JP2008543328A - ハイブリダイゼーションを安定化するコンストラクト - Google Patents

Abstract

互いに連結された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドから生産された、二本鎖ＤＮＡにトランス様式でハイブリダイズして転写に影響を与える能力を有するＺ型コンストラクトであって、ここにおいて、オリゴヌクレオチドは、配列特異的なワトソン−クリック塩基対形成；共有結合のリンカー、または、前記オリゴヌクレオチドの主鎖間もしくは塩基間の直接的共有結合；または、非共有結合のリンカー、または前記オリゴヌクレオチドの主鎖間もしくは塩基間の直接的非共有結合の１つを介して互いに連結される。
【選択図】 図８

Description

本発明は、遺伝子工学分野に関係し、特にＤＮＡまたはＲＮＡの両方の鎖間のトランス型安定化ハイブリダイゼーション（ｔｒａｎｓ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を介する二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡへのハイブリダイゼーションを安定化するためのコンストラクトに関する。

異常な遺伝子発現は、悪性腫瘍のような多くのヒトの疾患に関連している。これらの病気の治療において、特異的な遺伝子発現のサイレンシングが非常に大きな影響を有する可能性がある。配列特異的な方法でＤＮＡ二重鎖に結合する低分子物質は、遺伝子操作のための魅力的な候補であり、遺伝子ベースの治療剤に開発される見込みがある。

ロックト核酸（ＬＮＡ）塩基は、リボース環の２’と４’位との間で架橋したメチレン炭素を含む（１，２）。この制約によりオリゴヌクレオチド主鎖をプレオーガナイズ（ｐｒｅｏｒｇａｎｉｚｅ）させ、ＬＮＡ塩基１個置換毎にＴ_m値を１０℃も増加させることができる。ＬＮＡは、ワトソン−クリック塩基対を形成する点で天然核酸に類似している。ＬＮＡ塩基は標準的なＤＮＡ／ＲＮＡ合成プロトコールによって導入されるので、ＬＮＡは純粋なＬＮＡオリゴマーまたは混合型のＬＮＡ／ＤＮＡオリゴマーとして合成することができる。その上、ＬＮＡは相補的核酸に極めて効率的に結合し、インビトロおよび培養した哺乳動物細胞において活性なアンチセンス剤であり（３〜５）、さらにデコイ（６）、アプタマー（７）、ＬＮＡザイム（ＬＮＡｚｙｍｅ）（８）、およびＤＮＡ修復物質（９）でもあることが実証されている。しかしながら、ＬＮＡは、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、ＤＮＡ二重鎖へのストランドインベーション（ｓｔｒａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ）のための低分子物質としても、アンチジーン剤としてもあまり高くない有効性しか示していない。

ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、繰り返しのＮ−（２−アミノ−エチル）−グリシン単位からなる中性のプソイドペプチド主鎖を有するオリゴヌクレオチド類似体である（１０）。ＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対形成のルールに従うＤＮＡおよびＲＮＡを配列特異的に認識することができ（１１）、そのハイブリッド複合体は非常に高い熱安定性と特有のイオン強度の効果を示す。また、ＰＮＡはＤＮＡの二重鎖ホモプリン配列を認識することもでき、これにストランドインベーションによって結合し、ループを形成したＤＮＡ鎖と極めて安定なＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡの三重鎖を形成する（１２〜１４）。ピリミジンＰＮＡをフレキシブルなリンカーによって連結してビスＰＮＡを形成する場合、ストランドインベーションが最も効率的であり、この中の一つのＰＮＡ鎖がワトソン−クリック塩基対形成によってＤＮＡにハイブリダイズし、一方、他方のＰＮＡ鎖がフーグスティーン塩基対形成によって結合する。ＰＮＡは、細胞のヌクレアーゼおよびプロテアーゼの両方に対して耐性を有するようである（１５）。さらに近年、テール−クランプＰＮＡによって、ストランドインベーションに関する応用が広がって、該ＰＮＡが二重鎖ＤＮＡに結合でき、インビトロで転写を阻害することが報告されている（１６，１７）。これらのＰＮＡの特性は、アンチジーン分子としての使用に利点を有していてよいはずであった。これまで、インビトロでの無細胞実験から、三重鎖インベーション複合体が、特にテンプレート鎖に位置する場合、転写開始、加えて転写伸長の有効な阻害剤であるということが十分に確立されているにもかかわらず（１６〜１９）、遺憾ながら、本発明者等は、これらの三重鎖インベーション複合体が、培養した哺乳動物細胞において転写伸長を停止させることに成功できるということの直接的な証明について何も知らない。

ＷＯ９６／０２５５８Ａ１（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９０８４）は、非環状の主鎖を有するＤＮＡ類似体、すなわちペプチド核酸の含有に基づくコンストラクトに関する。さらに、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、フーグスティーン結合を示す。また、２種のオリゴヌクレオチドおよび／またはペプチド間のリンケージは、共有結合であることも明確に述べられている。本発明に係るコンストラクトの主な利点の一つは、塩基対を形成するリンケージである。

ＷＯ０３／０９１４５５Ａ１（ＰＣＴ／ＵＳ０３／１２４８０）では、一種のＺ型ＬＮＡが示されているが、ただし一つの鎖がワトソン−クリックで結合し、第二がフーグスティーンで結合している点で重要な差を有するものである。二つの鎖は、同じ（シス）鎖と結合していてもよいし、または異なる（トランス）鎖と結合していてもよい。フーグスティーン結合した鎖は、同じ位置、またはその他の位置のいずれかで結合し、Ｚ様の構造（ただしフーグスティーンを含む）を作出することができる。

ＷＯ９５／０１３６９Ａ１（ＰＣＴ／ＩＢ９４／００２１１）は、主にデコイ、アンチセンス、蛍光プローブのための、およびＤＮＡ結合タンパク質を結合／ブロックするためのオリゴヌクレオチドとしてのＰＮＡの使用を開示している。ワトソン−クリックを介した塩基対形成は、２つのオリゴヌクレオチド間に存在し得るリンカーとして記載されていない。リンカーは、共有結合または非共有結合で結合し、水素と塩基対を形成し、二本鎖構造を形成するための場所に２個のオリゴヌクレオチドを保持するために付加されている。さらに、直鎖状の主鎖しか問題とされていない。

ＷＯ９９／２２０１８Ａ２（ＰＣＴ／ＵＳ９８／２２７８５）には、類似体プローブの使用が記載されているが、検出、同定および定量化に限られている。機能化する手段（遺伝子サイレンシング、遺伝子移入など）については何も述べられていないようである。この文書は、本発明に係るＺ型の内部リンケージと間違えられる可能性がある２つのオリゴヌクレオチド間の部分的なハイブリダイゼーションを記載しているに過ぎない。この記載はむしろ、ハイブリダイズさせて２つのオリゴヌクレオチド間のクエンチングを達成することに焦点を当てており、分離すると蛍光シグナルを与える（正しい配列が存在しており、オリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションが競合している場合に、そのサンプルは発光する）。

本発明者等は、数々の報告において、ビスＰＮＡは、インビトロでは作用する可能性があると示されているにもかかわらず、ビスＰＮＡは、適切なモル量を超過すると遺伝子のダウンレギュレーションを引き起こさない可能性があることを見出した。この研究において、本発明者等は、培養した哺乳動物細胞においてテール−クランプＰＮＡをテンプレート鎖の内部に持たせることによって遺伝子の転写をブロックする可能性を調査することを試みた。膨大な量のＰＮＡ（１５０倍モル過剰（150-fold molar excess））が６個のＰＮＡ結合部位を有するプラスミドに付加された場合だけ、タンパク質発現の減少が観察された。この現象は、膨大な量のＰＮＡが結合したことによって複数の結合部位の周囲に大きな複合体が形成されたことに起因する可能性がある。

しかしながら、本発明者等は、一方のＬＮＡ鎖がコード鎖に結合し、他方の鎖が逆のテンプレート鎖に結合し、７個の塩基対形成を含む架橋によって２つの直鎖状ＬＮＡ鎖が連結された新規のアンチジーン試薬である「Ｚ型ＬＮＡ」を作製した（図１）。本発明者等は、Ｚ型ＬＮＡが、ＤＮＡ二重鎖への有効なストランドインベーションを誘導し、培養した哺乳動物細胞において「Ｚ型ＬＮＡ」がアンチジーン試薬として極めて強力な遺伝子のダウンレギュレーション（９５％〜１００％）を誘導したが、それに対して直鎖状ＬＮＡおよびビス−ＰＮＡはいずれも誘導しなかったことを証明した。

本発明者等は、二本鎖ＤＮＡにトランス様式でハイブリダイズして転写に影響を与える能力を有するコンストラクトを提供し、本コンストラクトは、互いに連結された少なくとも２個のオリゴヌクレオチドから生産され、ここにおいて、これらのオリゴヌクレオチドは、配列特異的なワトソン−クリック塩基対形成；共有結合のリンカー、または前記オリゴヌクレオチドの主鎖間もしくは塩基間の直接的共有結合；または非共有結合のリンカーまたは前記オリゴヌクレオチドの主鎖間もしくは塩基間の直接的非共有結合の１つを介して互いに連結される。

本発明およびそれらの実施態様は、添付された特許請求の範囲でさらに定義され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

図面の説明
本発明を、以下の説明と非限定的な実施例で、添付の図面を参照しながらより詳細に説明するが、図面は以下の通りである：
図１は、ＬＮＡおよびＰＮＡオリゴマーとハイブリダイズした標的部位および配列の概略図を示す。このようなＬＮＡおよびＰＮＡ標的部位を含むオリゴヌクレオチドを、プラスミドＰＮ２５のＢｇｌＩＩとＡｖｒＩＩとの間の位置にクローニングした。ａ．テール−クランプビスＰＮＡ、ＰＮＡ２５８２にハイブリダイズした５９−ｍｅｒの二重鎖オリゴヌクレオチド、ｂ．ＰＮ２５プラスミドコンストラクト、ｃ．ＰＮ２５２ＢＳプラスミドコンストラクト、ｄ．ＰＮＡ２５８２およびそれに対応する標的部位、ｅ．Ｚ型ＬＮＡコンストラクト、ここにおいて、１４−ｍｅｒのアーム（ＬＮＡ３８９）はコード鎖に結合するが、それとは別の１６−ｍｅｒのアーム（ＬＮＡ３９０）は、７個の塩基対を含む架橋によって連結される２つのアームでテンプレート鎖に結合する。ｆ．ＬＮＡ３８９（Ｚ型ＬＮＡの上半分）およびそれに対応する標的部位、ｇ．ＬＮＡ３９０（Ｚ型ＬＮＡの下半分）およびそれに対応する標的部位、ｈ．２７−ｍｅｒのＬＮＡ７４７２およびそれに対応する標的部位、ｉ．２７−ｍｅｒのＬＮＡ７４７３およびそれに対応する標的部位。大文字は、ＬＮＡであり；小文字は、ＤＮＡであり；Ｃｙ−３、Ｃｙ−５は、標識されたプローブであり、Ａｃｒは、挿入される９−アミノアクリジンであり；Ｌｙｓは、結合親和性を強化するためのリシンであり；Ｊは、プソイドイソシトシンであり、例えばエチレングリコール（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）リンカー単位である。

図２は、ＰＮＡ２５８２結合の分析を示す。ａ．二重鎖ＤＮＡオリゴ（１μＭ）の固定濃度を、２０ｍＭリン酸ナトリウムを含む高濃度のＰＮＡ（２０μｌ）と３７℃で一晩インキュベートした。ｉＤＮＡは、標的部位が欠失した無関係のコントロールＤＮＡである。ｂ．固定濃度の一本鎖ＤＮＡ（１μＭ）を、高濃度の２０ｍＭリン酸ナトリウムを含むＰＮＡ（２０μｌ）と３７℃で一晩インキュベートした。この反応を、１５％未変性（native）ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動によって分析した。

図３は、不安定型緑色蛍光タンパク質発現に対するＰＮＡ三重鎖の作用を図示する。ａ．ＰＮＡ結合部位を含んで、またはそれらを含まないプラスミドＰＮ２５を、ＰＮＡ２５８２とプレハイブリダイズさせ、その後Ｕ−２ＯＳ細胞にトランスフェクションした。２日後に、ｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現の強度を蛍光顕微鏡分析によってモニターした。１は、ＰＮＡを含まないＰＮ２５２ＢＳであり、２は、２０倍モル過剰のＰＮＡ２５８２とプレハイブリダイズしたＰＮ２５２ＢＳであり、３は、ＰＮＡを含まないＰＮ２５６ＢＳであり、４は、２０倍モル過剰のＰＮＡ２５８２とプレハイブリダイズしたＰＮ２５６ＢＳであり、５は、１５０倍モル過剰のＰＮＡ２５８２とプレハイブリダイズしたＰＮ２５６ＢＳであり、６は、ＰＮＡを含まないＰＮ２５であり、７は、１５０倍モル過剰のＰＮＡ２５８２とプレハイブリダイズしたＰＮ２５である。ｂ．プラスミドＰＮ２５およびＰＮ２５２ＢＳは、２０倍モル過剰のＺ型ＬＮＡオリゴマーおよびビスＰＮＡ２５８２とそれぞれプレハイブリダイズさせ、続いて、ＵＶ４細胞にトランスフェクションした。４８時間後、細胞を採取し、ウェスタンブロットでｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現を測定した。ｃ．ゲル移動度の実験、プラスミドＰＮ２５およびＰＮ２５６ＢＳの消化物を、２０倍モル過剰のＰＮＡ２５８２でプレハイブリダイズし、またはそれを用いないでプレハイブリダイズした；左のパネル；コントロールプラスミドＰＮ２５においてシフトを観察することができず、右のパネル；プラスミドＰＮ２５６ＢＳに対して約１００％の標的ＤＮＡが飽和し、シフトした。ｄ．プラスミドＰＮ２５、ＰＮ２５−１ＢＳ、２ＢＳ、４ＢＳおよび６ＢＳを、それぞれ１５０倍モル過剰のＰＮＡ２５８２とプレハイブリダイズさせ、続いてＵ−２ＯＳ細胞にトランスフェクションした。４８時間後、細胞を採取し、ＦＡＣＳでｄ２ＥＧＦＰ発現を解析した。

図４は、その他のコンストラクトと比較した、ＤＮＡ二重鎖とＺ型ＬＮＡとの結合を示す。ａ．プラスミドＰＮ２５およびＰＮ２５２ＢＳ（５μｇ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）中で、１０倍モル過剰のＺ型ＬＮＡ、ＬＮＡ３８９、ＬＮＡ３９０、ＬＮＡ７４７２、およびＬＮＡ７４７３それぞれと３７℃で一晩混合し、４〜２０％ポリアクリルアミドＴＢＥゲルで分析した。（１）ＳＹＢＲゴールド（ＳＹＢＲ ＧＯＬＤ）で染色されたスーパーコイルプラスミドからのシグナルである。（２）Ｃｙ−５プローブで標識されたＬＮＡからのシグナルである。（３）Ｃｙ−３プローブで標識されたＬＮＡからのシグナルである。ｂ．プラスミドＰＮ２５およびＰＮ２５６ＢＳ（３μｇ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）中で、１０倍過量のモル量のＺ型ＬＮＡ、ＬＮＡ３８９、ＬＮＡ３９０、混合型のＰＮＡ５１７１／ＬＮＡ３９０それぞれと混合し、３７℃で一晩インキュベートした。（１）ＳＹＢＲゴールドで染色されたスーパーコイルプラスミドからのシグナルである。（２）Ｃｙ−５プローブで標識されたＬＮＡからのシグナルである。（３）Ｃｙ−３プローブで標識されたＬＮＡからのシグナルである。右のパネルは、Ｚ型の混合型のＰＮＡ５１７１／ＬＮＡ３９０の概略図である。ｃ．２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）中で、プラスミドＰＮ２５２ＢＳ（３μｇ）を、１０倍モル過剰のＺ型ＬＮＡ、ブロック化Ｚ−ＬＮＡ（２つのＺ−ＬＮＡアームと混合する前に、２つのＬＮＡオリゴマーを連結する架橋を、相補的なＬＮＡ７１およびＬＮＡ７２とのハイブリダイゼーションでブロックした）とそれぞれ混合し、３７℃で一晩インキュベートした。（１）Ｃｙ−５プローブで標識されたＬＮＡからのシグナルである。（２）Ｃｙ−３プローブで標識されたＬＮＡからのシグナルである。（３）ＳＹＢＲゴールドで染色されたスーパーコイルプラスミドからのシグナルである。右のパネルは、ブロック化Ｚ−ＬＮＡの概略図である。ｄ．様々なＬＮＡコンストラクトの結合効率のデンシトメーター解析である。（１）Ｃｙ−５強度である。（２）Ｃｙ−３強度である。

図５は、Ｚ型ＬＮＡによって引き起こされた不安定型ＥＧＦＰ発現の阻害を示し、ａ．プラスミドＰＮ２５およびＰＮ２５２ＢＳが、１０倍モル過剰のＺ型ＬＮＡオリゴマー、およびコントロールＬＮＡオリゴマーＬＮＡ３８９、ＬＮＡ３９０、ＬＮＡ７４７２、ＬＮＡ７４７３のそれぞれとプレハイブリダイズさせ、その後、Ｕ−２ＯＳにトランスフェクションした。４８時間後、細胞を採取し、ウェスタンブロットによってｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現を測定した。ｂ．ｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現における阻害のデンシトメーター解析である。ｃ．ａで説明されているようにしてトランスフェクションした細胞のイメージングであり、ｄ．プラスミドＰＮ２５およびＰＮ２５２ＢＳを、Ｚ型ＬＮＡおよび混合型のＺ−ＰＮＡ／ＬＮＡのそれぞれとプレハイブリダイズさせ、その後、Ｕ−２ＯＳにトランスフェクションした。４８時間後、細胞を採取し、ウェスタンブロットによってｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現を測定した。ｅ．ｄ２ＥＧＦＰ発現における阻害のデンシトメーター解析である。ｆ．プラスミドＰＮ２５２ＢＳを、Ｚ型ＬＮＡ、およびブロック化Ｚ−ＬＮＡ（図４の説明文を参照）それぞれとプレハイブリダイズさせ、その後、Ｕ−２ＯＳにトランスフェクションした。４８時間後、細胞を採取し、ウェスタンブロットによってｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現を測定した。ｇ．ｄ２ＥＧＦＰ発現における阻害のデンシトメーター解析である。ｈ．ｄ２ＥＧＦＰｍＲＮＡレベルを、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。細胞のトランスフェクションは、ａで説明されているようにして行った。ｉ．プラスミドＰＮ２５およびＰＮ２５２ＢＳを、２０倍モル過剰のＺ型ＬＮＡとそれぞれプレハイブリダイズさせ、続いて、Ｕ２ＯＳ細胞にトランスフェクションした。４８時間後、細胞を採取し、ウェスタンブロットによってｄ２ＥＧＦＰおよびＮＰＴタンパク質発現を測定した。

図６は、マイクロインジェクション後の、Ｚ型ＬＮＡ結合が介在するｄ２ＥＧＦＰ遺伝子発現のブロックを示す。ＬＮＡに結合したＰＮ２５２ＢＳプラスミド、およびｍｏｃｋ処理したプラスミドを核内にインジェクションしてから１６時間後に、ｄ２ＥＧＦＰ遺伝子発現を測定した。全てのケースにおいて、コントロールプラスミドであるｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１を共にインジェクションした（ｃｏ−ｉｎｊｅｃｔｅｄ）。上部のパネルに、ｄ２ＥＧＦＰの蛍光を示し、下部のパネルに、ＤｓＲｅｄ２蛍光を示す。ａおよびｃは、ＰＮ２５２ＢＳプラスミドＤＮＡ単独をインジェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。ｂおよびｄは、Ｚ型ＬＮＡに結合したＰＮ２５２ＢＳをインジェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３である。

図７は、Ｕ６プロモーター遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩをブロックすることによってＥＧＦＰタンパク質のその他のプロモーターをダウンレギュレーションすることを示す。レーン１、ＥＧＦＰｌｕｃプラスミド単独でのトランスフェクションである。レーン２、ＥＧＦＰｌｕｃおよびＵ６−ｓｈｌｕｃプラスミド（０ＢＳ）（１：４）両方でのトランスフェクションである。レーン３、ＥＧＦＰｌｕｃおよびＺ型ＬＮＡでプレハイブリダイズされた−Ｕ６−ｓｈｌｕｃプラスミド（０ＢＳ）（１：４）両方でのトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）である。レーン４、ＥＧＦＰｌｕｃ、およびＵ６−ｓｈｌｕｃプラスミド（２ＢＳ）（１：４）両方でのトランスフェクションである。レーン５、ＥＧＦＰｌｕｃ、およびＺ型ＬＮＡでプレハイブリダイズされた−Ｕ６−ｓｈｌｕｃプラスミド（２ＢＳ）（１：４）両方でのトランスフェクションである。

図８は、ａ）ワトソン−クリック様塩基対形成、ｂ）共有結合のリンケージ、ｃ）非共有結合のリンケージによって形成された本発明のＺ型コンストラクトの略図である。オリゴヌクレオチドの方向は逆平行（ａｎｔｉ−ｐａｒａｌｌｅｌ）であり、ｙ’は、５’または３’のいずれかである。

図９は、ＬＮＡの代替の化学組成を図示しており、ノース（Ｎｏｒｔｈ）またはサウス（Ｓｏｕｔｈ）リボース環のいずれかである。ａ）は、オキシ−ＬＮＡであり、ｂ）は、アミノ−ＬＮＡであり、ｃ）は、ＰＮＡである。

図１０は、本発明の実施態様において、どのように両方のオリゴヌクレオチドが、ワトソン−クリック様塩基対形成によって逆平行のトランスの形態で二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズするかを示す。

図１１は、コンストラクトが、伸長したＺ型構成要素の複数のＺ型構成要素を含むような実施態様を説明する。

説明
本発明に係るコンストラクトの目的は、ＤＮＡ（理論上ＲＮＡも可能）の両方の鎖のトランス−ハイブリダイゼーションを介する、二本鎖ＤＮＡ（ＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションを安定化させることである。本発明者等は、転写伸長を停止させるために本発明のコンストラクトを利用したが、その他の用途も可能であり、例えば、これらに限定されないが、真核性（ゲノム）の、および細菌またはウイルスのＤＮＡ／ＲＮＡの翻訳、ならびに転写および翻訳の阻害、または固定（アンカー）するための実体としての用途があり、これらは、本出願人によるＷＯ００／１５８２４（ＰＣＴ／ＳＥ９９／００３９８）で説明されている通りである。その説明、実施例および特許請求の範囲において、用語「オリゴヌクレオチド」は、用語「オリゴマー」と置き換えることができる。

本発明者等は、少なくとも第一および第二のオリゴヌクレオチドを含むコンストラクトを提供し、試験しているが、ここにおいて、前記第一のオリゴヌクレオチドは、３’または５’末端それぞれで、前記第二のオリゴヌクレオチドの３’または５’末端それぞれに連結され、前記第一のオリゴヌクレオチドの３’末端は、前記第二のオリゴヌクレオチドの５’末端に向かっており（逆もまた同様）、好ましくは配列特異的なワトソン−クリック塩基対形成を介して、逆平行の方向に向いている。このコンストラクトは費用効率が高く、組み合わせが柔軟であり、合成が簡単である。

用語「逆平行」は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドに関して、ＤＮＡの２つの鎖は、逆の化学極性を有すること、または、別の言い方をすれば、それらの糖−リン酸主鎖が、逆の方向に進んでいることを意味する。核酸の方向は、ＤＮＡの糖−リン酸主鎖におけるリボース環の炭素を参照することによって特定される。５’は、リボース環中の、酸素原子から時計回りに数えて５番目の炭素と特定され、３’は、環中の３番目の炭素と特定される。次いで、これらの炭素との関係で、ＤＮＡ分子の方向およびＤＮＡ分子に準拠した方向が特定される。例えば、結果として起こる発現のための転写、すなわちＤＮＡをＲＮＡに転写する作用は、常に５’から３’への方向で起こる。５’メチル基と、ヒドロキシル基に結合した３’環炭素との間の化学的性質が異なるために、核酸の重合が、逆方向、３’から５’への方向で起こり得ない。

ある実施態様によれば、前記オリゴヌクレオチドは、共有結合のリンカー、または前記オリゴヌクレオチドの主鎖間もしくは塩基間の直接的共有結合を介して互いに連結される。

その他の実施態様によれば、前記オリゴヌクレオチドは、非共有結合のリンカー、または前記オリゴヌクレオチドの主鎖間もしくは塩基間の直接的非共有結合を介して互いに連結される。

その他の実施態様によれば、前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの類似体、またはそれらの任意の混合物から選択され、ここにおいて、前記オリゴヌクレオチドの組成は、様々なオリゴヌクレオチドから独立して選択することができる。好ましくは、前記ＤＮＡおよび／またはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡを少なくとも１個含有する。

その他の実施態様によれば、前記ＤＮＡおよび／またはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、機能化したアミノ−ＬＮＡを少なくとも１個含有する。アミノ−ＬＮＡは市販されていないが、その中性電荷のために、これが好ましい選択の場合がある。Ｒ側鎖は何であってもよく、最も簡単な形態は、水素となる。予備実験では、通常のオキシ−ＬＮＡを用いた。二本鎖ＤＮＡへのストランドインベーションのために、リボース環のサウス（ＤＮＡ様の）立体配置は、ＬＮＡおよびアミノ−ＬＮＡ両方に関して好ましいと予想された。しかしながら、ノースの立体配置のみが利用可能であった。

さらにその他の実施態様によれば、前記ＤＮＡおよび／またはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＰＮＡを少なくとも１個含有する。

さらにその他の実施態様によれば、前記コンストラクトは、トランス様式で二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする。前記オリゴヌクレオチドの標的配列が、好ましくは、５塩基以下を隔てて近接している。あるいは、前記オリゴヌクレオチドの標的配列が、隣接している。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドの標的配列が、部分的にオーバーラップしており、最も好ましくは１〜８塩基がオーバーラップする。このようにすることによって、目的とするＤＮＡ結合領域において自己ハイブリダイゼーションを併発することなく、ハイブリッドに最良の安定性が付与されることになる。予備実験において、本発明者等は、１塩基のオーバーラップを用いた。

ここ数年、多くの前駆細胞（様々な組織に関する幹細胞を含む）の特徴付けが行われてきた。胚性幹（ＥＳ）細胞は細胞の最も未成熟の形態とみなされており、これらはその他のあらゆる細胞系統に分化する能力を有する。また幹細胞の成熟型も存在する。この分化プロセスは、多数の転写活性化因子および阻害物質を介して調節される。Ｚ型コンストラクトは、これらのプロセスの新規な合成レギュレーターとして用いることができる。一つの非限定的な実施例において、培養したＥＳ細胞（または成熟幹細胞）は、１種またはそれ以上のＺ型コンストラクトの添加を介して特定の細胞系統に分化するように作製することができる。特定の細胞期が始まったら、もはや分化を誘導する物質を添加する必要がなくなるため、Ｚ型コンストラクトの使用は一過性となる。このような細胞は、ヒトまたはその他の種において再生治療に用いることができる。

しかしながら、本発明者等はまた、オリゴヌクレオチドの標的配列が、実質的に、または完全にオーバーラップしたコンストラクトも予定しており、このようなコンストラクトの完全な自己ハイブリダイゼーションは、改変された塩基および／または改変された主鎖を使用することで妨げられる。

また本発明には、前記オリゴヌクレオチドのいずれかの内部に、またはその末端のいずれかに追加の接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）が付加された、上述のようなコンストラクトも含まれる。前記追加の接合体は、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、標識、例えば蛍光または同位体標識、生物学的に活性な分子または不活性分子から選択される。

方法
細胞培養
Ｕ−２ＯＳ、ＣＯＳ−７、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−９６、ロックビル，メリーランド州）から得、ＵＶ４細胞系を、Ｔｈｏｍａｓ Ｈｅｌｌｅｄａｙ博士（ストックホルム大学（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），スウェーデン）から入手した。これらの細胞を、１０％（ｖ／ｖ）の熱で不活化したウシ胎児血清および１００μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ストックホルム，スウェーデン）が補足されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞を、加湿した５％ＣＯ₂インキュベーター中で、３７℃で培養した。

プラスミドコンストラクト
１、２、４または６個の結合部位（ＢＳ）、ＰＮ２５１ＢＳ、ＰＮ２５２ＢＳ、ＰＮ２５４ＢＳおよびＰＮ２５６ＢＳを有するプラスミドを標準的な分子クローニング法によって構築した。ＤＮＡフラグメントを、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーター／エンハンサー要素で駆動する不安定化強化緑色蛍光タンパク質（ｄ２ＥＧＦＰ）レポーターを固定したＰＮ２５プラスミドのＢｇｌＩＩおよびＡｖｒＩＩ部位に挿入した（２０）。元のプラスミドは、Ｐｉｒｕｚ Ｎａｈｒｅｉｎｉ博士（コロラド大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ），コロラド州）から入手した。

トランスフェクション
細胞を、ウェルあたり１×１０⁶細胞の密度で６枚のウェルプレートに播種し、トランスフェクションの１８時間前に付着させた。プラスミドＰＮ２５２ＢＳおよびＰＮ２５６ＢＳ（１μｇ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）中で、１０倍モル過剰のＬＮＡオリゴマー、または２０倍または１５０倍モル過剰のビスＰＮＡ（２.５μＭ）と３７℃で一晩インキュベートした。フージーン６（Ｆｕｇｅｎｅ ６）試薬（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），ストックホルム，スウェーデン）を用いて、ＰＮＡ／ＬＮＡが結合したプラスミドＤＮＡを導入した。トランスフェクション溶液を、製造元のプロトコールに従って無血清培地を用いて調製した。タンパク質発現を解析するために、細胞をトランスフェクションの４８または７２時間後に採取した。コトランスフェクション実験において、トランスフェクションの直前に、プラスミドＰＮ２５６ＢＳを量を増加させたＰＮＡ２５８２（９０倍、１８０倍、２７０倍、３６０倍モル過剰）と混合し、続いて、フージーン６によって、ＰＮＡとプラスミドとの混合物をＵ−２ＯＳ細胞にトランスフェクションした。タンパク質発現の解析のために、細胞をトランスフェクションの４８時間後に採取した。全ての実験を少なくとも３回繰り返した。値は、代表的な実験からの３連の平均（（＋／−）ＳＤ）として示した。

オリゴヌクレオチド、 ＰＮＡおよびＬＮＡ
ビスＰＮＡ、およびＺ型ＬＮＡ結合部位（５’−ＣＡＧＣＧＣＡＴＧＧＧＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡ−３’、および５’−ＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＡＣＣＣＡＴＧＣＧＣＴＧ−３’）、およびこの研究で用いられるプライマーを含むオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡテクノロジー社（ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ／Ｓ，オーフス，デンマーク）、またはサイバージーン社（Ｃｙｂｅｒｇｅｎｅ ＡＢ，フッディンゲ，スウェーデン）によって合成されたものであり、これらをカートリッジ型の精製装置（Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を用いて精製した。図１に示されるペプチド核酸のＰＮＡ２５８２（Ａｃｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＣＣＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣＴＴ−（ｅｇ１）３−ＴＴＪＴＴＴＪＴＪＪ−Ｌｙｓ−ＮＨ２、Ａｃｒ（挿入される９−アミノアクリジン）；Ｌｙｓ（リシン））を、Ｐｅｔｅｒ Ｎｉｅｌｓｅｎ教授（コペンハーゲン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ），デンマーク）から入手した。これまでに述べられたようにしてＰＮＡを合成した（２１）。図４ｂに示されるＰＮＡ５１７１（ｎ−ＯＴＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＣＡＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧ−ｎ）を、バイオシンセシス社（ＢｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．，ルイスビル，テキサス州）から購入し、ＨＰＬＣで精製した。図１および図４ｃに示される一連のＣｙ−３またはＣｙ−５末端が標識された、ＨＰＬＣで精製したロックト核酸を、プロリゴ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ ＳＡＳ，パリ，フランス）から購入した（図１）。

ＰＮＡ結合分析
標的の二重鎖に結合するＰＮＡを、ゲル移動度のシフト分析を用いることによって測定した。ＰＮＡ結合部位を含む２つの相補的な５９−ｍｅｒを合成した。この二重鎖ＤＮＡを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス／１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）中で両方の５９−ｍｅｒを１：１の比率で混合し、この溶液を９５℃で５分間インキュベートし、続いて、それを室温にゆっくり冷却することによって製造した。ＰＮＡ結合部位を含む５９−ｍｅｒの固定濃度の二重鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＤＮＡ鎖（１μＭ）をそれぞれ、２０ｍＭリン酸ナトリウムを含む溶液２０μＬ中で濃度を増加させたＰＮＡと３７℃で一晩インキュベートした。この反応を、１５％天然ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動によって解析した。

ＬＮＡ結合分析
プラスミドの標的部位に結合するＣｙ−３／Ｃｙ−５で標識したＬＮＡを、モレキュラー・イメージャーＦＸ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸ）装置（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），スンドビーベリ，スウェーデン）を用いて検出した。プラスミドＤＮＡのＰＮ２５、ＰＮ２５２ＢＳ、または、ＰＮ２５６ＢＳ（１μｇ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）中で、１０倍過量のモル量のＬＮＡオリゴマー、または、混合型のＬＮＡ／ＰＮＡオリゴマーと混合し、それぞれ３７℃で一晩インキュベートした。この反応を、ノヴェックス（Ｎｏｖｅｘ^（R)）の４〜２０％ポリアクリルアミドＴＢＥゲル（インビトロジェン）での電気泳動によって分析した。

ＲＴ−ＰＣＲ
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のＲＮＡ／ＤＮＡミニキット（キアゲン，ストックホルム，スウェーデン）を用いてトータルＲＮＡを製造し、キアゲンワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（キアゲン）と遺伝子に特異的なプライマーを用いて、製造元のプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。ｄ２ＥＧＦＰに関するフォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ、５’−ＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧ−３’、および５’−ＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＣ−３’であった。ＧＡＰＤＨプライマーは、それぞれ、５’−ＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣ−３’、および５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’であった（２２）。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、ノヴェックス^(R)の４〜２０％ポリアクリルアミドＴＢＥゲル（インビトロジェン）で分析した。ｄ２ＥＧＦＰプライマーによって、それぞれ６８０ｂｐ（ＰＮ２５）および７３８ｂｐ（ＰＮ２５２ＢＳ）のフラグメントが増幅された。対数増幅期におけるｄ２ＥＧＦＰおよびＧＡＰＤＨ転写物を検出するために、分析条件（すなわち、サイクル数、プライマー濃度、およびＲＮＡ テンプレートの量）を最適化する最初の実験を行った。

ウェスタンブロット解析
細胞を沸騰する溶解緩衝液（２％ＳＤＳ、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ６.８）中で溶解させ、タンパク質溶解産物を、４〜２０％のノヴェックス^(R)ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）で分画し、ニトロセルロースメンブレン（アドバンテックＭＦＳ（Ａｄｖａｎｔｅｃ ＭＦＳ），ダブリン，カリフォルニア州）に移した。このニトロセルロースメンブレンを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％の粉乳、および０.１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０）を用いてインキュベートし、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），ストックホルム，スウェーデン）の１：５０００希釈液、それに続いてホースラディッシュペルオキシダーゼに接合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２０００希釈）で探索した。免疫複合体を、スーパーシグナル^(R)ウェスト・フェムト（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ^(R)Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ）化学発光ウェスタンブロッティング検出システム（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ），ロックフォード，イリノイ州）を用いて検出した。抗ＳＵＭＯ−１抗体（インビトロジェン）を用いて、インターナルコントロールとして重い９０ｋＤａのスモレート化した（ｓｕｍｏｌａｔｅｄ）タンパク質を検出した。抗ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（アップステート，チャーロッツビル，バージニア州）をアプライして、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを検出した。

マイクロインジェクションおよび免疫蛍光法
プラスミドＰＮ２５２ＢＳ（２μｇ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）中で、１０倍モル過剰のＺ型ＬＮＡ（２.５μＭ）と共に、またはそれらを含まないで３７℃で一晩インキュベートした。ＬＮＡが結合したプラスミド、およびｍｏｃｋ処理したプラスミドを０.１μｇ／μｌの濃度に調節した。２２ｍｍのカバースリップ上で、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を５０％の密集度に増殖させ、０.２５μｇ／μｌのｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１（インビトロジェン）と、０.１μｇ／μｌのＬＮＡが結合したプラスミドまたはｍｏｃｋ処理したプラスミドを、エッペンドルフの５２４６マイクロインジェクターを用いてそれぞれ細胞核に共にインジェクションした。マイクロインジェクションの１６時間後に、細胞をカール・ツァイス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）の蛍光顕微鏡で可視化した。

ＦＡＣＳ解析
細胞を６ウェルに予め播種し、トランスフェクションの章で説明されているようにトランスフェクションさせた。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を採取し、ＦＡＣＳキャリバー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）フローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で解析した。

結果
ＰＮＡの直鎖状ＤＮＡ標的配列への効率的な結合
ＰＮＡのホモプリン標的配列への結合を試験するために、ゲル移動度のシフト分析を適用した。単一の中央の固定部位を有する５９ｂｐの合成ＤＮＡオリゴマーを、ＰＮＡ結合の二重鎖の標的として用いた（図１ａ）。固定部位は、伸長したビスＰＮＡに相補的な１５個のヌクレオチドからなり、これは、ワトソン−クリック塩基対を形成することを通してハイブリダイズするが、その一方で１０個のヌクレオチドがフーグスティーン様式で結合する。ハイブリダイゼーションを最適化するために、本発明者等は、電荷の相互作用によってＤＮＡ結合を高める３個のリシン残基を含むテール−クランプＰＮＡ（ＰＮＡ２５８２と称する）を用い、加えて、最大限の活性のために挿入されるアミノアクリジン成分を用いた。アミノアクリジンの付加は、ＤＮＡ結合親和性を２０〜１５０倍強化することが報告されている（２３）。ＰＮＡ２５８２において、ハイブリダイゼーションをさらに促進するために、シトシン残基をプソイドイソシトシン（またＪ−塩基とも称される）で置換した。サンプルを、未変性ＰＡＧＥを用いるゲル移動度のシフト分析によって、結合ついて解析した（図２ａ）。増加させた量のＰＮＡを、固定濃度の二重鎖標的ＤＮＡとインキュベートした。特異的なＰＮＡの濃度として、ＰＮＡ２５８２を増大させたところ、減少したＰＮＡ−ＤＮＡ複合体の移動度から明らかなように、結合した標的の二重鎖の比率は増加した。５μＭの濃度（ＰＮＡ：ＤＮＡ比は５：１）で、実質的に全ての５９−ｍｅｒの標的オリゴをシフトさせたところ、より遅い移動度の２種のフラグメントが得られた。これら２種の正確な組成は正確にはわっていないが、より低い移動度の形態に適度なスタッキングが存在する可能性がある。２０μＭのＰＮＡ濃度から、さらに減少した移動度を示す５９−ｍｅｒの標的オリゴを含む不鮮明なパターンが観察された。この結果は、おそらくスタッキングによるＤＮＡとＰＮＡとの大きい複合体の形成によるものと思われる（２４）。標的配列が欠失しているコントロール二本鎖の５９−ｍｅｒのＤＮＡオリゴ（ｉＤＮＡ）に、極めて弱い結合が検出され、これは、３０μＭの最大ＰＮＡ濃度でのみ目視できた（図２ａ）。ＰＮＡがＤＮＡに結合する能力は、ＰＮＡ：ＤＮＡ比が直線関係の場合に発揮されることを実証するために、単一の中央の固定部位を有する５９ｂｐの一本鎖ＤＮＡオリゴ（１μＭ）を、増加させた量のＰＮＡとインキュベートした。このサンプルを、未変性ＰＡＧＥを用いるゲル移動度のシフト分析によって、結合について解析した（図２ｂ）。これらの結果によれば、直鎖状ＤＮＡ二重鎖への結合から明らかなように、ＰＮＡは、有効なストランドインベーションを誘導し、適度なＰＮＡとＤＮＡ標的部位との比率で高度に安定な三重鎖を形態することが可能であり、さらにＰＮＡのＤＮＡ二重鎖へのインベーションは、厳密に濃度依存性である。このような主としてＰＮＡの配列特異的な結合を確認するのに用いられる条件下で、ＰＮＡ：ＤＮＡ比は、最大３０：１で最も適度であったことが示唆される。本発明者等は、複合体の形成は、この最適化されたＰＮＡオリゴヌクレオチドの強い結合有効性と共にＤＮＡオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションする際に適用された比較的高い最終濃度で起こりやすいと考えている。

哺乳動物細胞におけるビスＰＮＡ三重鎖の不安定型緑色蛍光タンパク質発現への作用
インビトロでの転写に関してこれまで報告されているように（１６、１７）、哺乳動物細胞においてテール−クランプビスＰＮＡが、転写伸長を停止させることができるかどうかを確認するために、ＰＮＡを、ＥＧＦＰレポータープラスミドに生じたアンカー部位に結合させ、培養したヒトＵ−２ＯＳ骨肉腫細胞にトランスフェクションした。ＥＧＦＰタンパク質の８の高い安定性により、本発明者等は、半減期がわずか２時間の不安定化形態であるｄ２ＥＧＦＰ（２５）を用いた。プラスミドを、それぞれ１５個のヌクレオチドからなる単一または複数の２、４または６個のホモプリンストレッチが含まれるように作製し、それらをＣＭＶプロモーターとｄ２ＥＧＦＰレポーター遺伝子との間に位置するＢｇｌＩＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位に導入した。ホモプリンストレッチは、アミノアクリジンを含むテール−クランプＰＮＡ２５８２の固定部位として役立つ。図１のパネルｂおよびｃに示される構築されたＰＮ２５およびＰＮ２５２ＢＳプラスミド、加えてＰＮ２５６ＢＳプラスミド（１μｇ）を、結合部位毎に２０倍モル過剰ＰＮＡ２５８２と混合し、２０ｍＭリン酸緩衝液中で３７℃で一晩インキュベートし、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡ三重鎖構造を形成した（図１ｄ）。ＰＮＡが結合したプラスミド、およびｍｏｃｋ処理したプラスミドを、フージーン６を用いてＵ−２ＯＳ細胞にトランスフェクションした。培養の２日後に、ｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現の強度を蛍光顕微鏡による解析によってモニターした（図３ａ）。２０倍モル過剰ＰＮＡ２５８２前処理された１、２または６個の固定部位を含むプラスミドでトランスフェクションされたＵ−２ＯＳ細胞において、ＧＦＰ発現の減少は検出されなかった（図３ａ、データ示さず）。興味深いことに、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）で消化したプラスミドのゲル移動度のシフトによって、プラスミドにおける本質的に全ての標的部位が、ＰＮＡ２５８２によって占められていることが証明されたにもかかわらず（図３ｃ、右のパネル、データ示さず）、作用が失われていることが観察された。それに対して、結合部位毎に１５０倍モル過剰ＰＮＡ２５８２で前処理されたＰＮ２５６ＢＳプラスミドでトランスフェクションされたＵ−２ＯＳ細胞において、ｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現における有意なダウンレギュレーションが観察された（図３ａ、パネル５）。この場合におけるＰＮＡ：プラスミドのモル比が、９００：１であったことから、この現象は、極めて過量のＰＮＡの存在によって引き起こされる複数の結合部位の周辺に大きい複合体の形成による可能性がある。遺伝子発現の阻害のための結合部位の数が９であることの影響を調査するために、本発明者等は、テール−クランプＰＮＡ、ＰＮＡ２５８２の作用を観察するために１、２、４または６個のＰＮＡ固定部位を有するプラスミドを研究した。全てのプラスミドを、結合部位毎に１５０倍モル過剰ＰＮＡ２５８２とプレハイブリダイズさせ、続いて、ＰＮＡが結合したプラスミドを、Ｕ−２ＯＳ細胞にトランスフェクションした。４８時間培養した後、ｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現の強度を、ＦＡＣＳ解析によってモニターした（図３ｄ）。デンシトメーター測定から、６個の結合部位を有するプラスミドがｄ２ＥＧＦＰ発現の８５％阻害されたことが明らかになった。結合部位の数が減少するにつれて、阻害の程度も減少するようになる（４ＢＳプラスミドは６５％阻害、２ＢＳプラスミドは４０％阻害、１ＢＳプラスミドは２０％以下の阻害；コントロールプラスミドＰＮ２５において、ｄ２ＥＧＦＰの発現における減少は観察されなかった）。その後、本発明者等は、ＰＮ２５６ＢＳプラスミドと増加させた量のＰＮＡ２５８２とを共にトランスフェクションした。培養の４８時間後、ｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現を、ウェスタンブロット解析によってモニターした。デンシトメーター測定から、３６０倍モル過剰のＰＮＡによって、最大のｄ２ＥＧＦＰの阻害（９０％）が引き起こされたが、それに対してＰＮＡの量が減少するにつれて、阻害効率も減少したことが明らかになった。同様に、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＣＯＳ−７細胞系でも類似の結果が観察された（データ示さず）。ＰＮＡの転写における特異的な作用を定義するために、本発明者等はまた、シス位に位置し、ＬＴＲプロモーターによって駆動するネオマイシン耐性遺伝子の発現レベルも測定した（図１ｃ）。この分析から、ＰＮＡは、ネオマイシン耐性遺伝子の転写に影響を与えないことが実証された。

Ｚ型ＬＮＡのＤＮＡへの結合の作用
ＰＮＡ：ＤＮＡ比が２０：１で標的部位の結合が飽和している場合、ＰＮＡはレポーター遺伝子の転写をブロックしないことから、本発明者等は、その他の核酸類似体、すなわちＬＮＡの作用を分析することを試みた。本発明者等は、ＬＮＡを用いた以前の経験から、ビスＰＮＡと比較して、ＬＮＡは、二本鎖ＤＮＡにあまり十分に結合しないということを知っている（２６）（および未発表のデータ）。この理由のために、まず同時にＤＮＡ二重鎖両方の鎖に結合する新規なタイプのコンストラクト（図１ｅ）を試験した。このオリゴマーのＺ様の構造を形成する形状のために、さらにＤＮＡの左巻きの形態との混同を回避するために、本発明者等は、これらのコンストラクトを「Ｚ型ＬＮＡ」と命名した。さらに、本発明の者等は、ＬＮＡのＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、ゲル移動度のシフト分析において、チャージされていないＰＮＡと比較してリターディションが少なくなることも確認している。この理由のために、それらの検出を簡単にするために、この研究で用いられる全てのＬＮＡオリゴマーの末端を、Ｃｙ−３またはＣｙ−５蛍光団で標識した。高度に精製したスーパーコイルプラスミドＰＮ２５およびＰＮ２５２ＢＳ（５μｇ）を、１６−ｍｅｒのＬＮＡ３９０と共に１４−ｍｅｒのＬＮＡ３８９によって形成された１０倍モル過剰のＺ型ＬＮＡと混合した。コントロールとして、ＬＮＡ７４７２およびＬＮＡ７４７３と命名された２７−ｍｅｒの直鎖状ＬＮＡ（図１ｈおよびｉ）を含めた。ＬＮＡが結合したスーパーコイルプラスミド、およびコントロールプラスミドを、４〜２０％ポリアクリルアミドＴＢＥゲルで泳動した（図４ａ）。スーパーコイルプラスミドをＳＹＢＲゴールドで染色した（図４ａ、パネル１）。Ｃｙ−５と接触させた結果から、Ｚ型ＬＮＡにより誘導された結合は、直鎖状Ｚ−アーム、ＬＮＡ３９０（１６−ｍｅｒ、Ｚ型ＬＮＡの下半分；図１ｇ）の１つにより誘導された結合よりもかなり強力であり、それに対して、結合部位が欠失したコントロールプラスミドＰＮ２５においては、Ｚ型ＬＮＡによる極めて弱い非特異的な結合しか観察されなかった（図４ａ、パネル２）ことが明らかになった。Ｃｙ−３と接触させた結果から、Ｚ型ＬＮＡにより誘導された結合も、その他のアーム、ＬＮＡ３８９（１４−ｍｅｒ、Ｚ型ＬＮＡの上半分；図１ｆ）により誘導された結合よりも強かったことが明らかになった。同様に、Ｃｙ−３を分析した場合、コントロールプラスミドに対して、Ｚ型ＬＮＡの極めて弱い非特異的な結合しか観察されなかった（図４ａ、パネル３）。二重鎖ＤＮＡ結合においてＺ型ＬＮＡによって強化されたシグナルは、特徴的なＺ−構造によるものであるという可能性、または「Ｚ」の両方の半分が寄与するより長いハイブリダイゼーション領域によって引き起こされるという可能性を区別するために、２種の直鎖状の２７−ｍｅｒのコントロールＬＮＡオリゴマー、すなわちそれぞれ１１個のアンチセンスＬＮＡ７４７２、およびセンスＬＮＡ７４７３（図１ｈおよびｉ）を用いた。これらの伸長した２７−ｍｅｒの一本鎖ＬＮＡの結合も極めて有効であることが見出された。本発明者等は、図４ａで観察されるように、アンチセンスの２７−ｍｅｒの直鎖状ＬＮＡ７４７２が、センスの２７−ｍｅｒの直鎖状ＬＮＡ７４７３シグナルと比較して強いシグナルを付与する（図４ａ、パネル２および３）ことを認識していたが、これはＬＮＡ７４７３オリゴに含まれるフルオロフォア標識の量が比較的低いことが理由である可能性が最も高い（データ示さず）。

Ｚ型ＰＮＡ−ＬＮＡハイブリッドのＤＮＡ二重鎖への結合
Ｚ型ＬＮＡの同様の形状のＰＮＡへのハイブリダイゼーション能力を比較するために、ＰＮＡ化学に基づいて同じ２つのアームを合成した。溶解性を促進するために、２個のアスパラギン残基を、Ｎ末端（５’末端）に付加した。プラスミドへのハイブリダイゼーションを起こりやすくすることによって、負電荷を有するＬＮＡとの比較を妨げるといった電荷の相互作用の影響を回避するために、リシンではなくアスパラギンを用いた。逆に言えば、正電荷を有するリシン残基と負電荷を有するＬＮＡとの想定される相互作用がむしろ、そのストランドインベーションする能力を損う可能性がある。しかしながら、混合してハイブリダイゼーションによる架橋を形成させると、各ＰＮＡ−アームが可溶性であるにもかかわらず、溶解性が顕著に減少することが観察され、このような現象は長いＰＮＡ配列を用いた場合に往々にして観察された（２７）。それゆえに、本発明者等は、ＬＮＡ−ＰＮＡＺ型コンストラクトのハイブリッド形態を結合について調査し、ここにおいて、Ｚ型ＬＮＡ中の１つのアーム（ＬＮＡ３８９）を、同一な配列を有する（図４ｂ、右のパネル）ＰＮＡアーム（ＰＮＡ５１７１）で置換した。この分析によれば、Ｚ型ＬＮＡの１つのアーム（ＬＮＡ３８９）をＰＮＡ５１７１で置き換えると、Ｃｙ−５シグナルがよりいっそう弱くなることが示された（図４ｂ、パネル２）。同様に、Ｃｙ−３と接触させることから、Ｚ型ＬＮＡにより誘導された結合は、１個のＰＮＡと１個のＬＮＡアームとを有するＺ−ハイブリッドにより誘導された結合よりもかなり強力であった（図４ｂ、パネル３）ことが明らかになった。この結果は、ＤＮＡ／ＰＮＡハイブリッドの融解温度は、ＤＮＡ／ＬＮＡの融解温度よりも低いこと（２８）による可能性がある。結合に関する２つのＬＮＡアーム間の架橋構造の重要性を理解するために、２種の７−ｍｅｒのＬＮＡオリゴマー（ＬＮＡ７１およびＬＮＡ７２；図４ｃ、右のパネル）を用いて、Ｚ型ＬＮＡの２つのＬＮＡアームの相互結合をブロックした。この実験によれば、Ｚ型ＬＮＡの架橋構造がブロックされると、Ｃｙ−５シグナルがかなり弱くなることが示された（図４ｃ、パネル１）。同様に、Ｃｙ−３と接触させることから、無傷のＺ型ＬＮＡにより誘導された結合は、Ｚ−ＬＮＡにおいて架橋形成をなくした後に誘導された結合よりも効率的であった（図４ｃ、パネル２）ことが示された。要約すると、１４−ｍｅｒまたは１６−ｍｅｒの直鎖状ＬＮＡのＤＮＡ二重鎖への結合活性は、Ｚ型ＬＮＡまたは２７−ｍｅｒの直鎖状ＬＮＡと比較して相当限定される。デンシトメーター測定から、Ｚ型ＬＮＡにより誘導された結合は、ＬＮＡ３９０により誘導された結合よりも１０倍効率的であり、ＬＮＡ３８９により誘導された結合よりも７倍効率的であった（図４ｄ）ことが明らかになった。さらに、Ｚ型ＬＮＡの１つのアームをＰＮＡオリゴマーで置換した場合、ＤＮＡ二重鎖に結合する作用は有意に減少した。第三に、Ｚ型ＬＮＡの２つのＬＮＡ間の架橋構造のリンケージをブロックした場合、同様に結合は有意に減少した。

Ｚ型ＬＮＡによって引き起こされる不安定化緑色蛍光タンパク質の阻害
ＬＮＡが、配列特異的な方法で遺伝子の転写をブロックするためのアンチジーン試薬として役立つ可能性があるのかどうかを調査するために、本発明者等はさらに、ヒト骨肉腫細胞におけるｄ２ＥＧＦＰタンパク質の発現に対する、新規なＺ型ＬＮＡコンストラクトの作用を研究した。１３種の２つの結合部位を有するＰＮ２５２ＢＳプラスミド（１μｇ）を、１０倍モル過剰のＺ型ＬＮＡオリゴマー、またはコントロールＬＮＡオリゴマーＬＮＡ３８９、ＬＮＡ３９０、ＬＮＡ７４７２、ＬＮＡ７４７３それぞれと、２０ｍＭリン酸緩衝液中で、３７℃で一晩プレハイブリダイズさせた（図１ｆ−ｉ）。Ｚ型のＬＮＡが結合したプラスミド、ｍｏｃｋ処理したプラスミド、およびその他のコントロールサンプルを、予め播種したＵ−２ＯＳにトランスフェクションした。４８時間後、細胞を採取し、細胞溶解産物のウェスタンブロットによって、ｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現を測定した（図５ａ）。デンシトメーター測定から、Ｚ型ＬＮＡが結合したプラスミドにおいて、ｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現の特異的な阻害が９０％を超えることが解明された。ｍｏｃｋ処理したプラスミド、またはコントロールＬＮＡオリゴマーのいずれかを用いたところ、ｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現における有意な減少は観察されなかった（図５ｂ）。蛍光顕微鏡でトランスフェクションした細胞を分析したところ、同じ結果が得られた（図５ｃ）。転写に対するＰＮＡの特異的な作用を定義するために、本発明者等は、ＬＴＲプロモーターによって駆動されるネオマイシン耐性遺伝子の発現レベルも測定した（図１ｃ）。Ｚ型ＬＮＡは、ネオマイシン耐性遺伝子の転写に影響を与えないことが実証された（図５ｉ）。加えて、ｄ２ＥＧＦＰのｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ＰＣＲで評価した。ｍＲＮＡレベルは、Ｚ型ＬＮＡが結合したＰＮ２５２ＢＳプラスミドによってトランスフェクションした細胞において同じく９０％以上減少したが、Ｚ型ＬＮＡで処理されたＰＮ２５コントロールプラスミドでトランスフェクションした細胞で検出されたｄ２ＥＧＦＰｍＲＮＡのレベルにおいて有意な減少はなかった。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルは、等しいＲＮＡローディングを示した（図５ｈ）。線維芽細胞系のＮＩＨ−３Ｔ３でも類似の結果が観察された（データ示さず）。また本発明者等はさらに、骨肉腫細胞における遺伝子転写の阻害に対するＺ型ＬＮＡの能力と、Ｚ−ＰＮＡ−ＬＮＡハイブリッドの能力とを比較した（図４ｂ、右のパネル）。プラスミドＰＮ２５およびＰＮ２５２ＢＳを、Ｚ−ＬＮＡまたはＺ−ＰＮＡ−ＬＮＡハイブリッドそれぞれとプレハイブリダイズさせ、その後、Ｕ−２ＯＳ細胞にトランスフェクションした。４８時間後、細胞を採取し、ウェスタンブロットによって解析した（図５ｄ）。デンシトメーター測定から、ｄ２ＥＧＦＰタンパク質の発現１４において、Ｚ型ＬＮＡにより顕著な減少が誘導されたが、それに対して、Ｚ−ＰＮＡ−ＬＮＡハイブリッドは、ｄ２ＥＧＦＰの発現において３０％の減少しか誘導されない（図５ｅ）ことが明らかになった。ｍｏｃｋプラスミドにおいては、タンパク質発現における有意な減少は観察されなかった。同様にして、改変されていないＺ型ＬＮＡと、架橋の形成をなくしたブロックした型との骨肉腫細胞における遺伝子転写の阻害に対する比較（図４ｃ、右のパネル）を行った。デンシトメーター測定から、Ｚ型ＬＮＡによるｄ２ＥＧＦＰタンパク質の発現における顕著な減少が明らかにあったが、それに対して、結合解析からの結果によれば、架橋の形成が阻害されたＺ−ＬＮＡは、ｄ２ＥＧＦＰの発現において２０〜３０％の減少しか誘導させなかった（図５ｇ）。細胞による取り込みまたは核への導入が、Ｚ型ＬＮＡの結合によって影響される可能性を除外するために、本発明者等は、Ｚ型ＬＮＡを有するプレハイブリダイズしたＰＮ２５２ＢＳの、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞への核内のマイクロインジェクションを行った。ＬＮＡに結合したＰＮ２５２ＢＳプラスミド、およびｍｏｃｋ処理したプラスミドをインジェクションしてから１６時間後に、ｄ２ＥＧＦＰ遺伝子発現を測定した（図６）。プラスミドＤＮＡ単独がインジェクションされた細胞におけるｄ２ＥＧＦＰ発現の強度と比較すると（図６ａ）、Ｚ型ＬＮＡが結合したプラスミドがインジェクションされた細胞においてｄ２ＥＧＦＰ遺伝子発現の強度は有意に減少した（図６ｂ）。全てのケースにおいて、コントロールプラスミド、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１がマーカーとして共にインジェクションした（図６ｃおよび６ｄ）。

Ｚ型ＬＮＡによって引き起こされたポリメラーゼＩＩＩによって転写された緑色蛍光タンパク質の阻害
ＬＮＡは、その他のポリメラーゼに関するアンチジーン試薬として役立つ可能性があるかどうかを調査するために、ＥＧＦＰの転写のためにＵ６プロモーターを用いた。Ｕ６プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写される。ｐＨ６.８の２０ｍＭリン酸緩衝液中で、ＬＮＡをプラスミドと共に３７℃で一晩インキュベートした。フージーン６試薬（ロシュ）とインキュベートした後に、トランスフェクションを行った。４８時間後、細胞を採取して、前述したようにウェスタンブロットによってＥＧＦＰｌｕｃ融合タンパク質の発現を検出した。

ＤＮＡ修復は、ＤＮＡが結合したＰＮＡを除去していない
生きた細胞において転写をブロックすると、飽和したＰＮＡが結合できないことに関して考えられる説明は、転写の間にＰＮＡが除去されることであり、その他の可能性は、ＤＮＡ修復機構が変更された構造を認識し、プラスミドのこの部分を切り出すことである。三重鎖を形成するＰＮＡが、細胞におけるＤＮＡ修復メカニズムを活性化できるかどうかを調査するために、ＰＮＡが結合したレポーター遺伝子プラスミドを、ヌクレオチドの切り出しによる修復に欠陥を有するＵＶ４細胞にトランスフェクションした（２９）。４８時間後、細胞を採取し、細胞の溶解産物のウェスタンブロットによってｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現を測定した（図３ｂ）。２０倍モル過剰のビスＰＮＡ２５８２でプレハイブリダイズしたプラスミドを用いたところｄ２ＥＧＦＰタンパク質発現の減少は検出されなかったが、それに対して、Ｚ型ＬＮＡが結合したプラスミドを用いたところ、このサンプルにおいて遺伝子サイレンシングは容易に観察された。ゲルシフト解析によれば、２０倍モル過剰のＰＮＡは、プラスミド上の標的部位を飽和させるのに十分であった（図３ｃ）。従って、ヌクレオチドの切り出しによる修復に欠陥を有するＵＶ４細胞などの異なる由来の数種の哺乳動物細胞系において、タンパク質発現の阻害は観察することはできなかった。１５０倍モル過剰のＰＮＡ中でプレハイブリダイズした場合に、ＰＮ２５６ＢＳでトランスフェクションされた細胞において阻害が観察できるにもかかわらず、この現象は、このプラスミド中の複数の結合部位の周辺に上記の分子複合体が形成されることによるためであり得る。

参考文献
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ＬＮＡおよびＰＮＡオリゴマーとハイブリダイズした標的部位および配列の概略図を示す。 ＰＮＡ２５８２結合の分析を示す。 不安定型緑色蛍光タンパク質発現に対するＰＮＡ三重鎖の作用を図示する。 その他のコンストラクトと比較した、ＤＮＡ二重鎖とＺ型ＬＮＡとの結合を示す。 Ｚ型ＬＮＡによって引き起こされた不安定型ＥＧＦＰ発現の阻害を示す。 マイクロインジェクション後の、Ｚ型ＬＮＡ結合が介在するｄ２ＥＧＦＰ遺伝子発現のブロックを示す。 Ｕ６プロモーター遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩをブロックすることによってＥＧＦＰタンパク質のその他のプロモーターをダウンレギュレーションすることを示す。 ａ）ワトソン−クリック様塩基対形成、ｂ）共有結合のリンケージ、ｃ）非共有結合のリンケージによって形成された本発明のＺ型コンストラクトの略図である。 ＬＮＡの代替の化学組成を図示しており、ノース（Ｎｏｒｔｈ）またはサウス（Ｓｏｕｔｈ）リボース環のいずれかである。 本発明の実施態様において、どのように両方のオリゴヌクレオチドが、ワトソン−クリック様塩基対形成によって逆平行のトランスの形態で二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズするかを示す。 コンストラクトが、伸長したＺ型構成要素の複数のＺ型構成要素を含むような実施態様を説明する。

Claims (21)

1. 少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチドを含み、互に連結したコンストラクトであり、該コンストラクトが二本鎖ＤＮＡにトランス様式でハイブリダイズして転写に影響を与える能力を有するコンストラクトであって、ここにおいて、これらオリゴヌクレオチドが以下：
   −配列特異的なワトソン−クリック塩基対形成、
   −共有結合のリンカー、もしくは上記オリゴヌクレオチドの主鎖間もしくは塩基間の直接的共有結合、または
   −非共有結合のリンカー、もしくは上記オリゴヌクレオチドの主鎖間もしくは塩基間の直接的非共有結合、
   の一つを介して互いに連結することを含むコンストラクト。
2. ２つより多いオリゴヌクレオチドが用いられる場合に、少なくとも１つが、両末端で連結している、請求項１に記載のコンストラクト。
3. オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの類似体、またはそれらの任意の混合物から選択され、ここにおいて、該オリゴヌクレオチドの組成が、その種々のオリゴヌクレオチドから独立して選択することができる、請求項１または２に記載のコンストラクト。
4. ＤＮＡおよび／またはＲＮＡオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡを少なくとも１個含有する、請求項３に記載のコンストラクト。
5. ＤＮＡおよび／またはＲＮＡオリゴヌクレオチドが、通常のＬＮＡ、および／または機能化したアミノ−ＬＮＡを少なくとも１個含有する、請求項３に記載のコンストラクト。
6. ＤＮＡおよび／またはＲＮＡオリゴヌクレオチドが、ＰＮＡを少なくとも１個含有する、請求項３に記載のコンストラクト。
7. 二本鎖ＤＮＡにおけるオリゴヌクレオチドの標的配列が、５塩基以下の隔りで近接している、請求項１に記載のコンストラクト。
8. オリゴヌクレオチドの標的配列が隣接している、請求項１に記載のコンストラクト。
9. オリゴヌクレオチドの標的配列が、部分的にオーバーラップしている、請求項１に記載のコンストラクト。
10. オリゴヌクレオチドの標的配列は、１〜８塩基がオーバーラップしている、請求項９に記載のコンストラクト。
11. オリゴヌクレオチドの標的配列が、実質的にまたは完全にオーバーラップしており、コンストラクトの完全な、または部分的であるが有意な自己ハイブリダイゼーションが、改変された塩基および／または改変された主鎖の使用によって妨げられる、請求項９に記載のコンストラクト。
12. 追加の接合体が、オリゴヌクレオチドのいずれかの内部に、またはその末端のいずれかに付加されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のコンストラクト。
13. 追加の接合体が、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、標識、例えば蛍光または同位体標識、生物学的に活性な分子または不活性分子から選択される、請求項１２に
    記載のコンストラクト。
14. ＤＮＡ／ＲＮＡの翻訳、ならびに転写および翻訳の阻害のための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のコンストラクトの使用。
15. ＤＮＡまたはＲＮＡが、真核性（ゲノム）、細菌、またはウイルス由来である、請求項１４に記載の使用。
16. ＤＮＡまたはＲＮＡが、腫瘍遺伝子である、請求項１４に記載の使用。
17. ＤＮＡまたはＲＮＡが、組織培養における細胞の分化を調節する遺伝子である、請求項１４に記載の使用。
18. 治療のために遺伝子発現をサイレンシングする薬剤を製造するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のコンストラクトの使用。
19. 遺伝子が、腫瘍遺伝子である、請求項１８に記載の使用。
20. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載のコンストラクトを使用した、ＤＮＡまたはＲＮＡの翻訳および転写を阻害する方法。
21. ＤＮＡまたはＲＮＡが、真核性（ゲノム）、細菌、またはウイルス由来である、請求項２０に記載の方法。

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