JP2008532492A - ゼアキサンチンの過剰蓄積を示すトウガラシ属品種およびそこから得られる産物 - Google Patents
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Abstract
Description
トウガラシ属の多肉果におけるカロテノイド類の蓄積はよく研究されており、数多くの既知生合成遺伝子がクローニングされ、配列決定され、ある程度、機能的に特徴づけられている。カロテノイド生合成の研究の大半は、モデル系ソラナムリコペルシコン(Solanum lycopersicon)(トマト)で行われてきたが、さらなる研究により、カロテノイド類を蓄積する全ての植物種の間でこれらの遺伝子は高レベルに保存されていることが示されている[Hirschberg(2001)]。また、一定のカルテノイド類は、分類学的特異性を示す。例えば、カプサンチンおよびカプソルビンは、トウガラシ属の成熟莢に見られる赤色を担っており、他の属には見られない。これら二つのカロテノイド類は、カプサンチン−カプソルビンシンターゼ(Ccs)の作用によって、それぞれアンテラキサンチンおよびビオラキサンチンから合成される。Ccsが存在しない場合、ペッパー類は有意な量のカプサンチンまたはカプソルビンを蓄積せず、結果として生じる成熟果実は橙色である[Bouvier,ら(1994)]。
全trans−3R,3R’ゼアキサンチン異性体は合成的に製造され、その製造方法は特許文献3および特許文献4に開示されている。合成ゼアキサンチンは、その技術をHoffman−LaRocheから購入したDSMによって市販されている。Hoffman−LaRocheは、ゼアキサンチンの3R,3’R異性体の化学合成を記述する二つの特許を取得していたが、それが特許文献3と特許文献4である。そこに開示されている方法は、三つの主要中間体の製造および精製を必要とし、各中間体はその前駆体からの収率が約70〜85%である。これらの特許に開示されている方法は全体で、一連の14反応ステップを必要とするらしく、それらは最低でも83時間(精製を除く)を要して、反応物と生成物の混合物を与える。次に、ゼアキサンチンの3R,3’R異性体を精製するために、最終反応混合物を大規模に処理しなければならない。したがって、この技法を使って合成しかつ精製するのに要求される全工程は、商業規模での生産を、あまりにも困難にし、費用のかかるものにする。合成的に製造されたゼアキサンチンは、現在、非エステル化型でしか入手できない。一定の合成由来カロテノイド類に伴う重大な問題は、典型的に最終産物に残留して最終産物を汚染する、高レベルの残留溶剤(それらの合成に使用したもの)である。例えば、市販の合成β−カロテンを本発明者らの実験室で分析したところ、合成供給源に依存してそれぞれ2000ppmおよび1200ppmという残留レベルのトルエンまたはアセトンを含有することが示された。一般に公衆には知られていないこれらのレベルは、望ましいものではなく、パプリカまたはニンジンオレオレジンなどといった高レベルのカロテノイド類を含有するスパイス抽出物について21 CFR §173で許されている残留溶剤レベルより、およそ50〜100倍高い。
公衆は、一般に、合成的に製造されたものではなく天然供給源から得られた化合物を消費することを好む。高レベルのゼアキサンチンを含有する天然供給源には、現在、マリーゴールド花弁の一定の突然変異品種、リキウム(Lycium)属およびホオズキ(Physalis)属の液果、具体的にはクコ(リキウムキネンセ(Lycium chinense))の液果などが含まれる。特許文献5は、ゼアキサンチンを含有する好ましい材料には「オレンジ、モモ、パパイア、プルーン、およびマンゴなどの果実が含まれる」ことを開示している。この特許にはトウガラシ属の記載はない。
マリーゴールド(タゲテスエレクタ(Tagetes erecta))花弁は、カロテノイド色素ルテインの商業的供給源として長い歴史を持っている。乾燥マリゴールド花は重量で約1〜1.6%のカロテノイド類を含有し、一般に総カロテノイド類の90%をルテインエステルが占める(Antonyら,2001)。特許文献6には、ゼアキサンチンを高レベルに発現させる突然変異マリーゴールドが開示されており、ここではゼアキサンチンが主要カロテノイド色素である。しかしマリーゴールド花弁は食品とは認識されていない。マリーゴールドから得られるルテインは自己確認による(self−affirmed)GRAS(Generally Recognized as Safe)プロセスを利用して食品添加物として導入されているが、それが食品の色を変化させる場合には、食品に添加することができない。これは、ルテインが21 CFR §73に基づく免除食品着色剤とは認識されていないからである。
ルテインからゼアキサンチンへの異性化反応は40年以上前から知られている。特許文献7に開示されている一方法では、ナトリウムエトキシド、メタノール、カリウムメトキシド、硫酸メチル、およびそれらの組み合わせを使って、この変換を達成する。
中医学に使用されてきた歴史を持つクコ(リキウムチネンセ)から、ゼアキサンチンのジパルミチン酸エステルが、高濃度に単離されている[Zhouら(1999)]。21 CFR 182によれば、クコはGRAS食品物質ではないので、食品系におけるクコの潜在的使用は限定される。
ゼアキサンチンは、表1に示すように、広範囲にわたるさまざまな果実および野菜に見出される(「Lutein and Zeaxanthin Scientific Review」Roche Vitamins Technical Publication HHN−1382/0800)。これらのレベルは、本発明に存在する濃度[生(湿)ベースで約60,000マイクログラム/100g]と比較して、極めて低い。
カプサイシン含量の極めて低いトウガラシ(Capsicum annuum)には、基本タイプが二つある。すなわちベル(bell)タイプおよびパプリカ(paprika)タイプである。一部のパプリカは感知できるほどに辛いが、ペッパー中の辛味成分であるカプサイシンの有無は、本発明にとっては重大な問題ではない。
フラボバクテリウムマルチボラム(Flavobacterium multivorum)(ATCC 55238)を使った発酵プロセスによってゼアキサンチンを製造する方法を開示している特許文献2に記載されているように、細菌はゼアキサンチンのもう一つの供給源になる。ゼアキサンチンを発現させることができる細菌は他にも同定されており、これにはフラボバクター属(Flavobacter)の微生物(ATCC 21081、21588、および11947)が含まれる。細菌供給源に由来するゼアキサンチンはGRASではない。さらにまた、細菌からの抽出物の安全性も確立されていない。利用できることが知られている細菌由来のゼアキサンチンの商業的供給源はない。
実莢を実らせ、かつ乾燥成熟実莢肉中にカロテノイド色素の過剰蓄積を示す、トウガラシ属(Capsicum)の植物またはその再生可能部分であって、非エステル型で測定した場合にゼアキサンチンが主要カロテノイドである、植物またはその再生可能部分。
(a)上記植物またはその再生可能部分から得た粉砕成熟実莢を、その実莢からゼアキサンチンを抽出するのに十分な時間、溶剤と接触させること、
(b)溶剤およびそこに溶解している抽出物を、残りの植物材料から分離すること、
(c)抽出物を脱溶剤化してゼアキサンチンオレオレジンを得ること、
(d)pHを下げるために、ゼアキサンチン抽出物をブチル化ヒドロキシトルエン、炭酸ナトリウムおよび水酸化カリウムと共に暗所で還流すること、および
(e)溶液を中和して純粋な非エステル化ゼアキサンチンの溶液を生じさせること
を含む方法。
本発明において、ゼアキサンチンという用語は、その幾何異性体、立体異性体および誘導体のどの形態にあるゼアキサンチンも包含する。ルテインは、本明細書では、ゼアキサンチンの異性体とはみなさない。ゼアキサンチン幾何異性体には、全trans型、ならびにさまざまなcis異性体、例えば9−cis、13−cisおよび15−cisが包含される。立体異性体には、3R,3’R;3S,3’R;3R,3’Sおよび3S,3’Sが含まれる。ゼアキサンチンの誘導体には、遊離ヒドロキシル型と、当技術分野においてその存在が典型的に知られているさまざまな脂肪酸とのエステルが、どちらも包含される。本発明は、これら全ての形態のゼアキサンチンの組み合わせに適用される。本発明の植物は、主として、trans−3R,3’Rを、遊離ヒドロキシル化合物と、脂肪酸のモノ−およびジ−エステルとの混合物として産生する。
1.遊離ジオールまたは非エステル化ジオールとして測定される、乾燥成熟実莢肉中のゼアキサンチンの質量が、総乾燥成熟実莢肉の質量の約0.4%より大きい。
本発明の植物はトウガラシ属に属し、古典的な雑種形成、個体選抜および子孫条播評価(progeny row evaluation)の植物育種法を使った植物育種プログラムの産物である。
ゼアキサンチン産生量の増加を含むカロテノイド生合成の改変は、本発明の植物におけるアブシジン酸産生の量または時期の変化につながりうる。発芽、発芽率または発芽時期に対する悪影響を避けるために、それらの発生におけるどこかの時点で、植物または種子をアブシジン酸またはアブシジン酸前駆体で処理するか、当技術分野で知られる他の処理を行う必要があるかもしれない。そのような処理は、当技術分野では、多種多様な植物について知られている。
本発明の植物が実らせる実莢は当技術分野で知られる任意の手段によって収穫することができる。関心対象のトウガラシ属を収穫するための好ましい方法は、機械収穫である。手による収穫も用いることができる。実莢は完全に含水した形で収穫して、青果市場用のペッパーにすることができる。実莢は、莢が圃場の植物上で乾燥した後に、部分乾燥状態で収穫することもできる(実施例参照)。
新鮮な莢または部分乾燥した莢は、天日乾燥、オーブン乾燥、凍結乾燥などを含む当技術分野で知られる任意の手段によって、さらに乾燥させることができる。
乾燥した莢は、当技術分野で知られる方法によって破砕または粉砕することができる。
ゼアキサンチンおよび他のカロテノイド類は、新鮮莢肉の抽出、乾燥果実の抽出、またはそれらの混合物の抽出によって得ることができる。場合によっては、抽出工程に先だって、莢肉を粉砕してペーストまたは粉末にすることが好ましい。粉砕プロファイルは当技術分野で知られる手段によって最適化することができる。抽出は、当技術分野で現在知られている方法のどれを使っても行うことができる。これには、溶剤による抽出、溶剤混合物(例えば21 CFR §173で承認されているもの)による抽出、圧搾機を使った機械的手段による抽出(例えば米国特許第5,773,075号に記載されているもの)、亜臨界流体または超臨界流体(例えば追加溶剤または共溶剤の存在下または不在下での超臨界二酸化炭素)による抽出、炭化水素(例えばエタン、プロパンまたはブタン)による抽出、ハイドロフルオロカーボン(例えばテトラフルオロエタン)または21 CFR §173で承認されている有機溶剤と混合されたテトラフルオロエタンによる抽出などがあるが、それらに限定されるわけではない。適切な抽出用溶剤には、n−ヘキサン、シクロヘキサン、分岐ヘキサン類、ヘプタン、分岐ヘプタン類、オクタン、ノナン、デカン、および他の炭化水素などがあるが、それらに限定されるわけではない。適切な溶剤には、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、メチル−tert−ブチル−エーテル、エタノール、メタノール、アセトン、リモネン、および他の精油も含まれるが、それらに限定されるわけではない。当業者には知られているとおり、これらの溶剤の組み合わせも抽出に利用することができる。溶剤の使用を伴う方法の後には、一般に、例えば蒸留、真空蒸留、蒸気蒸留、エバポレーション、蒸気トリッピング、窒素ストリッピング、膜浸透気化法、または分子蒸留を含む(ただしこれらに限定されるわけではない)脱溶剤化工程が行われる。
本トウガラシ属品種の全形新鮮莢、乾燥莢、粉砕莢、または莢抽出物を加熱して、天然の全transゼアキサンチンの全部または一部をcis型に変換することができる。同様にして、本トウガラシ属品種の全形新鮮莢、乾燥莢、粉砕莢、または莢抽出物に、天然の全transゼアキサンチンの全部または一部を同様のcis型またはさらなるcis型に変換するのに十分な波長の光を照射することもできる。あるいは、ゼアキサンチンのcis型を、エタノール中で還流することによって、trans型に変換し戻すすることもできる(Khachikら,1992)。β−カロテンおよびβ−アポ−8−カロテナールなどの他のカロテノイド類も、石油エーテルまたは水中で加熱してから結晶化することにより、cis型から全trans型へと高収率で変換することが示されている(Islerら,1956;米国特許第3,989,757号およびその参考文献)。cis異性体とtrans異性体の相互変換には、当技術分野で知られる他の化学的手段も使用することができる。
本発明は、トウガラシ属品種(非エステル化型で測定した場合に、乾燥成熟実莢肉において、50%より高い、総カロテノイド類に対するゼアキサンチンのパーセントを示すもの)から得られるゼアキサンチンの形態および製剤に関する。そのような形態および製剤は、ヒトおよび動物によって栄養補助剤、食品着色剤もしくは食品添加物、ヒト用食品もしくは動物用飼料の強化、または美容、介護もしくは医薬用途の成分として消費されることが企図される。
本植物産物は、トウガラシ属植物から収穫された新鮮実莢の形で、丸ごと、破砕して、ピューレ状にして、液体で柔らかくして、または圧搾汁として、摂取することができる。
本植物産物は、トウガラシ属植物から収穫された脱水、乾燥または乾物実莢の形態で、丸ごと、または破砕もしくは粉砕して、摂取することができる。これらの脱水ペッパー産物は、ペッパー粉末として、調味料として、または食品もしくは飲料中の調味料として、消費者に届けることができるだろう。
本植物産物は、当技術分野で知られる任意の手段によって製造される、トウガラシ属植物から収穫された実莢から製造されたオレオレジンまたは抽出物の形態で摂取することができる。
本植物産物は、例えば米国特許第5,773,075号の方法(ただしこれに限定されるわけではない)によって製造される、トウガラシ属植物の実莢からオレオレジンを圧搾抽出する際に副産物として生成する搾り滓(圧搾固形物)の形態で摂取することができる。本搾り滓は動物またはヒトの栄養補給に使用することができる。
本植物産物は、トウガラシ属植物から収穫された実莢から製造されたオレオレジンまたは抽出物であって、最初に抽出されたオレオレジン形態中に存在するゼアキサンチンよりも高濃度のゼアキサンチンを含む材料を製造するために、当技術分野で知られる任意の適切な植物抽出物加工技法(例えば遠心分離、傾瀉、沈殿(シード添加または沈殿を助長する他の物質の添加によるもの)、濾過、結晶化または再結晶、鹸化、クロマトグラフィー、膜加工またはゾーン精製を含むが、これらに限定されるわけではない)によって、さらに加工されたものの形態で摂取することができる。これらの材料中にゼアキサンチンはエステル化型または非エステル化型で存在することができる。
トウガラシ植物莢肉の抽出物をさらに加工して、異なる形態および純度のゼアキサンチンを得ることができる。さらなる加工方法には、遠心分離、傾瀉、沈殿(シード添加または沈殿を助長する他の物質の添加によるもの)、濾過、結晶化または再結晶、鹸化、クロマトグラフィー、膜加工またはゾーン精製などがあるが、これらに限定されるわけではない。これらの材料中にゼアキサンチンはエステル化型または非エステル化型で存在することができる。
トウガラシ属植物から得られるゼアキサンチンエステルは、当技術分野で記載されているいくつかの方法によって鹸化することができ、そのような方法には、1)酸または塩基による水中での鹸化、2)酸または塩基によるメタノールまたはイソプロピルアルコール中での鹸化、3)酸または塩基によるプロピレングリコール中での鹸化、および4)酵素を使った鹸化などがあるが、これらに限定されるわけではない。
短鎖有機酸を遊離ゼアキサンチンと反応させて、ゼアキサンチンの短鎖有機酸モノエステルまたはジエステルを製造することができる。これらの短鎖有機酸は、米国特許第5,959,138号に記述されているように、有機無水物をゼアキサンチン抽出物と反応させることによって得ることができる。使用することができる有機無水物には、例えば酢酸無水物、プロピオン酸無水物、およびそれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されるわけではない。他のカルボン酸、それらの無水物またはエステルが関わるエステル化工程によって、他のエステルを形成させることができる。ゼアキサンチンエステルをカルボン酸および酸、塩基または酵素触媒で処理するエステル交換反応を使って、さらなるゼアキサンチンエステルを製造することができる。
トウガラシ属植物中に存在するゼアキサンチンは、主として、3R,3’R立体異性体からなる。トウガラシ属植物の新鮮果実中に見出される色素は、圧倒的に、全trans配置にある。trans−ゼアキサンチンは、当技術分野で知られている方法により、その全部または一部を、さまざまなcis型に変換することができる(Khachikら,1992;Updikeら,2003)。
トウガラシ属植物から得られるゼアキサンチンは、栄養補助剤もしくは飼料補助剤、食品着色剤もしくは飼料着色剤、または食品添加物もしくは飼料添加物としての、その使用を容易にするために、ヒト食用成分または動物食用成分を使って製剤化することができる。パプリカオレオレジン型のゼアキサンチンまたはより高度に精製された形態のゼアキサンチンは、トウモロコシ油、ダイズ油、カノーラ油、ラッカセイ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、パーム油、ヤシ油、中鎖トリグリセリド、トリアセチン、硬化植物油などの植物油、ラード獣脂および家禽脂、漁油、鯨油などの動物脂、藻類油などの添加によって、着色力に関して標準化することができる。パプリカオレオレジン型のゼアキサンチンまたはより高度に精製された形態のゼアキサンチンは、乳化剤、例えばレシチン、ヒドロキシル化レシチン、モノグリセリド、ジグリセリド、ソルビタンエステル類、例えばポリソルベート−80、ショ糖エステル類、ポリグリセロールエステル類、モノグリセリドおよびジグリセリドの酒石酸エステル類などを含む食品等級の添加物と組み合わせることができる。具体的には、ゼアキサンチンを、食品および飲料の着香または着色に有用であり、油にも水にも分散可能な、均一液体香辛料組成物であって、(1)ヒドロキシル化レシチン、(2)モノグリセリドおよびジグリセリドの酒石酸エステル類、ならびに(3)食用着香剤、食用着色剤から選択される1以上の香辛料(そのうちの一つは本発明によって得られるゼアキサンチンでなければならない)を含み、(1)+(2)対(3)の重量比が少なくとも1:4であるような組成物に、することができる。食品等級の乳化剤を使って製剤化されたパプリカオレオレジン型のゼアキサンチンまたはより高度に精製された形態のゼアキサンチンは、飲料用途および乳液ベースの食品に、とりわけ有用である。
パプリカオレオレジン型のゼアキサンチンまたはより高度に精製された形態のゼアキサンチンを、1以上の他の天然および/または合成カロテノイド類と組み合わせて、栄養補助剤もしくは飼料補助剤、食品着色剤もしくは飼料着色剤、または食品添加物もしくは飼料添加物として有用な混合カロテノイド組成物を得ることができる。組み合わせることができる他の天然および/または合成カロテノイド類の例には、以下に挙げるものがあるが、これらに限定されるわけではない:ニンジン抽出物、合成β−カロテン、トマト抽出物、合成リコペン、マリーゴールド抽出物、合成ルテイン、ベニノキ抽出物、ビキシン、ノルビキシン、β−アポ−8−カロテナール、カンタキサンチン、アスタキサンチン、ルテイン、藻類カロテノイド類、真菌カロテノイド類、クリプトキサンチン、α−ゼアカロテン、β−ゼアカロテンなど。
パプリカオレオレジンまたはより高度に精製された形態のゼアキサンチンを、多種多様な用途における使用に適した固体担体上に分散させることができる。担体には、塩、デキストロース、マルトデキストリン、ラクトース、リグニン、穀粉、タルク、二酸化チタン、医薬品用および化粧品用賦形剤もしくは他の固体物質またはそれらの組み合わせを含めることができる。トウガラシ属植物から得られるゼアキサンチンから製造されるカロテノイド類の安定な冷水分散性調合物は、カロテノイド類と、温血動物由来のゼラチンに代えて使用される水溶性または水分散性リグニン誘導体とを含む(米国特許第5,668,183号)。本調合物用のリグニン誘導体は、単一のリグニンを含有するか、数種類のリグニン誘導体の混合物を含有することができる。リグノスルホン酸ナトリウム、カルシウム、およびアンモニウムは、とりわけ好ましい。
ゼアキサンチンをその形態のいずれかで含有するビーズレットまたはマイクロカプセルを製造することができる。典型的なカロテノイド濃度範囲は1〜50重量%の範囲である。マイクロカプセルは封入されたカロテノイドを摂取過程で放出する。これらのマイクロカプセルは、ヒト用または動物用食品、マルチビタミン剤、食事補助剤、および介護製品での使用にも適しうる。錠剤化およびカプセル剤にも使用することができる。
トウガラシ属植物から得られるゼアキサンチンの乳液は、当技術分野で周知の技法によって形成させることができる。食品、飲料、化粧品、医薬品および介護製品の水性系に使用するためのゼアキサンチン乳液を製造することができる。界面活性剤、ゼアキサンチン(要すれば油担体中)、そして要すれば制泡剤の組み合わせを使って、水性乳液を製造することができる。乳液を乾燥させて、水性媒質に容易に分散する粉末を形成させることができる。乳液中に使用するゼアキサンチンは、粗製オレオレジンの形態をとるか、より高度に精製されたゼアキサンチン(遊離のゼアキサンチンまたはエステル化型のゼアキサンチン)の形態をとることができる。
トウガラシ属植物から得られるゼアキサンチンは、粉末状に加工するのに適している。ゼアキサンチンオレオレジンの乳液またはゼアキサンチン結晶の分散液または微粉状ゼアキサンチンは、当技術分野で知られる技術を使って噴霧乾燥することができる。一般的には、ゼアキサンチンの油分散液または油溶液を水およびポリマー材料、例えばゼラチン、植物性ゴム、化工デンプン、デキストリン、または非ゲル化タンパク質などと混合する。乳化剤を加え、混合物を均質化する。得られた乳剤を霧状にして、乾燥室中の加熱された空気の柱に導入すると、水が蒸発するにつれて、流動性粉末が生成する。この種類の方法の一例は、米国特許第6,635,293号に記載されている。固形のゼアキサンチンは、流動層凝集またはコアセルベーションを含む当技術分野で知られるさまざまな技法のいずれかによって封入することができる。
ゼアキサンチン粒子またはゼアキサンチンを含有する粒子は、この色素の色を効果的に隠す不透明な材料でコーティングすることができる。これは、ある物品にゼアキサンチンをその物品の色を変えずに加えることが望ましい場合に、有用な技法である。
(高ゼアキサンチン食品)
カロテノイド色素の過剰蓄積を示す本発明のトウガラシ属品種の実莢はヒト用食品として直接使用することができ、そこから絞った汁は飲み物として使用することができる。トウガラシ属実莢は新鮮な状態または乾燥した状態で消費されうる。これらの形態は粉砕したり、切り刻んだり、液化したりして、単独で、または他の任意の食品、ソース、または飲料と組み合わせて使用することができる。この材料は調味料または香辛料の一成分として使用することができる。
天然由来のカロテノイド類は着色剤としてかなりの重要性を帯びるようになっており、以前認定された一定の着色剤の使用が政府の規則によって取り消されまたは制限されたことにより、その重要性は増大している。本発明のトウガラシ属品種中の色素は、FDA規則(21 CFR §73.340)の下に米国では食品着色剤として許容されうる。トウガラシ属由来の色素は、現行の食品規則の下で食品着色剤として使用することができるゼアキサンチンの唯一知られた供給源である。食品産業では、ウコン(Curcuma longa)から得られる光に不安定なクルクミン色素に代わる光に安定な黄色着色剤の可用性に、かなりの関心が持たれている。トウガラシ属品種から得られるゼアキサンチン産物は、ウコンよりも高い光安定性を持つ明るい自然な黄色の外観を与えるために、ヒト消費用のさまざまな食品および飲料に、栄養食品−着色剤として加えることができる。
本トウガラシ属植物から得られるゼアキサンチンは、さまざまなタイプの美容用途に使用することができる。これは、日焼け防止のために、そしてまた酸化防止剤として、局所外用するか、内服することができる。ゼアキサンチンは、リップクリーム、リップスティック、リップライナー、リップモイスチャライザーなどの唇用途に使用することができる。ゼアキサンチンは、ファンデーション、メークアップ、ほお紅、日焼け用クリームなどを含む美容用途に使用することができる。また、放射線(例えば太陽から来るもの)の作用から保護するために皮膚に適用される局所外用品に使用することもできる。これらの物品には、日焼けローション、日焼け促進剤、日焼け保湿剤などが含まれる。美容用途にゼアキサンチンを使用する一例は米国特許第6,110,478号であり、この特許には、皮膚色素沈着の調節剤であって、経口経路による投与にも皮膚への塗布にも適合する、美容目的の組成物が開示されている。
本トウガラシ属品種から得られるゼアキサンチンは、動物に、その肉、皮膚または卵を着色する目的で、または栄養補助剤として役立つように、投与することができる。
本トウガラシ属変種から得られるゼアキサンチンは、魚類または甲殻類に、その肉を着色する目的で投与することができる。例えば、消費者に対して訴求力を持つ肉色を作り出すために、サケに本発明の物品を給餌することができる。同様に、コエビ類、クルマエビ類、ロブスター類、およびザリガニ類などの甲殻類の肉を、より望ましい色に着色することができる。
家禽ブロイラー皮膚および卵黄の色は、重要な品質属性として広く知られている。世界の各地域は、このパラメータに関して、それぞれ独自の仕様を確立している。したがって、ブロイラー皮膚および卵黄の最適な着色は、文化的伝統および好みに依存する。伝統的に家禽飼育者は赤色色素および黄色色素(天然および合成)を鳥の飼料に混合してきた。
本トウガラシ属品種から得られるゼアキサンチンは、ペット、家畜、および他の動物に、食餌補助剤として、そしてまた、白内障、AMDおよび他の変性疾患などの疾患を予防するために、投与することができる。本発明のゼアキサンチンは、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、魚、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、および他の動物に、食餌補助剤として使用することができる。ゼアキサンチンは、当技術分野で知られる広範囲にわたるさまざまな形態で、これらの動物に投与することができる。これには、錠剤、浸液、食品、処理、およびペレットなどが含まれるが、これらに限定されるわけではない。水産養殖では、体および/または肉に所望の色を付与するために、ゼアキサンチンを使用することができる。
ゼアキサンチンはさまざまな眼疾患の処置に有効であることが開示されている(米国特許第5,854,015号)。立体異性体型のゼアキサンチンならびにAMDおよび他の眼障害の処置および予防におけるそれらの使用は、米国特許第6,329,432号に開示されている。本トウガラシ属品種から得られるゼアキサンチンには、先行技術のゼアキサンチン組成物と比較して、本明細書に挙げた理由による利点があり、それらを以下に再び要約する:
1.本トウガラシ属品種から得られるゼアキサンチン組成物は、光毒性物質または接触皮膚炎感作物質を含有せず、それらと接触したこともない。
本願で言及した特許は全て、参照により本明細書に組み入れられる。
(高濃度のゼアキサンチンを示すトウガラシ属植物の開発)
成熟実莢肉中に高濃度のゼアキサンチンを示す本トウガラシ属植物は、古典的植物育種法および当業者に知られる方法を使用し、植物育種材料の供給源として実用トウガラシ品種NM草型を使って開発された。本品種は、実莢中に高濃度のカロテノイド色素を示す植物品種の開発によって得られた。高いカロテノイド濃度および適切な草性は商用品種にとって望ましい。
(小規模圃場生産の説明)
本発明のトウガラシ属品種の小試験プロットに作付けを行った。6ヶ月後に、作物を落葉剤で処理し、圃場で乾燥させた。作物を手で収穫した。実莢を薄く切り、市販の連続ガス乾燥機で脱水した。生産によって得た乾燥実莢の複合試料二つを、実施例6、8および9で述べるように分析した。総カロテノイド類に対するゼアキサンチンの質量パーセントは70.81%および71.80%だった。成熟乾燥実莢中のゼアキサンチンの重量パーセントは0.93%および0.97%だった。
(圃場生産の説明)
本トウガラシ属品種の試験プロットに作付けを行った。6ヶ月後に、作物を落葉剤で処理し、圃場で乾燥させた。作物を手で収穫した。実莢を薄く切り、市販の連続ガス乾燥機で脱水した。7ロットの実莢を収穫し、それぞれの代表的試料を、実施例6、8および9で述べるように分析した。これらの7点の試料における、総カロテノイド類に対するゼアキサンチンの質量パーセントは、57.7%、59.7%、61.3%、59.1%、59.6%、53.3%および60.9%だった。乾燥成熟実莢中のゼアキサンチンの質量パーセントは、それぞれ、総乾燥成熟実莢肉の0.76%、0.81%、1.0%、0.96%、0.70%、0.83%、および0.87%だった。
(商業規模での本トウガラシ属品種の抽出)
実施例2で得た本トウガラシ属植物の乾燥成熟実莢2894ポンドを粉砕し、ヘキサンとアセトンの混合物(65:35)により、連続バスケット抽出機で溶剤抽出した。真空ストリッパーを使ってヘキサン類およびアセトンが25ppm未満になるまでミセルを脱溶剤化することにより、194ポンドのトウガラシ属オレオレジンを得た。このオレオレジンは、鹸化ステップ後に遊離ゼアキサンチンとして測定した場合に(実施例7および9の方法を使用)、6.7%の総ゼアキサンチンを含有していた。
(ゼアキサンチン立体化学の決定)
オレオレジン中に存在する光学異性体を、商用試験所での分析によって決定した。粉砕した投入材料を実施例4と同様に抽出し、実施例6の方法で小規模に鹸化した。この鹸化試料を、勾配分離を用いるC30カラムでのカロテノイド分析のために、テトラヒドロフランに溶解し、希釈した。光学異性体分析のために、試料をヘキサンに溶解し、順相HPLCでキサントフィル含量を調べた。複数のピークを含む試料の場合、この系で複数回の注入を行って、ゼアキサンチンピークを集めた。合わせた収集物を再注入して、trans−ゼアキサンチンだけが集められていることを確認した。合わせた収集物を窒素下で濃縮し、直列した二本のキラルChiralcel(R)ODカラム(4.6×250mm,5μm)(Daicel Chemical Industries, LTD,ニュージャージー州フォートリー)に注入した。この分離に使用した移動相は、流速0.6mL/分の5%イソプロパノール/ヘキサンである。分析物を450nmで検出した。3R,3’R−ゼアキサンチンのニート標品を各試料セットと共に注入して、保持時間を確認した。ゼアキサンチンピークの保持時間が3R,3’R−ゼアキサンチンピークの保持時間と一致しない試料については、保持時間シフトと明確に異なるピークとを区別するために、その試料にこの標品をスパイクして再注入した。試料は、3R,3’R−ゼアキサンチンと同定される光学異性体を一つだけ含有することがわかった。
(HPLC分析のための粉砕トウガラシ属の鹸化手順)
本トウガラシ属品種の粉砕した成熟乾燥実莢肉(1.0g)を、化学天秤で1ミリグラムの10分の1の位まで秤量し、125mlエルレンマイヤーフラスコに定量的に移した。光への曝露を減らすために、そのフラスコを直ちにアルミニウム箔で覆った。ブチル化ヒドロキシトルエン(0.2g,Sigma Chemical Company)および炭酸ナトリウム粉末(Aldrich Chemical−A.C.S.試薬)1.5gを秤量し、エルレンマイヤーフラスコに加えた。メタノール(Fisher Scientific−HPLC等級)50mlおよび水酸化カリウム(VWR Intl.)約0.8gをエルレンマイヤーフラスコに加えた。その溶液に撹拌子を入れ、エルレンマイヤーフラスコの上部にビグリュー蒸留塔を装着した。その溶液をホットプレート上に置き、撹拌しながら弱く加熱(約65℃)して1時間還流した。次に、その溶液をホットプレートから降ろして冷ました。その溶液を中和するために、合計1.2mlのリン酸(Innophos 75% FCC等級;Innophos, Inc.,ニュージャージー州クランベリー)を加えた。その溶液を、Celite(R)(Eagle Picher Filtration and Minerals,ネバダ州リノ)が入っているブフナー漏斗を通して、200mlメスフラスコ中に直接、減圧濾過した。全ての色素をエルレンマイヤーフラスコおよびブフナー漏斗からメタノールで濯ぎ出し、それらを合わせて、総体積をメタノールで200mlにした。フラスコを数回上下反転させた後、その溶液を0.45ミクロンPTFE Acrodisc(R)(Gelman)フィルターを装着した3ccシリンジに注ぎ込み、HPLC分析用の褐色バイアルに注入した。
(HPLC分析のためのオレオレジン鹸化手順)
本トウガラシ属品種から得たオレオレジン(0.03g)を、化学天秤で1ミリグラムの10分の1の位まで秤量し、125mlエルレンマイヤーフラスコに直接移した。光への曝露を減らすために、そのフラスコを直ちにアルミニウム箔で覆った。合計0.2gのブチル化ヒドロキシトルエン(Sigma Chemical Company)および1.5gの炭酸ナトリウム粉末(Aldrich Chemical−A.C.S.試薬)を秤量し、エルレンマイヤーフラスコに加えた。メタノール(Fisher Scientific−HPLC等級)50mlおよび水酸化カリウム(VWR Intl.)約0.8gをエルレンマイヤーフラスコに加えた。その溶液に撹拌子を入れ、エルレンマイヤーフラスコの上部にビグリュー蒸留塔を装着した。その溶液をホットプレート上に置き、撹拌しながら弱く加熱(約65℃)して1時間還流した。次に、その溶液をホットプレートから降ろして冷ました。その溶液を中和するために、合計1.2mlのリン酸(Innophos 75% FCC等級)を加えた。その溶液を、Celite(R)(Eagle Picher Filtration and Minerals,ネバダ州リノ)が入っているブフナー漏斗を通して、200mlメスフラスコ中に直接、減圧濾過した。全ての色素をエルレンマイヤーフラスコおよびブフナー漏斗からメタノールですすぎ落とし、それらを合わせて、総体積をメタノールで200mlにした。フラスコを数回上下反転させた後、その溶液を0.45ミクロンPTFE Acrodisc(R)(Gelman)フィルターを装着した3ccシリンジに注ぎ込み、HPLC分析用の褐色バイアルに注入した。
(HPLCによる総カロテノイド類に対するゼアキサンチンのパーセンテージ(面積%)の決定)
分析は、データステーションにインストールされたEmpower(ビルド1154、データベースバージョン5.00.00.00)ソフトウェアを使って、Waters 2695(米国マサチューセッツ州ミルフォード)分離システムで行った。クロマトグラフィー分離は、逆相カラム(Waters Symmetry(R)C18,粒径5μm,250mm×4.6mm)で行った。溶離液は、メタノール/水/アセトンの三元勾配で、1.0ml/分とした。溶離液の初期組成はメタノール−水−アセトン(0:25:75,v/v/v)とした。初期直線勾配を15分間適用して、組成をメタノール−水−アセトン(20:5:75,v/v/v)にした。この組成を15分保った後、もう一つの直線勾配を30分間適用して、組成をメタノール−水−アセトン(25:0:75,v/v/v)にした。最後に、もう一つの直線勾配を15分間適用して、組成をメタノール−水−アセトン(0:0:100,v/v/v)にした。この組成を5分間保ち、初期条件に戻した。化合物は、20.0μlの注入体積を使って、Waters 996フォトダイオードアレイ検出器で検出した(400nm〜600nmのマックスプロット)。文献の保持時間およびPDAスペクトルを使って、ピークの一部(ビオロキサンチン(violoxanthin)、アンテラキサンチン、9−cis−ゼアキサンチン、クリプトカプシン、α−クリプトキサンチン、ζ−カロテン)を同定した。他の化合物を同定し、Carotenature(スイス・ルプジンゲン)から得た標品と比較した。それらを以下に列挙する:カプソルビン、カプサンチン、trans−ゼアキサンチン、ルテイン、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、trans−β−カロテンおよびcis−β−カロテン。本トウガラシ属品種から得られる鹸化粉砕成熟乾燥実莢および鹸化オレオレジンのクロマトグラム例を、それぞれ図1および図2に示す。
(HPLCによるゼアキサンチン含量(重量%)の決定)
分析は、データステーションにインストールされたEmpower(ビルド1154、データベースバージョン5.00.00.00)ソフトウェアを使って、Waters 2695(米国マサチューセッツ州ミルフォード)分離システムで行った。クロマトグラフィー分離は、逆相カラム(Waters Symmetry(R)C18,粒径5μm,250mm×4.6mm)で行った。溶離液は、メタノール/水/アセトンの三元勾配で、1.0ml/分とした。溶離液の初期組成はメタノール−水−アセトン(0:25:75,v/v/v)とした。初期直線勾配を15分間適用して、組成をメタノール−水−アセトン(20:5:75,v/v/v)にした。この組成を15分保った後、もう一つの直線勾配を30分間適用して、組成をメタノール−水−アセトン(25:0:75,v/v/v)にした。最後に、もう一つの直線勾配を15分間適用して、組成をメタノール−水−アセトン(0:0:100,v/v/v)にした。この組成を5分間保ってから、初期条件に戻した。化合物は、20.0μlの注入体積を使って、Waters 996フォトダイオードアレイ検出器で検出した(400nm〜600nmのマックスプロット)。購入した標準試料で作成した検量線を基準としてゼアキサンチン含量を測定した。Carotenature(スイス・ルプジンゲン)から入手したtrans−ゼアキサンチンをメタノールに溶解した。この原液を使って、2.0μg/ml〜45.0μg/mlの濃度をカバーする5点外部検量線を作成した。9−cis−ゼアキサンチンは、応答係数を1:1と仮定して、trans−ゼアキサンチン検量線を使って定量した。ゼアキサンチン含量を全てのゼアキサンチン異性体の和として報告する。
(生産圃場のランダムサンプリング)
ランダムな本発明トウガラシ属植物個体の圃場試料10点を収穫した。莢から種子を取り除き、実験用脱水装置で脱水し、実施例6および8に記載の分析に付した。非エステル化型で測定した、各試料における総カロテノイド類に対するゼアキサンチンのパーセンテージを、以下に示す。
(生産圃場のランダムサンプリング)
ランダムな本発明トウガラシ属植物個体の圃場試料63点を収穫した。莢から種子を取り除き、実験用脱水装置で脱水し、実施例6、8および9に記載の分析に付した。非エステル化型で測定した、各試料における総カロテノイド類に対するゼアキサンチンのパーセンテージを、以下に示す。一部の試料については、遊離ジオールとして測定したゼアキサンチンの質量パーセントも示す。このHPLC法では、実施例8および9に記載の検量線を利用した。ASTA値およびASTAに基づくゼアキサンチン%は、実施例23の方法によって決定した。
(GC−EI−MSおよびGC−PFPDによる本発明のトウガラシ属品種の抽出物ならびにゼアキサンチンおよびルテインの商業的供給源におけるα−ターチオフェン(α−ターチエニル)レベルの決定)
分析は、Saturn 2000イオントラップ型質量分析計と接続したVarian 3800ガスクロマトグラフで行った。質量分析計は電子イオン化モードで運転し、40uから640uまでスキャンした。ピーク同定にはNIST Standard Reference Database(バージョン1.6)を使用した。GC−パルス式炎光光度検出器は供給元の仕様に従って硫黄特異的検出用に設定された。データ収集には、Varian Saturn GC/MSデータステーション(v5.51)を利用した。ガスクロマトグラフィーは、Supelco MDN−5S溶融石英キャピラリーカラム(30m×0.25mm内径,0.25μmフィルム(p/n24384))で行った。カラム流量は1.5mlヘリウム/分とした。インジェクター温度は240℃とした。検出器温度は230℃とした。オーブン温度プログラムは8℃/分で120℃から260℃まで、260℃で4.5分間維持とした。インジェクター分割比はPFPD分析用に1、およびGC−EI−MS実行用に20とした。注入体積は0.5μLとした。
(本トウガラシ属品種から得られるオレオレジンの鹸化およびより高いゼアキサンチンレベルを持つ組成物の製造)
ビグリュー蒸留塔と磁気撹拌子を装備した125mLエルレンマイヤーフラスコ中で、実施例4で得たオレオレジン(15.0g)、メタノール(15mL)および45%水酸化カリウム水溶液(6mL)を混合し、フラスコをアルミニウム箔で包んだ。その混合物を撹拌しながら1.5時間加熱還流した。その分散液を500mL丸底フラスコに軟水(30mL)を使って移した。その丸底フラスコからロータリーエバポレーターでメタノールを除去し、次にその溶液を600mLにビーカーに移し、そこに酢酸エチル(200mL)を加えた。その分散液を30分間撹拌し、アルミニウム箔で覆った分液漏斗に移した。液相は数時間後に相分離した。水相を酢酸エチル(200mL)で洗浄し、デカントした二つの酢酸エチル画分を合わせた。合わせた酢酸エチル溶液に軟水(100mL)を加え、その液液分散系を撹拌し、リン酸で中和した。その分散液を分液漏斗に移し、水層をデカントして取り除いた。分液漏斗に残っている酢酸エチル層にヘプタン(100mL)および軟水(25mL)を加え、その分散液を撹拌した。水層を除去し、有機相を、十分な酢酸エチルが除去されて固形物の形成が始まるまで、40〜45℃および圧力20インチでロータリーエバポーレーターにかけた。次に、そのスラリーを濾過し、この固形物の第1収穫をヘプタンですすいだ。固形物の第1収穫の収量は0.88gで、約58%ゼアキサンチンの純度だった。濾液を再びロータリーエバポレーターにかけて、残りの溶剤を除去することにより、さらなる固形物を含むオレオレジンを得た。ヘプタンを加え、その溶液を濾過することにより、固形物の第2収穫を得た。固形物の第2収穫の収量は0.43gで、約26%ゼアキサンチンの純度だった。第2濾液からヘプタンを蒸発させて、約968の測色値(American Spice Trade Association Method 20.1)を持つオレオレジンを得た。
(安定化オレオレジン)
実施例4で得たオレオレジンを、ゼアキサンチンの最終濃度が5%、添加したトコフェロール類の最終濃度が1%になるように、天然トコフェロール類および要すれば食用油と混合する。得られた液体を、ヒトまたは動物による摂取に適したゲルカプセルに封入する。
(安定化オレオレジン)
実施例4で得たオレオレジンを、ゼアキサンチンの最終濃度が5%、添加したトコフェロール類およびパルミチン酸アスコルビルの最終濃度が1%になるように、天然トコフェロール類、パルミチン酸アスコルビルおよび要すれば食用油と混合する。得られた液体を、ヒトまたは動物による摂取に適したゲルカプセルに封入する。
(安定化製剤)
実施例13で得たゼアキサンチン固形物を長鎖脂肪酸で再エステル化する。得られたゼアキサンチンエステルをアスコルビン酸、天然トコフェロール類、要すれば植物油および要すればローズマリー抽出物と共に製剤化して、5%ゼアキサンチン、5%アスコルビン酸、5%添加天然トコフェロール類および0〜5%ローズマリー抽出物を含有する完成品を得る。得られた液体を、ヒトまたは動物による摂取に適したゲルカプセルに封入する。
(安定化製剤)
実施例13で得たゼアキサンチン固形物を長鎖脂肪酸で再エステル化する。得られたゼアキサンチンエステルをパルミチン酸アスコルビル、天然トコフェロール類、要すれば植物油および要すればローズマリー抽出物と共に製剤化して、5%ゼアキサンチン、1〜5%パルミチン酸アスコルビル、5%添加天然トコフェロール類および0〜5%ローズマリー抽出物を含有する完成品を得る。得られた液体を、ヒトまたは動物による摂取に適したゲルカプセルに封入する。
(安定化製剤)
実施例13で得たゼアキサンチン固形物を食用油に分散させ、アスコルビン酸、天然トコフェロール類および要すればローズマリー抽出物と混合することにより、20%遊離(非エステル化)型ゼアキサンチン、5%アスコルビン酸、5%トコフェロールおよび0〜5%ローズマリー抽出物を含有する製品を得る。
(安定化製剤)
実施例13で得たゼアキサンチン固形物を食用油に分散させ、パルミチン酸アスコルビル、天然トコフェロール類および要すればローズマリー抽出物と混合することにより、20%遊離(非エステル化)型ゼアキサンチン、5%パルミチン酸アスコルビル、5%トコフェロールおよび0〜5%ローズマリー抽出物を含有する製品を得る。
(安定化製剤)
実施例13で得たゼアキサンチン固形物またはその固形物をさらに精製したものを食用油に分散させ、ルテイン、アスコルビン酸、天然トコフェロール類および要すればローズマリー抽出物と混合することにより、0〜20%ルテイン、1〜19%遊離(非エステル化)型ゼアキサンチン、1〜5%アスコルビン酸、5%トコフェロールおよび0〜5%ローズマリー抽出物を含有する製品を得る。
(安定化製剤)
実施例13で得たゼアキサンチン固形物またはその固形物をさらに精製したものを食用油に分散させ、ルテイン、パルミチン酸アスコルビル、天然トコフェロール類および要すればローズマリー抽出物と混合することにより、0〜20%ルテイン、1〜19%遊離(非エステル化)型ゼアキサンチン、1〜5%パルミチン酸アスコルビル、5%トコフェロールおよび0〜5%ローズマリー抽出物を含有する製品を得る。
(安定化製剤)
実施例4で得たオレオレジンを、ゼアキサンチンの最終濃度が2%、添加した天然トコフェロール類の最終濃度が1%になるように、天然トコフェロール類およびオリーブ抽出物と混合する。得られた液体を、ヒトまたは動物による摂取に適したゲルカプセルに封入する。
(種子を含む試料および種子を含まない試料に関する粉砕パプリカのASTA手順(ASTA法20.1を適応させたもの))
本トウガラシ属品種の種子を含むまたは種子を含まない粉砕成熟乾燥実莢肉(1.0g)を電子はかり(top loading balance)で秤量し、125mlエルレンマイヤーフラスコに定量的に移した。アセトン50mlをフラスコに加えた。その混合物を1分間ホモジナイズした。その溶液をブフナー漏斗を通して100mlメスフラスコ中に直接、減圧濾過した。全ての色素をエルレンマイヤーフラスコおよびブフナー漏斗からアセトンで濯ぎ出し、それらを合わせて、総体積をアセトンで100mlにした。1ml試料を100mlメスフラスコから25mlメスフラスコにピペットで移し、アセトンで合計25mlにした。分光光度計(BeckmanモデルDU650)を400nmから550nmまでの波長スキャンに設定し、アセトンブランクを使ってゼロ合わせをした。25mlメスフラスコ中の溶液の一部をセルに移し、スキャンを400nmから550nmまで行った。460nmでの吸光度を決定した。次の等式によってASTAを計算した。
ASTA値に基づくゼアキサンチンパーセント計算値は、次の式を使って計算した。
*E1%1CM純粋ゼアキサンチン=2340
<実施例24>
(遠心分離によるキサントフィル色素類の濃縮)
6.25%の総ゼアキサンチン(遊離ゼアキサンチンとして測定)を含有するオレオレジン量を、高速遠心分離器によって処理した。運転条件を変えて、数種類の濃縮物画分を作ったところ、そのうちの少なくとも一つは、12.55%の総ゼアキサンチン(遊離ゼアキサンチンとして測定)を含有した。この遠心分離によって得た上清は、抽出物全体に存在するレベルと比較して、クリプトキサンチンを濃縮された濃度で含んでいた。
(生産圃場のさらなるランダムサンプリング)
ランダムな本発明トウガラシ属植物個体の試料を収穫した。莢を実験用脱水装置で脱水し、分析に付した。乾燥果肉中のゼアキサンチンの濃度を、実施例26および27に記載するHPLC法で測定した。非エステル化型で測定した、総カロテノイド類に対するゼアキサンチンのパーセンテージも、実施例28に記載のHPLC法で測定した。各試料の分析結果を以下に示す。各試料のASTA値も、実施例23に記載した方法によって測定し、測定されたASTA値から、対応するゼアキサンチン質量パーセントを算出した。ASTA値のゼアキサンチン質量パーセントへの変換は、実施例23に記載の手順で計算した。
(HPLC分析のための種子を含む粉砕トウガラシ属の鹸化手順)
本トウガラシ属品種の粉砕した成熟乾燥実莢肉(0.5g)を、化学天秤で1ミリグラムの10分の1の位まで秤量し、125mlエルレンマイヤーフラスコに定量的に移した。光への曝露を減らすために、そのフラスコを直ちにアルミニウム箔で覆った。ブチル化ヒドロキシトルエン(0.2g,Sigma Chemical Company)および炭酸ナトリウム粉末(Aldrich Chemical−A.C.S.試薬)1.5gを秤量し、エルレンマイヤーフラスコに加えた。メタノール(Fisher Scientific−HPLC等級)50.0mlおよび水酸化カリウム(VWR Intl.)8粒(約0.8g)をエルレンマイヤーフラスコに加えた。その溶液に撹拌子を入れ、エルレンマイヤーフラスコの上部にビグリュー蒸留塔を装着した。その溶液をホットプレート上に置き、撹拌しながら弱く加熱(約65℃)して1時間還流した。次に、その溶液をホットプレートから降ろして冷ました。その溶液を中和するために、合計1.2mlのリン酸(JT Baker−A.C.S.試薬)を加えた。その溶液を、Celite(R)(Eagle Picher Filtration and Minerals,ネバダ州リノ)が入っているブフナー漏斗を通して、200mlメスフラスコ中に直接、減圧濾過した。全ての色素をエルレンマイヤーフラスコおよびブフナー漏斗からメタノールで濯ぎ出し、それらを合わせて、総体積をメタノールで200mlにした。フラスコを数回上下反転させた後、その溶液を0.45ミクロンPTFE Acrodisc(R)(Gelman)フィルターを装着した3ccシリンジに注ぎ込み、HPLC分析用の褐色バイアルに注入した。
(種子を含むトウガラシ属莢中および種子を含まないトウガラシ属莢中のゼアキサンチン含量(重量%)のHPLCによる決定)
分析は、データステーションにインストールされたEmpower(ビルド1154、データベースバージョン5.00.00.00)ソフトウェアを使って、Waters 2695(米国マサチューセッツ州ミルフォード)分離システムで行った。クロマトグラフィー分離は、逆相カラム(Waters Symmetry(R)C18,粒径5μm,250mm×4.6mm)で行った。溶離液は、メタノール/水/アセトンの三元勾配で、1.0ml/分とした。溶離液の初期組成はメタノール−水−アセトン(0:25:75,v/v/v)とした。初期直線勾配を15分間適用して、組成をメタノール−水−アセトン(20:5:75,v/v/v)にした。この組成を15分保った後、もう一つの直線勾配を5分間適用して、組成をメタノール−水−アセトン(0:0:100,v/v/v)にし、5分間保った。もう一つの直線勾配を5分間適用して初期状態とし、次の注入まで15分間保った。化合物は、20.0μlの注入体積を使って、Waters 2996フォトダイオードアレイ検出器により、分光光度法で検出した(400nm〜600nmのマックスプロット)。購入した標準試料で作成した検量線を基準としてゼアキサンチン含量を測定した。Indofine Chemical Company, Inc.から入手したtrans−ゼアキサンチンを90%のアセトン/10%の6%氷酢酸を含有するアセトンに溶解した。この原液をアセトンで希釈し、Beckman Coulter DU640分光光度計により452nmで測定した。その吸光度を、2340というE1%と共に用いることにより、原液の濃度を計算した。次に原液をアセトンで希釈して、4.0μg/ml〜75.0μg/mlの濃度をカバーする5点外部検量線を線形フィットで作成した。9−cis−ゼアキサンチンは、応答係数を1:1と仮定して、trans−ゼアキサンチン検量線を使って定量した。ゼアキサンチン含量を全てのゼアキサンチン異性体の和として報告する。システムチェック用試料(DSMゼアキサンチン20%FS;製品コード:5002001;ロット:UE00303001)を、25.0μg/ml〜45.0μg/mlのレベルで、分析当日に測定した。チェック用試料が予想値の5%以内にない場合に限り、結果を補正した。
(種子を含むトウガラシ属莢および種子を含まないトウガラシ属莢に関するHPLCによる総カロテノイド類に対するゼアキサンチンのパーセンテージ(面積%)の決定)
分析は、データステーションにインストールされたEmpower(ビルド1154、データベースバージョン5.00.00.00)ソフトウェアを使って、Waters 2695(米国マサチューセッツ州ミルフォード)分離システムで行った。クロマトグラフィー分離は、逆相カラム(Waters Symmetry(R)C18,粒径5μm,250mm×4.6mm)で行った。溶離液は、メタノール/水/アセトンの三元勾配で、1.0ml/分とした。溶離液の初期組成はメタノール−水−アセトン(0:25:75,v/v/v)とした。初期直線勾配を15分間適用して、組成をメタノール−水−アセトン(20:5:75,v/v/v)にした。この組成を15分保った後、もう一つの直線勾配を5分間適用して、組成をメタノール−水−アセトン(0:0:100,v/v/v)にし、5分間保った。もう一つの直線勾配を5分間適用して初期状態とし、次の注入まで15分間保った。化合物は、20.0μlの注入体積を使って、Waters 2996フォトダイオードアレイ検出器により、分光光度法で検出した(400nm〜600nmのマックスプロット)。文献の保持時間およびPDAスペクトルを使って、ピークの一部(ビオロキサンチン、アンテラキサンチン、9−cis−ゼアキサンチン、クリプトカプシン、α−クリプトキサンチン、ζ−カロテン)を同定した。他の化合物を同定し、Carotenature(スイス・ルプジンゲン)から得た標品と比較した。それらを以下に列挙する:カプソルビン、カプサンチン、trans−ゼアキサンチン、ルテイン、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、trans−β−カロテンおよびcis−β−カロテン。
(HPLC分析のための種子を含まない粉砕トウガラシ属の鹸化手順)
種子を含まない本トウガラシ属品種の成熟乾燥実莢肉(0.5g)を粉砕し、化学天秤で1ミリグラムの10分の1の位まで秤量し、125mlエルレンマイヤーフラスコに定量的に移した。光への曝露を減らすために、そのフラスコを直ちにアルミニウム箔で覆った。ブチル化ヒドロキシトルエン(0.2g,Sigma Chemical Company)および炭酸ナトリウム粉末(Aldrich Chemical−A.C.S.試薬)1.5gを秤量し、エルレンマイヤーフラスコに加えた。メタノール(Fisher Scientific−HPLC等級)50mlおよび水酸化カリウム(VWR Intl.)8粒(約0.8g)をエルレンマイヤーフラスコに加えた。その溶液に撹拌子を入れ、エルレンマイヤーフラスコの上部にビグリュー蒸留塔を装着した。その溶液をホットプレート上に置き、撹拌しながら弱く加熱(約65℃)して1時間還流した。次に、その溶液をホットプレートから降ろして冷ました。その溶液を中和するために、合計1.2mlのリン酸(JT Baker−A.C.S.試薬)を加えた。その溶液を、Celite(R)(Eagle Picher Filtration and Minerals,ネバダ州リノ)が入っているブフナー漏斗を通して、200mlメスフラスコ中に直接、減圧濾過した。全ての色素をエルレンマイヤーフラスコおよびブフナー漏斗からメタノールで濯ぎ出し、それらを合わせて、総体積をメタノールで200mlにした。フラスコを数回上下反転させた後、その溶液を0.45ミクロンPTFE Acrodisc(R)(Gelman)フィルターを装着した3ccシリンジに注ぎ込み、HPLC分析用の褐色バイアルに注入した。
(種子を含まないトウガラシ属の分析)
ランダムな本発明トウガラシ属植物個体の試料を収穫した。莢から種子を取り除き、実験用脱水装置で脱水し、分析のために実施例29に沿って処理した。乾燥果肉中のゼアキサンチンの濃度を、実施例27に記載のHPLC法で測定した。非エステル化型で測定した、総カロテノイド類に対するゼアキサンチンのパーセンテージも、実施例28に記載のHPLC法で測定した。各試料の分析結果を以下に示す。
(色素のHPLC分離)
赤パプリカと本発明の橙パプリカは、どちらも、未同定の色素をいくつか含有し、それらのスペクトルは、橙パプリカと比較して赤パプリカで作動する代替生合成経路が存在することを示している。黄色種では色素の約40%以上までが、現在、HPLCによって同定されていない。このような著しい相違があるので、黄色タイプはこれ以上考慮しない。
表3:橙色パプリカを赤色パプリカから識別するキー色素比
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Claims (64)
- 実莢を実らせ、かつ乾燥成熟実莢肉中にカロテノイド色素の過剰蓄積を示す、トウガラシ属(Capsicum)の植物またはその再生可能部分であって、非エステル型で測定した場合にゼアキサンチンが主要カロテノイドである、植物またはその再生可能部分。
- トウガラシ種(annuum)の一構成要素である、請求項1記載の植物またはその再生可能部分。
- パプリカ品種である、請求項2記載の植物またはその再生可能部分。
- ゼアキサンチンの質量が、非エステル化型で測定した場合に、総乾燥成熟実莢肉の0.4%より大きい、請求項1記載の植物またはその再生可能部分。
- 乾燥成熟実莢肉中の総カロテノイド類に対するゼアキサンチンのパーセンテージが50%より大きい、請求項1記載の植物またはその再生可能部分。
- ゼアキサンチンの質量が総乾燥成熟実莢肉の0.4%より大きい、請求項5記載の植物またはその再生可能部分。
- 実莢を実らせ、かつ乾燥成熟実莢肉中にゼアキサンチンを示す、トウガラシ属の植物またはその再生可能部分であって、ゼアキサンチンの質量が、非エステル化型で測定した場合に、総乾燥成熟実莢肉の0.6%より大きい、トウガラシ属の植物またはその再生可能部分。
- ゼアキサンチンの質量が総乾燥成熟実莢肉の0.7%より大きい、請求項7記載の植物またはその再生可能部分。
- ゼアキサンチンの質量が総乾燥成熟実莢肉の0.8%より大きい、請求項7記載の植物またはその再生可能部分。
- ゼアキサンチンの質量が総乾燥成熟実莢肉の0.9%より大きい、請求項7記載の植物またはその再生可能部分。
- 乾燥成熟実莢肉において175より大きいASTA値を示す、請求項3記載の植物またはその再生可能部分であって、ゼアキサンチンが、総色素類のHPLC面積カウントの約50%より高いレベルで存在する、植物またはその再生可能部分。
- 乾燥成熟実莢肉において200より大きいASTA値を示す、請求項11記載の植物またはその再生可能部分。
- 乾燥成熟実莢肉において225より大きいASTA値を示す、請求項11記載の植物またはその再生可能部分。
- 乾燥成熟実莢肉において275より大きいASTA値を示す、請求項11記載の植物またはその再生可能部分。
- ゼアキサンチンの質量が総乾燥成熟実莢肉の0.4%より大きい、請求項11記載の植物またはその再生可能部分。
- 総色素類のHPLC面積カウントの約10%より少ないカプサンチンおよびカプソルビンの含量を特徴とする、請求項11記載の植物またはその再生可能部分。
- 総色素類のHPLC面積カウントの約7%より少ないカプサンチンおよびカプソルビンの含量を特徴とする、請求項16記載の植物またはその再生可能部分。
- 総色素類のHPLC面積カウントの約60%より多いゼアキサンチン含量を特徴とする、請求項11記載の植物またはその再生可能部分。
- 総色素類のHPLC面積カウントの約70%より多いゼアキサンチン含量を特徴とする、請求項18記載の植物またはその再生可能部分。
- 請求項11記載の植物またはその再生可能部分から得られるオレオレジン組成物。
- 再生可能部分が、胚、***組織、花粉、葉、葯、胚珠、根、根端、実莢、種子、花弁、花、繊維、さや(bolls)、およびプロトプラストまたはそこから得られるカルスからなる群より選択される、請求項1記載の植物またはその再生可能部分。
- 請求項1記載の植物またはその再生可能部分の細胞培養物または組織培養物。
- 請求項1記載の再生可能部分の接木植物または子孫。
- 適切な環境に植えて成熟するまで栽培した場合に請求項1記載のトウガラシ属の植物をもたらす種子。
- 一方の祖先が請求項1記載のトウガラシ属品種である、雑種トウガラシ属植物。
- 請求項1記載の植物またはその再生可能部分のゲノム。
- 請求項1記載のトウガラシ属植物またはその再生可能部分から得られるゼアキサンチンを含む植物抽出物組成物。
- 請求項2記載のトウガラシ属植物またはその再生可能部分から得られるゼアキサンチンを含む植物抽出物組成物。
- 請求項3記載のトウガラシ属植物またはその再生可能部分から得られるゼアキサンチンを含む植物抽出物組成物。
- リップスティック、ローション、セッケン、ファンデーション、マスカラ、アイシャドー、ボディースクラブ、日焼けローション、マッド、パック、マスク、シャンプー、コンディショナーおよび練り歯磨きから選択される化粧品および洗浄調合物中の成分である、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- 動物用飼料補助剤中の成分である、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- 食品および飲料中の成分である、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- 食品、飲料、および動物用飼料中の着色剤である、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- ゼアキサンチンが、モノエステル、ジエステル、遊離アルコール型、またはそれらの組み合わせの形態をとっている、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- ゼアキサンチンが全trans幾何異性体もしくはcis幾何異性体またはそれらの組み合わせである、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- 固形または半固形である、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- 形態が粉末、ビーズレット、水分散性粉末、結晶、無定形固体、および封入固体から選択される、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- 乳液状である、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- カプセル剤、錠剤、ビーズレット、タイトレーションパック、散剤、滴剤、口中錠、噴霧剤、シロップ剤、速溶性ストリップおよび徐放性カプセル剤から選択される摂取可能な形態をした、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- 皮膚貼付剤、注射用液剤、滴剤、坐剤、局所外用ローション剤、クリーム剤、および噴霧剤から選択される摂取可能でない形態をした、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- シソ科(Labiatae)香草(ローズマリー、セージ、オレガノ、ペパーミント、バジル、スペアミント、サマーセイバリーを含む)の抽出物、オリーブ抽出物、コーヒー抽出物、柑橘抽出物、茶抽出物、茶カテキン類、カテキン、エピカテキン、没食子酸エピカテキン、没食子酸エピガロカテキン、没食子酸、トコフェロール類、トコトリエノール類、アスコルビン酸およびアスコルベート類(パルミチン酸アスコルビルを含む)、エリトルビン酸およびエリトルベート類、グルタチオン、カルノシン酸、カルノソール、ロスマノール、ロズマリン酸、サルビアフラシド(salviaflaside)、フラボノイド類もしくはフラボノイドグルクロニド類(ケルセチン(quercitin)、ルテオリン、アピゲニン、もしくはケルセチン、ルテオリンおよびアピゲニンのグルクロニドなどを含む)、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヒドロキシチロソール、オリューロペイン、BHT、BHA、ヒドロキシルアミン類、没食子酸プロピル、エトキシキン、トロロックス(Trolox)もしくはTBHQ、またはそれらの混合物をさらに含む、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- ベニノキ(Bixa orellana)、ウコン(Curcuma longa)、ニンジン(Daucus carota sativa)、トウガラシ(Capsicum annuum:本発明の品種ではないもの)、ドナリエナサリナ(Dunaliella salina)、ヘマタコッカスプルバルス(Haematacoccus pluvalus)の抽出物、β−カロテン、β−アポ−8−カロテナール、β−アポ−8−カロテン酸のエチルエステル、合成着色剤(FD&C着色剤)、および/またはそれらの混合物をさらに含む、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- ヒトおよび動物の眼の健康のためおよび/または白内障、加齢性黄斑変性症、色素性網膜炎、アッシャー症候群、シュタルガルト病、ベスト病、進行性錐体ジストロフィーおよび網膜劣化(retinal degradation)を含む眼疾患を発症するリスクを低下させるために摂取される、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- 癌関連疾患、心血管疾患、炎症性障害および神経系疾患を含むヒトまたは動物の疾患を処置または予防するために摂取される、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- 癌関連疾患が乳癌、胃癌および黒色腫から選択される、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- 炎症性障害が多発性関節炎および慢性関節リウマチから選択される、請求項27記載の植物抽出物組成物。
- 請求項1記載の植物またはその再生可能部分から得られるオレオレジン組成物。
- ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、および他のカロテノイド類を含む、請求項47記載のオレオレジン組成物。
- ターチオフェン類を実質的に含まない、請求項47記載のオレオレジン組成物。
- スパイス抽出物に関する21 CFR §73規則の要件を満たす、請求項47記載のオレオレジン組成物。
- 請求項1記載の植物から得られる搾り滓(presscake)。
- 全形または破砕形である、請求項1記載の植物の新鮮または乾燥果実。
- 請求項1記載の植物から得られる鹸化産物。
- 天然香料および合成香料を含む、請求項1記載の植物から得られる調味および着香組成物。
- 動物用およびヒト用食品のための、請求項1記載の植物から得られる着色、着香および/または保存加工組成物。
- 加齢性黄斑変性症、網膜変性症、白内障、心血管疾患および癌を含む変性疾患またはフリーラジカル介在性疾患を予防する方法であって、ヒトを含む生きた動物体に、請求項1記載の植物またはその再生可能部分から得られるゼアキサンチンを、前記疾患の予防にとって栄養的に有効な量で投与するステップを含む方法。
- 加齢性黄斑変性症、網膜変性症、白内障、心血管疾患および癌を含む変性疾患またはフリーラジカル介在性疾患を処置する方法であって、ヒトを含む生きた動物体に、請求項1記載の植物またはその再生可能部分から得られるゼアキサンチンを、前記疾患を患う対象に治療上の利益を与えるのに有効な量で投与するステップを含む方法。
- 白内障、網膜変性症、加齢性黄斑変性症、シュタルガルト病、ベスト病、進行性錐体ジストロフィー、色素性網膜炎、コロイデレミア、アッシャー症候群および糖尿病性網膜症から選択される眼の障害を発症するリスクを低下させる方法であって、ヒトを含む生きた動物体に、請求項1記載の植物から得られるゼアキサンチンを投与するステップを含む方法。
- 癌関連疾患、心血管疾患、炎症性障害、神経系疾患から選択されるフリーラジカル介在性疾患を発症するリスクを低下させる方法であって、ヒトを含む生きた動物体に、請求項1記載の植物から得られるゼアキサンチンを投与するステップを含む方法。
- 癌関連疾患が乳癌、胃癌および黒色腫から選択される、請求項59記載の方法。
- 炎症性障害が多発性関節炎および慢性関節リウマチから選択される、請求項59記載の方法。
- 動物用およびヒト用食品を着色、着香、および/または保存加工するための方法であって、前記動物用およびヒト用食品に、請求項1記載の植物またはその再生可能部分から得られる抽出物組成物を組み入れるステップを含む方法。
- 動物用およびヒト用食品を着色、着香、および/または保存加工するための方法であって、前記動物用およびヒト用食品に、請求項1記載の植物またはその再生可能部分から得られるゼアキサンチンを組み入れるステップを含む方法。
- 高純度の非エステル化ゼアキサンチンを取得する方法であって、
(a)請求項1記載の植物またはその再生可能部分から得た粉砕成熟実莢を、その実莢からゼアキサンチンを抽出するのに十分な時間、溶剤と接触させること、
(b)溶剤およびそこに溶解している抽出物を、残りの植物材料から分離すること、
(c)抽出物を脱溶剤化してゼアキサンチンオレオレジンを得ること、
(d)pHを下げるために、ゼアキサンチン抽出物をブチル化ヒドロキシトルエン、炭酸ナトリウムおよび水酸化カリウムと共に暗所で還流すること、および
(e)溶液を中和して純粋な非エステル化ゼアキサンチンの溶液を生じさせること
を含む方法。
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