JP2008526973A - 標的治療薬を作製する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は、個々の患者または患者の亜集団に合わせて調整した治療薬を作製する方法、またこのような治療薬を用いて、悪性疾患、病原体感染および他の状態を治療する方法、ならびに移植拒絶反応を減少させるかまたは阻止する方法に関する。
多くの悪性細胞は、悪性疾患のタイプに特異的であるばかりでなく、個々の患者にも特異的であるエピトープを示す。ある態様では、本発明は悪性リンパ球上に示されるエピトープのような患者特異的なエピトープを標的にできる治療薬に関する。
様々な態様において、細胞表面マーカー(例えばエピトープ、イディオタイプなど)、または悪性腫瘍細胞、病原体、移植された細胞、および/または治療の標的にされる他の物により、あるいはその極めて近傍で発現の異なる他の分子を標的にすることにより、広範な状態の治療に有効な、標的治療薬を開発するための方法が本明細書において提供される。また本明細書に記載する方法により生成される治療薬を投与することにより、疾患または状態を治療する方法も提供する。
図面の簡単な説明
図1、標的エピトープ結合タンパク質および免疫エフェクター抗体を含む複合体は、細胞表面上に発現したFabイディオタイプを介して悪性細胞と反応した。
好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書中で用いられる用語「Tリンパ球」および「T細胞」は、T細胞前駆体から成熟T細胞までの、Tリンパ球系列内のあらゆる細胞を包含する。
これは、以下の式によって説明される。
効率的な進化のための複製の公称最小回数は、以下の式を用いて推定してもよい。
選択的改善が突然変異r離れており、突然変異率pである長さn配列がある場合、複製において選択的改善が生じる確率は以下のように決定してもよい:
r=1では、適当な点での突然変異の確率(p)×その突然変異が、開始点とは異なる3個のヌクレオチドの目的ものに変異する確率(1/3)×他のn−1部位が、変異しないままである確率(1−p)(n-r)、または
P3=1.51×10-9
したがって、有利である次のアミノ酸に合理的に到達することを予測するためには、その突然変異率において:
精製に対する制限
BおよびCがAに対して競合する可逆的結合において:
[B]T=[B]+[AB](3)
[C]T=[C]+[AC](4)
(3)を(4)で割り算し:
以下の方程式において:
当業者は、いくつかの異なる方法でSATAを生成することができることを理解するであろう。以下の実施例中に記載したプロトコルは、tRNA上にピューロマイシンおよび架橋剤の両方を有するSATA、またはtRNA上にピューロマイシンを有しmRNA上に架橋剤を有するSATAに用いることができる。架橋剤がmRNA上にあるものは、以下の実施例4に指針が提供されている。好ましい実施形態において、連結tRNA類似体もtRNA上に架橋剤を有するという意味で、以下のプロトコルは連結tRNA類似体についても有用である。
モノ付加体の精製
次いで、参照として本明細書に組み込まれているSastryら、J.Photochem.Photobiol.B Biol.、14:65〜79に記載のHPLCによってモノ付加体を精製した。一般に25量体以上のモノ付加体の精製は困難なので、フラグメント2がフラグメント3から分離されたことで、精製ステップが容易になった(参照として本明細書に組み込まれているSpielmannら、PNAS、89:4514〜4518)。
フラグメント2および3のライゲーション
T4 RNAリガーゼを用いて、フラグメント2を フラグメント3にライゲーションした。3’末端のピューロマイシンは保護基として役割を果たした。これは参照として本明細書に組み込まれているRomaniukとUhlenbeck、Methods in Enzymology、100:52〜59(1983)により実施する。フラグメント2+3とフラグメント1の3’末端との結合は、参照として本明細書に組み込まれているUhlenbeck、Biochemistry、24:2705〜2712(1985)に記載の方法に従って実施した。フラグメント2+3をポリヌクレオチドキナーゼによって5’リン酸化し、2つの半分子をアニールした。
さらに、UAAまたはUGAも用いた。様々な実施形態では、「連結コドン」として選択されたストップコドンを有する任意のメッセージを用いた。
実施例2:ソラレン化したフラン側鎖のモノ付加体の生成
RNA:DNAハイブリッドのUV光露光
いずれも50mMのNaClを含む、等容積の3ng/mlのRNA:cRNAハイブリッドセグメントおよび10μg/mlのHMTを、新しい1.5mlのキャップ付ポリプロピレンマイクロ遠心チューブに移し、37℃で30分間、暗所でインキュベートした。次いで、これを新しい清浄な培養皿に移した。これを、照射量が約6.5mW/cm2であるように約12.5cmの距離で光化学反応器(419nmのピーク、Southern New England Ultraviolet Co.)内に配置し、60〜120分間照射した。
100μlのクロロホルム−イソアミルアルコール(24:1)をピペットで注ぎ、ボルテックスによって混合した。混合物をマイクロ遠心チューブ中で、5分間、15000×gで遠心分離した。クロロホルム−イソアミルアルコール層をマイクロピペットで除去した。クロロホルム−イソアミルアルコールによる抽出を再度繰り返した。透明なRNAが溶液から沈殿した。
2倍量(約1000μl)の氷冷無水エタノールを混合物に加えた。チューブを15分間、15,000×gで、マイクロ遠心機で遠心分離した。上清をデカンテーションして廃棄し、沈殿したRNAを100μlのDEPC処理水に再溶解し、その後、再度RNA+8−MOPに曝した。
全ての成分、ガラス器具および試薬は、RNAaseフリーのように調製した。HPLCはDionex DNAPA−100パッケージカラムを用いてセットアップした。ソラレン化したRNA:DNAハイブリッドを4℃まで暖めた。ソラレン化したRNAをHPLCにかけ、次いで「HPLCによるオリゴヌクレオチド解析」という表題の以下のセクションに記載のように、オリゴヌクレオチド解析を行った。採取された分画は以下を表した:
・5’CUAGAΨCUGGAGG3’、ここで、Ψはプソイドウリジンである(配列番号1)
・フラン側鎖の5’CUPソラレンAGAΨCUGGAGG3’モノ付加体(配列番号:2)
電気泳動ユニットを4℃の冷蔵庫内にセットアップした。2mmのスペーサーを有するゲルを選択した。各HPLC分画の5μlをローディング緩衝液で10μlまで希釈した。10μlの各希釈した分画を適切に標識した試料ウェルに入れた。追跡用色素を別のレーンに載せ、「ソラレン化したRNAフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)」という表題の以下のセクションに記載のように電気泳動を行った。電気泳動の実行が完了したあと、追跡用色素がゲルの端に達した時に電気泳動を停止した。装置を解体した。ゲル−ガラスパネルユニットをUV光ボックス上に置いた。UV光を点けた。RNAのバンドを同定した。バンドはUV光の条件下でより濃い影として現れた。
各バンドを滅菌して、RNAaseフリーの新しいメスの刃を用いて切り出し、新しい1.5mlのスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに移した。メスの刃の側面を用いて、各ゲルをマイクロ遠心チューブの壁でつぶした。各試料に新しい刃を用いた。1.0mlの0.3M酢酸ナトリウムを各チューブに加え、少なくとも24時間、4℃で溶出させた。マイクロピペットを用いて溶出液を新しい0.5mlのスナップキャップ付ポリプロピレンマイクロ遠心チューブに移した。各チューブに新しいRNAaseフリーのピペットチップを用い、RNAをエタノールで沈殿させた。
2倍容量の氷冷エタノールを各溶出液に加え、マイクロ遠心機で、15,000×gで15分間遠心分離した。上清を排出し、沈殿したRNAを再度100μlのDEPC処理脱イオン水に溶かした。RNAは必要時まで4℃でマイクロ遠心チューブに保存した。保存が2週間を超える場合、チューブを−20℃で保存した。以下が、各フラグメントの移動速度の順(速いものから遅いものの順)であった:
エタノール沈殿
RNAオリゴヌクレオチドフラグメントを沈殿させ、RNaseの痕跡を全て取り除くために、全てのガラス器具を「装置上、消耗品上、および溶液中のRNasesの不活化」という表題の以下のセクションに記載のように洗浄した。全ての溶液はRNAaseフリーのガラス器具中で保存し、ヌクレアーゼの導入を防いだ。無水エタノールは使用時まで0℃で保存した。マイクロピペットを用いて、2倍容量の氷冷エタノールをマイクロ遠心チューブ内で沈殿させる核酸に加えた。キャップ付マイクロ遠心チューブをマイクロ遠心器内に入れ、15,000×gで15分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿したRNAを再度DEPC処理脱イオン水に溶かした。RNAは使用の準備ができるまで、マイクロ遠心チューブ中に4℃で保存した。
RNAフラグメント2および3のライゲーション
RNaseの痕跡を全て取り除くために、全てのガラス器具を「装置上、消耗品上、および溶液中のRNaseの不活化」という表題の以下のセクションに記載のように洗浄した。100〜1000μlのピペットを用いて以下を新しい1.5mlのポリプロピレンスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに加え、各溶液に新しい滅菌したピペットチップを用いた:
フラグメント2(3.0nM) 125.0μl
フラグメント3(3.0nM) 125.0μ1
反応緩衝液 250.0μ1
RNA T4リガーゼ(9〜12U/ml) 42μl
反応緩衝液
RNaseを含まない脱イオン水 90.00ml
トリス−HCl(50mM) 0.79g
MgCl2(10mM) 0.20g
DTT(5mM) 0.078g
ATP(1mM) 0.55g
HClを用いてpHは7.8
RNaseを含まない脱イオン水で100.00mlに調整
混合物を穏やかに混合し、混合物を温度制御した冷蔵庫内で、16℃で1時間インキュベートしてRNAを溶解した。インキュベーション完了後直ちに、RNAを溶液から沈殿させた。
2倍容量(約1000μl)の氷冷無水エタノールを反応混合物に加えた。マイクロ遠心チューブを15,000×gで15分間マイクロ遠心機内に置いた。上清をデカントして捨て、沈殿したRNAを100μlのDEPC処理水に再溶解した。混合物を「ソラレン化したRNAフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)」という表題の以下のセクションに記載のように電気泳動した。以下が、各フラグメントの移動速度の順(速いものから遅いものの順)であった:
a) フラグメント2
RNAフラグメント1とフラグメント2+3とのライゲーション
RNaseの痕跡を全て取り除くために、全てのガラス器具を「装置上、消耗品上、および溶液中のRNaseの不活化」という表題の以下のセクションに記載のように洗浄した。以下を新しい1.5mlのポリプロピレンスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに加えた。各溶液に100〜1000μlのピペットおよび新しいチップを用いた:
フラグメント2+3(3.0nM) 125.0μl
反応緩衝液 250.0μl
T4ポリヌクレオチドキナーゼ(5〜10U/ml) 1.7μl
反応緩衝液
RNaseを含まない脱イオン水 90.00ml
トリス−HCl(40mM) 0.63g
MgCl2(10mM) 0.20g
DTT(5mM) 0.08g
ATP(1mM) 0.006g
HClを用いてpHは7.8
RNase含まない脱イオン水で100.00mlに調整
RNAを穏やかに混合し、その後、加熱ブロック内で、混合物を70℃まで5分間加熱し、融解した。混合物を2時間かけて室温まで冷却し、RNAをtRNAの立体配置でアニールさせた。RNAを溶液から沈殿させた。
2倍容量(約1000μl)の氷冷無水エタノールを反応混合物に加えた。マイクロ遠心チューブを15,000×gで15分間マイクロ遠心機内に置いた。上清をデカントして捨て、沈殿したRNAを100μlのDEPC処理水に再溶解した。混合物を「ソラレン化したRNAフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)」という表題の以下のセクションに記載のように電気泳動した。以下が、各フラグメントの移動速度の順(速いものから遅いものの順)であった:
a) フラグメント1
以下を新しい1.5mlのポリプロピレンスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに加えた。各溶液に100〜1000μlのピペットおよび新しいチップを用いた:
フラグメント1+2+3(3.0nM) 250μl
反応緩衝液 250μl
RNA T4リガーゼ(44μg/ml) 22μg
混合物を温度制御した冷蔵庫内で、17℃で4.7時間インキュベートした。インキュベーションの直後、上記ステップ6.2に記載のようにtRNAを沈殿させ、「ソラレン化したRNAフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)」という表題の以下のセクションに記載したように電気泳動によりtRNAを分離した。tRNAを少量のRNaseを含まない水にプールし、2週間までは4℃で、または2週間を超える長い期間は−20℃で保存した。
ソラレン化したRNAフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)
アクリルアミドゲルの調製
全ての試薬およびガラス器具は、「装置上、消耗品上、および溶液中のRNaseの不活化」という表題の以下のセクションに記載のようにRNAaseフリーのようにした。ゲル装置を組み立てて厚さが4mmで20cm×42cmの四角いゲルを作製した。RNAaseフリーの厚肉エルレンマイヤーフラスコ内で、適量のアクリルアミド溶液を用いて、29部のアクリルアミドと1部のアンモニウム架橋剤を室温で混合した。
尿素(7M) 420.42g
TBE(1×) 1Lに調整
(5×TBE)
0.455M トリスHCl 53.9g
10mM EDTA 0.5Mを20ml
RNAaseフリーの脱イオン水 900ml
ホウ酸を用いて pH9
RNAaseフリーの脱イオン水を用いて 1Lに調整
混合物を1分間真空圧で脱気した。適量のTEMEDを加え、穏やかに混合し、その後、ゲル混合物をガラスプレートの間に上部から0.5cm以内まで注いだ。すぐにガラスシートの間のゲル混合物内に櫛を挿入した。RNAaseフリーのゲル用櫛を用いた。櫛で5mm幅の色素レーンおよび135mmの試料レーン用のウェルを作製した。ゲルを約30〜40分間重合させ、その後、注意しながら櫛を取り外した。新しいピペットチップを備えたマイクロピペットを用いて試料ウェルを泳動緩衝液ですすいだ。その後、ウェルに泳動緩衝液を満たした。
試料のアリコートをスナップキャップ付マイクロ遠心チューブ中のローディング緩衝液に懸濁させ、ボルテックスした。指示色素は試料に加えなかった。
尿素(7M) 420.42g
トリスHCl(50mM) 7.85g
RNAaseフリーの蒸留水を用いて 1Lに調整
電気泳動の実行
最大量のRNA/ローディング緩衝液溶液を135mmの試料ウェルにセットし、適量の追跡用色素を5mmの追跡用レーンに載せた。試料を5℃の冷蔵庫で電気泳動した。追跡用色素がゲルの端に達したら電気泳動を停止した。装置を解体した。ガラスパネルはゲルから取り外さなかった。ゲル−ガラスパネルユニットをUV光ボックス上に置いた。UVフィルタリングゴーグルを装着してUV光を点けた。RNAのバンドを同定した。バンドはUV光条件下でより濃い影として現れた。RNAをゲルから抽出した。各バンドを滅菌したRNAaseフリーの新しいメスの刃を用いて切り出し、各バンドを新しい1.5mlのスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに移した。メスの刃の側面を用いて、各ゲルをマイクロ遠心チューブの壁でつぶした。各試料に新しい刃を用いた。1.0mlの0.3M酢酸ナトリウムを各チューブに加え、少なくとも24時間、4℃で溶出した。各チューブにRNAaseフリーの新しいピペットチップを備えたマイクロピペットを用いて、溶出液を新しい0.5mlのスナップキャップ付ポリプロピレンマイクロ遠心チューブに移した。2倍容量の氷冷エタノールを各溶出液に加え、次いでマイクロ遠心機で、15,000×gで15分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿したRNAを100μlのDEPC処理脱イオン水に再溶解した。RNAは必要時まで4℃でマイクロ遠心チューブに保存した。
HPLCによるオリゴヌクレオチド解析
RNAオリゴヌクレオチドのHPLC精製は陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて最も良好に達成される。2’−保護または2’−脱保護の型のいずれもククロマトグラフィーによって分離できる。2’−保護の型は、二次構造効果を最小限に抑える利点を提供し、ヌクレアーゼに対して耐性を与える。RNAが完全に脱保護されている場合は、精製中は無菌的な条件が必要である。
チューブを15,000×gで、30秒間またはRNAペレットが底部に存在するまで遠心分離する。400μlのpH3.8脱保護緩衝液を、RNAの各チューブに添加する。
酢酸(100mM)を、テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を用いてpH3.8に調整する。ピペットで吸入と排出とを行って、ペレットを緩衝液中に完全に溶解する。チューブを10秒間ボルテックスし、15,000×gで遠心分離する。チューブを、60℃の水浴で30分間インキュベートする。試料は、使用前に凍結乾燥する。
260nmで40吸光度単位(ODU)のキャパシティを有するDionex(800)−DIONEX−0(346−6390)で充填された4×250 mmカラム(DNAPAC PA、No.043010)を設置する。カラム温度は、54℃にセットする。注入量を、5μlが約0.20ODUをもたらすように調整する。
溶出緩衝液
オリゴ17〜32塩基対長に対して、緩衝液Bの30%〜60%の勾配が用意される:
勾配は、以下のとおり塩基数に基づき選択される:
装置上、消耗品上、および溶液中のRNasesの不活化
ガラス器具は、180℃で少なくとも8時間ベーキングすることにより処理した。プラスチック器具は、クロロホルムですすぐことにより処理した。あるいは、全てのものを0.1%のDEPCに浸した。
0.1%のDEPCを調製した。脱イオン水を0.2μMの膜フィルターで濾過した。水を15psiで15分間、液体サイクルでオートクレーブした。1.0g(wt/v)のDEPC/リットルの無菌的な濾過水を加えた。
全てのガラスとプラスチック器具を、0.1%DEPCに37℃で2時間浸した。
ガラス器具を少なくとも5回、殺菌した脱イオン水ですすいだ。ガラス器具は、15分間100℃までに加熱するか、または15psiで15分間、液体サイクルでオートクレーブした。
泳動槽を洗剤で洗浄し、水、次いでエタノールですすぎ、空気乾燥した。泳動槽に3%(v/v)の過酸化水素(30ml/L)を満たし、10分間室温で放置した。泳動槽をDEPC処理水で少なくとも5回すすいだ。
全ての溶液は、Rnaseを含まないガラス器具、プラスチック器具、オートクレーブした水、RNAを用いる作業のための化学薬品、およびRNaseを含まないスパーテルを用いて作製した。使い捨ての手袋を用いた。可能な場合は、溶液を0.1%のDEPCで少なくとも12時間、37℃で処理し、その後、100℃までに15分間加熱するか、または15分間15psiで、液体サイクルでオートクレーブした。
RNAの翻訳
20μl/mlの濃度の腸阻害ペプチド(GIP)mRNA、2μlを、250μlのスナップキャップポリプロピレンマイクロ遠心チューブに入れた。35μlのウサギ網状赤血球溶解物(Promegaから購入可能)を加えた。メチオニンを含まないアミノ酸混合物(Promegaから購入可能)を1μl加えた。35S メチオニンまたは非標識のメチオニンを1μl加えた。35S GIPmRNAまたは非標識のGIPmRNAを2μl加えた。任意選択で、対照として役割を果たすために2mlのルシフェラーゼを一部のチューブに加えてもよい。好ましい実施形態では、GIPmRNAの代わりにルシフェラーゼを用いた。当業者は、実際に適切な配列を含む任意のmRNAフラグメントを用い得ることを理解するであろう。
実施例3:プソイドウリジンを用いたSATAの生成
上記のように、当業者は、SATA、連結tRNA類似体およびナンセンスサプレッサーtRNAを、多くの異なる方法により生成することができることを理解するであろう。図5はウリジンおよびプソイドウリジンの化学構造を示す。プソイドウリジンは、ウリジンと同じように水素結合を形成するが、ソラレンの標的である5−6二重結合を欠くtRNAにおいて見出される天然の塩基である。本明細書中で用いるプソイドウリジンには、天然に存在する塩基および任意の合成類似体または修飾体が含まれる。好ましい実施形態では、プソイドウリジンを用いてSATAを生成した。連結tRNA類似体もプソイドウリジンを用いて生成することができる。具体的には、好ましい実施形態では、3つのフラグメント(図1)を商業的な供与源(Dharmacon Research Inc.、Boulder,CO)から購入した。それぞれの3’末端にピューロマイシンおよびPO4を事前に結合させた、修飾された塩基およびフラグメント3(「フラグメント3」)が含まれ、これらは全て市販されている。3つのフラグメントは、モノ付加体の形成においてフラグメント2(「フラグメント2」)の操作を容易にするために用いた。いくつかの実施形態によれば、3つのフラグメントの配列は以下のとおりである(各フラグメントにつき2つの配列例を提供する):
フラグメント1
フラグメント2の標的ウリジンを用いたフラン側鎖のソラレンモノ付加体の形成を以下のように行った。
トリスHCL 25mM
NaCl 100mM
EDTA 0.32mM
pH 7.0
次いで、4’ヒドロキシメチル−4,5’,8’−トリエチルソラレン(HMT)を最終濃度0.32mMまで加え、等モル量のフラグメント2およびcRNAをフラグメント2:cRNA:ソラレンの最終モル比=1:1:1000まで加えた。100μlの全容量を一度に照射した。
1)PCRサーモサイクラーを用いて、85℃まで60秒間加熱し、次いで4℃まで15分間かけて冷却した。
ステップ2:HPLCによるHMTとコンジュゲートしたフラグメント2(2MA)オリゴの精製
1)反応混合物を高速真空(speed vacuum)で10分間乾燥させ、その後、2μlの0.1MのTEAA、pH7.0の緩衝液に溶解した。
酢酸 5.6ml
トリエチルアミン 13.86ml
H2O(RNAaseフリーの) 950ml
酢酸を用いてpHを7.0に調整し、水を加えて1Lにする
2)試料を、緩衝液A(0.1MのTEAA、pH7.0中5%wt/wtのアセトニトリル)で事前に平衡化したWaters Xterra MS C18、2.5μm、4.5×50mmの逆相カラムに載せた。試料を、緩衝液Aに対して0〜55%の緩衝液B(0.1MのTEAA、pH7.0中15%wt/wtのアセトニトリル)の勾配で、35分間の時間フレームをかけて、1ml/分の流速で溶出した。カラム温度は60℃であり、狭帯域フィルターによって設定した検出波長は340nmであった。フラン側鎖のソラレンモノ付加体は340nmで吸収するが、RNAおよび任意のピロン側鎖のモノ付加体は吸収しない。緩衝溶液は使用前に濾過し脱気した。
ステップ3:HPLCによるHMTとコンジュゲートした、cRNAからのフラグメント2オリゴの精製
乾燥した試料をプールし、その後、0.5×TE緩衝液に溶かした。約0.4吸光単位の試料を、緩衝液C(25mMのトリス−HCl、pH8.0)で事前に平衡化したDionex DNAPac PA−100(4×250mm)カラムに載せた。カラム温度は85℃であった(陰イオン交換HPLC)。
C:25mMトリス−HCl pH8.0、
D:25mMのトリス、pH8.0の緩衝液中250mMのNaClO4、
TE:1mMのEDTAを含む10mMトリス−HCl、pH8.0
ステップ4:精製した2MAオリゴの脱塩、沈殿および採取
乾燥した分画を100μlのRnaseを含まない蒸留水に再溶解した。0.5Mの(NH4)2CO3を含む500μlの100%冷エタノールを加え、混合物を短時間ボルテックスした。その後、混合物を60分間ドライアイス上で凍結させるか、または−20℃で一夜保存した。
ステップ5:2MAオリゴのフラグメント3オリゴへのライゲーション
以下のステップを実施した。
ヌクレアーゼを含まない水(Promega)
ポリエチレングリコール(PEG8000、Sigma)40%(水中のwt/wt)
RNasin(登録商標)リボヌクレアーゼ阻害剤(Promega)
フェノール:クロロホルム
滅菌1.5mlマイクロ遠心チューブ
100%エタノール
70%エタノール
ドライアイスまたは−20℃の冷凍庫
室温および+4℃のマイクロ遠心機
PCRサーモサイクラーまたは水浴
B.以下の反応条件を用いた:
50mMトリス−HCl(pH7.8)
10mM MgCl2、
10mM DTT
1mM ATP
18〜20%のPEG
C.以下の反応混合物を無菌的なマイクロ遠心チューブ内で構築した:
フラグメント3(ドナー)1μl(6μg)(必要な場合は、ドナーとして用いる前に精製した)
2MA(アクセプター)1μl(1.5μg)。
10×リガーゼ緩衝液 4μl
10mMのATP 4μl
Rnase OutまたはRnasin(40単位/μl)Promega 0.5μl
PEG、40%(Sigma) 20μl
T4 RNAリガーゼ(10単位/μl)(NEB) 1μl
ヌクレアーゼを含まない水を加えて全容積を40μlとした。混合物を16℃で一夜(16時間)インキュベートした。混合物を短時間遠心分離し、次いで氷上に置いた。
60μlのDEPC RNaseを含まない蒸留水を混合物に加え、次いで150μlのフェノール/クロロホルムを加えた。混合物を30秒間激しくボルテックスした。その後マイクロ遠心分離機で、室温で5分間、最大速度で遠心分離して沈殿物を除去した。水相を新しいマイクロ遠心チューブに移した(>95μl)。
ステップ6:ライゲーションしたフラグメント3オリゴ複合体の精製
乾燥した試料を0.5×TE緩衝液に再溶解し、緩衝液Cで平衡化したDNAPac PA−100カラムに載せた。カラム温度は85℃であり、検出器をRNAを有する分画の同定には254nmで作動させ、2MaFを有する分画の同定には340nmで作動させた。オリゴは、最初の20分間は30%〜70%の緩衝液Dの凸型勾配で、0.8ml/分の流速で溶出させ、次いでさらに20分間、70%の〜98%のDの直線勾配で、同じ流速で溶出させた。溶出は、100%のDで7分間および100%のCでさらに10分間、1.0ml/分の流速で洗浄することによって完了した。分画は254または260nmの波長の光を用いて検出した。ライゲーションしたオリゴ(2MA−フラグメント3)は34分より後に、90%を超える緩衝液Bで溶出された。254nmでの吸光度を有する分画(A254nm>0.01)を採取し、高速真空で一夜乾燥させた。
ステップ7:精製した2MA−フラグメント3の脱塩および沈殿
乾燥した分画を100μlのRnaseを含まない蒸留水に再溶解し、500μlの0.5Mの(NH4)2CO3を含む100%冷エタノールを加え、混合物を短時間ボルテックスした。次いで混合物を60分間ドライアイス上で凍結させるか、または−20℃で一夜保存した。
ステップ8:SATA(または他のtRNA分子)の調製
A.RNAオリゴの5’リン酸化
1.試薬および器具:
・ヌクレアーゼを含まない水(カタログ番号P1193、Promega)
・RNasin(登録商標)リボヌクレアーゼ阻害剤(カタログ番号N2511、Promega)
・フェノール:クロロホルム
・無菌的なマイクロ遠心チューブ
・100%のエタノール
・70%のエタノール
・室温および4℃のマイクロ遠心機
・PCRサーマルサイクラーまたは水浴
2.以下の反応混合物を無菌的なマイクロ遠心チューブ内で構築する:
成分 : 容積
・アクセプターRNA <200ng
・T4リガーゼ10×反応緩衝液* 4μl
・RNasin(登録商標)リボヌクレアーゼ阻害剤(40単位/μl) 20単位
・T4キナーゼ(9〜12単位/μl) 2μl
・10mM ATP 4μl
・ヌクレアーゼを含まない水で最終容量に 40μl
PCRサーモサイクラーまたは水浴中で、37℃で30分間インキュベートする。非放射性のリン酸化には、1×T4ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液、1mMのATPおよび10〜20単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを含む30〜40μlの反応で、300pmolまでの5’末端を用いる。37℃で30分間インキュベートする。1×T4DNAリガーゼ反応緩衝液は1mMのATPを含み、非放射性のリン酸化において置き換えることができる。T4ポリヌクレオチドキナーゼはこの緩衝液中で100%の活性を示す)。最適な活性には新しい緩衝液が必要である(古い緩衝液では、酸化によるDTTの減少が活性を低下させる。
1.試薬および器具:
・PCRサーモサイクラー装置または水浴
・100μg/mlのヌクレアーゼを含まないアルブミン
・100mMのMgCl2
2.以下の反応混合物を無菌的なマイクロ遠心チューブ内で構築する:
・アクセプターRNAオリゴ(1E) <200ng
・ドナーRNAオリゴ(3G−2Gのライゲーションしたオリゴ) <200ng
・(ステップAからの5’リン酸化されたオリゴ)
適切な比は以下のとおりで、フラグメント1の自己ライゲーションを回避するために、アクセプターオリゴ:ドナーオリゴ(フラグメント1:2MA−フラグメント3)のモル比が1:1.1であるべきである。MgCl2を、T4リガーゼ緩衝液(50mM トリス−HCl2−(pH7.8)、10mM MgCl2、10mM DTTおよび1mM ATP)に、最終20mMの濃度で添加した。Rnaseを含まないアルブミンを最終的に5μg/mlになるように添加する。最終容量は、100μl以下とすべきである。溶液を5分間70℃まで加熱し、次いで2時間にわたって70℃から26℃まで冷やし、40分にわたって26から0℃まで冷却した。PCR器具を用いて、16℃で16〜17時間インキュベートする。
・アニールしたオリゴ <15μl
・10mM ATP 2μl
・40%PEG 18μl
・T4リガーゼ 10×緩衝液 2μl
・RNasin(登録商標)リボヌクレアーゼ阻害剤(40単位/μl) 0.5μl
・T4リガーゼ(9〜12u/μl)(NEB) 1μl
・ヌクレアーゼを含まない水で 最終容量40μl
D.tRNAフラグメントの沈殿
ライゲーションの後、50μlのDEPC水および150μlのフェノール:クロロホルムを加え、30秒間激しくボルテックスした。その後、これをマイクロ遠心機で、室温で最大速度で5分間遠心分離した。水相を新しいマイクロ遠心チューブ(約100μl)に移した。これに、2μlの10mg/mlのイガイグリコーゲン、10μlの3Mの酢酸ナトリウム、pH5.2を加えた。これをよく混合した。次いで220μlの95%のエタノールを加え、短時間ボルテックスした。その後、混合物を30分間ドライアイス上で凍結させた。この時点で、混合物を一夜−20℃で保存してもよいし、または先に進んでもよい。1つの実施形態では、RNAは好ましくはDEPC水中に保存すべきでなく、エタノール中に−20℃で保存すべきである。
SATAのアンチコドンによって認識されるコドンに対応するストップコドン(この場合はUAG)を有するように修飾されたルシフェラーゼmRNAを、1μlの濃度1μg/μlを推奨する標準のPromega in vitro翻訳キットで用いた。当業者は、実際、適切な配列を含む任意のmRNAフラグメントを用い得ることを理解するであろう。
実施例4:架橋剤を形成するよう修飾したリボヌクレオチドを用いたtRNA類似体の生成:ソラレンおよび非ソラレン架橋剤の使用
上記のように、いくつかの実施形態では、所望しないモノ付加体および架橋結合の形成を最小限にするために、プソイドウリジンを用いることができる。1つの実施形態では、架橋剤で修飾されたモノヌクレオチドを形成して用いる。架橋剤で修飾されたモノヌクレオチドの1つの利点は、これが望ましくないモノ付加体および架橋結合の形成を最小限にすることである。
修飾されたヌクレオチドの生成
長さが80塩基対までのカスタムヌクレオチドにすでに組み込まれている、ピューロマイシンを有するかまたは有さない4−チオU、5−ヨードおよび5−ブロモUを購入できる(Dharmacon,Inc)。したがって、SATA、およびこれらの架橋剤が既に適所に存在する連結tRNA類似体、ならびに類似の架橋剤を、Dharmacon,Incから直接購入できる。ナンセンスサプレッサー類似体もDharmacon,Incから購入できる。
反応緩衝液を調製する。pH7.0を有する反応緩衝液は、25mM トリスHCL、100mM NaCl、および0.32mM EDTAを含む。
以下のステップを実施する:(1)高速真空内でオリゴを乾燥する、(2)ペレットを10μLの1×ハイブリッド混合物に再懸濁する、(3)68℃で10分間加熱する、(4)ゆっくりと30℃まで冷却する。パルススピンダウン(Pulse spin down)する、(5)10μLの2×RNase H緩衝液を加える。混合する。(6)30℃で60分間インキュベートする、(7)130μLの停止混合液を加える。
tRNA成分オリゴリボヌクレオチド内への光感受性ヌクレオチドの組み込み
pU架橋剤をCUAストップアンチコドン内に組み込むために以下のプロトコルを用いることができる。しかし当業者は、本明細書中に記載の方法に従って、他のストップアンチコドンおよび疑似ストップアンチコドンを生成するために他のヌクレオチドも用いることができることを理解するであろう。
フラグメント2Bと1Bもしくは1B1との第1のライゲーション
この2Bフラグメントは、安定したアクセプターを有するtRNA類似体または、天然のエステル化されたアクセプターを有するtRNA類似体において用いることができる。1つの実施形態では、天然のAA−tRNA合成酵素によって、天然の3’末端をアミノアシル化できることを保証するために、その類似体のバージョンにおいてアクセプター基部を修飾する。SATAのバージョンでは、1つの実施形態では、3’フラグメントは市販の調製されたピューロマイシンをアクセプターとして保守する。したがって、1つの実施形態では、異なる2つの5’末端において以下を用いる:
3’リン酸を除去して5’リン酸を付加するために、上記生成物を、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて2つの個別のステップで処理する。
配列1B:(Ψ=プソイドウリジン)
実施例5:SATAおよびナンセンスサプレッサーtRNAに対するmRNA上への架橋剤の配置
いくつかの実施形態では、架橋剤(ソラレンまたは非ソラレン架橋剤など)はtRNA上に配置されず、mRNA上に位置する。例えば、1つの実施形態では、SATAはtRNA上に位置するピューロマイシンを含むが、架橋剤はmRNA上にある。さらに別の実施形態では、ナンセンスサプレッサーtRNAを用い、これはピューロマイシンを有さないtRNAを含み、架橋剤はmRNA上にある。架橋剤のメッセージ(mRNA)上への配置は、以下に示すように達成することができる。関連する配列は以下のとおりである:
実施例6:ピューロマイシンを必要としないtRNA系の使用
本発明のいくつかの実施形態は、ピューロマイシン、ピューロマイシン類似体、または他のアミドリンカーを必要としない系および方法を提供する。1つの実施形態では、連結tRNA類似体およびナンセンスサプレッサーtRNAはピューロマイシンを必要とせず、以下の例に従って作製および使用することができる。
実施例7:代替配列
好ましい実施形態では、上記の実施例1に記載したフラグメント1、2および3は、以下の代替配列を有する:
フラグメント1(配列番号13)
Claims (43)
- 疾患または状態を治療するための標的治療薬を作製する方法であって、
疾患もしくは状態を有する患者、または疾患もしくは状態を発現する危険性がある患者から生体試料を得るステップであって、前記試料が疾患細胞の集団を含むステップと、
前記疾患細胞に結合するmRNA−タンパク質対を同定するために、同族mRNAと連結させたタンパク質を含むライブラリーをスクリーニングするステップと、
前記同定したmRNA−タンパク質対から、1つまたは複数のタンパク質を分離するステップと、
前記分離したタンパク質(複数可)を治療薬に結合するステップであって、前記治療薬が前記疾患細胞に対して治療有効性を有するステップと、
を含む方法。 - 第1の亜集団細胞を前記試料から分離するステップであって、前記第1の亜集団が、非疾患細胞を実質的に含まない疾患細胞を含むステップと、
第2の亜集団細胞を前記試料から分離するステップであって、前記第2の集団が、疾患細胞を実質的に含まない非疾患細胞を含み、前記非疾患細胞よりも前記疾患細胞と実質的に高親和性で結合するmRNA−タンパク質対を同定するために、前記ライブラリーをスクリーニングするステップと、
をさらに含む請求項1に記載の方法。 - 前記疾患または状態が癌であり、前記疾患細胞が悪性細胞である請求項1に記載の方法。
- 前記疾患または状態が血液癌であり、前記悪性細胞がリンパ球を含む請求項3に記載の方法。
- 前記悪性細胞がB細胞である請求項4に記載の方法。
- 前記悪性細胞がT細胞である請求項4に記載の方法。
- 前記疾患または状態が病原体の感染であり、前記疾患細胞が病原体で感染した細胞である請求項1に記載の方法。
- 前記病原体がウイルスである請求項7に記載の方法。
- 前記ウイルスがHIVである請求項8に記載の方法。
- 前記治療薬が細胞毒性薬剤である請求項1に記載の方法。
- 前記治療薬が前記患者で免疫応答を引き起こしうる請求項1に記載の方法。
- 前記治療薬がアジュバントである請求項11に記載の方法。
- 前記疾患または状態が移植拒絶反応であり、前記疾患細胞が移植された細胞である請求項1に記載の方法。
- 前記治療薬が前記患者で免疫応答を抑制できる請求項13に記載の方法。
- 前記疾患または状態が移植拒絶反応であり、前記疾患細胞が移植された細胞に結合するリンパ球である請求項1に記載の方法。
- 前記治療薬が前記患者で免疫応答を引き起こしうる請求項15に記載の方法。
- 前記治療薬が補体媒介免疫応答を刺激する請求項14に記載の方法。
- 前記治療薬がC3転換酵素である請求項17に記載の方法。
- 前記分離ステップが、前記同定されたmRNA−タンパク質対の前記mRNAに対応するオリゴヌクレオチドをクローニングすること、および前記オリゴヌクレオチドからタンパク質を発現することを含む請求項1に記載の方法。
- 同族のmRNAに連結したタンパク質を含むライブラリーを作製するステップであって、
少なくとも2つの候補mRNA分子を提供することであって、前記mRNA分子のそれぞれが架橋剤を含むこと、
前記候補mRNA分子のうちの少なくとも2つを翻訳して、少なくとも1つの翻訳されたタンパク質を生成すること、および
前記候補mRNA分子のうちの少なくとも1つを、架橋剤を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも1つの同族対を形成すること
を含むステップをさらに含む請求項1に記載の方法。 - 前記架橋剤がコドン上に配置される請求項18記載の方法。
- 前記架橋剤が疑似ストップコドン上に配置される請求項18に記載の方法。
- 前記架橋剤がソラレン架橋剤を含み、連結には前記mRNAをUV光に曝露することを含む請求項18に記載の方法。
- 前記翻訳がin vitroで実施される請求項18に記載の方法。
- 前記候補mRNA分子の少なくとも1つおよび前記翻訳されたタンパク質の少なくとも1つが、tRNA、修飾されたtRNA、およびtRNA類似体からなる群から選択されるtRNA分子によって連結される請求項18に記載の方法。
- 前記疾患または状態が癌であり、前記疾患細胞が悪性細胞である請求項18に記載の方法。
- 前記疾患または状態が血液癌であり、前記悪性細胞がリンパ球を含む請求項24に記載の方法。
- 前記疾患または状態が病原体の感染であり、前記疾患細胞が病原体で感染した細胞である請求項18に記載の方法。
- 前記疾患または状態が移植拒絶反応であり、前記疾患細胞が移植された細胞である請求項18に記載の方法。
- 前記治療薬が前記患者で免疫応答を抑制できる請求項27に記載の方法。
- 前記疾患または状態が移植拒絶反応であり、前記疾患細胞が移植された細胞に結合するリンパ球である請求項18に記載の方法。
- 前記治療薬が前記患者で免疫応答を引き起こしうる請求項29に記載の方法。
- 前記治療薬が細胞毒性薬剤である請求項18に記載の方法。
- 前記治療薬が前記患者で免疫応答を引き起こしうる請求項18に記載の方法。
- 疾患または状態を治療するための標的治療薬を作製する方法であって、
疾患もしくは状態を有する患者、または疾患もしくは状態を発現する危険性がある患者から試料を得るステップと、
1つまたは複数のタンパク質を前記試料から分離するステップであって、前記タンパク質が、非疾患細胞と比べて疾患細胞上で発現の異なるマーカーを含むステップと、
前記マーカーに対して実質的に親和性を有するmRNA−タンパク質対を同定するために、同族のmRNAと連結されたタンパク質を含むライブラリーをスクリーニングするステップと、
1つまたは複数のタンパク質を、前記同定されたmRNA−タンパク質対から分離するステップと、
前記分離したタンパク質を治療薬に結合するステップであって、前記治療薬が前記疾患細胞に対して治療有効性を有するステップと、
を含む方法。 - 同族のmRNAに連結されたタンパク質を含むライブラリーを作製するステップであって、
少なくとも2つの候補mRNA分子を提供することであって、前記mRNA分子のそれぞれが架橋剤を含むこと、
前記候補mRNA分子のうちの少なくとも2つを翻訳して、少なくとも1つの翻訳されたタンパク質を生成すること、
および前記候補mRNA分子のうちの少なくとも1つを、前記架橋剤を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも1つの同族対を形成すること、
を含むステップをさらに含む請求項35に記載の方法。 - 前記マーカーがMHCを含む1つまたは複数のタンパク質である請求項35に記載の方法。
- 前記治療薬が免疫応答を抑制する請求項37に記載の方法。
- 前記疾患または状態が移植拒絶反応である請求項38に記載の方法。
- 前記マーカーが、MHCに結合するリンパ球のイディオタイプを含む1つまたは複数のタンパク質である請求項35に記載の方法。
- 前記治療薬が免疫応答を増強する請求項40に記載の方法。
- 前記疾患または状態が移植拒絶反応である請求項41に記載の方法。
- 請求項18から請求項42のいずれか1項に記載の前記方法を実施するためのキットであって、
同族のmRNAに連結されたタンパク質を含む前記ライブラリーを発現する手段と、
生体試料の1つまたは複数の成分に結合するmRNA−タンパク質対を同定するために、前記ライブラリーをスクリーニングする手段であって、前記試料を疾患もしくは状態を有する患者、または疾患もしくは状態を発現する危険性がある患者から採取する手段と、
前記同定されたmRNA−タンパク質対から、前記タンパク質を分離する手段と、
前記分離したタンパク質を前記治療薬に結合する手段であって、前記治療薬が前記疾患または状態に対して治療有効性を有する手段と、
を含むキット。
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