JP2008537487A - ビタミン含有量が改変された果実を有するコショウ植物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ビタミン含有量が改変された可食果実、特に高い含有量のビタミンＥを含み、高い含有量のプロビタミンＡ、高い含有量のビタミンＣ及びこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含む果実を有するコショウ植物を提供する。ビタミンＥ濃度の濃度は少なくとも約５ｍｇ／１００ｇ新鮮重量であり、望ましくない形質と連鎖している分子マーカーを欠いている植物を選択する。

Description

本発明は、ビタミン含有量が改変された果実を有するコショウ植物、特に高いビタミンＥ含有量、並びに高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量及びこれらの組合せの少なくとも１つを有する新鮮な可食果実に関する。本発明はさらに、高いビタミン含有量という望ましい形質を保持しながら、望ましくない形質と連鎖している遺伝子マーカーを欠いているとして選択した植物に関する。

天然ビタミンは、哺乳動物身体の正常な機能に必要不可欠な有機食用物質である。しかしながら、幾つかの例外を除いて、哺乳動物はビタミンを生成又は合成することができず、したがって、ビタミンは食品中に、又は栄養サプリメントとして供給されなければならない。消費されるべき特定のビタミンの量は年齢、性別及びビタミンの型に依存する。ビタミンの栄養所要量（ＲＤＡ）は、各年齢段階及び性別集団中のほぼ全ての（９７〜９８％の）健康な個体の栄養要件を満たすのに充分な、平均的な１日当たりの食物摂取レベルである。高濃度の幾つかのビタミンは、健康問題を引き起こす可能性があるので、ＲＤＡを超える用量でビタミンを消費することは勧められていない。ビタミンの上限の許容レベルは、典型的には「一般的な集団中のほぼ全ての個体において悪い健康上の影響の危険性を呈する可能性がない栄養素の最大摂取を表す」レベルとして認められている（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｂｏａｒｄ．Ｄｉｅｔａｒｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｉｎｔａｋｅｓ：ＶｉｔａｍｉｎＣ，ＶｉｔａｍｉｎＥ，Ｓｅｌｅｎｉｕｍ、ａｎｄ Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ、ワシントン、ＤＣ、２０００）。

ヒトに関しては、果実及び野菜が、抗酸化ビタミン、ビタミンＥ、ビタミンＡ及びビタミンＣを含めたビタミンの主な食品源である。

ビタミンＥとも呼ばれるトコフェロール化合物は、植物油中に見られる活性要素である。ビタミンＥは８つの異なる化学形で存在し、その中でヒトにおいて最も有効な形はα−トコフェロールである。ビタミンＥの活性は、この群の栄養物質の生理活性を指す。ビタミンＥの活性を有する物質は、いずれもクロマン−６−オールの誘導体である。これらの化合物は、イソプレノイドＣｉ_６−側鎖を有するトコール誘導体である。用語「トコール」は、２−メチル−２−（４’，８’，１２’−トリメチルトリデシル）クロマン−６−オールを指す。α−、β−、γ−、及びδ−トコフェロールを含むこれらの化合物は、ビタミンＥの活性に最も重要である。

近年公開された前方視的健康試験は、ビタミンＥサプリメントの摂取は、女性と男性の両方において冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）の低い危険性と関係があることを実証している。例えばＲｉｍｍら（ＮＥＪＭ、３２８、１４５０〜１４５６、１９９３）は、ビタミンＥの１日当たりのサプリメントレベルが増大すると、ＣＨＤの危険性が有意に低下したことを示した。この試験は、ビタミンＥの１５〜２５国際単位（ＩＵ）の現在のＲＤＡ（すなわち、１０〜１５ｍｇ／１日）は、ビタミンＥの完全な防御利点を得るのに充分ではない可能性があることを示す。他の試験は、酸化ダメージに対する血漿ＬＤＬコレステロール及び細胞要素の保護、及び疾患に対して身体を保護するための正常な免疫機能の維持に関する、ビタミンＥの有益な機能を示してきている。長期間健康な高齢者によって摂取される１日当たりのビタミンＥの高用量（すなわち、４カ月間１日当たり８００ＩＵ）さえも、副作用を引き起こさず、一般的な健康又は代謝機能に否定的な変化を引き起こさなかったことも、広範囲の一連の血液試験に基づいた対象試験において示されてきている（Ｍｅｙｄａｎｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．６８：３１１〜３１８、１９９８）。対照的に、Ｔ細胞介在性機能の有意な改善、及び血漿中のビタミンＥレベルの有意な増大が記された。植物油、ナッツ、及び青葉野菜は、ビタミンＥのよい供給源である。しかしながら、例えばマンゴーフルーツ又はブロッコリーの１食分によって与えられるビタミンＥの量は、栄養所要量の約５〜８パーセントしか与えない。

ビタミンＡ化合物のファミリーのうち、レチノールが最も活性があり、すなわち有用な形であり、それは、ビタミンＡの他の活性形であるレチナール及びレチノイン酸に転換され得る。カロテノイドは、果実にその黄色から赤色を与える色素のファミリーである。プロビタミンＡカロテノイドの中では、β−カロテンが、他のプロビタミンカロテノイド、例えばα−カロテン及びβ−クリプトキサンチンより効率良くレチノールに転換される。リコペン、ルテイン及びゼアキサンチンなどの他の知られているカロテノイドはビタミンＡの供給源ではないが、しかしながらそれらは、強い抗酸化性及び抗発癌活性を有する重要な栄養素でもある。ビタミンＡは骨の成長、細胞***及び細胞分化において重要な役割を果たす。ビタミンＡ、特にレチノールは、眼、気道、尿路及び腸管の表面内層の維持と関係があり、したがってこれらの内層を完全に保つことによって感染を予防する際に役割を有する。ビタミンＡは、皮膚及び粘膜の完全性を保つため、並びに細菌及びウイルス感染を妨げるために近年使用されている。それが免疫系の制御を手助けすることも知られている。ビタミンＡのＲＤＡは、レチノール及びプロビタミンＡカロテノイドの異なる活性を計算するためのレチノール活性当量（ＲＡＥ）として記され、現在は年齢及び性別に応じて６００〜９００μｇである。身体中のビタミンＡの高い貯蔵レベル（ビタミンＡ過剰症）は、毒性症状をもたらす可能性がある。過剰量のビタミンＡが原因である３つの主な悪影響：先天性異常、肝臓の異常、及び骨粗しょう症をもたらす可能性がある低い骨ミネラル密度が存在する。短期間で非常に多量の予備形成ビタミンＡを消費した後に、毒性症状が生じる可能性もある。ビタミンＡはレバー、全乳及び全卵などの動物性食品中に見られる。しかしながら、脂肪及びコレステロールの高い含有量のために、このような食品の多大な消費は勧められない。β−カロテンを含む暗色の野菜及び果実を消費することが、したがって好ましい。さらに、プロビタミンＡカロテノイドのビタミンＡへの転換は、身体中の貯蔵が完全であるとき減少し、これがしたがって貯蔵レベルのさらなる増大を制限し、ビタミンＡ過剰症を予防する。

アスコルビン酸としても知られるビタミンＣは、抗酸化剤としてのその役割だけには限らないがそれを含めた様々な理由で、適切な栄養摂取に必要不可欠である。多くの栄養物質は酸化によって破壊されるが、ビタミンＣはそれ自体が酸化状態になることによって、これらの物質を保護することができる（Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、２９４、Ｗｈｉｔｎｅｙ ａｎｄ Ｒｏｌｆｅｓ Ｅｄｓ．６ｔｈ Ｅｄ．、１９９３）。食品製造者はビタミンＣを彼らの製品に加えて、食品を酸化から保護することが多いはずである。身体内においてビタミンＣは、他のビタミン及びミネラルを酸化から保護する。例えば腸内では、ビタミンＣは鉄を保護し、したがってその生物学的利用能を促進する。

ビタミンＣは、結合組織を含む繊維状構造タンパク質であるコラーゲンの形成、及びホルモンエピネフィリン及びチロキシンに転換されるアミノ酸を含めた、幾つかのアミノ酸の代謝に関与している。風邪及び感染に曝されることによって、ビタミンＣの必要性が増大する。ビタミンＣによって形成されるチロキシンは、身体が熱の生成を必要とするとき、例えば発熱中又は非常に寒い気候中に常に増大する代謝率を制御する。

異なる国々がビタミンＣに関する異なる１日当たりの要件を設定しているが、毎日約１０ｍｇはビタミンＣ欠乏症（壊血病）となるはずであることに、大部分が賛同している。１日当たり６０ｍｇでは、身体はさらなるビタミンＣ摂取に対する応答を止めるはずである。毎日１００ｍｇでは、全ての身体の組織が飽和状態であり、身体は過剰のビタミンＣを排出し始める。米国内のビタミンＣの栄養所要量（ＲＤＡ）は、１日当たり６０ｍｇである。しかしながら、患者がちょうどある程度の生理的又は精神的ストレスを経ているか、毎日アルコールを消費する或いは喫煙している場合、より多くのビタミンＣが必要とされる可能性がある。妊婦又は授乳中の女性も、胎児又は母乳に移動するその１日当たりの摂取量の割合のために、追加のビタミンＣを必要とする。

過剰のビタミンＣは毒性であり、痙攣、悪心及び下痢を引き起こす可能性があり、糖尿病の存在を不明瞭にする可能性もある。毒性レベルは１日２ｇで始まる可能性がある。ビタミンＣのよい供給源には柑橘系果実、ブロッコリー、カリフラワー、イチゴ、ジャガイモ、並びに腎臓及び肝臓などの臓器の肉がある。

要約すると、食事においてビタミンＡ、Ｃ及びＥを得ることは、良好な健康状態を保つためには必要不可欠であり、果実及び野菜はこれらのビタミンの好ましい供給源である。

コショウは、その種であるＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ及びＣａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓを含むトウガラシ属に属しており、大部分の栽培されているコショウはそれに由来する。コショウはピーマンなどのアマトウガラシとして、ハラペニョトウガラシなどの刺激性チリペッパーとして、（タバスコソースを作製するために使用される）タバスコトウガラシとして、及びパプリカなどの様々な色の乾燥粉末の供給源として、世界中で栽培及び使用されている。コショウ果実、特に赤色及びオレンジ色の果実を有するコショウ果実は、プロビタミンＡカロテノイドを含めたカロテノイドの供給源として知られている。ビタミンＣは充分な量で存在してもよいが、高いビタミンＣ含有量を含む果実は典型的には刺激性である。可食果実を有するコショウ変種では、ビタミンＥ含有量は１食当たりのＲＤＡをごく一部分しか与えない。高いビタミン含有量は典型的には、コショウ果実の可食部分である薄い果皮を有する刺激性果実と関係がある。このような刺激性果実は、少量の１食分でスパイスとして新鮮な状態で消費され、消費することができるビタミン含有量は劇的に減少する。望ましくない可食果実である刺激性及び薄い果皮という形質は、交配によって除去することは難しく、刺激性変種から市販レベルでの高いビタミンＥ含有量を有する果実を作出することができる植物の開発は、冗長且つ困難であろうことは、したがって予想される。

したがって、刺激性形質及び他の望ましくない形質を欠きながら、高い含有量のビタミンＥ、及びプロビタミンＡ、ビタミンＣの少なくとも１つを有する果実を有するコショウ植物を有することは、非常に有利であるはずである。

本発明は、改善されたビタミン含有量を有するコショウ果実の必要性を述べる。したがって本発明は、現在市販されているコショウ品種の可食果実と比較してビタミン含有量が改変された可食性の甘い果実を有する、市販用に生長させるのに適したコショウ植物を提供する。より詳細には本発明は、現在市販されているコショウ品種と比較してビタミン含有量が改変された果実を有するコショウ植物であって、果実が高いビタミンＥ含有量を含み、高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量又はこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含み、ビタミンＥの濃度が少なくとも５ｍｇ／１００ｇ新鮮重量（ＦＷ）である、コショウ植物を提供する。本発明の果実は、非刺激性であり厚い果皮を有するものをさらに選択する。このような選択は、例えばＤＮＡマーカーを使用して実施する。

好ましくは、コショウ果実は高い含有量の全３種の必須ビタミンを含み、プロビタミンＡ濃度は少なくとも約３ｍｇ／１００ｇＦＷであり、ビタミンＣの濃度は少なくとも約２００ｍｇ／１００ｇＦＷ、好ましくは約２００ｍｇ／１００ｇＦＷ〜約５００ｍｇ／１００ｇＦＷの範囲である。コショウ果実は、少なくとも７０ｍｇ／１００ｇＦＷの高い含有量の合計カロテノイドを含むことがさらに好ましい。本発明の植物は安定した真の近交系の形であってよく、或いは雑種、交配種などを含めたより多様な物質としての形であってよく、前に記載したように、これらはいずれもビタミン含有量が改変された果実を与える。

本発明はさらに、本発明の植物の種子、種子から生長した植物、それらの子孫、植物によって作出された果実、これらに由来する植物の一部分、及びこれらの作出法に関する。本発明はさらに、本発明の植物によって作出された優性の高ビタミンコショウ果実から得た作出物に関する。

一態様によれば本発明は、現在市販されているコショウ品種の可食果実と比較してビタミン含有量が改変された果実を有するコショウ植物であって、果実が高いビタミンＥ含有量を含み、高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量及びこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含み、ビタミンＥの濃度が少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷである、コショウ植物を提供する。特定の実施形態によれば、果実は非刺激性であり厚い果皮を有する。

一実施形態によれば、果実は少なくとも約７ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥ、好ましくは少なくとも約９ｍｇ／１００ｇＦＷ、より好ましくは少なくとも約１１ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含む。

別の実施形態によれば、本発明は少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含み、プロビタミンＡをさらに含む果実を有するコショウ植物を提供する。なお別の実施形態によれば、本発明は少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含み、ビタミンＣをさらに含む果実を有するコショウ植物を提供する。さらなる実施形態によれば、本発明は少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含み、高い含有量のプロビタミンＡ及びビタミンＣをさらに含む果実を有するコショウ植物を提供する。特定の実施形態によれば、果実は非刺激性であり厚い果皮を有する。

一実施形態によれば、プロビタミンＡ濃度は少なくとも約３ｍｇ／１００ｇＦＷ、好ましくは少なくとも約４ｍｇ／１００ｇＦＷ、より好ましくは少なくとも約６ｍｇ／１００ｇＦＷであり、且つビタミンＣの濃度は少なくとも約２００ｍｇ／１００ｇＦＷ、好ましくは約２００ｍｇ／１００ｇＦＷ〜約５００ｍｇ／１００ｇＦＷの範囲である。

いっそうさらなる実施形態によれば、本発明のコショウ植物によって作出された果実は、高い含有量の合計カロテノイドをさらに含む。一実施形態によれば、合計カロテノイド濃度は少なくとも約７０ｍｇ／１００ｇＦＷである。

本明細書で使用する用語「改変されたビタミン含有量」は、前に記載した高いビタミンＥ濃度、並びにプロビタミンＡ及びビタミンＣ、及びこれらの組合せの少なくとも１つの高い濃度を指し、コショウ果実、特に非刺激性であり厚い果皮を有する現在市販されている新鮮な可食コショウ果実における、これまでに知られているビタミン濃度と比較して、これらの濃度は改変されている。このような可食コショウ果実における知られているビタミン濃度は、約１．５〜３．０ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥ濃度、約１．０ｍｇ／１００ｇＦＷのプロビタミンＡ、及び約１００ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＣである。好ましい実施形態では、このビタミンＥ、プロビタミンＡ及び／又はビタミンＣの濃度は、現在市販されている可食コショウ果実において見られるビタミンＥ、プロビタミンＡ及び／又はビタミンＣの濃度と比較して高い。

本明細書で前に記載したように、ビタミンＥの天然供給源は、１日当たりの用量に必要とされるビタミンのわずか一部分しか含まない。果実は知られている多量のビタミンＥの供給源に含まれず、このような供給源は典型的にはカロリーが高く、したがって健康食にはあまり勧められない。今日現在、必要量のビタミンＥを得るには、天然形と同一でなく天然形と比較して活性が低い合成α−トコフェロールを補った食品を消費することが必要である。

これまで、高濃度のビタミンＣ及びビタミンＥは、それぞれ刺激性のコショウ果実及びパプリカ系果実においてのみ見られた、これらは少量の１食分においてのみ働く可能性があり、或いは典型的には生鮮品として消費されず、したがってわずかな少ない割合のＲＤＡを与える。

本発明は、生鮮品用可食コショウ果実を有するコショウ植物であって、現在市販されているコショウ果実において見られるこれらのビタミンの濃度と比較して、果実が高濃度のビタミンＥを含み、高濃度のプロビタミンＡ、特にβ−カロテン、及び抗酸化ビタミンＣの少なくとも１つをさらに含むコショウ植物を与えることによって、これらの制約に答える。好ましくは、果実は高い含有量の合計カロテノイドも含む。

特定の実施形態によれば、本発明は、高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列を欠いているコショウ植物を提供する。一実施形態によれば、ＤＮＡ配列はＤＮＡ断片の増幅用の鋳型であり、この場合ＤＮＡ断片は刺激性に関する分子マーカーとして使用され、したがってこのＤＮＡマーカーを欠いている植物は非刺激性である。一実施形態によれば、高刺激性と同時分離するＤＮＡ配列は、配列番号３で示されるポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。現在好ましい一実施形態によれば、刺激性と同時分離するＤＮＡ配列は、配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列を有する第１プライマー、及び配列番号２で示されるポリヌクレオチド配列を有する第２プライマーを使用するＤＮＡ断片の増幅用の鋳型である。生成するＤＮＡ断片は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有する約７００ｂｐである。したがって、現在好ましい一実施形態によれば、本発明の植物は配列番号３を有するＤＮＡ断片を欠いている。

特定の実施形態によれば、本発明の植物は１００ｇの平均重量を有する果実を作出する。ビタミンＥのＲＤＡは、今日現在１０〜１５ｍｇである。したがって、本発明の１つの１００ｇのコショウ果実は、ビタミンＥのＲＤＡの少なくとも２５％、好ましくはＲＤＡの５５％までを含み、これは現在市販用に生産されているアマトウガラシ果実によって与えられる約３〜５倍のビタミンＥ量である。本発明の果実は刺激性を欠くので、１食分は約１００ｇの少なくとも１つの果実である。

別の態様によれば本発明は、ビタミン含有量が改変された果実作物を作出するコショウ植物であって、果実作物が高いビタミンＥ含有量を含み、高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量又はこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含み、平均的な作物のビタミンＥの濃度が少なくとも５ｍｇ／１００ｇＦＷである、コショウ植物を提供する。幾つかの実施形態によれば、果実は非刺激性であり厚い果皮を有する。

本発明の範囲内のコショウ植物は、ビタミン含有量が改変された可食コショウ果実を有する任意の植物であって、果実が高いビタミンＥ含有量を含み、高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量及びこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含み、ビタミンＥの濃度が少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷである植物を含む。この新鮮な可食コショウ果実は、刺激性を欠いており厚い果皮を有する。これらのコショウ植物は有利なことに、高い発芽率、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌性、真菌性又はウイルス性の病害に対する抵抗性、様々な型の非生物的ストレスに対する抵抗性、雄性不稔及び活発な生長だけには限られないが、これらを含めた、当技術分野でよく知られている有益な農業上の形質をさらに含むことができる。

本発明の植物は非遺伝子組換え（非ＧＭＯ）であることが好ましいが、しかしながら、形質転換による形質の付加又は欠失が、本発明の範囲内に明らかに含まれることは理解されよう。

本発明はさらにコショウの種子を提供し、これらの種子から生長した植物は、本明細書で前に記載したように、改変されたビタミン含有量、特に高いビタミンＥ含有量、及び高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量又はこれらの組合せの少なくとも１つを有する可食果実を有する。幾つかの実施形態によれば、これらの種子から生長した植物の果実は、非刺激性であり厚い果皮を有する。

本発明の種子から生長したコショウ植物は、安定した真の近交系の形であってよく、或いはより多様な物質としての形であってよく、本明細書で前に記載したように、これらはいずれもビタミン含有量が改変された可食コショウ果実を有する。

Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ雑種ＡＣＥ０５Ｆ０１−５２１は、本発明の植物の一例として働く。ＡＣＥ０５Ｆ０１−５２１の代表的な種子は、２００６年３月９日にアクセッション番号４１３８１でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された。本明細書で以後記載する本発明の教示によれば、ＡＣＥ０５Ｆ０１−５２１の種子から生長した植物は、高いビタミン含有量を有する可食果実を作出する。

本発明のコショウ植物由来の花粉及び胚珠、これらから生長した種子、及び種子から生長した植物、及びこれらの植物によって作出される果実も、本発明の範囲内に含まれる。

なお別の態様によれば、本発明は、本発明の植物から再生した組織培養物及びそこから再生した植物を提供する。

一実施形態によれば、組織培養物は葉、花粉、胚、根、根端、葯、花、果実及び種子だけには限られないが、これらからなる群から選択される組織由来の細胞又はプロトプラストを含む。

なおさらなる態様によれば、本発明は、本明細書で前に記載したように、現在市販されている甘い可食性のコショウ果実と比較してビタミン含有量が改変された可食コショウ果実を提供する。特定の実施形態によれば、果実は非刺激性であり厚い果皮を有する。新鮮な果実は生鮮品として市場に出すことができ、或いは加工コショウ製品の供給源として働くことができる。

なお別の態様によれば、本発明は、ビタミン含有量が改変された可食果実を有するコショウ植物を作出するための方法であって、現在市販されているコショウ品種の可食果実と比較して、高いビタミンＥ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物、高いプロビタミンＡ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物、及び高いビタミンＣ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物を選択するステップ；それぞれの高ビタミン含有量の植物と知られている市販の植物を交配して少なくとも１つの集団を作出するステップ；ＤＮＡマーカーを使用して高いビタミン含有量と刺激性の間、及び高いビタミン含有量と薄い果皮の間で連鎖していない植物の集団をスクリーニングするステップ；並びに少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥ濃度、並びに少なくとも約３ｍｇ／１００ｇＦＷのプロビタミンＡ濃度、及び約２００ｍｇ／１００ｇＦＷ〜約５００ｍｇ／１００ｇＦＷの範囲のビタミンＣ濃度、又はこれらの組合せの少なくとも１つを有し、非刺激性であり厚い果皮を有するコショウ果実を有する植物を選択するステップを含む方法を提供する。

一実施形態によれば、この方法は、現在市販されているコショウ品種の可食果実と比較して、高いビタミンＥ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物、高いプロビタミンＡ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物、及び高いビタミンＣ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物を選択するステップ；高いビタミンＥ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物と知られている市販の植物を交配して第１Ｆｉ集団を作出するステップ；高いプロビタミンＡ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物と高いビタミンＣ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物を交配して第２Ｆｉ集団を作出するステップ；第１及び第２Ｆｉ集団の種子を回収するステップ；前記第１及び前記第２Ｆｉ種子集団から植物を生長させるステップ；前記第１Ｆｉ集団由来の少なくとも１つの植物と前記第２Ｆｉ集団由来の少なくとも１つの植物を交配してＦ_２集団を作出するステップ；雑種Ｆ_２種子を回収するステップ；Ｆ_２種子からＦ_２植物を生長させるステップ；高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列の存在をＦ_２植物において調べるステップ；Ｆ_２植物によって作出された成熟果実における果皮の厚さを測定するステップ；高刺激性と同時分離するＤＮＡ配列を欠いており厚い果皮を有するＦ_２植物を選択するステップ；ＤＮＡマーカーを欠き厚い果皮を有するＦ_２植物によって作出された成熟果実における、ビタミンＥ、プロビタミンＡ及びビタミンＣの含有量を測定するステップ；並びに少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥ濃度、及び場合によっては少なくとも約３ｍｇ／１００ｇＦＷのプロビタミンＡ濃度、及び約２００ｍｇ／１００ｇＦＷ〜約５００ｍｇ／１００ｇＦＷの範囲のビタミンＣ濃度、又はこれらの組合せの少なくとも１つを有するコショウ果実を有する植物を選択するステップを含む。

一実施形態によれば、知られている市販の植物は、高い発芽率、活発な生長、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、少なくとも１つの細菌性、真菌性又はウイルス性の病害に対する抵抗性、及び様々な型の非生物的ストレスに対する抵抗性からなる群から選択される少なくとも１つの形質を示す。

一実施形態によれば、高刺激性と同時分離するＤＮＡ配列は、配列番号３で示されるポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。

本発明の一実施形態によれば、交配のステップ及び選択のステップは少なくとも１回繰り返す。

別の実施形態によれば、本発明の方法は、選択した植物を少なくとも１回自家受粉させるステップ、及び非刺激性であり厚い果皮を有しながら、前に記載したビタミン含有量を有する可食コショウ果実を有する植物をさらに選択するステップをさらに含む。

なお別の実施形態によれば、その遺伝物質が１つ又は複数の制御要素と動作可能に連結した１つ又は複数のトランス遺伝子を含むように、植物又はその子孫又は一部分が形質転換されている、本発明によるコショウ植物を提供する。コショウ植物及び形質転換した変種から作出されたその一部分も、本発明の範囲内に含まれる。一実施形態によれば、形質転換した１つ又は複数の遺伝子は、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌性、真菌性又はウイルス性の病害に対する抵抗性、雄性不稔及び活発な生長からなる群から選択される特徴を与える。

これらの実施形態及びさらなる実施形態は、以下の図面、記載及び特許請求の範囲と共にさらに理解されるであろう。

本発明は、不均衡な食物摂取のため、ビタミンで哺乳動物、特にヒトの食事を補う増大する必要性に関する。天然供給源から栄養所要量（ＲＤＡ）のビタミンを得るには、多量の果実及び野菜を消費することが必要である。しかしながら、大部分の現代の集団の食物摂取はごくわずかな割合の新鮮な果実及び野菜を含み、したがって勧められている必須ビタミンの摂取はもたらさない。

したがって本発明の目的は、一食分の１つのコショウ果実中に約２５％〜約５０％のＲＤＡのビタミンＥを含む、新鮮な可食性のコショウ果実を提供することである。本発明の他の目的は、前に確認したビタミンＥ含有量を含み、約７０％〜約１００％のＲＤＡのプロビタミンＡ及び／又はビタミンＣをさらに含むコショウ果実を提供することである。コショウ果実は、高含有量の合計カロテノイドをさらに含むことが好ましい。

定義
本明細書で使用する用語「ビタミンＥ」は、天然Ｄ−α−トコフェロールを指す。用語「プロビタミンＡ」は、哺乳動物の身体中でビタミンＡの最も活性がある形であるレチノールに転換され得る、プロビタミンＡカロテノイド、特にβ−カロテン、α−カロテン及びβ−クリプトキサンチンからなる群から選択されるカロテノイドを指す。用語ビタミンＣは、アスコルビン酸を指す。

本明細書で使用する「可食果実」及び「新鮮な可食果実」は、如何なる他の加工もせずに、ヒトが消費するのに適した植物から採取した果実を指す。

本明細書で使用する用語「非刺激性コショウ果実」は、低レベルのカプサイシン（８−メチル−ｎ−バニリル−６−ノネンアミド）、ジヒドロカプサイシン（８−メチル−ｎ−バニリル−６−ノネンアミド）、及びそれらの前駆体を有する果実を指す。果実の味は一群の独立したボランティアによって調べた。特に「低いカプサイシンレベル」は、０．００３％未満、好ましくは０．００１％未満のカプサイシンを指す。

本明細書で使用する用語「形質」は、特徴又は表現型を指す。例えば、本発明の文脈では、「刺激性」は、本明細書で前に記載した、コショウ果実の味及びそのカプサイシンレベルに関する。形質は優性又は劣性式、或いは部分的又は不完全優性的に遺伝され得る。形質は単遺伝子性（すなわち、１つの遺伝子座によって決定される）又は多遺伝子性（すなわち、２つ以上の遺伝子座によって決定される）である可能性があり、或いは１つ又は複数の遺伝子と環境の相互作用から生じる可能性もある。優性形質はヘテロ接合又はホモ接合状態での完全な表現型の出現をもたらし、劣性形質はホモ接合状態で存在するときのみそれ自体が現れる。

用語「果皮」は、当技術分野で知られているように、成熟した子房の壁を指す。特に、コショウ果実の果皮は、コショウ果実の色つきの可食部分である果実の壁を指す。

本明細書で使用する用語「厚い果皮」は、少なくとも５ｍｍ、好ましくは少なくとも８ｍｍの果皮の幅を指す。

本明細書で使用する用語「自家受粉」は、植物の制御型の自家受粉、すなわち同じ植物によって作出された花粉と胚珠を接触させることを指す。用語「交配」は、制御型の交配受粉、すなわちそれぞれ異なる植物によって作出された花粉と胚珠を接触させることを指す。

用語「植物の生長力」は、本明細書では広義に使用し、植物の一般的な強さを指す。

本明細書で使用する用語「平均」は、ビタミンＥ濃度の平均プラス又はマイナス標準偏差を指す。ストレスフリーの栽培によって得た完熟した果実作物のビタミンＥ濃度を測定することによって、平均値を得る。

本明細書で使用する「果実作物」は、１種の植物の作物、或いは好ましくは商業規模で生長させたコショウ植物から得た果実作物を指す。

本明細書で使用する用語「市販のコショウ品種」は、厚い果皮を有する甘い可食果実を有する、市販されているコショウ品種を指す。典型的には市販のコショウ品種は、塊状のカリフォルニア系果実の形状を有する果実を有する。

一態様によれば本発明は、現在市販されているコショウ品種の果実と比較してビタミン含有量が改変された果実を有するコショウ植物であって、果実が高いビタミンＥ含有量を含み、高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量及びこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含み、ビタミンＥの濃度が少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷである、コショウ植物を提供する。特定の実施形態によれば、果実は非刺激性であり厚い果皮を有する。

一実施形態によれば、果実は少なくとも約７ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥ、好ましくは少なくとも約９ｍｇ／１００ｇＦＷ、より好ましくは少なくとも約１１ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含む。

トコフェロールは、高等植物のプラスチド（主に葉緑体）中で合成される２次的な代謝産物である。プラスチド中では、トコフェロールは全キノンプールの４０％までを占める。トコフェロールは、イソプレノイド生合成経路によって生成される。高等植物中のα−トコフェロール（ビタミンＥ）の生合成は、ホモゲンチシン酸とフィチルピロリン酸を縮合させて、環状化及び後のメチル化によって様々なトコフェロールを形成することができる、２−メチル−６フィチルベンゾキノールを形成することを含む。トコフェロール及びトコトリエノール（不飽和トコフェロール誘導体）はよく知られている抗酸化剤であり、フリーラジカルによるダメージから細胞を保護する際に重要な役割を果たす。トコフェロールは植物において重要な機能を果たすだけでなく、哺乳動物の栄養観点からも重要である。トコフェロール、特にビタミンＥは、心臓病、癌、白内障、網膜障害、神経障害及びアルツハイマー病を含めた多くの疾患の予防と関係がある。ビタミンＥは、関節炎の症状に対して有益な影響を有するとして、且つアンチエイジング物質としても示されてきている。ビタミンＥは、肉の貯蔵寿命、外見、香り、及び酸化安定性を改善するため、及び飼料から卵にトコールを移動させるためにニワトリ用飼料中にも使用されている。ビタミンＥは正常な生殖に必要不可欠であることが示されてきており、全体の性能を改善し、家畜動物中の免疫能力を増大させる。動物飼料中のビタミンＥサプリメントは、乳製品に酸化安定性も与える。天然トコフェロールは、合成によって生じるトコフェロールのラセミ混合物より生物学的効能があることが知られている。天然に存在するトコフェロールはいずれもＤ−ステレオマーであり、一方合成α−トコフェロールは８つのＤ，Ｌ−α−トコフェロール異性体の混合物であり、そのうちの１つのみ（１２．５％）が天然のＤ−α−トコフェロールと同一である。天然のＤ−α−トコフェロールは、他の天然トコフェロール又はトコトリエノールと比較すると、最高のビタミンＥ活性（１．４９ＩＵ／ｍｇ）を有している。合成α−トコフェロールは、１．１ＩＵ／ｍｇのビタミンＥ活性を有する。

市販の非刺激性の可食コショウ果実は、少量のビタミンＥを含む。一実施形態では、本発明のコショウ果実は、約１．５〜３．０ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを典型的に含む、これまでに知られている市販の甘いコショウ果実におけるその濃度と比較して、２倍を超えるビタミンＥ濃度を含む。

本発明のコショウ植物は、コショウ、主にＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ種だけでなく、さらにＣ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍ及びＣ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅを含めた他種の集団、外来種、栽培品種及び変種に由来する。スクリーニングプロセス中に、高いビタミンＥ濃度を有する果実を有する植物を同定した。しかしながら、これらの野生型植物は、可食コショウ果実を作出するのに適していない（典型的には、刺激性及び／又は薄い、咀嚼するのが困難な果皮のため）。本発明はここで、非刺激性であり、厚い果皮を有し新鮮な可食製品として市場に出すのに適した、高いビタミンＥ含有量を有する果実を有するコショウ植物を提供する。さらに、本発明のコショウ植物は、商業規模で生長させるのに適している。

別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含み、プロビタミンＡ及びビタミンＣの少なくとも１つをさらに含む果実を有するコショウ植物を提供する。

一実施形態によれば、プロビタミンＡ濃度は少なくとも約３ｍｇ／１００ｇＦＷ、好ましくは少なくとも約４ｍｇ／１００ｇＦＷ、より好ましくは少なくとも約６ｍｇ／１００ｇＦＷである。

プロビタミンＡカロテノイドの生合成は、大きなイソプレノイド生合成経路の一部でもある。カロテノイド炭化水素はカロテンと呼ばれ、一方で酸素添加誘導体はキサントフィルと呼ばれる。植物中のカロテノイド経路は、α−カロテン、β−カロテン、及びリコペンなどのカロテン、並びにルテインなどのキサントフィルを生成する。カロテノイドの生合成は、Ｃ_２０前駆体ゲラニルピロリン酸の２分子を縮合させて、第１のＣ_４０炭化水素フィトエンを生成することを含む。一連の連続的な飽和度低下反応において、フィトエンはリコペンを生成する。リコペンは環状カロテン、β−カロテン及びα−カロテンの前駆体であり、これらはビタミンＡに転換され得る。ヒトを含めた哺乳動物は、肝臓中でカロテンをレチノールに転換することができる。レチノールは最も活性のある形のビタミンＡであり、β−カロテンの１分子はレチノールの２分子に切断されるので、β−カロテンはレチノールの最良の供給源である。市販のレッドペッパー果実は、本発明のコショウ果実における約２ｇ／１００ｇＦＷの約２倍のβ−カロテン濃度と比較して、約１〜１．５ｍｇのβ−カロテン／１００ｇ新鮮重量を典型的には含む。

一般にカロテノイドは、果実にその黄−オレンジ−赤色を与える色素であり、したがってこのような果実中により多量に存在する。ケトカロテノイド、カプサンシン及びカプソルビンはレッドペッパー中にのみ存在し、その赤色に貢献する。幾つかの実施形態によれば、本発明のコショウ果実は少なくとも７０ｍｇ／１００ｇＦＷの高含有量の合計カロテノイドを含む。

別の実施形態によれば、本発明の植物によって作出される果実中のビタミンＣ濃度は、少なくとも約２００ｍｇ／１００ｇＦＷである。ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）は果実及び野菜中に見られる。近年、植物中のＬ−アスコルビン酸の生合成は、Ｄ−ガラクツロン酸、細胞壁のペクチンの主成分を介して生じることが示されてきている。Ｄ−ガラクツロン酸リダクターゼをコードするＧａＩＵＲはビタミンＣ合成を制御し、これを使用して植物中のビタミンＣ生成を増大させることができる。

一般にコショウ果実は、約１００ｍｇのビタミンＣ／１００ｇ新鮮重量を典型的に含むので、ビタミンＣのよい供給源として考えられていない。本発明によれば多量のビタミンＣは、少なくとも２倍のこのような濃度、すなわち少なくとも２００ｍｇ／１００ｇＦＷを含むコショウ果実を指す。高濃度（典型的には約５００〜６００ｍｇ／１００ｇＦＷを超える）の酸性ビタミンＣの存在は、果実にすっぱい味を与える。ビタミンＣの「よい」供給源としての果実の定義は、１００ｇの新鮮重量当たりのビタミンＣの絶対量だけではなく、果実の嗜好性にも従って依存する。非常に少量の１食分でのみ消費され得る非常にすっぱい果実は、必要とされる１日当たりの所要量を与えないはずである。好ましい一実施形態によれば、本発明の植物は、２００〜５００ｍｇ／１００ｇＦＷの範囲のビタミンＣ濃度を含む果実を提供する。

別の態様によれば本発明は、現在市販されている品種の可食コショウ果実において見られるビタミンレベルと比較して、ビタミン含有量が改変された果実作物を作出するコショウ植物であって、果実作物が高いビタミンＥ含有量を含み、高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量及びこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含み、平均的な作物のビタミンＥの濃度が少なくとも５ｍｇ／１００ｇＦＷである、コショウ植物を提供する。特定の実施形態によれば、果実は非刺激性であり厚い果皮を有する。

本発明の植物によって作出されるコショウ果実中のビタミンＥ、プロビタミンＡ（β−カロテン）及びビタミンＣの含有量は、当業者に知られている技法を使用して測定する。典型的には、ビタミンＥ、β−カロテン、プロビタミンＡ及び合計カロテノイドの濃度は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定する。アスコルビン酸濃度の測定は、本明細書の以後の実施例項に記載したように比色反応に基づく。しかしながら、これらの方法を使用して本発明の果実のビタミン含有量を実証したが、それによってビタミンＥ、プロビタミンＡ、ビタミンＣ及び合計カロテノイドの含有量を測定することができる任意の他の方法も、本発明の範囲内に含まれることは理解されよう。

本発明によるコショウ果実のビタミンプロファイルは、１つの果物中のそれぞれのビタミンの含有量、及びそれぞれのビタミンの平均的な果実作物中の含有量を表すことができる。果実作物は、１つの植物によって作出される果実、又は好ましくは商業規模で生長させた植物によって作出される果実作物を指すことができる。本明細書で使用する用語「平均的な作物中の含有量」は、例えばストレスフリーの栽培によって得た成熟したコショウ作物に関して測定した、ビタミンＥ濃度の平均プラス又はマイナス標準偏差を指す。

本発明のコショウ果実中のビタミンの含有量、特にビタミンＥの含有量は、コショウ植物の生長条件、コショウ果実の成熟段階及び保存条件によって影響を受ける。本明細書で以後例示するように、高生長温度（それぞれ２９℃／２１℃の日中／夜間温度）は、低生長温度（それぞれ２０℃／１２℃の日中／夜間温度）と比較して２倍のビタミン濃度をもたらした。完熟した果実中のビタミン含有量は保存中安定しているが、一方で完全な成熟前に採取した果実中のビタミンＥ濃度は、時間と共に増大する可能性がある。

したがって、本発明中、本発明の果実中のビタミン濃度に関して示す値は、ストレスフリーの環境条件下で生長させた植物から新鮮な状態で採取した完熟した果実において測定した値を表す。

本発明のコショウ植物は、遺伝的に安定した近交系、及び２つの異なる品種を交配させることによって生じる雑種であってよい。本明細書で使用するように、親系統は、自家受粉及び植付けのサイクル中の望ましい形質に関して安定した自然受粉の近交系を指す。

本発明の親系統は、その高いビタミン含有量に関して選択した品種改良品種と、本発明の出願の１つに属する占有の品種改良物質の生殖質の集合から選択した市販の生長力のあるコショウ植物の間の、交配から開発した。

市販の優性のコショウ品種の開発は、相当な品種改良努力を必要とする。かなりの変化が異なるコショウ集団内で見られ、したがってそれらは、新たな又は望ましい形質の供給源として働き得る。しかしながら、望ましい形質を有する植物は、乏しい発芽率、低い生長力、低い果実収率、小さな果実、病害への感受性などの望ましくない形質を有する可能性があるので、必ずしも商業規模の生産に有用であるわけではない。特に、高いビタミン含有量は典型的には刺激性及び／又は薄い果皮と連鎖しており、本発明の品種改良プログラムは、刺激性に関する分子ＤＮＡマーカーを使用してこの連鎖を切断することを目的とした。トウガラシ属果実における刺激性は、アルカロイドカプサイシン及びその類似体の蓄積によるものである。カプサイシンの生合成はトウガラシ属に限られており、分岐鎖脂肪酸による芳香族部分、バニリルアミンのアシル化に原因がある。刺激性はＰｕｎｌ遺伝子座と連鎖していることが報告された。近年、刺激性コショウ果実中に存在するカプサイシノイド生合成に重要なアセチルトランスフェラーゼを、Ｐｕｎｌがコードすることが分かってきている（例えば、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ栽培品種Ｔｈａｉ Ｈｏｔ由来のＰｕｎｌ遺伝子、アクセッション番号ＡＹ８１９０２９；配列番号４；Ｓｔｅｗａｒｔ Ｃら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．４２（５）：６７５〜８８ ２００５）。刺激性の欠如と関係があることが知られていた劣性対立遺伝子ｐｕｎｌは、この遺伝子座における大きな欠失に原因がある（アクセッション番号ＡＹ８１９０３１、部分配列；配列番号５）。この欠失は、１．８ｋｂの推定プロモーター及び０．７ｋｂの第１エクソンに及ぶ２．５ｋｂであったことが分かった（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｃら、上記）。したがって、この欠失内由来の配列は刺激性に関するマーカーとして働くことができ、このような配列を欠くゲノムを有する植物は非刺激性果実を作出した。本発明の幾つかの現在好ましい実施形態に従い使用するＤＮＡマーカーは、Ｐｕｎｌ遺伝子のプロモーター領域内由来の約７００ｂｐの断片である（配列番号４の位置６６６〜１３９７、本明細書では配列番号３と明示する）。したがって、このＤＮＡ断片を欠き配列番号３で示されるポリヌクレオチド配列を有する植物は、劣性ｐｕｎｌｐｕｎｌ遺伝子に関してホモ接合であり、したがって非刺激性である。

さらに、本発明のコショウ植物は、高濃度のビタミンの組合せを有する果実であって、このような組合せがこれまで知られているコショウ果実中に存在しない果実を作出する。

本明細書で使用する用語「発芽率」は、まいた種子から出現する実生の割合を指す。「乏しい発芽率」は、まいた種子からの８０％未満の実生の出現、及び出現する実生の乏しい均一性を指す。本明細書で使用する用語「非生物的ストレス」は、低温、水の限られた供給、土壌中の塩分、次善の光強度及びこれらの任意の組合せだけには限られないが、これらを含めた植物の生長に好ましくない環境条件を指す。本発明によるコショウ植物の生長に関する「低温」は、１０℃未満の温度を指す。

本発明の品種改良プログラムは、コショウ、主にＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ種の集団、外来種、栽培品種及び変種由来、並びにＣ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍ及びＣ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅを含めた他種由来の数種由来の数百の植物のスクリーニングで始めた。植物はカロテノイドスペクトル、β−カロテン（プロビタミンＡ）濃度並びにビタミンＣ及びＥの合計含有量に関して分析した。

ビタミンＥ、プロビタミンＡ（β−カロテン）及びビタミンＣの１つ又は複数の最高含有量を示す果実を有する植物を選択した。これらの植物のそれぞれを、制御型自家受粉用に野生から温室に移した。これらの植物によって作出された果実をそれらのビタミン含有量に関して調べ、３品種：高いビタミンＥ含有量を有する果実を有する品種（「ＨＥ」）、高いプロビタミンＡ（β−カロテン）含有量を有する果実を有する品種（「ＨＰＡ」）、及び高いビタミンＣ含有量を有する果実を有する品種（「ＨＣ」）を選択した。

ＨＡとＨＣの間、及びＨＥと望ましい農業形質を有する市販の品種の間で交配を行って、Ｆ_１植物を得た。２つのＦ_１集団を次いで交配して、Ｆ_２植物を作出した。Ｆ_２植物は、植物の生長力、果実組合せの回数及び均一性、収率、果実の大きさ、形状、果皮の厚さ、触感、色、果皮上の裂け目の存在を含めた園芸形質に関してスクリーニングし、それらの果実の質に従いスコアをつけた。さらに植物は、刺激性に関するＤＮＡマーカーの存在に関してスクリーニングした。高スコアを有する果実を有し刺激性に関するＤＮＡマーカーを欠く植物を、ビタミン含有量の分析用に選択した。ビタミンＥ、プロビタミンＡ及びビタミンＣの少なくとも１つの高い含有量をさらに示す果実を有する植物を、さらなる品種改良用に選択した。これらの植物は最初に自家受粉させてＦ_３集団を得た。高スコアの果実（すなわち、望ましい園芸形質及び高いビタミン含有量を示す果実）を作出するその能力を保っているＦ_３植物を、さらなる品種改良用に得た（図１）。交配は選択した植物間、及び選択した植物と望ましい園芸形質を有する市販の品種の間で行った。形質の安定性は、自家受粉によって得た種子から生長させた植物を調べることによって確認した。

一実施形態によれば、本発明は、現在市販されているコショウ品種の可食果実と比較して、非刺激性であり厚い果皮を有しながら、ビタミン含有量が改変された可食果実を有するコショウ植物を作出するための方法であって、現在市販されているコショウ品種の可食果実と比較して、高いビタミンＥ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物、高いプロビタミンＡ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物、及び高いビタミンＣ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物を選択するステップ；高いビタミンＥ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物と知られている市販の植物を交配して第１Ｆ_１集団を作出するステップ；高いプロビタミンＡ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物と高いビタミンＣ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物を交配して第２Ｆ_１集団を作出するステップ；第１及び第２Ｆ_１集団の種子を回収するステップ；前記第１及び前記第２Ｆｉ種子集団から植物を生長させるステップ；前記第１Ｆｉ集団由来の少なくとも１つの植物と前記第２Ｆ_１集団由来の少なくとも１つの植物を交配してＦ_２集団を作出するステップ；雑種Ｆ_２種子を回収するステップ；Ｆ_２種子からＦ_２植物を生長させるステップ；高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列の存在をＦ_２植物において調べるステップ；Ｆ_２植物によって作出された成熟果実における果皮の厚さを測定するステップ；ＤＮＡマーカーを欠き厚い果皮を有するＦ_２植物を選択するステップ；高刺激性と同時分離するＤＮＡ配列を欠いており厚い果皮を有するＦ_２植物によって作出された成熟果実における、ビタミンＥ、プロビタミンＡ及びビタミンＣの含有量を測定するステップ；並びに少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥ濃度、及び少なくとも約３ｍｇ／１００ｇＦＷのプロビタミンＡ濃度、約２００ｍｇ／１００ｇＦＷ〜約５００ｍｇ／１００ｇＦＷの範囲のビタミンＣ濃度、又はこれらの任意の組合せの少なくとも１つを有するコショウ果実を有する植物を選択するステップを含む方法を提供する。

一実施形態によれば、知られている市販の植物は、高い発芽率、活発な生長、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌性、真菌性又はウイルス性の病害に対する抵抗性、及び様々な型の非生物的ストレスに対する抵抗性からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を与える。特に、トウガラシマイルドモットルウイルス（ＰＭＭＶ）３類及び／又はトマト黄化壊疽トスポウイルス（ＴＳＷＶ）に対する耐性、厚い果皮、並びに望ましい果実の大きさ及び形状を与えるために、知られている市販の植物を選択した。

一実施形態によれば、高刺激性と同時分離するＤＮＡ配列は、配列番号３で示されるポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。

本発明の一実施形態によれば、交配のステップ及び選択のステップは少なくとも１回繰り返す。

他の実施形態によれば、本発明の方法は、選択した植物を少なくとも１回自家受粉させるステップ、及び少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥ濃度、少なくとも約３ｍｇ／１００ｇＦＷの少なくとも１つのプロビタミンＡ濃度、約２００ｍｇ／１００ＦＷ〜約５００ｍｇ／１００ＦＷの範囲のビタミンＣ濃度、又はこれらの組合せを有し、非刺激性であり厚い果皮を有するコショウ果実を有する植物をさらに選択するステップをさらに含む。

一実施形態によれば、本発明の方法によって作出された植物は遺伝的に安定した近交系である。別の実施形態によれば植物は、２つの近交系を交配させることによって作出された雑種である。

別の態様によれば本発明は、第１世代（Ｆ_１）雑種コショウ種子を作出するための方法を提供する。

一実施形態によれば、本発明は、第１世代の雑種種子を作出するための方法であって、第１の安定した近交系コショウ植物と第２の安定した近交系コショウ植物を交配させるステップ、及び作出されたＦ_１雑種種子を採取するステップを含み、第１及び第２の安定した近交系植物が、現在市販されている品種の可食果実と比較して改変されたビタミン含有量を有し、特に高いビタミンＥ含有量を含み、高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量又はこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含み、一方で非刺激性であり厚い果皮を有する選択した果実を有するコショウ植物である方法を提供する。

別の実施形態によれば、本発明はさらに、前に記載した方法により雑種コショウ種子を生長させることによって作出される、第１世代のＦｉ雑種コショウ植物を提供する。Ｆｉ植物は高いビタミン含有量を有する果実を有しているだけでなく、それらは農業用途にも適しており、知られている市販の雑種に匹敵する園芸形質を有する。

アクセッション番号４１３８１でＮＣＩＭＢに寄託された雑種ＡＣＥ０５Ｆ０１−５２１種子は、ビタミン含有量が改変された果実を有する雑種植物に対する一例として働く。特に、これらの種子から生長させた植物の果実は、約９ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥ、約５ｍｇ／１００ｇＦＷのプロビタミンＡ（β−カロテン）及び約２６０ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＣを含む。

本発明はさらに、Ｆｉ雑種コショウ植物から採取した種子、及びこれらの種子から生長させた植物に関する。植物の品種改良における一般的な慣習は、戻し交配の方法を使用して単一形質変換により新たな変種を開発することである。本明細書で使用する用語、単一形質変換は、親系統への新たな一遺伝子又は対立遺伝子の取り込みを指し、この場合移動する一遺伝子又は対立遺伝子以外に、親系統のほぼ全ての望ましい形態及び生理特徴が回復する。本明細書で使用する用語、戻し交配は、親コショウ植物の１つに戻す雑種子孫の反復交配を指す。遺伝子又は対立遺伝子に望ましい特徴を与える親コショウ植物は、１回親又はドナー親と呼ばれる。この専門用語は、１回親は戻し交配プロトコル中に１回使用され、したがって反復しないという事実を指す。１回親由来の遺伝子又は対立遺伝子が移動する親コショウ植物は戻し交配プロトコル中に数ラウンド使用される反復親として知られている。典型的な戻し交配プロトコルでは、当該の原種（反復親）由来の植物を、移動する当該の一遺伝子／対立遺伝子を有する第２種（１回親）から選択した植物と交配させる。次いでこの交配から生じた子孫を反復親と再度交配し、コショウ植物を得るまでこのプロセスを繰り返し、この場合１回親由来の移動する一遺伝子又は対立遺伝子以外に、反復親のほぼ全ての望ましい形態及び生理特徴が変換された植物において回復する。戻し交配法を本発明と共に使用して、特徴を改善するか或いは親系統に導入することができる。

本発明は、花粉、胚珠及びこれらの植物から再生した組織培養物を含めた、安定した親植物又は雑種植物の任意の部分を含む。花粉及び胚珠を、一般的且つ本発明によって記載したのと同様に、品種改良プログラムにおいて使用する。コショウの組織培養物は、当技術分野でよく知られているように、コショウ植物のｉｎ ｖｉｔｒｏ再生用に使用することができる。

本発明によるビタミン含有量が改変された果実を有するコショウ植物をその系統内に含む植物、及びこれらを作出するための方法も、本発明の範囲内に含まれる。

本発明はコショウの種子をさらに提供し、それらの種子から生長した植物は、高いビタミンＥ含有量を含み、高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量及びこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含み、ビタミンＥの濃度が少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷである、ビタミン含有量が改変された可食果実を有する。特定の実施形態によれば、果実は非刺激性であり厚い果皮を有する。

一実施形態によれば、種子から生長した植物は、少なくとも約７ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥ、好ましくは少なくとも約９ｍｇ／１００ｇＦＷ、より好ましくは少なくとも約１１ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含む果実を有する。

別の実施形態によれば、種子から生長した植物は、少なくとも５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含み、プロビタミンＡをさらに含む果実を有する。なお別の実施形態によれば、種子から生長した植物は、少なくとも５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含み、ビタミンＣをさらに含む果実を有する。さらに他の実施形態によれば、種子から生長した植物は、少なくとも５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含み、プロビタミンＡ及びビタミンＣをさらに含む果実を作出する。

一実施形態によれば、種子から生長した植物によって作出された果実中のプロビタミンＡ濃度は、少なくとも約３ｍｇ／１００ｇＦＷ、好ましくは約４ｍｇ／１００ｇＦＷ、より好ましくは約６ｍｇ／１００ｇＦＷであり、且つビタミンＣの濃度は少なくとも約２００ｍｇ／１００ｇＦＷ、好ましくは約２００ｍｇ／１００ｇＦＷ〜約５００ｍｇ／１００ｇＦＷの範囲である。

いっそうさらなる実施形態によれば、種子から生長した植物によって作出されたコショウ果実は、少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含み、少なくとも約３ｍｇ／１００ｇＦＷのプロビタミンＡ、少なくとも約２００ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＣ、及び高い含有量の合計カロテノイドをさらに含む。一実施形態によれば、合計カロテノイド濃度は少なくとも約７０ｍｇ／１００ｇＦＷである。

なお別の実施形態によれば、その遺伝物質が１つ又は複数の制御要素と動作可能に連結した１つ又は複数のトランス遺伝子を含むように、植物又はその子孫又は一部分が形質転換されている、本発明による強壮なコショウ植物を提供する。コショウ植物及び形質転換した植物から作出されたその一部分も、本発明の範囲内に含まれる。一実施形態によれば、形質転換した１つ又は複数の遺伝子は、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌性、真菌性又はウイルス性の病害に対する抵抗性、雄性不稔及び活発な生長からなる群から選択される特徴を与える。

別の実施形態によれば、本発明は、現在市販されている甘い可食果実である可食果実と比較して改変されたビタミン含有量、特に高いビタミンＥ含有量を有し、好ましくは高いプロビタミンＡ含有量及び高いビタミンＣ含有量をさらに含む、可食コショウ果実を提供する。果実は生鮮品として市場に出すことができ、或いは新鮮な果実は、加工された高ビタミンのコショウ製品の供給源として働き得る。コショウ及びコショウ製品の消費は、１年中供給することができる新たな変種が開発されているため、及び果実の一般的な栄養利点に対する意識が増大しているため、絶えず増大している。

一実施形態によれば、可食コショウ果実は、少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷ、好ましくは少なくとも約７ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥ、より好ましくは少なくとも約９ｍｇ／１００ｇＦＷ、最も好ましくは少なくとも約１１ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含む。

別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含み、高い含有量のプロビタミンＡをさらに含む可食コショウ果実を提供する。なお別の実施形態によれば、少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含む可食コショウ果実は、高い含有量のビタミンＣをさらに含む。さらなる実施形態によれば、少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含む可食コショウ果実は、高い含有量のプロビタミンＡ及びビタミンＣをさらに含む。特定の実施形態によれば、果実は非刺激性であり厚い果皮を有する。

一実施形態によれば、果実中のプロビタミンＡ濃度は、少なくとも約３ｍｇ／１００ｇＦＷ、好ましくは約４ｍｇ／１００ｇＦＷ、より好ましくは約６ｍｇ／１００ｇＦＷである。別の実施形態によれば、果実中のビタミンＣの濃度は少なくとも約２００ｍｇ／１００ｇＦＷ、好ましくは約２００ｍｇ／１００ｇＦＷ〜約５００ｍｇ／１００ｇＦＷの範囲である。

いっそうさらなる実施形態によれば、本発明は、少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥを含み、少なくとも約３ｍｇ／１００ｇＦＷのプロビタミンＡ、少なくとも２００ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＣ、及び高い含有量の合計カロテノイドをさらに含む、可食コショウ果実を提供する。一実施形態によれば、合計カロテノイド濃度は少なくとも約７０ｍｇ／１００ｇＦＷである。

高含有量のビタミン、特に少なくとも約５ｍｇ／１００ｇＦＷのビタミンＥ濃度、少なくとも約３ｍｇ／１００ｇＦＷのプロビタミンＡ濃度及び約２００ｍｇ／１００ｇＦＷ〜約５００ｍｇ／１００ｇＦＷの範囲のビタミンＣ濃度を有する可食果実を有するコショウ植物に関して本発明を詳細に記載するが、このような高いビタミン含有量を有する果実を有する他の植物種も、本発明の範囲内にあると企図されることは理解されるはずである。本発明の選択法を使用して、本明細書に記載したように、高含有量のビタミンＥ、プロビタミンＡ及び／又はビタミンＣを有する果実を有する広く様々な植物種を作出することができる。したがって、当業者に知られているように選択しやすい、特にＤＮＡマーカーを使用して選択しやすい任意の植物種が、本発明の広い範囲内に含まれる。このような植物種は、コショウナス科、例えばトマト及びナス、又は例えばキュウリ、パンプキンなどの他の科由来の可食果実を有する植物であってよい。

以下の実施例は、本発明の幾つかの実施形態をより完全に例示するために示す。しかしながら決して、本発明の広い範囲を制限するものとしてこれらを解釈すべきではない。当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、本明細書で開示する原理の多くの変形及び改変を容易に考案することができる。

（実施例１：高いビタミン濃度を有するコショウ植物の選択）
コショウ、主にＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ種の集団、外来種、栽培品種及び変種由来、並びにＣ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍ及びＣ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅＱを含めた他種由来の数百の植物をスクリーニングした。植物は、特にβ−カロテンを含めたカロテノイドのスペクトル、並びにビタミンＣ及びビタミンＥの濃度に関して分析した。以下のように、３つの品種改良品種を、ビタミンＥ、カロテノイド及びビタミンＣの少なくとも１つが豊富な果実を有する数世代の植物の制御型自家受粉によって開発した：

Ａ）品種Ｅ−８５１１、比較的高い安定性の赤色パプリカの開発を目的とした品種改良プログラムの分離集団由来のパプリカ系コショウ。そのビタミンＥ含有量は分析した全ての集団中で最も高く、約１２．５ｍｇ／果実果皮１００ｇ新鮮重量であった。この果実は薄い果皮を有しており、その味は非常に刺激性が強かった。

Ｂ）品種ＣＬＲ−７１７４、非常に強烈な色、及びその約１０分の１がβ−カロテンである約１８５ｍｇ／１００ｇＦＷのカロテノイド含有量を有する果実を有する品種。この品種は高いカロテノイド含有量のために特別に開発し、薄い果皮を有する果実を作出するパプリカ系コショウであった。

この２つの選択品種は、果実を採取しようとする前に果実の果皮が乾燥する傾向があるので、製粉を製造するのに適しているが新鮮な可食製品として使用するのに適していない、果実を作出する。

Ｃ）７５０ｍｇ／１００ｇ果実ＦＷを超える非常に高い含有量のビタミンＣを有する品種Ｃ−８２７１。この品種はイスラエルのＧｅｎｅ Ｂａｎｋから得た観賞用コショウの外来種に由来し、丸く小さな非常に刺激性が強い果実を有するキダチトウガラシ系である。

この３つの品種、及び塊状のカリフォルニア系果実を有する第４の市販の「Ｍａｏｒ」栽培品種を、高い含有量の１つ又は複数のビタミンＥ、Ｃ、及びプロビタミンＡと植物及び果実の望ましい農業上の特徴とを組み合わせた品種改良品種を開発するための、４親の交配において親として使用した。

４親の交配は以下及び図１中に示したように実施した：

１万を超えるＦ_２世代の植物を野生で生長させ、果実の大きさ、形状及び色、果実組合せの回数及び均一性、生長習性、並びに病原型及び発生頻度を含めた病害への感受性を含めた農業上の形質に関してスクリーニングした。非刺激性である果実を選択するために、本明細書の以下の実施例２に記載したように、刺激性に関するＤＮＡマーカーの存在を調べた。

２つ以上の望ましい形質を組み合わせた３１のＦ_２植物を、４親の交配のＦ_２世代から選択した。制御された自家受粉及び後代検定によって、これらの植物をＦ_６世代に進行させた。

これらの品種改良品種は、異なる気象条件下で生長させた。最も性能の良かった品種を、様々な広範囲のコショウの病害に抵抗性がある遺伝子を有するＨａｚｅｒａ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｔｄ．の生殖質由来の品種改良系と交配した。

（実施例２：分子ＤＮＡマーカーを使用した非刺激性果実を有する植物の選択）
刺激性の存在又は不在は、１つの優性遺伝子Ｐｕｎｌによって制御される（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｃら、上記）。この遺伝子（ｐｕｎｌｐｕｎｌ）に対してホモ劣性である植物は、果実において刺激性を示さない。劣性遺伝子は優性遺伝子と比較して２．５ｋｂの欠失を有し、これは遺伝子のプロモーターから第１エクソンまで及ぶ。使用したマーカーは、以下のプライマーを使用したＰＣＲ反応の約７００ｂｐの産物である。

約７００ｂｐの生成したＤＮＡ断片はＰｕｎｌ遺伝子のプロモーター内に位置し、したがって刺激性のコショウ果実を有する植物のみが、予想される７００ｂｐ断片を示すはずである（図２）。

当技術分野で知られている標準法によって調べた植物からＤＮＡを単離し、以下の条件下で前に同定したプライマーを使用するＰＣＲ反応にかけた。
ＰＣＲ反応混合物：
バッファー×１０（ＭｇＣｌ_２含まず） ２．５μｌ
ＭｇＣｌ_２（２．５ｍＭ） １．５μｌ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ） ４μｌ
プライマー（ＰＴ−１＋ＰＴ−２）１００ｎｇ／μｌ ２μｌ＋２μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ ０．２μｌ（ＩＵ）
Ｈ_２Ｏ １０．８μｌ
ＤＮＡ ２μｌ（１００ｎｇ／μｌ）
全体積 ２５μｌ

ＰＣＲプログラムの終了後、サンプルを１．５％アガロースゲルにロードし、対照サンプルの明確なバンドが出現するまで８０〜１２０Ｖで泳動した。

ＰＣＲ法は、多数のＤＮＡサンプルを同時に調べることができる。図１は、マーカー、並びに刺激性果実を有することが知られている植物から単離したＤＮＡ（陽性対照）、及び調べた植物から単離したＤＮＡをロードしたアガロースゲルの典型的な写真を示す。７００ｂｐバンドの不在は、非刺激性果実を有する植物からＤＮＡサンプルが単離されたことを示す。

（実施例３：ビタミン濃度の測定）
コショウ果実中のカロテノイド含有量の測定
けん化：調べたレッドペッパー果実を凍結乾燥させ、乾燥物質はコーヒーマシーンを使用して粉末にすり潰した。３０ｍｇの凍結乾燥粉末を、２％ＢＨＴ及び１．２５ｍｌのＫＯＨ６０％を含む７．５ｍｌエタノール溶液中に導入した。溶液中にＮ_２ガスを導入しながら、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。

抽出：５ｍｌのＨ_２Ｏをけん化混合物に加え、混合物を室温で１０分間インキュベートした。５ｍｌのヘキサンを次いで加え、混合物を攪拌し、ヘキサン分画と水分画が分離するまで次いで放置した。

抽出したカロテノイドを含むヘキサン分画を次いで回収した。もはや色が検出されなくなる（すなわち、目に見える量のカロテノイドが存在しなくなる）まで、抽出手順を５回繰り返した。ヘキサン分画中の残留Ｈ_２Ｏは硫酸ナトリウムで乾燥させた。ヘキサンはＮ_２ガスと共に乾燥状態まで蒸発させ、カロテノイドは１ｍｌのアセトンによって溶かした。サンプルは０．２μフィルターを介して濾過し、ＨＰＬＣ系に注入した。

ＨＰＬＣによるカロテノイド濃度の測定：測定はＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−ＩＯＡ ＨＰＬＣを使用して実施した。この系は、自己注射用注入器及び検出器ダイオードアレイ（ＳＰＤ−ＭＩＯＡＶＰ）を含む。カラムＬｉｃｈｒｏｓｐｈａｒｅ−１００、ＲＰ−１８．５、２５０ｍｍ×５μｍ粒子径を、カロテノイド分離用に使用した。ガードカラム（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈａｒｅ４−４ＲＰ−１８．５μｍ）も使用した。Ｈ_２Ｏ（２５％〜０、３７分中）の勾配を使用して１ｍｌ／分の流速で、溶液Ａ：アセトンと溶液Ｂ：Ｈ_２Ｏの混合物を用いてカロテノイドを溶出した。以下の経験に基づく勾配を用いて最良の分離を得た。
時間（分）：０ １５ １２ ５ ５
Ｈ_２Ｏの％：２５ ２５ ５ ０ ２５

ピークは４７４ｎｍ及び４６０ｎｍで検出した。

合計カロテノイドは、２５ｍｌのアセトンを用いて抽出した１００ｍｇのレッドペッパー粉末から推定した。色は４７４ｎｍで決定し、カプサンシン１％＝１９０５、（Ｄａｗｓｏｎら、１９６９．「生化学リサーチのデータ（Ｄａｔａ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ、オクスフォード、イングランド ｐ．３２８）の吸光係数によって合計カロテノイドを計算した。ピークを同定するために、Ｌｅｖｙら（Ｊ．ｏｆ Ａｇｒｉｃ．ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．４３：３６２〜３６６、１９９５）によって記載されたのと同様に、Ｒｆ値及び吸収スペクトルを標準物質のそれらと比較した。

コショウ果実中のビタミンＥの測定
レッドペッパー果実を凍結乾燥させ、乾燥物質はコーヒーマシーンを使用して粉末にすり潰し、３０ｍｇのコショウ粉末からα−トコフェロールを、４℃で一晩３ｍｌのエタノールを用いて抽出した。エタノール抽出物は３分間２０，８００ｇで遠心分離にかけた。上清は０．２μｍ膜を介して濾過した。２０μｌのサンプルをＨＰＬＣ（Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌ−６２００Ａ）に注入し、Ｍｅｒｃｋ ＬｉｃｈｒｏｃａｒｔカラムＲＰ−１８、１２５〜４ｍｍで分離させ、１ｍｌ／分の流速でメタノールの均一濃度移動相によって溶出させ、ＨＰＬＣ分光蛍光計検出器（Ｊａｓｃｏ ＦＰ−２１０）を用いて検出した。この成分を２９０ｎｍで励起させ、３２９ｎｍで発光させた。結果はそれぞれのサンプルに関する３つの測定値の平均である。Ｄ−α−トコフェロール（Ｓｉｇｍａ）は、標準曲線の較正用に使用した。

コショウ果実中のビタミンＣの測定
新鮮なコショウ果実を２×２ｃｍ^２の立方体に切断した。５ｇの果実の立方体を、Ｗａｒｉｎｇブレンダーを使用して２０ｍｌの４％メタリン酸とブレンドした。生成したジュースは３０分間２３，５００ｇで遠心分離にかけた。上清中のアスコルビン酸濃度は、製造者の指示に従いＭｅｒｃｋ ＲＱｆｌｅｘキットを使用して、反射率計によって測定した。原則としてこのアッセイは、青色を有するリンモリブデンへの黄色い物質モリブドリン酸の還元に基づく。反射率計によって示された値はアスコルビン酸のｍｇ／１リットルであり、これらの値をアスコルビン酸のｍｇ／１００ｇＦＷに変換した。

ＨＰＬＣによるビタミンＣの測定：サンプルの一部において、ＨＰＬＣによってアスコルビン酸濃度を測定した。測定用に得た果実エキスは、本明細書で前に記載したのと同様である。ＨＰＬＣによるアスコルビン酸の測定は、自己注射用注入器及び検出器ダイオードアレイ（ＳＰＤ−ＭＩＯＡＶＰ）を含むＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−ＩＯＡ ＨＰＬＣを用いて実施した。抽出した溶液は０．２μのフィルターを介して濾過し、Ｍｅｒｃｋ ＲＰ−１８ｅ ４×２５０ｍｍ、５μｍ粒子径のカラムに注入し、１ｍｌ／分の流速でＫＨ_２ＰＯ_４ １０ｍＭ／ＭｅＯＨ（９７：３ｖ／ｖ）及び水酸化テトラブチルアンモニウム０．７５ｍＭの均一濃度移動相で溶出させた。アスコルビン酸は２６８ｎｍで検出した。アスコルビン酸（Ｍｅｒｃｋ）を標準曲線の較正用に使用した。

（実施例４：ビタミン含有量及び環境要因）
本発明によるビタミン含有量が改変された果実を有する植物の品種改良の工程中に、植物を異なる環境条件下で生長させて、果実中のビタミン濃度に影響を与える可能性がある要因を確認した。

実験１
７４のＲｉ交配植物（２つの親品種由来の初代雑種植物）を同じ場所に植えて、２００２年１１月及び２００３年１月に果実を採取した。したがって、植物における成熟した果実を、１年の時期に応じて異なる温度及び光レジメンに曝した（１月と比較して１１月はより暖かく日が長い）。図３中に示すように、ビタミンＥ含有量は果実を採取した季節に依存することが分かった。

実験２
２１のＲｉ交配植物を２つの異なる場所：マイボア（南イスラエル）及びアルメリア（南スペイン）に植えた。果実はそれぞれ２００２年５月及び２００２年１１月に採取した。両群由来の果実を、２００２年１１月にも採取した。これらの果実において、ビタミンＥ含有量及びビタミンＣ含有量を測定した。図４中に示すように、ビタミンＥ含有量の有意な変化を、植えた場所（すなわち、温度、光及び灌漑の異なる環境条件）に関して観察した。両方の場所で、比較可能なビタミンＣ濃度を測定した（データ示さず）。

実験３
制御した温度レジメン：高温（日中２９℃及び夜間２１℃）、及び低温（日中２０℃及び夜間１２℃）の下で植物を生長させた。さらに、それぞれの温度レジメンで生長させた植物を３群に分けた。１群は完全な自然光（２０００マイクロアインシュタイン、μＥ）を得た；１群は３０％日陰（１２００〜１４００μＥ）下で生長させ、１群は５０％日陰（９００〜１０００μＥ）下で生長させた。ビタミン含有量（Ｅ、プロＡ及びＣ）は、光強度に依存しないことが分かった。温度レジメンは、ビタミンＣ及びプロビタミンＡのレベルにごくわずかに影響を与えた。しかしながら、高温レジメンはビタミンＥ濃度を約２倍増大させた。

実験４
ビタミンＥ及びビタミンＣ濃度を、採取時に未熟果実（緑色果実）及び完全成熟果実（赤色果実）において測定した。さらに、それぞれの群において、７℃で３０日間の保存期間中にビタミン濃度をさらに測定した。保存中、５つの時間地点でビタミン濃度を測定した。結果（３回の実験の平均）は以下の表１中に要約する。

表１中に示すように、果実を成熟状態で採取したとき、高く安定した濃度のビタミンＥ及びビタミンＣを得る。

要約すると、本明細書及び以下の特許請求の範囲を通じて記載するビタミン濃度の値は、好ましい条件、特に１０℃を超える温度下で生長させた植物由来の成熟果実から得た値を指す。

（実施例５：品種改良プログラム中に選択した果実中のビタミン含有量）
ビタミンＣ、ビタミンＥ、プロビタミンＡ（β−カロテン）及び合計カロテノイドの含有量を、１００を超えるサンプルにおいて測定した。この様々な集団中で見られるビタミンの範囲は、ビタミンＣ：２００〜６００ｍｇ、ビタミンＥ：２〜１２ｍｇ、及びβ−カロテン：１〜７ｍｇ（ｍｇ／１００ｇＦＷ）であった。本明細書の前の実施例１に記載した１つの市販品種及び高いビタミン含有量を有する３つの植物を含めた、４つの親植物を選択した。表２Ａは、４つの親品種におけるビタミン濃度を示す。表２Ｂは、前に記載したＦ_１集団のビタミン濃度を記載する。

前に記載したＦ_１集団の種子から生長させた約５，０００の苗木を、野生で生長させた（Ｆ_２植物集団）。これらのＦ_２植物は、果実の大きさ及び形状、果皮上の裂け目の存在、果実の触感及び色、植物の生長力、及び果皮の厚さを含めた園芸形質に関してスクリーニングした。約３００の植物が望ましい特徴を有する果実を作出し、それらの果実をビタミン含有量に関してさらに分析した。ビタミンＥ、プロビタミンＡ及びビタミンＣの少なくとも１つの高い含有量を有する果実を有する植物を、さらなる品種改良用に使用した。これらの植物を自家受粉させ、Ｆ_３種子を高いビタミン含有量、及びＤＮＡマーカーを用いて検出した刺激性の不在に関するさらなる選択にかけた。この選択法を繰り返して、本発明の教示に従い高いビタミン含有量、厚い果皮を有し、刺激性がない果実を有する安定した親系統を得た。

表２Ｃは、その種子がアクセッション番号４１３８１でＮＣＩＭＢに寄託された雑種品種ＡＣＥ０５Ｆ０１−５２１から得た、コショウ果実のビタミン含有量を示す。この雑種は、前に記載した自家受粉と選択の連続ステップを使用して得た、ＡＣＥ０５Ｆ０８−７１、雄親及びＡＣＥ０５Ｆ１１−１１８、雌親のＦｉである。表１Ｃ中に示すビタミンの値は、２００５年１１月及び２００６年１月に採取した代表的な果実の平均値である。品種ＡＣＥ０５Ｆ０１−５２１は、本発明による高いビタミン含有量を有する果実を作出する植物の一例として本明細書に記載し、本発明の範囲内に含まれ得る様々なコショウ型及び系を制限することは意味せず、これらを例示するものである。

具体的な実施形態の前述の記載は、他者が現在の知識を適用することによって、過度の実験なしで一般的な概念から逸脱せずに、このような具体的な実施形態を様々な用途に容易に改変及び／又は適用することができ、したがって、このような適用及び改変は、開示した実施形態の均等物の意味及び範囲内に含まれるはずであり、含まれることを意図するように、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするはずである。本明細書で使用する語句又は用語は、記載の目的であり制限の目的ではないことは理解されよう。様々な開示した機能を実施するための手段、物質及びステップは、本発明から逸脱せずに様々な代替形態をとることができる。

出発物質として使用したコショウ植物の果実、及び選択法のスキームを示す図である。 ＰＣＲ産物をロードしたアガロースゲルの典型的な写真である。約７００ｂｐのバンドの存在は、刺激性果実を有する植物から得たサンプルを示す（例えば、レーン４；９〜１０）。バンドの不在は非刺激性果実を示す（例えば、レーン１〜３；５〜８）。レーンＭはサイズマーカー−ｐＢＲ３２２／ＡｌｕＩを示す。 ２つの時間地点：２００２年１１月（系１）及び２００３年１月（系２）において採取した果実中の、ビタミンＥの含有量（ｍｇ／１００ｇＦＷ）を示す図である。 アルメリア、スペインで生長した植物から２００２年１１月に採取した果実、及びマイボア、イスラエルで生長した植物から２００２年の春に採取した果実中の、ビタミンＥの含有量（ｍｇ／１００ｇＦＷ）を示す図である。

Claims (58)

1. 現在市販されているコショウ品種の可食果実と比較してビタミン含有量が改変された可食果実を有するコショウ植物であって、果実が高いビタミンＥ含有量を含み、高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量及びこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含み、ビタミンＥの濃度が少なくとも約５ｍｇ／１００ｇ新鮮重量である、コショウ植物。
2. 果実が非刺激性であり厚い果皮を有する、請求項１に記載のコショウ植物。
3. 植物ゲノムが高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列を欠いている、請求項２に記載のコショウ植物。
4. 高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列が配列番号３で示されるポリヌクレオチド配列又はその断片を含む、請求項３に記載のコショウ植物。
5. ビタミンＥの濃度が少なくとも約７ｍｇ／１００ｇ新鮮重量である、請求項１に記載のコショウ植物。
6. ビタミンＥの濃度が少なくとも約９ｍｇ／１００ｇ新鮮重量である、請求項１に記載のコショウ植物。
7. ビタミンＥの濃度が少なくとも約１１ｍｇ／１００ｇ新鮮重量である、請求項１に記載のコショウ植物。
8. プロビタミンＡ濃度が少なくとも約３ｍｇ／１００ｇ新鮮重量であり、ビタミンＣ濃度が少なくとも約２００ｍｇ／１００ｇ新鮮重量である、請求項１に記載のコショウ植物。
9. ビタミンＣ濃度が約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ／１００ｇ新鮮重量の範囲である、請求項８に記載のコショウ植物。
10. 果実がビタミンＥ、プロビタミンＡ及びビタミンＣを含む、請求項８に記載のコショウ植物。
11. 果実が少なくとも約７０ｍｇ／１００ｇ新鮮重量のカロテノイドをさらに含む、請求項１０に記載のコショウ植物。
12. ビタミン含有量が改変された果実作物を作出し、ビタミンＥの平均濃度が少なくとも約５ｍｇ／１００ｇ新鮮重量である、請求項１に記載のコショウ植物。
13. 近交系及び雑種からなる群から選択される、請求項１に記載のコショウ植物。
14. 請求項１に記載の植物の花粉。
15. 請求項１に記載の植物の胚珠。
16. 高い発芽率、活発な生長、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌性、真菌性又はウイルス性の病害に対する抵抗性、及び非生物的ストレスに対する抵抗性からなる群から選択される少なくとも１つの他の形質をさらに含む、請求項１に記載の植物。
17. 品種改良、単一形質変換及び形質転換からなる群から選択される方法によって他の形質が導入される、請求項１６に記載の植物。
18. ＡＣＥ０５Ｆ０１−５２１で明示される雑種であり、その種子がアクセッション番号４１３８１でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された、請求項１に記載の植物。
19. 現在市販されているコショウ品種の可食果実と比較してビタミン含有量が改変された可食コショウ果実であって、果実が高いビタミンＥ含有量を含み、高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量及びこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含み、ビタミンＥの濃度が少なくとも約５ｍｇ／１００ｇ新鮮重量である、可食コショウ果実。
20. 非刺激性であり厚い果皮を有する、請求項１９に記載の可食コショウ果実。
21. 果実ゲノムが高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列を欠いている、請求項２０に記載の可食果実。
22. 高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列が配列番号３で示されるポリヌクレオチド配列又はその断片を含む、請求項２１に記載の可食果実。
23. プロビタミンＡ濃度が少なくとも約３ｍｇ／１００ｇ新鮮重量であり、ビタミンＣ濃度が少なくとも約２００ｍｇ／１００ｇ新鮮重量である、請求項１９に記載の可食コショウ果実。
24. ビタミンＣ濃度が約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ／１００ｇ新鮮重量の範囲である、請求項２３に記載の可食果実。
25. 果実がビタミンＥ、プロビタミンＡ及びビタミンＣを含む、請求項２３に記載の可食コショウ果実。
26. 少なくとも約７０ｍｇ／１００ｇ新鮮重量のカロテノイドをさらに含む、請求項２５に記載の可食コショウ果実。
27. コショウ植物の種子であって、種子から生長した植物が現在市販されているコショウ品種の可食果実と比較してビタミン含有量が改変された果実を作出し、果実が高いビタミンＥ含有量を含み、高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量及びこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含み、ビタミンＥの濃度が少なくとも約５ｍｇ／１００ｇ新鮮重量である種子。
28. 果実が非刺激性であり厚い果皮を有する、請求項２７に記載の種子。
29. 種子から生長した植物のゲノムが高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列を欠いている、請求項２８に記載の種子。
30. 高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列が配列番号３で示されるポリヌクレオチド配列又はその断片を含む、請求項２９に記載の種子。
31. プロビタミンＡ濃度が少なくとも約３ｍｇ／１００ｇ新鮮重量であり、ビタミンＣ濃度が少なくとも約２００ｍｇ／１００ｇ新鮮重量である、請求項２７に記載の種子。
32. ビタミンＣ濃度が約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ／１００ｇ新鮮重量の範囲である、請求項３１に記載の種子。
33. 果実がビタミンＥ、プロビタミンＡ及びビタミンＣを含む、請求項３１に記載の種子。
34. 果実が少なくとも約７０ｍｇ／１００ｇ新鮮重量のカロテノイドをさらに含む、請求項３３に記載の種子。
35. 種子から生長した植物が近交系及び雑種からなる群から選択される、請求項２７に記載の種子。
36. 請求項２７に記載の種子を生長させることによって作出されたコショウ植物、又はその一部分。
37. 請求項１に記載のコショウ植物、又はその一部分から得た、再生可能な細胞の組織培養物。
38. 組織培養物の再生可能な細胞が、葉、花粉、胚、根、根端、葯、花、果実及び種子からなる群から選択される植物の一部分から得られる、請求項３７に記載の組織培養物。
39. 組織培養物が現在市販されているコショウ品種の果実と比較してビタミン含有量が改変された果実を有する植物を再生し、果実が高いビタミンＥ含有量を含み、高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量及びこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含み、ビタミンＥの濃度が少なくとも約５ｍｇ／１００ｇ新鮮重量である、請求項３７に記載の組織培養物。
40. 果実が非刺激性であり厚い果皮を有する、請求項３９に記載の組織培養物。
41. 請求項３７に記載の組織培養物から再生したコショウ植物。
42. 現在市販されているコショウ品種の可食果実と比較してビタミン含有量が改変された果実を有するコショウ植物であって、果実が高いビタミンＥ含有量を含み、高いプロビタミンＡ含有量、高いビタミンＣ含有量及びこれらの組合せの少なくとも１つをさらに含み、ビタミンＥの濃度が少なくとも約５ｍｇ／１００ｇ新鮮重量であり、非刺激性であり厚い果皮を有するコショウ植物を作出するための方法であって、
    ａ．現在市販されているコショウ品種の可食果実と比較して、高いビタミンＥ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物、高いプロビタミンＡ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物、及び高いビタミンＣ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物を選択するステップ、
    ｂ．高いビタミンＥ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物と市販のコショウ植物を交配して第１Ｆ_１集団を作出するステップ、
    ｃ．高いプロビタミンＡ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物と高いビタミンＣ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物を交配して第２Ｆｉ集団を作出するステップ、
    ｄ．第１及び第２Ｆｉ集団の種子を回収するステップ、
    ｅ．前記第１及び前記第２Ｆｉ種子集団から植物を生長させるステップ、
    ｆ．前記第１Ｆ_ｉ集団由来の少なくとも１つの植物と前記第２Ｆｉ集団由来の少なくとも１つの植物を交配してＦ_２集団を作出するステップ、
    ｇ．雑種Ｆ_２種子を回収するステップ、
    ｈ．Ｆ_２種子からＦ_２植物を生長させるステップ、
    ｉ．高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列の存在に関してＦ_２植物から得たＤＮＡサンプルを調べるステップ、
    ｊ．Ｆ_２植物によって作出された果実における果皮の厚さを測定するステップ、
    ｋ．高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列を欠いており厚い果皮を有するＦ_２植物を選択するステップ、
    ｌ．ステップ（ｋ）で選択したＦ_２植物によって作出された果実におけるビタミンＥ、プロビタミンＡ及びビタミンＣの含有量を測定するステップ、及び
    ｍ．少なくとも約５ｍｇ／１００ｇ新鮮重量のビタミンＥ濃度、並びに少なくとも約３ｍｇ／１００ｇ新鮮重量のプロビタミンＡ濃度、及び約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ／１００ｇ新鮮重量の範囲のビタミンＣ濃度、又はこれらの組合せの少なくとも１つを有するコショウ果実を有する植物を選択するステップ
    を含む方法。
43. 市販のコショウ果実が高い発芽率、活発な生長、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌性、真菌性又はウイルス性の病害に対する抵抗性、及び非生物的ストレスに対する抵抗性からなる群から選択される少なくとも１つの形質を示す、請求項４２に記載の方法。
44. 選択した植物を少なくとも１回自家受粉させるステップ、及び少なくとも約５ｍｇ／１００ｇ新鮮重量のビタミンＥ濃度、並びに少なくとも約３ｍｇ／１００ｇ新鮮重量のプロビタミンＡ濃度、少なくとも約２００ｍｇ／１００ｇ新鮮重量のビタミンＣ濃度、及びこれらの組合せの少なくとも１つを有し、非刺激性であり厚い果皮を有するコショウ果実を有する植物をさらに選択するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
45. プロビタミンＡ濃度が少なくとも約３ｍｇ／１００ｇ新鮮重量であり、ビタミンＣ濃度が少なくとも約２００ｍｇ／１００ｇ新鮮重量である、請求項４２に記載の方法。
46. ビタミンＣ濃度が約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ／１００ｇ新鮮重量の範囲である、請求項４５に記載の方法。
47. 果実がビタミンＥ、プロビタミンＡ及びビタミンＣを含む、請求項４５に記載の方法。
48. 果実が少なくとも約７０ｍｇ／１００ｇ新鮮重量のカロテノイドをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
49. 高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列が配列番号３で示されるポリヌクレオチド配列又はその断片を含む、請求項４２に記載の方法。
50. 請求項４２に記載の方法によって作出されたコショウ植物、及びその一部分。
51. 現在市販されているコショウ品種の可食果実と比較してビタミン含有量が改変された可食果実を有するコショウ植物を作出するための方法であって、
    ａ．現在市販されているコショウ品種の可食果実と比較して、高いビタミンＥ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物、高いプロビタミンＡ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物、及び高いビタミンＣ含有量を含む果実を有する少なくとも１つのコショウ植物を選択するステップ、
    ｂ．選択した植物のそれぞれと市販のコショウ植物を交配して少なくとも１つの子孫集団を作出するステップ、
    ｃ．高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列の存在に関して子孫集団から得たＤＮＡサンプルを調べるステップ、
    ｄ．高刺激性形質と同時分離するＤＮＡ配列を欠いており、少なくとも約５ｍｇ／１００ｇ新鮮重量のビタミンＥ濃度、並びに少なくとも約３ｍｇ／１００ｇ新鮮重量のプロビタミンＡ濃度、約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ／１００ｇ新鮮重量の範囲のビタミンＣ濃度、及びこれらの組合せの少なくとも１つを有するコショウ果実を有する植物を選択するステップ
    を含む方法。
52. 厚い果皮を有する果実を選択するステップをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
53. 市販のコショウ植物が高い発芽率、活発な生長、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌性、真菌性又はウイルス性の病害に対する抵抗性、及び非生物的ストレスに対する抵抗性からなる群から選択される少なくとも１つの形質を示す、請求項５１に記載の方法。
54. 交配のステップ（ｂ）と選択のステップ（ｄ）を少なくとも１回繰り返す、請求項５１に記載の方法。
55. 選択した植物を少なくとも１回自家受粉させるステップ、及び少なくとも約５ｍｇ／１００ｇ新鮮重量のビタミンＥ濃度、並びに少なくとも約３ｍｇ／１００ｇ新鮮重量のプロビタミンＡ濃度、約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ／１００ｇ新鮮重量の範囲のビタミンＣ濃度、及びこれらの組合せの少なくとも１つを有し、非刺激性であり厚い果皮を有するコショウ果実を有する植物をさらに選択するステップをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
56. 果実がビタミンＥ、プロビタミンＡ及びビタミンＣを含む、請求項５５に記載の方法。
57. 果実が少なくとも約７０ｍｇ／１００ｇＦＷのカロテノイドをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
58. 請求項５１に記載の方法によって作出されたコショウ植物、及びその一部分。