量のケタミンを注射した後の処置マウスの肺から回収した気管支肺胞洗浄(BAL)液に対して行った。ISIS 231894による処置により、顕著なBAL好酸球浸潤の減少が生じたが(1μg/kgおよび10μg/kgの両方について、ビヒクル処理対照に対してp<0.05)、ミスマッチ対照では生じなかった。これらの結果から、IL4R-αを標的とするオリゴヌクレオチドが、好酸球浸潤を減少させることにより、肺炎を減少させたことが示される。
アレルギー性炎症のマウスモデル〜再チャレンジモデル
誘導性アレルギー性炎症の再チャレンジモデルにより、以前に感作されそして空気アレルゲンに暴露されたマウスにおける薬理学的アプローチの試験ができる。局所アレルゲンチャレンジの最初のセットの間、マウスはアレルゲン-特異的記憶Tリンパ球を作り出す。引き続いて2回目のセットの吸入アレルゲンチャレンジに暴露すると、洗浄液中のTh2サイトカインレベルが増加することにより示されるように、肺における炎症性反応が亢進する。アレルギー性炎症の再チャレンジモデルには、0およびday 14の2回のIP OVA投与に加えてday 59およびday 60のOVAの2回目のシリーズのエアロゾル化投与、そしてday 24、day 25およびday 26の急性モデルの噴霧OVA投与(図1B参照)が含まれる。このモデルを使用して、1回目のセットの局所アレルゲンチャレンジの後にオリゴヌクレオチド処理をおこなう。このことにより、初回免疫応答とは対照的に、記憶の反応においては標的の役割の評価が可能になる。
Day 67の2回目の噴霧OVA再チャレンジ後6時間後に肺を採取した。肺細胞を組織のコラゲナーゼ処理後に回収し、そしてフローサイトメトリーにより解析した。IL 4R-αタンパク質発現を、肺好酸球およびマクロファージ(CD11b-陽性、GR-1陰性または低陽性);CD11lc-陽性およびMHCクラスII-陽性樹上細胞;およびE-カドヘリン-陽性上皮細胞の混合集団の表面上で測定した。データは、平均螢光強度±SEMで表す、N=4/群。* スチューデントのT-テストにより、ビヒクル処理対照に対してp<0.05。
Penhにより決定された、メタコリンに対する気道過敏性
day 60に、上述したように、AHRをPenhにより解析した。メタコリン誘導AHRにおける顕著な減少は、1.0または10.0μg/kg ISIS 231894を吸入する動物において見いだされたが、表10以下において見いだすことができるビヒクル対照動物と比較して、10μg/kgのミスマッチ対照オリゴヌクレオチド(ISIS 352492)では見いだされなかった。データは、群平均として提示される、N=10/群。* スチューデントのT-テストにより、ビヒクル処理対照に対してp<0.05。
気管支洗浄液中のサイトカインおよびケモカイン発現
気道におけるTh2サイトカインおよびケモカインの定量、および好酸球の定量を通じて、肺炎をモニターした。空気アレルゲン暴露後の肺におけるTh2サイトカインおよびケモカインの産生は、肺炎および気道過敏性の誘導と関連する。BAL液を回収し、そしてTh2サイトカインおよびケモカインレベルを、Day 67の、マウスにおける2回目の噴霧OVAチャレンジの6時間後に、ELISAにより定量した(n=4/群)。IL-13レベルは、Isis 231894の3回の投与すべてで、顕著に減少した(p<0.05)。ヒトIL-8のマウス類似体であるKCは、2種類のより高い用量のIsis 231894で顕著に減少し(p<0.05)、そしてIL-5およびMCP-1は、500μg/kgの用量で顕著に減少した(ビヒクル処理対照に対してp<0.05)。サイトカイン濃度は、複数点標準曲線の直線回帰分析から決定した。ミスマッチオリゴヌクレオチド、Isis 352942、は、Th2サイトカインレベルに対して何も効果を有さなかった。これらのデータから、IL-4α発現の阻害は、肺炎および気道過敏性に関連するアレルゲンチャレンジの後に、Th2サイトカインおよびケモカインの発現、特にTh2サイトカイン発現を減少させるために有効であることが示される。
細胞差別化をBALについて行った。BAL液中の好酸球の割合は、ビヒクル処理対照動物由来のBALFと比較して、顕著に減少した。結果を表12に示す。データは、群平均として提示される、N=10/群。* スチューデントのT-テストにより、ビヒクル対照と比較して、ビヒクル処理対照に対してp<0.05。
粘液産生
粘液は、肺炎の指標である。OVA再チャレンジマウスの気道におけるMuc5AC遺伝子発現、粘液レベル、および杯細胞化生を解析した。Muc5AC mRNAレベルを、Day 69に採取した肺組織由来の抽出物において、定量的RT-PCRにより解析した。発現レベルを、G3PDH発現に対して正規化した。Muc 5AC/β-アクチンmRNA比は、ビヒクル処理と比較して、231894により顕著に減少した(ビヒクル処理対照群と比較して、p<0.05)。352492処理動物においては、減少は見られなかった(n=4)。デジタル画像処理により決定したところ、IL 4R-αASOで処理したマウスから得たPAS-染色肺の粘液中では顕著に減少していたが(ビヒクル処理対照群と比較して、p<0.05)、しかしながら塩類溶液またはミスマッチ対照オリゴヌクレオチドで処理した場合にはそのような減少は見られなかった。
誘導性アレルギー性炎症の慢性モデルは、局所肺炎の確立後に開始されるASO処置による、治療上の処置方法を使用する。慢性モデルは、コラーゲン沈着および肺組織リモデリングを含むヒトにおける重度の喘息の組織学的特徴のいくつかに概括される。慢性OVAモデルは、急性モデルまたは再チャレンジモデルにおいて観察されたものよりも、より重度の疾患を生成する。
ビヒクル(すなわち、塩類溶液)を用いた治療と比較して、マウスを両用量のISIS 231894で処置したところ、結果としてメタコリン誘導性AHRが顕著に減少した。データは、群平均として示される、N=40/群。* スチューデントのT-テストにより、ビヒクル処理対照に対してp<0.05。
マウスをより高い用量の231894で処置したところ、ビヒクル対照と比較して、結果としてBAL液中の好酸球の割合が顕著に減少した。両用量のISIS 231894は、ビヒクル対照と比較して、BAL中の好中球の割合を顕著に減少した。データは、軍兵金として示される、N=7/群。* スチューデントのT-テストにより、ビヒクル対照に対してp<0.05。
肺炎はまた、サイトカインおよびケモカイン発現、並びに炎症性細胞浸潤によりモニタリングした。BALFを回収し、そして4種のTh2サイトカインレベルを、day 62の、アレルゲンチャレンジの6時間後に、ELISAにより定量した。BAL液の解析は、ビヒクル処置動物と比較して、高用量231894処理動物において、IL-5およびKCの顕著な減少を示した。
実施例7:アレルギー性炎症のマウスモデル、鼻炎評価項目についての解析
上述したものと同様のアレルゲン-誘導性急性および慢性鼻炎のマウスモデルを使用して、マウスにおけるアレルギー性鼻炎を研究した(Hussain et al., Larangyoscope. 112: 1819-1826. 2002;Iwasaki et al., J. Allergy Clin Immunol. 112: 134-140. 2003;Malm-Erjefaelt et al., Am J Respir Cell MoI Biol. 24:352-352.2001;McCusker et al., J Allergy Clin Immunol., 110: 891-898;Saito et el., Immunology. 104:226-234. 2001)。モデルのすべてにおいて、マウスを上述したように注射によりOVAで感作し、その後鼻内OVA滴加を行った。
喫煙は、肺気腫およびCOPDを含む(しかしこれらには限定されない)ヒトにおける多数の疾患を引き起こす可能性がある、肺過敏および炎症を引き起こすことが知られている。マウスを使用した喫煙動物モデル(Churg et al., 2002. Am. J. Respir. Cell. MoI. Biol. 27:368-347;Churg et al., 2004. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170:492-498、両文献とも、参考文献として本明細書中に援用する)、ラットを使用したもの(例えば、Sekhon et al., 1994. Am. J. Physiol. 267:L557-L563、参考文献として本明細書中に援用する)、およびモルモットを使用したもの(Selman et al., 1996. Am J. Physiol. 271:L734-L739、参考文献として本明細書中に援用する)を含む、多数の喫煙動物モデルが、当業者には周知である。動物は、当業者に対して周知な喫煙装置(例えば、Sekhon et al., 1994. Am. J. Physiol. 267.-L557-L563)を使用して、煙全体に対して暴露される。
エラスターゼは、煙-誘導性損傷により動員された好中球による肺損傷および肺炎の放出において、本質的なメディエータである。肺気腫のラットモデルは、エラスターゼ媒介性肺損傷のプロセスを解析するために、そしてそのような損傷または結果として生じる疾患と関連する病体を予防し、改善し、および/または治療するための可能性のある治療的介入を解析するために、開発された(Kuraki et al., 2002, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 166, 496-500、参考文献として本明細書中に援用される)。肺のすべての葉におけるエラスターゼの気管内投与は、BALF中のヘモグロビン増加により示される重度の肺出血;BALF中の好中球蓄積;弾性収縮力(elastic recoil)の過膨脹および分解の阻害を含む、気腫性変化を誘導した。組織病理学的変化には、エラスターゼ-誘導性空隙拡大および肺胞の破壊が含まれた。これらの変化は、ヒト肺気腫において観察されたものと同様である。
Claims (18)
- ヒトIL 4R-α(SEQ ID NO: 1)をコードする核酸分子を標的とし、ヒトIL 4R-αの発現を阻害する、12から35核酸塩基のオリゴマー化合物。
- SEQ ID NO: 1の2056-2101;167-265;284-303;353-372;428-450;487-525;530-550;619-640;642-668;735-760;777-796;917-950;998-1025;1053-1072;1077-1121;1160-1203;1221-1246;1395-1420;1492-1528;1608-1627;1670-1695;1700-1735;1777-1801;1976-1995;1997-2016;2126-2150;2230-2349;2390-2422;2524-2598;2626-2662;2674-2693;2731-2791;2856-2880;2915-2934;3053-3072;3103-3122;3168-3187;3198-3217;3297-3322;または3420-3451のヌクレオチドを標的とする、請求項1の化合物。
- SEQ ID NO: 1の2056-2101;167-265;284-303;353-372;428-450;487-525;530-550;619-640;642-668;735-760;777-796;917-950;998-1025;1053-1072;1077-1121;1160-1203;1221-1246;1395-1420;1492-1528;1608-1627;1670-1695;1700-1735;1777-1801;1976-1995;1997-2016;2126-2150;2230-2349;2390-2422;2524-2598;2626-2662;2674-2693;2731-2791;2856-2880;2915-2934;3053-3072;3103-3122;3168-3187;3198-3217;3297-3322;または3420-3451のヌクレオチドの20核酸塩基部分と、少なくとも約80%同一である、請求項1または2の化合物。
- SEQ ID NO: 1のヌクレオチド2056から2088の20核酸塩基部分と、少なくとも約80%同一である、請求項1から3のいずれかの化合物。
- SEQ ID NO: 281と少なくとも約80%同一である、請求項1から4のいずれかの化合物。
- 一本鎖の化合物である、請求項1から5のいずれかの化合物。
- 少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合、糖部分、または核酸塩基を有する、請求項1から6のいずれかの化合物。
- キメラオリゴヌクレオチドを含む、請求項7の化合物。
- 修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合を含む、請求項7または8の化合物。
- 修飾された糖部分が2'-MOE修飾を含む、請求項7または8の化合物。
- 修飾された核酸塩基が5-メチルシトシンを含む、請求項7または8の化合物。
- 請求項1から11のいずれかの化合物、および、医薬的に許容可能な浸透促進剤、担体、または希釈剤を含む、薬剤組成物。
- IL 4R-αの発現に伴う症状の予防、改善、または、処置のための、IL 4R-αの発現を阻害するための薬剤の調製における、請求項1から11のいずれかの化合物の使用。
- IL 4R-αの発現に伴う症状が、気道過敏性、または肺炎である、請求項13の使用。
- 肺炎および/または気道過敏性の予防、改善、および/または処置のための、前記介入の必要がある個人への、請求項1から11のいずれか一つの化合物の投与を含む方法。
- 投与が、動物の呼吸器管への局所的な投与を含む、請求項15の方法。
- 投与を含む、請求項15の方法。
- エアロゾル投与を含む、請求項15の方法。
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