JP2008532939A - ニワトリにおける抗体の組織特異的発現 - Google Patents
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Abstract
Description
遺伝的に改変された動物は、抗体など有益な薬学的製品の持続可能な製造を大きく前進させる可能性を与える。しかし、遺伝的に改変された動物の作製は、著しい技術的障害を伴い、これらの障害は少数の種でしか克服されていない。特異的発現のために、タンパク質をコードする遺伝的改変をある種のDNA中に組み入れられるようにするには、各遺伝的改変のために開発されなければならないいくつかの独特な技術が必要となる。ある動物の遺伝的特徴および肉体的特徴を改変するための1つの手法は、その動物のレシピエント胚中に細胞を導入することである。これらの細胞は、レシピエント胚から生まれる動物の組織に寄与し、結果として生じる遺伝的に改変された動物の子孫のゲノに寄与する能力を有する。
本発明は、ニワトリにおけるタンパク質発現、ならびにキメラニワトリおよびトランスジェニックニワトリを作製するために使用される、遺伝子工学、遺伝子導入、および細胞の長期培養などの実現技術を含む。本発明はまた、ニワトリにおいて産生される抗体およびそれらの独特な化学的性質にも関する。具体的には、これらの抗体は、ある種の用途におけるそれらの治療的有用性を高める有利な化学的諸特性を有する。ニワトリにおいて産生される抗体は、脊椎動物、植物、または細菌の細胞系において産生される抗体と比べて独特なパターンの化学的改変を有し、その結果、腫瘍などの標的組織に毒素を結合させる目的で患者に投与された場合に、標的組織は、高い治療有効性で治療される。一実施形態では、胚性幹細胞の長期培養物は、外因性抗体の組織特異的発現をもたらす導入遺伝子の挿入物を含む、キメラトリに遺伝的改変を導入するために特別に設計された遺伝子構築物を用いて作り出される。本発明のトランスジェニックトリは、導入遺伝子に由来する抗体を輸卵管中で発現し、また、抗体は、卵中に大量に蓄積する。好ましい実施形態では、天然のヒト抗体がニワトリの輸卵管において発現され、そして卵から回収することができるように、外因性抗体タンパク質は、ヒトDNA配列によってコードされる。
本発明によれば、ニワトリES細胞系は大型の核を有し、かつ顕著な核小体を含むステージX胚に由来する(図1)。これらの細胞は、長期の培養後に形態学的にニワトリ胚性幹(cES)細胞であることが確認され、また、レシピエント胚中に注入された場合にキメラを生じることが確認されている。さらに、ES細胞は、広範囲の羽毛キメラ現象によって判定されるように、体細胞組織に対する高度の寄与を可能にする。さらにまた、これらの胚性幹細胞は、外因性タンパク質をコードするDNAを有する導入遺伝子でトランスフェクトされることが実証されている。ES細胞は、導入遺伝子を安定に組み込み、そして導入遺伝子を発現して、形質転換細胞の選択を可能にする。これらの形質転換細胞はキメラを形成することができ、その際、導入遺伝子によってコードされた外因性タンパク質は、このキメラの選択された組織中に存在する。このキメラに由来する細胞は、この導入遺伝子によってコードされる外因性タンパク質を発現する。特に好ましい実施形態では、この導入遺伝子によってコードされる外因性抗体は、この導入遺伝子によってコードされる抗体に応じて、特定の組織または組織型において発現される。胚性幹細胞の子孫は、レシピエント胚へのES細胞の導入およびキメラの形成後に非ES細胞表現型に分化する、ES細胞の派生物である。
ニワトリ胚性幹細胞(cES細胞)の誘導
ニワトリES細胞を、2種の交雑、すなわち、横斑ロック×横斑ロック、または横斑ロック×ロードアイランドレッドのうちの1つから誘導した。cES細胞の発育能を試験する場合、羽毛マーカーを得るためにこれらの品種を選択した。これらcES細胞を、優性の白色遺伝子座においてホモ接合優性である白色レグホーン胚中に注入する。これらのES細胞の注入の結果として生じるキメラニワトリは、cES細胞由来の黒色の羽毛およびレシピエント胚由来の白色の羽毛を提示する。
レシピエント胚へのニワトリ胚性幹細胞の注入
新しく産卵された卵中の胚への到達を可能にするためには、殻を割らなければならず、これは、21日のインキュベーション期間の最終時点のふ化率の低下を不可避的にもたらす。慣例としては、卵の側面を切断して小さな穴(直径10mm未満)をあけ、この穴を通して胚を操作し、そしてテープ、カバーガラス、卵殻膜、または一片の殻で再び封じた。実施するのは比較的簡単であるが、この「窓開け」法は、70%〜100%の胎児死亡率を引き起こした。胚への到達の改善、および生存およびふ化能力の増大は、2種の異なる殻および(Callebautから適応させた)方法(参照により本明細書に具体的に組み入れられる、Callebaut、Poult. Sci 60巻:723〜725頁、1981年、ならびにRowlett,K.およびK.Simkiss,J.Exp.Biol.143巻:529〜536頁、1989年)を用いて、ふ化までのインキュベーションのために代理卵殻に胚を移入した場合に実現することができ、この技術を用いた場合、平均ふ化率は、約41%(23〜70%の範囲)であり、469個のcES細胞注入胚から191匹のヒヨコがふ化した。
ニワトリ胚性幹細胞(cES)に由来する体細胞キメラ
ニワトリES細胞を白色レグホーンレシピエント胚中に注入する。第1期の実験では、28回の実験において合計14種の細胞株を、ステージXのレシピエント胚に注入する(表2を参照されたい)。これらのcES細胞は、4〜106日間培養して増殖させたものであり、一部の株は、凍結保存したものであった。ニワトリES細胞を軽くトリプシン処理して、cES細胞の小さな塊を得、25mM HEPES+10%ウシ胎児血清を添加したDMEM中に再懸濁する。2000〜5000個の細胞を含む3μl〜5μlの細胞懸濁液を、レシピエント胚の胚盤下腔中に注入する。羽毛を発達させた胚をすべて分析し、また、羽毛の色によって判定したところ、24パーセントの胚(83/347)が、キメラである。羽毛キメラは、14種の細胞株中11種から得られる。キメラ現象の程度は、1%〜95%まで様々であり、程度の平均は、25.9%(SD=20.4)であった。
リポフェクションおよびエレクトロポレーションによるcES細胞のトランスフェクション
表6に言及すると、トランスフェクトされるウェルのサイズと適合した適切な量のDNAを、血清も抗生物質も含まない培地中に希釈する。適切な体積のSuperfect(Stratagene社)を添加し、DNAと混合し、そして5〜10分間、反応を生じさせる。この培地を除去し、そしてトランスフェクトしようとするウェルを、CaおよびMgを含まない塩溶液で洗浄する。血清および抗生物質を含み得る適切な体積の培地を、DNA/Superfect混合物に添加する。これらのプレートを37℃で2〜3時間インキュベートする。インキュベーションが完了したら、細胞を1〜2回洗浄することによってSuperfectを除去し、そして新鮮な培養培地を添加する。
組織特異的な抗体発現
導入遺伝子の設計に応じて、外因性抗体をコードするDNAは、選択された組織おいてのみ有意なレベルの抗体を発現するように設計される。この導入遺伝子構築物は、宿主生物のゲノムに由来する遺伝子エレメントを含み得、また、選択された組織における抗体の公知の発現または発現パターンに基づいて選択され得る。特定の組織における発現のためには、選択される組織において通常発現され、また通常高度に発現される、タンパク質をコードする遺伝子を選択し、そしてこの外因性抗体の発現を駆動するために、この遺伝子に由来する調節エレメントを選択する。この外因性抗体のDNAコード配列と組み合わせる場合、オボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボムチン、リゾチーム、オボグロブリン、オボインヒビター、シスタチン、オボグリコプロテイン、オボフラボプロテイン、オボマクログロブリン、またはアビジンのプロモーターなど他の調節エレメントを、選択マーカーをコードする遺伝子と組み合わせて、および/またはIRESと組み合わせて、使用してよい。この導入遺伝子は、選択された組織において、好ましくは卵白において優先的な抗体発現をもたらす。特定の組織型における優先的発現は、選択されていない組織と比較して規模が3〜4桁大きな、選択された組織における発現と定義することができる。
4.6×300mmのBioSep SEC S3000カラム(Phenomenex社)を用いて、Waters 2795 HPLCによって約10μγのIgGサンプルを解析した。0.1Mリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、および0.1M硫酸ナトリウム、pH7.2において、流速0.4ml/分で20分間、クロマトグラフィーを実施した。A280で分離をモニターした。分子量標準物質(Bio−Rad社)を用いて、概算の分子量を決定した。SEC−HPLC解析により、双方とも90%を超えるIgGモノマーであることが示された(表10)。
双方のMAb調製物を還元およびアルキル化し、一晩透析し、そして25mM重炭酸アンモニウム(PH8)中、37℃で4時間、トリプシンで消化した。双方のトリプシン消化物のタンデム型質量分析を、陽イオンモードで、そしてタンデムスペクトル(tandem spectra)を得るために衝突誘起解離(CID)を用いるQSTAR pulsar質量分析計(MDS Sciex社、コンコード、オンタリオ州、カナダ)工程に連結されたNano HPLCシステム(Dionex社、サニーベール、カリフォルニア州)によって実施した。各サンプルをμl 1mlずつ注入し、75mm直径μm Pepmap C18カラムを用いて流速250nl/分で分離した。移動相は溶媒A(95%水、5%アセトニトリル、0.5%ギ酸)および溶媒B(20%水、80%アセトニトリル、0.5%ギ酸)であった。機器は、2秒間フルスペクトルを記録し、次いで、最も強度の強いイオンを選択して次の5秒間CIDスペクトルを記録する7秒間の運転サイクルを用いる情報依存的取得(information dependent acquisition)モードで操作した。スペクトルは、Mascot(Matrix Science社、ロンドン、イギリス)を用いて解析した。説明した方法による双方のMAb調製物の解析では、配列の差異は示されなかった。
4MグアニジンHCl中IgGサンプル(50μγ)を、サンプルを60℃で90分間インキュベートすることによって25mM DTT中で還元した。次いで、暗所、室温で15分間、45mMヨード酢酸中でサンプルをアルキル化し、そして22mM DTTで反応を停止させた。LC−MSに先立って、サンプルを25mM重炭酸アンモニウム1Lに対して透析し、そして各サンプル50μlを、Micromass ZQ質量分析計を装備されたWaters2795 HPLCを使用するPoros R1/10 2.1×100mmカラム(Applied Biosystems社)に注入し、陽イオンモードで解析した。移動相は、(A)0.1%ギ酸および0.01%トリフルオロ酢酸(TFA)ならびに(B)0.1%ギ酸および0.01%TFAを含む100%CH3CNであった。溶出(0.25ml/分)は、100分に渡って作られる(A)中(B)の10〜60%の直線勾配によって実施した。
ニワトリ発現系およびCHO発現系において作製されたMAbF1の熱安定性を示差走査熱量測定(DSC)を用いて測定し、そしてFcドメインにおいて脱グリコシル化されたそれらの対応する型と比較した。融解温度(Tm)の熱量測定は、オートサンプラーと組み合わされたVP−Capillary DSC示差走査マイクロカロリメータープラットホーム(MicroCal LLC、ノーサンプトン、マサチューセッツ州、米国)を用いて実施した。サンプルセルの容積は0.144mLである。これらの抗体のグリコシル化型および脱グリコシル化型に関する変性データは、濃度2.3μMのこれらのサンプルを1℃/分の速度で30℃から95℃まで加熱することによって得た。これらのタンパク質サンプルは、pH7.4のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中に存在した。比較してモル熱容量を得るために、同じ緩衝液を参照セルにおいて使用した。観測された温度記録図をベースライン補正し、また、標準化したデータをOrigin v7.0を用いて解析した。
サンプルを12.5mUのPNGaseF(Prozyme社)と共に40℃で一晩インキュベーションすることによってIgGサンプル(100μγ)からオリゴ糖を遊離させた。使用した条件下で、CHO細胞およびニワトリにおいて発現されたHuMAbF1のFc部分に由来するN結合型グリカンが遊離された。MAbタンパク質を除去するためにエタノール沈殿を実施した後、これらのグリカンを含む上清を減圧遠心分離によって乾燥させ、そして15%酢酸中19mM APTS(Beckman社)およびTHF(Sigma社)中1Mシアノ水素化ホウ素ナトリウム中に再懸濁した。グリカン標識反応を40℃で一晩継続させ、続いて、サンプルを水で25倍に希釈した。APTSで標識したグリカンを、有効長50cm、内径50μmのN−CHOコーティングキャピラリー(Beckman社)を使用する、逆極性を有するP/ACE MDQ CEシステム(Beckman社)による、レーザー誘起蛍光法を用いたキャピラリー電気泳動に適用した。サンプルは圧力(8秒)注入し、また、分離は、Carbohydrate Separation Gel Buffer(Beckman社)を用いて、25kV、20℃で20分間実施した。これらの分離物を、3mWアルゴンイオンレーザーならびに488nmの励起波長および520nmの発光波長を用いるレーザー誘起蛍光検出システム(Beckman社)を用いて観察した。図9に示すように、ニワトリにおいて産生されたMAbF1のオリゴ糖プロファイルは、CHO細胞において産生されたMAbF1のプロファイルと大きく異なることが判明した。
精製した抗体(100μg、各1.0mg/ml)を4μlのPNGaseF、すなわちN結合型糖質を切断するエンドグリコシダーゼ(Prozyme社)で処理した。これらのサンプルを37℃で一晩インキュベートし、次いで、50mM重炭酸アンモニウム(pH8)に対して一晩透析した。タンパク質は、エタノール沈殿によって除去した。遊離された糖質を、本質的には供給業者のプロトコールに従って、ただし溶出体積を5μlに減らして、Glygen Corp.(コロンビア、メリーランド州)製のマイクロカーボンカラムを用いて脱塩した。各グリカンサンプルの1μl分取物を、マトリックス溶液(α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸または2,5−ジヒドロキシ安息香酸(Applied Biosystems社)と1:1(体積比)で混合し、MALDIターゲットプレート上にスポットし、自然乾燥させる。MALDI−Q−TOFタンデム型解析を用いて、完全な複合糖質の解析を実施した。すべての質量スペクトルは、糖質のクラスの質量(組成)を提供する、o−MALDIソース2(MDS Sciex社、コンコード、オンタリオ州、カナダ)を装備したQSTAR pulsar i質量分析計を用いて記録した。双方のMAbのグリカンをプロファイリングした後、各グリカン中で起こり得るグリコシド結合を調査した。高CIDによる質量スペクトルを、TOF/TOFオプティクスを装備した4700Proteomics分析計(Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州)を用いて記録した。高CIDのMS/MS実験の場合、衝突エネルギーは1kVに設定した。衝突セルの内部で、選択したオリゴ糖イオンを2×10−6トルの圧力でアルゴンと衝突させた。MALDI TOF質量分析法によって解析した、ニワトリに由来するMAbF1中の11種の主要なグリカンの糖質組成および起こり得るグリコシド結合を表13に要約する。これらのオリゴ糖構造体は、高マンノース型、複合型、およびハイブリッド型のNグリカンを含むことが判明した。
要約すれば、N結合型オリゴ糖プロファイルにおける最も目を引く差異は、ニワトリにおいて産生された抗体中に高マンノース型のN−グリカンが存在し、フルコースは存在せず、またガラクトース残基の含有量が極めて少ないことであった。これらの特性はいくつかの理由から重要である。第1に、抗原性であることが公知であるα1−3 Gal結合の証拠がない。典型的には約2%未満のレベルまでガラクトース濃度が低下すると、ガラクトースを含む結合に起因する抗原性が実質的に減少する。第2に、同じく抗原性であることが公知であるN−グリコリルノイラミン酸残基の証拠がない。第3に、ニワトリ管状腺細胞において産生された抗体には、抗体のADCC活性を高めるフコシル残基が実質的にない。この文脈において、実質的にないとは、0.1%未満と定義される。第4に、ニワトリに産生された抗体は、典型的には40%を上回る高いマンノース含有率を有し、これは、CHO細胞において産生された抗体を標準物質として用いてBalb/cマウスにおいてクリアランスを評価した場合のこの抗体のクリアランス速度を速める。これらの有利な化学的諸特性に加えて、これらの抗体は、ニワトリゲノム中にランダムに組み込まれるか、または組織特異的な様式で発現されない導入遺伝子を用いた場合には観察されない濃度で卵白中に存在する。好ましい濃度は卵1個当たり抗体1mgより高く、卵1個当たり2mgより高く、卵1個当たり3mgより高く、また、卵1個当たり6mgもの高さである。各卵は約25mlの卵白を含むため、好ましい濃度は40μg/mlより高く、80μg/mlより高く、120μg/mlより高く、また、240μg/mlもの高さである。
卵白からの抗体の抽出および精製
最初に、室温で30分間、卵白を低剪断速度で混合し、次いで、以前に説明されている改良法によってオボムチンを沈殿させた。1体積のホモジナイズした卵白懸濁液を3倍体積の逆浸透水に添加し、30分間攪拌した。希釈した懸濁液を、0.5Mリン酸を用いてpH6.0に調整し、次いで12,100gで20分間遠心分離した。この方法によって主としてオボムチンを含有する卵白タンパク質の約3%を回収した。0.5Mリン酸水素二ナトリウムを用いて上清をpH7.4に調整し、そして結晶塩を用いて塩化ナトリウム濃度を150mMに調整した。Protein A−Sepharose FFカラム(Amersham Biosciences社)を用いて、線流速120cm/時でヒトIgGを精製した。吸着されたヒトIgGを5カラム容量のローディング緩衝液(PBS、pH7.4)で洗浄し、次いで、3mMリン酸を用いて溶出させた。230mM NaClを含有する60mMリン酸ナトリウム(pH7.5)を用いて、溶出されたヒトIgG画分をpH7.5に調整して、最終濃度を40mMリン酸ナトリウムおよび150mM NaClとした。次いで、サンプルを0.2mmシリンジフィルター(Pall社)に通してろ過した。図10に示すように、精製した物質の大半は、90%を超える純度を有する(ELISAおよびA280によって決定、データは示さず)、完全に構築されたH2L2であった。
結合親和性に関するアッセイ
LNCaP細胞(ATCC)上のPSMAを、結合を分析するための抗原として使用した。ウェル当たり20万個の細胞を、指定した濃度の50μlずつの抗体と共に、デュプリケートで30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄した後、希釈度1:200のヤギ抗ヒトIgG PE標識抗体(Jackson ImmunoResearch社)をウェル当たり50μl、4℃で30分間、添加した。1%BSAを含むPBS中で細胞を2回洗浄し、FACSによって分析した。LNCaP細胞上のPSMAに対するMAb結合のEC50値は、GraphPad Prism 3.0(GraphPad Software社)を利用して、結合曲線から決定した。細胞は、10%FBS、10mM HEPES、2mM L−グルタミン、および1mMピルビン酸ナトリウムを添加したRPMI1640培地中で増殖させた。ニワトリ管状腺細胞において産生されたMAbF1の抗原結合特性を、CHO細胞において産生されたMAbF1の抗原結合特性と比較した。どちらの抗体調製物も、LNCaP細胞上で発現されたPSMAに対してほぼ同一の結合曲線を描き、EC50値は類似していた(図11)。このデータにより、ニワトリに由来する抗体およびCHOに由来する抗体はグリコシル化の様式は異なるが、同等に抗原を認識し、結合することが実証される。
抗体内部移行のアッセイ
PSMAへのMAbF1の結合は、抗体の内部移行を招く。潜在的な1つの応用において、PSMAを発現する腫瘍細胞を標的とし、そして破壊するために、MAbを細胞毒と結合させることができる。LNCaP細胞上のPSMAに対する抗体結合の内部移行は、MAbおよびHum−Zap(Advanced Targeting Systems社)と共に細胞をインキュベートすることによって判定した。HumZapは、リボソーム不活性化タンパク質であるサポリンに結合されたヤギ抗ヒトIgG抗体である。MAbF1/Hum−Zap複合体が細胞表面上のPSMAに結合し、そして内部移行された場合に細胞は死滅するが、抗体またはHum−Zapは単独ではLNCaP細胞に対して毒性ではない。300ngのHum−Zap、および300ngのF1MAbまたは対照MAbを含む培養培地150μl中で、37℃で48時間、トリプリケートでLNCaP細胞(10,000/ウェル)をインキュベートした。細胞の増殖および生存は、CellTiter−Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega社)を用いて決定した。ウェル当たり10,000個のLNCaP付着細胞と共に、細胞培養培地中の抗体希釈物を4℃で2時間インキュベートすることによって内部移行アッセイも実施した。抗体溶液を穏やかに除去し、HumZap 200ngを含有する培地150μlに交換した。37℃で48時間インキュベーションした後、細胞生存率を決定した。抗体内部移行に対するEC50値は、Prism3.0(GraphPad Software社)を用いてグラフから決定した。図12に示すように、双方の抗体調製物が同様の効率で内部移行された。一連の抗体濃度に渡って試験した場合、ニワトリに由来するMAbF1およびCHOに由来するMAbF1の双方の内部移行に対するEC50値は0.49nMであった。
BALB/cマウスにおけるMAbのクリアランス
放射標識した抗体の静脈注射により、BALB/cマウスにおいて、ニワトリに産生されたMAbF1のin vivo半減期を、CHOに産生された抗体と並行して解析した。MAbタンパク質10μgを、Iodobead法(Pierce社)を用いて、125Iで少しヨウ素標識した(抗体当たり1個未満のI)。6週齢の雌BALB/cマウス(Taconic Farms社、ジャーマンタウン、ニューヨーク州)に、実験前の1週間、飲料水に溶かした0.1mg/mlヨウ化カリウムを与えた。タンパク質当たり4匹のマウスの尾静脈に約600,000cpmの標識MAbを静脈注射し、そして全身ガンマカウンター(Wm.B.Johnson社、Ludlum社製計数器付きNaI結晶検出器)を用いて、選択された時間に全身の放射能を測定した。半減期は、指数関数的回帰分析または残留放射能に基づいて算出した。図13に示したように、ニワトリ管状腺細胞によって産生されたMAbF1は、102.4±0.9時間の半減期(t1/2)で浄化されたのに対し、CHO細胞によって産生されたMAbF1は、より緩徐に浄化され、半減期は207.5±18.3時間であった。
ADCCのアッセイ
改良された51CrADCCアッセイにおいてLNCaP−C42B細胞を試験した。標準的なFicoll−Paque分離法によってヘパリン処置した全血からヒト末梢血単核細胞を精製した。これらの細胞を、10%FBSおよび10U/mlヒトIL−2を含有するRPMI1640培地中に(1×10E6細胞/mLで)再懸濁し、そして37℃で一晩インキュベートした。翌日、これらの細胞を回収し、培養培地中で1回洗浄し、そして2×107細胞/mlの濃度で再懸濁した。200万個のLNCaP−C42b標的細胞を、総体積1ml中の200uCi 51Crと共に37℃で1時間インキュベートする。標的細胞を1回洗浄し、培地1ml中に再懸濁し、37℃でさらに30分間インキュベートする。最終のインキュベーションの後、標的細胞を1回洗浄し、そして最終体積を1×105細胞/mLにする。最終のADCCアッセイのために、標識LNCaP細胞100μlをエフェクター細胞50μlおよび抗体50μlと共にインキュベートする。標的とエフェクターの最終比率は1:100を選択した。すべての研究において、対照のヒトIgG1アイソタイプを試験し、CHOに由来する抗PSMA MAbF1抗体と比較した。含まれる他の対照は、a)標的細胞およびエフェクター細胞、ただし抗体はなし、b)エフェクター細胞を伴わない標的細胞、ならびにc)3%TritonX−100の存在下の標的細胞およびエフェクター細胞である。37℃で4時間インキュベーションした後、上清を回収し、240〜400keVの読取領域を有するガンマカウンター(Packard Instruments社製のCobra IIオートガンマ)を用いて計数した。抗体濃度の関数としてカウント毎分をプロットし、そしてこのデータを、Prismソフトウェア(サンディエゴ、カリフォルニア州)を用いた非線形回帰、すなわちS字形用量反応(可変勾配)によって解析した。溶解率は以下の式、すなわち、溶解率(%)=(サンプルCPM−抗体なしのCPM)/(TritonX CPM−抗体なしのCPM)×100によって決定した。本発明者らは、すべての研究においてEC50値および溶解率の双方がモニターされることが重要であることを発見した。例えば、2種の抗体を比較する場合に、EC50値もしくは溶解率または双方が変化している可能性がある。
CD16結合
CHOおよびニワトリに由来するMAbF1を、Biacore社によって提供されるアミンカップリングキットを用いて、一級アミンを介してBiacoreセンサーチップ(CM5)のカルボキシメチルデキストランマトリックス表面に固定化した。どちらの抗体も、約10,000RUの密度まで塗った。固定化した抗体表面上にいくつかの濃度のタンパク質を流しかけることによってこれら2種の抗体とCD16−PheおよびCD16−Valとの結合を起こさせた。空白の表面および純粋な緩衝液の結合サイクルを考慮することによって非特異的結合の効果を説明した。HBS−EP緩衝液を希釈用および泳動用緩衝液として使用した。実験は、Biacore−3000機器を用いて25℃で実施した。データはGraphPad Prismソフトウェアによって解析し、また、平衡解離定数を推定するために、単一結合部位モデルにデータを適合させた。
治療的有用性
本発明は、具体的に定められたグリコシル化パターンおよび他の化学的諸特性を有し、そして前述の遺伝的に改変されたニワトリを用いて作製された抗体を提供する。これらの特性により、標的組織中の抗原特異的な標的に結合させる目的で患者に投与した場合の治療特性が改善される。具体的には、上記のように、いくつかの臨床適応症に対して、これらの抗体は、増強された抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)を示し、また、この効果はいくつかの臨床適応症において重要な利点を与える。
Claims (11)
- 外因性ポリヌクレオチドにコードされ、そして遺伝的に改変されたニワトリの管状腺細胞において選択的に発現され、そして該ニワトリによって産卵された卵中で回収されるモノクローナル抗体を含む組成物であって、該抗体が、少なくとも40μg/mlの濃度で卵白中に存在する組成物。
- 卵中に含まれる前記モノクローナル抗体がフコシル残基を実質的に含まない、請求項1に記載の組成物。
- マンノース濃度が約40%より高い、請求項1に記載の組成物。
- ガラクトース濃度が約2%より低い、請求項1に記載の組成物。
- フコシル残基を実質的に含まないモノクローナル抗体を作製するための方法であって、
ニワトリのゲノム中に組み入れられた外因性ポリヌクレオチドを有する遺伝的に改変されたニワトリの管状腺細胞において該抗体を発現させるステップと、
該ニワトリによって産卵された卵から、少なくとも40μg/mlの濃度で卵白中に存在する該抗体を回収するステップと
を含む方法。 - 前記抗体のマンノース濃度が約40%より高い、請求項5に記載の方法。
- ガラクトース濃度が約2%より低い、請求項5に記載の方法。
- モノクローナル抗体が、少なくとも40μg/mlの濃度で卵白中に存在する、外因性ポリヌクレオチドにコードされたモノクローナル抗体を管状腺細胞において発現する遺伝的に改変されたニワトリ。
- 前記抗体がフコシル残基を実質的に含まない、請求項8に記載のニワトリ。
- マンノース濃度が約40%より高い、請求項8に記載のニワトリ。
- ガラクトース濃度が約2%より低い、請求項8に記載のニワトリ。
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