JP2008538365A - 腫瘍内の不均一または混合細胞集団を排除する方法 - Google Patents

腫瘍内の不均一または混合細胞集団を排除する方法 Download PDF

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Abstract

不均一または混合細胞集団からなる腫瘍を死滅または阻害する方法を記載する。腫瘍の死滅または阻害は、特定の細胞集団に発現すると推測されるユニークリガンドを選択的にターゲティングし、かつそのユニークリガンドを欠如する細胞集団をも死滅させることにより達成される。これらのコンジュゲートは特定の細胞集団へ送達されてこれらの細胞を死滅させ、かつ細胞毒性薬物が放出されて非ターゲット細胞を死滅させ、これにより腫瘍を排除するので、療法用として有用である。

Description

[01] 本出願は、米国仮特許出願no. 60/671,498（2005年4月15日出願）および米国仮特許出願no. 60/781,722（2006年3月14日出願）に基づく優先権を主張する。両方の仮特許出願の開示内容全体を本明細書に援用する。
発明の分野
[02] 本発明は、不均一または混合細胞集団を排除または死滅させるための方法に関する。特に本発明は、特定の細胞集団に発現するユニークリガンド、たとえば抗原、エピトープまたは受容体を選択的にターゲティングすることにより、不均一または混合細胞集団を含む腫瘍を死滅させ、かつそのユニークリガンドを欠如する細胞集団をも死滅させる方法に関する。
発明の背景
[03] 細胞毒性抗癌薬の療法有効性は、癌細胞に対するそれらの選択性を高めることにより改善できる。この目標を達成するための１方法は、腫瘍細胞に対して選択的親和性をもつモノクローナル抗体または他のタイプのターゲティング剤に薬物を共有結合により連結することである。この方法は種々のタイプの細胞毒性薬剤について広範に探索され、ターゲット腫瘍細胞を死滅させる高い効力および選択性、長い循環保持時間、ならびに免疫原性の喪失を兼ね備えた、幾つかのタイプのヒト化（またはヒト）抗体-薬物コンジュゲート、すなわちイムノコンジュゲートが開発された。有効性の高いこの新世代抗癌薬には、抗体とメイタンシノイド（maytansinoid）類、CC 1065の類似体、タキソール（taxol）誘導体（タキソイド類、taxoid）、オーリスタチン（auristatin）誘導体およびカリケアマイシンγ1（calicheamycin γ1）誘導体とのコンジュゲートが含まれる。幾つかのメイタンシノイド（DMl）コンジュゲートが現在臨床開発段階にあり、抗CD33抗体とカリケアマイシンのコンジュゲートであるミロタルグ（Mylotarg）は米国食品薬品局（Federal Food and Drug Administration）により抗癌薬としての臨床使用が承認された。
[04] 腫瘍細胞をモノクローナル抗体-薬物コンジュゲートで特異的にターゲティングする試みを詳述した多数の報文が公表されている(Sela et al., Immunoconjugates 189-216 (C. Vogel編, 1987); Ghose et al, Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg編, 1983); Diener et al, Antibody Mediated Delivery Systems 1-23 (J. Rodwell編, 1988); Pietersz et al, Antibody Mediated Delivery Systems 25-53 (J. Rodwell編, 1988); Bumol et al, Antibody Mediated Delivery Systems 55-79 (J. Rodwell編, 1988)。細胞毒性薬物、たとえばメトトレキセート（methotrexate）、ダウノルビシン（daunorubicin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ビンクリスチン（vincristine）、ビンブラスチン（vinblastine）、メルファラン（melphalan）、マイトマイシンC（mitomycin C）およびクロラムブシル（chlorambucil）が、多様なモノクローナル抗体にコンジュゲートされた。場合により、薬物分子が中間キャリヤー分子、たとえば血清アルブミンにより（Garnett et al. Cancer Res. 46:2407-2412 (1986); Ohkawa et al. Cancer Immumol. Immunother. 23:81-86 (1986); Endo et al. Cancer Res. 47:1076-1080 (1980)）、デキストランにより（Hurwitz et al. Appl. Biochem. 2:25-35 (1980); Manabi et al. Biochem. Pharmacol. 34:289-291 (1985); Dillman et al. Cancer Res. 46:4886-4891 (1986); Shoval et al. Proc. Natl. Acad. ScL 85: 8276-8280 (1988)）、またはポリグルタミン酸により（Tsukada et al. J. Natl. Cane. Inst. 73:721-729 (1984); Kato et al. J. Med. Chem. 27:1602-1607 (1984); Tsukada et al. Br. J. Cancer 52:111-116 (1985)）、抗体分子に連結された。
[05] 抗体が抗原陽性腫瘍細胞に結合することによるコンジュゲート薬物の送達は、抗体が結合できない抗原陰性腫瘍細胞があれば見逃すであろうから、抗体-薬物コンジュゲートの有効性は、ある腫瘍においてターゲット抗原の不均一発現によって一般に妨げられる。さらに腫瘍の血管は、腫瘍の血液供給を枯渇させることにより腫瘍を縮小させる手段として魅力的なターゲットであり、次第に多くの関心を引き付けている。腫瘍の血管は通常は腫瘍抗原陰性である。幾つかのクラスの抗体ターゲティング型細胞毒性薬剤は実際に抗原陽性細胞だけでなく隣接する抗原陰性細胞をも根除できることが先に報告された；いわゆる”バイスタンダー（傍観者）効果（bystander effect）”。このバイスタンダー効果は、免疫放射性核種、免疫リポソーム、およびADEPTについてみられた(Allen TM, Nat Rev Cancer 2 (10): 750-63 (2002); Muldoon LL, Neurosurgery 53(6): 1406-12 (2003); Muldoon LL and Neuwelt EA, J Neurooncol 65(l):49-62 (2003))。Proceedings of the American Association for Cancer Research, vol 41, 2000年3月に公表された抄録中では、その著者らは、開裂したDM1の一部が細胞内のp糖タンパク質その他の排出トランスポーターにより排出されると述べている。その理由は、細胞外環境で、放出された遊離DM1-チオールが、スルフヒドリル基またはジスルフィド結合をもつ細胞分子、たとえばシステインもしくはシスチン、酸化型もしくは還元型グルタチオン、またはタンパク質（たとえば血漿アルブミン）と容易に反応するからである。これらの親水性生体分子と反応すると、DM-1は不活性な混合ジスルフィド化合物になり、このため隣接細胞に浸透してその効力を保持する作用を示すことができない。
[06] したがって、より安定で有効な形の遊離薬物を供給するように細胞結合剤-薬物コンジュゲートを設計して、抗原陽性腫瘍細胞だけでなく周囲の抗原陰性腫瘍細胞または新生血管の細胞をも破壊することができれば、種々の増殖性疾患の処置にきわめて有益となり、これによりターゲット細胞内でコンジュゲートから安定な遊離薬物を放出することによって腫瘍処置の成功が最大限に高められるであろう。
発明の概要
[07] 本発明の目的は、不均一または混合細胞集団ＡＢを排除する方法を提供することであり、その際、Ａは特異的リガンドを選択的に発現する細胞集団であり、ＢはＡが発現するこのリガンドを欠如する細胞集団である。この方法は一般に下記を含む：ジスルフィド基を含むリンカーにより連結した細胞結合剤-薬物コンジュゲートを、上記リガンドを発現する選択した細胞集団Ａへ送達して、この薬剤を細胞集団Ａのリガンドに結合させ、場合により、細胞集団Ａを構成する細胞内へ薬物をインターナリゼーションさせる。コンジュゲート中の細胞結合剤に結合している薬物をプロドラッグと呼ぶ；このプロドラッグは、いったんコンジュゲートから開裂すると、細胞毒性薬物、すなわち”薬物”に変換され、さらにアルキル化などの修飾を受ける可能性がある。細胞毒性薬物または修飾された薬物は有効医薬である。たとえば１態様において、薬物はいったんコンジュゲートから開裂すると、アルキル化、好ましくはメチル化を受け、これは未反応チオール基がさらに修飾されて薬物が不活性化されるのを防ぐ。アルキル化された遊離薬物は細胞集団Ａの細胞を死滅させるのに有効である；そして、このような”活性化された”薬物が細胞集団Ａから放出されて細胞集団Ｂの細胞死を誘発し、これによって不均一または混合細胞集団ＡＢが排除される。本明細書中で用いる用語”活性化された”は、遊離薬物、好ましくは修飾された遊離薬物を意味し、その際、遊離薬物のこの修飾は薬物の安定性または活性を高めるものである。そのような修飾には、薬物が抗体-薬物コンジュゲートから開裂した後のアルキル化、たとえばメチル化が含まれる。
[08] このように、薬物がコンジュゲートから放出された際にチオール基においてアルキル化（たとえばメチル化）を受けると、このアルキル化により、スルフヒドリル基をもつ細胞分子、たとえばシステインまたはタンパク質（たとえば血漿アルブミン）との反応（これにより遊離薬物は妨害または不活性化される）から薬物が保護されることが、予想外に見いだされた。本発明に示すように、アルキル化された遊離薬物はきわめて安定かつ有効であり、隣接する抗原陰性細胞へ移行し、これにより腫瘍内の不均一または混合細胞集団は死滅する。
[09] 前記の所見と関連するのは、細胞結合剤を薬物に連結するリンカー中のジスルフィド結合がジスルフィド結合付近に立体障害を形成することによって安定化されるならば遊離薬物のアルキル化は好ましい事象であるという、もうひとつの予想外の所見である。好ましい態様において、この連結の薬物側に立体障害を付与することによりジスルフィド結合が安定化される。立体障害は一般にメチル基などのアルキル原子により付与されるが、他のアルキル基も使用できる。本明細書中で用いる”薬物側”とは、コンジュゲート中のジスルフィド結合が開裂した後にジスルフィド結合の2つのα-炭素原子のうち薬物に結合する一方のα-炭素原子における置換を表わす。
[10] ”不均一または混合細胞集団”は、腫瘍細胞集団における多様性を表わし、これには異なる表現型特徴または分子シグネチャー、たとえば腫瘍細胞表面の抗原、エピトープまたは受容体などのリガンドの不均一性が含まれる。それは、腫瘍組織中の混合細胞集団、たとえば腫瘍細胞、腫瘍血管細胞および腫瘍間質細胞をも表わす。さらにそれは、腫瘍が１個のトランスフォームした悪性細胞から増殖するのに伴って腫瘍細胞が自然突然変異を生じて遺伝的に不均一な細胞の集団になる可能性のある腫瘍をも表わす。表現型特徴は、腫瘍進行の特定の段階で腫瘍細胞表面に抗原、エピトープまたは受容体などのリガンドを発現する腫瘍細胞から構成される可能性がある。腫瘍がたとえば分化により表現型の変化を生じるのに伴って、同じ腫瘍細胞が表面のリガンド発現を喪失する可能性もある。表現型の変化には、細胞がリガンドを周囲へ脱落することによりリガンドを喪失することも含まれる。
[11] ”不均一または混合細胞集団”とは、ウイルス感染細胞、微生物感染細胞および寄生虫感染細胞をも表わし、この場合、ウイルス、微生物または寄生虫が１個の細胞から増殖するのに伴って自然突然変異を生じて遺伝的または表現型において不均一な細胞の集団になる可能性がある。
[12] したがって１態様において本発明は、少なくとも若干の細胞が特異的リガンドを発現する腫瘍において、選択した細胞集団に薬物をターゲティングさせて、同じ腫瘍内のそのリガンドを欠如する無関係な細胞集団を死滅または排除する方法である。この方法は、特異的リガンドを発現する選択した細胞集団または組織を、１以上の薬物がリンカーにより細胞結合剤に共有結合した細胞結合剤-薬物コンジュゲートと接触させることを含み、その際、選択した細胞集団は細胞毒性薬剤または”活性化された”薬物を放出して、ターゲット細胞集団が発現するリガンドを欠如する無関係な細胞集団を死滅または排除する。
[13] 本発明の他の観点は、選択した細胞集団に細胞結合剤-薬物コンジュゲートをターゲティングすることによって不均一または混合細胞集団を排除する方法であって、その際、不均一または混合細胞集団内の少なくとも若干の細胞が特異的リガンドを発現する。１以上の薬物がリンカーにより共有結合したコンジュゲートの細胞結合剤が、このリガンドを認識する。細胞結合剤はターゲット細胞に結合してインターナリゼーションされ、これによりターゲット細胞を死滅させる。活性化された薬物が周囲へ放出されて、このリガンドを欠如する選択した他の細胞集団の死を誘発し、これにより不均一または混合細胞集団を排除する。
[14] 本発明は、腫瘍内の細胞を死滅させる方法であって、不均一または混合細胞集団ＡＢのうち選択した細胞集団Ａに最初に発現して経時的に培地中へ脱落するリガンドをターゲティングすることを含む方法をも教示する。この場合、細胞結合剤-薬物コンジュゲートは、好ましくはこの脱落リガンドをターゲティングする。細胞結合剤-薬物コンジュゲートは開裂して活性化された薬物を放出し、これが脱落抗原の周囲にある隣接する異常細胞中へ拡散して、腫瘍内の不均一または混合細胞集団を構成する選択的にターゲティングしたリガンドを欠如するこれらの細胞の死を誘発し、これにより腫瘍内の細胞を死滅させる。
発明の詳細な記述
[39] 本発明者らは、薬物がコンジュゲートから放出された際にチオール基においてアルキル化（たとえばメチル化）を受けると、このアルキル化により、スルフヒドリル基をもつ細胞分子、たとえばシステインもしくはタンパク質（たとえば血漿アルブミン）、またはジスルフィド基をもつ細胞分子、たとえばシステイン、酸化型グルタチオンとの反応（これにより遊離薬物は妨害または不活性化される）から薬物が保護されることを、予想外に見いだした。さらに本発明者らは、細胞結合剤-薬物コンジュゲート中の薬物の有効性が細胞毒性薬物と細胞結合剤の連結部に生じる立体障害に依存することを、予想外に見いだした。このコンジュゲートは、ジスルフィド結合に隣接する2個のα-炭素に結合したアルキル基、たとえばメチル基を付加することにより、立体障害を生じる。この立体障害をコンジュゲートの薬物側に付与すると、薬物がそのターゲットにおいて放出された際に（細胞内または細胞外）、遊離薬物のアルキル化（たとえばメチル化）が誘発される。硫黄原子をもつα-炭素原子上に１または2個のアルキル置換基をもつ立体障害のあるチオールおよびジスルフィドを含むメイタンシノイド類の製造は、米国特許出願公開No. 2004/0235840（2004年11月25日公開）に記載されており、その全体を本明細書に援用する。
[40] したがって１態様において、細胞結合剤-薬物コンジュゲート中のジスルフィド結合が開裂した際に、コンジュゲートはターゲット細胞またはその付近に薬物を放出する。さらに、薬物はチオール基においてアルキル化（たとえばメチル化、すなわち１以上のCH3基の付加）を受け、これにより薬物は安定化され、ターゲット細胞だけでなく非ターゲット細胞、すなわち、たとえば腫瘍内に存在する不均一または混合細胞集団中のターゲット細胞の周囲にある細胞をも死滅させる効力をもつ。
[41] 細胞結合剤-薬物コンジュゲート中の立体障害のあるチオール基は、立体障害のないチオール基と異なり、薬物が開裂された際に容易にアルキル化を受け、これにより薬物が修飾反応を受けてその機能を喪失するのを阻止するので、類似コンジュゲート中の立体障害のないチオール基に優る利点を備えている。さらに、アルキル化された薬物は長期間にわたって有効であり、腫瘍内の隣接細胞をターゲティングすることにより隣接細胞を死滅させることができる。有効なアルキル化形薬物は、実施例に示すように化学的に合成でき、インビトロで少なくとも100倍高い有効性をもつことが見いだされた。
[42] 本発明は、混合または不均一細胞集団中の細胞、特に破壊すべき細胞、たとえば異常細胞の不均一または混合細胞集団からなる腫瘍細胞（特に充実性腫瘍）、ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、および寄生虫感染細胞をターゲティングするための改良法をも提供する。
[43] 本発明方法に用いるコンジュゲートは、細胞結合剤にジスルフィドリンカーにより結合した１以上のメイタンシノイド類、タキサン類またはCC-1065類似体を含む。コンジュゲートを製造するための１方法においては、細胞結合剤、たとえば抗体を、まずヘテロ二官能性架橋試薬、たとえばSPP、SPDP、SPDB、SSNPBまたはSSNPPで修飾する。ここに挙げた架橋試薬はすべて、抗体との反応にN-ヒドロキシスクシンイミドエステル化学を利用する。ここに挙げた化合物は、鎖長、および遊離チオールと反応するジチオピリジンの周囲の立体障害度が異なる。第２工程で、この修飾された試薬を、チオール基をもつ薬物、たとえばメイタンシノイド類、タキサン類またはCC-1065類似体と反応させて、細胞結合剤-薬物コンジュゲートを製造する。したがって最終リンカーは、2つのピース、すなわち細胞結合剤に導入した架橋試薬と薬物（たとえばDMlまたはDM4）からのスルフヒドリル基とから組み立てられる。あるいは、薬物、たとえばメイタンシノイド類を、細胞結合剤と反応させる前に架橋試薬で修飾することもできる。たとえばUSP no. 6,441,163 Blを参照。
[44] 薬物が開裂した際にアルキル化されるのは好ましいことであり、当業者はインビボアルキル化されたメイタンシノイド類（たとえばインビボメチル化されたメイタンシノイド類）を単離することができるが、図８に示すようにメイタンシノイド類をインビトロでアルキル化することもできる。インビトロメチル化されたメイタンシノイド類は腫瘍細胞致死効力が高い。
細胞結合剤
[45] 療法薬としての本発明化合物の有効性は、適切な細胞結合剤を慎重に選択することに依存する。細胞結合剤は、現在知られている、または知られることになる、いかなる種類のものであってもよく、これにはペプチドおよび非ペプチドが含まれる。一般にこれらは、ターゲットを特異的に結合する抗体（特にモノクローナル抗体およびそのフラグメント）、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、ビタミン、栄養輸送分子（たとえばトランスフェリン）、または他のいずれかの細胞結合分子もしくは細胞結合物質であってよい。
[46] ターゲットは一般に腫瘍に存在するが、必ずしも腫瘍細胞の表面に存在するわけではなく、たとえばターゲットは最初は細胞表面に存在し、脱離して周囲の培地中へ脱落してもよい。
[47] 使用できる細胞結合剤のより具体的な例には、下記のものが含まれる：
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体：完全ヒト抗体を含む；
一本鎖抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル）；
抗体フラグメント（ポリクローナルおよびモノクローナル）、たとえばFab、Fab'、F(ab')2およびFv (Parham, 131 J. Immunol. 2895-2902 (1983)；Spring et al., 113 J. Immunol. 470-478 (1974)；Nisonoff et al., 89 Arch. Biochem. Biophys. 230-244 (I960))；
キメラ抗体およびその抗原結合フラグメント；
ドメイン抗体(dAbs)およびその抗原結合フラグメント：カメリド（camelid）抗体を含む(Desmyter et al., 3 Nature Struct. Biol, 752, 1996)；
サメ（shark）抗体：新規抗原受容体と呼ばれる(IgNAR) (Greenberg et al., 374 Nature, 168, 1995；Stanfield et al. 305 Science 1770-1773, 2004)；
インターフェロン類（たとえばアルファ、ベータ、ガンマ）；
リンホカイン類、たとえばIL-2、IL-3、IL-4、IL-6；
ホルモン類、たとえばインスリン、TRH（チロトロピン放出ホルモン）、MSH（メラノサイト刺激ホルモン）、ステロイドホルモン、たとえばアンドロゲン類およびエストロゲン類；
増殖因子およびコロニー刺激因子、たとえばEGF、TGF-α、FGF、VEGF、G-CSF5 M-CSFおよびGM-CSF (Burgess, 5 Immunology Today 155-158 (1984))；
トランスフェリン(O'Keefe et al., 260 J. Biol. Chem. 932-937 (1985))；ならびに
ビタミン類、たとえば葉酸。
[48] モノクローナル抗体法により、特異的モノクローナル抗体の形のきわめて特異的な細胞結合剤を製造することができる。当技術分野で特に周知の方法は、マウス、ラット、ハムスターまたは他のいずれかの哺乳動物を目的抗原、たとえば無傷のターゲット細胞、ターゲット細胞から単離した抗原、全ウイルス、弱毒化した全ウイルス、およびウイルスタンパク質、たとえばウイルスコートタンパク質で免疫化することにより産生されるモノクローナル抗体の作製方法である。感作したヒト細胞も使用できる。モノクローナル抗体を作製するための他の方法は、抗体フラグメント、たとえばFabおよびscFv（一本鎖可変部）、特にヒトscFv（たとえばGriffithsら、USP No. 5,885,793および5,969,108；McCaffertyら、WO 92/01047；Limingら、WO 99/06587を参照）のファージライブラリーの使用である。さらに、USP No. 5,639,641に開示されるリサーフェスト抗体（resurfaced antibodies）およびヒト化抗体も使用できる。
[49] 適切な細胞結合剤の選択は、ターゲティングすべき個々の細胞集団に応じてなされるが、適切なものが得られるならば一般にヒトモノクローナル抗体が好ましい。
[50] たとえばモノクローナル抗体J5は、普通型急性リンパ芽球性白血病)（Common Acute Lymphoblastic Leukemia Antigen (CALLA)）に特異的なネズミIgG2a抗体であり(Ritz et al, 283 Nature 583-585 (1980)）、急性リンパ芽球性白血病の疾患の場合のようにターゲット細胞がCALLAを発現していれば使用できる。
[51] モノクローナル抗体MY9は、CD33抗原に特異的に結合するネズミIgG1抗体であり(J.D. Griffin et al 8 Leukemia Res., 521 (1984))、急性骨髄性白血病(AML)の疾患の場合のように細胞がCD33を発現していれば使用できる。
[52] 同様に、モノクローナル抗体抗B4（あるいはB4とも呼ばれる）は、B細胞上のCD19抗原に結合するネズミIgG1であり(Nadler et al, 131 J. Immunol. 244-250 (1983))、ターゲット細胞がB細胞であるか、あるいは非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ芽球性白血病の場合のようにこの抗原を発現する疾患細胞であれば使用できる。同様に、N901、すなわち神経内分泌由来の細胞（小細胞性肺腫瘍を含む）にみられるCD56（神経細胞接着分子）抗原に結合するネズミモノクローナル抗体も使用できる。これらの抗体は、好ましくはそれらを使用する前にリサーフェシング（resurfacing）またはヒト化される。たとえばリサーフェシングまたはヒト化されたMY9、抗B4またはN901は、薬物-抗体コンジュゲートに好ましい抗体である。これらの抗体のリサーフェシングまたはヒト化は、Roguska et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994年2月1日; 91(3): 969-73に記載されており、これを本明細書に援用する。
[53] さらに、CanAg抗原に結合するモノクローナル抗体C242 (USP No. 5,552,293)は、CanAg発現腫瘍、たとえば結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞性肺癌および胃癌の処置に使用できる。HuC242は、USP No. 5,552,293に記載されたヒト化型モノクローナル抗体C242であり、これに関してハイブリドーマがECACC、識別番号90012601で寄託されている。ヒト化型は、CDR-グラフト法の適用(USP No. 5,585,089; 5,693,761; および5,693,762)またはリサーフェシング法(USP No. 5,639,641)により調製できる。HuC242も、CanAg発現腫瘍、たとえば結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞性肺癌および胃癌の処置に使用できる。
[54] さらに、抗体トラスツヅマブ（trastuzumab）は、Her2抗原を発現する乳癌ならびに他の癌、たとえば前立腺癌および卵巣癌の処置に使用できる。
[55] インスリン増殖因子受容体に結合する抗IGF-IR抗体も有用である。
[56] 卵巣癌および前立腺癌は、たとえば抗MUCl抗体、たとえば抗HMFG-2 (Taylor-Papadimitriou et al., 28. Int. J. Cancer 17-21, 1981)またはhCTMOl (56 Cancer Res. 5179-5185, 1996)またはDS6、および抗PSMA (前立腺特異的膜抗原)、たとえばJ591 (Liu et al. 57 Cancer Res. 3629-3634, 1997)で、それぞれ効果的にターゲティングできる。
[57] 非抗体分子を用いて特定の細胞集団をターゲティングすることもできる。たとえば骨髄細胞に結合するGM-CSFは、急性骨髄性白血病に由来する疾患細胞をターゲティングするための細胞結合剤として使用できる。さらに、活性T細胞に結合するIL-2は、移植片拒絶の予防、移植片対宿主疾患の治療および予防、ならびに急性T細胞性白血病の治療に使用できる。メラノサイトに結合するMSHは、メラノーマの治療に使用できる。葉酸は、卵巣腫瘍その他の腫瘍に発現する葉酸受容体のターゲティングに使用できる。上皮増殖因子(EGF)は、扁平上皮癌、たとえば肺癌および頭頚部癌のターゲティングに使用できる。ソマトスタチン（somatostatin）は、神経芽細胞腫その他のタイプの腫瘍のターゲティングに使用できる。胸部および睾丸の癌は、細胞結合剤としてのエストロゲン（またはエストロゲン類似体）またはアンドロゲン（またはアンドロゲン類似体）で、それぞれ効果的にターゲティングできる。
架橋試薬
[58] 本明細書中で用いる”リンカー”は、細胞結合剤を薬物、たとえばメイタンシノイド類、タキサン類またはCC 1065類似体に共有結合により連結するいずれかの化学物質部分である。リンカーの一部は薬物により供給される。たとえば、チオール含有メイタンシノイドDMlは、メイタンシンの誘導体である。DMlを形成するためには、メイタンシンのC-3ヒドロキシル基が遊離SHをもつように修飾する。このチオール形メイタンシンは、修飾された細胞結合剤と反応してコンジュゲートを形成することができる。したがって、最終リンカーは2つのピース、すなわち細胞結合剤に導入された架橋試薬に由来する部分とDMlからの側鎖に由来する部分とから組み立てられる。
[59] 開裂可能なリンカーは、緩和な条件、すなわちメイタンシノイド類、タキサン類またはCC 1065などの薬物の活性が影響を受けない条件、および細胞内に存在する条件下で開裂できるリンカーである。多数の既知のリンカーがこのカテゴリーに含まれ、それらを以下に記載する。
[60] ジスルフィドを含むリンカーは、生理的条件下で起きる可能性のあるジスルフィド交換により開裂できるリンカーである。
[61] 酸不安定リンカーは、酸性pHで開裂できるリンカーである。たとえば、ある細胞内コンパートメント、たとえばエンドソームおよびリソソームは酸性pH（pH 4〜5）をもち、酸不安定リンカーを開裂させるのに適切な条件を備えている。
[62] 光不安定リンカーは、体表および光が到達できる多くの体腔に有用である。さらに、赤外線は組織を貫通できる。
[63] あるリンカーはペプチダーゼにより開裂できる。特定のペプチドのみが細胞の内外で容易に開裂される。たとえばTrouet et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 626-629 (1982)およびUmemoto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989)を参照。
細胞毒性薬剤
[64] 本発明の細胞毒性コンジュゲート中に用いられる細胞毒性薬剤は、細胞を死滅させ、または細胞死を誘発し、または何らかの様式で細胞の生存性を低下させる、いかなる化合物であってもよい。好ましい細胞毒性薬剤には、たとえば下記のメイタンシノイド類およびメイタンシノイド類似体、タキソイド類、CC-1065およびCC-1065類似体、ドラスタチン（dolastatin）およびドラスタチン類似体が含まれる。これらの細胞毒性薬剤を、本明細書に開示する抗体、抗体のフラグメント、機能均等物、改良された抗体、およびそれらの類似体にコンジュゲートさせる。
[65] 細胞毒性コンジュゲートは、インビトロ法で製造できる。薬物または薬物プロドラッグを抗体に連結させるためには、ジスルフィド基を利用する。コンジュゲートは、抗体と薬物またはプロドラッグとのジスルフィド交換反応により構築できる。
メイタンシノイド類
[66] 本発明において細胞毒性コンジュゲートの形成に使用できる細胞毒性薬剤には、メイタンシノイド類およびメイタンシノイド類似体が含まれる。適切なメイタンシノイド類の例には、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が含まれる。メイタンシノイド類は、微小管形成を阻害し、哺乳動物細胞に対して毒性の高い薬物である。
[67] 適切なメイタンシノール類似体の例には、修飾された芳香族環をもつものおよび他の位置に修飾をもつものが含まれる。そのような適切なメイタンシノイド類がUSP No. 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; および5,846,545に開示されている。
[68] 修飾された芳香族環をもつ適切なメイタンシノール類似体の具体例には、下記のものが含まれる：
(1) C-19-ジクロロ(USP No. 4,256,746) (アンサマイトシン(ansamytocin) P2のLAH還元により製造)；
(2) C-20-ヒドロキシ(またはC-20-デメチル) +/- C-19-デクロロ(USP No. 4,361,650および4,307,016) (ストレプトミセス属(Streptomyces)菌またはアクチノミセス属(Actinomyces)菌を用いる脱メチルまたはLAHを用いる脱塩素により製造)；および
(3) C-20-デメトキシ、C-20-アシルオキシ(-OCOR) +/- デクロロ(USP No. 4,294,757) (塩化アシルを用いるアシル化により製造)。
[69] 他の位置に修飾をもつ適切なメイタンシノール類似体の具体例には、下記のものが含まれる：
(1) C-9-SH (USP No. 4,424,219) (メイタンシノールとH2SまたはP2S5の反応により製造)；
(2) C-14-アルコキシメチル(デメトキシ/CH2OR) (USP No. 4,331,598)；
(3) C-14-ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル(CH2OHまたはCH2OAc) (USP No. 4,450,254) (ノカルジア属(Nocardia)菌から製造)；
(4) C-15-ヒドロキシ/アシルオキシ(USP No. 4,364,866) (ストレプトミセス属菌によるメイタンシノールの変換により製造)；
(5) C-15-メトキシ(USP No. 4,313,946および4,315,929) (トレビア・ヌーディフロラ(Trewia nudiflora)から単離)；
(6) C-18-N-デメチル(USP No. 4,362,663および4,322,348) (ストレプトミセス属菌によるメイタンシノールの脱メチルにより製造)；および
(7) 4,5-デオキシ(USP No. 4,371,533) (メイタンシノールの三塩化チタン/LAH還元により製造)。
[70] 好ましい態様において、本発明の細胞毒性コンジュゲートには、細胞毒性薬剤としてチオール含有メイタンシノイドDMl、正式にはN2’-デアセチル-N2’-(3-メルカプト-l-オキソプロピル)-メイタンシンと呼ばれるものを用いる。DMlは下記の構造式(I)で表わされる。
Figure 2008538365
[71] 他の好ましい態様において、本発明の細胞毒性コンジュゲートには、細胞毒性薬剤としてチオール含有メイタンシノイドDM4、正式にはN2’-デアセチル-N2’-(4-メチル-4-メルカプト-l-オキソペンチル)-メイタンシンと呼ばれるものを用いる。DM4は下記の構造式(II)で表わされる。
Figure 2008538365
[72] 本発明の他の好ましい態様においては、他のメイタンシン類を使用でき、これらにはチオールおよびジスルフィドを含有し、硫黄原子をもつ炭素原子上にモノまたはジ-アルキル置換をもつ、メイタンシノイド類が含まれる。これらには、C-3、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシまたはC-20デスメチルの位置に立体障害スルフヒドリル基を備えたアシル化アミノ酸側鎖をもつメイタンシノイド類が含まれる；これらにおいて、チオール官能基をもつアシル基の炭素原子は、１または2個の置換基をもち、それらの置換基はCH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらに置換基のうちの１つはHであってもよく、アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子の間に少なくとも3個の炭素原子の長さの直鎖をもつ。
[73] そのような他のメイタンシン類には、式(III)により表わされる化合物が含まれる：
Figure 2008538365
式中：
Y’は
Figure 2008538365
を表わし、ここで
R1およびR2は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2はHであってもよく；
A、BおよびDは、それぞれ独立して、3〜10個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、単純または置換されたアリールまたは複素環式芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり；
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11およびR12は、それぞれ独立して、H、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
1、m、n、o、p、q、r、sおよびtは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただし1、m、n、o、p、q、r、sおよびtのうち少なくとも2つが同時にゼロであることはなく；
Zは、H、SRまたは-CORであり、ここでRは、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールもしくは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基である。
[74] 式(III)の好ましい態様には、下記の式(III)の化合物が含まれる：
R1はHであり、R2はメチルであり、ZはHである；
R1およびR2はメチルであり、ZはHである；
R1はHであり、R2はメチルであり、Zは-SCH3である；
R1およびR2はメチルであり、Zは-SCH3である。
[75] そのような他のメイタンシン類には、式(IV-L)、(IV-D)5または(IV-D,L)により表わされる化合物も含まれる：
Figure 2008538365
式中：
Yは
Figure 2008538365
を表わし、ここで
R1およびR2は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2はHであってもよく；
R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
1、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく；
Zは、H、SRまたは-CORであり、ここでRは、1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する環式のアルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールもしくは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
Mayは、C-3、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシまたはC-20デスメチルの位置に側鎖を有するメイタンシノイド類を表わす。
[76] 式(IV-L)、(IV-D)5および(IV-D,L)の好ましい態様には、下記の式(IV-L)、(IV-D)5および(IV-D,L)の化合物が含まれる：
R1はHであり、R2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmはそれぞれ１であり、nは0であり、ZはHである；
R1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmは１であり、nは0であり、ZはHである；
R1はHであり、R2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmはそれぞれ１であり、nは0であり、Zは-SCH3である；
R1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmは１であり、nは0であり、Zは-SCH3である。
[77] 好ましくは、細胞毒性薬剤は式(IV-L)で表わされる。
[78] そのような他のメイタンシン類には、式(V)により表わされる化合物も含まれる：
Figure 2008538365
式中：
Yは
Figure 2008538365
を表わし、ここで
R1およびR2は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2はHであってもよく；
R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
1、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく；
Zは、H、SRまたは-CORであり、ここでRは、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールもしくは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基である。
[79] 式(V)の好ましい態様には、下記の式(V)の化合物が含まれる：
R1はHであり、R2はメチルであり；R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり；1およびmはそれぞれ１であり；nは0であり；ZはHである；
R1およびR2はメチルであり；R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり；1およびmは１であり；nは0であり；ZはHである；
R1はHであり、R2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmはそれぞれ１であり、nは0であり、Zは-SCH3である；
R1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmは１であり、nは0であり、Zは-SCH3である。
[80] そのような他のメイタンシン類には、さらに式(VI-L)、(VI-D)5または(VI-D,L)により表わされる化合物が含まれる：
Figure 2008538365
式中：
Y2は
Figure 2008538365
を表わし、ここで
R1およびR2は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2はHであってもよく；
R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
1、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく；
Z2は、SRまたは-CORであり、ここでRは、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールもしくは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
Mayは、メイタンシノイド類である。
[81] そのような他のメイタンシン類には、式(VII)により表わされる化合物も含まれる：
Figure 2008538365
式中：
Y2 ’は
Figure 2008538365
を表わし、ここで
R1およびR2は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖、分枝鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2はHであってもよく；
A、BおよびDは、それぞれ独立して、3〜10個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、単純または置換されたアリールまたは複素環式芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり；
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11およびR12は、それぞれ独立して、H、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
1、m、n、o、p、q、r、sおよびtは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただし1、m、n、o、p、q、r、sおよびtのうち少なくとも2つが同時にゼロであることはなく；
Z2は、SRまたは-CORであり、ここでRは、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールもしくは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基である。
[82] 式(VII)の好ましい態様には、R1がHであり、R2はメチルである式(VII)の化合物が含まれる。
[83] 前記のメイタンシノイド類を、抗CA6抗体DS6、huN901、huC242、huCD33、MY9、トラスツヅマブ、またはその相同体もしくはフラグメントにコンジュゲートさせることができ、その際、メイタンシノイドのC-3、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシまたはC-20デスメチルの位置にあるアシル化アミノ酸側鎖のアシル基上に存在するチオールまたはジスルフィド官能基を用いてメイタンシノイドに抗体を連結させ、その際、アシル化アミノ酸側鎖のアシル基は、１または2個の置換基をもつ炭素原子にあるチオールまたはジスルフィド官能基をもち、それらの置換基は1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにそれらの置換基のうち１つはHであってもよく、その際、アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子の間に少なくとも3個の炭素原子の長さの直鎖をもつ。
[84] 本発明の好ましいコンジュゲートは、式(VIII)のメイタンシノイドにコンジュゲートした抗-抗CA6抗体DS6、huN901、huC242、huCD33、MY9、トラスツヅマブ、またはその相同体もしくはフラグメント、またはその相同体もしくはフラグメントを含むものである：
Figure 2008538365
式中：
Y1 ’は
Figure 2008538365
を表わし、ここで
A、BおよびDは、それぞれ独立して、3〜10個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、単純または置換されたアリールまたは複素環式芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり；
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11およびR12は、それぞれ独立して、H、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
1、m、n、o、p、q、r、sおよびtは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただし1、m、n、o、p、q、r、sおよびtのうち少なくとも2つが同時にゼロであることはない。
[85] 好ましくは、R1はHであり、かつR2はメチルであるか、またはR1およびR2はメチルである。
[86] 本発明の好ましいコンジュゲートは、式(IX-L)、(IX-D)または(IX-D,L)のメイタンシノイドにコンジュゲートした抗CA6抗体DS6、huN901、huC242、huCD33、MY9、トラスツヅマブ、またはその相同体もしくはフラグメント、またはその相同体もしくはフラグメントを含むものである：
Figure 2008538365
式中：
Y1は
Figure 2008538365
を表わし、ここで
R1およびR2は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2はHであってもよく；
R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、たとえばCH3およびC2H5、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり；
1、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく；
Mayは、C-3、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシまたはC-20デスメチルの位置に側鎖を有するメイタンシノール類を表わす。
[87] 式(IX-L)、(IX-D)5および(IX-D,L)の好ましい態様には、下記の式(IX-L)、(IX-D)5および(IX-D,L)の化合物が含まれる：
R1はHであり、かつR2はメチルであるか、またはR1およびR2はメチルである。
R1はHであり、R2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり；1およびmはそれぞれ１であり；nは0である；
R1およびR2はメチルであり；R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり；1およびmは１であり；nは0である。
[88] 好ましくは、細胞毒性薬剤は式(IX-L)で表わされる。
[89] 本発明の好ましいコンジュゲートは、式(X)のメイタンシノイドにコンジュゲートした抗CA6抗体DS6、huN901、huC242、huCD33、MY9、トラスツヅマブ、またはその相同体もしくはフラグメント、またはその相同体もしくはフラグメントを含むものである：
Figure 2008538365
式中、置換基は前記式(IX)について定めたものである。
[90] 特に好ましいものは、R1はHであり、R2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmはそれぞれ１であり、nは0である、前記化合物のいずれかである。
[91] さらに特に好ましいものは、R1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmは１であり、nは0である、前記化合物のいずれかである。
[92] さらに、L-アミノアシル立体異性体が好ましい。
[93] 米国特許出願公開No. 2004/0235840（2004年11月25日公開）中に教示される各メイタンシノイド類も、本発明の細胞毒性コンジュゲート中に使用できる。米国特許出願公開No. 2004/0235840（2004年11月25日公開）の開示内容全体を本明細書に援用する。
ジスルフィドを含む連結基
[94] メイタンシノイド類を、細胞結合剤、たとえばDS6、huN901、huC242、huCD33、MY9またはトラスツヅマブ抗体に連結させるために、メイタンシノイド類は連結部分を含む。連結部分は、完全活性メイタンシノイド類を特定の部位で放出できる化学結合を含む。適切な化学結合は当技術分野で周知であり、これにはジスルフィド結合、酸不安定結合、光不安定結合、ペプチダーゼ不安定結合およびエステラーゼ不安定結合が含まれる。好ましいものはジスルフィド結合である。
[95] 連結部分は、反応性化学基をも含む。好ましい態様において、この反応性化学基をジスルフィド結合連結部分によりメイタンシノイド類に結合させることができる。
[96] 特に好ましい反応性化学基はN-スクシンイミジルエステルおよびN-スルホスクシンイミジルエステルである。
[97] 反応性化学基を含む連結部分をもつ特に好ましいメイタンシノイド類は、メイタンシノールのC-3エステルおよびその類似体であって、連結部分がジスルフィド結合を含み、反応性化学基がN-スクシンイミジルエステルまたはN-スルホスクシンイミジルエステルを含むものである。
[98] 連結部分を化学的に連結させる位置として、メイタンシノイド類の多くの位置を使用できる。たとえばヒドロキシルをもつC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位置、ヒドロキシで修飾されたC-15位、ヒドロキシ基をもつC-20位がすべて有用であると予想される。しかし、C-3位が好ましく、メイタンシノールのC-3位が特に好ましい。
[99] 反応性基を含むジスルフィド部分をもつメイタンシノイド類およびメイタンシノイド誘導体の合成は、USP No.6,441,163および6,333,410、ならびに米国特許出願No. 10/161,651に記載されており、それらのそれぞれを本明細書に援用する。
[100] 反応性基を含むメイタンシノイド類、たとえばDMlを、抗体、たとえばDS6、huN901、huC242、huCD33、MY9またはトラスツヅマブ抗体と反応させて、細胞毒性コンジュゲートを製造する。これらのコンジュゲートをHPLCまたはゲル濾過により精製することができる。
[101] そのような抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを製造するための幾つかの優れたスキームが、USP No. 6,716,821、6,441,163および6,333,410、ならびに米国特許出願公開no. 2003/0055226（2003年3月20日公開）中に提示されており、これらそれぞれの全体を本明細書に援用する。
[102] 一般に水性緩衝液中の抗体溶液を、反応性基を含むジスルフィド部分をもつメイタンシノイド類の過剰モルと共にインキュベートすることができる。反応混合物を過剰のアミン（たとえばエタノールアミン、タウリンなど）の添加により反応停止することができる。次いでこのメイタンシノイド-抗体コンジュゲートをゲル濾過により精製することができる。
[103] 抗体分子１個に結合したメイタンシノイド分子の個数は、252 nmおよび280 nmにおける吸光度の比を分光光度法で測定することにより判定できる。抗体分子１個当たり平均1〜10個のメイタンシノイド分子が好ましい。
[104] 抗体とメイタンシノイド薬物のコンジュゲートが種々の不都合な細胞系の増殖を抑制する能力は、インビトロで評価することができる。たとえばヒト類上皮癌細胞系A-431、ヒト小細胞性肺癌細胞系SW2、ヒト乳腺腫瘍細胞系SKBR3、およびバーキットリンパ腫細胞系ナマルバ（Namalwa）は、これらの化合物の細胞毒性評価に使用しやすい。評価すべき細胞をこれらの化合物に24時間曝露し、細胞の生存割合を既知の方法による直接アッセイ法で測定することができる。次いで、これらのアッセイの結果からIC50を算出することができる。
タキサン類
[105] 本発明による細胞毒性コンジュゲート中に用いる細胞毒性薬剤は、タキサン類またはその誘導体であってもよい。
[106] タキサン類は、癌の治療に広く用いられている2種類の化合物、細胞毒性天然物パクリタキセル（paclitaxel）（タキソール(Taxol)）、および半合成誘導体ドセタキセル（docetaxel）（タキソテール(Taxotere)）を含む、一群の化合物である。タキサン類は紡錘体毒であり、チューブリンの脱重合を阻害して細胞死に至らせる。ドセタキセルおよびパクリタキセルは癌の治療に有用な薬剤であるが、正常細胞に対するそれらの非特異的毒性のため、それらの抗腫瘍活性には限界がある。さらに、パクリタキセルおよびドセタキセルなどの化合物自体は、細胞結合剤のコンジュゲート中に使用するのに十分なほど有効ではない。
[107] 細胞毒性コンジュゲートの製造に使用するのに好ましいタキサン類は、式(XI)のタキサン類である。
Figure 2008538365
[108] 本発明の細胞毒性コンジュゲート中に使用できるタキサン類の合成方法、およびそれらのタキサン類を細胞結合剤、たとえば抗体にコンジュゲートさせる方法は、USP No. 5,416,064, 5,475,092, 6,340,701, 6,372,738, 6,436,931, 6,716,821および6,596,757、ならびに米国特許出願公開no. 2003/0014048（2003年1月16日公開）および2004/0024049（2004年2月5日公開）に詳述されている。
CC-1065類似体
[109] 本発明による細胞毒性コンジュゲート中に用いられる細胞毒性薬剤は、CC-1065またはその誘導体であってもよい。
[110] CC-1065はストレプトマイセス・ゼレンシス（Streptomyces zelensis）の培養ブロスから単離された有効な抗腫瘍性抗生物質である。CC-1065は、一般に用いられている抗癌薬、たとえばドキソルビシン（doxorubicin）、メトトレキセート（methotrexate）およびビンクリスチン（vincristine）より約1000倍高い効力をもつ(B.K. Bhuyan et al, Cancer Res., 42. 3532-3537 (1982))。CC-1065およびその類似体は、USP No. 6,372,738、6,340,701、5,846,545および5,585,499に開示されている。
[111] CC-1065の細胞毒性は、そのアルキル化活性およびそのDNA結合またはDNA挿入活性と相関関係がある。これら2つの活性は分子の別個の部分にある。たとえばアルキル化活性はシクロプロパピロロインドール(CPI)サブユニットに含まれ、DNA結合活性は2つのピロロインドールサブユニット中にある。
[112] CC-1065は細胞毒性薬剤として、ある魅力的な特色をもつが、療法用には限界がある。CC-1065をマウスに投与すると、12.5μg/kgを１回静脈内投与した後、遅延肝毒性が生じ、50日目に死亡した{V.L. Reynolds et al., J. Antibiotics, XXIX, 319-334 (1986)}。これが、遅延毒性を生じない類似体を開発する努力に拍車をかけ、CC-1065をモデルとした、より簡単な類似体の合成が示された{M.A. Warpehoski et al., J. Med. Chem., 31, 590-603 (1988)}。
[113] 他の系列の類似体においては、CPI部分がシクロプロパベンゾインドール(CBI)部分で交換された{D.L. Boger et al., J. Org. Chem., 55, 5823-5833, (1990), D.L. Boger et al., BioOrg. Med. Chem. Lett., 1, 115-120 (1991)}。これらの化合物は親薬物の高いインビトロ効力を保持し、マウスにおいて遅延毒性を生じることがない。CC-1065のように、これらの化合物はDNAの副溝に共有結合様式で結合して細胞死を引き起こすアルキル化剤である。しかし、最も有望な類似体であるアドゼレシン（Adozelesin）およびカルゼレシン（Carzelesin）の臨床評価は失望すべき結果をもたらした{B.F. Foster et al., Investigational New Drugs, 13, 321-326 (1996); I. Wolff et al., Clin. Cancer Res., 2,1717-1723 (1996)}。これらの薬物は、それらの高い全身毒性のため低い療法効果を示す。
[114] CC-1065類似体の療法有効性は、腫瘍部位をターゲティングした送達によりインビボ分布を変化させて非ターゲット組織に対する毒性を低下させ、したがって全身毒性を低下させることによって、大幅に改善することができる。この目標を達成するために、CC-1065の類似体および誘導体と腫瘍細胞を特異的にターゲティングする細胞結合剤とのコンジュゲートが示された{USP; 5,475,092; 5,585,499; 5,846,545}。これらのコンジュゲートは、一般にインビトロで高いターゲット特異的細胞毒性を示し、ヒト腫瘍異種移植マウスモデルにおいてきわめて優れた抗腫瘍活性を示す{R.V.J. Chari et al., Cancer Res., 55, 4079-4084 (1995)}。
[115] 本発明の細胞毒性コンジュゲートに使用できるCC-1065類似体の合成方法、およびこれらの類似体を細胞結合剤、たとえば抗体にコンジュゲートする方法は、USP No. 5,475,092、5,846,545、5,585,499、6,534,660、6,586,618および6,756,397、ならびに米国特許出願公開no. 2003/0195365（2003年10月16日公開）に詳述されている。
他の薬物
[116] メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン（doxorubicin）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、カリケアマイシン、チューブリシン（tubulysin）およびチューブリシン類似体、デュオカルマイシン（duocarmycin）およびデュオカルマイシン類似体、ドラスタチン（dolastatin）およびドラスタチン類似体も、本発明のコンジュゲートを製造するのに適切である。これらの薬物分子を、中間キャリヤー分子、たとえば血清アルブミンにより抗体分子に連結させることもできる。たとえばUSP No. 6,630,579に記載されているドキサルビシン（doxarubicin）およびダウノルビシン化合物も有用な細胞毒性薬剤である。
組成物および使用方法
[117] 本発明は、有効量の本発明のいずれかの薬物-細胞結合剤、その医薬的に許容できる塩または溶媒和物、および医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
[118] 本発明は、処置を必要とする対象に有効量の前記のいずれかのコンジュゲートを投与することを含む処置方法をも提供する。
[119] 本発明はまた、不均一または混合細胞集団において細胞死を誘発する方法であって、ターゲット細胞またはターゲット細胞含有組織を、本発明のいずれかの薬物-細胞結合剤（たとえば、メイタンシノイド類、タキサン類またはCC1065-細胞結合剤）、その塩または溶媒和物を含む有効量の細胞毒性薬剤と接触させることを含む方法を提供する。ターゲット細胞は、これらの細胞がユニーク抗原を発現するので細胞結合剤が結合できる細胞である。細胞毒性薬物はターゲット細胞においてコンジュゲートから開裂して薬物を放出し、かつターゲット細胞に発現する抗原を欠如する細胞を死滅させる。
[120] 本発明は、リガンドが最初に特定の細胞または組織に発現し、次いで培地中へ脱落する、不均一または混合細胞集団の死滅をも提供する。その際、脱落したリガンドは細胞結合剤のターゲットであり、薬物は脱落抗原付近の不均一または混合腫瘍細胞集団を死滅させる。
[121] 所望により、他の有効薬剤、たとえば他の抗腫瘍薬を本発明のコンジュゲートと共に投与してもよい。
[122] 医薬的に許容できる適切なキャリヤー、希釈剤または賦形剤は周知であり、臨床状況から許容されるものとして当業者が判定できる。
[123] 適切なキャリヤー、希釈剤および／または賦形剤には下記のものが含まれる：(1)ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水、pH約7.4、約1〜25 mg/mlのヒト血清アルブミンを含有するもの、または含有しないもの、(2) 0.9%の生理食塩水(0.9% w/v NaCl)、および(3) 5% (w/v)のデキストロース；酸化防止剤、たとえばトリプタミン、および安定剤、たとえばトウィーン（Tween）20を含有してもよい。選択した細胞集団において細胞死を誘発する方法は、インビトロおよびインビボで実施できる。インビトロ使用の例を本明細書の実施例のセクションに示す。
[124] インビボ臨床使用のためには、本発明の細胞毒性薬剤を溶液または凍結乾燥粉末として供給し、無菌性および内毒素レベルについて試験する。コンジュゲート投与に適切なプロトコルの例は以下のものである。コンジュゲートを週１回、4週間、静脈内ボーラスとして各週投与する。ボーラス投与は50〜1000 mlの生理食塩水中において行われ、これに5〜10 mlのヒト血清アルブミンを添加してもよい。用量は、１回の静脈内投与当たり10μg〜2000 mg（１日当たり100 ng〜20 mg/kg）であろう。4週間の処置後、患者は週１回の基準で処置を受け続けることができる。投与経路、賦形剤、希釈剤、用量、時間などに関する具体的な臨床プロトコルは、臨床状況から許容されるものとして当業者が判定できる。
[125] 選択した細胞集団において細胞死を誘発するインビボ法およびエクスビボ法に従って処置できる病的状態の例には、不均一または混合異常細胞集団を含むいかなるタイプの悪性疾患も含まれ、たとえば肺、***、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、卵巣の癌、またはいずれかの種類の新生物増殖が含まれる。
[126] 本明細書および以下の実施例に引用したすべての参考文献の全体を本明細書に援用する。
実施例
[127] 本発明の広義の範囲は以下の実施例を参照すると最も良く理解される。これらは本発明を具体例に限定するためのものではない。
実施例１−抗体-薬物コンジュゲートのバイスタンダー効果
材料および方法
イムノコンジュゲート
[128] イムノコンジュゲートの製造：メイタンシノイドDMl（N2’-デアセチル-N2’-(3-メルカプト-l-オキソプロピル)-メイタンシン）は、微生物発酵産物アンサミトシン（ansamitocin）P-3から、先の記載に従って合成された{Chari, R.V., et al., Cancer Res., 52, 127-31 (1992); USP No. 6,333,410}。CC-1065類似体、5-[(3-メルカプト-l-オキソプロピル)アミノ]-ビス-インドリル-(seco)-l,2,9,9a-テトラヒドロシクロプロパ[c]ベンゾ[e]インドール-4-オン、DClの合成は、他に報告されている{Chari, R.V., et al., Cancer Res. 55, 4079-84 (1995)}。C242抗体のヒト化(huC242)は、先に記載されたリサーフェシング法により行われた{Roguska M.A., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 91, 969-73 (1994)}。抗体-薬物コンジュゲートは、ジスルフィド連結には4-(2-ピリジルジチオ)ペンタン酸N-スクシンイミジルを用い、チオエーテル連結には4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボン酸N-スクシンイミジル(SMCC)を用いて、他の記載に従って製造された{Liu, C, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 8618-23 (1996); Chari, R.V., et al., Cancer Res., 52, 127-31 (1992)}。この試験に用いたイムノコンジュゲートは、抗体１分子当たり平均3.5分子の薬物分子DMlまたはDClを含有していた。
細胞系
[129] COLO 205 (ヒト結腸腺癌、ATCC CCL-222)、HL-60 (ヒト急性前骨髄細胞性白血病、ATCC CCL-240)およびナマルバ（Namalwa）(ヒトバーキットリンパ腫、ATCC CRL- 1432)培養物は、10%の熱不活化ウシ胎仔血清および50μg/mLの硫酸ゲンタマイシンを補充したRPMI-1640培地中に維持された。HT-29 (ヒト結腸腺癌、ATCC HTB-38)、A375 (ヒト悪性メラノーマ、ATCC CRL-1619)およびHepG2 (ヒト肝細胞癌、ATCC HB-8065)培養物は、10%の熱不活化ウシ胎仔血清および50μg/mLの硫酸ゲンタマイシンを補充したDMEM培地中に維持された。SNU-16 (胃癌、ATCC CRL-5974)培養物は、10%の熱不活化ウシ胎仔血清および50μg/mLの硫酸ゲンタマイシンを補充したRPMI-1640培地(ATCC, 30-2003)中に維持された。すべての細胞系を加湿インキュベーター内で37℃、6% CO2において培養した。
CanAgへのhuC242抗体の結合
[130] CanAg陽性細胞へのhuC242抗体の結合は、フローサイトメトリーを用いる間接的免疫蛍光アッセイにより評価された。細胞(ウェル当たり5×104個)を96ウェル丸底プレートに接種し、2% (v/v)の正常ヤギ血清(Sigma)を補充したアルファ-MEM培地0.2 mL中におけるhuC242抗体の系列希釈液と共に、4℃で3時間インキュベートした。各試料を三重アッセイした。対照ウェルはhuC242を含有しなかった。次いで細胞を0.2 mLの低温(4℃)培地で洗浄し、フルオレセイン標識したヤギ抗ヒトIgG抗体により4℃で１時間、染色した。細胞を再び培地で洗浄し、1%ホルムアルデヒド/PBS溶液中で固定し、FACSCalibur(商標)フローサイトメーター(BD Biosciences、カリフォルニア州サンホゼ)を用いて分析した。
三次元コラーゲン細胞毒性アッセイ
[131] COLO 205細胞(2×105個/mL)を、huC242-DMl (1×10-8 Mのコンジュゲート抗体、37℃、6% CO2で24時間のインキュベーション)、1%のホルムアルデヒド(20分間のインキュベーション)、または5 GyのUV照射(UV Stratalinker 1800、Stratagene、カリフォルニア州)で処理した。処理した細胞を20〜30 mLの新鮮な培地で3回洗浄し、培地中に1×108個/mLで再懸濁した。処理していないCOLO 205、ナマルバ、A375およびHepG2細胞を、同様に洗浄および再懸濁した。次いでそれぞれ１μLの非処理細胞懸濁液を、0、1、2、4または8μLの処理COLO 205細胞と混合した。100μLの氷冷コラーゲンゲル溶液(三次元コラーゲン細胞培養系、Chemicon International)を細胞混合物に添加し、細胞-コラーゲン混合物(ウェル当たり5μL)を直ちに丸底96ウェルプレートに分注した。プレートを37℃で１時間インキュベートして、コラーゲンを重合させた。次いで新鮮な培地(200μL)を各ウェルに穏やかに添加した。5〜6日後、生存細胞によるMTTテトラソリウム塩(l-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-3,5-ジフェニルホルマザン、Sigma)からホルマザンへの還元を測定する比色細胞増殖アッセイ法により、生存細胞数を判定した。50μLのMTT原液(5 mg/mL、リン酸緩衝化生理食塩水中)を各ウェルに添加した。プレートを37℃で3時間インキュベートし、次いで860×gで10分間、遠心分離した。各ウェルから培地を吸引し、ホルマザン結晶をジメチルスルホキシド(ウェル当たり100μL)で可溶化し、OD540nmを測定した。培地のバックグラウンド読みに対して補正し、次いで各数値を対照（非処理細胞）ウェルにおける平均値で割ることにより、各ウェルにおける細胞の相対数（細胞生存率）を算出した。
液体培養による細胞毒性アッセイ
[132] 適切な培地中におけるイムノコンジュゲート希釈液を、2×103個のCOLO 205細胞、または2×103個のSNU-16細胞、または2×103個のナマルバ細胞、または2×103個のCOLO 205細胞と2×103個のナマルバ細胞の混合物、または2×103個のSNU-16細胞と2×103個のナマルバ細胞の混合物を入れた96ウェル丸底プレートのウェルに添加した。プレートを37℃、6% CO2で5日間インキュベートした。次いで各ウェル内の細胞の写真をNikon Diaphot 300倒立顕微鏡で撮影した。
huC242-DMl、huC242-SMCC-DMl、およびコンジュゲートから放出されたメイタンシノイド薬物の定量のためのELISAアッセイ
[133] この方法は先に記載されている{Xie, H., et al., J Pharmacol Exp Ther, 308, 1073-82 (2004)}。要約すると、huC242-DMlの濃度を測定するためには、標準品または被験試料からのコンジュゲートを、ネズミ抗メイタンシノイドモノクローナル抗体(ImmunoGen)でコーティングしたELISAプレート上に捕獲し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したロバ抗ヒトIgG (Jackson ImmunoResearch、ペンシルベニア州ウェスト・グローブ)で検出した。コンジュゲートから放出されたメイタンシノイド薬物の濃度を測定するために、5容量の氷冷アセトンを添加することにより試料からタンパク質を沈殿させた。沈殿したタンパク質を16,000×gでの遠心分離により沈降させ、上清中の放出薬物濃度を下記に従って競合ELISAにより測定した。ウシ血清アルブミンにコンジュゲートさせたDMl (BSA-DMl、ImmunoGen)でプレートをコーティングした。メイタンシン標準溶液の希釈試料および被験試料をビオチニル化ネズミ抗メイタンシノイドモノクローナル抗体(ImmunoGen)と混合し、次いでBSA-DMlコーティングしたプレート内でインキュベートした。最後に、結合したビオチニル化抗メイタンシノイド抗体をストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(Jackson ImmunoResearch)で検出した。
マウスにおけるヒト異種移植腫瘍モデル
[134] 5週令の雌CB-17重症複合免疫不全(SCID)マウスをTaconic (ニューヨーク州ジャーマンタウン)から入手した。１週間後、マウスに下記の細胞系のうちの１つを皮下接種した：HT-29細胞(マウス当たり2×106個)、COLO 205細胞(1×107個)、ナマルバ細胞(2×106個)、またはCOLO 205細胞とナマルバ細胞の混合物(マウス当たりそれぞれ1×107個および2×106個)。9〜13日後、各マウスに、PBS (対照)、25、75または150μg/kgのコンジュゲートDMlを含有するhuC242-SMCC-DMlまたはhuC242-DMlを、１日１回、連続5日間(qd×5)、静脈内ボーラス注射した。腫瘍の寸法を週2回測定し、1/2 (L×W×H)として容積を算出した；ここでLは腫瘍の長さ、Wは幅、Hは高さである。
免疫組織学的検査
[135] 腫瘍組織を10%ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋した。パラフィン切片の免疫組織学的検査を行った：ネズミC242抗体を用いてCOLO 205細胞を検出し、ネズミ抗CD38抗体(RDI-CD38abm-290、Research Diagnostic、ニュージャージー州フランダース)を用いてナマルバ細胞を検出した；アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ(ABC)法を使用。
結果：
HuC242-DMlはインビトロでターゲット細胞付近の非ターゲット細胞を死滅させる
[136] イムノコンジュゲートであるカンツヅマブメルタンシン（cantuzumab mertansine）またはhuC242-DMlは、マウスにおいてCanAg発現ヒト腫瘍異種移植体（この抗原を不均一発現するものを含む）を根除するのに有効である{Liu, C, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 8618-23 (1996)}が、CanAg陰性異種移植腫瘍に対しては無効である。CanAg陽性細胞に結合したhuC242-DMlコンジュゲートが隣接する非ターゲット細胞を死滅させる能力をもつかを判定するために、インビトロで三次元コラーゲンマトリックス中の抗原陽性細胞と抗原陰性細胞の混合培養物を用いてコンジュゲートの挙動を調べた。細胞をマトリックスに高密度で埋め込んでインビボ腫瘍環境を模倣することができる。
[137] 第１系列の実験では、処理した、および処理していない抗原陽性COLO 205細胞（図２）を用いた。huC242-DMlを含む培地中において37℃で16時間、一組の細胞をインキュベートした。次いで結合していないコンジュゲートを十分な洗浄により除去し、処理細胞：非処理細胞の比率がそれぞれ0:1 (対照)、1:1、4:1および8:1となるように、漸増数の処理細胞を非処理細胞の試料と混合した。次いでこれらの細胞混合物をコラーゲンに埋め込み、5日間インキュベートし、各試料中の生存細胞数をMTTアッセイ法で測定した。他の対照培養には、イムノコンジュゲート処理したCOLO 205細胞の代わりに、ホルムアルデヒド処理またはUV線処理したCOLO 205細胞を用いた。結果を図３Ａに示す。漸増数のコンジュゲート処理細胞を含有する培養物においては、細胞の生存割合が漸減した（図３Ａ、黒色の棒）。したがって、混合培養物中の非処理細胞が死滅した。ホルムアルデヒド処理またはUV照射によるCOLO 205死細胞は非処理細胞の増殖に有意の影響を及ぼさなかったので（図３Ａ、それぞれ灰色および白色の棒）、この死滅はコンジュゲート依存性であって、COLO 205死細胞が非処理細胞集団に及ぼす何らかの阻害効果によるものではない。
[138] 第２系列の実験では、前記に従ってhuC242-DMlで処理したCOLO-205細胞を抗原陰性細胞系と1:1の比率で混合し、コラーゲンに埋め込み、5日間インキュベートし、次いでMTTアッセイ法で細胞増殖をアッセイした。抗原陰性細胞系は多様な由来のものであった：バーキットリンパ腫（ナマルバ）、メラノーマ(A375)および肝癌(HepG2)。図３Ｂに示すように、huC242-DMl処理細胞は培養したすべての抗原陰性細胞系の増殖を阻害した。ナマルバ細胞は、生存割合が0.2未満に低下したことから示されるように、コンジュゲートで前処理したCOLO 205細胞により生じる細胞毒性効果に対して感受性が最も高かった；HepG2細胞は生存割合が約0.7で感受性が最も低く、A375およびCOLO 205細胞は中間の感受性を示した。
[139] ターゲット細胞依存性の非ターゲット細胞死が液体細胞培養でも起きるかを次に調べた。混合培養物中に抗原陰性非接着性ナマルバ細胞をリポーター細胞として用い、半接着性COLO 205をターゲット細胞として用いた。これら2タイプの細胞を一緒に96ウェル丸底プレートに接種した。数時間以内に、すべての細胞が一緒にウェルの中央に互いに近接して沈降した。この実験には、2×103個のナマルバ細胞のみ、2×103個のCOLO 205細胞のみ、およびそれぞれ2×103個のこれら2細胞系の混合物を入れたウェルが含まれていた；すべて、1 nMのhuC242-DMlを含有する液体培地0.2 mL中。37℃で5日間のインキュベーション後、細胞集団の写真を撮影した（図３Ｃ）。コンジュゲートが存在しない場合（図３Ｃ、左欄）、細胞計数により測定してすべてのウェルの細胞数がほぼ20倍増加した。混合細胞集団をフローサイトメトリーによっても分析して、ナマルバおよびCOLO 205の両細胞とも増殖したことを確認した。アレクサ（Alexa）標識huC242をCanAg陽性COLO 205細胞の染色に用い、一方、B細胞特異的アレクサ標識抗CD19抗体をナマルバ細胞の検出に用いた。この分析により、5日間の増殖後にコンジュゲートを含まない混合培養物は40%のCOLO 205細胞と60%のナマルバ細胞からなることが明らかになった；これは、両タイプの細胞とも同様な速度で増殖したことを証明する。予想どおり、huC242-DMlはCanAg陽性COLO 205細胞を含むウェルの大部分の細胞を死滅させ（図３Ｃ、上列）、抗原陰性ナマルバ細胞を含むウェルにおける増殖には有意の影響を及ぼさなかった（図３Ｃ、中列）。混合細胞集団を含むウェルにおいては、このコンジュゲートはCOLO 205およびナマルバの両細胞を死滅させた（図３Ｃ、下列）。したがって、huC242-DMl処理したCOLO 205細胞は、三次元コラーゲン細胞培養の場合と同様に液体培養においても付近の抗原陰性細胞を根除することができる。
[140] COLO 205以外のターゲット細胞系がこの細胞毒性効果をバイスタンダー細胞に及ぼすことができるかを調べるために、他のCanAg陽性細胞系である胃癌SNU-16を用いて同様な実験を行った（図２）。図３Ｄに示すように、huC242-DMl (1 nM)はSNU-16細胞を死滅させ、ナマルバの増殖には影響を及ぼさず、ナマルバ／SNU-16混合細胞集団を死滅させた。これらの実験は合わせて、huC242-DMlのインビトロバイスタンダー効果は特定のタイプのCanAg陽性ターゲット細胞または特定のタイプのCanAg陰性バイスタンダー細胞に限定されないことを証明する。
イムノコンジュゲートのバイスタンダー効果は抗体-薬物リンカーの性質により影響される
[141] HuC242-DMlは、DMl分子がhuC242抗体にジスルフィド含有リンカーによりコンジュゲートしたものからなる。このリンカーはインビトロで無細胞環境においてチオールによって容易に還元されるので、豊富な細胞関連チオールにより開裂する可能性があると思われる。リンカー中にジスルフィド結合が存在することがバイスタンダー効果の発生に必要であるかを調べるために、huC242-SMCC-DMl、すなわちDMlが非還元性チオエーテル結合により抗体に連結したコンジュゲート（図１）を合成し、COLO 205細胞、ナマルバ細胞、および混合COLO 205／ナマルバ細胞集団に対するコンジュゲートのインビトロ細胞毒性を調べた。huC242-SMCC-DMlは、COLO 205ターゲット細胞の死滅においてはhuC242-DMlと同様に有効であり、4×10-11 MのIC50値を示した（データを提示していない）。試験した全濃度範囲（最高1×10-9M）において抗原陰性ナマルバ細胞に対してはいずれのコンジュゲートも細胞毒性ではなかったので、この細胞毒性はCanAg選択的であった。huC242-DMlと異なり、huC242-SMCC-DMlは、三次元コラーゲンマトリックスアッセイまたは液体培養アッセイのいずれにおいても、バイスタンダー細胞に対する細胞毒性を示すとしてもわずかにすぎなかった（それぞれ、図３Ｂおよび３Ｃ）；これは、huC242-DMlに関するバイスタンダー効果の機序にジスルフィド結合開裂段階が含まれることを示唆する。
バイスタンダー効果は抗体-メイタンシノイドコンジュゲートに限定されない
[142] バイスタンダー効果が抗体-メイタンシノイドコンジュゲートに限定された特性であるかを判定するために、huC242とDClのコンジュゲートについて調べた。DClは副溝結合型のDNAアルキル化剤CC-1065の類似体であり、その構造（図１）および作用機序が共にDMlと異なる。これまでに、DClと抗CD19抗体および抗CD56抗体との有効な抗原選択的コンジュゲートが報告されている{Chari, R.V., et al., Cancer Res. 55, 4079-84 (1995)}。図１に示すように、DClとhuC242から同様なコンジュゲート、すなわち薬物と抗体がジスルフィド含有リンカーによりコンジュゲートしたもの(huC242-DCl)またはチオエーテル含有リンカーによりコンジュゲートしたもの(huC242-SMCC-DCl)を構築し、それらがインビトロで抗原陽性細胞およびバイスタンダー細胞を死滅させる能力を調べた。2×10-10〜2×10-9Mの濃度で、いずれのコンジュゲートも抗原陽性COLO 205培養物中の大部分の細胞を死滅させた（図３Ｃ、上列に1×10-9 Mの濃度についての結果を示す）が、抗原陰性ナマルバ培養物中の細胞は死滅させなかった（図３Ｃ、中列）；このことから、それらの細胞毒性は抗原依存性であることが確認された。ターゲット／非ターゲット混合細胞集団について試験した場合、huC242-DClは両種の大部分の細胞を死滅させることができたが、huC242-SMCC-DClはできなかった（図３Ｃ、下列）。これらの実験は、バイスタンダー細胞を死滅させる能力はDMlコンジュゲートに限定された特性ではなく、ジスルフィド含有結合により連結した他の抗体-薬物コンジュゲートにも適合することを証明する。
huC242-DMlのバイスタンダー効果はターゲット細胞がコンジュゲートをプロセシングして細胞毒性メイタンシノイドを培地中へ放出することにより発生する
[143] バイスタンダー効果の機序を判定するために、huC242-DMlで処理したCanAg発現細胞が細胞毒性化合物を培地中へ放出し、次いでこれが隣接細胞へ拡散するかを調べた。ターゲットCOLO 205細胞または抗原陰性ナマルバ細胞を、huC242-DMlまたはhuC242-SMCC-DMl (10-7 M)と共に37℃で0、6、24または48時間インキュベートした。細胞を培地から遠心分離により除去し、上清をhuC242-DMlおよび遊離メイタンシノイドの存在について2つの異なるELISA法によりアッセイした（材料および方法を参照）。結果を図４Ａ〜Ｃに示す。ターゲット細胞と共に48時間インキュベートした後、上清中のいずれのコンジュゲートの濃度も約3倍低下し、同時に遊離メイタンシノイド種の濃度は約4倍上昇した（図４Ａ、Ｃ）。huC242-DMlとCanAg陰性ナマルバ細胞を同様にインキュベートした場合、培地中のコンジュゲートの消失も遊離メイタンシノイドの出現も生じなかった（図４Ｂ）。これは、これらのコンジュゲートのプロセシングおよび培地中へのメイタンシノイド薬物放出にはこの細胞表面抗原への結合が必要であることを指摘する。
[144] 次いで、COLO 205細胞でコンディショニングしたコンジュゲート含有培地にCanAg陰性ナマルバ細胞を曝露することにより、放出されたメイタンシノイド薬物の細胞毒性をアッセイした。huC242-DMlを含有する培地の非特異的細胞毒性は、48時間にわたって徐々に約10倍増大した；これは、初期IC50値2×10-8M（混合直後にインキュベーションせずに採取した上清）が24および48時間のインキュベーション後にそれぞれ3×10-9 Mおよび1.7×10-9Mに変化したことにより証明される（図４Ｄ）。これに対し、huC242-DMl含有培地をナマルバ細胞の存在によりコンディショニングした場合、培地の検出可能な細胞毒性の増大は起きなかった（図４Ｅ）。COLO 205コンディショニングしたコンジュゲート含有培地の細胞毒性の増大は、図４Ａの遊離メイタンシノイド濃度の上昇と平行する。これらのデータは、コンジュゲートが抗原発現細胞に結合し、続いて細胞仲介によりコンジュゲートがプロセシングされ、隣接細胞を死滅させることができる細胞毒性メイタンシノイド種が次第に放出されるという、huC242-DMlのバイスタンダー細胞毒性に関する機序を示唆する。
[145] huC242-SMCC-DMlをCOLO 205細胞と共にインキュベートした場合、培地の非特異的細胞毒性はわずか2倍の増大を生じたにすぎない（図４Ｆ）。ジスルフィド連結コンジュゲートおよびチオエーテル連結コンジュゲートは両方ともCOLO 205細胞によりプロセシングされて、同等量の遊離メイタンシノイド種を培地中へ放出する（図４Ａおよび４Ｃ）ので、huC242-DMlとhuC242-SMCC-DMlから異なる代謝産物が形成されたと思われる。後記のように、代謝産物の化学構造を同定して、huC242-DMlプロセシングの産物のうちあるものはhuC242-SMCC-SMlの代謝産物より100〜10,000倍高い効力をもつことが確認された。
ヒト異種移植腫瘍モデルにおけるhuC242-DMlのバイスタンダー効果
[146] インビトロ混合培養系の場合と同様に、CanAg発現COLO 205細胞とCanAg陰性ナマルバ細胞を含む混合異種移植腫瘍モデルを開発した。COLO 205細胞とナマルバ細胞の混合物をSCIDマウスに皮下注射した(マウス当たり合計1.2×107個の細胞)。各動物(合計23匹のマウス)が測定可能な腫瘍を発症し、細胞移植の9日後に平均腫瘍容積が約100 mm3に達した。9日令の腫瘍2つを屠殺した動物から摘出し、これらの組織をネズミC242抗体およびネズミ抗CD38抗体で免疫組織化学的に染色することにより、それぞれCOLO 205細胞(CanAg+ / CD38-)およびナマルバ細胞(CD38+ / CanAg-)の存在を分析した。COLO 205細胞のマーカー（図５Ａa）およびナマルバ細胞のマーカー（図５Ａb）はほぼ等しい大きさの領域を染色し、腫瘍の混合性が確認された。COLO 205細胞およびナマルバ細胞は両方とも大部分が生存していることが認められ、壊死はほとんど見られなかった。次いで、約100 mm3の大きさのこのような混合腫瘍をもつマウス群を、5回の静脈内注射により処理した：PBS (対照群)、１日量150μg/kgの連結DMlを含有するコンジュゲートhuC242-SMCC-DMlまたはhuC242-DMlを、連続5日間(qd×5)投与。最終注射の１日後、各群から2匹のマウスを屠殺し、それらの腫瘍を前記に従って免疫組織化学的に分析した。PBS処理した対照群では、腫瘍切片は非処理腫瘍から得たものと同様に見え（図５Ａcと５Ａa、および図５Ａdと５Ａbを対比）、COLO 205組織とナマルバ組織の領域は同様な大きさであり、両方ともわずかな程度の壊死を示したにすぎない。huC242-SMCC-DMlで処理した腫瘍から得た切片は、強い壊死COLO 205組織(50〜60%の壊死、図５Ａe)および健康なナマルバ組織（図５Ａf）を示した。最後に、huC242-DMlで処理した腫瘍から得た切片は、COLO 205組織とナマルバ組織の両方において高度の壊死(70〜80%)を示した（図５Ａgおよび５Ａh）。これらのインビボデータは、混合細胞集団を用いたインビトロ結果を反映している。非ジスルフィドリンカーを含むコンジュゲートの活性はターゲット抗原を発現する細胞に限定され、これに対しジスルフィドリンカーを含むコンジュゲートは同一腫瘍内のターゲット細胞と非ターゲット細胞の両方を死滅させた。
[147] これらの免疫組織化学的結果は、huC242-DMlおよびhuC242-SMCC-DMlが腫瘍の増殖に及ぼす効果と一致していた。いずれのコンジュゲートによる処理もCanAg陽性COLO 205腫瘍に対しては同等に有効であった（図５Ｂa）：5匹中4匹のマウスの腫瘍が完全に退縮し、実験を終了した90日目まで再発しなかった；各群において１匹のマウスが再発し、腫瘍の増殖は28日遅延した。非ターゲット-ナマルバ腫瘍に対してはいずれのコンジュゲートも無効であった：huC242-SMCC-DMl処理は腫瘍の増殖を遅延させず、一方、huC242-DMlは腫瘍の増殖をわずか7日間遅延させたにすぎない（図５Ｂb）。このことから、これらの抗腫瘍活性はCanAg選択的であることが確認される。2種類のコンジュゲートはCOLO 205-ナマルバ混合腫瘍に対するそれらの抗腫瘍活性において顕著に異なっていた。huC242-SMCC-DMlは混合腫瘍の進行を遅延しなかったのに対し、huC242-DMlは2週間以内に腫瘍を完全に退縮させ（図５Ｂc）、5匹中4匹のマウスは試験終了まで腫瘍のない状態を維持した(150日間、すなわち腫瘍倍加時間の約34倍)。この群において唯一再発した腫瘍の免疫組織化学的分析から、この腫瘍は全体としてナマルバ細胞からなることが分かった（データを提示していない）。結論として、ジスルフィドリンカーを含むコンジュゲートのみがバイスタンダー細胞をインビボで死滅させる能力を示した。
[148] SCIDマウスにおけるHT-29ヒト結腸癌異種移植モデルにおいても、huC242-DMlおよびhuC242-SMCC-DMlのインビボバイスタンダー効果を評価した。HT-29腫瘍は単一細胞系から自然発症したものであるが、抗原発現に関して不均一である特殊な”混合”腫瘍の症例である。HT-29細胞は、インビトロ（図２）または異種移植腫瘍においてhuC242抗体ターゲットCanAgを少数細胞(20〜40%)に発現するにすぎない{Liu, C, et al., Proc Natl Acad Sci U S A ;93, 8618-23 (1996)}。樹立した(約130 mm3)のHT-29腫瘍をもつマウスを種々の用量のhuC242-DMlまたはhuC242-SMCC-DM1 (25μg/kg、75μg/kgまたは100μg/kgの結合DMl、qd×5)で処理し、腫瘍の増殖をモニターした。ジスルフィド連結コンジュゲートhuC242-DMlは各用量で顕著な腫瘍増殖遅延を誘発した(用量に応じて5〜25日、図６Ａ)が、huC242-SMCC-DMlコンジュゲートはかろうじて抗腫瘍効果を生じたにすぎない(2.5〜3.5日の増殖遅延、図６Ｂ)。これらのデータは合わせて、ジスルフィドリンカーを含まないhuC242-SMCC-DMlコンジュゲートはすべての増殖細胞がターゲット抗原を発現する腫瘍に対してのみ有効であるという証拠を提示する。これに対し、ジスルフィド含有コンジュゲートに伴うバイスタンダー効果は、ごく一部の細胞がCanAgターゲットを発現する腫瘍に対してもこのコンジュゲートを有効にする。
実施例２−抗体-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞内活性化
略号
[149] BafAl バフィロマイシン（Bafilomycin）Al；
[150] BSA ウシ血清アルブミン；
[151] FACS 蛍光活性化細胞ソーター；
[152] HPLC 高速液体クロマトグラフィー；
[153] MTT l-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-3,5-ジフェニルホルマザン；
[154] NEM N-エチルマレイミド；
[155] SPDB 4-(2-ピリジルジチオ)酪酸N-スクシンイミジル；
[156] SMCC 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボン酸N-スクシンイミジル；
[157] DMl N2’-デアセチル-N2’-(3-メルカプト-l-オキソプロピル)-メイタンシン；
[158] DM4 N2’-デアセチル-N2’-(4-メルカプト-4-メチル-l-オキソペンチル)-メイタンシン；
[159] DMl-SMe N2’-デアセチル-N2’-[(3-メチルジチオ)-l-オキソプロピル]-メイタンシン；
[160] DTT ジチオトレイトール。
材料および方法
[161] RPMI 1640およびグルタミンをCambrex Bioscienceから入手した。Ultima Flo(商標) Mシンチレーション液をPerkin Elmer life and analytical sciencesから入手した。硫酸ゲンタマイシンをGibco BRLから入手した。N-エチルマレイミド(NEM)および他のすべての化学薬品をSigmaから入手した。用いたすべての抗体、huC242、TrasおよびhuB4は、ヒト化IgGl抗体である。メイタンシノイド類、[3H]DM4、D-[3H]DM4、S-メチル-DM4、リシン-Nε-SMCC-DMlおよびリシン-Nε-SPDB-DM4、ならびにコンジュゲート、huC242-SPDB-[3H]DM4、huC242-SMCC-[3H]DM4、Tras-SMCC-[3H]DM4およびhuB4-SPDB-[3H]DM4は、公表された下記の方法で製造された{Chari, R. V., et al., Cancer Res, 52, 127-131 (1992)、およびXie, H., et al., J Pharmacology and Experimental Therapeutics, 308, 1073-1082 (2004)}。
抗体-薬物コンジュゲートによるCOLO 205細胞の処理
[162] 抗体-薬物コンジュゲートをコンジュゲート抗体10-7Mの濃度で含有する培地3 mLに懸濁したCOLO 205細胞(6×106)を、37℃で3〜30時間インキュベートした。次いで細胞と培地を遠心分離(2000×g、5分)により分離した。上清(3 mL)を氷冷し、4 mLの氷冷アセトンと混合し、-80℃に少なくとも１時間、またはさらに処理するまで保持した。細胞を3 mLのHBBS緩衝液に懸濁し、遠心分離により沈降させ、次いで0.5%のBSAを含有する0.3 mLのTBSに再懸濁した。遊離チオールのキャッピングのためにアルキル化したい場合、この時点でNEMを7.5 mMになるように添加し、溶液を混合し、室温に30分間保持した。次いで、この細胞懸濁液を0.6 mLの氷冷アセトンと混合した。これらの試料を-80℃に少なくとも１時間、またはさらに処理するまで置いた。アセトン処理した培地試料を-80℃から取り出した。沈殿したタンパク質を2500×gでの遠心分離により分離し、上清を5%酢酸で酸性にし、蒸発乾固した。これらの試料を、0.025%のTFAを含有する20% CH3CN水溶液12 mLに溶解し、0.1 mLずつに分けてHPLC処理した。
インビボ試験
[163] コンジュゲートの抗腫瘍活性を、HT-29腫瘍をもつ雌CB-17 SCIDマウス(Taconic Labs、ニューヨーク州ジャーマンタウン)において、先の記載に従って評価した{Liu, C, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 8618-23 (1996)}。コンジュゲートをマウス6匹の群に静脈内投与した。
細胞周期試験
[164] 指数関数増殖しているCOLO 205細胞を、薬物またはコンジュゲート処理の前に1〜2×105個/mLに再懸濁した。細胞核を、先の記載に従ってヨウ化プロピジウムで染色した{Firpo, E.J., et al, MoI Cell Biol, 14, 4889-901 (1994)}。DNA含量分析をFACSCalibur (Becton Dickinson、カリフォルニア州サンホゼ)により実施した。試料当たり10,000事象を収集し、各試料についてFL2-Aヒストグラムを作成した。細胞周期分析ソフトウェアModFit LT 3.1 (Verity Software House、メーン州トプシャム)を用いて、細胞周期の種々の期の細胞％を測定した。
分析法
[165] 0.025%のトリフルオロ酢酸(TFA)を含有する20% CH3CN水溶液で平衡化した分析用C-18カラム(0.46×25 cm)により、2% CH3CN/分の直線勾配および1 mL/分の流速で展開して、すべてのメイタンシノイドを分離した。流出液をダイオードアレイ検出器へ送り、続いて用途に応じて、Radiomatic 150βカウンター(Perkin Elmer)へ送ってここで流出液を3 mLのシンチレーションカクテルと連続混合した後に0.5 mLのフローセルへ送り、あるいはBruker Daltonics Esquire 3000エレクトロスプレー質量分析機へ送った。データサンプリング間隔は6秒であった。クロマトグラムのピーク面積を下記に従ってピコモルに換算した：0.025%のTFAを含有する20% CH3CN水溶液中に希釈した[3H]DM4原液(250 mCi/mmol)1000〜50,000 cpmを注入することにより、クロマトグラム上のトリチウムの放射能ピーク(mV2)を毎分カウント数(cpm)に関連づける標準曲線を作成した。二重の各試料を前記に従ってHPLC処理した。
結果
huC242-メイタンシノイドコンジュゲートのインビトロ効力およびインビボ活性
[166] ジスルフィド連結した抗体-メイタンシノイドコンジュゲートhuC242-SPDB-DM4、およびチオエーテル連結したコンジュゲートhuC242-SMCC-DMlを、まず抗原陽性COLO 205細胞および抗原陰性ナマルバ細胞に対するそれらの細胞毒性効力について、MTTベースのアッセイ法でアッセイした(両方ともメイタンシン感受性、両細胞系について30〜60 pMのIC50値)。これらのコンジュゲートは、細胞をコンジュゲートに4日間曝露した際、COLO 205細胞に対して40 pMのIC50値、ナマルバ細胞に対して20〜80 nMのIC50値で同様な効力を示した（図７Ａ）。2種類のコンジュゲートの抗腫瘍活性を、皮下HT-29またはCOLO 205腫瘍（両方ともCanAg陽性ヒト結腸腺癌）をもつSCIDマウスにおいて評価した。50μg/kg、１回投与（濃度はコンジュゲートしたDM4を基準とする）のhuC242-SPDB-DM4がHT-29腫瘍を根除する活性は、150μg/kg/日の用量で１日１回、5日間の注射により投与したhuC242-SMCC-DMlのものより大きかった（図７Ｂ）。COLO 205腫瘍をもつSCIDマウスに両者を150μg/kg/日の用量で１日１回、5日間の注射により投与した場合にも、HuC242-SPDB-DM4はhuC242-SMCC-DMlより大きな活性を示した（122日目に5匹中5匹の無腫瘍マウスと、122日目に5匹中2匹の無腫瘍マウスを対比、データを提示していない）。これらの結果は、両コンジュゲートともインビトロでは同様な細胞毒性を示すが、インビボでの腫瘍に対するそれらの有効性は有意に異なることを証明する。
huC242-メイタンシノイドコンジュゲートにより誘発される細胞周期停止に対するリソソーム阻害薬の影響
[167] メイタンシノイド類はチューブリン重合を阻害し、これにより細胞周期をG2/M期で停止させる{Issell B.F., et al Cancer Treat Rev, 5, 199-207 (1978)}。したがって、両コンジュゲートをこの活性について調べた。非同調増殖している細胞の試料をコンジュゲート(3 nM)、またはDMl-SMe（10 nM、構造については図１６を参照）、またはノコダゾール（nocodazole）(0.66μM)（他の微小管重合阻害薬）に、37℃で20時間曝露し、次いでフローサイトメトリーによりDNA含量を分析した。非処理COLO 205細胞のわずか10% (一般に約60%がG1期、30%がS期)と対比して、ノコダゾールまたはDMl-SMeで処理した培養物では50%を超える細胞がG2/M期で停止した（図７Ｃ、第１列）。2種類のコンジュゲートのうちのいずれかで処理した試料では、約70〜80%の細胞がG2/M期で停止した；これは、メイタンシノイドコンジュゲートの細胞周期効果が遊離メイタンシノイド類のものと類似することを示す（図７Ｃ）。ターゲット抗原を欠如する細胞ではコンジュゲートによる細胞周期停止は誘発されなかった（データを提示していない）。
[168] リソソームによるコンジュゲートの取込みおよびプロセシングが癌細胞に対するそれらの活性に必要であるかを試験するために、リソソーム阻害薬バフィロマイシンAlの存在下で誘発したコンジュゲートによるG2/M停止を調べた。BafAlは、エンドソームおよびリソソーム中に存在するプロトンポンプV-ATPaseを選択的に阻害し、これによりこれらの小胞におけるpHが中和される{Drose, S., et al , J Exp Biol, 200, 1-8 (1997); Bowman, E.J., et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 85, 7972-76 (1988)}。このpH中和は後期エンドソームからリソソームへの輸送およびリソソームによるプロセシングを遮断し、わずかではあるがインターナリゼーションおよび周期再開の速度に影響を及ぼし、エンドソームとトランスゴルジの間の輸送は阻害しない{van Weert, A.W., et al, J Cell Biol, 130, 821-34 (1995); Oda, K., et al, Biochem Biophys Res Commun, 178, 369-77 (1991); Zetser, A., et al, J Cell Sci, 117, 2249-58 (2004)}。蛍光修飾したhuC242のインターナリゼーション速度はBafAlにより影響を受けないことも認められた（データを提示していない）。COLO 205細胞をBafAlのみで処理しても、細胞周期の各期の間の細胞分布は有意には変化しなかった（図７Ｃ）。しかし、huC242-SMCC-DMlまたはhuC242-SPDB-DM4により誘発されたG2/M停止は、BafAlの存在下ではほぼ完全に無効になった（6〜9%がG2/M、図７Ｃ）。これに対し、遊離メイタンシノイドDMl-SMeまたはノコダゾールにより起きたG2/M停止の程度に対するBafAl処理の影響はわずかであった（37〜29%がG2/M、図７Ｃ）。異なる機序でpHを中和する他のリソソーム阻害薬クロロキン（chloroquine）{Zetser A., et al, J Cell Sci., 117, 2249-58 (2004)、およびHomewood, C.A., et al, Nature, 235, 50-52 (1972)}を用いた場合も、同様な結果がみられた（図８）。これらの所見は、huC242-SMCC-DMlおよびhuC242-SPDB-DM4両方の活性化においてリソソームによるプロセシングの重要性を指摘する最初のものであった。
huC242-メイタンシノイドコンジュゲートからのメイタンシノイド代謝産物の単離
[169] ターゲット細胞を抗体-メイタンシノイドコンジュゲートと共にインキュベートした際のメイタンシノイド薬物の動態を調べるために、C-20メトキシ基において[3H]-標識したメイタンシノイド類を含むコンジュゲートを製造した（図１６を参照）。放射性標識メイタンシノイドコンジュゲートhuC242-SPDB-[3H]DM4 (250 mCi/mmol)およびhuC242-SMCC-[3H]DMl (214 mCi/mmol)は、放射性標識していないコンジュゲート試料と同様なインビトロ細胞毒性を示す（データを提示していない）。2×106個のCOLO 205細胞の培養物を10-7 Mの[3H]-標識コンジュゲートに5、9および26時間曝露し、細胞とコンディショニングされた培地画分とに分離し、各試料をアセトンで抽出した。これらの条件下で処理した細胞は、トリパンブルー染色により判定して少なくとも最初の26時間は生存し続け、細胞膜は無傷のままであった（データを提示していない）。アセトン抽出液を[3H]-標識代謝産物について逆相HPLCにより分析した。クロマトグラムは、チオエーテル連結したhuC242-SMCC-[3H]DMlからのアセトン抽出試料中の放射能の量に関する信号を示す（図９Ａ）。細胞に曝露する前のhuC242-SMCC-[3H]DMl試料中に存在する遊離メイタンシノイド種を同定するために、実験に用いたコンジュゲートのアセトン抽出液から対照を調製した（図９Ａ; g）。細胞ペレットからの抽出液中に、それぞれ約18.7分および19.2分の保持時間をもつ部分的に分離した新たな2つの放射能ピークが同定された。これらの代謝産物は5時間の曝露後に容易に検出でき、9および26時間までに増加する（図９Ａ; a,c,e）。これらの同じ代謝産物を培地中にも検出できたが、9時間の時点まで検出できず、次いで26時間目の試料中には容易に検出できた。別個の実験でこれら2種類の代謝産物を単離し、質量分析によりリシン-Nε-SMCC-[3H]DMlの2つの異性体であることが認められた（コンジュゲーション反応中に形成されたチオエーテル結合の炭素におけるRまたはS立体配置；両者はM+ = 1103.5; M+Na = 1125.5にピークをもつ）。
[170] ジスルフィド連結したhuC242-SPDB-[3H]DM4コンジュゲートを用いた同様な実験から得た結果も図９Ｂに示す。保持時間20.5、26.5および27分をもつ3つの別個のピークが、huC242-SPDB-[3H]DM4で5および9時間処理した細胞のペレットに由来するクロマトグラム中にみられた（図９Ｂ; a,c）。26時間処理した細胞では、主に27分の保持時間をもつ１つのピークが得られた（図９Ｂ; e）；これは、20.5および26.5分で溶出する代謝産物が27分で溶出する代謝産物に変換されたか、あるいはもはや細胞中に存在しないことを指摘する。26.5分のピークはDM4と同じ保持時間をもつ。この代謝産物をさらに調べるために、また他のいずれかの代謝産物が遊離スルフヒドリル基を含むかを評価するために、9時間曝露からのアセトン抽出液をN-エチル-マレイミド(NEM)で処理し、次いでHPLC処理した（図２Ｂ; g）。アルキル化の後、5時間および9時間目の試料にみられた26.5分のピークに代わって25分に新たなピークがみられた。この新たなピークは精製したDM4-NEM反応生成物の標準品と同時に溶出する（データを提示していない）；これは、26.5分の代謝産物が実際にDM4であったことを示唆する。
[171] 処理細胞からのコンディショニングされた培地に関連する対応するクロマトグラムを図９Ｂ(b、dおよびf)に示す。5時間の曝露後には代謝産物を検出できなかった−存在するピークはコンジュゲート試料のアセトン抽出液のクロマトグラムにもみられる（図９Ｂ; h）。しかし、9時間の曝露後には、5時間後の細胞中にみられた保持時間20.5分の未知の代謝産物を培地中に検出でき、26時間後には18.5分および27分の保持時間をもつさらに2つの代謝産物が存在した。培地中の18.5分で溶出する独自の代謝産物は、DM4とシステインの混合ジスルフィド（S-システイニル-DM4、データを提示していない）と同じ保持時間をもつことが認められた。RPMI 1640培地は0.21 mMのシステインを含有し、別個の実験によりDM4はこれらの条件下でチオール-ジスルフィド交換反応によって速やかに反応して（t1/2＜１時間）S-システイニル-DM4を形成することが示された（データを提示していない）。したがって、このS-システイニル-DM4ジスルフィド化合物は、細胞ペレット中にみられたDM4が細胞から離脱すれば培地中に生成すると想像される。培地中のいずれかの代謝産物がジスルフィド化合物であるかをさらに調べるために、26時間曝露からの細胞上清試料を2等分し、一方をそのままクロマトグラフィー処理し、他方の部分はすべてのジスルフィド結合を還元するためにDTTおよびセレノールで処理した後にクロマトグラフィー処理した(18)。還元後、27分で溶出するピークおよび26.5分の保持時間をもつ１つの新たなピーク（これはDM4のもの）以外のすべての放射能ピークがクロマトグラム中に消失した（図１０）。したがって、18.5分および20.5分で溶出した代謝産物は、ジスルフィド連結した置換基を含むDM4種であるが、27分の代謝産物はそうではない。別個の実験で、20.5分および27分で溶出する未知の代謝産物は、それぞれリシン-Nε-SPDB-DM4 (M+Na = 1048.4)およびS-メチル-DM4 (M+Na = 816.4/ M+K = 832.5)と一致する質量をもつことが認められた。
[172] 前記の実験で、2×106個のCOLO 205細胞を、10-7 Mのコンジュゲートを含有する培地3 mL中でインキュベートした。細胞と共に26時間インキュベートした後に同定されたメイタンシノイド代謝産物中に、この大量のコンジュゲートから回収されたコンジュゲート結合メイタンシノイドは、20%未満であった（図１１Ａcの点線は20%のレベルを表わす）。細胞に4℃で結合させたhuC242-SPDB-[3H]DM4の動態を追跡した別個の実験では、37℃で22時間以内に、COLO 205細胞に結合したコンジュゲートDM4の73%が4種類の代謝産物DM4、S-システイニル-DM4、リシン-Nε-SPDB-DM4、およびS-メチル-DM4に変換された（図１２）。これらの代謝産物は細胞による活性化過程で形成された主な（すべてではないとしても）代謝産物であると考えられる。さらに、これらのメイタンシノイド代謝産物の産生は、COLO 205細胞をこれらの細胞にあるターゲット抗原を結合しないジスルフィド連結またはSMCC-連結メイタンシノイドコンジュゲートと共にインキュベートした場合にはみられなかった（図１３）。
代謝産物の蓄積および細胞周期停止の動力学
[173] huC242-SMCC-[3H]DMlおよびhuC242-SPDB-[3H]DM4から生成した代謝産物に伴う放射能（図９）のピーク面積を測定し、材料および方法の記載に従ってメイタンシノイドのpmolに換算した。結果を図１１Ａに、細胞にコンジュゲートを添加した時点(T = 0)からの経時的なメイタンシノイド代謝産物の累積として示す。パネル(a)は、細胞ペレットおよび培地中におけるhuC242-SMCC-[3H]DMlからの単一代謝産物リシン-Nε-SMCC-DMlの蓄積を示す。細胞中の代謝産物の濃度は9時間のインキュベーション後に定常状態に達する；これは細胞内結合部位が飽和するためであろう。このメイタンシノイド代謝産物は9時間目に培地中に出現し始め、荷電したリシン-Nε-SMCC-DMl種が細胞膜を通って効率的に排出されたことが示唆される。図１１Ａ(b)は、細胞ペレットおよび培地中におけるhuC242-SPDB-[3H]DM4から生成した3種類の安定な代謝産物の蓄積を示す。ジスルフィド化合物リシン-Nε-SPDB-DM4の細胞内量は、26時間の観察期間にわたって漸減する；これは、おそらくジスルフィドが細胞内還元性環境で開裂してDM4になり、生成した遊離チオールDM4が続いて安定なS-メチル-DM4誘導体に変換されたためであろう。9時間のインキュベーション後に細胞内部にみられるDM4があったとしてもごく少量であり、これは、おそらくメチルトランスフェラーゼにより触媒されると思われる急速なメチル化を示唆する。代謝産物の細胞内全蓄積はいずれのコンジュゲートにも9時間曝露した後に定常状態に達し、定常状態の代謝産物レベルは両代謝産物についてほぼ等しい（図１１Ａ）；これは、これらのコンジュゲートが代謝産物の産生に関して同じ律速段階を共有すること、およびこれらの代謝産物が同じ細胞内ターゲットに結合すると思われることを示唆する。
[174] 代謝産物の細胞内蓄積が定常状態レベルに達するのには約9時間が必要であるにすぎないので、いずれかのコンジュゲートにより誘発されるG2/M停止がその時間枠内で起きうるかを判定するために実験を行った。細胞をS期にブロックする可逆的DNA複製阻害剤アフィジコリン（aphidicolin）による24時間処理により、COLO 205細胞をまず同調させた(Ikegami S. et al, Nature, 275, 458-460 ((1978))。大部分の非同調COLO 205細胞集団はG1期にあったので、アフィジコリン処理細胞は大部分がS期の初期にブロックされ、これをFACS分析でG1期から識別することはできない（図１１Ｂ、上図）。次いで、アフィジコリンの除去によりこの同調細胞を停止から開放し、処理せずに放置し、またはDMl-SMeもしくはいずれかのコンジュゲートで処理した。非処理細胞は直ちにDNA合成を開始し、5時間後には大部分(59%)がG2/M期にあり（図１１Ｂ）、10時間目には有糸***を行ってG1期になる(76%)。これに対し、DMl-SMeまたはいずれかのコンジュゲートで処理した細胞は、大部分が1O時間および18時間後にG2/M期にある(75〜85%)；これは、アフィジコリンから開放された細胞が有糸***に達した時点で、有糸***停止を誘発するのに十分な量の活性薬物種が細胞内に蓄積していたことを指摘する。したがって、COLO 205細胞が細胞周期停止を引き起こすのに十分な活性薬物代謝産物を生成するのに必要なのは5時間程度であり、10時間を超えることはない。したがって、これらのコンジュゲートにより誘発されるG2/M期停止の速度は、薬物代謝産物の細胞内蓄積が定常状態レベルに達するのに必要な時間と相関する。
メイタンシノイド代謝産物の活性
[175] 2つの主要な代謝産物S-メチル-DM4およびリシン-Nε-SMCC-DMlを合成し、COLO 205細胞およびナマルバ細胞に対するそれらのインビトロ細胞毒性を調べた。S-メチル-DM4は両細胞系に対して2 pMのIC50値できわめて毒性が高く、一方、リシン-Nε-SMCC-DMlは両細胞系に対して0.1μMのIC50値で効力が約105倍低かった（データを提示していない）。この相異は、これらの化合物の荷電状態の相異により説明できる。荷電したリシン誘導体は細胞膜の透過がきわめて非効率的であるため、要求される細胞内毒性濃度に達するのに高い外部濃度が必要であると想像される。これに対し、中性親油性S-メチル-DM4化合物については細胞膜透過が効率的である。
[176] 非開裂性コンジュゲートからのリシン-Nε-SMCC-DM1代謝産物の蓄積は、観察された開裂性コンジュゲートからの有効なS-メチル-DM4、DM4およびリシン-Nε-SPDB-DM4の形成と一致する。これは、細胞内送達された場合にはリシン-Nε-SMCC-DM1代謝産物が開裂性コンジュゲートからの代謝産物と同様に有効であること、および細胞内で産生された場合すべてのメイタンシノイド代謝産物が活性であることを示唆する。開裂性および非開裂性両方のコンジュゲートの細胞周期停止が、リソソーム阻害薬BafAlの存在下で妨げられた（図７Ｃ）。リシン-Nε-SMCC-DMl代謝産物および開裂性コンジュゲートにみられた他の代謝産物が細胞を停止させるのであれば、BafAlはそれらの形成を阻止するはずである。この可能性を調べるために、COLO 205細胞を37℃で22時間、10-7 MのhuC242-SMCC-[3H]DMlまたはhuC242-SPDB-[3H]DM4コンジュゲートと共に、300 nMのBafAlの存在下または不存在下でインキュベートした。BafAlは、チオエーテル連結コンジュゲートからのリシン-Nε-SMCC-DM1の形成およびジスルフィド連結コンジュゲートからのS-メチル-DM4の形成を妨げた（図１４Ａ）。さらに、BafAlの存在下では、いずれのコンジュゲートで処理した細胞の培地中にも代謝産物は検出されなかった（データを提示していない）。これらの結果は、リシン代謝産物は細胞内送達された場合に有毒であること、および観察されたすべての代謝産物の産生にリソソームによるプロセシングが必要であることを示唆する。
[177] 全メイタンシノイドの放出速度はほぼ一定で20時間であるが、細胞内の代謝産物の最大量に達する9時間後まで、培地中にはほとんど代謝産物がみられない（図１１Ａ，c）。これは、細胞内ターゲットへの代謝産物の結合が排出に影響を及ぼすこと、および毒性の低さが細胞内ターゲットへの結合親和性の低さによるものであれば、より毒性の低いDM4誘導体はより早期に排出する可能性があることを示唆する。この可能性を調べるために、効力が50倍低い（データを提示していない）DM4異性体D-[3H]DM4から製造したコンジュゲートの細胞プロセシングについて試験した。DM4は側鎖に天然L-N-メチル-アラニル基をもち、一方、D-DM4はそれのD-N-メチル-アラニル異性体をもつ。DM4のD-異性体を用いて製造したHuC242コンジュゲートは、COLO 205細胞に対して、対応するL-異性体コンジュゲートより毒性が少なくとも700倍低かった（データを提示していない）。2×106個のCOLO 205細胞試料を、10-7 MのhuC242-SPDB-D-[3H]DM4コンジュゲートおよび対照としての10-7MのhuC242-SPDB-[3H]DM4に37℃で種々の期間曝露し、逆相HPLCにより分析した（図１５）。huC242-SPDB-D-[3H]DM4で処理した細胞内には3O時間後ですら代謝産物はほとんどみられないのに対し、培地中にはわずか5時間のインキュベーション後に保持時間22分の未知代謝産物がみられ、9、22および3時間の曝露後に定常的に増加する。この未知物質の正体はリシン-Nε-SPDB-D-DM4であることがMS分析により確認された(M+Na = 1048.5)。
[178] 30時間後のリシン-Nε-SPDB-D-DM4代謝産物の量は、huC242-SPDB-[3H]DM4で処理した対照細胞からの30時間後のすべての代謝産物の和と類似していた（図１４Ｂ）；これは、DM4のDおよびL-異性体を含む2種類のコンジュゲートが両方とも同様な速度でインターナリゼーションおよびプロセシングされて、それらの各リシン-DM4付加物になることを示唆する。DM4のD-異性体を含むコンジュゲートからのD-DM4、S-システイニル-D-DM4およびS-メチル-D-DM4の蓄積が認められないことの説明は、リシン-Nε-SPDB-D-DM4の細胞内結合の低さおよび急速な排出により説明できる。
実施例３
若干のメイタンシノイド類の合成（図１７）
[179] N 2’ -デアセチル-N 2’ -(3-メチルチオ-l-オキソプロピル)-メイタンシン（S-メチル-DMl、DMlMe）：N2’-デアセチル-N2’-(3-メルカプト-l-オキソプロピル)-メイタンシン(DMl, 30 mg, 0.041 mmol)の、ジメチルアセトアミド(0.25 mL)中における溶液に、ヨードメタン(5.8 mg, 0.041 mmol)の、ジメチルアセトアミド0.2 mL中における溶液を、アルゴン雰囲気下で磁気撹拌しながら添加した。次いでジイソプロピルエチルアミン(5.0 mg, 0.041 mmol)を添加し、反応物を3時間撹拌した。逆相Cl8カラムおよび脱イオン水とアセトニトリルの勾配を用いる高速液体クロマトグラフィー精製により、20 mg (65%の収率)の目的生成物DMlMeを得た。質量スペクトル：実測値774.5 (M + Na＋),計算値774.3 (M + Na＋)；
Figure 2008538365
[180] N 2’ -デアセチル-N 2’ -(4-メチルチオ-4-メチル-l-オキソペンチル)-メイタンシン（S-メチル-DM4、DM4Me）：N2’-デアセチル-N2’-(4-メルカプト-4-メチル-l-オキソペンチル)-メイタンシン(DM4, 12 mg, 0.015 mmol)の、ジメチルアセトアミド(0.1 mL)中における溶液に、ヨードメタン(2.2 mg, 0.015 mmol)の、ジメチルアセトアミド(0.04 mL)中における溶液を、アルゴン雰囲気下で磁気撹拌しながら添加した。次いでジイソプロピルエチルアミン(2.0 mg, 0.015 mmol)を添加し、反応物を3時間撹拌した。Cl8カラムおよび脱イオン水とアセトニトリルの勾配を用いる逆相高速液体クロマトグラフィーにより、目的生成物を単離した(7 mg, 57%の収率)。質量スペクトル：実測値816.4 (M + Na＋), 計算値816.3 (M + Na＋)；
Figure 2008538365
抗体-薬物コンジュゲートの構造である。 結腸腺癌細胞系COLO 205およびHT-29、胃癌細胞系SNU-16、メラノーマ細胞系A375、ならびにバーキットリンパ腫細胞系ナマルバ（Namalwa）へのhuC242抗体結合のヒストグラムである。材料および方法、実施例１に記載したように、細胞をhuC242と共にインキュベートし、次いで蛍光標識-抗ヒトIgGで染色した。細胞に伴う蛍光を蛍光活性化細胞ソーター(FACS)で測定し、それらのヒストグラムを実線で示す。点線は、huC242とプレインキュベートせずに蛍光標識-抗ヒトIgGで染色した細胞のヒストグラムである（バックグラウンド染色）。抗原陽性細胞および抗原陰性細胞の％を数字で示す。 チオエーテル結合ではなくジスルフィド結合により連結したイムノコンジュゲートがインビトロでターゲット細胞に近接した位置にある非ターゲット細胞を死滅させることを示すヒストグラムである。Ａ．三次元コラーゲン細胞培養において、huC242-DMl、ホルムアルデヒドまたはUV線で処理したCOLO 205細胞が非処理COLO 205細胞の増殖に及ぼす効果を示す。非処理細胞と処理細胞を種々の比率で混合し、試料をコラーゲン中で5日間インキュベートし、次いで生存細胞をMTTアッセイにより測定した。各比率の細胞混合物について、生存細胞の割合を示す。黒色、灰色および白色の棒は、それぞれhuC242-DMl処理細胞、ホルムアルデヒド処理細胞およびUV線処理細胞についての培養の結果を表わす。この実験を2回繰り返して、同様な結果を得た。Ｂ．三次元コラーゲン混合細胞培養において増殖した場合、huC242-DMlまたはhuC242-SMCC-DMlで処理したCOLO 205細胞が、非処理COLO205、ナマルバ、A375およびHepG2細胞に及ぼす効果を示す。huC242-DMlまたはhuC242-SMCC-DMlで処理したCOLO 205細胞の試料を、同数のナマルバ、A375、HepG2または非処理COLO 205と混合し、これらの混合培養物をコラーゲンマトリックス中で5日間インキュベートした時点で、生存細胞数をMTTアッセイにより測定し、対照試料（非処理細胞のみ）と比較した。各細胞系について生存細胞の割合を示す；黒色の棒：COLO 205細胞、灰色の棒：ナマルバ細胞、白色の棒：A375細胞、および斜線付きの棒： HepG2細胞。 チオエーテル結合ではなくジスルフィド結合により連結したイムノコンジュゲートがインビトロでターゲット細胞に近接した位置にある非ターゲット細胞を死滅させることを示すヒストグラムである。Ｃ．細胞液体培養における、huC242-DMl、huC242-SMCC-DMl、huC242-DClまたはhuC242-SMCC-DClによる、CanAg陽性COLO 205細胞、CanAg陰性ナマルバ細胞、またはCOLO 205とナマルバの混合細胞集団の処理を示す。COLO 205細胞、ナマルバ細胞、および同数のCOLO 205とナマルバの混合細胞集団を、１種類の抗体-薬物コンジュゲート1 nMの不存在下（左列）または存在下（右列）に、組織培養プレートの丸底ウェル内で増殖させた。5日間のインキュベーション後、ウェルの写真を撮影した。Ｄ．Ｃの場合と同様な実験の結果である。ただし、抗原陽性細胞系はSNU-16である。 huC242-DMで処理した抗原陽性ターゲット細胞の上清中に、細胞毒性メイタンシノイドが徐々に蓄積する。CanAg陽性COLO 205細胞（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）およびCanAg陰性ナマルバ細胞（Ｂ、Ｅ）を、huC242-DMl（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）またはhuC242-SMCC-DMl（Ｃ、Ｆ）と共にインキュベートした。インキュベーションの開始時、ならびに6、24および48時間後に培地を取り出し、コンジュゲート（黒色の棒）および放出されたメイタンシノイド薬物（白色の棒）の存在（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ならびにCanAg陰性ナマルバ細胞に対する毒性活性（Ｄ、Ｅ、Ｆ）をアッセイした。細胞の生存割合を試料中のコンジュゲートの濃度に対してプロットしている。 huC242-DMで処理した抗原陽性ターゲット細胞の上清中に、細胞毒性メイタンシノイドが徐々に蓄積する。CanAg陽性COLO 205細胞（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）およびCanAg陰性ナマルバ細胞（Ｂ、Ｅ）を、huC242-DMl（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）またはhuC242-SMCC-DMl（Ｃ、Ｆ）と共にインキュベートした。インキュベーションの開始時、ならびに6、24および48時間後に培地を取り出し、コンジュゲート（黒色の棒）および放出されたメイタンシノイド薬物（白色の棒）の存在（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ならびにCanAg陰性ナマルバ細胞に対する毒性活性（Ｄ、Ｅ、Ｆ）をアッセイした。細胞の生存割合を試料中のコンジュゲートの濃度に対してプロットしている。 異種移植腫瘍モデルにおけるイムノコンジュゲートのバイスタンダー細胞毒性を示す。Ａ．混合COLO 205 /ナマルバ異種移植腫瘍をSCIDマウスにおいて増殖させ、huC242-DMlまたはhuC242-SMCC-DMlで処理した免疫組織化学的分析を示す。スライドをネズミC242抗体で染色してCOLO 205細胞を検出し（左欄）、または抗CD38抗体で染色してナマルバ細胞を検出した（右欄）。aおよびbは非処理腫瘍の連続切片であり、cおよびdはPBSで処理した対照群動物の腫瘍からのものであり、eおよびfはhuC242-SMCC-DMlで処理した動物の腫瘍からのものであり、gおよびhはhuC242-DMlで処理した動物の腫瘍からのものである。矢印は壊死領域を示す。 異種移植腫瘍モデルにおけるイムノコンジュゲートのバイスタンダー細胞毒性を示す。Ｂ．CanAg陽性ターゲットCOLO 205細胞(a)、抗原陰性ナマルバ細胞(b)、およびCOLO 205とナマルバの混合細胞集団(c)の異種移植腫瘍に対する、huC242-DMlおよびhuC242-SMCC-DMlコンジュゲートの活性を示す。約100 mm3の大きさの腫瘍が樹立した動物を、連続5日間、PBS (黒四角、対照群)、150μg/kgの連結DMlを含有する１日量のコンジュゲートhuC242-SMCC-DMl (〇、●)またはhuC242-DMl (△、▲)で処理した。腫瘍容積mm3を時間（細胞接種後の日数）に対してプロットした。 ターゲット抗原CanAgを不均一発現するHT-29異種移植腫瘍に対するhuC242-DMlおよびhuC242-SMCC-DMlコンジュゲートの活性を示す。平均容積約170 mm3の13日令-皮下腫瘍をもつマウス5匹の群を、連続5日間、PBS (黒四角、対照群)、１日量25μg/kg (◇)、75μg/kg (◆)または150μg/kg (〇)の連結DMlを含有するコンジュゲートhuC242-DMl (Ａ)またはhuC242-SMCC-DMl (Ｂ)で処理した。腫瘍容積mm3を時間（細胞接種後の日数）に対してプロットした。 huC242-SPDB-DM4およびhuC242-SMCC-DMlの細胞毒性、ならびにそれらがリソソーム阻害薬BafAlの存在下で細胞周期に及ぼす効果を示す。（Ａ）種々の濃度のhuC242-SPDB-DM4 (菱形)またはhuC242-SMCC-DMl (四角)に4日間曝露した後、抗原陽性COLO 205細胞（中実記号）および抗原陰性ナマルバ細胞（中空記号）の生存割合をMTTアッセイにより測定し、コンジュゲート濃度に対してプロットした。（Ｂ）HT-29ヒト結腸腫瘍異種移植体をもつSCIDマウスにおける、huC242-SPDB-DM4およびhuC242-SMCC-DMlの抗腫瘍活性を示す。用量はコンジュゲートしたDM4またはDMlを基準とする。腫瘍をもつマウスを、PBS（中実丸、両パネル）、１回量50μg/kgのhuC242-SPDB-DM4（中空菱形）、150μg/kgのhuC242-SPDB-DM4（中実菱形）、または１日１回、5日間、150μg/kgのhuC242-SMCC-DMl注射（中空四角）で処理した。（Ｃ）FACSヒストグラム(FL2-A)により、0.66μMのノコダゾール（nocodazole）、10-8MのDMl-SMe、3×10-9 MのhuC242-SMCC-DMl、もしくは3×10-9 MのhuC242-SPDB-DM4で、30μMのクロロキン（chloroquine）、30 nMのBafAlの存在下に20時間処理した、または処理しなかった非同調指数関数増殖COLO 205細胞のDNA含量を示す。 huC242-SMCC-DMlにより誘発された有糸***停止にクロロキンが及ぼす効果を示す。FACSヒストグラム(FL2-A)により、処理しなかった、または10-8MのDMl-SMe、3×10-9 MのhuC242-SMCC-DMlで、30μMのクロロキンの存在下に20時間処理した非同調指数関数増殖COLO 205細胞試料のDNA含量を示す。クロロキンの存在下ではhuC242-SMCC-DMlにより誘発されるG2/M停止がほぼ完全に阻害され(14%がG2)、これに対しクロロキンはDMl-SMeにより起きるG2/M停止に対してはわずかな効果をもつにすぎなかった(51%がG2)。 COLO 205細胞をhuC242-SMCC-[3H]DMl（Ａ）またはhuC242-SPDB-[3H]DM4（Ｂ）で処理した際に形成されるメイタンシノイド代謝産物を示す。代謝産物を細胞ペレットおよび使用済み培地それぞれからアセトンで抽出し、次いでHPLCにより分析した。カラムからの流出液のトリチウムを、インラインフローシンチレーション分析機により出力mV2でモニターした；したがって、これらのクロマトグラムは保持時間を横軸に、[3H]の尺度としてのmV2を縦軸に示す。パネルa〜fは、huC242-SMCC-[3H]DMl（Ａ）またはhuC242-SPDB-[3H]DM4（Ｂ）で5、9および26時間処理したCOLO 205細胞からの培地および細胞ペレットに関連するクロマトグラムである。（Ａ）のパネルg、および（Ｂ）のパネルhは、それぞれ実験に用いたhuC242-SMCC-[3H]DMlおよびhuC242-SPDB-[3H]DM4コンジュゲート試料のアセトン抽出液から得たクロマトグラムである。パネルg（Ｂ）は、9時間インキュベーションからの細胞ペレット(パネルcの場合と同じ)と同等に処理した細胞に由来するが、ただしクロマトグラフィーの前に試料をさらにNEMに曝露して、スルフヒドリル基があればそれをアルキル化した。 huC242-SPDB-[3H]DM4で処理したCOLO 205細胞からの培地中の代謝産物を、DTTおよびセレノール（selenol）で処理したものである。細胞をコンジュゲートに26時間曝露した後、代謝産物を使用済み培地からアセトンで抽出した。抽出液を2等分した。一方をそのままクロマトグラフィー処理し(a)、他方の部分(b)をクロマトグラフィーの前にDTTおよびセレノールで処理してすべてのジスルフィド結合を還元した。カラムからの流出液のトリチウムを、インラインフローシンチレーション分析機により出力mV-2でモニターした；したがって、これらのクロマトグラムは保持時間を横軸に、[3H]の尺度としてのmV-2を縦軸に示す。 [3H]コンジュゲートで処理したCOLO 205細胞の内外におけるメイタンシノイド代謝産物の蓄積、およびそれらと有糸***停止の相関関係を示す。（Ａ）材料および方法、実施例２に記載するように、図９の代謝産物に関する放射能ピークに関連する面積を定量し、pmolに換算した。パネルa〜cは、26時間のインキュベーション期間にわたる試料中の種々の代謝産物の量の変化を示す。パネルa：COLO 205細胞をhuC242-SMCC-[3H]DMlで処理した後の培地（中空丸）および細胞（中実丸）中におけるリシン-Nε-SMCC-DMlの蓄積。パネルb：COLO 205細胞をhuC242-SPDB-[3H]DM4で処理した後の細胞ペレット（中実記号）および培地（中空記号）中におけるメイタンシノイド代謝産物の量の変化：S-メチル-DM4（四角）、リシン-Nε-SPDB-DM4（丸）、S-システイニル-DM4（菱形）。パネルc：両コンジュゲート、huC242-SMCC-[3H]DMl（丸）およびhuC242-SPDB-[3H]DM4 (四角)について、細胞ペレット中（中実記号）または細胞ペレットと培地を合わせたものの中（中空記号）に存在するすべての代謝産物の総量の変化を示す。（Ｂ）COLO 205細胞を2μg/mLのアフィジコリン（aphidicolin）で24時間処理することによりS期に同調させた。アフィジコリンの除去により細胞をS期から開放し、10-8MのDMl-SMe、3×10-9 MのhuC242-SMCC-DMl、3×10-9 MのhuC242-SPDB-DM4と共にインキュベートし、または処理せずに放置した。アフィジコリン開放後、5、10および18時間目にFACS分析を行った。 細胞表面結合したhuC242-SPDB-[3H]DM4からのメイタンシノイド代謝産物の生成を示す。増殖中のCOLO 205細胞を氷に乗せ、飽和量のhuC242-SPDB-[3H]DM4 (10-7 M)と共にインキュベートして、コンジュゲートをインターナリゼーションさせずに表面受容体に結合させた。次いで細胞を洗浄し、少量の試料をシンチレーション計数することにより、結合した放射能の量を定量した。0℃でコンジュゲートを結合させた後に細胞試料に結合している放射能の全量を示す：縦軸T = 0(中空三角、78 pmol)、および22時間のインキュベーション後(中空三角、57 pmol)。これらの曲線は、5、9、22および30時間インキュベートした試料について、細胞（中実記号）および培地（中空記号）における種々の代謝産物の蓄積を示す。メイタンシノイド代謝産物はS-メチル-DM4（四角）、リシン-Nε-SPDB-DM4（丸）、S-システイニル-DM4（菱形）である。 細胞代謝の抗原依存性を示す。メイタンシノイド代謝産物を、COLO 2005細胞に結合しないコンジュゲートを用いて調べた。パネルＡ(a、b)は、COLO 205細胞をTras-SMCC-[3H]DM1と共に26時間処理した後の細胞(a)および培地(b)のアセトン抽出液のクロマトグラムを示す。同様に、パネルＡ(c)（細胞）およびd（培地）はコンジュゲートhuB4-SPDB-[3H]DM4についてのものである。パネルＢは、Tras-SMCC-[3H]DM1(a)およびhuB4-SPDB-[3H]DM4(b)のアセトン抽出液に関するクロマトグラムを示す。 細胞毒性における主要な代謝産物の役割を示す。（Ａ）BafAlの存在下および不存在下での、BafAlがhuC242-SMCC-[3H]DMlおよびhuC242-SPDB-[3H]DM4の細胞代謝に及ぼす影響。これらのクロマトグラムは、BafAlの存在下にhuC242-SMCC-[3H]DMlまたはhuC242-SPDB-[3H]DM4で22時間処理した、または処理しなかったCOLO 205細胞のアセトン抽出液からのものである。（Ｂ）COLO 205細胞をhuC242-SPDB-D-[3H]DM4またはhuC242-SPDB-[3H]DM4で処理した際に形成されたメイタンシノイド代謝産物の蓄積。huC242-SPDB-D-[3H]DM4（中実四角）およびhuC242-SPDB-[3H]DM4（中実丸）から生成したメイタンシノイド代謝産物の全量。代謝産物を図９の記載に従って定量した。 COLO 205細胞をhuC242-SPDB-D-[3H]DM4で処理した際に形成されたメイタンシノイド代謝産物を示す。COLO 205細胞をhuC242-SPDB-D-[3H]DM4で処理し、5、9、22および30時間目に細胞および培地を収穫し、図７の記載に従って代謝産物を分析した。（Ａ）左パネルは上記の連続4時点における細胞抽出液のクロマトグラムを示し、右パネルは対応する培地試料のクロマトグラムである。（Ｂ）細胞（中実丸）および培地（中空四角）中のhuC242-SPDB-D-[3H]DM4から生成したメイタンシノイド代謝産物の全量を図９の記載に従って定量した。 ターゲット癌細胞におけるhuC242-メイタンシノイドの活性化に関するモデルを示す。コンジュゲート活性化の初期段階は、ジスルフィド結合コンジュゲートhuC242-SPDB-DM4と、非ジスルフィド結合コンジュゲートhuC242-SMCC-DMlについて類似している。両方ともまず抗原仲介エンドサイトーシスによりターゲット癌細胞にインターナリゼーションされ、小胞輸送によりリソソームへ運搬され、次いでリシン誘導体リシン-Nε-SMCC-DMlおよびリシン-Nε-SPDB-DM4に分解される。これらのリシン誘導体は細胞内ターゲットであるチューブリンに結合して、微小管重合の阻害により細胞毒性を引き起こすと思われる。リシン-Nε-SMCC-DMlと異なり、リシン-Nε-SPDB-DM4はさらに細胞内修飾、還元およびS-メチル化を受け、最終的にS-メチル-DM4を形成する可能性がある。荷電したリシン誘導体はいったんターゲット細胞から離れるともはや活性ではないのに対し、中性の親油性S-メチル-DM4化合物は活性を維持し、ターゲット細胞に再侵入するか、または隣接細胞（バイスタンダー）に侵入する可能性がある。 チオメチルメイタンシノイドの合成を示すスキームである。

Claims (115)

  1. Ａはあるリガンドを選択的に発現する細胞集団であり、ＢはＡに発現する該リガンドを欠如する細胞集団である、不均一または混合細胞集団ＡＢを排除する方法であって、
    a．細胞結合剤-薬物コンジュゲートを選択した細胞集団Ａにターゲティングし、その際、１以上の薬物がジスルフィド結合を含むリンカーにより細胞結合剤に共有結合しており、細胞結合剤が細胞集団Ａのリガンドに結合し；
    b．細胞集団Ａを構成する細胞内へ細胞結合剤-薬物コンジュゲートがインターナリゼーションされ；
    c．細胞集団Ａの細胞を死滅させる前に、薬物がコンジュゲートから開裂することにより薬物がアルキル化段階を経由し；そして
    d．アルキル化された薬物が細胞集団Ａから放出されて、細胞集団Ｂ内の細胞の死を誘発し；
    これにより不均一細胞集団を排除することを含む方法。
  2. リンカーは、ジスルフィド交換、酸性pH、光またはペプチダーゼにより開裂する、請求項１の方法。
  3. 薬物は、少なくとも１つのメイタンシノイド類、タキサン類もしくはCC1065、またはその類似体である、請求項１または２の方法。
  4. リンカーは、リンカー内のジスルフィド結合に隣接する炭素原子上にアルキル基を有する、請求項１または２の方法。
  5. アルキル基をコンジュゲートの薬物側に有する、請求項４の方法。
  6. 細胞におけるアルキル化段階により遊離薬物がメチル化される、請求項１の方法。
  7. 薬物は、少なくとも１つのメイタンシノイド類である、請求項１の方法。
  8. リンカーは、少なくとも１つのメイタンシノイド類のC-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチル基のいずれか１つの位置にある、請求項７の方法。
  9. 少なくとも１つのメイタンシノイド類がメイタンシノールのN-メチル-アラニン含有エステルである、請求項７の方法。
  10. 少なくとも１つのメイタンシノイド類がメイタンシノールのN-メチル-システイン含有エステルである、請求項７の方法。
  11. 少なくとも１つのメイタンシノイド類が式(II'-L)、(II'-D)または(II'-D,L)：
    Figure 2008538365
     ［式中：
    Y1’は
    Figure 2008538365
     を表わし、ここで
    R1〜R12は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2〜R12はHであってもよく；
    A、BおよびDは、それぞれ独立して、3〜10個の炭素原子を有する環式アルキルまたは環式アルケニル、単純または置換されたアリールまたは複素環式芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり；
    1、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただし1、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuのうち少なくとも2つが共にゼロであることはなく；
    Mayは、C-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチルの位置に側鎖を有するメイタンシノイド類を表わす］
    で表わされる、請求項７の方法。
  12. R1はメチルであり、かつR2はHであるか、またはR1およびR2はメチルである、請求項１１の方法。
  13. R1はメチルであり、R2はHであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmはそれぞれ１であり、かつnは0であるか；またはR1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmは１であり、かつnは0である、請求項１１の方法。
  14. 少なくとも１つのメイタンシノイド類が式(II-L)、(II-D)または(II-D,L)：
    Figure 2008538365
     ［式中：
    Y1は
    Figure 2008538365
     を表わし、ここで
    R1〜R8は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2〜R8はHであってもよく；
    1、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく；
    Mayは、C-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチルの位置に側鎖を有するメイタンシノイド類を表わす］
    で表わされる、請求項７の方法。
  15. R1はメチルであり、かつR2はHであるか、またはR1およびR2はメチルである、請求項１４の方法。
  16. R1はメチルであり、R2はHであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmはそれぞれ１であり、かつnは0であるか；またはR1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmは１であり、かつnは0である、請求項１４の方法。
  17. 少なくとも１つのメイタンシノイド類が式41'：
    Figure 2008538365
     ［式中：
    Y1’は
    Figure 2008538365
     を表わし、ここで
    R1〜R12は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2〜R12はHであってもよく；
    A、BおよびDは、それぞれ独立して、3〜10個の炭素原子を有する環式アルキルまたは環式アルケニル、単純または置換されたアリールまたは複素環式芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり；
    1、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただし1、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuのうち少なくとも2つが共にゼロであることはない］
    で表わされる、請求項７の方法。
  18. R1はメチルであり、かつR2はHであるか、またはR1およびR2はメチルである、請求項１７の方法。
  19. R1はメチルであり、R2はHであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmはそれぞれ１であり、かつnは0であるか；またはR1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmは１であり、かつnは0である、請求項１７の方法。
  20. 少なくとも１つのメイタンシノイド類が式41：
    Figure 2008538365
     ［式中：
    Y1は
    Figure 2008538365
     を表わし、ここで
    R1〜R8は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2〜R8はHであってもよく；
    1、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよい］
    で表わされる、請求項７の方法。
  21. R1はメチルであり、かつR2はHであるか、またはR1およびR2はメチルである、請求項２０の方法。
  22. R1はメチルであり、R2はHであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmはそれぞれ１であり、かつnは0であるか；またはR1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmは１であり、かつnは0である、請求項２０の方法。
  23. 少なくとも１つのメイタンシノイド類がDM1である、請求項７の方法。
  24. 少なくとも１つのメイタンシノイド類がDM3である、請求項７の方法。
  25. 少なくとも１つのメイタンシノイド類がDM4である、請求項７の方法。
  26. 細胞結合剤は、腫瘍細胞；ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞、活性細胞、骨髄細胞、活性T細胞、B細胞もしくはメラノサイト；CD33、CD19、CanAg、CALLAもしくはHer-2抗原を発現する細胞；またはインスリン増殖因子受容体、上皮増殖因子受容体もしくは葉酸受容体に結合する、請求項１の方法。
  27. 細胞集団Ｂは、腫瘍細胞；ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞、活性細胞、骨髄細胞、活性T細胞、B細胞もしくはメラノサイト、またはその組合わせである、請求項１の方法。
  28. ターゲット細胞集団Ａが発現するリガンドはCD33、CD19、CanAg、CALLAまたはHer-2抗原から選択される抗原であり、非ターゲット細胞集団Ｂは細胞集団Ａにおいてターゲティングする抗原を欠如する、請求項１の方法。
  29. ターゲット細胞集団Ａはインスリン増殖因子受容体、上皮増殖因子受容体または葉酸受容体を発現すると推測され、非ターゲット細胞集団Ｂは細胞集団Ａにおいてターゲティングする受容体を欠如する、請求項１の方法。
  30. 細胞結合剤は、特定のリガンドを発現する乳癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、扁平上皮癌細胞、小細胞性肺癌細胞、睾丸癌細胞および神経芽細胞腫細胞よりなる群から選択される細胞に結合する、請求項１の方法。
  31. 細胞集団Ｂは、乳癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、扁平上皮癌細胞、小細胞性肺癌細胞、睾丸癌細胞および神経芽細胞腫細胞よりなる群から選択される、請求項１の方法。
  32. 腫瘍細胞は不均一腫瘍に由来する、請求項２４の方法。
  33. 不均一腫瘍は充実性腫瘍である、請求項２６の方法。
  34. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメント；ターゲット細胞に特異的に結合する、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、モノクローナル抗体フラグメント；ターゲット細胞に特異的に結合する、キメラ抗体、キメラ抗体フラグメント；ターゲット細胞に特異的に結合する、ドメイン抗体、ドメイン抗体フラグメント；リンホカイン、ホルモン、ビタミン、増殖因子、コロニー刺激因子、または栄養輸送分子である、請求項１の方法。
  35. 細胞結合剤は、インターフェロン、IL2、IL3、IL4、IL6、インスリン、チロトロピン放出ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、ステロイドホルモン、ソマトスタチン、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF、葉酸、トランスフェリン、エストロゲン、エストロゲン類似体、アンドロゲン、またはアンドロゲン類似体である、請求項１の方法。
  36. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、抗体、一本鎖抗体または抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  37. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、リサーフェスト（resurfaced）抗体、リサーフェスト一本鎖抗体またはリサーフェスト抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  38. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、ヒト化抗体、ヒト化一本鎖抗体またはヒト化抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  39. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  40. 細胞結合剤が、ターゲット細胞に特異的に結合する、リサーフェストモノクローナル抗体、リサーフェスト一本鎖モノクローナル抗体またはリサーフェストモノクローナル抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  41. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体、ヒト化一本鎖モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  42. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、キメラ抗体、キメラ抗体フラグメント、ドメイン抗体またはドメイン抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  43. 細胞結合剤は、腫瘍細胞に特異的に結合する、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  44. 細胞結合剤は、腫瘍細胞に特異的に結合する、リサーフェストモノクローナル抗体、リサーフェスト一本鎖モノクローナル抗体またはリサーフェストモノクローナル抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  45. 細胞結合剤は、腫瘍細胞に特異的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体、ヒト化一本鎖モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  46. 細胞結合剤は、腫瘍細胞に特異的に結合する、キメラ抗体、キメラ抗体フラグメント、ドメイン抗体またはドメイン抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  47. 細胞結合剤は、結腸直腸癌細胞または乳癌細胞に特異的に結合する、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  48. 細胞結合剤は、結腸直腸癌細胞または乳癌細胞に特異的に結合する、リサーフェストモノクローナル抗体、リサーフェスト一本鎖モノクローナル抗体またはリサーフェストモノクローナル抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  49. 細胞結合剤は、結腸直腸癌細胞または乳癌細胞に特異的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体、ヒト化一本鎖モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  50. 細胞結合剤は、乳癌細胞に特異的に結合する、リサーフェストモノクローナル抗体、リサーフェスト一本鎖モノクローナル抗体またはリサーフェストモノクローナル抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  51. 細胞結合剤は、乳癌細胞に特異的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体、ヒト化一本鎖モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項１の方法。
  52. 細胞結合剤は、抗CanAg抗体、抗CD19抗体、抗CD33抗体、抗CALLA抗体、抗EGFR抗体、抗CD56抗体、抗IGF-IR抗体、または抗Her2抗体である、請求項１の方法。
  53. 細胞結合剤は、リサーフェスト抗体My9-6、KS77またはN901である、請求項１の方法。
  54. 細胞結合剤は、トラスツヅマブ抗体、B4抗体またはhuC242抗体である、請求項１の方法。
  55. 細胞結合剤はhuC242抗体である、請求項１の方法。
  56. 細胞結合剤はトラスツヅマブ抗体である、請求項１の方法。
  57. 異常細細胞集団を排除する方法であって、
    a）細胞結合剤-薬物コンジュゲートを、該コンジュゲートの細胞結合剤が認識するリガンドを発現する選択した細胞集団にターゲティングし、その際、１以上の薬物がジスルフィド結合を含むリンカーにより細胞結合剤に共有結合しており、細胞結合剤が該細胞に結合し；
    b）コンジュゲート中のプロドラッグが細胞毒性薬物に変換され、これは該リガンドを含むと推測される選択した細胞集団を死滅させる前に、さらにアルキル化段階を経由し；そして
    c）アルキル化された細胞毒性薬物が、選択した細胞集団から放出されて、該リガンドを欠如すると推測される他の選択した細胞集団の死を誘発し；
    これにより異常細胞集団内の細胞を排除することを含む方法。
  58. リンカーは、ジスルフィド交換、酸性pH、光またはペプチダーゼにより開裂する、請求項５７の方法。
  59. 薬物は、少なくとも１つのメイタンシノイド類、タキサン類もしくはCC1065、またはその類似体である、請求項５７または５８の方法。
  60. リンカーは、リンカー内のジスルフィド結合に隣接する炭素原子上にアルキル基を有する、請求項５７の方法。
  61. アルキル基をコンジュゲートの薬物側に有する、請求項５７の方法。
  62. 薬物は、少なくとも１つのメイタンシノイド類である、請求項５７の方法。
  63. リンカーは、少なくとも１つのメイタンシノイド類のC-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチル基のいずれか１つの位置にある、請求項６２の方法。
  64. 少なくとも１つのメイタンシノイド類がメイタンシノールのN-メチル-アラニン含有エステルである、請求項６２の方法。
  65. 少なくとも１つのメイタンシノイド類がメイタンシノールのN-メチル-システイン含有エステルである、請求項６２の方法。
  66. 少なくとも１つのメイタンシノイド類が式(II'-L)、(II'-D)または(II'-D,L)：
    Figure 2008538365
     ［式中：
    Y1’は
    Figure 2008538365
     を表わし、ここで
    R1〜R12は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2〜R12はHであってもよく；
    A、BおよびDは、それぞれ独立して、3〜10個の炭素原子を有する環式アルキルまたは環式アルケニル、単純または置換されたアリールまたは複素環式芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり；
    1、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただし1、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuのうち少なくとも2つが共にゼロであることはなく；
    Mayは、C-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチルの位置に側鎖を有するメイタンシノイド類を表わす］
    で表わされる、請求項６２の方法。
  67. R1はメチルであり、かつR2はHであるか、またはR1およびR2はメチルである、請求項６６の方法。
  68. R1はメチルであり、R2はHであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmはそれぞれ１であり、かつnは0であるか；またはR1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmは１であり、かつnは0である、請求項６６の方法。
  69. 少なくとも１つのメイタンシノイド類が式(II-L)、(II-D)または(II-D,L)：
    Figure 2008538365
     ［式中：
    Y1は
    Figure 2008538365
     を表わし、ここで
    R1〜R8は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2〜R8はHであってもよく；
    1、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく；
    Mayは、C-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチルの位置に側鎖を有するメイタンシノイド類を表わす］
    で表わされる、請求項６２の方法。
  70. R1はメチルであり、かつR2はHであるか、またはR1およびR2はメチルである、請求項６９の方法。
  71. R1はメチルであり、R2はHであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmはそれぞれ１であり、かつnは0であるか；またはR1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmは１であり、かつnは0である、請求項６９の方法。
  72. 少なくとも１つのメイタンシノイド類が式41’：
    Figure 2008538365
     ［式中：
    Y1’は
    Figure 2008538365
     を表わし、ここで
    R1〜R12は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2〜R12はHであってもよく；
    A、BおよびDは、それぞれ独立して、3〜10個の炭素原子を有する環式アルキルまたは環式アルケニル、単純または置換されたアリールまたは複素環式芳香族またはヘテロシクロアルキル基であり；
    1、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただし1、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuのうち少なくとも2つが共にゼロであることはない］
    で表わされる、請求項６２の方法。
  73. R1はメチルであり、かつR2はHであるか、またはR1およびR2はメチルである、請求項７２の方法。
  74. R1はメチルであり、R2はHであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmはそれぞれ１であり、かつnは0であるか；またはR1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmは１であり、かつnは0である、請求項７２の方法。
  75. 少なくとも１つのメイタンシノイド類が式41：
    Figure 2008538365
     ［式中：
    Y1は
    Figure 2008538365
     を表わし、ここで
    R1〜R8は、それぞれ独立して、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2〜R8はHであってもよく；
    1、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよい］
    で表わされる、請求項６２の方法。
  76. R1はメチルであり、かつR2はHであるか、またはR1およびR2はメチルである、請求項７５の方法。
  77. R1はメチルであり、R2はHであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmはそれぞれ１であり、かつnは0であるか；またはR1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7およびR8はそれぞれHであり、1およびmは１であり、かつnは0である、請求項７５の方法。
  78. 少なくとも１つのメイタンシノイド類がDM1である、請求項６２の方法。
  79. 少なくとも１つのメイタンシノイド類がDM3である、請求項６２の方法。
  80. 少なくとも１つのメイタンシノイド類がDM4である、請求項６２の方法。
  81. 細胞結合剤は、腫瘍細胞；ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞、活性細胞、骨髄細胞、活性T細胞、B細胞もしくはメラノサイト；CD33、CD19、CanAg、CALLAもしくはHer-2抗原を発現する細胞；またはインスリン増殖因子受容体、上皮増殖因子受容体もしくは葉酸受容体に結合する、請求項５７の方法。
  82. 細胞結合剤は、乳癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、扁平上皮癌細胞、小細胞性肺癌細胞、睾丸癌細胞および神経芽細胞腫細胞よりなる群から選択される細胞に結合する、請求項５７の方法。
  83. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメント；ターゲット細胞に特異的に結合する、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、モノクローナル抗体フラグメント；ターゲット細胞に特異的に結合する、キメラ抗体、キメラ抗体フラグメント；ターゲット細胞に特異的に結合する、ドメイン抗体、ドメイン抗体フラグメント；リンホカイン、ホルモン、ビタミン、増殖因子、コロニー刺激因子、または栄養輸送分子である、請求項５７の方法。
  84. 細胞結合剤は、インターフェロン、IL2、IL3、IL4、IL6、インスリン、チロトロピン放出ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、ステロイドホルモン、ソマトスタチン、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF、葉酸、トランスフェリン、エストロゲン、エストロゲン類似体、アンドロゲン、またはアンドロゲン類似体である、請求項５７の方法。
  85. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、抗体、一本鎖抗体または抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  86. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、リサーフェスト抗体、リサーフェスト一本鎖抗体またはリサーフェスト抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  87. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、ヒト化抗体、ヒト化一本鎖抗体またはヒト化抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  88. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  89. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、リサーフェストモノクローナル抗体、リサーフェスト一本鎖モノクローナル抗体またはリサーフェストモノクローナル抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  90. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体、ヒト化一本鎖モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  91. 細胞結合剤は、ターゲット細胞に特異的に結合する、キメラ抗体、キメラ抗体フラグメント、ドメイン抗体またはドメイン抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  92. 細胞結合剤は、腫瘍細胞に特異的に結合する、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  93. 細胞結合剤は、腫瘍細胞に特異的に結合する、リサーフェストモノクローナル抗体、リサーフェスト一本鎖モノクローナル抗体またはリサーフェストモノクローナル抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  94. 細胞結合剤は、腫瘍細胞に特異的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体、ヒト化一本鎖モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  95. 細胞結合剤は、腫瘍細胞に特異的に結合する、キメラ抗体、キメラ抗体フラグメント、ドメイン抗体またはドメイン抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  96. 細胞結合剤は、結腸直腸癌細胞または乳癌細胞に特異的に結合する、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  97. 細胞結合剤は、結腸直腸癌細胞または乳癌細胞に特異的に結合する、リサーフェストモノクローナル抗体、リサーフェスト一本鎖モノクローナル抗体またはリサーフェストモノクローナル抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  98. 細胞結合剤は、結腸直腸癌細胞または乳癌細胞に特異的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体、ヒト化一本鎖モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  99. 細胞結合剤は、乳癌細胞に特異的に結合する、リサーフェストモノクローナル抗体、リサーフェスト一本鎖モノクローナル抗体またはリサーフェストモノクローナル抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  100. 細胞結合剤は、乳癌細胞に特異的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体、ヒト化一本鎖モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項５７の方法。
  101. 細胞結合剤は、抗CanAg抗体、抗CD19抗体、抗CD33抗体、抗CALLA抗体、抗EGFR抗体、抗CD56抗体、抗IGF-IR抗体、または抗Her2抗体である、請求項５７の方法。
  102. 細胞結合剤は、リサーフェスト抗体My9-6、KS77またはN901である、請求項５７の方法。
  103. 細胞結合剤は、トラスツヅマブ抗体、B4抗体またはhuC242抗体である、請求項５７の方法。
  104. 細胞結合剤はhuC242抗体である、請求項５７の方法。
  105. 細胞結合剤はトラスツヅマブ抗体である、請求項５７の方法。
  106. 不均一または混合細胞集団中の非ターゲット細胞を阻害または死滅させるためにターゲット細胞集団を利用する方法であって、
    a）細胞結合剤-薬物コンジュゲートを、該コンジュゲートの細胞結合剤が認識するリガンドを含むと推測されるターゲット細胞集団にターゲティングし、その際、１以上の薬物がジスルフィド結合を含むリンカーにより細胞結合剤に共有結合しており、細胞結合剤が該細胞に結合し；
    b）コンジュゲート中のプロドラッグが、選択したターゲット細胞集団において細胞毒性薬物に変換されて、ターゲット細胞を阻害または死滅させ；そして
    c）細胞毒性薬物がターゲット細胞集団から放出されて、ターゲット細胞中のリガンドを欠如する非ターゲット細胞を阻害または死滅させ；
    d）これにより、ターゲット細胞および非ターゲット細胞の不均一または混合細胞集団を阻害または死滅させる
    ことを含む方法。
  107. 不均一または混合細胞集団を含む腫瘍内の腫瘍細胞を死滅させる方法であって、
    a）リガンドを発現すると推測される選択した腫瘍細胞集団から脱落した脱落リガンドを、細胞結合剤-薬物コンジュゲートで選択的にターゲティングし、その際、１以上の薬物がジスルフィド結合を含むリンカーにより細胞結合剤に共有結合しており、細胞結合剤が脱落リガンドに結合し；
    b）コンジュゲート中のプロドラッグが細胞毒性薬物に変換され、リガンドを脱落した選択した腫瘍細胞集団を死滅させる前に、これがさらにアルキル化段階を経由し；そして
    c）さらに、該リガンドを完全に欠如する腫瘍細胞の死を誘発し；
    これにより腫瘍内の不均一または混合細胞集団を死滅させることを含む方法。
  108. 次式の化合物：
    Figure 2008538365
     （式中、nは0または１であり、Mayはメイタンシノイド類である）。
  109. 次式の化合物：
    Figure 2008538365
     （式中、DMlMeにおいてはn=0であり；DM4Meにおいてはn=lである）。
  110. メイタンシノイド類が未反応チオール基においてアルキル化を受けた、アルキル化メイタンシノイド。
  111. アルキルがメチル、エチル、プロピルまたはブチルである、請求項１１０のアルキル化メイタンシノイド。
  112. 単離されたリシン-Nε-SMCC-DMl。
  113. 単離されたリシン-Nε-SPDB-DM4。
  114. 単離されたS-システイニル-DM4。
  115. 単離されたS-メチル-DM4。
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