JP2008543328A - ハイブリダイゼーションを安定化するコンストラクト - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図8
Description
本発明を、以下の説明と非限定的な実施例で、添付の図面を参照しながらより詳細に説明するが、図面は以下の通りである:
図1は、LNAおよびPNAオリゴマーとハイブリダイズした標的部位および配列の概略図を示す。このようなLNAおよびPNA標的部位を含むオリゴヌクレオチドを、プラスミドPN25のBglIIとAvrIIとの間の位置にクローニングした。a.テール−クランプビスPNA、PNA2582にハイブリダイズした59−merの二重鎖オリゴヌクレオチド、b.PN25プラスミドコンストラクト、c.PN252BSプラスミドコンストラクト、d.PNA2582およびそれに対応する標的部位、e.Z型LNAコンストラクト、ここにおいて、14−merのアーム(LNA389)はコード鎖に結合するが、それとは別の16−merのアーム(LNA390)は、7個の塩基対を含む架橋によって連結される2つのアームでテンプレート鎖に結合する。f.LNA389(Z型LNAの上半分)およびそれに対応する標的部位、g.LNA390(Z型LNAの下半分)およびそれに対応する標的部位、h.27−merのLNA7472およびそれに対応する標的部位、i.27−merのLNA7473およびそれに対応する標的部位。大文字は、LNAであり;小文字は、DNAであり;Cy−3、Cy−5は、標識されたプローブであり、Acrは、挿入される9−アミノアクリジンであり;Lysは、結合親和性を強化するためのリシンであり;Jは、プソイドイソシトシンであり、例えばエチレングリコール(8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸)リンカー単位である。
本発明に係るコンストラクトの目的は、DNA(理論上RNAも可能)の両方の鎖のトランス−ハイブリダイゼーションを介する、二本鎖DNA(RNA)間のハイブリダイゼーションを安定化させることである。本発明者等は、転写伸長を停止させるために本発明のコンストラクトを利用したが、その他の用途も可能であり、例えば、これらに限定されないが、真核性(ゲノム)の、および細菌またはウイルスのDNA/RNAの翻訳、ならびに転写および翻訳の阻害、または固定(アンカー)するための実体としての用途があり、これらは、本出願人によるWO00/15824(PCT/SE99/00398)で説明されている通りである。その説明、実施例および特許請求の範囲において、用語「オリゴヌクレオチド」は、用語「オリゴマー」と置き換えることができる。
細胞培養
U−2OS、COS−7、NIH−3T3細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC、HTB−96、ロックビル,メリーランド州)から得、UV4細胞系を、Thomas Helleday博士(ストックホルム大学(Stockholm University),スウェーデン)から入手した。これらの細胞を、10%(v/v)の熱で不活化したウシ胎児血清および100μg/mlのペニシリン−ストレプトマイシン(インビトロジェン(Invitrogen),ストックホルム,スウェーデン)が補足されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養した。細胞を、加湿した5%CO2インキュベーター中で、37℃で培養した。
1、2、4または6個の結合部位(BS)、PN251BS、PN252BS、PN254BSおよびPN256BSを有するプラスミドを標準的な分子クローニング法によって構築した。DNAフラグメントを、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーター/エンハンサー要素で駆動する不安定化強化緑色蛍光タンパク質(d2EGFP)レポーターを固定したPN25プラスミドのBglIIおよびAvrII部位に挿入した(20)。元のプラスミドは、Piruz Nahreini博士(コロラド大学(University of Colorado),コロラド州)から入手した。
細胞を、ウェルあたり1×106細胞の密度で6枚のウェルプレートに播種し、トランスフェクションの18時間前に付着させた。プラスミドPN252BSおよびPN256BS(1μg)を、20mMリン酸緩衝液(pH6.8)中で、10倍モル過剰のLNAオリゴマー、または20倍または150倍モル過剰のビスPNA(2.5μM)と37℃で一晩インキュベートした。フージーン6(Fugene 6)試薬(ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals),ストックホルム,スウェーデン)を用いて、PNA/LNAが結合したプラスミドDNAを導入した。トランスフェクション溶液を、製造元のプロトコールに従って無血清培地を用いて調製した。タンパク質発現を解析するために、細胞をトランスフェクションの48または72時間後に採取した。コトランスフェクション実験において、トランスフェクションの直前に、プラスミドPN256BSを量を増加させたPNA2582(90倍、180倍、270倍、360倍モル過剰)と混合し、続いて、フージーン6によって、PNAとプラスミドとの混合物をU−2OS細胞にトランスフェクションした。タンパク質発現の解析のために、細胞をトランスフェクションの48時間後に採取した。全ての実験を少なくとも3回繰り返した。値は、代表的な実験からの3連の平均((+/−)SD)として示した。
ビスPNA、およびZ型LNA結合部位(5’−CAGCGCATGGGTGCCCCTCCTCTTTCTTCA−3’、および5’−TGAAGAAAGAGGAGGGGCACCCATGCGCTG−3’)、およびこの研究で用いられるプライマーを含むオリゴヌクレオチドは、DNAテクノロジー社(DNA Technology A/S,オーフス,デンマーク)、またはサイバージーン社(Cybergene AB,フッディンゲ,スウェーデン)によって合成されたものであり、これらをカートリッジ型の精製装置(Cartridge Purification)を用いて精製した。図1に示されるペプチド核酸のPNA2582(Acr−Lys−Lys−CCCCTCCTCTTTCTT−(eg1)3−TTJTTTJTJJ−Lys−NH2、Acr(挿入される9−アミノアクリジン);Lys(リシン))を、Peter Nielsen教授(コペンハーゲン大学(University of Copenhagen),デンマーク)から入手した。これまでに述べられたようにしてPNAを合成した(21)。図4bに示されるPNA5171(n−OTCAATCTGCACCCATGCGCTGCTG−n)を、バイオシンセシス社(BioSynthesis Inc.,ルイスビル,テキサス州)から購入し、HPLCで精製した。図1および図4cに示される一連のCy−3またはCy−5末端が標識された、HPLCで精製したロックト核酸を、プロリゴ社(Proligo SAS,パリ,フランス)から購入した(図1)。
標的の二重鎖に結合するPNAを、ゲル移動度のシフト分析を用いることによって測定した。PNA結合部位を含む2つの相補的な59−merを合成した。この二重鎖DNAを、TE緩衝液(10mMトリス/1mMのEDTA、pH8.0)中で両方の59−merを1:1の比率で混合し、この溶液を95℃で5分間インキュベートし、続いて、それを室温にゆっくり冷却することによって製造した。PNA結合部位を含む59−merの固定濃度の二重鎖DNA、または一本鎖DNA鎖(1μM)をそれぞれ、20mMリン酸ナトリウムを含む溶液20μL中で濃度を増加させたPNAと37℃で一晩インキュベートした。この反応を、15%天然ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動によって解析した。
プラスミドの標的部位に結合するCy−3/Cy−5で標識したLNAを、モレキュラー・イメージャーFX(Molecular Imager FX)装置(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ(Bio−Rad Laboratories),スンドビーベリ,スウェーデン)を用いて検出した。プラスミドDNAのPN25、PN252BS、または、PN256BS(1μg)を、20mMリン酸緩衝液(pH6.8)中で、10倍過量のモル量のLNAオリゴマー、または、混合型のLNA/PNAオリゴマーと混合し、それぞれ37℃で一晩インキュベートした。この反応を、ノヴェックス(Novex(R))の4〜20%ポリアクリルアミドTBEゲル(インビトロジェン)での電気泳動によって分析した。
キアゲン(Qiagen)のRNA/DNAミニキット(キアゲン,ストックホルム,スウェーデン)を用いてトータルRNAを製造し、キアゲンワンステップRT−PCRキット(キアゲン)と遺伝子に特異的なプライマーを用いて、製造元のプロトコールに従ってRT−PCRを行った。d2EGFPに関するフォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ、5’−TCAGATCGCCTGGAGACG−3’、および5’−TGTTCTGCTGGTAGTGGTC−3’であった。GAPDHプライマーは、それぞれ、5’−GGGTGTGGGCAAGGTCATCC−3’、および5’−TCCACCACCCTGTTGCTGTA−3’であった(22)。RT−PCR産物を、ノヴェックス(R)の4〜20%ポリアクリルアミドTBEゲル(インビトロジェン)で分析した。d2EGFPプライマーによって、それぞれ680bp(PN25)および738bp(PN252BS)のフラグメントが増幅された。対数増幅期におけるd2EGFPおよびGAPDH転写物を検出するために、分析条件(すなわち、サイクル数、プライマー濃度、およびRNA テンプレートの量)を最適化する最初の実験を行った。
細胞を沸騰する溶解緩衝液(2%SDS、10mMトリスHCl、pH6.8)中で溶解させ、タンパク質溶解産物を、4〜20%のノヴェックス(R)SDS−PAGEゲル(インビトロジェン)で分画し、ニトロセルロースメンブレン(アドバンテックMFS(Advantec MFS),ダブリン,カリフォルニア州)に移した。このニトロセルロースメンブレンを、ブロッキング緩衝液(PBS中5%の粉乳、および0.1%トゥイーン(Tween)−20)を用いてインキュベートし、ウサギ抗GFP抗体(BDバイオサイエンス(BD Biosciences),ストックホルム,スウェーデン)の1:5000希釈液、それに続いてホースラディッシュペルオキシダーゼに接合したヤギ抗ウサギIgG(1:2000希釈)で探索した。免疫複合体を、スーパーシグナル(R)ウェスト・フェムト(Supersignal(R)West Femto)化学発光ウェスタンブロッティング検出システム(ピアース(Pierce),ロックフォード,イリノイ州)を用いて検出した。抗SUMO−1抗体(インビトロジェン)を用いて、インターナルコントロールとして重い90kDaのスモレート化した(sumolated)タンパク質を検出した。抗ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(アップステート,チャーロッツビル,バージニア州)をアプライして、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを検出した。
プラスミドPN252BS(2μg)を、20mMリン酸緩衝液(pH6.8)中で、10倍モル過剰のZ型LNA(2.5μM)と共に、またはそれらを含まないで37℃で一晩インキュベートした。LNAが結合したプラスミド、およびmock処理したプラスミドを0.1μg/μlの濃度に調節した。22mmのカバースリップ上で、NIH−3T3細胞を50%の密集度に増殖させ、0.25μg/μlのpDsRed2−N1(インビトロジェン)と、0.1μg/μlのLNAが結合したプラスミドまたはmock処理したプラスミドを、エッペンドルフの5246マイクロインジェクターを用いてそれぞれ細胞核に共にインジェクションした。マイクロインジェクションの16時間後に、細胞をカール・ツァイス(Carl Zeiss)の蛍光顕微鏡で可視化した。
細胞を6ウェルに予め播種し、トランスフェクションの章で説明されているようにトランスフェクションさせた。トランスフェクションの48時間後に、細胞を採取し、FACSキャリバー(FACSCalibur)フローサイトメーター(BDバイオサイエンス(BD Biosciences))で解析した。
PNAの直鎖状DNA標的配列への効率的な結合
PNAのホモプリン標的配列への結合を試験するために、ゲル移動度のシフト分析を適用した。単一の中央の固定部位を有する59bpの合成DNAオリゴマーを、PNA結合の二重鎖の標的として用いた(図1a)。固定部位は、伸長したビスPNAに相補的な15個のヌクレオチドからなり、これは、ワトソン−クリック塩基対を形成することを通してハイブリダイズするが、その一方で10個のヌクレオチドがフーグスティーン様式で結合する。ハイブリダイゼーションを最適化するために、本発明者等は、電荷の相互作用によってDNA結合を高める3個のリシン残基を含むテール−クランプPNA(PNA2582と称する)を用い、加えて、最大限の活性のために挿入されるアミノアクリジン成分を用いた。アミノアクリジンの付加は、DNA結合親和性を20〜150倍強化することが報告されている(23)。PNA2582において、ハイブリダイゼーションをさらに促進するために、シトシン残基をプソイドイソシトシン(またJ−塩基とも称される)で置換した。サンプルを、未変性PAGEを用いるゲル移動度のシフト分析によって、結合ついて解析した(図2a)。増加させた量のPNAを、固定濃度の二重鎖標的DNAとインキュベートした。特異的なPNAの濃度として、PNA2582を増大させたところ、減少したPNA−DNA複合体の移動度から明らかなように、結合した標的の二重鎖の比率は増加した。5μMの濃度(PNA:DNA比は5:1)で、実質的に全ての59−merの標的オリゴをシフトさせたところ、より遅い移動度の2種のフラグメントが得られた。これら2種の正確な組成は正確にはわっていないが、より低い移動度の形態に適度なスタッキングが存在する可能性がある。20μMのPNA濃度から、さらに減少した移動度を示す59−merの標的オリゴを含む不鮮明なパターンが観察された。この結果は、おそらくスタッキングによるDNAとPNAとの大きい複合体の形成によるものと思われる(24)。標的配列が欠失しているコントロール二本鎖の59−merのDNAオリゴ(iDNA)に、極めて弱い結合が検出され、これは、30μMの最大PNA濃度でのみ目視できた(図2a)。PNAがDNAに結合する能力は、PNA:DNA比が直線関係の場合に発揮されることを実証するために、単一の中央の固定部位を有する59bpの一本鎖DNAオリゴ(1μM)を、増加させた量のPNAとインキュベートした。このサンプルを、未変性PAGEを用いるゲル移動度のシフト分析によって、結合について解析した(図2b)。これらの結果によれば、直鎖状DNA二重鎖への結合から明らかなように、PNAは、有効なストランドインベーションを誘導し、適度なPNAとDNA標的部位との比率で高度に安定な三重鎖を形態することが可能であり、さらにPNAのDNA二重鎖へのインベーションは、厳密に濃度依存性である。このような主としてPNAの配列特異的な結合を確認するのに用いられる条件下で、PNA:DNA比は、最大30:1で最も適度であったことが示唆される。本発明者等は、複合体の形成は、この最適化されたPNAオリゴヌクレオチドの強い結合有効性と共にDNAオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションする際に適用された比較的高い最終濃度で起こりやすいと考えている。
インビトロでの転写に関してこれまで報告されているように(16、17)、哺乳動物細胞においてテール−クランプビスPNAが、転写伸長を停止させることができるかどうかを確認するために、PNAを、EGFPレポータープラスミドに生じたアンカー部位に結合させ、培養したヒトU−2OS骨肉腫細胞にトランスフェクションした。EGFPタンパク質の8の高い安定性により、本発明者等は、半減期がわずか2時間の不安定化形態であるd2EGFP(25)を用いた。プラスミドを、それぞれ15個のヌクレオチドからなる単一または複数の2、4または6個のホモプリンストレッチが含まれるように作製し、それらをCMVプロモーターとd2EGFPレポーター遺伝子との間に位置するBglIIおよびAvrII制限部位に導入した。ホモプリンストレッチは、アミノアクリジンを含むテール−クランプPNA2582の固定部位として役立つ。図1のパネルbおよびcに示される構築されたPN25およびPN252BSプラスミド、加えてPN256BSプラスミド(1μg)を、結合部位毎に20倍モル過剰PNA2582と混合し、20mMリン酸緩衝液中で37℃で一晩インキュベートし、PNA−DNA−PNA三重鎖構造を形成した(図1d)。PNAが結合したプラスミド、およびmock処理したプラスミドを、フージーン6を用いてU−2OS細胞にトランスフェクションした。培養の2日後に、d2EGFPタンパク質発現の強度を蛍光顕微鏡による解析によってモニターした(図3a)。20倍モル過剰PNA2582前処理された1、2または6個の固定部位を含むプラスミドでトランスフェクションされたU−2OS細胞において、GFP発現の減少は検出されなかった(図3a、データ示さず)。興味深いことに、制限酵素(HindIII)で消化したプラスミドのゲル移動度のシフトによって、プラスミドにおける本質的に全ての標的部位が、PNA2582によって占められていることが証明されたにもかかわらず(図3c、右のパネル、データ示さず)、作用が失われていることが観察された。それに対して、結合部位毎に150倍モル過剰PNA2582で前処理されたPN256BSプラスミドでトランスフェクションされたU−2OS細胞において、d2EGFPタンパク質発現における有意なダウンレギュレーションが観察された(図3a、パネル5)。この場合におけるPNA:プラスミドのモル比が、900:1であったことから、この現象は、極めて過量のPNAの存在によって引き起こされる複数の結合部位の周辺に大きい複合体の形成による可能性がある。遺伝子発現の阻害のための結合部位の数が9であることの影響を調査するために、本発明者等は、テール−クランプPNA、PNA2582の作用を観察するために1、2、4または6個のPNA固定部位を有するプラスミドを研究した。全てのプラスミドを、結合部位毎に150倍モル過剰PNA2582とプレハイブリダイズさせ、続いて、PNAが結合したプラスミドを、U−2OS細胞にトランスフェクションした。48時間培養した後、d2EGFPタンパク質発現の強度を、FACS解析によってモニターした(図3d)。デンシトメーター測定から、6個の結合部位を有するプラスミドがd2EGFP発現の85%阻害されたことが明らかになった。結合部位の数が減少するにつれて、阻害の程度も減少するようになる(4BSプラスミドは65%阻害、2BSプラスミドは40%阻害、1BSプラスミドは20%以下の阻害;コントロールプラスミドPN25において、d2EGFPの発現における減少は観察されなかった)。その後、本発明者等は、PN256BSプラスミドと増加させた量のPNA2582とを共にトランスフェクションした。培養の48時間後、d2EGFPタンパク質発現を、ウェスタンブロット解析によってモニターした。デンシトメーター測定から、360倍モル過剰のPNAによって、最大のd2EGFPの阻害(90%)が引き起こされたが、それに対してPNAの量が減少するにつれて、阻害効率も減少したことが明らかになった。同様に、NIH−3T3、COS−7細胞系でも類似の結果が観察された(データ示さず)。PNAの転写における特異的な作用を定義するために、本発明者等はまた、シス位に位置し、LTRプロモーターによって駆動するネオマイシン耐性遺伝子の発現レベルも測定した(図1c)。この分析から、PNAは、ネオマイシン耐性遺伝子の転写に影響を与えないことが実証された。
PNA:DNA比が20:1で標的部位の結合が飽和している場合、PNAはレポーター遺伝子の転写をブロックしないことから、本発明者等は、その他の核酸類似体、すなわちLNAの作用を分析することを試みた。本発明者等は、LNAを用いた以前の経験から、ビスPNAと比較して、LNAは、二本鎖DNAにあまり十分に結合しないということを知っている(26)(および未発表のデータ)。この理由のために、まず同時にDNA二重鎖両方の鎖に結合する新規なタイプのコンストラクト(図1e)を試験した。このオリゴマーのZ様の構造を形成する形状のために、さらにDNAの左巻きの形態との混同を回避するために、本発明者等は、これらのコンストラクトを「Z型LNA」と命名した。さらに、本発明の者等は、LNAのDNAへのハイブリダイゼーションは、ゲル移動度のシフト分析において、チャージされていないPNAと比較してリターディションが少なくなることも確認している。この理由のために、それらの検出を簡単にするために、この研究で用いられる全てのLNAオリゴマーの末端を、Cy−3またはCy−5蛍光団で標識した。高度に精製したスーパーコイルプラスミドPN25およびPN252BS(5μg)を、16−merのLNA390と共に14−merのLNA389によって形成された10倍モル過剰のZ型LNAと混合した。コントロールとして、LNA7472およびLNA7473と命名された27−merの直鎖状LNA(図1hおよびi)を含めた。LNAが結合したスーパーコイルプラスミド、およびコントロールプラスミドを、4〜20%ポリアクリルアミドTBEゲルで泳動した(図4a)。スーパーコイルプラスミドをSYBRゴールドで染色した(図4a、パネル1)。Cy−5と接触させた結果から、Z型LNAにより誘導された結合は、直鎖状Z−アーム、LNA390(16−mer、Z型LNAの下半分;図1g)の1つにより誘導された結合よりもかなり強力であり、それに対して、結合部位が欠失したコントロールプラスミドPN25においては、Z型LNAによる極めて弱い非特異的な結合しか観察されなかった(図4a、パネル2)ことが明らかになった。Cy−3と接触させた結果から、Z型LNAにより誘導された結合も、その他のアーム、LNA389(14−mer、Z型LNAの上半分;図1f)により誘導された結合よりも強かったことが明らかになった。同様に、Cy−3を分析した場合、コントロールプラスミドに対して、Z型LNAの極めて弱い非特異的な結合しか観察されなかった(図4a、パネル3)。二重鎖DNA結合においてZ型LNAによって強化されたシグナルは、特徴的なZ−構造によるものであるという可能性、または「Z」の両方の半分が寄与するより長いハイブリダイゼーション領域によって引き起こされるという可能性を区別するために、2種の直鎖状の27−merのコントロールLNAオリゴマー、すなわちそれぞれ11個のアンチセンスLNA7472、およびセンスLNA7473(図1hおよびi)を用いた。これらの伸長した27−merの一本鎖LNAの結合も極めて有効であることが見出された。本発明者等は、図4aで観察されるように、アンチセンスの27−merの直鎖状LNA7472が、センスの27−merの直鎖状LNA7473シグナルと比較して強いシグナルを付与する(図4a、パネル2および3)ことを認識していたが、これはLNA7473オリゴに含まれるフルオロフォア標識の量が比較的低いことが理由である可能性が最も高い(データ示さず)。
Z型LNAの同様の形状のPNAへのハイブリダイゼーション能力を比較するために、PNA化学に基づいて同じ2つのアームを合成した。溶解性を促進するために、2個のアスパラギン残基を、N末端(5’末端)に付加した。プラスミドへのハイブリダイゼーションを起こりやすくすることによって、負電荷を有するLNAとの比較を妨げるといった電荷の相互作用の影響を回避するために、リシンではなくアスパラギンを用いた。逆に言えば、正電荷を有するリシン残基と負電荷を有するLNAとの想定される相互作用がむしろ、そのストランドインベーションする能力を損う可能性がある。しかしながら、混合してハイブリダイゼーションによる架橋を形成させると、各PNA−アームが可溶性であるにもかかわらず、溶解性が顕著に減少することが観察され、このような現象は長いPNA配列を用いた場合に往々にして観察された(27)。それゆえに、本発明者等は、LNA−PNAZ型コンストラクトのハイブリッド形態を結合について調査し、ここにおいて、Z型LNA中の1つのアーム(LNA389)を、同一な配列を有する(図4b、右のパネル)PNAアーム(PNA5171)で置換した。この分析によれば、Z型LNAの1つのアーム(LNA389)をPNA5171で置き換えると、Cy−5シグナルがよりいっそう弱くなることが示された(図4b、パネル2)。同様に、Cy−3と接触させることから、Z型LNAにより誘導された結合は、1個のPNAと1個のLNAアームとを有するZ−ハイブリッドにより誘導された結合よりもかなり強力であった(図4b、パネル3)ことが明らかになった。この結果は、DNA/PNAハイブリッドの融解温度は、DNA/LNAの融解温度よりも低いこと(28)による可能性がある。結合に関する2つのLNAアーム間の架橋構造の重要性を理解するために、2種の7−merのLNAオリゴマー(LNA71およびLNA72;図4c、右のパネル)を用いて、Z型LNAの2つのLNAアームの相互結合をブロックした。この実験によれば、Z型LNAの架橋構造がブロックされると、Cy−5シグナルがかなり弱くなることが示された(図4c、パネル1)。同様に、Cy−3と接触させることから、無傷のZ型LNAにより誘導された結合は、Z−LNAにおいて架橋形成をなくした後に誘導された結合よりも効率的であった(図4c、パネル2)ことが示された。要約すると、14−merまたは16−merの直鎖状LNAのDNA二重鎖への結合活性は、Z型LNAまたは27−merの直鎖状LNAと比較して相当限定される。デンシトメーター測定から、Z型LNAにより誘導された結合は、LNA390により誘導された結合よりも10倍効率的であり、LNA389により誘導された結合よりも7倍効率的であった(図4d)ことが明らかになった。さらに、Z型LNAの1つのアームをPNAオリゴマーで置換した場合、DNA二重鎖に結合する作用は有意に減少した。第三に、Z型LNAの2つのLNA間の架橋構造のリンケージをブロックした場合、同様に結合は有意に減少した。
LNAが、配列特異的な方法で遺伝子の転写をブロックするためのアンチジーン試薬として役立つ可能性があるのかどうかを調査するために、本発明者等はさらに、ヒト骨肉腫細胞におけるd2EGFPタンパク質の発現に対する、新規なZ型LNAコンストラクトの作用を研究した。13種の2つの結合部位を有するPN252BSプラスミド(1μg)を、10倍モル過剰のZ型LNAオリゴマー、またはコントロールLNAオリゴマーLNA389、LNA390、LNA7472、LNA7473それぞれと、20mMリン酸緩衝液中で、37℃で一晩プレハイブリダイズさせた(図1f−i)。Z型のLNAが結合したプラスミド、mock処理したプラスミド、およびその他のコントロールサンプルを、予め播種したU−2OSにトランスフェクションした。48時間後、細胞を採取し、細胞溶解産物のウェスタンブロットによって、d2EGFPタンパク質発現を測定した(図5a)。デンシトメーター測定から、Z型LNAが結合したプラスミドにおいて、d2EGFPタンパク質発現の特異的な阻害が90%を超えることが解明された。mock処理したプラスミド、またはコントロールLNAオリゴマーのいずれかを用いたところ、d2EGFPタンパク質発現における有意な減少は観察されなかった(図5b)。蛍光顕微鏡でトランスフェクションした細胞を分析したところ、同じ結果が得られた(図5c)。転写に対するPNAの特異的な作用を定義するために、本発明者等は、LTRプロモーターによって駆動されるネオマイシン耐性遺伝子の発現レベルも測定した(図1c)。Z型LNAは、ネオマイシン耐性遺伝子の転写に影響を与えないことが実証された(図5i)。加えて、d2EGFPのmRNAのレベルをRT−PCRで評価した。mRNAレベルは、Z型LNAが結合したPN252BSプラスミドによってトランスフェクションした細胞において同じく90%以上減少したが、Z型LNAで処理されたPN25コントロールプラスミドでトランスフェクションした細胞で検出されたd2EGFPmRNAのレベルにおいて有意な減少はなかった。GAPDHのmRNAレベルは、等しいRNAローディングを示した(図5h)。線維芽細胞系のNIH−3T3でも類似の結果が観察された(データ示さず)。また本発明者等はさらに、骨肉腫細胞における遺伝子転写の阻害に対するZ型LNAの能力と、Z−PNA−LNAハイブリッドの能力とを比較した(図4b、右のパネル)。プラスミドPN25およびPN252BSを、Z−LNAまたはZ−PNA−LNAハイブリッドそれぞれとプレハイブリダイズさせ、その後、U−2OS細胞にトランスフェクションした。48時間後、細胞を採取し、ウェスタンブロットによって解析した(図5d)。デンシトメーター測定から、d2EGFPタンパク質の発現14において、Z型LNAにより顕著な減少が誘導されたが、それに対して、Z−PNA−LNAハイブリッドは、d2EGFPの発現において30%の減少しか誘導されない(図5e)ことが明らかになった。mockプラスミドにおいては、タンパク質発現における有意な減少は観察されなかった。同様にして、改変されていないZ型LNAと、架橋の形成をなくしたブロックした型との骨肉腫細胞における遺伝子転写の阻害に対する比較(図4c、右のパネル)を行った。デンシトメーター測定から、Z型LNAによるd2EGFPタンパク質の発現における顕著な減少が明らかにあったが、それに対して、結合解析からの結果によれば、架橋の形成が阻害されたZ−LNAは、d2EGFPの発現において20〜30%の減少しか誘導させなかった(図5g)。細胞による取り込みまたは核への導入が、Z型LNAの結合によって影響される可能性を除外するために、本発明者等は、Z型LNAを有するプレハイブリダイズしたPN252BSの、NIH−3T3細胞への核内のマイクロインジェクションを行った。LNAに結合したPN252BSプラスミド、およびmock処理したプラスミドをインジェクションしてから16時間後に、d2EGFP遺伝子発現を測定した(図6)。プラスミドDNA単独がインジェクションされた細胞におけるd2EGFP発現の強度と比較すると(図6a)、Z型LNAが結合したプラスミドがインジェクションされた細胞においてd2EGFP遺伝子発現の強度は有意に減少した(図6b)。全てのケースにおいて、コントロールプラスミド、pDsRed2−N1がマーカーとして共にインジェクションした(図6cおよび6d)。
LNAは、その他のポリメラーゼに関するアンチジーン試薬として役立つ可能性があるかどうかを調査するために、EGFPの転写のためにU6プロモーターを用いた。U6プロモーターは、RNAポリメラーゼIIIによって転写される。pH6.8の20mMリン酸緩衝液中で、LNAをプラスミドと共に37℃で一晩インキュベートした。フージーン6試薬(ロシュ)とインキュベートした後に、トランスフェクションを行った。48時間後、細胞を採取して、前述したようにウェスタンブロットによってEGFPluc融合タンパク質の発現を検出した。
生きた細胞において転写をブロックすると、飽和したPNAが結合できないことに関して考えられる説明は、転写の間にPNAが除去されることであり、その他の可能性は、DNA修復機構が変更された構造を認識し、プラスミドのこの部分を切り出すことである。三重鎖を形成するPNAが、細胞におけるDNA修復メカニズムを活性化できるかどうかを調査するために、PNAが結合したレポーター遺伝子プラスミドを、ヌクレオチドの切り出しによる修復に欠陥を有するUV4細胞にトランスフェクションした(29)。48時間後、細胞を採取し、細胞の溶解産物のウェスタンブロットによってd2EGFPタンパク質発現を測定した(図3b)。20倍モル過剰のビスPNA2582でプレハイブリダイズしたプラスミドを用いたところd2EGFPタンパク質発現の減少は検出されなかったが、それに対して、Z型LNAが結合したプラスミドを用いたところ、このサンプルにおいて遺伝子サイレンシングは容易に観察された。ゲルシフト解析によれば、20倍モル過剰のPNAは、プラスミド上の標的部位を飽和させるのに十分であった(図3c)。従って、ヌクレオチドの切り出しによる修復に欠陥を有するUV4細胞などの異なる由来の数種の哺乳動物細胞系において、タンパク質発現の阻害は観察することはできなかった。150倍モル過剰のPNA中でプレハイブリダイズした場合に、PN256BSでトランスフェクションされた細胞において阻害が観察できるにもかかわらず、この現象は、このプラスミド中の複数の結合部位の周辺に上記の分子複合体が形成されることによるためであり得る。
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Claims (21)
- 少なくとも第1および第2のオリゴヌクレオチドを含み、互に連結したコンストラクトであり、該コンストラクトが二本鎖DNAにトランス様式でハイブリダイズして転写に影響を与える能力を有するコンストラクトであって、ここにおいて、これらオリゴヌクレオチドが以下:
−配列特異的なワトソン−クリック塩基対形成、
−共有結合のリンカー、もしくは上記オリゴヌクレオチドの主鎖間もしくは塩基間の直接的共有結合、または
−非共有結合のリンカー、もしくは上記オリゴヌクレオチドの主鎖間もしくは塩基間の直接的非共有結合、
の一つを介して互いに連結することを含むコンストラクト。 - 2つより多いオリゴヌクレオチドが用いられる場合に、少なくとも1つが、両末端で連結している、請求項1に記載のコンストラクト。
- オリゴヌクレオチドが、DNA、RNA、それらの類似体、またはそれらの任意の混合物から選択され、ここにおいて、該オリゴヌクレオチドの組成が、その種々のオリゴヌクレオチドから独立して選択することができる、請求項1または2に記載のコンストラクト。
- DNAおよび/またはRNAオリゴヌクレオチドが、LNAを少なくとも1個含有する、請求項3に記載のコンストラクト。
- DNAおよび/またはRNAオリゴヌクレオチドが、通常のLNA、および/または機能化したアミノ−LNAを少なくとも1個含有する、請求項3に記載のコンストラクト。
- DNAおよび/またはRNAオリゴヌクレオチドが、PNAを少なくとも1個含有する、請求項3に記載のコンストラクト。
- 二本鎖DNAにおけるオリゴヌクレオチドの標的配列が、5塩基以下の隔りで近接している、請求項1に記載のコンストラクト。
- オリゴヌクレオチドの標的配列が隣接している、請求項1に記載のコンストラクト。
- オリゴヌクレオチドの標的配列が、部分的にオーバーラップしている、請求項1に記載のコンストラクト。
- オリゴヌクレオチドの標的配列は、1〜8塩基がオーバーラップしている、請求項9に記載のコンストラクト。
- オリゴヌクレオチドの標的配列が、実質的にまたは完全にオーバーラップしており、コンストラクトの完全な、または部分的であるが有意な自己ハイブリダイゼーションが、改変された塩基および/または改変された主鎖の使用によって妨げられる、請求項9に記載のコンストラクト。
- 追加の接合体が、オリゴヌクレオチドのいずれかの内部に、またはその末端のいずれかに付加されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載のコンストラクト。
- 追加の接合体が、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、標識、例えば蛍光または同位体標識、生物学的に活性な分子または不活性分子から選択される、請求項12に
記載のコンストラクト。 - DNA/RNAの翻訳、ならびに転写および翻訳の阻害のための、請求項1〜13のいずれか一項に記載のコンストラクトの使用。
- DNAまたはRNAが、真核性(ゲノム)、細菌、またはウイルス由来である、請求項14に記載の使用。
- DNAまたはRNAが、腫瘍遺伝子である、請求項14に記載の使用。
- DNAまたはRNAが、組織培養における細胞の分化を調節する遺伝子である、請求項14に記載の使用。
- 治療のために遺伝子発現をサイレンシングする薬剤を製造するための、請求項1〜13のいずれか一項に記載のコンストラクトの使用。
- 遺伝子が、腫瘍遺伝子である、請求項18に記載の使用。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載のコンストラクトを使用した、DNAまたはRNAの翻訳および転写を阻害する方法。
- DNAまたはRNAが、真核性(ゲノム)、細菌、またはウイルス由来である、請求項20に記載の方法。
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