JP2008525440A

JP2008525440A - Immunoglobulin comprising mainly GalGlcNAcMan5GLcNAc2 glycoform

Info

Publication number: JP2008525440A
Application number: JP2007548187A
Authority: JP
Inventors: ガーングロス，ティルマン，ユー．; リ，ヒュイジュン; ウィルト，ステファン
Original assignee: グライコフィ，インコーポレイテッド
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2005-07-19
Publication date: 2008-07-17
Also published as: CA2590441A1; AU2005322617A1; WO2006071280A1; WO2006071280B1; EP1831256A1

Abstract

本発明は、特定のエフェクター機能を付与する主要Ｎ−グリカン構造を免疫グロブリン糖タンパク質上に有する免疫グロブリン糖タンパク質組成物に関する。さらにまた、本発明は、特定の濃縮されたＮ−グリカン構造を有する抗体を含む医薬組成物であって、前記Ｎ−グリカン構造がＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂である医薬組成物に関する。The present invention relates to an immunoglobulin glycoprotein composition having a major N-glycan structure on an immunoglobulin glycoprotein that confers specific effector functions. Furthermore, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising an antibody having a specific concentrated N-glycan structure, wherein the N-glycan structure is GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ .

Description

本願は、米国仮特許出願第６０／６３９，６５７号（２００４年１２月２３日出願）および米国仮特許出願第６０／６３９，６９８号（２００４年１２月２３日出願）の利益を主張する。本願は、米国仮特許出願第６０／３４４，１６９号（２００１年１２月２７日出願）の利益を主張する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／４１５１０（２００２年１２月２４日出願）の国内段階出願である米国特許出願第１０／５００，２４０号（２００４年６月２５日出願）の一部継続出願（「ＣＩＰ」）でもある。本願は、米国仮特許出願第６０／２１４，３５８号（２０００年６月２８日出願）、米国仮特許出願第６０／２１５，６３８号（２０００年６月３０日出願）および米国仮特許出願第６０／２７９，９９７号（２００１年３月３０日出願）の利益を主張する米国特許出願第０９／８９２，５９１号（２００１年６月２７日）のＣＩＰである米国特許出願第１０／３７１，８７７号（２００３年２月２０日出願）のＣＩＰである米国特許出願第１１／１０８，０８８号（２００５年４月１５日出願）のＣＩＰでもある。上述した出願のそれぞれは参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。 This application claims the benefit of US Provisional Patent Application No. 60 / 639,657 (filed December 23, 2004) and US Provisional Patent Application No. 60 / 639,698 (filed December 23, 2004). This application is a national phase application of international application number PCT / US02 / 41510 (filed on Dec. 24, 2002) claiming the benefit of US Provisional Patent Application No. 60 / 344,169 (filed on Dec. 27, 2001). It is also a continuation-in-part application ("CIP") of a US patent application Ser. No. 60 / 214,358 (filed Jun. 28, 2000), U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 215,638 (filed Jun. 30, 2000), and U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 214,358. US patent application Ser. No. 10/371, which is the CIP of US patent application Ser. No. 09 / 892,591 (June 27, 2001) claiming the benefit of 60 / 279,997 (filed Mar. 30, 2001). It is also the CIP of US Patent Application No. 11 / 108,088 (filed on April 15, 2005), which is the CIP of 877 (filed on February 20, 2003). Each of the aforementioned applications is hereby incorporated by reference in its entirety.

本発明は、特定のＮ−結合型グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を製造するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、特定のＮ−グリカン構造を有する複数のＮ−グリカンを含む免疫グロブリン糖タンパク質の組成物に関し、より具体的には、前記複数のＮ−グリカン内に、特定のエフェクター機能を調節（例えば促進）する１またはそれ以上の主要グリコフォーム構造が免疫グロブリン上に存在するような、免疫グロブリンタンパク質を含む組成物に関する。 The present invention relates to compositions and methods for producing glycoproteins having a specific N-linked glycosylation pattern. Specifically, the present invention relates to an immunoglobulin glycoprotein composition comprising a plurality of N-glycans having a specific N-glycan structure, and more specifically, a specific N-glycan has a specific It relates to a composition comprising an immunoglobulin protein such that one or more major glycoform structures that modulate (eg promote) effector function are present on the immunoglobulin.

糖タンパク質は、ヒトおよび他の哺乳動物における多くの必須機能、例えば触媒、シグナリング、細胞間コミュニケーション、ならびに分子認識および分子会合などを媒介する。糖タンパク質は、真核生物では、非細胞質ゾルタンパク質の大部分を占めている（LisおよびSharon, 1993, Eur. J. Biochem. 218:1-27）。多くの糖タンパク質が治療目的に利用されており、ここ２０年間は、天然糖タンパク質の組換え型がバイオテクノロジー産業の大部分になっている。治療薬として使用される組換えグリコシル化タンパク質の例には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＨ）（Cummingら, 1991, Glycobiology 1:115-130）などがある。最近、予防薬候補および治療薬候補として生産された組換えタンパク質が臨床応用へと近づくにつれて、科学界では、組換え生産された糖タンパク質のグリコシル化パターンの変動が、多くの注目を集める話題になっている。 Glycoproteins mediate many essential functions in humans and other mammals, such as catalysis, signaling, intercellular communication, and molecular recognition and association. Glycoproteins make up the majority of non-cytosolic proteins in eukaryotes (Lis and Sharon, 1993, Eur. J. Biochem. 218: 1-27). Many glycoproteins have been used for therapeutic purposes, and over the last 20 years, recombinant forms of natural glycoproteins have become a major part of the biotechnology industry. Examples of recombinant glycosylated proteins used as therapeutic agents include erythropoietin (EPO), therapeutic monoclonal antibodies (mAb), tissue plasminogen activator (tPA), interferon-β (IFN-β), granulocyte macrophages Colony stimulating factor (GM-CSF), and human chorionic gonadotropin (hCH) (Cumming et al., 1991, Glycobiology 1: 115-130). Recently, as recombinant proteins produced as prophylactic and therapeutic candidates have approached clinical application, changes in glycosylation patterns of recombinantly produced glycoproteins have attracted much attention in the scientific community. It has become.

抗体または免疫グロブリン（Ｉｇ）は、体液性免疫応答に中心的な役割を果たす糖タンパク質である。抗体は、体液性防御機構と細胞性防御機構の間の連係をもたらすアダプター分子と考えることができる。抗体による抗原特異的な認識は免疫複合体の形成をもたらし、それが複数のエフェクター機構を活性して、複合体の除去および破壊をもたらしうる。免疫グロブリンの一般クラスでは、５クラスの抗体−ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ−を、生化学的および機能的に識別することができる。一方、可変領域に限定されるもっと微細な相違は、抗原結合の特異性の説明になる。これら５クラスのＩｇの中に、軽鎖は２タイプしかなく、それらはラムダ（λ）およびカッパ（κ）と呼ばれる。λ鎖またはκ鎖を持つ抗体の間に機能的な相違は見出されておらず、これら２タイプの軽鎖の比は種ごとに異なる。重鎖クラスまたはアイソタイプは５つあり、これらは、抗体分子の機能的活性を決定する。免疫グロブリンの５つの機能的クラスは、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）および免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）である。各アイソタイプは免疫応答において特有の機能を持ち、それらの特徴的な機能的性質は、軽鎖と会合していない重鎖のカルボキシ末端部分によって付与される。ＩｇＧは血漿中に最も豊富に存在する免疫グロブリンアイソタイプである（例えば「Immunobiology」（Janewayら, 第６版, 2004, Garland Publishing, ニューヨーク）を参照されたい）。 Antibodies or immunoglobulins (Ig) are glycoproteins that play a central role in the humoral immune response. Antibodies can be thought of as adapter molecules that provide a link between humoral and cellular defense mechanisms. Antigen-specific recognition by the antibody can lead to the formation of immune complexes, which can activate multiple effector mechanisms, leading to removal and destruction of the complex. In the general class of immunoglobulins, five classes of antibodies-IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE- can be distinguished biochemically and functionally. On the other hand, finer differences limited to the variable region explain the specificity of antigen binding. Among these five classes of Ig, there are only two types of light chains, called lambda (λ) and kappa (κ). No functional differences have been found between antibodies with λ or κ chains, and the ratio of these two types of light chains varies from species to species. There are five heavy chain classes or isotypes, which determine the functional activity of the antibody molecule. The five functional classes of immunoglobulins are immunoglobulin M (IgM), immunoglobulin D (IgD), immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin A (IgA) and immunoglobulin E (IgE). Each isotype has a unique function in the immune response, and their characteristic functional properties are conferred by the carboxy-terminal portion of the heavy chain that is not associated with the light chain. IgG is the most abundant immunoglobulin isotype in plasma (see eg "Immunobiology" (Janeway et al., 6th edition, 2004, Garland Publishing, New York)).

免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子は、定常領域および可変領域を持つＦａｂ（抗原結合性断片（ｆｒａｇｍｅｎｔａｎｔｉｇｅｎｂｉｎｄｉｎｇ））ドメインと、Ｆｃ（結晶性断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｄ））ドメインとを含む。各重鎖のＣＨ２ドメインは、Ｎ−グリカンをＩｇ分子に連結するアスパラギン残基（通常は残基Ａｓｎ−２９７）に、ただ一つのＮ−結合型グリコシル化部位を含有する(Kabatら「Sequences of proteins of immunological interest」第５版, Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242）。 An immunoglobulin G (IgG) molecule comprises a Fab (fragment antigen binding) domain having a constant region and a variable region, and an Fc (fragment crystallized) domain. The CH2 domain of each heavy chain contains a single N-linked glycosylation site at the asparagine residue (usually residue Asn-297) that links the N-glycan to the Ig molecule (Kabat et al., “Sequences of proteins of immunological interest "5th edition, Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242).

Ｎ−結合型オリゴ糖の構造的側面および機能的側面の解析は、３つの主な理由から生物学的に興味深い。すなわち、（１）ＣＨ２ドメインのグリコシル化は進化を通して保存されてきたことから、オリゴ糖の重要な役割が示唆される；（２）免疫グロブリン分子はオリゴ糖不均一性を解析するためのモデル系として役立つ（RademacherおよびDwek, 1984；Rademacherら, 1982）；そして（３）抗体は２つの重鎖の二量体会合物を含み、それが２つのオリゴ糖ユニットを互いに直接接触させるので、免疫グロブリン分子には特異的タンパク質−糖質相互作用と糖質−糖質相互作用の両方が関わる。 Analysis of the structural and functional aspects of N-linked oligosaccharides is biologically interesting for three main reasons. (1) Glycosylation of the CH2 domain has been conserved throughout evolution, suggesting an important role for oligosaccharides; (2) immunoglobulin molecules are model systems for analyzing oligosaccharide heterogeneity (Rademacher and Dwek, 1984; Rademacher et al., 1982); and (3) an immunoglobulin contains a dimeric association of two heavy chains that directly contact two oligosaccharide units with each other Molecules involve both specific protein-carbohydrate interactions and carbohydrate-carbohydrate interactions.

Ｉｇの異なるグリコシル化パターンは異なる生物学的性質と関連づけられることが示されている（JefferisおよびLund, 1997, Antibody Eng. Chem. Immunol., 65:111-128；WrightおよびMorrison, 1997, Trends Biotechnol, 15:26-32）。しかし、望ましい生物学的機能を付与することがわかっている具体的なグリコフォームは、わずかしかない。例えば、Ｎ−結合型グリカン上のフコシル化が少ない免疫グロブリン組成物は、ヒトＦｃγＲＩＩＩへの結合が強化されており、それゆえに抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が強化されると報告されている（Shieldsら, 2002, J. Biol Chem, 277:26733-26740；Shinkawaら, 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-3473）。また、ＣＨＯ細胞で生産されたフコシル化Ｇ２（Ｇａｌ₂ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂）ＩｇＧの組成物は、報告によれば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を、不均一な抗体の組成物よりも高度に増加させるとされている（Ｒａｊｕ，２００４、米国特許出願公開第２００４／０１３６９８６号）。また、腫瘍に対する最適な抗体は、活性化Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩ）に優先的に結合し、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体には最低限にしか結合しないものであるだろうということも示唆されている（Clynesら, 2000, Nature, 6:443-446）。したがって、Ｉｇ糖タンパク質上の特定グリコフォームを濃縮できることは、非常に望ましい。 Different glycosylation patterns of Ig have been shown to be associated with different biological properties (Jefferis and Lund, 1997, Antibody Eng. Chem. Immunol., 65: 111-128; Wright and Morrison, 1997, Trends Biotechnol , 15: 26-32). However, there are only a few specific glycoforms that are known to confer desirable biological functions. For example, immunoglobulin compositions with low fucosylation on N-linked glycans have been reported to have enhanced binding to human FcγRIII and therefore enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). (Shields et al., 2002, J. Biol Chem, 277: 26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278: 3466-3473). In addition, fucosylated G2 (Gal ₂ GlcNAc ₂ Man ₃ GlcNAc ₂ ) IgG compositions produced in CHO cells reportedly reported complement-dependent cytotoxic (CDC) activity, heterogeneous antibody composition. (Raju, 2004, US Patent Application Publication No. 2004/0136986). It also suggests that optimal antibodies against tumors will preferentially bind to activated Fc receptors (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIII) and minimally bind to inhibitory FcγRIIb receptors. (Clynes et al., 2000, Nature, 6: 443-446). Therefore, the ability to concentrate specific glycoforms on Ig glycoproteins is highly desirable.

一般に、糖タンパク質上のグリコシル化構造（オリゴ糖）は、発現宿主および培養条件に依存して変動するだろう。非ヒト宿主細胞で生産された治療用タンパク質は、ヒトにおける免疫原応答を引き出しうる非ヒトグリコシル化−例えば酵母における超マンノシル化（hypermannosylation）（Ballou, 1990, Methods Enzymol 185:440-470）；植物におけるα（１，３）−フコースおよびβ（１，２）−キシロース（Cabanes-Macheteauら, 1999, Glycobiology, 9:365-372）；チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＮ−グリコリルノイラミン酸（Noguchiら, 1995. J. Biochem. 117:5-62）およびマウスにおけるＧａｌα−１，３Ｇａｌグリコシル化（Borrebaeckら, 1993, Immun. Today, 14:477-479）など−を含有する可能性が高い。さらにまた、ガラクトシル化は細胞培養条件によって変化する場合があり、それは、その特異的ガラクトースパターンに依存して、一部の免疫グロブリン組成物を免疫原性にしうる（Patelら, 1992. Biochem J. 285:839-845）。非ヒト哺乳動物細胞によって生産された糖タンパク質のオリゴ糖構造は、ヒト糖タンパク質のそれに、より近い傾向がある。したがって大半の市販免疫グロブリンは哺乳動物細胞で生産される。しかし哺乳動物細胞には、タンパク質生産用の宿主細胞として、いくつかの重大な不都合がある。多大な費用を要することに加えて、哺乳動物細胞でタンパク質を発現させる方法は、不均一なグリコフォーム集団をもたらし、低い容量力価（volumetric titer）を持ち、継続的なウイルスの封じ込めと、安定な細胞株を作出するためのかなりの時間とを、どちらも必要とする。 In general, glycosylation structures (oligosaccharides) on glycoproteins will vary depending on the expression host and culture conditions. Therapeutic proteins produced in non-human host cells are non-human glycosylation capable of eliciting an immunogenic response in humans-eg hypermannosylation in yeast (Ballou, 1990, Methods Enzymol 185: 440-470); plants Α (1,3) -fucose and β (1,2) -xylose (Cabanes-Macheteau et al., 1999, Glycobiology, 9: 365-372); N-glycolylneuraminic acid in Chinese hamster ovary cells (Noguchi et al. , 1995. J. Biochem. 117: 5-62) and Galα-1,3Gal glycosylation in mice (Borrebaeck et al., 1993, Immun. Today, 14: 477-479). Furthermore, galactosylation may vary depending on cell culture conditions, which may make some immunoglobulin compositions immunogenic depending on their specific galactose pattern (Patel et al., 1992. Biochem J. 285: 839-845). The oligosaccharide structure of glycoproteins produced by non-human mammalian cells tends to be closer to that of human glycoproteins. Thus, most commercial immunoglobulins are produced in mammalian cells. However, mammalian cells have several significant disadvantages as host cells for protein production. In addition to being expensive, the method of expressing proteins in mammalian cells results in a heterogeneous glycoform population, low volumetric titer, continuous virus containment and stability Both require considerable time to create a new cell line.

異なるグリコフォームは、治療薬の性質、例えば薬物動態、薬力学、受容体相互作用および組織特異的ターゲティングなどに、著しい影響を及ぼしうると理解されている（Graddisら, 2002, Curr Pharm Biotechnol. 3:285-297）。具体的には、抗体の場合、オリゴ糖構造は、プロテアーゼ耐性、ＦｃＲｎ受容体によって媒介される抗体の血清半減期、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する補体複合体Ｃ１への結合、ならびに抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）経路、食作用および抗体フィードバックの調整を担うＦｃγＲ受容体への結合に関連する性質に影響を及ぼしうる（NoseおよびWigzell, 1983；LeatherbarrowおよびDwek, 1983；Leatherbarrow ら, 1985；Walkerら, 1989；Carterら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289）。 It is understood that different glycoforms can significantly affect the properties of therapeutic agents such as pharmacokinetics, pharmacodynamics, receptor interactions and tissue-specific targeting (Graddis et al., 2002, Curr Pharm Biotechnol. 3 : 285-297). Specifically, in the case of antibodies, the oligosaccharide structure binds to complement complex C1, which induces protease resistance, FcRn receptor-mediated antibody serum half-life, complement dependent cytotoxicity (CDC). , And properties related to binding to the FcγR receptor responsible for regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) pathway, phagocytosis and antibody feedback (Nose and Wigzell, 1983; Leatherbarrow and Dwek, 1983; Leatherbarrow et al., 1985; Walker et al., 1989; Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289).

異なるグリコフォームは異なる生物学的性質に関連づけられるので、１またはそれ以上のグリコフォームを濃縮することができれば、それを使って、特定のグリコフォームと特定の生物学的機能との間の関係を解明することができる。望ましい生物学的機能が特定のグリコフォームパターンに関連づけられたら、有利なグリコフォーム構造が濃縮された糖タンパク質組成物を生産することができる。したがって、特定のグリコフォームが濃縮されている糖タンパク質組成物を生産できることは、非常に望ましい。 Different glycoforms are associated with different biological properties, so if one or more glycoforms can be concentrated, it can be used to establish a relationship between a specific glycoform and a specific biological function. It can be clarified. Once the desired biological function is associated with a particular glycoform pattern, a glycoprotein composition enriched in advantageous glycoform structures can be produced. Thus, it is highly desirable to be able to produce glycoprotein compositions that are enriched for specific glycoforms.

本発明は、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各免疫グロブリンがそこに結合された少なくとも一つのＮ−グリカンを含むことにより、主要Ｎ−グリカンが本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_5-ＧｌｃＮＡｃ₂からなっている複数のＮ−グリカンを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、前記複数のＮ−グリカンの５０モルパーセントを越える量が、本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなる。より好ましくは、前記複数のＮ−グリカンの７５モルパーセントを越える量が、本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなる。最も好ましくは、前記複数のＮ−グリカンの９０モルパーセントを越える量が、本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなる。別の好ましい実施形態では、前記ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン構造が、前記複数のＮ−グリカンの、その次に最も主要なＮ−グリカン構造よりも、約５モルパーセント〜約５０モルパーセント多いレベルで存在する。 The present invention is a composition comprising a plurality of immunoglobulins, wherein each immunoglobulin comprises at least one N-glycan attached thereto so that the primary N-glycan consists essentially of GalGlcNAcMan ₅ -GlcNAc _2. And a composition comprising a plurality of N-glycans. In a preferred embodiment, the greater than 50 mole percent of the plurality of N-glycans consists essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ . More preferably, the greater than 75 mole percent of the plurality of N-glycans consists essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ . Most preferably, the greater than 90 mole percent of the plurality of N-glycans consists essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ . In another preferred embodiment, the GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycan structure is at a level of about 5 mole percent to about 50 mole percent greater than the next most dominant N-glycan structure of the plurality of N-glycans. Exists.

本発明は、免疫グロブリン上の特定グリコフォーム（例えばＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂）を濃縮することによって、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ受容体への結合を増加させ、ＦｃγＲＩＩｂ受容体への結合を減少させる方法も提供する。好ましい実施形態は、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各免疫グロブリンがそこに結合された少なくとも一つのＮ−グリカンを含むことにより、主要Ｎ−グリカンが本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなっている複数のＮ−グリカンを含む組成物を製造するための方法であって、前記免疫グロブリンまたはその断片を発現するように操作または選択された宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。もう一つの好ましい実施形態は、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各免疫グロブリンがそこに結合された少なくとも一つのＮ−グリカンを含むことにより、主要Ｎ−グリカンが本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなっている複数のＮ−グリカンを含む組成物を製造するための方法であって、前記免疫グロブリンまたはその断片を発現するように操作または選択された下等真核宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。本発明の別の実施形態では、宿主細胞が、免疫グロブリンまたはその断片をコードする外因性遺伝子を含み、前記宿主細胞は前記免疫グロブリンまたはその断片を発現するように操作または選択され、その結果、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各免疫グロブリンがそこに結合された少なくとも一つのＮ−グリカンを含むことにより、主要Ｎ−グリカンが本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなっている複数のＮ−グリカンを含む組成物を産生する。本発明のさらに別の実施形態では、下等真核宿主細胞が、免疫グロブリンまたはその断片をコードする外因性遺伝子を含み、前記宿主細胞は前記免疫グロブリンまたはその断片を発現するように操作または選択され、その結果、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各免疫グロブリンがそこに結合された少なくとも一つのＮ−グリカンを含むことにより、主要Ｎ−グリカンが本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなっている複数のＮ−グリカンを含む組成物を産生する。 The present invention also provides methods of increasing binding to FcγRIIIa and FcγRIIIb receptors and decreasing binding to FcγRIIb receptors by concentrating specific glycoforms on immunoglobulins (eg, GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ ). A preferred embodiment is a composition comprising a plurality of immunoglobulins, wherein each immunoglobulin comprises at least one N-glycan attached thereto so that the primary N-glycan is essentially from GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc _2. A method for producing a composition comprising a plurality of N-glycans, comprising culturing host cells engineered or selected to express said immunoglobulin or fragment thereof. . Another preferred embodiment is a composition comprising a plurality of immunoglobulins, wherein each immunoglobulin comprises at least one N-glycan attached thereto so that the primary N-glycan is essentially GalGlcNAcMan _5. a method for preparing a composition comprising a plurality of N- glycans consists GlcNAc _2, culturing said immunoglobulin or lower eukaryotic host cell that has been engineered or selected to express fragment thereof A method comprising steps is provided. In another embodiment of the invention, the host cell comprises an exogenous gene encoding an immunoglobulin or fragment thereof, and the host cell is engineered or selected to express the immunoglobulin or fragment thereof, so that A composition comprising a plurality of immunoglobulins, wherein each immunoglobulin comprises at least one N-glycan bound thereto, whereby a plurality of primary N-glycans consisting essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ A composition comprising N-glycans is produced. In yet another embodiment of the invention, a lower eukaryotic host cell comprises an exogenous gene encoding an immunoglobulin or fragment thereof, wherein the host cell is engineered or selected to express the immunoglobulin or fragment thereof. As a result, a composition comprising a plurality of immunoglobulins, wherein each immunoglobulin comprises at least one N-glycan bound thereto so that the primary N-glycan is essentially composed of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc _2. Producing a composition comprising a plurality of N-glycans.

本発明の好ましい実施形態では、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各免疫グロブリンがそこに結合された少なくとも一つのＮ−グリカンを含むことにより、その組成物は、主要Ｎ−グリカンが本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなっている複数のＮ−グリカンを含み、前記免疫グロブリンがＦｃγＲＩＩｂ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す組成物。本発明の別の好ましい実施形態では、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各免疫グロブリンがそこに結合された少なくとも一つのＮ−グリカンを含むことにより、その組成物は、主要Ｎ−グリカンが本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなっている複数のＮ−グリカンを含み、前記免疫グロブリンがＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ受容体に対して増加した結合アフィニティを示す組成物。本発明のさらにもう一つの好ましい実施形態では、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各免疫グロブリンがそこに結合された少なくとも一つのＮ−グリカンを含むことにより、その組成物は、主要Ｎ−グリカンが本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_5-ＧｌｃＮＡｃ₂からなっている複数のＮ−グリカンを含み、前記免疫グロブリンが増加した抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す組成物。 In a preferred embodiment of the invention, a composition comprising a plurality of immunoglobulins, wherein each immunoglobulin comprises at least one N-glycan bound thereto, such that the composition comprises a major N-glycan. A composition comprising a plurality of N-glycans consisting essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ , wherein the immunoglobulin exhibits reduced binding affinity for the FcγRIIb receptor. In another preferred embodiment of the invention, a composition comprising a plurality of immunoglobulins, wherein each immunoglobulin comprises at least one N-glycan bound thereto, such that the composition comprises a major N- A composition comprising a plurality of N-glycans, wherein the glycan consists essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ , wherein said immunoglobulin exhibits increased binding affinity for FcγRIIIa and FcγRIIIb receptors. In yet another preferred embodiment of the invention, a composition comprising a plurality of immunoglobulins, each immunoglobulin comprising at least one N-glycan bound thereto, whereby the composition comprises includes a plurality of N- glycans N- glycans consists essentially of GalGlcNAcMan _5- GlcNAc _2, said immunoglobulin antibody-dependent cellular cytotoxicity which increased (ADCC) is shown the composition.

ある実施形態では、本発明の組成物は、本質的にフコースを含まない免疫グロブリンを含む。もう一つの実施形態では、本発明の組成物は、フコースを欠く免疫グロブリンを含む。本発明の組成物は医薬組成物および医薬的に許容される担体も含む。本発明の組成物は、精製され診断キットに組み込まれた免疫グロブリンの医薬組成物も含む。 In certain embodiments, the compositions of the invention comprise immunoglobulins that are essentially free of fucose. In another embodiment, the composition of the invention comprises an immunoglobulin that lacks fucose. The composition of the present invention also includes a pharmaceutical composition and a pharmaceutically acceptable carrier. The compositions of the present invention also include pharmaceutical compositions of immunoglobulins that have been purified and incorporated into a diagnostic kit.

したがって本発明は、所定のグリコシル化構造を有する糖タンパク質、具体的には、本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなるＮ−グリカンを有する免疫グロブリンまたは抗体分子の組成物を製造するための材料および方法を提供する。 Accordingly, the present invention provides materials and methods for producing a composition of an immunoglobulin or antibody molecule having a glycoprotein having a predetermined glycosylation structure, in particular an N-glycan consisting essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc _2. I will provide a.

本明細書において別段の定義をしない限り、本発明に関連して使用する科学的および技術的な用語および表現は、当業者が共通して理解している意味を持つものとする。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形の用語は複数を包含し、複数形の用語は単数を包含するものとする。一般に、本明細書に記載する生物学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用する術語およびその技法は、当業者には周知で、よく使用されているものである。本発明の方法および技法は、一般に、別段の表示がない限り、本明細書の至る所で引用し議論するさまざまな一般文献およびより詳細な文献に記述されているとおりに、当分野において周知である従来の方法に従って行われる。例えば、Sambrookら「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1989）；Ausubelら「Current Protocols in Molecular Biology」Greene Publishing Associates（1992および2002年までのSupplement）；HarlowおよびLane「Antibodies: A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1990）；TaylorおよびDrickamer「Introduction to Glycobiology」Oxford Univ. Press(2003)；「Worthington Enzyme Manual」Worthington Biochemical Corp., ニュージャージー州フリーホールド；「Handbook of Biochemistry: Section A Proteins」Vol. I, CRC Press(1976)；「Handbook of Biochemistry: Section A Proteins」Vol. II, CRC Press(1976)；「Essentials of Glycobiology」Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)；「Immunobiology」Janewayら, 第６版, 2004, Garland Publishing, ニューヨーク）などを参照されたい。 Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms and expressions used in connection with the present invention shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. Further, unless otherwise required by context, singular terms shall include pluralities and plural terms shall include the singular. In general, the terms and techniques used in connection with biology, enzymology, molecular and cellular biology, microbiology, genetics, and protein and nucleic acid chemistry and hybridization described herein are It is well known and commonly used by vendors. The methods and techniques of the present invention are generally well known in the art as described in various general and more detailed references cited and discussed throughout this specification, unless otherwise indicated. This is done according to some conventional method. For example, Sambrook et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); Ausubel et al. “Current Protocols in Molecular Biology” Greene Publishing Associates (until 1992 and 2002) Supplement); Harlow and Lane "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990); Taylor and Drickamer "Introduction to Glycobiology" Oxford Univ. Press (2003); "Worthington Enzyme Manual" Worthington Biochemical Corp., New Jersey Freehold; “Handbook of Biochemistry: Section A Proteins” Vol. I, CRC Press (1976); “Handbook of Biochemistry: Section A Proteins” Vol. II, CRC Press (1976); “Essentials of Glycobiology "Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999);" Immunobiology "Janeway et al., 6th edition, 2004, Garland Publishing, New York) Please refer to.

本明細書で言及する全ての刊行物、特許および他の文献は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。 All publications, patents and other references mentioned herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

以下の用語は、別段の表示がない限り、以下の意味を持つと解釈されるものとする。 The following terms shall be interpreted to have the following meanings unless otherwise indicated.

本明細書で使用する用語「Ｎ−グリカン」「グリカン」および「グリコフォーム」は、互換的に用いられ、Ｎ−結合型オリゴ糖、例えばタンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に連結されたＮ−アセチルグルコサミン残基によって結合される（または結合された）ものなどを指す。糖タンパク質上に見出される主要糖類は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えばＮ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。Ｎ−結合型糖タンパク質の場合、糖基のプロセシングはＥＲの内腔で共翻訳的に起こり、ゴルジ装置でも続けられる。 As used herein, the terms “N-glycan”, “glycan” and “glycoform” are used interchangeably and are N-linked oligosaccharides, eg, N linked to the amide nitrogen of an asparagine residue in a protein. -It refers to those bound (or bound) by acetylglucosamine residues. The major saccharides found on glycoproteins are glucose, galactose, mannose, fucose, N-acetylgalactosamine (GalNAc), N-acetylglucosamine (GlcNAc) and sialic acid (eg N-acetyl-neuraminic acid (NANA)). . In the case of N-linked glycoproteins, sugar group processing occurs co-translationally in the ER lumen and continues in the Golgi apparatus.

Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂という共通の五糖コアを持っている（「Ｍａｎ」はマンノースを指し、「Ｇｌｃ」はグルコースを指し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを指し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを指す）。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂（「Ｍａｎ３」）コア構造（「トリマンノース構造」「五糖コア」または「少マンノースコア」ともいう）に付加される末端糖（例えばＧｃｌＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数が異なる。Ｎ−グリカンは、その分岐構成要素に従って分類される（例えば高マンノース型、複合型またはハイブリッド型）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５個以上のマンノース残基を持つ。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、「トリマンノース」コアの１，３マンノースアームに結合された少なくとも一つのＧｌｃＮＡｃと、１，６マンノースアームに結合された少なくとも一つのＧｌｃＮＡｃを持つ。複合型Ｎ−グリカンは、ガラクトース（「Ｇａｌ」）残基またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を持つこともあり、それらの残基は、必要に応じて、シアル酸またはシアル酸誘導体（例えば「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」。ここに「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を指し、Ａｃはアセチルを指す）で修飾される。複合型Ｎ−グリカンは、「バイセクティング」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を持つこともある。複合型Ｎ−グリカンは、「トリマンノース」コア上に複数のアンテナを持つこともあり、しばしば「マルチアンテナ型グリカン」と呼ばれる。「ハイブリッド」型Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端に少なくとも一つのＧｌｃＮＡｃを持ち、トリマンノースコアの１，６マンノースアーム上に０またはそれ以上のマンノースを持つ。さまざまなＮ−グリカンを「グリコフォーム」ともいう。 N-glycans have a common pentasaccharide core, Man ₃ GlcNAc ₂ (“Man” refers to mannose, “Glc” refers to glucose, “NAc” refers to N-acetyl, and GlcNAc refers to N— Refers to acetylglucosamine). N-glycans are terminal sugars (eg, GclNAc, galactose, fucose and so on) that are added to the Man ₃ GlcNAc ₂ (“Man3”) core structure (also referred to as “trimannose structure”, “pentose core” or “small mannose core”). The number of branches (antennas) containing (sialic acid) is different. N-glycans are classified according to their branching components (eg, high mannose, complex or hybrid). “High mannose” type N-glycans have 5 or more mannose residues. “Complex” N-glycans typically have at least one GlcNAc bound to the 1,3 mannose arm of the “trimannose” core and at least one GlcNAc bound to the 1,6 mannose arm. . Complex N-glycans may have galactose (“Gal”) or N-acetylgalactosamine (“GalNAc”) residues, which residues may be sialic acid or sialic acid derivatives, as appropriate. (Eg “NANA” or “NeuAc”, where “Neu” refers to neuraminic acid and Ac refers to acetyl). Complex N-glycans may have intrachain substitutions including “bisecting” GlcNAc and core fucose (“Fuc”). Complex N-glycans may have multiple antennas on a “trimannose” core, often referred to as “multi-antenna glycans”. “Hybrid” type N-glycans have at least one GlcNAc at the end of the 1,3 mannose arm of the trimannose core and zero or more mannose on the 1,6 mannose arm of the trimannose core. Various N-glycans are also referred to as “glycoforms”.

本明細書で使用する省略形は当分野で一般的に使用されているものである。例えば上述した糖の省略形を参照されたい。他の一般的な省略形には、例えば「ＰＮＧａｓｅ」または「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」があり、これらはいずれもペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を指す。 Abbreviations used herein are those commonly used in the art. See, for example, the sugar abbreviations described above. Other common abbreviations are, for example, “PNGase” or “glycanase” or “glucosidase”, which all refer to the peptide N-glycosidase F (EC 3.2.2.18).

「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ、ＤＮＡまたは混成ポリマー）は、その天然の宿主細胞でネイティブポリヌクレオチドに天然に随伴している他の細胞成分、例えばそれが天然に結合しているリボソーム、ポリメラーゼおよびゲノム配列などから、実質的に分離されているものである。この用語は、（１）その天然環境から取り出された核酸またはポリヌクレオチド、（２）自然界においてその「単離されたポリヌクレチド」を内包するポリヌクレオチドの全部または一部と結合していない核酸またはポリヌクレオチド、（３）自然界ではそれが連結していないポリヌクレオチドに作動的に連結している核酸またはポリヌクレオチド、または（４）自然界には存在しない核酸またはポリヌクレオチドを包含する。「単離された」または「実質的に単離された」という用語は、組換え体またはクローン化されたＤＮＡ単離物、化学合成されたポリヌクレオチド類似体、または異種の系によって生物学的に合成されるポリヌクレオチド類似体についても使用することができる。 An “isolated” or “substantially pure” nucleic acid or polynucleotide (eg, RNA, DNA or a hybrid polymer) is another cellular component that naturally accompanies the native polynucleotide in its natural host cell, For example, it is substantially separated from ribosomes, polymerases and genomic sequences to which it is naturally bound. The terms include: (1) a nucleic acid or polynucleotide removed from its natural environment, (2) a nucleic acid or polynucleotide that is not bound to all or part of the polynucleotide that naturally encloses the “isolated polynucleotide”. Nucleotides include (3) a nucleic acid or polynucleotide that is operatively linked to a polynucleotide to which it is not linked in nature, or (4) a nucleic acid or polynucleotide that does not exist in nature. The terms “isolated” or “substantially isolated” refer to biologically by recombinant or cloned DNA isolates, chemically synthesized polynucleotide analogs, or heterologous systems. Polynucleotide analogs synthesized in can also be used.

しかし、「単離された」は、そのように記述された核酸またはポリヌクレオチドそのものが、そのネイティブ環境から物理的に取り出されていることを、必ずしも必要としない。例えばある生物のゲノム中の内在性核酸配列は、その内在性核酸配列に隣接して、この内在性核酸配列の発現が改変されるような形で異種配列が置かれるのであれば、ここでは「単離された」とみなされる。この文脈において、異種配列とは内在性核酸配列に天然には隣接していない配列であり、その異種配列そのものが内在性である（同じ宿主細胞またはその子孫に由来する）か、外因性である（異なる宿主細胞またはその子孫に由来する）かは問わない。例えば、宿主細胞のゲノムにおける、ある遺伝子のネイティブプロモーターを、この遺伝子が改変された発現パターンを持つように、プロモーター配列で（例えば相同組換えによって）置換することができる。そうすると、この遺伝子は「単離された」遺伝子になる。なぜなら、それに天然に隣接している配列の少なくとも一部から、それが分離されるからである。 However, “isolated” does not necessarily require that the nucleic acid or polynucleotide so described itself be physically removed from its native environment. For example, if an endogenous nucleic acid sequence in the genome of an organism is adjacent to the endogenous nucleic acid sequence and the heterologous sequence is placed in such a way that the expression of the endogenous nucleic acid sequence is altered, then “ It is considered “isolated”. In this context, a heterologous sequence is a sequence that is not naturally adjacent to an endogenous nucleic acid sequence, and the heterologous sequence itself is endogenous (derived from the same host cell or its progeny) or exogenous. Whether it is derived from a different host cell or its progeny. For example, the native promoter of a gene in the host cell genome can be replaced with a promoter sequence (eg, by homologous recombination) such that the gene has an altered expression pattern. The gene then becomes an “isolated” gene. This is because it is separated from at least part of the sequence that is naturally adjacent to it.

核酸は、それが、ゲノム中の対応する核酸に天然には起こらない何らかの修飾を含有する場合にも、「単離された」とみなされる。例えば内在性コード配列は、それが人工的に（例えば人間の介入によって）導入された挿入、欠失または点突然変異を含有する場合には、「単離された」とみなされる。「単離された核酸」には、宿主細胞染色体の非相同部位に組み込まれた核酸、およびエピソームとして存在する核酸コンストラクトも含まれる。さらにまた、「単離された核酸」は、他の細胞物質を実質的に含まないこと、組換え技法によって製造される場合には培養培地を実質的に含まないこと、または化学合成される場合には化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないこともできる。 A nucleic acid is also considered “isolated” if it contains any modifications that do not naturally occur to the corresponding nucleic acid in a genome. For example, an endogenous coding sequence is considered “isolated” if it contains an insertion, deletion, or point mutation introduced artificially (eg, by human intervention). "Isolated nucleic acid" also includes nucleic acids that are integrated into non-homologous sites on the host cell chromosome and nucleic acid constructs that exist as episomes. Furthermore, an “isolated nucleic acid” is substantially free of other cellular material, is substantially free of culture medium when produced by recombinant techniques, or is chemically synthesized. Can be substantially free of chemical precursors or other chemicals.

本明細書で使用する、基準核酸配列の「縮重変種」という表現は、標準遺伝暗号に従って翻訳することにより、基準核酸配列から翻訳されたものと同一のアミノ酸配列をもたらすことができる核酸配列を包含する。「縮重オリゴヌクレオチド」または「縮重プライマー」という用語は、配列は必ずしも同一でないが１またはそれ以上の個別セグメント内で互いに相同であるような標的核酸配列とハイブリダイズする能力を持つオリゴヌクレオチドを示すために用いられる。 As used herein, the expression “degenerate variant” of a reference nucleic acid sequence refers to a nucleic acid sequence that can be translated according to the standard genetic code to yield the same amino acid sequence as translated from the reference nucleic acid sequence. Include. The term “degenerate oligonucleotide” or “degenerate primer” refers to an oligonucleotide that is capable of hybridizing to a target nucleic acid sequence such that the sequences are not necessarily identical but are homologous to each other within one or more individual segments. Used to indicate.

核酸配列との関連において、「配列一致率」または「同一」という用語は、一致が最大になるように整列した場合に、二つの配列中で同じである残基を指す。配列一致度比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、さらに典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６またはそれ以上のヌクレオチドのストレッチに及びうる。当分野では、ヌクレオチド配列一致度を測定するために使用することができるいくつかの異なるアルゴリズムが知られている。例えばポリヌクレオチド配列は、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅＶｅｒｓｉｏｎ１０．０（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン）中のプログラムであるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを使って比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリ配列と検索配列の間の最適オーバーラップ領域のアラインメントおよび配列一致率を与える。Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98(1990)（参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。例えば、核酸配列間の配列一致率は、参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧＶｅｒｓｉｏｎ６．１で用意されているとおりに、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６およびスコアリング行列にはＮＯＰＡＭファクタ）で使用するか、Ｇａｐをそのデフォルトパラメータで使用することにより、決定することができる。あるいは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Altschulら, J. MoI. Biol. 215:403-410(1990)；GishおよびStates, Nature Genet. 3:266-272(1993)；Maddenら, Meth. Enzymol 266:131-141(1996)；Altschulら, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997)；ZhangおよびMadden, Genome Res. 7:649-656(1997))、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Altschulら, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997))を使って、配列を比較することもできる。 In the context of nucleic acid sequences, the term “sequence identity” or “identical” refers to residues that are the same in two sequences when aligned for maximum correspondence. The length of the sequence identity comparison is at least about 9 nucleotides, usually at least about 20 nucleotides, more usually at least about 24 nucleotides, typically at least about 28 nucleotides, more typically at least about 32 nucleotides, Preferably it can span a stretch of at least about 36 or more nucleotides. A number of different algorithms are known in the art that can be used to measure nucleotide sequence identity. For example, polynucleotide sequences can be compared using the programs FASTA, Gap or Bestfit in the Wisconsin Package Version 10.0 (Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis.). FASTA gives the alignment of the optimal overlap region between the query sequence and the search sequence and the sequence match rate. Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990), which is incorporated herein by reference in its entirety. For example, the percent identity between nucleic acid sequences is FASTA default parameters (NOPAM factor for word size 6 and scoring matrix) as provided in GCG Version 6.1, which is incorporated herein by reference. Or by using Gap with its default parameters. Alternatively, the computer program BLAST (Altschul et al., J. MoI. Biol. 215: 403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet. 3: 266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol 266: 131- 141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997); Zhang and Madden, Genome Res. 7: 649-656 (1997)), especially blastp or tblastn (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)) can also be used to compare sequences.

核酸またはその断片に関して、「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、適当なヌクレオチド挿入またはヌクレオチド欠失を加えてもう一つの核酸配列（またはその相補鎖）と最適に整列させた場合に、何らかの周知の配列一致度アルゴリズム、例えば上述のＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐで測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約５０％、より好ましくは６０％、通常は少なくとも約７０％、より一般的には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％に、ヌクレオチド配列一致があることを示す。 With respect to a nucleic acid or fragment thereof, the terms “substantial homology” or “substantial similarity” are optimally aligned with another nucleic acid sequence (or its complementary strand) with appropriate nucleotide insertions or nucleotide deletions. At least about 50%, more preferably 60%, usually at least about 70% of the nucleotide base, as measured by any well-known sequence identity algorithm, such as FASTA, BLAST or Gap as described above. Indicates at least about 80%, preferably at least about 90%, more preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of the nucleotide bases have a nucleotide sequence match.

あるいは、実質的相同性または類似性は、ある核酸またはその断片がもう一つの核酸、またはもう一つの核酸の鎖、またはその相補鎖に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験との関連において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」は、いくつかの異なる物理的パラメータに依存する。当業者にはすぐに理解されるだろうが、核酸ハイブリダイゼーションは、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補領域の長さ、およびハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数などといった条件による影響を受けるだろう。これらのパラメータを変動させて、個別のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを達成する方法は、当業者には知られている。 Alternatively, substantial homology or similarity exists when a nucleic acid or fragment thereof hybridizes under stringent hybridization conditions to another nucleic acid, or another nucleic acid strand, or its complementary strand. To do. In the context of nucleic acid hybridization experiments, “stringent hybridization conditions” and “stringent wash conditions” depend on several different physical parameters. As will be readily appreciated by those skilled in the art, nucleic acid hybridization involves salt concentration, temperature, solvent, base composition of hybridizing species, length of complementary region, and nucleotide base mismatch between hybridizing nucleic acids. It will be affected by conditions such as numbers. Methods of varying these parameters to achieve individual hybridization stringencies are known to those skilled in the art.

一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、個別の条件セット下で、その特定ＤＮＡハイブリッドの熱融解温度（Ｔ_m）より約２５℃低い温度で行われる。「ストリンジェントな洗浄」は、個別の条件セット下で、その特定ＤＮＡハイブリッドのＴ_mより約５℃低い温度で行われる。Ｔ_mは、完全に合致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。参照により本明細書に組み込まれるSambrookら「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1989)の９．５１頁を参照されたい。ここでは、「ストリンジェントな条件」が、液相ハイブリダイゼーションに関して、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは３．０ＭＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含有する）、１％ＳＤＳ中、６５℃で８〜１２時間の水系ハイブリダイゼーション（すなわちホルムアミドを含まない）の後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間ずつ２回の洗浄と定義される。６５℃でのハイブリダイゼーションが、いくつかの因子、例えばハイブリダイズしている配列の長さおよび一致率などに依存して異なる速度で起こることは、当業者には理解されるだろう。 In general, “stringent hybridization” is performed at a temperature about 25 ° C. lower than the thermal melting temperature (T _m ) of the specific DNA hybrid under a particular set of conditions. “Stringent washing” is performed at a temperature about 5 ° C. below the T _{m of the} specific DNA hybrid under a separate set of conditions. T _m is the temperature at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe. See Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), page 9.51, incorporated herein by reference. Here, “stringent conditions” are 6 × SSC (20 × SSC contains 3.0 M NaCl and 0.3 M sodium citrate), 1% SDS at 65 ° C. for liquid phase hybridization. It is defined as two washes for 20 minutes at 65 ° C. in 0.2 × SSC, 0.1% SDS after ˜12 hours of aqueous hybridization (ie, no formamide). One skilled in the art will appreciate that hybridization at 65 ° C. occurs at different rates depending on several factors, such as the length and identity of the hybridizing sequences.

「突然変異した」という用語を核酸配列に適用する場合、それは、基準核酸配列と比較して、核酸配列中のヌクレオチドを挿入するか、欠失させるか、または変化させうることを意味する。単一の改変を一つの座に加えるか（点突然変異）、単一の座で複数のヌクレオチドを挿入し、欠失させ、または変化させることができる。さらにまた、１またはそれ以上の改変を、核酸配列内のいくつもの座に加えることもできる。核酸配列は、当分野で知られている任意の方法によって、例えば突然変異誘発技法、例えば「エラープローンＰＣＲ」（ＰＣＲ産物の全長にわたって高率の点突然変異が得られるように、ＤＮＡポリメラーゼの複写忠実度が低くなる条件下でＰＣＲを行う方法；例えばLeungら, Technique, 1:11-15(1989)ならびにCaldwellおよびJoyce, PCR Methods Applic. 2:28-33(1992)を参照されたい）および「オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発法」（関心対象である任意のクローン化ＤＮＡセグメント中に部位特異的突然変異を生成させることを可能にする方法；例えばReidhaar-OlsonおよびSauer, Science 241:53-57(1988)を参照されたい）などによって（ただしこれに限定するわけではない）、突然変異させることができる。 When the term “mutated” is applied to a nucleic acid sequence, it means that nucleotides in the nucleic acid sequence can be inserted, deleted or altered as compared to the reference nucleic acid sequence. A single modification can be made at one locus (point mutation), or multiple nucleotides can be inserted, deleted or changed at a single locus. Furthermore, one or more modifications can be made at any number of loci within the nucleic acid sequence. Nucleic acid sequences can be generated by any method known in the art, eg, mutagenesis techniques such as “error prone PCR” (replication of DNA polymerases to obtain a high rate of point mutations over the entire length of the PCR product. (See, eg, Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989) and Caldwell and Joyce, PCR Methods Applic. 2: 28-33 (1992)) and low fidelity conditions) “Oligonucleotide-directed mutagenesis” (a method that allows site-specific mutations to be generated in any cloned DNA segment of interest; eg Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241: 53-57 (See (1988)), etc. (but not limited to).

本明細書で使用する「ベクター」という用語は、それを連結しておいたもう一つの核酸を輸送する能力を持つ核酸分子を指すものとする。ベクターの一タイプは「プラスミド」であり、これは、追加ＤＮＡセグメントをその中にライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。他のベクターには、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）などがある。もう一タイプのベクターはウイルスベクターであり、この場合は、追加ＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲートすることができる（後に詳述する）。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律的に複製する能力を持つ（例えば宿主細胞中で機能する複製起点を持つベクター）。別のベクターは、宿主細胞中に導入されると、宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、その結果、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらにまた、ある種の好ましいベクターは、それらが作動的に連結される遺伝子の発現を指示する能力を持つ。そのようなベクターを、本明細書では、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）という。 As used herein, the term “vector” is intended to refer to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been linked. One type of vector is a “plasmid”, which refers to a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated. Other vectors include cosmids, bacterial artificial chromosomes (BAC) and yeast artificial chromosomes (YAC). Another type of vector is a viral vector, in which additional DNA segments can be ligated into the viral genome (detailed below). Certain vectors have the ability to replicate autonomously in the host cell into which they are introduced (eg, vectors having an origin of replication that functions in the host cell). Another vector, when introduced into a host cell, can integrate into the genome of the host cell and, as a result, replicate with the host genome. Furthermore, certain preferred vectors have the ability to direct the expression of genes to which they are operably linked. Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” (or simply “expression vectors”).

本明細書で使用する「関心対象配列」または「関心対象遺伝子」という用語は、その宿主細胞内で通常は産生されない核酸配列（典型的にはタンパク質をコードするもの）を指す。本明細書に開示する方法は、１またはそれ以上の関心対象配列が、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれることを可能にする。関心対象配列の限定でない例には、１またはそれ以上の、酵素活性を持つポリペプチド、例えば宿主中でＮ−グリカン合成に影響を及ぼす酵素、例えばマンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン輸送体、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼなどをコードする配列が含まれる。 As used herein, the term “sequence of interest” or “gene of interest” refers to a nucleic acid sequence (typically encoding a protein) that is not normally produced in the host cell. The methods disclosed herein allow one or more sequences of interest to be stably integrated into the host cell genome. Non-limiting examples of sequences of interest include one or more polypeptides with enzymatic activity, such as enzymes that affect N-glycan synthesis in the host, such as mannosyltransferase, N-acetylglucosaminyltransferase, UDP Sequences encoding -N-acetylglucosamine transporter, galactosyltransferase, UDP-N-acetylgalactosyltransferase, sialyltransferase, fucosyltransferase and the like are included.

「マーカー配列」または「マーカー遺伝子」という用語は、宿主細胞内でその配列の有無に関する陽性選択または陰性選択を可能にする活性を発現させる能力を持つ核酸配列を指す。例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＵＲＡ５遺伝子はマーカー遺伝子である。なぜならその存在は、その遺伝子を含有する細胞がウラシルの不在下で成長できるということによって、選択することができるからである。その存在は、その遺伝子を含有する細胞が５−ＦＯＡの存在下で成長できないということによって、逆選択することもできる。マーカー配列またはマーカー遺伝子が、陽性選択可能性と陰性選択可能性の両方を持つ必要は必ずしもない。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のマーカー配列またはマーカー遺伝子の限定でない例には、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４およびＵＲＡ３が含まれる。抗生物質耐性マーカー遺伝子、カナマイシン、ネオマイシン、ジェネティシン（またはＧ４１８）、パロモマイシンおよびハイグロマイシン耐性遺伝子は、これらの抗生物質の存在下での成長を可能にするために、よく用いられる。 The term “marker sequence” or “marker gene” refers to a nucleic acid sequence capable of expressing an activity that allows positive or negative selection for the presence or absence of the sequence in a host cell. For example, P.I. The pastoris URA5 gene is a marker gene. Because its presence can be selected by the ability of cells containing the gene to grow in the absence of uracil. Its presence can also be counter-selected by the fact that cells containing the gene cannot grow in the presence of 5-FOA. The marker sequence or marker gene need not necessarily have both positive and negative selectability. P. Non-limiting examples of marker sequences or marker genes from pastoris include ADE1, ARG4, HIS4 and URA3. Antibiotic resistance marker genes, kanamycin, neomycin, geneticin (or G418), paromomycin and hygromycin resistance genes are commonly used to allow growth in the presence of these antibiotics.

「作動的に連結された」発現制御配列とは、発現制御配列が関心対象遺伝子を制御するために関心対象遺伝子に隣接している連結、ならびにトランスに作用するか遠隔作用して関心対象遺伝子を制御する発現制御配列を指す。 An “operably linked” expression control sequence is a linkage in which the expression control sequence is adjacent to the gene of interest to control the gene of interest, as well as acting on the trans or acting remotely to define the gene of interest. Refers to the expression control sequence to be controlled.

本明細書で使用する「発現制御配列」という用語は、それが作動的に連結されるコード配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、適当な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率の良いＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（例えばリボソーム結合部位）；タンパク質の安定性を高める配列；および、所望であれば、タンパク質の分泌を増進する配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物に依存して相違し、原核生物の場合、そのような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現にとって不可欠である全ての成分を、最低限、包含するものとし、その存在が有利であるような追加成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も包含することができる。 The term “expression control sequence” as used herein refers to a polynucleotide sequence that is necessary to affect the expression of a coding sequence to which it is operably linked. Expression control sequences are sequences that control transcription, post-transcriptional events and translation of nucleic acid sequences. Expression control sequences include appropriate transcription initiation sequences, transcription termination sequences, promoter sequences and enhancer sequences; efficient RNA processing signals such as splicing signals and polyadenylation signals; sequences that stabilize cytoplasmic mRNA; sequences that enhance translation efficiency (Eg, a ribosome binding site); sequences that enhance protein stability; and, if desired, sequences that enhance protein secretion. The nature of such control sequences varies depending on the host organism, and in the case of prokaryotes, such control sequences generally include a promoter, a ribosome binding site, and a transcription termination sequence. The term “regulatory sequence” shall, at a minimum, include all components whose presence is essential for expression, and also include additional components such as leader sequences and fusion partner sequences whose presence is advantageous. be able to.

本明細書で使用する「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」「発現宿主系」「発現系」または単に「宿主細胞」）という用語は、組換えベクターが導入されている細胞を指すものとする。そのような用語は個別の対象細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫も指すものであると理解すべきである。後続の世代では突然変異または環境の影響によってある程度の変異が起こりうるので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、それでもなお、本明細書で使用する「宿主細胞」という用語の範囲に包含される。組換え宿主細胞は、培養で生育した単離された細胞もしくは細胞系であるか、または生きている組織もしくは生物内に存在する細胞であることができる。 As used herein, the term “recombinant host cell” (“expression host cell”, “expression host system”, “expression system” or simply “host cell”) refers to a cell into which a recombinant vector has been introduced. And It should be understood that such terms refer not only to individual subject cells, but also to the progeny of such cells. Such progeny may not actually be identical to the parental cell, as some variation may occur due to mutations or environmental effects in subsequent generations, but nevertheless as used herein. Included within the scope of the term “host cell”. A recombinant host cell can be an isolated cell or cell line grown in culture, or a cell present in a living tissue or organism.

「真核生物（の）」という用語は有核の細胞または生物を指し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、動物細胞および下等真核細胞を包含する。 The term “eukaryotic” refers to a nucleated cell or organism and includes insect cells, plant cells, mammalian cells, animal cells and lower eukaryotic cells.

「下等真核細胞」という用語は、酵母、真菌、襟鞭毛虫、微胞子虫、アルベオラータ（例えば渦鞭毛虫）、ストラメノパイル（例えば褐藻類、原虫類）、紅色植物（例えば紅藻類）、植物（例えば緑藻、植物細胞、コケ）および他の原生生物を包含する。酵母および真菌には以下に挙げるものが含まれるが、これらに限定されるわけではない：Ｐｉｃｈｉａ属の種、例えばＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａｐｉｊｐｅｒｉ、ＰｉｃｈｉａｓｔｉｐｔｉｓおよびＰｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の種、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の種、例えばＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ；Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属の種、例えばＦｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ；ＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａｐａｔｅｎｓおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ。 The term “lower eukaryotic cells” refers to yeast, fungi, dinoflagellates, microsporidia, albeolata (eg dinoflagellates), stramenopile (eg brown algae, protozoa), red plants (eg red algae) , Including plants (eg, green algae, plant cells, moss) and other protists. Yeast and fungi include, but are not limited to, species of the genus Pichia, such as Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membran, Pichia membran, Pichia Lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salicaria, Pichia guercumum, Pichia pijperi, Pichia schitropis and Pichia siptis charomyces cerevisiae; Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp, e.g. Kluyveromyces lactis; Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp, for example Fusarium gramineum, Fusarium venenatum; Physcomitrella patens and Neurospora crassa .

本明細書で使用する「ペプチド」という用語は、短いポリペプチド、例えば典型的には約５０アミノ酸長未満、より典型的には約３０アミノ酸長未満のものを指す。本明細書で使用する場合、この用語は、類似体、および構造を模倣することによって生物学的機能を模倣するミメティックを包含する。 The term “peptide” as used herein refers to a short polypeptide, eg, one that is typically less than about 50 amino acids long, more typically less than about 30 amino acids long. As used herein, the term encompasses analogs and mimetics that mimic biological functions by mimicking structure.

「ポリペプチド」という用語は、天然タンパク質と非天然タンパク質の両方、ならびにその断片、突然変異体、誘導体および類似体を包含する。ポリペプチドは単量体でも多量体でもよい。さらにポリペプチドは、それぞれが１またはそれ以上の異なる活性を持ついくつかの異なるドメインを含むことができる。 The term “polypeptide” encompasses both natural and non-natural proteins, as well as fragments, mutants, derivatives and analogs thereof. Polypeptides may be monomeric or multimeric. In addition, a polypeptide can include several different domains, each with one or more different activities.

「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」という用語は、その起源または由来源ゆえに、（１）そのネイティブ状態においてそれに随伴している天然付随成分と結合していないか、（２）自然界では見出されない純度（この場合、純度は他の細胞物質の存在に関して判断することができる）で存在する（例えば同じ種に由来する他のタンパク質を含まない）か、（３）異なる種に由来する細胞によって発現されるか、または（４）自然界には存在しない（例えば自然界に見出されるポリペプチドの断片であるか、自然界には見出されないアミノ酸類似体または誘導体を含むか、標準的ペプチド結合以外の結合を含む）タンパク質またはポリペプチドである。したがって、化学合成されたポリペプチド、またはその天然の起源である細胞とは異なる細胞系内で合成されたポリペプチドは、その天然付随成分から「単離される」だろう。ポリペプチドまたはタンパク質は、当分野で周知のタンパク質精製技法を使って単離することにより、天然付随成分を実質的に含まないようにすることもできる。このように定義されるので、「単離された」とは、そのように記述されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドが、そのネイティブ環境から物理的に取り出されていることを必ずしも必要としない。 The term “isolated protein” or “isolated polypeptide” may, because of its origin or origin, be (1) not bound to its naturally associated components associated with it in its native state, ( 2) exists in a purity not found in nature (in this case, the purity can be judged with respect to the presence of other cellular material) (eg does not include other proteins from the same species) or (3) different Expressed by a cell derived from a species, or (4) non-naturally occurring (eg, a fragment of a polypeptide found in nature, or containing an amino acid analog or derivative not found in nature, or standard A protein or polypeptide (including bonds other than specific peptide bonds). Thus, a chemically synthesized polypeptide, or a polypeptide synthesized in a cell line different from the cell from which it is naturally derived, will be “isolated” from its naturally associated components. Polypeptides or proteins can also be made substantially free of naturally associated components by isolation using protein purification techniques well known in the art. As so defined, “isolated” does not necessarily require that the protein, polypeptide, peptide or oligopeptide so described has been physically removed from its native environment. do not do.

本明細書で使用する「ポリペプチド断片」という用語は、完全長ポリペプチドと比較して欠失、例えばアミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、ポリペプチド断片が連続した配列であり、その断片のアミノ酸配列は、天然配列中の対応する位置と同一である。断片は、典型的には、少なくとも５、６、７、８、９または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６または１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０または４５アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０または６０アミノ酸長、さらに好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。 As used herein, the term “polypeptide fragment” refers to a polypeptide that has a deletion, eg, an amino-terminal and / or carboxy-terminal deletion, compared to a full-length polypeptide. In a preferred embodiment, the polypeptide fragment is a contiguous sequence and the amino acid sequence of the fragment is identical to the corresponding position in the native sequence. Fragments are typically at least 5, 6, 7, 8, 9 or 10 amino acids long, preferably at least 12, 14, 16 or 18 amino acids long, more preferably at least 20 amino acids long, more preferably at least 25, It is 30, 35, 40 or 45 amino acids, more preferably at least 50 or 60 amino acids long, more preferably at least 70 amino acids long.

「修飾誘導体」とは、一次構造配列は実質的に相同であるが、例えばインビボまたはインビトロ化学修飾および生化学修飾を含むか、ネイティブポリペプチドには見出されないアミノ酸を組み込んでいるポリペプチドまたはその断片を指す。当業者にはすぐに理解されるだろうが、そのような修飾には、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種などによる標識化、およびさまざまな酵素修飾が含まれる。ポリペプチドを標識化するためのさまざまな方法およびそのような目的に役立つさまざまな置換基またはラベルは、当分野では周知であり、放射性同位体、例えば¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、および³Ｈ、標識された抗リガンド（例えば抗体）に結合するリガンド、蛍光団、化学発光剤、酵素、および標識されたリガンドの特異的結合対メンバーとして役立ちうる抗リガンドが含まれる。ラベルの選択は要求される感度、プライマーとのコンジュゲーションの容易さ、安定性要件、および利用可能な計測手段に依存する。ポリペプチドを標識化するための方法は当分野では周知である。例えばAusubelら「Current Protocols in Molecular Biology」Greene Publishing Associates(1992および2002年までのSupplement）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。 “Modified derivative” refers to a polypeptide or its polypeptide that is substantially homologous in primary structure but includes, for example, in vivo or in vitro chemical and biochemical modifications, or incorporates amino acids not found in native polypeptides. Refers to a fragment. As will be readily appreciated by those skilled in the art, such modifications include, for example, acetylation, carboxylation, phosphorylation, glycosylation, ubiquitination, labeling with, for example, radionuclides, and various enzyme modifications. included. Various methods for labeling polypeptides and various substituents or labels useful for such purposes are well known in the art and include radioisotopes such as ¹²⁵ I, ³² P, ³⁵ S, and ³ H. , Ligands that bind to labeled anti-ligands (eg, antibodies), fluorophores, chemiluminescent agents, enzymes, and anti-ligands that can serve as specific binding pair members of the labeled ligand. The choice of label depends on the sensitivity required, ease of conjugation with the primer, stability requirements, and available instrumentation. Methods for labeling polypeptides are well known in the art. See, for example, Ausubel et al. “Current Protocols in Molecular Biology” Greene Publishing Associates (Supplement by 1992 and 2002), incorporated herein by reference.

「融合タンパク質」という用語は、異種アミノ酸配列に結合されたポリペプチドまたは断片を含むポリペプチドを指す。融合タンパク質は、２またはそれ以上の異なるタンパク質に由来する２またはそれ以上の望ましい機能的要素を含有するように構築することができるので、有用である。融合タンパク質は、関心対象のポリペプチドに由来する少なくとも１０個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０個または３０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも４０、５０または６０個のアミノ酸、より一層好ましくは少なくとも７５、１００または１２５個のアミノ酸を含む。本発明のタンパク質を全部含む融合物は特に有用である。本発明の融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチドは少なくとも６アミノ酸長、多くの場合、少なくとも８アミノ酸長、効果的には少なくとも１５、２０、および２５アミノ酸長である。より大きいポリペプチド、例えば免疫グロブリンＦｃ断片、または免疫グロブリンＦａｂ断片、さらにはタンパク質全体、例えば緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）発色団含有タンパク質または完全長免疫グロブリンなどを含む融合物は、特に有用である。融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸と、同じ読み枠になるように（in frame）構築した後、融合タンパク質を発現させることによって、組換え生産することができる。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片をもう一つのタンパク質に架橋することによって、化学的に製造することもできる。 The term “fusion protein” refers to a polypeptide comprising a polypeptide or fragment linked to a heterologous amino acid sequence. Fusion proteins are useful because they can be constructed to contain two or more desirable functional elements from two or more different proteins. The fusion protein comprises at least 10 contiguous amino acids from the polypeptide of interest, more preferably at least 20 or 30 amino acids, even more preferably at least 40, 50 or 60 amino acids, even more preferably at least Contains 75, 100 or 125 amino acids. Fusions that include all of the proteins of the invention are particularly useful. The heterologous polypeptide contained in the fusion protein of the present invention is at least 6 amino acids long, often at least 8 amino acids long, and effectively at least 15, 20, and 25 amino acids long. Fusions comprising larger polypeptides, such as immunoglobulin Fc fragments, or immunoglobulin Fab fragments, as well as whole proteins such as green fluorescent protein (“GFP”) chromophore-containing proteins or full-length immunoglobulins are particularly useful. is there. A fusion protein is constructed by constructing a nucleic acid sequence encoding a polypeptide or fragment thereof in frame with a nucleic acid encoding a different protein or peptide, and then expressing the fusion protein. Can be produced in exchange. Alternatively, a fusion protein can be produced chemically by crosslinking a polypeptide or fragment thereof to another protein.

本明細書で使用する「抗体」「免疫グロブリン」「Ｉｇ」および「Ｉｇ分子」という用語は互換的に用いられる。各抗体分子は、それがその特異的抗原を結合することを可能にするユニークな構造を持つが、すべての抗体／免疫グロブリンは本明細書に記載するように同じ全体的構造を持っている。基本的な抗体構造単位は、サブユニットの四量体を含むことが知られている。各四量体は同一な二対のポリペプチド鎖を持ち、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を持つ。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能を担う定常領域を規定する。軽鎖はカッパまたはラムダに分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと規定する。軽鎖および重鎖は可変領域および定常領域に細分される（総論的には「Fundamental Immunology」（Paul, W.編, 第2版, Raven Press, ニューヨーク, 1989）の第７章（参照によりその全てがあらゆる目的で本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。各軽／重鎖対の可変領域が抗体結合部位を形成する。したがって完全な抗体は二つの結合部位を持つ。二官能性または二特異性抗体を除いて、二つの結合部位は同じである。鎖は全て、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる三つの超可変領域によって接合されているという、同じ一般構造を示す。各対の二つの鎖に由来するＣＤＲはフレームワーク領域によって整列され、それが特異的エピトープへの結合を可能にする。これらの用語は天然型ならびに断片および誘導体を包含する。この用語の範囲には、Ｉｇのクラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＤが包含される。これらの用語の範囲には、ＩｇＧのサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４も包含される。この用語は最も広い意味で用いられ、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）を包含すると共に、複数のエピトープまたは抗原に結合するであろう抗体組成物も包含する。これらの用語は、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二特異性抗体）を包含し、また抗体断片を、それらが、重鎖免疫グロブリン定常領域のＣ_H２ドメインのうち、Ｃ_H２ドメインのＮ−結合型グリコシル化部位を含む部分、またはその変種を少なくとも含有するか、含有するように修飾される限り、包含する。これらの用語には、Ｆｃ領域を含む分子、例えばイムノアドヘシン（米国特許出願公開第２００４／０１３６９８６号）、Ｆｃ融合物および抗体様分子が包含される。あるいは、これらの用語は、少なくともＮ−結合型グリコシル化部位を含有する含有する少なくともＦａｂ領域の抗体断片を指すこともできる。 As used herein, the terms “antibody”, “immunoglobulin”, “Ig” and “Ig molecule” are used interchangeably. Each antibody molecule has a unique structure that allows it to bind its specific antigen, but all antibodies / immunoglobulins have the same overall structure as described herein. The basic antibody structural unit is known to comprise a tetramer of subunits. Each tetramer has two identical pairs of polypeptide chains, each pair having one “light” chain (about 25 kDa) and one “heavy” chain (about 50-70 kDa). The amino-terminal portion of each chain contains a variable region of about 100-110 or more amino acids that is primarily responsible for antigen recognition. The carboxy-terminal portion of each chain defines a constant region primarily responsible for effector functions. Light chains are classified as kappa or lambda. Heavy chains are classified as gamma, mu, alpha, delta, or epsilon, and define the antibody's isotype as IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE, respectively. Light and heavy chains are subdivided into variable and constant regions (generally, Chapter 7 of “Fundamental Immunology” (Paul, W., Ed. 2, Raven Press, New York, 1989) All of which are incorporated herein for all purposes). The variable region of each light / heavy chain pair forms the antibody binding site. A complete antibody thus has two binding sites. Except for bifunctional or bispecific antibodies, the two binding sites are the same. All strands exhibit the same general structure in which a relatively conserved framework region (FR) is joined by three hypervariable regions, also called complementarity determining regions or CDRs. The CDRs from the two strands of each pair are aligned by the framework region, which allows binding to specific epitopes. These terms include natural forms as well as fragments and derivatives. This term includes the Ig classes, namely IgG, IgA, IgE, IgM, and IgD. The scope of these terms also includes IgG subtypes, namely IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. The term is used in the broadest sense and encompasses a single monoclonal antibody (including agonist and antagonist antibodies) as well as an antibody composition that will bind to multiple epitopes or antigens. These terms specifically include monoclonal antibodies (including full-length monoclonal antibodies), polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies), and antibody fragments that contain heavy chain immunity. It includes as long as it contains or is modified to contain at least a portion of the C _H 2 domain of a globulin constant region that includes an N-linked glycosylation site of the C _H 2 domain, or a variant thereof. These terms include molecules comprising an Fc region, such as immunoadhesins (US Patent Application Publication No. 2004/0136986), Fc fusions and antibody-like molecules. Alternatively, these terms can refer to antibody fragments of at least the Fab region containing at least N-linked glycosylation sites.

「Ｆｃ」断片という用語は、Ｃ_H２およびＣ_H３ドメインを含有する、抗体の「結晶性断片（fragment crystallized）」Ｃ末端領域を指す（図１）。「Ｆａｂ」断片という用語は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬドメインを含有する、抗体の「抗原結合性断片（fragment antigen binding）」領域を指す（図１）。 The term “Fc” fragment refers to the “fragment crystallized” C-terminal region of an antibody, which contains C _H 2 and C _H 3 domains (FIG. 1). The term “Fab” fragment refers to the “fragment antigen binding” region of an antibody, which contains the VH, CH1, VL and CL domains (FIG. 1).

本明細書で使用する「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわちその集団を構成する個々の抗体は、微量に存在する可能性がある考えうる天然の突然変異を除けば同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位を指向する。さらにまた、典型的には異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含んでいる従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各ｍＡｂは抗原上の単一の決定基を指向する。モノクローナル抗体はその特異性に加えて、他の免疫グロブリンの混入がないハイブリドーマ培養によって合成することができるという点でも有利である。「モノクローナル」という用語は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、何か特別な方法で抗体を製造することを要求していると解釈してはならない。例えば本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerら,（１９７５）Nature, ２５６：４９５に初めて記載されたハイブリドーマ法で製造してもよいし、組換えＤＮＡ法（例えばCabillyらの米国特許第４,８１６,５６７号を参照されたい）によって製造してもよい。 As used herein, the term “monoclonal antibody” (mAb) refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies. That is, the individual antibodies that make up the population are identical except for possible natural mutations that may be present in trace amounts. Monoclonal antibodies are highly specific and are directed to a single antigenic site. Furthermore, in contrast to conventional (polyclonal) antibody preparations that typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each mAb is directed against a single determinant on the antigen. . In addition to its specificity, monoclonal antibodies are also advantageous in that they can be synthesized by hybridoma culture free of other immunoglobulins. The term “monoclonal” indicates the character of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and should not be construed as requiring production of the antibody in any particular manner. For example, monoclonal antibodies used in accordance with the present invention may be produced by the hybridoma method first described in Kohler et al., (1975) Nature, 256: 495, or by recombinant DNA methods (eg, US Patent No. 4 of Cabilly et al. , 816, 567).

本明細書におけるモノクローナル抗体には、起源の種または免疫グロブリンクラスもしくはサブクラスの指定に拘わらずに、抗体の可変ドメイン（超可変ドメインを含む）を定常ドメインと接合するか（例えば「ヒト化」抗体）、軽鎖を重鎖と接合するか、ある種に由来する鎖を別の種に由来する鎖と接合するか、融合物を異種タンパク質と接合することによって製造されるハイブリッドおよび組換え抗体が含まれる（例えばＣａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号；MageおよびLamoyi「Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications」の79〜97頁(Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, 1987）を参照されたい）。本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、第１の種に由来する抗体中または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であると共に、鎖の残りの部分は、異なる種に由来する抗体中または異なる抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であるような「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を包含すると共に、そのような抗体の断片を、それらが、少なくとも一つのＣ_H２ドメインを含有するか、少なくとも一つのＣ_H２ドメインを含有するように修飾される限り、包含する。非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、ヒト免疫グロブリン由来の配列を含有する特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）₂、または抗体の他の抗原結合性サブ配列）である。抗体のＦｖ断
片は、その分子全体の結合特徴および特異性が保たれる抗体の最小単位である。Ｆｖ断片は非共有結合的に会合した抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインのヘテロ二量体である。Ｆ（ａｂ）'₂断片は、ジスルフィド橋によって連結されたＦａｂ断片の両ア
ームを含有する断片である。 Monoclonal antibodies herein include antibody variable domains (including hypervariable domains) joined to constant domains regardless of the species of origin or designation of immunoglobulin class or subclass (eg, “humanized” antibodies) Hybrid and recombinant antibodies produced by joining a light chain with a heavy chain, joining a chain from one species with a chain from another species, or joining a fusion with a heterologous protein (See, eg, Cabilly et al., US Pat. No. 4,816,567; Mage and Lamoyi “Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications” pages 79-97 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). The monoclonal antibody herein specifically includes a corresponding sequence in a part of a heavy chain and / or light chain in an antibody derived from a first species or in an antibody belonging to a specific antibody class or subclass. “Chimeric” antibodies (immunoglobulins) that are identical or homologous and in which the remainder of the chain is identical or homologous to corresponding sequences in antibodies from different species or in antibodies belonging to different antibody classes or subclasses ) along with including, fragments of such antibodies, they, or contains at least one C _H 2 domain, as long as it is modified to contain at least one C _H 2 domain, encompasses. “Humanized” forms of non-human (eg, murine) antibodies are specific chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof (eg, Fv, Fab, Fab ′, F (ab ′)) containing sequences derived from human immunoglobulins. ₂ , or other antigen-binding subsequence of the antibody). An Fv fragment of an antibody is the smallest unit of antibody that retains the binding characteristics and specificity of the molecule as a whole. Fv fragments are heterodimers of non-covalently associated antibody heavy and light chain variable domains. An F (ab) ′ ₂ fragment is a fragment containing both arms of an Fab fragment linked by a disulfide bridge.

ヒト化抗体の最も一般的な形態は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）が望ましい特異性、アフィニティ、および能力（capacity）を持つ非ヒト種（ドナー抗体）（例えばマウス、ラット、またはウサギ）のＣＤＲに由来する残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられる場合もある。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもインポートしたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良し最大化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、かつＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも一つ（典型的には二つ）の可変ドメインの実質的に全てを含むだろう。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部も含むだろう。さらなる詳細については、Jonesら, 1986, Nature 321:522-524；Reichmannら, 1988, Nature 332:323-327、およびPresta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596を参照されたい。 The most common forms of humanized antibodies are non-human species (donor antibodies) (eg, mouse, rat, or rabbit) that have the desired specificity, affinity, and capacity for the recipient's complementarity determining region (CDR). ) Human immunoglobulin (recipient antibody) replaced with residues from the CDRs of In some cases, Fv framework residues of the human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. Furthermore, humanized antibodies can comprise residues that are found neither in the recipient antibody nor in the imported CDR or framework sequences. These modifications are made to further refine and maximize antibody performance. In general, a humanized antibody has at least one of which all or substantially all of the CDR regions correspond to those of a non-human immunoglobulin, and all or substantially all of the CDR regions are of a human immunoglobulin consensus sequence. It will contain substantially all of the (typically two) variable domains. A humanized antibody optimally also will comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin. For further details see Jones et al., 1986, Nature 321: 522-524; Reichmann et al., 1988, Nature 332: 323-327, and Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596. I want.

抗体または免疫グロブリンという用語の範囲に含まれる「断片」には、その断片が標的分子に特異的に結合する能力を保っている限り、さまざまなプロテアーゼを使った消化によって生成するもの、化学的切断および／または化学的解離によって生成するもの、および組換え生産されるものが包含される。そのような断片には、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ'）₂、および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片がある。 “Fragments” within the scope of the term antibody or immunoglobulin include those produced by digestion with various proteases, chemical cleavage, as long as the fragments retain the ability to specifically bind to the target molecule. And / or those produced by chemical dissociation and those produced recombinantly. Such fragments include Fc, Fab, Fab ′, Fv, F (ab ′) ₂ , and single chain Fv (scFv) fragments.

本発明の抗体にとって興味深い標的には、成長因子受容体（例えばＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＮＧＦＲ、およびＶＥＧＦ）ならびにそれらのリガンドが含まれる。他の標的にはＧタンパク質受容体があり、これには、サブスタンスＫ受容体、アンギオテンシン受容体、α−およびβ−アドレナリン作動性受容体、セロトニン受容体、およびＰＡＦ受容体が含まれる。例えばGilman, Ann. Rev.Biochem. 56:625-649(1987)を参照されたい。他の標的には、イオンチャネル（例えばカルシウム、ナトリウム、カリウムチャネル）、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体、およびドーパミン受容体が含まれる（Ｈａｒｐｏｌｄ、Ｕ．Ｓ．５，４０１，６２９およびＵ．Ｓ．５，４３６，１２８を参照されたい）。他の標的には接着タンパク質類、例えばインテグリン、セレクチン、および免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーがある（Springer, Nature 346:425-433(1990)、Osborn, Cell 62:3(1990);Hynes, Cell 69:11(1992)参照）。他の標的にはサイトカイン類、例えばインターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、腫瘍成長因子β（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）などがある。「Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research」（Aggrawalら編, Blackwell Scientific, マサチューセッツ州ボストン, 1991）を参照されたい。他の標的には、ホルモン類、酵素類、ならびに細胞内および細胞間伝達物質、例えばアデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ、およびホスホリパーゼＣなどがある。興味深い他の標的は、白血球抗原、例えばＣＤ２０およびＣＤ３３である。薬物も興味深い標的になりうる。標的分子は、ヒト、哺乳動物または細菌の分子であることができる。他の標的には、病原微生物（ウイルス性および細菌性の両方）ならびに腫瘍に由来する抗原、例えばタンパク質、糖タンパク質および糖質がある。さらに他の標的はＵ．Ｓ．４，３６６，２４１に記述されている。 Interesting targets for the antibodies of the present invention include growth factor receptors (eg, FGFR, PDGFR, EGFR, NGFR, and VEGF) and their ligands. Other targets include G protein receptors, including substance K receptors, angiotensin receptors, α- and β-adrenergic receptors, serotonin receptors, and PAF receptors. See, for example, Gilman, Ann. Rev. Biochem. 56: 625-649 (1987). Other targets include ion channels (eg, calcium, sodium, potassium channels), muscarinic receptors, acetylcholine receptors, GABA receptors, glutamate receptors, and dopamine receptors (Harpold, US, 5,). 401,629 and U.S. 5,436,128). Other targets include adhesion proteins such as integrins, selectins, and immunoglobulin superfamily members (Springer, Nature 346: 425-433 (1990), Osborn, Cell 62: 3 (1990); Hynes, Cell 69: 11 (1992)). Other targets include cytokines such as interleukins IL-1 to IL-13, tumor necrosis factors α and β, interferons α, β and γ, tumor growth factor β (TGF-β), colony stimulating factor (CSF) and For example, granulocyte monocyte colony stimulating factor (GMCSF). See “Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research” (Aggrawal et al., Blackwell Scientific, Boston, Mass., 1991). Other targets include hormones, enzymes, and intracellular and intercellular transmitters such as adenyl cyclase, guanyl cyclase, and phospholipase C. Other targets of interest are leukocyte antigens such as CD20 and CD33. Drugs can also be interesting targets. The target molecule can be a human, mammalian or bacterial molecule. Other targets include pathogenic microorganisms (both viral and bacterial) and tumor-derived antigens such as proteins, glycoproteins and carbohydrates. Still other targets are U.S. S. 4,366,241.

本明細書で議論する免疫Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂおよびＦｃＲｎ（新生児受容体）を含めることができる。ＦｃγＲＩという用語は、別段の指定がない限り、任意のＦｃγＲＩサブタイプを指すことができる。ＦｃγＲＩＩという用語は、別段の指定がない限り、任意のＦｃγＲＩＩ受容体を指すことができる。ＦｃγＲＩＩＩという用語は、別段の指定がない限り、任意のＦｃγＲＩＩＩサブタイプを指す。 The immune Fc receptors discussed herein can include FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb, and FcRn (neonatal receptors). The term FcγRI can refer to any FcγRI subtype unless specified otherwise. The term FcγRII can refer to any FcγRII receptor unless otherwise specified. The term FcγRIII refers to any FcγRIII subtype unless specified otherwise.

この用語の範囲に含まれる「誘導体」には、配列は変更されているが、標的分子への特異的結合能は保っている抗体（またはその断片）、例えば種間キメラおよびヒト化抗体；抗体融合物；ヘテロマー抗体複合体および抗体融合物、例えばダイアボディ（二特異性抗体）、単鎖ダイアボディ、およびイントラボディなどが含まれる（例えば「Intracellular Antibodies: Research and Disease Applications」（Marasco編, Springer-Verlag New York, Inc., 1998)を参照されたい)。 “Derivatives” within the scope of this term include antibodies (or fragments thereof) that are altered in sequence but retain specific binding ability to the target molecule, such as interspecies chimeric and humanized antibodies; antibodies Fusions; include heteromeric antibody conjugates and antibody fusions such as diabodies (bispecific antibodies), single chain diabodies, and intrabodies (eg, “Intracellular Antibodies: Research and Disease Applications” (Edited by Marasco, Springer -See Verlag New York, Inc., 1998).

「非ペプチド類似体」という用語は、基準ポリペプチドの性質と類似する性質を持つ化合物を指す。非ペプチド化合物は「ペプチドミメティック（peptide mimeticまたはpeptidomimetic）」と呼ぶこともできる。例えばJones「Amino Acid and Peptide Synthesis」Oxford University Press(1992)；Jung「Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook」John Wiley(1997)；Bodanszkyら「Peptide Chemistry-A Practical Textbook」Springer Verlag(1993)；「Synthetic Peptides: A Users Guide」（Grant編, Ｗ.Ｈ.Freeman and Co., 1992）；Evansら, J. Med. Chem. 30:1229(1987)；Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29(1986)；VeberおよびFreidinger, Trends Neurosci., 8:392-396(1985)；ならびに上記の各文献で言及されている文献などを参照されたい（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）。そのような化合物は、多くの場合、コンピュータ分子モデリングを利用して開発される。本発明の有用なペプチドと構造的に類似するペプチドミメティックは、等価な効果を生み出すために使用することができるので、本発明の一部とみなされる。 The term “non-peptide analog” refers to a compound having properties similar to those of the reference polypeptide. Non-peptide compounds can also be referred to as “peptide mimetic or peptidomimetic”. For example, Jones “Amino Acid and Peptide Synthesis” Oxford University Press (1992); Jung “Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook” John Wiley (1997); Bodanszky et al. “Peptide Chemistry-A Practical Textbook” Springer Verlag (1993); Synthetic Peptides: A Users Guide "(Grant, W. H. Freeman and Co., 1992); Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987); Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber and Freidinger, Trends Neurosci., 8: 392-396 (1985); and references mentioned in each of the above references (these references are incorporated herein by reference). ) Such compounds are often developed using computer molecular modeling. Peptide mimetics that are structurally similar to the useful peptides of the invention are considered part of the invention because they can be used to produce equivalent effects.

アミノ酸置換には、そのような類似体の（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるもの、（２）酸化に対する感受性を低下させるもの、（３）タンパク質複合体を形成するための結合アフィニティを変化させるもの、（４）結合アフィニティまたは酵素活性を変化させるもの、および（５）他の物理化学的性質または機能的性質を付与または変更するものを含めることができる。 Amino acid substitutions include (1) reducing the sensitivity to proteolysis of such analogs, (2) reducing the sensitivity to oxidation, and (3) changing the binding affinity to form a protein complex. (4) those that alter binding affinity or enzyme activity, and (5) those that impart or modify other physicochemical or functional properties.

本明細書において、２０の通常アミノ酸およびそれらの省略形は、従来の用法に従う。参照により本明細書に組み込まれる「Immunology-A Synthesis」（GolubおよびGren編, Sinauer Associates, マサチューセッツ州サンダーランド, 第2版, 1991）を参照されたい。２０の通常アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の非通常アミノ酸も、本発明のポリペプチドに適した成分になりうる。非通常アミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ−メチルアルギニンなどのアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で使用するポリペプチド表記では、標準的な用法および慣例に従って、左端がアミノ末端に相当し、右端がカルボキシ末端に相当する。 In this specification, the 20 common amino acids and their abbreviations follow conventional usage. See "Immunology-A Synthesis" (Edited by Golub and Gren, Sinauer Associates, Sunderland, Mass., 2nd edition, 1991), incorporated herein by reference. Twenty common amino acid stereoisomers (eg, D-amino acids), unnatural amino acids, such as α, α-disubstituted amino acids, N-alkyl amino acids, and other unconventional amino acids are also suitable components of the polypeptides of the invention. Can be. Examples of unusual amino acids include 4-hydroxyproline, γ-carboxyglutamic acid, ε-N, N, N-trimethyllysine, ε-N-acetyllysine, O-phosphoserine, N-acetylserine, N-formylmethionine, Amino acids such as 3-methylhistidine, 5-hydroxylysine, N-methylarginine and imino acids (eg 4-hydroxyproline) are included. In the polypeptide notation used herein, the left end corresponds to the amino terminus and the right end corresponds to the carboxy terminus, in accordance with standard usage and convention.

あるタンパク質をコードする核酸配列が第２のタンパク質をコードする核酸配列に類似する配列を持つ場合、そのタンパク質は第２のタンパク質に対して「相同性」を持つ、または「相同」である。あるいは、あるタンパク質と第２のタンパク質とが「類似する」アミノ酸配列を持つ場合、そのタンパク質は第２のタンパク質に対して相同性を持つ。（したがって「相同タンパク質」という用語は、それら二つのタンパク質が類似するアミノ酸配列を持つことを意味すると定義される。）好ましい実施形態では、相同タンパク質は、野生型タンパク質に対して少なくとも６５％の配列相同性を示すものであり、より好ましいのは、少なくとも７０％の配列相同性である。さらに好ましいのは、野生型タンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％または９０％の配列相同性を示す相同タンパク質である。より一層好ましい実施形態では、相同タンパク質が少なくとも９５％、９８％、９９％または９９．９％の配列一致度を示す。本明細書においては、アミノ酸配列の二つの領域間の相同性（特に予想構造類似性に関して）は、機能の類似性を含意すると解釈される。 A protein has “homology” or “homologous” to a second protein if the nucleic acid sequence encoding the protein has a sequence similar to the nucleic acid sequence encoding the second protein. Alternatively, if a protein and a second protein have “similar” amino acid sequences, the protein has homology to the second protein. (Thus, the term “homologous protein” is defined to mean that the two proteins have similar amino acid sequences.) In a preferred embodiment, the homologous protein has at least 65% sequence relative to the wild-type protein. Indicating homology, more preferred is at least 70% sequence homology. Even more preferred are homologous proteins that exhibit at least 75%, 80%, 85% or 90% sequence homology to the wild-type protein. In an even more preferred embodiment, the homologous protein exhibits a sequence identity of at least 95%, 98%, 99% or 99.9%. As used herein, homology between two regions of an amino acid sequence (especially with respect to predicted structural similarity) is taken to imply functional similarity.

「相同」をタンパク質またはペプチドに関して用いる場合、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換によって異なっていることが多いと理解される。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、類似する化学的性質（例えば電荷または疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的に変化させないだろう。２またはそれ以上のアミノ酸配列が互いに保存的置換によって異なっている場合は、置換の保存的性質に合わせた補正をするために、配列一致率または相同性の度合いを上向きに調節することができる。この調節を行うための手段は、当業者には周知である。例えばPearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24:307-31および25:365-89を参照されたい（これらは参照により本明細書に組み込まれる）。 When “homologous” is used in reference to proteins or peptides, it is understood that residue positions that are not identical often differ by conservative amino acid substitutions. A “conservative amino acid substitution” is one in which one amino acid residue is replaced with another amino acid residue having a side chain (R group) with similar chemical properties (eg, charge or hydrophobicity). In general, a conservative amino acid substitution will not substantially change the functional properties of a protein. If two or more amino acid sequences differ from each other by conservative substitutions, the sequence identity or degree of homology can be adjusted upwards to correct for the conservative nature of the substitution. Means for making this adjustment are well known to those of skill in the art. See, for example, Pearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24: 307-31 and 25: 365-89, which are hereby incorporated by reference.

以下の６群は、それぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有している：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。 The following 6 groups each contain amino acids that are conservative substitutions for each other: 1) serine (S), threonine (T); 2) aspartic acid (D), glutamic acid (E); 3) asparagine ( N), glutamine (Q); 4) arginine (R), lysine (K); 5) isoleucine (I), leucine (L), methionine (M), alanine (A), valine (V) and 6) phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptophan (W).

ポリペプチドに関する配列相同性は、配列一致率とも呼ばれ、典型的には、配列解析ソフトウェアを使って測定される。例えば、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ、ウィスコンシン州５３７０５マディソン・ユニバーシティアベニュー９１０）のＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅを参照されたい。タンパク質解析ソフトは、さまざまな置換、欠失および他の変更（保存的アミノ酸置換を含む）に割り当てられたホモロジーの尺度を使って、類似する配列を一致させる。例えばＧＣＧには「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムが含まれていて、それらをデフォルトパラメータで使用することにより、近縁ポリペプチド（例えば異なる生物種に由来する相同ポリペプチド）の間または野生型タンパク質とそのムテインの間の配列相同性または配列一致度を決定することができる。例えばＧＣＧＶｅｒｓｉｏｎ６．１を参照されたい。 Sequence homology for polypeptides, also called sequence identity, is typically measured using sequence analysis software. See, for example, Sequence Analysis Software, Genetics Computer Group (GCG) (University of Wisconsin Biotechnology Center, 53705 Madison University Avenue, WI). Protein analysis software matches similar sequences using a measure of homology assigned to various substitutions, deletions and other changes (including conservative amino acid substitutions). For example, GCG includes programs such as “Gap” and “Bestfit” which can be used with default parameters between closely related polypeptides (eg, homologous polypeptides from different species) or wild The sequence homology or sequence identity between the type protein and its mutein can be determined. See for example GCG Version 6.1.

ある特定のポリペプチド配列を、さまざまな生物に由来する多数の配列を含むデータベースと比較する際に好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Altschulら, J. MoI. Biol. 215:403-410(1990)；GishおよびStates, Nature Genet. 3:266-272(1993)；Maddenら, Meth. Enzymol 266:131-141(1996)；Altschulら, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997)；ZhangおよびMadden, Genome Res. 7:649-656(1997))、特にblastpまたはtblastn（Altschulら, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997))である。 A preferred algorithm for comparing a particular polypeptide sequence to a database containing a large number of sequences from different organisms is the computer program BLAST (Altschul et al., J. MoI. Biol. 215: 403-410 (1990)). Gish and States, Nature Genet. 3: 266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol 266: 131-141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997); Madden, Genome Res. 7: 649-656 (1997)), especially blastp or tblastn (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)).

ＢＬＡＳＴｐに関して好ましいパラメータは、期待値：１０（デフォルト）；フィルタ：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップ開始コスト：１１（デフォルト）；ギャップ伸長コスト：１（デフォルト）；アラインメントの最大表示数：１００（デフォルト）；ワードサイズ：１１（デフォルト）；説明の表示数：１００（デフォルト）；ペナルティ行列：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。 Preferred parameters for BLASTp are: Expected value: 10 (default); Filter: seg (default); Gap start cost: 11 (default); Gap extension cost: 1 (default); Maximum number of alignments displayed: 100 (default); Word size: 11 (default); number of explanations displayed: 100 (default); penalty matrix: BLOWSUM62.

相同性に関して比較されるポリペプチド配列の長さは、一般的には、少なくとも約１６アミノ酸残基、通常は少なくとも約２０残基、より一般的には少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基より多いだろう。多数のさまざまな生物に由来する配列を含むデータベースを検索する場合は、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を使ったデータベース検索は、当分野で知られるｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって判定することができる。例えばポリペプチド配列は、ＧＣＧＶｅｒｓｉｏｎ６．１中のプログラムであるＦＡＳＴＡを使って比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリ配列と検索配列の間の最適オーバーラップ領域のアラインメントおよび配列一致率を与える。Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98(1990)（参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、アミノ酸配列間の配列一致率は、参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧＶｅｒｓｉｏｎ６．１で用意されているとおりに、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ２およびＰＡＭ２５０スコアリング行列）で使用することにより、決定することができる。 The length of polypeptide sequences compared for homology is generally at least about 16 amino acid residues, usually at least about 20 residues, more usually at least about 24 residues, typically at least There will be more than about 28 residues, preferably about 35 residues. When searching a database containing sequences from a large number of different organisms, it is preferable to compare amino acid sequences. Database searches using amino acid sequences can be determined by algorithms other than blastp known in the art. For example, polypeptide sequences can be compared using FASTA, a program in GCG Version 6.1. FASTA gives the alignment of the optimal overlap region between the query sequence and the search sequence and the sequence match rate. Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990) (incorporated herein by reference). For example, sequence identity between amino acid sequences uses FASTA with its default parameters (word size 2 and PAM250 scoring matrix) as provided in GCG Version 6.1, which is incorporated herein by reference. Can be determined.

「特異的結合」とは、その環境下で他の分子への結合に優先して互いに結合するという、二つの分子の能力を指す。典型的には、「特異的結合」は、反応中の偶発的結合に対して、少なくとも２倍、より典型的には少なくとも１０倍、多くの場合、少なくとも１００倍の差を付ける。典型的には、解離定数によって定量化される特異的結合反応のアフィニティまたはアビディティは、約１０^-7Ｍより強い（例えば約１０^-8Ｍ、１０^-9Ｍまたはそれ以上に強い）。 “Specific binding” refers to the ability of two molecules to bind to each other in preference to binding to other molecules. Typically, “specific binding” makes a difference of at least 2-fold, more typically at least 10-fold, and often at least 100-fold over accidental binding during the reaction. Typically, the affinity or avidity of a specific binding reaction quantified by the dissociation constant is greater than about 10 ⁻⁷ M (eg, about 10 ⁻⁸ M, 10 ⁻⁹ M or more).

本明細書で使用する「領域」という用語は、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を指す。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続した部分によって定義される。 As used herein, the term “region” refers to a physically contiguous portion of the primary structure of a biomolecule. In the case of a protein, a region is defined by a contiguous portion of the amino acid sequence of the protein.

本明細書で使用する「ドメイン」という用語は、生体分子の既知の機能または推測される機能の一因となる生体分子の構造を指す。ドメインは領域またはその一部と同一の広がりを持ちうる。またドメインは生体分子の別々の非連続領域を含む場合もある。 As used herein, the term “domain” refers to the structure of a biomolecule that contributes to a known or suspected function of the biomolecule. A domain can be coextensive with a region or part thereof. A domain may also contain separate non-contiguous regions of biomolecules.

本明細書で使用する「分子」という用語は、任意の化合物を意味し、例えば小分子、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などを含むが、これらに限定されるわけではなく、そのような化合物は天然物または合成物であることができる。 As used herein, the term “molecule” means any compound, including but not limited to small molecules, peptides, proteins, glycoproteins, sugars, nucleotides, nucleic acids, lipids, and the like. Rather, such compounds can be natural or synthetic.

本明細書で使用する「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、またはその変形、例えばｃｏｍｐｒｉｓｅｓもしくはｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という用語は、指定した完全体または完全体群の包含を含意するが、他の完全体または完全体群の除外を含意するわけではないと解釈されるだろう。 As used herein, the term “comprise” (or a variation thereof, eg, comprises or comprising) implies the inclusion of a specified whole body or whole body group, but excludes other whole bodies or whole body groups. It will be interpreted as not implying.

本明細書で使用する「本質的に〜からなる」(consisting essentially of)という用語は、指定した完全体または完全体群の包含を含意すると同時に、指定した完全体に著しい影響または改変を加える変更または他の完全体は除外されると解釈されるだろう。Ｎ−グリカンの種については、「本質的に（指定したＮ−グリカン）からなる」という用語は、そのＮ−グリカンが、糖タンパク質のアスパラギン残基に直接連結されているＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）においてフコシル化されるかどうかにかかわらず、そのＮ−グリカンを含むと解釈されるだろう。 As used herein, the term “consisting essentially of” implies the inclusion of a specified whole or group of complete bodies, while at the same time making a significant impact or modification to the specified whole. Or other completeness would be interpreted as excluded. For N-glycan species, the term “consisting essentially of (designated N-glycans) refers to N-acetylglucosamine (GlcNAc) in which the N-glycan is directly linked to an asparagine residue of a glycoprotein. ) Will be interpreted as containing the N-glycan regardless of whether it is fucosylated.

本明細書で使用する「主として」（predominantly）という用語、またはその変形、例えば「主要」（predominant）もしくは「主要である」（which is predominant）は、その糖タンパク質をＰＮＧａｓｅで処理し、放出されたグリカンを質量分析法、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで解析した後に、全Ｎ−グリカンのうち最も高いモルパーセント（％）を持つグリカン種を意味すると解釈されるだろう。言い換えると「主として」という表現は、他の一個の実体のどれよりも高いモルパーセントで存在する一個の実体、例えば特定グリコフォームと定義される。例えば、ある組成物が、４０モルパーセントの種Ａ、３５モルパーセントの種Ｂ、および２５モルパーセントの種Ｃからなるとすると、その組成物は主として種Ａを含み、種Ｂはその次に最も主要な種になるだろう。 As used herein, the term “predominantly”, or variations thereof, such as “predominant” or “which is predominant,” treats the glycoprotein with PNGase and is released. After analyzing glycans by mass spectrometry, such as MALDI-TOF MS, it will be taken to mean the glycan species with the highest mole percent (%) of all N-glycans. In other words, the expression “primarily” is defined as a single entity, such as a particular glycoform, that is present in a higher mole percent than any other single entity. For example, if a composition consists of 40 mole percent of species A, 35 mole percent of seed B, and 25 mole percent of seed C, the composition contains primarily species A, and species B is the next most dominant. It will be a kind of seed.

本明細書で使用する、特定の糖残基（例えばフコースまたはガラクトースなど）を「本質的に含まない」（essentially free of）という用語は、糖タンパク質組成物が、そのような残基を含有するＮ−グリカンを実質的に欠くことを示すために用いられる。純度面から表現すると、本質的に含まないとは、そのような糖を含有するＮ−グリカン構造の量が１０％を越えず、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満であることを意味し、この場合、パーセンテージは重量パーセントまたはモルパーセントである。したがって、本発明の糖タンパク質組成物中のＮ−グリカン構造の実質的に全てが、フコースもしくはガラクトースまたはその両方を含まない。 As used herein, the term “essentially free of” certain sugar residues (eg, fucose or galactose, etc.) means that the glycoprotein composition contains such residues. Used to indicate a substantial lack of N-glycans. Expressed in terms of purity, essentially free means that the amount of N-glycan structures containing such sugars does not exceed 10%, preferably less than 5%, more preferably less than 1%, most preferably It means less than 0.5%, where the percentage is weight percent or mole percent. Accordingly, substantially all of the N-glycan structures in the glycoprotein composition of the invention are free of fucose or galactose or both.

本明細書において、検出可能な量の特定糖残基、例えばフコースまたはガラクトースがＮ−グリカン構造上に常に存在しない場合、糖タンパク質組成物はそのような糖残基を「欠く」（lacks）または「欠いている」（is lacking）という。例えば、本発明の好ましい実施形態では、糖タンパク質組成物が、上に定義した下等真核生物、例えば酵母［例えばＰｉｃｈｉａ属の種；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の種；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の種；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種］によって生産され、「フコースを欠く」だろう。なぜなら、これらの生物の細胞は、フコシル化Ｎ−グリカン構造を産生するのに必要な酵素を持たないからである。したがって「本質的にフコースを含まない」という用語は「フコースを欠く」という用語を包含する。しかし、上述のように、たとえ組成物がフコシル化Ｎ−グリカン構造をかつて含有していたか、または限られてはいるが検出可能な量のフコシル化Ｎ−グリカン構造を含有しているとしても、その組成物は「本質的にフコースを含まない」と言える。 As used herein, if a detectable amount of a particular sugar residue, such as fucose or galactose, is not always present on the N-glycan structure, the glycoprotein composition “lacks” such sugar residue or It is called “is lacking”. For example, in a preferred embodiment of the invention, the glycoprotein composition comprises a lower eukaryote as defined above, such as a yeast [eg Pichia species; Saccharomyces species; Kluyveromyces species; Aspergillus species] Produced by and will "lack fucose". This is because the cells of these organisms do not have the enzymes necessary to produce fucosylated N-glycan structures. Thus, the term “essentially free of fucose” encompasses the term “devoid of fucose”. However, as noted above, even if the composition once contained a fucosylated N-glycan structure or a limited but detectable amount of fucosylated N-glycan structure, The composition can be said to be “essentially free of fucose”.

本明細書で使用する「増加した結合活性」という表現は「増加した結合アフィニティ」と互換的に用いられ、ＩｇＧ分子と受容体−または他の注目分子−との結合の増加を指す。 As used herein, the expression “increased binding activity” is used interchangeably with “increased binding affinity” and refers to an increase in binding between an IgG molecule and a receptor—or other molecule of interest.

本明細書で使用する「低下した結合活性」という表現は「低下した結合アフィニティ」と互換的に用いられ、ＩｇＧ分子と受容体−または他の注目分子−との結合の減少を指す。 As used herein, the expression “reduced binding activity” is used interchangeably with “reduced binding affinity” and refers to decreased binding of an IgG molecule to a receptor—or other molecule of interest—.

本明細書で使用する「食作用」という表現は、免疫複合体のクリアランスであると定義される。食作用は免疫細胞−マクロファージおよび好中球を含むが、これらに限定されるわけではない−の免疫活動である。 As used herein, the expression “phagocytosis” is defined as clearance of immune complexes. Phagocytosis is the immune activity of immune cells—including but not limited to macrophages and neutrophils.

抗体および抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用ならびにさまざまな応答は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、免疫複合体のクリアランス（食作用）、Ｂ細胞による抗体産生およびＩｇＧ血清半減期を含めて、それぞれ以下の文献に定義されている：Daeronら, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234；WardおよびGhetie, 1995, Therapeutic Immunol 2:77-94；CoxおよびGreenberg, 2001, Semin. Immunol. 13:339-345；Heyman, 2003, Immunol. Lett. 88:157-161；ならびにRavetch, 1997, Curr. Opin. Immunol. 9:121-125。 The interaction of antibodies and antibody-antigen complexes with cells of the immune system and various responses include antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cytotoxicity (CDC), clearance of immune complexes ( Phagocytosis), antibody production by B cells, and IgG serum half-life, each defined in the following literature: Daeron et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234; Ward and Ghetie, 1995 , Therapeutic Immunol 2: 77-94; Cox and Greenberg, 2001, Semin. Immunol. 13: 339-345; Heyman, 2003, Immunol. Lett. 88: 157-161; and Ravetch, 1997, Curr. Opin. Immunol. 9: 121-125.

別段の定義をしない限り、本明細書において使用する全ての技術用語よび科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を持つ。代表的な方法および材料を以下に説明するが、本明細書に記載するものと似たまたは等価な方法および材料も本発明の実施に使用することができ、それらは当業者には明白であるだろう。本明細書において言及する全ての刊行物および他の参考文献は参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。矛盾が生じた場合は、本明細書が、定義を含めて、支配することになる。材料、方法および実施例は単なる例示であって、限定を意図するものではない。 Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention is related. Exemplary methods and materials are described below, but methods and materials similar or equivalent to those described herein can also be used in the practice of the present invention, and will be apparent to those skilled in the art right. All publications and other references mentioned herein are hereby incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting.

組換えＩｇ−ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂分子
本発明は、主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−結合型グリコフォームを有するグリコシル化Ｉｇの集団を含む組成物を提供する。本発明は、抗体エフェクター機能、例えば受容体結合などを媒介する主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−結合型グリコフォームを有するＩｇおよびＩｇ組成物も提供する。好ましくは、本発明のＩｇとＦｃγＲＩＩＩ受容体との間の相互作用は、直接結合活性の増加をもたらす。また、好ましくは、本発明のＩｇとＦｃγＲＩＩｂ受容体との間の相互作用は、直接結合活性の低下（または欠如）をもたらす。もう一つの実施形態では、本発明のＩｇまたはＩｇ組成物が、あるグリコフォーム構造の濃縮／優勢によって付与される増加した結合活性を示す。本発明の顕著な特徴は、それが、抗体エフェクター機能、例えばＡＤＣＣ活性の増加またはＢ細胞による抗体産生量の増加などを媒介する、主要な特定グリコフォームを有するＩｇおよびＩｇ組成物を提供することである。もう一つの実施形態では、本発明のＩｇまたはＩｇ組成物が、一つのグリコフォームの濃縮／優勢によって付与される増加したＡＤＣＣ活性またはＢ細胞による抗体産生を示す。さらにまた、ある主要グリコフォームを有するＩｇ組成物を製造することの一つの利点は、それにより、望ましくないグリコフォームを有するＩｇの製造、および／または望ましくない効果を誘発しそして／またはより有効なＩｇグリコフォームの濃度を薄める可能性があるＩｇの不均一混合物の製造が回避される点であることは、当業者にはすぐに明白になるだろう。したがって、主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリコフォームを有するＩｇを含む医薬組成物は、有益な特徴（例えばＦｃγＲＩＩｂへの結合の減少、ならびにＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の増加を含むが、これらに限定されるわけではない）を持ち、それゆえに、より低い容量でおそらく有効であり、したがって、より高い効力／力価を持つだろうと考えられる。 Recombinant Ig-GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ Molecule The present invention provides a composition comprising a population of glycosylated Ig having a major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-linked glycoform. The present invention also provides Ig and Ig compositions having a major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-linked glycoform that mediates antibody effector functions such as receptor binding. Preferably, the interaction between the Ig of the present invention and the FcγRIII receptor results in increased direct binding activity. Also preferably, the interaction between the Ig of the present invention and the FcγRIIb receptor results in a reduction (or lack) of direct binding activity. In another embodiment, an Ig or Ig composition of the present invention exhibits increased binding activity conferred by the enrichment / dominance of certain glycoform structures. A salient feature of the present invention is that it provides Ig and Ig compositions with major specific glycoforms that mediate antibody effector functions, such as increased ADCC activity or increased antibody production by B cells. It is. In another embodiment, an Ig or Ig composition of the present invention exhibits increased ADCC activity conferred by enrichment / dominance of one glycoform or antibody production by B cells. Furthermore, one advantage of producing an Ig composition having a certain major glycoform is thereby the production of Ig having an undesirable glycoform, and / or inducing undesirable effects and / or more effective. It will be readily apparent to those skilled in the art that the production of a heterogeneous mixture of Ig that can dilute the concentration of Ig glycoform is avoided. Thus, a pharmaceutical composition comprising Ig having predominantly GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycoforms includes beneficial features such as, but not limited to, decreased binding to FcγRIIb and increased binding to FcγRIIIa and FcγRIIIb. Is therefore likely to be effective at lower volumes and therefore will have higher potency / titer.

ある実施形態では、本発明のＩｇ分子は、Ｉｇ分子中の抗体エフェクター機能を媒介するＦｃ領域にある重鎖のＣ_H２ドメインのＡｓｎ−２９７に、少なくとも一つのＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を含む。好ましくは、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造は、二量化したＩｇ中の各ＣＨ２領域の各Ａｓｎ−２９７上にある（図１）。もう一つの実施形態において、本発明は、Ａｓｎ−２９７が、本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造からなるＮ−グリカンで、主としてグリコシル化されているＩｇを含む組成物を提供する（図１）。あるいは、Ｉｇ分子上に見出される１またはそれ以上の糖質部分が削除され、そして／またはその分子に付加されて、Ｉｇ上のグリコシル化部位の数が付加または削除されてもよい。さらに、Ｉｇ分子のＣ_H２領域内のＮ−結合型グリコシル化部位の位置は、その分子内のさまざまな位置にアスパラギン（Ａｓｎ）またはＮ−グリコシル化部位を導入することによって、変化させることもできる。Ａｓｎ−２９７は、マウスおよびヒトＩｇＧ分子に典型的に見出されるＮ−グリコシル化部位であるが（Kabatら「Sequences of Proteins of Immunological Interest」1991）、この部位が、予見することのできる唯一の部位というわけではないし、機能を発揮するためにこの部位を維持することが必ずしも必要であるというわけでもない。突然変異を誘発するための既知の方法を使用することにより、当業者は、本発明のＩｇをコードするＤＮＡ分子を、Ａｓｎ−２９７にあるＮ−グリコシル化部位が削除されるように変化させることができ、さらに、１またはそれ以上のＮ−グリコシル化部位がそのＩｇ分子内の他の位置に生じるようにＤＮＡ分子を変化させることができる。Ｎ−グリコシル化部位はＩｇ分子のＣ_H２領域内に生じさせることが好ましい。しかし、ＩｇのＦａｂ領域のグリコシル化は血清抗体の３０％で記述されている−一般的にはＡｓｎ−７５に見出される（Rademacherら, 1986, Biochem. Soc. Symp., 51:131-148）。Ｉｇ分子のＦａｂ領域におけるグリコシル化は、Ｆｃ領域中のＮ−グリコシル化と共に組み合わせてもよいし、単独でもよい。 In certain embodiments, an Ig molecule of the invention comprises at least one GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure in Asn-297 of the heavy chain C _H 2 domain in the Fc region that mediates antibody effector function in the Ig molecule. . Preferably, a GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure is on each Asn-297 of each CH2 region in dimerized Ig (FIG. 1). In another embodiment, the present invention provides a composition in which Asn-297 is an N-glycan consisting essentially of a GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure, and is primarily glycosylated Ig (FIG. 1). . Alternatively, one or more carbohydrate moieties found on the Ig molecule may be deleted and / or added to the molecule to add or delete the number of glycosylation sites on the Ig. In addition, the position of N-linked glycosylation sites within the C _H 2 region of an Ig molecule can be altered by introducing asparagine (Asn) or N-glycosylation sites at various positions within the molecule. it can. Asn-297 is an N-glycosylation site typically found in mouse and human IgG molecules (Kabat et al. “Sequences of Proteins of Immunological Interest” 1991), but this is the only site that can be foreseen. This is not to say and it is not always necessary to maintain this site in order to perform its function. By using known methods for inducing mutations, one of skill in the art can alter the DNA molecule encoding the Ig of the present invention such that the N-glycosylation site at Asn-297 is deleted. In addition, the DNA molecule can be altered such that one or more N-glycosylation sites occur at other positions within the Ig molecule. N-glycosylation sites are preferably generated within the C _H 2 region of the Ig molecule. However, glycosylation of the Fab region of Ig has been described in 30% of serum antibodies—generally found in Asn-75 (Rademacher et al., 1986, Biochem. Soc. Symp., 51: 131-148). . Glycosylation in the Fab region of an Ig molecule may be combined with N-glycosylation in the Fc region or may be alone.

ある実施形態では、本発明は、主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物であって、前記ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造が、その組換えＩｇ組成物の、次に主要なグリカン構造よりも、少なくとも約５モルパーセント多いレベルで存在する組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物であって、前記ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造が、その組換えＩｇ組成物の、次に主要なグリカン構造よりも、少なくとも約１０モルパーセント〜約２５モルパーセント多いレベルで存在する組成物を提供する。より好ましい実施形態では、本発明は、主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物であって、前記ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造が、その組換えＩｇ組成物の、次に主要なグリカン構造よりも、少なくとも約２５モルパーセント〜約５０モルパーセント多いレベルで存在する組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物であって、前記ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造が、その組換えＩｇ組成物の、次に主要なグリカン構造よりも約５０モルパーセントを越えて多いレベルで存在する組成物を提供する。もう一つの好ましい実施形態では、本発明は、主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物であって、前記ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造が、その組換えＩｇ組成物の、次に主要なグリカン構造よりも約７５モルパーセントを越えて多いレベルで存在する組成物を提供する。さらにもう一つの実施形態では、本発明は、主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物であって、前記ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造が、その組換えＩｇ組成物の、次に主要なグリカン構造よりも約９０モルパーセントを越えて多いレベルで存在する組成物を提供する。主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン（５９．２％）を有するＪＣ−ＩｇＧのＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析を図４Ａに示す。主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン（６６％）を有するＤＸ−ＩｇＧのＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析を図４Ｂに示す。 In certain embodiments, the invention provides a recombinant Ig composition having a major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycan structure, wherein the GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure is the _second major Ig of the recombinant Ig composition. Compositions are provided that are present at a level of at least about 5 mole percent greater than the glycan structure. In a preferred embodiment, the present invention provides a recombinant Ig composition having a major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure, wherein the GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure is the next major glycan structure of the recombinant Ig composition. Provides a composition that is present at a level of at least about 10 mole percent to about 25 mole percent. In a more preferred embodiment, the present invention provides a recombinant Ig composition having a major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure, wherein the GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure is the next major glycan of the recombinant Ig composition. Compositions are provided that are present at a level of at least about 25 mole percent to about 50 mole percent greater than the structure. In a preferred embodiment, the present invention provides a recombinant Ig composition having a major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure, wherein the GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure is the next major glycan structure of the recombinant Ig composition. Provides a composition that is present at a level greater than about 50 mole percent. In another preferred embodiment, the present invention provides a recombinant Ig composition having a major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure, wherein the GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure is then the major Ig composition. A composition is provided that is present at a level greater than about 75 mole percent greater than the normal glycan structure. In yet another embodiment, the present invention provides a recombinant Ig composition having a major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure, wherein the GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure is then the major Ig composition. Compositions are provided that are present at levels greater than about 90 mole percent greater than the normal glycan structure. A MALDI-TOF analysis of JC-IgG N-glycans with a major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycan (59.2%) is shown in FIG. 4A. A MALDI-TOF analysis of DX-IgG N-glycans with major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycans (66%) is shown in FIG. 4B.

ＦｃγＲＩＩＩ受容体に対するＩｇ−ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂の増加した結合
ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂに結合するＩｇのエフェクター機能、例えばＡＤＣＣの活性化は、Ｉｇ分子のＦｃ領域によって媒介される。異なる機能がこの領域の異なるドメインによって媒介される。したがって本発明は、Ｉｇ分子上のＦｃ領域がエフェクター機能を実行する能力を持つ主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有しているＩｇ分子および組成物を提供する。ある実施形態では、主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_5-ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＦｃ領域が、ＦｃγＲＩＩＩａ（図６）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（図５）受容体への結合の増加をもたらす。もう一つの実施形態では、Ｆｃが主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_5-ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有する。Ｆｃ領域を含む分子、例えばイムノアドヘシン（ChamowおよびAshkenazi, 1996, Trends Biotechnol. 14:52-60；AshkenaziおよびChamow, 1997, Curr Opin. Immunol. 9:195-200）、Ｆｃ融合物および抗体様分子なども本発明に包含されることは、当業者にはすぐに明白になるだろう。 Increased binding of Ig-GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc _{2 to} the FcγRIII receptor The effector functions of Ig that bind to FcγRIIIa and FcγRIIIb, eg activation of ADCC, are mediated by the Fc region of the Ig molecule. Different functions are mediated by different domains in this region. Thus, the present invention provides Ig molecules and compositions having a major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycan with the ability of the Fc region on the Ig molecule to perform effector functions. In certain embodiments, an Fc region with a major GalGlcNAcMan _5- GlcNAc ₂ N-glycan results in increased binding to FcγRIIIa (FIG. 6) and FcγRIIIb (FIG. 5) receptors. In another embodiment, the Fc has a major GalGlcNAcMan _5- GlcNAc ₂ N-glycan. Molecules containing the Fc region, such as immunoadhesins (Chamow and Ashkenazi, 1996, Trends Biotechnol. 14: 52-60; Ashkenazi and Chamow, 1997, Curr Opin. Immunol. 9: 195-200), Fc fusions and antibody-like It will be readily apparent to those skilled in the art that molecules and the like are also encompassed by the present invention.

Ｆｃ受容体に対するＩｇ分子の結合活性（アフィニティ）は、アッセイによって決定することができる。ＩｇＧを使ったＦｃγＲＩＩＩ結合アッセイの一例を実施例６に記載する。このアッセイを、任意の免疫グロブリン分子に関するアッセイと併用することができるように容易に適合させうることは、当業者には理解される。 The binding activity (affinity) of an Ig molecule for the Fc receptor can be determined by assay. An example of an FcγRIII binding assay using IgG is described in Example 6. One skilled in the art will appreciate that this assay can be readily adapted to be used in conjunction with assays for any immunoglobulin molecule.

主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＪＣ−ＩｇＧ（本発明に従って製造されるＩｇ）は、図５Ａに示すように、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）と比較して、ＦｃγＲＩＩＩｂに対して１０倍増加した結合活性を持ち、図６に示すように、ＦｃγＲＩＩＩａに対して１０倍を越えて増加した結合活性を持つ。主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＤＸ−ＩｇＧ（本発明に従って製造されるもう一つのＩｇ）も、図５Ｂに示すように、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）と比較して、ＦｃγＲＩＩＩｂに対して約１０倍増加した結合活性を持つ。 JC-IgG (Ig produced according to the present invention) with predominantly GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycan, increased binding to FcγRIIIb by 10-fold compared to Rituximab®, as shown in FIG. 5A As shown in FIG. 6, it has a binding activity increased more than 10 times against FcγRIIIa. DX-IgG (another Ig produced in accordance with the present invention) with predominantly GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycans is also about 10 FcγRIIIb compared to Rituximab® as shown in FIG. 5B. Has double increased binding activity.

最も興味深いことに、ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子の二型性により、二つのアロタイプ、すなわちＦｃγＲＩＩＩａ−１５８ＶおよびＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆが生じる（Dall'Ozzoら, 2004, Cancer Res. 64:4664-4669）。ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖに関してホモ接合性である遺伝子型は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）に対する、より高い臨床応答と関連づけられる（Cartronら, 2002, Blood, 99:754-758）。しかし、人口の大半は一つのＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ対立遺伝子を持ち、それが、ＦｃγＲＩＩＩａ結合によるＡＤＣＣの誘導に関するＲｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）の有効性を、人口の大半について、低減させている。しかし、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）様の抗ＣＤ２０抗体をフコシルトランスフェラーゼ活性を欠く宿主細胞で発現させた場合、この抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８ＦによるＡＤＣＣの増進にも、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８ＶによるＡＤＣＣの増進にも、等しく有効である（Niwaら, 2004, Clin. Cane Res. 10:6248-6255）。本発明の一定の好ましい実施形態の抗体は、Ｎ−グリカンにフコースを付加しない宿主細胞（例えば、フコースを欠く酵母宿主Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ；実施例１および２参照）で発現される。したがって、フコースを欠き、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆへの結合が強化されている本発明の抗体は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）に対して低下した臨床応答を示す多くの患者を処置するのに、とりわけ有用でありうる。 Most interestingly, the dimorphism of the FcγRIIIa gene results in two allotypes: FcγRIIIa-158V and FcγRIIIa-158F (Dall'Ozzo et al., 2004, Cancer Res. 64: 4664-4669). Genotypes that are homozygous for FcγRIIIa-158V are associated with a higher clinical response to Rituximab® (Cartron et al., 2002, Blood, 99: 754-758). However, the majority of the population has one FcγRIIIa-158F allele, which reduces the effectiveness of Rituximab® for induction of ADCC by FcγRIIIa binding for the majority of the population. However, when a Rituximab®-like anti-CD20 antibody is expressed in a host cell that lacks fucosyltransferase activity, this antibody can be used to enhance ADCC by FcγRIIIa-158F, ADCC by FcγRIIIa-158V, It is equally effective (Niwa et al., 2004, Clin. Cane Res. 10: 6248-6255). The antibodies of certain preferred embodiments of the invention are expressed in host cells that do not add fucose to N-glycans (eg, yeast host P. pastoris lacking fucose; see Examples 1 and 2). Accordingly, the antibodies of the invention lacking fucose and enhanced binding to FcγRIIIa-158F are particularly useful for treating many patients who show a reduced clinical response to Rituximab®. sell.

ＦｃγＲＩＩｂ受容体に対するＩｇ−ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂の減少した結合
ＦｃγＲＩＩｂに結合するＩｇのエフェクター機能、例えばＢ細胞による増加した抗体産生および増加したＡＤＣＣ活性は、Ｉｇ分子のＦｃ領域によって媒介される。異なる機能がこの領域の異なるドメインによって媒介される。したがって本発明は、Ｉｇ分子上のＦｃ領域がエフェクター機能を実行する能力を持つ主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有しているＩｇ分子および組成物を提供する。ある実施形態では、主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_5-ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＩｇのＦｃ領域が、ＦｃγＲＩＩｂ受容体への結合の減少をもたらす。Ｆｃ領域を含む分子、例えばイムノアドヘシン（ChamowおよびAshkenazi, 1996, Trends Biotechnol. 14:52-60；AshkenaziおよびChamow, 1997, Curr Opin. Immunol. 9:195-200）、Ｆｃ融合物および抗体様分子なども本発明に包含されることは、当業者にはすぐに明白になるだろう。 Decreased binding of Ig-GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc _{2 to} the FcγRIIb receptor The effector functions of Ig binding to FcγRIIb, such as increased antibody production by B cells and increased ADCC activity, are mediated by the Fc region of the Ig molecule. Different functions are mediated by different domains in this region. Thus, the present invention provides Ig molecules and compositions having a major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycan with the ability of the Fc region on the Ig molecule to perform effector functions. In certain embodiments, the Fc region of Ig with a major GalGlcNAcMan ₅ -GlcNAc ₂ N-glycan results in decreased binding to the FcγRIIb receptor. Molecules containing the Fc region, such as immunoadhesins (Chamow and Ashkenazi, 1996, Trends Biotechnol. 14: 52-60; Ashkenazi and Chamow, 1997, Curr Opin. Immunol. 9: 195-200), Fc fusions and antibody-like It will be readily apparent to those skilled in the art that molecules and the like are also encompassed by the present invention.

Ｆｃ受容体に対するＩｇ分子の結合活性（アフィニティ）は、アッセイによって決定することができる。ＩｇＧ１を使ったＦｃγＲＩＩｂ結合アッセイの一例を実施例６に記載する。開示したこのアッセイを、任意の免疫グロブリン分子に関連して使用することができるように容易に適合させうることは、当業者には理解される。 The binding activity (affinity) of an Ig molecule for the Fc receptor can be determined by assay. An example of an FcγRIIb binding assay using IgG1 is described in Example 6. Those skilled in the art will appreciate that this disclosed assay can be readily adapted to be used in connection with any immunoglobulin molecule.

主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_5-ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＪＣ−ＩｇＧ（本発明に従って製造されるＩｇ）は、図７Ａに示すように、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）と比較して、ＦｃγＲＩＩｂに対して約４分の１に低下した結合活性を持つ。主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＤＸ−ＩｇＧ（本発明に従って製造されるもう一つのＩｇ）は、図７Ｂに示すように、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）と比較して、ＦｃγＲＩＩｂに対して約４分の１に減少した結合活性を持つ。 JC-IgG (Ig produced according to the present invention) with the major GalGlcNAcMan _5- GlcNAc ₂ N-glycan is about 4 minutes relative to FcγRIIb compared to Rituximab® as shown in FIG. 7A. It has a binding activity reduced to 1. DX-IgG (another Ig produced in accordance with the present invention) with a major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycan is about 4 to FcγRIIb compared to Rituximab®, as shown in FIG. 7B. Has a binding activity reduced by a factor of 2.

増加した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
さらにもう一つの実施形態では、主要Ｎ−グリカンとしてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂を有するＩｇ分子または組成物のＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃγＲＩＩＩｂ結合の増加が、ＦｃγＲＩＩＩ媒介性ＡＤＣＣの増加をもたらしうる。ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）受容体がＡＤＣＣ活性を担っていることは確立されている（Daeronら, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234）。もう一つの実施形態では、主要Ｎ−グリカンとしてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂を有するＩｇ分子または組成物のＦｃγＲＩＩｂ結合の減少が、ＡＤＣＣの増加をもたらす（Clynesら, 2000, 前出）。もう一つの実施形態では、本発明のＩｇ分子または組成物が、主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカンの存在によってもたらされる増加したＡＤＣＣ活性を示す。 Increased antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity In yet another embodiment, an increase in FcγRIIIa or FcγRIIIb binding of an Ig molecule or composition having GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ as the major N-glycan results in an increase in FcγRIII-mediated ADCC. Can bring. It has been established that the FcγRIII (CD16) receptor is responsible for ADCC activity (Daeron et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234). In another embodiment, a decrease in FcγRIIb binding of an Ig molecule or composition having GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ as the major N-glycan results in increased ADCC (Clynes et al., 2000, supra). In another embodiment, an Ig molecule or composition of the invention exhibits increased ADCC activity caused by the presence of a major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan.

Ｂ細胞枯渇を測定するインビトロアッセイの一例および蛍光放出ＡＤＣＣアッセイを実施例７に開示する。開示したこれらのアッセイを、任意のＩｇ分子に関するアッセイと併用することができるように容易に適合させうることは、当業者には理解される。さらにまた、動物モデルにおけるインビボＡＤＣＣアッセイを、Borchmannら, 2003, Blood, 102:3737-3742、Niwaら, 2004, Cancer Research, 64:2127-2133および実施例７から、任意の特定ＩｇＧに適合させることもできる。 An example of an in vitro assay for measuring B cell depletion and a fluorescence emitting ADCC assay are disclosed in Example 7. Those skilled in the art will appreciate that these disclosed assays can be readily adapted to be used in conjunction with assays for any Ig molecule. Furthermore, the in vivo ADCC assay in animal models is adapted to any specific IgG from Borchmann et al., 2003, Blood, 102: 3737-3742, Niwa et al., 2004, Cancer Research, 64: 2127-2133 and Example 7. You can also.

増加した、Ｂ細胞による抗体産生
調節性ＦｃγＲ経路による腫瘍に対する抗体の関与（engagement）が示されている（Clynesら, 2000, Nature, 6:443-446）。具体的には、ＦｃγＲＩＩｂを免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有受容体、例えばＢ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃεＲＩなどと共架橋した場合、それはＩＴＡＭ媒介性シグナルを阻害することが知られている（VivierおよびDaeron, 1997, Immunol. Today, 18:286-291）。例えば、ＦｃｇＲＩＩ特異的抗体の添加はＦｃｇＲＩＩＢへのＦｃ結合を遮断して、増強されたＢ細胞増殖をもたらす（Wagleら, 1999, J of Immunol. 162: 2732-2740）。したがって、ある実施形態では、本発明のＩｇ分子は、Ｂ細胞の活性化をもたらすＦｃγＲＩＩｂ受容体結合の減少を媒介することができ、それは、結果として、形質細胞による抗体産生を触媒する（Parker, D.C. 1993, Annu. Rev. Immunol. 11:331-360）。ＩｇＧ１を使ったＢ細胞による抗体産生を測定するアッセイの一例を実施例６に記載する。このアッセイを、任意の免疫グロブリン分子に関するアッセイと併用することができるように容易に適合させうることは、当業者には理解される。 Increased antibody production by B cells The engagement of antibodies against tumors by the regulatory FcγR pathway has been shown (Clynes et al., 2000, Nature, 6: 443-446). Specifically, when FcγRIIb is co-crosslinked with immunoreceptor tyrosine activation motif (ITAM) containing receptors, such as B cell receptor (BCR), FcγRI, FcγRIII, and FcεRI, it inhibits ITAM-mediated signals (Vivier and Daeron, 1997, Immunol. Today, 18: 286-291). For example, the addition of FcgRII-specific antibodies blocks Fc binding to FcgRIIB, resulting in enhanced B cell proliferation (Wagle et al., 1999, J of Immunol. 162: 2732-2740). Thus, in certain embodiments, an Ig molecule of the invention can mediate a decrease in FcγRIIb receptor binding resulting in B cell activation, which in turn catalyzes antibody production by plasma cells (Parker, DC 1993, Annu. Rev. Immunol. 11: 331-360). An example of an assay for measuring antibody production by B cells using IgG1 is described in Example 6. One skilled in the art will appreciate that this assay can be readily adapted to be used in conjunction with assays for any immunoglobulin molecule.

他の免疫活動
好中球上のエフェクター細胞分子の改変された表面発現は、細菌感染に対する感受性を増加させることが示されている（Ohsakaら, 1997, Br. J. Haematol. 98:108-113）。さらに、ＦｃγＲＩＩＩａエフェクター細胞受容体へのＩｇＧ結合が、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の発現を調節することも実証されている（Blomら, 2004, Arthritis Rheum., 48:1002-1014）。さらにまた、ＦｃγＲが誘導するＴＮＦ−αは、ＩｇＧ被覆赤血球を結合し貧食するという好中球の能力も増加させる（Capsoniら, 1991, J. Clin. Lab Immunol. 34:115-124）。したがって、ＦｃγＲＩＩＩへの結合の増加を示す本発明のＩｇ分子および組成物は、ＴＮＦ−αの発現の増加をもたらしうると考えられる。 Other immune activities Altered surface expression of effector cell molecules on neutrophils has been shown to increase susceptibility to bacterial infection (Ohsaka et al., 1997, Br. J. Haematol. 98: 108-113 ). Furthermore, it has also been demonstrated that IgG binding to FcγRIIIa effector cell receptor regulates tumor necrosis factor alpha (TNF-α) expression (Blom et al., 2004, Arthritis Rheum., 48: 1002-1014). Furthermore, TNF-α induced by FcγR also increases the ability of neutrophils to bind and phagocytose IgG-coated erythrocytes (Capsoni et al., 1991, J. Clin. Lab Immunol. 34: 115-124). Thus, it is believed that Ig molecules and compositions of the invention that exhibit increased binding to FcγRIII can result in increased expression of TNF-α.

ＦｃγＲＩＩＩ受容体活性の増加は、リソソーム・ベータ−グルクロニダーゼならびに他のリソソーム酵素の分泌を増加させることが示されている（Kavaiら, 1982, Adv. Exp Med. Biol. 141:575-582；WardおよびGhetie, 1995, Therapeutic Immunol., 2:77-94）。さらにまた、免疫受容体の、そのリガンドによる結合（engagement）後の重要なステップは、それらの内在化およびリソソームへの送達である（Bonnerotら, 1998, EMBO J., 11:4906-4916）。したがって、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の増加を示す本発明のＩｇ分子または組成物は、リソソーム酵素の分泌の増加をもたらしうると考えられる。 Increased FcγRIII receptor activity has been shown to increase secretion of lysosomal beta-glucuronidase as well as other lysosomal enzymes (Kavai et al., 1982, Adv. Exp Med. Biol. 141: 575-582; Ward and Ghetie, 1995, Therapeutic Immunol., 2: 77-94). Furthermore, an important step after the engagement of immune receptors with their ligands is their internalization and delivery to lysosomes (Bonnerot et al., 1998, EMBO J., 11: 4906-4916). Thus, it is believed that an Ig molecule or composition of the invention that exhibits increased binding to FcγRIIIa and FcγRIIIb can result in increased secretion of lysosomal enzymes.

もっぱら好中球上に存在するＦｃγＲＩＩＩｂは、免疫複合体の組立てに主要な役割を果たし、その凝集は、食作用、脱顆粒、および呼吸バーストを活性化し、それがオプソニン化された病原体の破壊につながる。好中球の活性化は、受容体の二つの細胞外ドメインに相当する、タンパク質分解によって切断された可溶型受容体の分泌につながる。可溶型ＦｃγＲＩＩＩｂは、ＦｃγＲ依存的エフェクター機能の競合的阻害および補体受容体ＣＲ３への結合による調節機能を発揮し、炎症媒介物質の産生をもたらす（Sautes-Fridmanら, 2003, ASHI Quarterly, 148-151）。 FcγRIIIb, which is exclusively present on neutrophils, plays a major role in the assembly of immune complexes, and its aggregation activates phagocytosis, degranulation, and respiratory burst, which is responsible for the destruction of opsonized pathogens. Connected. Neutrophil activation leads to the secretion of soluble receptors cleaved by proteolysis, corresponding to the two extracellular domains of the receptor. Soluble FcγRIIIb exerts regulatory functions by competitive inhibition of FcγR-dependent effector function and binding to complement receptor CR3, resulting in production of inflammatory mediators (Sautes-Fridman et al., 2003, ASHI Quarterly, 148 -151).

したがって本発明は、本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなるＮ−グリカンを含む免疫グロブリン分子を提供する。また本発明は、免疫グロブリンおよびそこに結合された複数のＮ−グリカンを含む組成物であって、前記複数のＮ−グリカン内の主要Ｎ−グリカンが本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなる組成物を提供する。どちらの実施形態でも、免疫グロブリンにおける前記ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンの優勢は、好ましくは、本明細書に示すように、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂへの改善された結合およびＦｃγＲＩＩｂへの減少した結合に加えて、望ましい治療的エフェクター活性を付与する。 Accordingly, the present invention provides an immunoglobulin molecule comprising N-glycans consisting essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ . The present invention also relates to a composition comprising an immunoglobulin and a plurality of N-glycans bound thereto, wherein the main N-glycan in the plurality of N-glycans consists essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ . I will provide a. In both embodiments, the predominance of said GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycans in immunoglobulins is preferably in addition to improved binding to FcγRIIIa and FcγRIIIb and reduced binding to FcγRIIb, as shown herein. Confer desirable therapeutic effector activity.

免疫グロブリンサブクラス
ＩｇＧサブクラスは、Ｆｃ受容体に対して異なる結合アフィニティを持つことが示されている（Huizingaら, 1989, J. of Immunol, 142:2359-2364）。ＩｇＧサブクラスのそれぞれは、本発明の異なる側面に、個別の利点を与えうる。したがって、一側面として、本発明は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂をＩｇＧ１分子に結合された主要Ｎ−グリカンとして含むＩｇＧ１組成物を提供する。もう一つの側面として、本発明は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂をＩｇＧ２分子に結合された主要Ｎ−グリカンとして含むＩｇＧ２組成物を提供する。さらにもう一つの側面として、本発明は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂をＩｇＧ３分子に結合された主要Ｎ−グリカンとして含むＩｇＧ３組成物を提供する。もう一つの側面として、本発明は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂をＩｇＧ４分子に結合された主要Ｎ−グリカンとして含むＩｇＧ４組成物を提供する。 Immunoglobulin subclass The IgG subclass has been shown to have different binding affinities for Fc receptors (Huizinga et al., 1989, J. of Immunol, 142: 2359-2364). Each of the IgG subclasses can provide distinct advantages to different aspects of the invention. Thus, in one aspect, the invention provides an IgG1 composition comprising GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ as the major N-glycan linked to an IgG1 molecule. In another aspect, the present invention provides an IgG2 composition comprising GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ as the major N-glycan linked to an IgG2 molecule. In yet another aspect, the present invention provides an IgG3 composition comprising GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ as the major N-glycan linked to an IgG3 molecule. In another aspect, the present invention provides an IgG4 composition comprising GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ as the major N-glycan linked to an IgG4 molecule.

あるいは、本発明を、免疫グロブリンの５つの大クラス（major class）、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＧの全てに適用することができる。本発明の好ましい免疫グロブリンはヒトＩｇＧであり、好ましくはサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の一つに由来するものである。より好ましくは、本発明の免疫グロブリンはＩｇＧ１分子である。 Alternatively, the invention can be applied to all five major classes of immunoglobulins, namely IgA, IgD, IgE, IgM and IgG. The preferred immunoglobulin of the present invention is human IgG, preferably derived from one of the subtypes IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4. More preferably, the immunoglobulin of the present invention is an IgG1 molecule.

抗体エフェクター機能および活性を媒介する組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の製造
一側面として、本発明は、本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造からなるＮ−グリカンをＣ_H２ドメインのＡｓｎ−２９７に有する組換えＩｇ分子を製造するための方法であって、そのＩｇ分子が抗体エフェクター機能および活性を媒介する方法を提供する。また同様に、本発明は、免疫グロブリン組成物であって、その免疫グロブリンに結合されている主要Ｎ−グリカンがＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂である組成物を製造する方法も提供する。ある実施形態では、Ｉｇの重鎖および軽鎖がオーバーラップオリゴヌクレオチドを使って合成され、宿主細胞中で発現させるための発現ベクター（実施例１）に個別にクローニングされる。好ましい実施形態では、組換えＩｇ重鎖および軽鎖を、主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂の付加を触媒する宿主株で発現させる。ある実施形態では、このグリコフォーム構造が、より具体的には、Ｉｇ上のＦｃ領域のアミノ酸Ａｓｎ−２９７の窒素と、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン上のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンのヒドロキシル基との間に結合を形成する［Ｇａｌ−（ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，３）（Ｍａｎα１，３Ｍａｎα１，６Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ］で表される。さらにもう一つの実施形態では、この主要グリカンを、Ｉｇ分子内の異なる部位にある（Ａｓｎ−２９７以外の）アスパラギンに付加するか、またはＦａｂ領域中のＮ−グリコシル化部位と組み合わせ付加することができる。 Production of Recombinant Immunoglobulin (Ig) Molecules that Mediate Antibody Effector Function and Activity In one aspect, the present invention relates to N-glycans consisting essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structures in the As ₂ of C _H 2 domain. Methods for producing a recombinant Ig molecule having an Ig molecule that mediates antibody effector function and activity are provided. Similarly, the present invention also provides a method for producing an immunoglobulin composition, wherein the major N-glycan bound to the immunoglobulin is GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ . In one embodiment, Ig heavy and light chains are synthesized using overlapping oligonucleotides and individually cloned into an expression vector (Example 1) for expression in a host cell. In a preferred embodiment, recombinant Ig heavy and light chains are expressed in host strains that catalyze the addition of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ primarily. In certain embodiments, the glycoform structure more specifically comprises the nitrogen of the amino acid Asn-297 of the Fc region on Ig and the hydroxyl group of N-acetyl-β-D-glucosamine on GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycans. And [Gal- (GlcNAcβ1,2-Manα1,3) (Manα1,3Manα1,6Manα1,6) Manβ1,4-GlcNAcβ1,4-GlcNAc]. In yet another embodiment, this major glycan can be added to asparagine (other than Asn-297) at a different site in the Ig molecule or combined with an N-glycosylation site in the Fab region. it can.

下等真核生物における主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂を有するＩｇの製造
本発明の一側面は、主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリコフォームを持つ免疫グロブリンまたは抗体分子の製造に使用することができる組換え下等真核宿主細胞を提供する。これは、前記グリコフォームを低い収率で天然に産生する哺乳動物細胞において発現される糖タンパク質の組成物と比較した利点である。 Production of Ig with predominantly GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ in lower eukaryotes One aspect of the present invention is a recombinant lower true truth that can be used primarily for the production of immunoglobulins or antibody molecules with GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycoforms. A nuclear host cell is provided. This is an advantage compared to glycoprotein compositions expressed in mammalian cells that naturally produce the glycoform in low yield.

容易に再現することができる所定のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質の組成物が得られることは、本発明のもう一つの利点である。そのような組成物の性質は評価され、望ましい性質が得られるように最適化されると共に、有害な作用を最小限に抑えるか、全く回避することができる。 It is another advantage of the present invention that a composition of glycoproteins having a predetermined glycosylation pattern that can be easily reproduced is obtained. The properties of such compositions can be evaluated and optimized to achieve the desired properties, and harmful effects can be minimized or avoided altogether.

本発明は、本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなるＮ−グリカンを含むＩｇ分子および主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有するＩｇ組成物を製造するために１またはそれ以上の核酸分子を発現させるように操作または選択される組換え宿主を作出するための方法も提供する。本発明の一定の好ましい実施形態では、組換え宿主細胞、好ましくは組換え下等真核宿主細胞を使って、主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカンを有する前記Ｉｇ分子および組成物が製造される。 The present invention is directed to expressing one or more nucleic acid molecules to produce an Ig molecule comprising N-glycans consisting essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ and an Ig composition predominantly having a GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure. Also provided are methods for producing a recombinant host to be engineered or selected. In certain preferred embodiments of the invention, the Ig molecules and compositions having predominantly GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycans are produced using recombinant host cells, preferably recombinant lower eukaryotic host cells.

別の好ましい実施形態では、本発明は、組換え宿主細胞から得ることができるまたは本発明の方法によって得ることができる糖タンパク質を含む。 In another preferred embodiment, the present invention includes glycoproteins obtainable from recombinant host cells or obtainable by the methods of the present invention.

本発明の宿主細胞は、所望のＩｇ領域をコードするベクター、および本明細書に記載するグリコシル化関連酵素の１またはそれ以上をコードするベクターで形質転換し、次にそれを、主要ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有する組換えＩｇ分子または組成物の発現に関して選択することができる。本発明の組換え宿主細胞は、主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_5-ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン構造を有するＩｇ組成物を産生するように操作または選択された真核宿主細胞または原核宿主細胞、例えば動物、植物、昆虫、細菌細胞などであることができる。 A host cell of the invention is transformed with a vector encoding the desired Ig region and a vector encoding one or more of the glycosylation-related enzymes described herein, which is then transformed into the major GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc. it can be selected for expression of the recombinant Ig molecule or composition having ₂ N- glycan. A recombinant host cell of the invention is a eukaryotic or prokaryotic host cell that has been engineered or selected to produce an Ig composition having primarily a GalGlcNAcMan ₅ -GlcNAc ₂ N-glycan structure, such as an animal, plant, insect, It can be a bacterial cell or the like.

好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は、当分野で記載されているように遺伝子操作された下等真核宿主細胞である（ＷＯ０２／００８７９、ＷＯ０３／０５６９１４、ＷＯ０４／０７４４９８、ＷＯ０４／０７４４９９、Ｃｈｏｉら、２００３、ＰＮＡＳ、１００：５０２２−５０２７；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ、３０１：１２４４−１２４６およびＢｏｂｒｏｗｉｃｚら、２００４、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４：７５７−７６６）。具体的に述べると、ＷＯ０２／００８７９およびＷＯ０４／０７４４９９には、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を発現させるための方法が開示されると共に、下等真核生物へのβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの導入が記述されている。さらに具体的に述べると、米国特許出願第１１／１０８０８８号には、主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質（免疫グロブリンを含む）が開示されている。 Preferably, the recombinant host cell of the invention is a lower eukaryotic host cell that has been genetically engineered as described in the art (WO02 / 00879, WO03 / 056914, WO04 / 074498, WO04 / 074499, Choi et al., 2003, PNAS, 100: 5022-5027; Hamilton et al., 2003, Nature, 301: 1244-1246 and Bobroicz et al., 2004, Glycobiology, 14: 757-766). Specifically, WO 02/00879 and WO 04/074499 disclose methods for expressing glycoproteins having GlcNAcMan5GlcNAc2 N-glycans, and β-1,4-galactosyl to lower eukaryotes. The introduction of transferase has been described. More specifically, US patent application Ser. No. 11/108088 discloses glycoproteins (including immunoglobulins) having primarily GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycans.

ある実施形態では、ＩｇＧ１をコードするベクター、例えばＪＣ−ＩｇＧ１を含有するＡＯＸ１／ｐＰＩＣＺＡベクター（実施例１）が、酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＹＡＳ３８５−１株に導入される。このＹＡＳ３８５−１株は、Ｋ３レポータータンパク質が除去されたＹＳＨ４４株（Hamiltonら, 2003, Science, 301:1244-1246）に似ており、ＰＮＯ１およびＭＮＮ４ｂ遺伝子が記述のとおり破壊されていると共に（米国特許出願第１１／０２０８０８号）、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼＩ遺伝子が記述のとおり導入されている（米国特許出願第１１／１０８０８８号）。Δｐｎｏ１Δｍｎｎ４ｂ二重破壊は、マンノシルリン酸化の排除をもたらす。ＹＳＨ４４（Hamiltonら, 2003）について記述されたようにＵＲＡ５遺伝子に隣接して導入されたマンノシダーゼＩＩ遺伝子は、その株を５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）で生育することによって排除された（GuthrieおよびFink, 1991「Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology」Methods in Enzymology, Vol.169, Academic Press, サンディエゴ）。マンノシダーゼＩＩ遺伝子の除去により、α−１，６マンノースアームに連結された末端α−１，３およびα−１，６マンノースならびにα−１，３マンノース上のβ−１，２ＧｌｃＮＡｃおよびβ−１，２ＧｌｃＮＡｃに連結された末端β−１，４ガラクトースを持つ、ペンタマンノースコア構造が保たれる。次に、ＵＲＡ３遺伝子をＡＭＲ２遺伝子座に挿入するＵＲＡ３ノックアウトプラスミド（ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ、１９９１、前出）を使って、ＡＭＲ２遺伝子を破壊することにより、β−マンノシル化を排除した（米国特許出願第１１／１１８００８号）。このＹＡＳ３８５−１株は、主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂およびＧｌｃＮＡｃＭａｎ_5-ＧｌｃＮＡｃ₂の両方を有する糖タンパク質を発現させるので、主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂およびＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂を有するＪＣ−ＩｇＧをもたらす。主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂およびＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂を有するこのＪＣ−ＩｇＧを、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（実施例３）で処理すると、主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＪＣ−ＩｇＧが得られる（図４Ａ）。 In one embodiment, a vector encoding IgG1, such as an AOX1 / pPICZA vector (Example 1) containing JC-IgG1, is produced in yeast P. a. pastoris YAS385-1 strain. This YAS385-1 strain is similar to the YSH44 strain from which the K3 reporter protein has been removed (Hamilton et al., 2003, Science, 301: 1244-1246), with the PNO1 and MNN4b genes being disrupted as described (US No. 11/020808), the β-1,4 galactosyltransferase I gene has been introduced as described (US patent application No. 11/108088). The Δpno1Δmnn4b double disruption results in the elimination of mannosyl phosphorylation. The mannosidase II gene introduced adjacent to the URA5 gene as described for YSH44 (Hamilton et al., 2003) was eliminated by growing the strain in 5-fluoroorotic acid (5-FOA) (Guthrie And Fink, 1991 “Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology” Methods in Enzymology, Vol. 169, Academic Press, San Diego). Removal of the mannosidase II gene resulted in terminal α-1,3 and α-1,6 mannose linked to the α-1,6 mannose arm and β-1,2GlcNAc and β-1, on α-1,3 mannose. A pentamannose core structure with terminal β-1,4 galactose linked to 2GlcNAc is retained. Next, β-mannosylation was eliminated by disrupting the AMR2 gene using a URA3 knockout plasmid (Guthrie and Fink, 1991, supra) that inserts the URA3 gene into the AMR2 locus (US Patent Application No. 11 / 118008). This YAS385-1 strain mainly expresses glycoproteins with both GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ and GlcNAcMan _5- GlcNAc ₂ , thus yielding JC-IgG with mainly GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ and GlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ . Treatment of this JC-IgG with predominantly GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ and GlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ with β-1,4 galactosyltransferase (Example 3) yields JC-IgG with predominantly GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycans. (FIG. 4A).

もう一つの実施形態では、ＤＸ−ＩｇＧを含有するＡＯＸ１／ｐＰＩＣＺＡ中のＩｇＧ１をコードするベクター（実施例１）も、酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＹＡＳ３８５−１株（前出）に導入され、精製され、次にβ−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼで処理されることにより（実施例３）、主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＤＸ−ＩｇＧが得られる（実施例４Ｂ）。 In another embodiment, a vector (Example 1) encoding IgG1 in AOX1 / pPICZA containing DX-IgG is also used in yeast introduced into pastoris YAS385-1 strain (supra), purified, by subsequently treated with beta-l, 4-galactosyltransferase (Example 3), DX-IgG having predominantly GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycan Is obtained (Example 4B).

あるいは、当分野で公知のいくつかの方法を使って、本発明の抗体を発現させることもできる（「Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications」79〜97頁（Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, 1987）。 Alternatively, the antibodies of the present invention can be expressed using several methods known in the art ("Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications" pages 79-97 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

下等真核生物におけるグリコシルトランスフェラーゼの発現および安定な遺伝子組み込み
選択可能マーカー、例えばＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＨＩＳ４、ＳＵＣ２、Ｇ４１８、ＢＬＡまたはＳＨＢＬＡなどを使って、下等真核宿主株（例えばＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）に異種遺伝子を導入し、その組み込みを確認するための方法は、既に記述されている。そのような方法は、発現系が下等真核生物で作製される場合は、本発明のＩｇの製造に適合させることができる。また、ＵＲＡ３マーカーを反復使用して、望ましくないマンノシルトランスフェラーゼ活性を排除させる方法も、既に記述されている。Alaniら, 1987, Genetics, 116:541-545および米国特許第６，０５１，４１９号には、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中のＵＲＡ３遺伝子を破壊することに基づく選択系が記述されている。好ましくは、ＰｐＵＲＡ３−またはＰｐＵＲＡ５−ブラスターカセットを使って、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５またはウラシル生合成経路中の任意の遺伝子を破壊し、ウラシルに関する栄養要求性および５−フルオロオロト酸（５ＦＯＡ）に対する耐性に基づく陽性選択と陰性選択の両方を可能にする（Boekeら, 1984, MoI. Gen. Genet., 197:345-346）。したがって、そのような系が、選択および対抗選択による複数の異種遺伝子の挿入を可能にすることは、当業者には理解される。 Glycosyltransferase expression and stable gene integration in lower eukaryotes Using selectable markers such as URA3, URA5, HIS4, SUC2, G418, BLA or SH BLA, lower eukaryotic host strains (eg P. pastoris) A method for introducing a heterologous gene into () and confirming its integration has already been described. Such methods can be adapted for the production of the Ig of the present invention when the expression system is made in lower eukaryotes. A method of repeatedly using the URA3 marker to eliminate unwanted mannosyltransferase activity has also been described. Alani et al., 1987, Genetics, 116: 541-545 and US Pat. A selection system based on the disruption of the URA3 gene in pastoris has been described. Preferably, a PpURA3- or PpURA5-blaster cassette is used to disrupt any gene in the URA3, URA5 or uracil biosynthetic pathway and positive based on uracil auxotrophy and resistance to 5-fluoroorotic acid (5FOA) Allows both selection and negative selection (Boeke et al., 1984, MoI. Gen. Genet., 197: 345-346). Thus, those skilled in the art will appreciate that such a system allows the insertion of multiple heterologous genes by selection and counter-selection.

さらなる酵素修飾
ヒトにおける異常な免疫原活性を付与しうるマンノシルリン酸化またはβ−マンノシル化を含まないＩｇを単離するには、さらなる酵素欠失が有益または必要であるかもしれない。上述のように、米国特許出願第１１／０２０８０８号にはマンノシルリン酸化を排除するための方法が開示されており、米国特許出願第１１／１１８００８号には、β−マンノシル化を排除するための方法が開示されている。 Further enzyme modifications Further enzyme deletions may be beneficial or necessary to isolate Igs that do not contain mannosyl phosphorylation or β-mannosylation that may confer abnormal immunogenic activity in humans. As mentioned above, US patent application Ser. No. 11/020808 discloses a method for eliminating mannosyl phosphorylation, and US patent application Ser. No. 11/118008 discloses a method for eliminating β-mannosylation. A method is disclosed.

他のタンパク質発現系における主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有するＩｇの製造
異種タンパク質発現のために、ある主要グリカン構造を有するＩｇを発現させるように操作する必要があってもなくてもよい発現宿主系（生物）が選択されることは、当業者には理解される。本明細書に記載する実施例は、Ａｓｎ−２９７もしくは別のＮ−グリコシル化部位、またはその両方に特定のグリカンを有するＩｇの発現を実行するための一方法の例である。当業者は、本発明のこれらの詳細および実施例を任意のタンパク質発現宿主系（生物）に、容易に適合させることができる。 Production of Igs with primarily GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structures in other protein expression systems Expression hosts that may or may not need to be engineered to express Ig with certain major glycan structures for heterologous protein expression One skilled in the art understands that the system (organism) is selected. The example described herein is an example of one method for carrying out the expression of Ig with specific glycans at Asn-297 or another N-glycosylation site, or both. One skilled in the art can readily adapt these details and examples of the invention to any protein expression host system (organism).

他のタンパク質発現宿主系、例えば動物、植物、昆虫、細菌細胞などを、本発明のＩｇ分子および組成物を製造するために使用することができる。そのようなタンパク質発現宿主系は、主要グリコフォームを発現させるように操作または選択されうるか、あるいは主要グリカン構造を有する糖タンパク質を天然に産生することができる。ある主要グリコフォームを有する糖タンパク質を産生する操作されたタンパク質発現宿主系の例には、遺伝子ノックアウト／突然変異体（Shieldsら, 2002, JBC, 277:26733-26740）；遺伝子操作（Umanaら, 1999, Nature Biotech., 17:176-180）または両方の組み合わせが含まれる。あるいは、一定の細胞は、主要グリコフォームを天然に発現させる−例えばニワトリ、ヒトおよびウシ（Rajuら, 2000, Glycobiology, 10:477-486）。したがって、当業者は、本発明に従って主として一つの特定グリカン構造を有するＩｇ糖タンパク質または組成物の発現を、数多くの発現宿主系の少なくとも一つを選択することによって得ることができる。糖タンパク質を製造するための、当分野で見出されるさらなる発現宿主系には、ＣＨＯ細胞：ＲａｊｕＷＯ９９２２７６４Ａ１およびＰｒｅｓｔａＷＯ０３／０３５８３５Ａ１；ハイブリドーマ細胞：Trebakら, 1999, J. Immunol. Methods, 230:59-70；昆虫細胞：Hsuら, 1997, JBC, 272:9062-970、および植物細胞：Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら、ＷＯ０４／０７４４９９Ａ２が含まれる。 Other protein expression host systems such as animals, plants, insects, bacterial cells, etc. can be used to produce the Ig molecules and compositions of the invention. Such protein expression host systems can be engineered or selected to express the major glycoform, or can naturally produce glycoproteins having a major glycan structure. Examples of engineered protein expression host systems that produce glycoproteins with certain major glycoforms include gene knockout / mutants (Shields et al., 2002, JBC, 277: 26733-26740); genetic engineering (Umana et al., 1999, Nature Biotech., 17: 176-180) or a combination of both. Alternatively, certain cells naturally express the major glycoform—for example chicken, human and bovine (Raju et al., 2000, Glycobiology, 10: 477-486). Thus, one skilled in the art can obtain expression of an Ig glycoprotein or composition having primarily one specific glycan structure according to the present invention by selecting at least one of a number of expression host systems. Additional expression host systems found in the art for producing glycoproteins include CHO cells: Raju WO9922764A1 and Presta WO03 / 035835A1; hybridoma cells: Trebak et al., 1999, J. Immunol. Methods, 230: 59-70. Insect cells: Hsu et al., 1997, JBC, 272: 9062-970, and plant cells: Gerngross et al., WO 04/074499 A2.

ＩｇＧの精製
抗体を精製および単離する方法は、当分野で知られており、開示されている。例えばKohlerおよびMilstein,（1975）Nature 256:495；Brodeurら「Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications」51〜63頁, Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, 1987)；Goding「Monoclonal Antibodies: Principles and Practice」59〜104頁（Academic Press, 1986）；ならびにJakobovitsら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-255およびJakobovitsら,（1993）Nature 362:255-258を参照されたい。さらなる一実施形態では、McCaffertyら（1990）Nature, 348:552-554（1990）に記述されている技法を使って作成された抗体ファージライブラリーから、関心対象の抗原を使って適切な抗体または抗体断片を選択することにより、抗体または抗体断片を単離することができる。 Purification of IgG Methods for purifying and isolating antibodies are known and disclosed in the art. See, for example, Kohler and Milstein, (1975) Nature 256: 495; Brodeur et al. “Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications” pages 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); Goding “Monoclonal Antibodies: Principles and Practice” 59- 104 (Academic Press, 1986); and Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-255 and Jakobovits et al. (1993) Nature 362: 255-258. In a further embodiment, suitable antibodies or antibodies using an antigen of interest from an antibody phage library generated using the techniques described in McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552-554 (1990) By selecting an antibody fragment, the antibody or antibody fragment can be isolated.

本発明の方法に従って製造された組換えＩｇ分子は、実施例３に概説する方法に従って精製することができる。図２にＹＡＳ３８５−１から精製されたＪＣ−ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルを示す。図３にＹＡＳ３８５−１から精製されたＤＸ−ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルを示す。もう一つの実施形態では、精製したＩｇ抗体が、主要Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂を持つ。任意のＩｇ分子上のグリカンの解析および分布は、当業者に知られるいくつかの質量分析法、例えばＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＬＣＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳなど（ただしこれらに限定されるわけではない）によって決定することができる。好ましい一実施形態では、グリカンの分布が、実施例５に開示するように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ解析によって決定される。図４Ａに、ＹＡＳ３８５−１から精製し、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼで処理したＪＣ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す（実施例３）。このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、全Ｎ−グリカンの約５９．２モル％がＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂であることを示している。図４ＢにＹＡＳ３８５−１から精製し、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼで処理したＤＸ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、全Ｎ−グリカンの約６６モル％がＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂であることを示している。 Recombinant Ig molecules produced according to the method of the invention can be purified according to the method outlined in Example 3. FIG. 2 shows an SDS-PAGE Coomassie-stained gel of JC-IgG purified from YAS385-1. FIG. 3 shows an SDS-PAGE Coomassie stained gel of DX-IgG purified from YAS385-1. In another embodiment, the purified Ig antibody has GlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ as the major N-glycan. Analysis and distribution of glycans on any Ig molecule is determined by several mass spectrometry methods known to those skilled in the art, such as but not limited to HPLC, NMR, LCMS and MALDI-TOF MS. can do. In a preferred embodiment, the distribution of glycans is determined by MALDI-TOF MS analysis as disclosed in Example 5. FIG. 4A shows a MALDI-TOF spectrum of JC-IgG purified from YAS385-1 and treated with β-1,4 galactosyltransferase (Example 3). This MALDI-TOF shows that about 59.2 mol% of total N-glycans is GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ . FIG. 4B shows a MALDI-TOF spectrum of DX-IgG purified from YAS385-1 and treated with β-1,4 galactosyltransferase. This MALDI-TOF shows that about 66 mol% of all N-glycans is GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ .

医薬組成物
本発明の抗体は、活性治療剤としての抗体と他のさまざまな医薬的に許容できる成分とを含む医薬組成物に組み入れることができる。「Remington's Pharmaceutical Science」（第15版, Mack Publishing Company, ペンシルバニア州イーストン, 1980）を参照されたい。好ましい形態は、意図する投与様式および治療用途に依存する。本組成物は、所望する製剤に応じて、医薬的に許容できる無毒性の担体または希釈剤も含むことができ、それらは動物投与用またはヒト投与用の医薬組成物を調剤するために一般に使用される賦形剤と定義される。希釈剤は、その組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。さらにまた、医薬組成物または医薬製剤は、他の担体、アジュバント、または無毒性で治療剤でない非免疫原性の安定剤なども含むことができる。 Pharmaceutical Compositions The antibodies of the present invention can be incorporated into pharmaceutical compositions comprising antibodies as active therapeutic agents and various other pharmaceutically acceptable ingredients. See "Remington's Pharmaceutical Science" (15th Edition, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980). The preferred form depends on the intended mode of administration and therapeutic application. Depending on the desired formulation, the composition can also include a pharmaceutically acceptable non-toxic carrier or diluent, which are commonly used to formulate pharmaceutical compositions for animal or human administration. Defined as an excipient. The diluent is selected so as not to affect the biological activity of the combination. Examples of such diluents are distilled water, physiological phosphate buffered saline, Ringer's solution, dextrose solution, and Hank's solution. Furthermore, the pharmaceutical composition or formulation can also include other carriers, adjuvants, or non-toxic, non-therapeutic non-immunogenic stabilizers and the like.

非経口投与用の医薬組成物は、滅菌状態にあり、実質的に等張性であり、パイロジェンフリーであり、ＦＤＡまたは類似する組織のＧＭＰに従って製造される。抗体は、生理学的に許容できる希釈剤中の物質の溶液または懸濁液の注射可能な投薬量として、滅菌液体、例えば水、油、食塩水、グリセロールまたはエタノールなどであることができる医薬担体と共に、投与することができる。さらにまた、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などが、組成物中に存在することもできる。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油、および鉱油などである。一般に、グリコール類、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールは、特に注射可能溶液には、好ましい液体担体である。抗体は、活性成分の徐放が可能になるような形で調剤することができるデポー注射またはインプラント調製物の形態で投与することができる。典型的には、組成物は注射可能剤として、溶液または懸濁液の形で調剤され、注射に先だって液体賦形剤中に溶解または懸濁するのに適した固形剤形も製造することができる。上述のように、調製物は、アジュバント効果を強化するために、リポソームまたはマイクロ粒子、例えばポリラクチド、ポリグリコライド、またはコポリマー中に、乳化または封入することもできる（Langer, Science 249, 1527（1990）およびHanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119（1997）を参照されたい）。 Pharmaceutical compositions for parenteral administration are sterile, substantially isotonic, pyrogen free and manufactured according to FDA or similar tissue GMP. The antibody is in an injectable dosage of a solution or suspension of the substance in a physiologically acceptable diluent, together with a pharmaceutical carrier, which can be a sterile liquid, such as water, oil, saline, glycerol or ethanol. Can be administered. In addition, auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, surfactants, pH buffering substances and the like may be present in the composition. Other ingredients of the pharmaceutical composition are of petroleum, animal, vegetable, or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, and mineral oil. In general, glycols such as propylene glycol or polyethylene glycol are preferred liquid carriers, particularly for injectable solutions. The antibodies can be administered in the form of depot injections or implant preparations that can be formulated in such a way as to allow sustained release of the active ingredient. Typically, the composition is formulated as an injectable solution in the form of a solution or suspension, and a solid dosage form suitable for dissolution or suspension in a liquid vehicle prior to injection may also be prepared. it can. As mentioned above, the preparation can also be emulsified or encapsulated in liposomes or microparticles such as polylactides, polyglycolides or copolymers to enhance the adjuvant effect (Langer, Science 249, 1527 (1990). ) And Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997)).

診断製品
本発明の抗体は、さまざまな診断用キットおよび他の診断製品、例えばアレイなどに組み入れることもできる。抗体は、多くの場合、固相に（例えばマイクロタイターディッシュのウェルに）予め結合された状態で提供される。キットは、多くの場合、抗体結合を検出するための試薬類、およびキットの使用方法を記載したラベリングも含む。イムノメトリックアッセイまたはサンドイッチアッセイは、診断キットには好ましい形式である（ＵＳ４，３７６，１１０、４，４８６，５３０、５，９１４，２４１、および５，９６５，３７５参照）。抗体アレイは、例えばＵＳ５，９２２，６１５、ＵＳ５，４５８，８５２、ＵＳ６，０１９，９４４、およびＵＳ６，１４３，５７６によって記述されている。 Diagnostic Products The antibodies of the present invention can also be incorporated into various diagnostic kits and other diagnostic products such as arrays. The antibody is often provided pre-bound to a solid phase (eg, to a well of a microtiter dish). Kits often also include reagents for detecting antibody binding and labeling that describes how to use the kit. Immunometric or sandwich assays are the preferred format for diagnostic kits (see US Pat. No. 4,376,110, 4,486,530, 5,914,241, and 5,965,375). Antibody arrays are described, for example, by US 5,922,615, US 5,458,852, US 6,019,944, and US 6,143,576.

治療用途
本発明は、糖タンパク質上に主として特定のグリコフォームを含む糖タンパク質組成物を提供する。本発明の特徴は、哺乳動物（ヒトを含む）に投与した場合に、この新規糖タンパク質組成物を含む医薬組成物が、好ましい実施形態においては、類似する一次構造を持つ他の糖タンパク質組成物と比較して、優れたインビボでの性質を有利に示すことである。したがって本発明の新規組成物は、糖タンパク質医薬剤が現在使用されている状況ならどこにでも使用することができ、性質の改善ならびに製造ロット間および製造ロット全体での均一性の増加をもたらしうる。本発明の調製物は、個別の薬物または医薬およびその標的領域に応じて、溶液、単位剤形、例えば経口送達用の錠剤およびカプセル剤、ならびに懸濁剤、軟膏などに組み入れることができる。 Therapeutic Uses The present invention provides glycoprotein compositions that primarily comprise a particular glycoform on a glycoprotein. A feature of the present invention is that when administered to mammals (including humans), a pharmaceutical composition comprising this novel glycoprotein composition, in a preferred embodiment, is another glycoprotein composition having a similar primary structure. Is advantageous in that it exhibits superior in vivo properties. Thus, the novel compositions of the present invention can be used wherever glycoprotein pharmaceutical agents are currently used, resulting in improved properties and increased uniformity between and between production lots. The preparations of the present invention can be incorporated into solutions, unit dosage forms such as tablets and capsules for oral delivery, as well as suspensions, ointments and the like, depending on the particular drug or medicament and its target area.

ある特定の側面として、本発明は、糖タンパク質医薬剤、薬物または医薬のための新規組成物であって、糖タンパク質が免疫グロブリン分子を含み、組成物が主として糖タンパク質の特定グリコフォームを含むものを提供する。本発明の特定の一側面によれば、本明細書に記載の、主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を持つＮ−結合型オリゴ糖を有する免疫グロブリン糖タンパク質を含む組成物が提供される。好ましい側面として、糖タンパク質は抗体であり、特にモノクローナル抗体であることができる。本発明はさらに、本発明の組成物を製造するための方法およびツールも提供する。 In one particular aspect, the present invention provides a novel composition for a glycoprotein pharmaceutical agent, drug or medicament, wherein the glycoprotein comprises an immunoglobulin molecule and the composition primarily comprises a particular glycoform of the glycoprotein. I will provide a. According to one particular aspect of the present invention, there is provided a composition comprising an immunoglobulin glycoprotein having an N-linked oligosaccharide having a predominantly GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure as described herein. In a preferred aspect, the glycoprotein is an antibody, particularly a monoclonal antibody. The present invention further provides methods and tools for producing the compositions of the present invention.

本発明はさらに、本発明のグリコフォーム調製物を含む医薬組成物を包含する。本組成物は好ましくは滅菌状態にある。組成物が水溶液である場合、好ましくは、糖タンパク質は可溶性である。組成物が凍結乾燥粉末である場合、好ましくは、その粉末は適当な溶媒で復元することができる。 The present invention further encompasses pharmaceutical compositions comprising the glycoform preparations of the present invention. The composition is preferably sterile. When the composition is an aqueous solution, preferably the glycoprotein is soluble. When the composition is a lyophilized powder, preferably the powder can be reconstituted with a suitable solvent.

他の側面として、本発明は、疾患状態を処置するための方法であって、その必要がある哺乳動物に、治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。本発明のさらにもう一つの目的は、疾患または障害を処置する目的に使用することができる製造品またはキットとしてグリコフォーム調製物を提供することである。 In another aspect, the present invention relates to a method for treating a disease state comprising administering to a mammal in need thereof a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition of the present invention. Yet another object of the present invention is to provide a glycoform preparation as an article of manufacture or kit that can be used for the purpose of treating a disease or disorder.

主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有する本発明のＩｇ分子は、適応症、例えば癌、炎症性疾患、感染症、免疫疾患、自己免疫疾患、例えば特発性血小板減少性紫斑病、関節炎、全身性エリテマトーデス、および自己免疫性溶血性貧血などに、多くの治療用途を持っている。 Ig molecules of the present invention having predominantly GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycans are indicated for indications such as cancer, inflammatory diseases, infections, immune diseases, autoimmune diseases such as idiopathic thrombocytopenic purpura, arthritis, systemic It has many therapeutic uses such as lupus erythematosus and autoimmune hemolytic anemia.

以下は、Ｉｇ糖タンパク質組成物の製造に関して、本発明の組成物および方法を例示する実施例である。これらの実施例は限定であるとみなしてはならず、これらの実施例は例示を目的として記載するに過ぎない。この開示には数多くの変更および拡張（最適化を含む）が可能であることは、当業者には理解される。そのような変更および拡張は本発明の一部とみなされる。 The following are examples that illustrate the compositions and methods of the present invention with respect to the production of Ig glycoprotein compositions. These examples should not be considered limiting, and these examples are described for illustrative purposes only. Those skilled in the art will appreciate that many changes and extensions (including optimization) are possible in this disclosure. Such changes and extensions are considered part of this invention.

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現させるためのＤＸ−ＩｇＧ１のクローニング
ＤＸ−ＩｇＧ１（抗ＣＤ２０ＩｇＧ１）の軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖は、マウス可変領域とヒト定常領域とからなる。軽鎖を配列番号１として開示し、重鎖を配列番号２として開示する。重鎖配列および軽鎖配列を、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入したオーバーラップオリゴヌクレオチドを使って合成した。軽鎖可変領域については、１５のオーバーラップオリゴヌクレオチド（配列番号５〜１９）を購入し、ＰＣＲ反応でＥｘｔａｑ（Ｔａｋａｄａ）を使ってアニールさせることにより、５'ＭｌｙＩ部位を持つ軽鎖可変領域断片を作製
した。次に、この軽鎖可変断片を、５'ＭｌｙＩプライマーＣＤ２０Ｌ／ｕｐ（配列
番号２０）、３'可変／５'定常プライマーＬｆｕｓｉｏｎＲＴＶＡＡＰＳ／ｕｐ（
配列番号２１）、３'定常領域プライマーＬｆｕｓｉｏｎＲＴＶＡＡＰＳ／ｌｐ（配
列番号２２）および３'ＣＤ２０Ｌ／ｌｐ（配列番号２３）を用いるオーバーラップ
ＰＣＲにより、軽鎖定常領域（配列番号３）（ＧｅｎｅＡｒｔ、カナダ・トロント）と接合した。次に、その最終ＭｌｙＩ−軽鎖断片（これは５'ＡＧ塩基対を含む）
をｐＣＲ２．１ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入して、ｐＤＸ３４３を得た。重鎖については、マウス重鎖可変領域に相当する１７のオーバーラップオリゴヌクレオチド（配列番号２４〜４０）をＩＤＴから購入し、Ｅｘｔａｑを使ってアニールさせた。次に、この重鎖可変断片を、５'ＭｌｙＩプライマーＣＤ２０Ｈ／
ｕｐ（配列番号４１）、５'可変／定常プライマーＨｃｈａｉｎＡＳＴＫＧＰＳ／ｕ
ｐ（配列番号４２）、３'可変／定常プライマーＨｃｈａｉｎＡＳＴＫＧＰＳ／ｌｐ
（配列番号４３）および３'定常領域プライマーＨＦｃｋｐｎｌ／ｌｐ（配列番号４
４）を用いるオーバーラップＰＣＲにより、重鎖定常領域（配列番号４）（ＧｅｎｅＡｒｔ）に接合した。最終ＭｌｙＩ−重鎖断片（これは５'ＡＧ塩基対を含む）を
ｐＣＲ２．１ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入して、ｐＤＸ３６０を得た。完全長軽鎖および完全長重鎖を各ｔｏｐｏベクターからＭｌｙ１およびＮｏｔ１断片として単離した。次に、これらの軽鎖および重鎖断片を、４つのオーバーラップオリゴヌクレオチド−Ｐ．ＢｉＰｓｓ／ＵＰ１−ＥｃｏＲＩ、Ｐ．ＢｉＰｓｓ／ＬＰ１、Ｐ．ＢｉＰｓｓ／ＵＰ２およびＰ．ＢｉＰ／ＬＰ２（それぞれ配列番号４６〜４９）を使ってＫａｒ２（Ｂｉｐ）シグナル配列（配列番号４５）にライゲートし、次にｐＰＩＣＺＡのＥｃｏＲＩ−Ｎｏｔ１部位にライゲートすることにより、Ｋａｒ２−軽鎖を運ぶｐＤＸ３４４およびＫａｒ２−重鎖を運ぶｐＤＸ４６８を得た。次に、ｐＤＸ３４４のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、染色体組み込み用のＡＯＸ２プロモーター遺伝子を含有するｐＢＫ８５にサブクローニングして、ｐＤＸ４５８を得た。次に、重鎖を運ぶｐＤＸ４６８のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＤＸ４５８にサブクローニングして、ＡＯＸ１プロモーター下にＣＤ２０の重鎖と軽鎖の両方を含有するｐＤＸ４７８を得た。次にこのプラスミドをＳｐｅＩで直線化した後、ＡＯＸ２遺伝子座への組み込みが起こるように形質転換し、Ｚｅｏｃｉｎ耐性を使って形質転換体を選択した（実施例２参照）。 P. Cloning of DX-IgG1 for expression in pastoris The light (L) and heavy (H) chains of DX-IgG1 (anti-CD20 IgG1) consist of a mouse variable region and a human constant region. The light chain is disclosed as SEQ ID NO: 1 and the heavy chain is disclosed as SEQ ID NO: 2. Heavy and light chain sequences were synthesized using overlapping oligonucleotides purchased from Integrated DNA Technologies (IDT). For the light chain variable region, a light chain variable region fragment having a 5′MlyI site was obtained by purchasing 15 overlapping oligonucleotides (SEQ ID NOs: 5 to 19) and annealing using Extaq (Takada) in the PCR reaction. Was made. Next, this light chain variable fragment was subjected to 5′MlyI primer CD20L / up (SEQ ID NO: 20), 3 ′ variable / 5 ′ constant primer LfusionRTVAAPS / up (
SEQ ID NO: 21) Light chain constant region (SEQ ID NO: 3) (Gene Art, Canada) by overlap PCR using 3 ′ constant region primers LfusionRTVAAPS / lp (SEQ ID NO: 22) and 3 ′ CD20L / lp (SEQ ID NO: 23)・ Toronto was joined. Then the final MlyI-light chain fragment (which contains 5'AG base pairs)
Was inserted into the pCR2.1topo vector (Invitrogen) to obtain pDX343. For the heavy chain, 17 overlapping oligonucleotides (SEQ ID NOs: 24-40) corresponding to the mouse heavy chain variable region were purchased from IDT and annealed using Extaq. This heavy chain variable fragment is then designated as 5′MlyI primer CD20H /
up (SEQ ID NO: 41), 5 ′ variable / constant primer HchainASTKGPS / u
p (SEQ ID NO: 42), 3 ′ variable / constant primer HchainASTKGPS / lp
(SEQ ID NO: 43) and 3 ′ constant region primer HFckpnl / lp (SEQ ID NO: 4
It was joined to the heavy chain constant region (SEQ ID NO: 4) (Gene Art) by overlap PCR using 4). The final MlyI-heavy chain fragment (which contains 5′AG base pairs) was inserted into the pCR2.1 topo vector (Invitrogen) to yield pDX360. Full length light chain and full length heavy chain were isolated from each topo vector as Mly1 and Not1 fragments. These light and heavy chain fragments are then combined into four overlapping oligonucleotides—P. BiPss / UP1-EcoRI, P.I. BiPss / LP1, P.I. BiPss / UP2 and P.I. PDX344 carrying the Kar2-light chain by ligating to the Kar2 (Bip) signal sequence (SEQ ID NO: 45) using BiP / LP2 (SEQ ID NO: 46-49, respectively) and then ligating to the EcoRI-Not1 site of pPICZA. And pDX468 carrying the Kar2-heavy chain was obtained. Next, the BglII-BamHI fragment of pDX344 was subcloned into pBK85 containing the AOX2 promoter gene for chromosomal integration to obtain pDX458. The BglII-BamHI fragment of pDX468 carrying the heavy chain was then subcloned into pDX458, resulting in pDX478 containing both the heavy and light chains of CD20 under the AOX1 promoter. Next, this plasmid was linearized with SpeI, transformed so that integration into the AOX2 locus occurred, and a transformant was selected using Zeocin resistance (see Example 2).

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現させるためのＪＣ−ＩｇＧのクローニング
ＪＣ−ＩｇＧ１の軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖は、マウス可変領域とヒト定常領域とからなる。マウス可変軽鎖を配列番号５０（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＦ０１３５７６）として開示し、マウス可変重鎖を配列番号５１（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＦ０１３５７７）として開示する。重鎖配列および軽鎖配列を、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入したオーバーラップオリゴヌクレオチドを使って合成した。前記軽鎖領域については、１２のオーバーラップオリゴヌクレオチド（配列番号５２〜６３）を購入し、ＰＣＲ反応でＥｘｔａｑ（Ｔａｋａｄａ）を使ってアニールさせることにより、５'ＥｃｏＲＩ部位および３'Ｋｐｎ１部位を持
つ６６０塩基対の軽鎖を作製した。次に、この軽鎖を、ｐＰＩＣＺａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片としてサブクローニングした。重鎖については、Ｆａｂ断片に相当する１２のオーバーラップオリゴヌクレオチド（配列番号６４〜７５）を購入し、Ｅｘｔａｑを使って６６０塩基対のＦａｂ断片を作製した。Ｆｃ断片は、１２のオーバーラップオリゴヌクレオチド（配列番号７６〜８７）を使用し、それらを同様のオーバーラップＰＣＲ反応でアニールさせることにより、合成した。次に、重鎖のＦａｂ断片とＦｃ断片の両方を、重鎖Ｆａｂ断片の５'末端
に相当する５'ＥＣｏＲＩプライマー（配列番号６４）およびＦｃ断片の３'末端に
相当する３'Ｋｐｎ１プライマー（配列番号８８）を使ってアニールさせ、ｐＦＵ
Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用することにより、１，３３０塩基対の重鎖を作製した。プライマーにコードされている５'ＥｃｏＲＩ部位およ
び３'Ｋｐｎ１部位を使って、重鎖をｐＰＩＣＺａベクターにクローニングした。組
み込み遺伝子座として機能するＡＯＸ２プロモーター配列を、最終ｐＰＩＣＺａベクターにサブクローニングした。次に、ＡＯＸ１プロモーターを含有するＢｇｌＩＩ−ＢｓｔＢ１断片と、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー由来のＨＳＡ配列（配列番号８９）、トロンビン部位（配列番号９０）およびＪＣ軽鎖を含有するＢｓｔＢ１−ＢａｍＨＩ断片とを、どちらもこのＡＯＸ２／ｐＰＩＣＺａベクターのＢａｍＨＩにサブクローニングした。次に、ＡＯＸ１プロモーターを含有するもう一つのＢｌｇＩＩ−ＢｓｔＢＩ断片と、ＨＳＡ配列、トロンビン部位およびＪＣ重鎖を含有するＢｓｔＩＢ１−ＢａｍＨＩ断片とを、同じｐＰＩＣＺａベクターのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。この最終ベクターは、ＡＯＸ２組み込み遺伝子座、ＨＳＡタグ付ＪＣ軽鎖およびＨＳＡタグ付ＪＣ重鎖を含有し、ｐＪＣ1４０をもたらす。この発現カセットをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの株のＡＯＸ２遺伝子座に組み込み、ｚｅｏｃｉｎ耐性で形質転換体を選択した（実施例２参照）。 P. Cloning of JC-IgG for expression in pastoris The light (L) and heavy (H) chains of JC-IgG1 consist of a mouse variable region and a human constant region. The mouse variable light chain is disclosed as SEQ ID NO: 50 (GenBank # AF013576) and the mouse variable heavy chain is disclosed as SEQ ID NO: 51 (GenBank # AF013577). Heavy and light chain sequences were synthesized using overlapping oligonucleotides purchased from Integrated DNA Technologies (IDT). For the light chain region, 12 overlapping oligonucleotides (SEQ ID NOs: 52-63) are purchased and annealed using Extaq (Takada) in the PCR reaction to have a 5 ′ EcoRI site and a 3 ′ Kpn1 site. A 660 base pair light chain was made. This light chain was then subcloned into the pPICZa vector (Invitrogen) as an EcoRI-KpnI fragment. For the heavy chain, 12 overlapping oligonucleotides (SEQ ID NOs: 64-75) corresponding to the Fab fragment were purchased and a 660 base pair Fab fragment was made using Extaq. Fc fragments were synthesized using 12 overlapping oligonucleotides (SEQ ID NOs: 76-87) and annealing them in a similar overlapping PCR reaction. Next, both the heavy chain Fab fragment and the Fc fragment were divided into a 5 ′ EcoRI primer corresponding to the 5 ′ end of the heavy chain Fab fragment (SEQ ID NO: 64) and a 3 ′ Kpn1 primer corresponding to the 3 ′ end of the Fc fragment ( Annealed using SEQ ID NO: 88) and pFU
By using Turbo polymerase (Stratagene), a 1,330 base pair heavy chain was generated. The heavy chain was cloned into the pPICZa vector using the 5 ′ EcoRI and 3 ′ Kpn1 sites encoded by the primers. The AOX2 promoter sequence that functions as an integration locus was subcloned into the final pPICZa vector. Next, a BglII-BstB1 fragment containing the AOX1 promoter and a BstB1-BamHI fragment containing an HSA sequence (SEQ ID NO: 89) derived from a human liver cDNA library, a thrombin site (SEQ ID NO: 90) and a JC light chain, Both were subcloned into BamHI of this AOX2 / pPICZa vector. Next, another BlgII-BstBI fragment containing the AOX1 promoter and a BstIB1-BamHI fragment containing the HSA sequence, thrombin site and JC heavy chain were subcloned into the BamHI site of the same pPICZa vector. This final vector contains the AOX2 integration locus, HSA-tagged JC light chain and HSA-tagged JC heavy chain, resulting in pJC140. This expression cassette was designated as P. A transformant was selected by integration into the AOX2 locus of a strain of pastoris and resistance to zeocin (see Example 2).

Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）／Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）は、Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州サンフランシスコ）から購入した抗ＣＤ２０マウス／ヒトキメラＩｇＧ１である。 Rituximab® / Rituxan® is an anti-CD20 mouse / human chimeric IgG1 purchased from Biogen-IDEC / Genentech (San Francisco, Calif.).

ＰＣＲ増幅
ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒを全てのＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応はテンプレートＤＮＡ、１２５μＭｄＮＴＰ類、各０．２μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ＥｘＴａｑポリメラーゼ緩衝液（タカラバイオ株式会社）とＥｘＴａｑポリメラーゼまたはｐＦＵＴｕｒｂｏポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とｐＦＵＴｕｒｂｏポリメラーゼを含有した。ＤＮＡ断片を、９７℃で１５秒、５５℃で１５秒および７２℃で９０秒の３０サイクルと、９７℃で２分の初期変性ステップおよび７２℃で７分の最終伸長ステップとで、増幅した。 PCR amplification The Eppendorf Mastercycler was used for all PCR reactions. PCR reaction was performed using template DNA, 125 μM dNTPs, 0.2 μM each of forward and reverse primers, Ex Taq polymerase buffer (Takara Bio Inc.) and Ex Taq polymerase or pFU Turbo polymerase buffer (Stratagene) and pFU Turbo polymerase. Contained. The DNA fragment was amplified with 30 cycles of 97 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 90 seconds, an initial denaturation step at 97 ° C for 2 minutes and a final extension step at 72 ° C for 7 minutes. .

ＰＣＲ試料をアガロースゲル電気泳動によって分離し、ＱｉａｇｅｎのＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを使って、ＤＮＡバンドを抽出し、精製した。脱イオンＨ₂Ｏに溶出させた最終ＰＣＲ（３断片全てのオーバーラップ）を除いて、全てのＤＮＡ精製物を、１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に溶出させた。 PCR samples were separated by agarose gel electrophoresis, and DNA bands were extracted and purified using Qiagen's Gel Extraction Kit. All DNA purifications were eluted in 10 mM Tris (pH 8.0) except for the final PCR (overlap of all three fragments) eluted in deionized H ₂ O.

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＹＡＳ３８５−１株へのＩｇＧベクターの形質転換
酢酸ナトリウムを加えて最終濃度を０．３Ｍにすることにより、ベクターＤＮＡを調製する。次に、１００％氷冷エタノールをＤＮＡ試料に加えて、最終濃度を７０％にする。ＤＮＡを遠心分離（１２０００ｇ×１０分）によってペレット化し、７０％氷冷エタノールで２回洗浄する。ＤＮＡを乾燥し、５０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に再懸濁する。形質転換に付すＹＡＳ３８５−１酵母培養物（Choiら, ２００３；Hamiltonら, ２００３）は、小さな培養物をＢＭＧＹ（緩衝最少グリセロール：１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）；１．３４％酵母ニトロゲンベース；４×１０^-5％ビオチン；１％グリセロール）でＯ．Ｄ．約２〜６まで増殖させることによって調製する。次にその酵母細胞を、１Ｍソルビトールで３回洗浄し、約１〜２ｍｌの１Ｍソルビトールに再懸濁することにより、エレクトロコンピテントにする。ＤＮＡ（１〜２μｇ）を１００μｌのコンピテント酵母と混合し、氷上で１０分間インキュベートする。次に酵母細胞を、ＢＴＸＥｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌＭａｎｉｐｕｌａｔｏｒ６００で、以下のパラメータを使ってエレクトロポレートする：１．５ｋＶ、１２９オーム、および２５μＦ。１ミリリットルのＹＰＤＳ（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％デキストロース、１Ｍソルビトール）をエレクトロポレートした細胞に加えた。次に、形質転換された酵母を、ｚｅｏｃｉｎを含む選択寒天平板に播種した。 P. Transformation of IgG vector into pastoris strain YAS385-1 Vector DNA is prepared by adding sodium acetate to a final concentration of 0.3M. Next, 100% ice cold ethanol is added to the DNA sample to a final concentration of 70%. The DNA is pelleted by centrifugation (12000 g × 10 min) and washed twice with 70% ice-cold ethanol. The DNA is dried and resuspended in 50 μl of 10 mM Tris (pH 8.0). The YAS385-1 yeast culture (Choi et al., 2003; Hamilton et al., 2003) subjected to transformation was transformed into BMGY (buffered minimum glycerol: 100 mM potassium phosphate (pH 6.0); 1.34% yeast nitrogen. Base; 4 × 10 ⁻⁵ % biotin; 1% glycerol). D. Prepare by growing to about 2-6. The yeast cells are then made electrocompetent by washing three times with 1M sorbitol and resuspending in about 1-2 ml of 1M sorbitol. DNA (1-2 μg) is mixed with 100 μl of competent yeast and incubated on ice for 10 minutes. The yeast cells are then electroporated with a BTX Electrocell Manipulator 600 using the following parameters: 1.5 kV, 129 ohms, and 25 μF. One milliliter of YPDS (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose, 1M sorbitol) was added to the electroporated cells. The transformed yeast was then seeded on selective agar plates containing zeocin.

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＩｇＧ１のための培養条件
ｐＤＸ４７８またはｐＪＣ１４０で形質転換されたＹＡＳ３８５−１の単一コロニーを、５０ｍｌＦａｌｃｏｎ(商標)遠心管中の１０ｍｌのＢＭＧＹ培地（これは１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０^-5％ビオチン、および１％グリセロールからなる）に接種した。その培養物を、２４℃／１７０〜１９０ｒｐｍで振とうしながら、培養物が飽和するまで４８時間インキュベートした。次に１００ｍｌのＢＭＧＹを５００ｍｌバッフル付きフラスコに加えた。次に種培養を、１００ｍｌのＢＭＧＹ培地が入っているバッフル付きフラスコに移した。この培養物を２４℃／１７０〜１９０ｒｐｍで振とうしながら２４時間インキュベートした。フラスコの内容物を２本の５０ｍｌＦａｌｃｏｎ（商標）遠心管にデカントし、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞ペレットをグリセロールを含まない２０ｍｌのＢＭＧＹで１回洗浄し、次に２０ｍｌのＢＭＭＹ（１％グリセロールの代わりに１％ＭｅＯＨを含むＢＭＧＹ）で穏やかに再懸濁した。懸濁した細胞を２５０ｍｌバッフル付きフラスコに移した。培養物を２４℃／１７０〜１９０ｒｐｍで振とうしながら２４時間インキュベートした。次にフラスコの内容物を２本の５０ｍｌＦａｌｃｏｎ（商標）遠心管にデカントし、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。培養上清をＥＬＩＳＡで解析することにより、タンパク質単離に先だっておよその抗体価を決定した（実施例３参照）。 P. Culture conditions for IgG1 in pastoris A single colony of YAS385-1 transformed with pDX478 or pJC140 was added to 10 ml BMGY medium (this was 1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), 1.34% yeast nitrogen base, consisting of 4 × 10 ⁻⁵ % biotin and 1% glycerol). The culture was incubated for 48 hours until the culture was saturated while shaking at 24 ° C./170-190 rpm. Then 100 ml of BMGY was added to the 500 ml baffled flask. The seed culture was then transferred to a baffled flask containing 100 ml of BMGY medium. The culture was incubated for 24 hours with shaking at 24 ° C / 170-190 rpm. The contents of the flask were decanted into two 50 ml Falcon ™ centrifuge tubes and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. The cell pellet was washed once with 20 ml BMGY without glycerol and then gently resuspended with 20 ml BMMY (BMGY with 1% MeOH instead of 1% glycerol). Suspended cells were transferred to a 250 ml baffled flask. The culture was incubated for 24 hours with shaking at 24 ° C./170-190 rpm. The contents of the flask were then decanted into two 50 ml Falcon ™ centrifuge tubes and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. By analyzing the culture supernatant by ELISA, the approximate antibody titer was determined prior to protein isolation (see Example 3).

培養上清中の抗体の定量は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって行った：Ｈｉｇｈｂｉｎｄｉｎｇマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、１０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、２４μｇのヤギ抗ヒトＦａｂ（Ｂｉｏｃａｒｔａ，Ｉｎｃ、カリフォルニア州サンディエゴ）でコートし、４℃で終夜インキュベートした。緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ）を加え、次に室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄後に、増加する体積量の抗体培養上清（０．４、０．８、１．５、３．２、６．２５、１２．５、２５および５０μｌ）を加え、室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。最後の洗浄後に、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを１：２０００ＰＢＳ溶液として加え、次に室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。ＴＭＢ基質キットを使用し、製造者の指示（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従って、プレートを解析した。 Quantification of antibodies in the culture supernatant was performed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): High binding microtiter plates (Costar) in 24 μg goat anti-human Fab (10 μl PBS, pH 7.4). Biocarta, Inc, San Diego, CA) and incubated overnight at 4 ° C. The buffer was removed and blocking buffer (3% BSA in PBS) was added and then incubated for 1 hour at room temperature. Blocking buffer was removed and the plate was washed 3 times with PBS. After the last wash, increasing volumes of antibody culture supernatant (0.4, 0.8, 1.5, 3.2, 6.25, 12.5, 25 and 50 μl) are added and 1 hour at room temperature Incubated. The plates were then washed with PBS + 0.05% Tween20. After the last wash, anti-human Fc-HRP was added as a 1: 2000 PBS solution and then incubated for 1 hour at room temperature. The plate was then washed 4 times with PBS-Tween20. Plates were analyzed using the TMB substrate kit according to manufacturer's instructions (Pierce Biotechnology).

ＩｇＧ１の精製
モノクローナル抗体をＳｔｒｅａｍｌｉｎｅＰｒｏｔｅｉｎＡカラムを使って培養上清から捕捉した。抗体をＴｒｉｓ−グリシン（ｐＨ３．５）に溶出させ、１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８.０）を使って中和した。さらなる精製は、疏水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使って行った。ＨＩＣカラムの具体的タイプは抗体に依存する。ＪＣ−ＩｇＧおよびＤＸ−ＩｇＧには、フェニルセファロースカラム（オクチルセファロースを使用することもできる）を、２０ｍＭＴｒｉｓ（７．０）、１Ｍ (ＮＨ₄）₂ＳＯ₄緩衝液と共に使用し、１Ｍ→０Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の直線的勾配緩衝液で溶出させた。フェニルセファロースカラムから得た抗体画分をプールし、カチオン交換（ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムによる最終精製のために、５０ｍＭＮａＯＡｃ／Ｔｒｉｓ（ｐＨ５．２）緩衝液に交換した。抗体を５０ｍＭＴｒｉｓ、１ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を用いる直線的勾配で溶出させた。 Purification of IgG1 Monoclonal antibody was captured from the culture supernatant using a Streamline Protein A column. The antibody was eluted in Tris-glycine (pH 3.5) and neutralized using 1M Tris (pH 8.0). Further purification was performed using brine interaction chromatography (HIC). The specific type of HIC column depends on the antibody. For JC-IgG and DX-IgG, a phenyl sepharose column (octyl sepharose can also be used) is used with 20 mM Tris (7.0), 1M (NH ₄ ) ₂ SO ₄ buffer, and 1M → 0M Elute with (NH ₄ ) ₂ SO ₄ linear gradient buffer. The antibody fractions obtained from the phenyl sepharose column were pooled and exchanged into 50 mM NaOAc / Tris (pH 5.2) buffer for final purification on a SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) column. The antibody was eluted with a linear gradient using 50 mM Tris, 1 M NaCl (pH 7.0).

β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼによるＹＡＳ３８５−１から得たＪＣ−ＩｇＧおよびＤＸ−ＩｇＧの処理
５ｍｇの精製ＩｇＧ（ＪＣ−ＩｇＧまたはＤＸ−ＩｇＧ）を５０ｍＭＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ５．０）に緩衝液交換した。シリコーン処理した管で、０．３Ｕの牛乳由来β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州ラホーヤ）を、５０ｍＭＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ５．０）中の精製ＩｇＧに加え、３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。これの試料を蒸発乾固し、水に再懸濁し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで解析した。次に、抗体をβ−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼから上述のフェニルセファロース精製法で精製した。 Treatment of JC-IgG and DX-IgG obtained from YAS385-1 with β-1,4 galactosyltransferase 5 mg of purified IgG (JC-IgG or DX-IgG) was buffer exchanged to 50 mM NH ₄ Ac (pH 5.0) did. In a silicone-treated tube, 0.3 U milk-derived β-1,4 galactosyltransferase (EMD Biosciences, La Jolla, Calif.) Is added to purified IgG in 50 mM NH ₄ Ac (pH 5.0) and 16-37 at 37 ° C. Incubated for 24 hours. A sample of this was evaporated to dryness, resuspended in water and analyzed by MALDI-TOF. Next, the antibody was purified from β-1,4 galactosyltransferase by the above-mentioned phenyl sepharose purification method.

精製Ｉｇの検出
精製したＪＣ−ＩｇＧまたはＤＸ−ＩｇＧを適当な体積の試料ローディング緩衝液と混合し、プレキャストゲルを使って製造者の指示（ＮｕＰＡＧＥｂｉｓ−Ｔｒｉｓ電気泳動システム；ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，カリフォルニア州カールズバッド）に従ってドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付した。ゲルタンパク質をクーマシーブリリアントブルー染料（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で染色した。図２および図３参照。 Purified Ig Detection Purified JC-IgG or DX-IgG is mixed with an appropriate volume of sample loading buffer and precast gel is used to provide manufacturer instructions (NuPAGE bis-Tris electrophoresis system; Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) ) Was subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Gel proteins were stained with Coomassie Brilliant Blue dye (Bio-Rad, Hercules, CA). See FIG. 2 and FIG.

抗体濃度
タンパク質クロマトグラフィー画分の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Bradford, M. 1976, Anal. Biochem.（1976）72, 248-254）により、標準としてアルブミンを使用して決定した（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）。 Antibody Concentration The concentration of the protein chromatography fraction was determined by the Bradford assay (Bradford, M. 1976, Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254) using albumin as a standard (Pierce, Rock, Ill.). Ford).

ＩｇＧ１糖質解析
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）．アスパラギン結合型オリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ解析：Papacら, Glycobiology 8, 445-454（1998）の変法を使ってＮ−結合型グリカンをＪＣ−ＩｇＧおよびＤＸ−ＩｇＧから放出させた。抗体の試料を還元し、カルボキシメチル化し、膜をブロックし、ウェルを水で３回洗浄した。１ｍＵのＮ−グリカナーゼ（ＥＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州ラホーヤ）を含有する３０μｌの１０ｍＭＮＨ₄ＨＣＯ₃（ｐＨ８．３）を加えることにより、ＩｇＧタンパク質を脱グリコシル化した。３７℃で１６時間後に、グリカンを含有する溶液を遠心分離によって取り出し、濃縮乾固した。各ウェルから得られる乾燥グリカンを１５μｌの水に溶解し、０．５μｌをステンレス鋼試料プレートにスポットし、０．５μｌのＳ−ＤＨＢマトリックス（１：１水／アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸中、９ｍｇ／ｍｌのジヒドロキシ安息香酸／１ｍｇ／ｍｌの５−メトキシ−サリチル酸）と混合し、乾燥させた。パルス時間４ｎｓのパルス窒素レーザー（３３７ｎｍ）を照射することによってイオンを生成させた。計器は、遅延時間１２５ｎｓおよび加速電圧２０ｋＶの遅延引き出しモードで作動させた。グリッド電圧は９３．００％、ガイドワイヤ電圧は０．１％、内圧は＜５×１０^-7ｔｏｒｒ（１ｔｏｒｒ＝１３３Ｐａ）、ローマスゲート（low mass gate）は８７５Ｄａとした。スペクトルは１００〜２００レーザーパルスの和から生成し、５００ＭＨｚディジタイザで収集した。（Ｍａｎ）₅（ＧｌｃＮＡｃ）₂オリゴ糖を外部分子量標準として使用した。全てのスペクトルを陽イオンモードの計器で生成させた。 IgG1 carbohydrate analysis Matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). MALDI-TOF MS analysis of asparagine-linked oligosaccharides: N-linked glycans were released from JC-IgG and DX-IgG using a modification of Papac et al., Glycobiology 8, 445-454 (1998). A sample of the antibody was reduced, carboxymethylated, the membrane was blocked, and the wells were washed 3 times with water. The IgG protein was deglycosylated by adding 30 μl of 10 mM NH ₄ HCO ₃ (pH 8.3) containing 1 mU N-glycanase (EMD Biosciences, La Jolla, Calif.). After 16 hours at 37 ° C., the solution containing glycans was removed by centrifugation and concentrated to dryness. The dry glycan obtained from each well is dissolved in 15 μl water, 0.5 μl is spotted onto a stainless steel sample plate, and 0.5 μl S-DHB matrix (1: 1 water / acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid is used. And 9 mg / ml dihydroxybenzoic acid / 1 mg / ml 5-methoxy-salicylic acid) and dried. Ions were generated by irradiation with a pulsed nitrogen laser (337 nm) having a pulse time of 4 ns. The instrument was operated in a delayed extraction mode with a delay time of 125 ns and an acceleration voltage of 20 kV. The grid voltage was 93.00%, the guide wire voltage was 0.1%, the internal pressure was <5 × 10 ⁻⁷ torr (1 torr = 133 Pa), and the Roman gate (low mass gate) was 875 Da. The spectrum was generated from the sum of 100-200 laser pulses and collected with a 500 MHz digitizer. (Man) ₅ (GlcNAc) ₂ oligosaccharide was used as an external molecular weight standard. All spectra were generated with positive ion mode instruments.

抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイ
Ｈｉｇｈｂｉｎｄｉｎｇマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１０μｇの抗原でコートし、４℃で終夜インキュベートした。緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ）を加え、次に室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄後に、増加する量の精製抗体を０．２ｎｇから１００ｎｇまで加え、室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。最後の洗浄後に、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを１：２０００ＰＢＳ溶液として加え、次に室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。ＴＭＢ基質キットを使用し、製造者の指示（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従って、プレートを解析した。 Antigen Binding ELISA Assay High binding microtiter plates (Costar) were coated with 10 μg of antigen in PBS (pH 7.4) and incubated at 4 ° C. overnight. The buffer was removed and blocking buffer (3% BSA in PBS) was added and then incubated for 1 hour at room temperature. Blocking buffer was removed and the plate was washed 3 times with PBS. After the last wash, increasing amounts of purified antibody were added from 0.2 ng to 100 ng and incubated at room temperature for 1 hour. The plates were then washed with PBS + 0.05% Tween20. After the last wash, anti-human Fc-HRP was added as a 1: 2000 PBS solution and then incubated for 1 hour at room temperature. The plate was then washed 4 times with PBS-Tween20. Plates were analyzed using the TMB substrate kit according to manufacturer's instructions (Pierce Biotechnology).

Ｆｃ受容体結合アッセイ
ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂに関するＦｃ受容体結合アッセイを、先に記述されたプロトコールに従って行った（Shieldsら, 2001, J.Biol. Chem, 276:6591-6604）。ＦｃγＲＩＩＩ結合：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１μｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＩｂ（図５）およびＦγＲＩＩｂ（図７）融合タンパク質、または０．８μｇ／ｍのＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ（図６）融合タンパク質を、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ、イリノイ州ネーパービル）上に、４℃で４８時間コートした。プレートを、ＰＢＳ中、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、２５℃で１時間ブロックした。ＪＣ−ＩｇＧまたはＤＸ−ＩｇＧ二量体複合体を、２：１のモル量のＪＣ−ＩｇＧまたはＤＸ−ＩｇＧとＨＲＰコンジュゲートＦ（Ａｂ'
）２抗Ｆ（Ａｂ'）２とを、２５℃で１時間混合することによって、ＰＢＳ中の１％
ＢＳＡに調製した。次に、二量体複合体を１％ＢＳＡ／ＰＢＳに１：２で連続希釈し、プレート上に２５℃で１時間コートした。使用した基質は３，３'，５，５'−テ
トラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。製造者（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の指示に従って、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。 Fc receptor binding assay Fc receptor binding assays for FcγRIIb, FcγRIIIa and FcγRIIIb were performed according to the protocol described previously (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem, 276: 6591-6604). FcγRIII binding: 1 μg / ml FcγRIIIb (FIG. 5) and FγRIIb (FIG. 7) fusion protein, or 0.8 μg / m FcγRIIIa-LF (FIG. 6) fusion protein in PBS (pH 7.4) ELISA plate ( Nalge-Nunc, Naperville, Ill.) For 48 hours at 4 ° C. Plates were blocked with 3% bovine serum albumin (BSA) in PBS for 1 hour at 25 ° C. The JC-IgG or DX-IgG dimer complex was converted to a 2: 1 molar amount of JC-IgG or DX-IgG and HRP conjugate F (Ab ′
2) 1% in PBS by mixing 2 anti-F (Ab ′) 2 at 25 ° C. for 1 hour.
Prepared in BSA. The dimer complex was then serially diluted 1: 2 in 1% BSA / PBS and coated on the plate at 25 ° C. for 1 hour. The substrate used is 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) (Vector Laboratories). Absorbance at 450 nm was read according to the manufacturer's instructions (Vector Laboratories).

Ｂ細胞における抗体フィードバックに関するＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
このアッセイは、Westmanら, 1997, Scand. J. Immunol. 46:10-15に記述されているように行われる。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を、まずＩｇＧ抗体にコンジュゲートして、ＢＳＡ−ＩｇＧ複合体を得る。ＢＳＡ特異的ＩｇＧを分泌するＢ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使って決定する。注射したマウスから脾臓を取り出し、０．５％正常マウス血清を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク）中に細胞懸濁液を調製する。１００マイクロリットルの細胞懸濁液をＢＳＡ被覆マイクロタイタープレート（上記ＥＬＩＳＡプロトコール参照）に適用し、３７℃、５％ＣＯ₂で３．５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに１／１００希釈した５０μｌのアルカリホスファターゼコンジュゲートヒツジ抗マウスＩｇＧと共に、４℃で終夜インキュベートした。スポットを、５０μｌの５ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中、室温で１時間発色させ、実体顕微鏡下で計数した。 ELISPOT assay for antibody feedback in B cells This assay is performed as described in Westman et al., 1997, Scand. J. Immunol. 46: 10-15. BSA (bovine serum albumin) is first conjugated to an IgG antibody to obtain a BSA-IgG complex. The number of B cells secreting BSA specific IgG is determined using an ELISPOT assay. Spleens are removed from the injected mice and cell suspensions are prepared in DMEM (Gibco, New York) containing 0.5% normal mouse serum. 100 microliters of cell suspension was applied to a BSA coated microtiter plate (see ELISA protocol above) and incubated for 3.5 hours at 37 ° C., 5% CO ₂ . Plates were washed and incubated overnight at 4 ° C. with 50 μl alkaline phosphatase conjugated sheep anti-mouse IgG diluted 1/100 in PBS-Tween. Spots were developed in 50 μl of 5 bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (Sigma-Aldrich) for 1 hour at room temperature and counted under a stereomicroscope.

VugmeysterおよびHowell, 2004, Int. Immunopharm. 4:1117-1124に記載の血液マトリックス研究（例えばＢ細胞枯渇）を使ってアッセイされるＡＤＣＣについて．血漿および赤血球（ＲＢＣ）を枯渇させた全血を染色緩衝液（１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ））に復元して、染色緩衝液中の白血球懸濁液を得る。つまり、全血試料を１０００ｇで５分間遠心し、上清（血漿）を捨て、ペレットをアンモニウムクロライド溶解（ＡＣＬ）試薬で処理し、洗浄し、等量の染色緩衝液に再懸濁する。Ｂ細胞枯渇アッセイについて：１００μｇ／ｍｌの抗体溶液または染色緩衝液１０μｌを９０μｌのＳＢマトリックスに加え、３７℃で１時間インキュベートする。試料を直ちに、抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ４５−ＰＥで、２５℃で３０分間、染色する。次に、試料を１％ホルムアルデヒドで固定し、試料を三重に試験する。Ｂ細胞枯渇の定量をフローサイトメトリーによって得る。Ｂ細胞枯渇のフローサイトメトリーアッセイ：自動ＦＡＣＳＬｏａｄｅｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔＳｏｆｔｗａｒｅを装備したＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）計器を使用して、全ての試料を収集および解析した。サイトメーターのＱＣおよび設定には、計器の機能および検出器の直線性を確認するために、ＣａｌｉＢｒｉｔｅビーズおよびＳｐｈｅｒｏＴｅｃｈｒａｉｎｂｏｗビーズの試験を含める。計器の設定を確認するためにアイソタイプ対照および補正対照を各アッセイと共に試験する。全リンパ球に対するＢ細胞のパーセントを以下のゲーティング戦略で得る。リンパ球集団を前方散乱／側方散乱散布図上でマークして領域１（Ｒ１）を定義する。Ｒ１内のイベントを使って、蛍光強度ドットプロットをＣＤ１９およびＣＤ４５マーカーについて表示する。蛍光標識アイソタイプ対照を使って、ＣＤ１９およびＣＤ４５陽性に関する各カットオフ点を決定する。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔを使って、ＣＤ１９陽性、ＣＤ４５陽性表現型を持つＲ１領域内の細胞の割合として、％Ｂを決定する。各処置群について三重の試料を試験する。式：平均［１００＊（１−対照抗体で処理した％Ｂ）／平均［ＳＢで処理した％Ｂ］）を使って、Ｂ細胞枯渇パーセントを計算する。蛍光色素放出ＡＤＣＣアッセイ：ＰＢＭＣ単離：ヘパリン処理したｖａｃｕｔａｉｎｅｒ管（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＶａｃｕｔａｉｎｅｒＳｙｓｔｅｍｓ、米国ニュージャージー州ラザフォード）に、健常個体または献血者（１０〜２０）から末梢静脈血を収集する。２匹のマウスに移植するには約５ｍｌの血液が必要である。ＯｐｔｉＰｒｅｐを使用し、製造者の指示に従って、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を遠心分離によって分離する。ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）からなる完全培養培地（ＣＭ）に２０％ウシ胎仔血清を添加したもので、ＰＢＭＣを１回洗浄し、１×１０⁶/ｍｌＣＭの濃度で再懸濁し、単球枯渇のために２５０ｍｌ培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ(商標)、米国ニュージャージー州）に移す。３７℃および５％ＣＯ₂で１時間インキュベートした後、非付着細胞を回収し、培養培地で１回洗浄し、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を２．５×１０⁷／ｍｌＣＭの濃度に調節する。蛍光色素放出ＡＤＣＣ．ＡＤＣＣアッセイの背後にある前提は、ＣＤ２０またはＣＤ４０抗原提示標的細胞（それぞれＲａｊｉ細胞株またはＢＣＬ１−３Ｂ３細胞）への抗体結合が、エフェクター細胞上のＦｃγ受容体への標的細胞結合を刺激するということである。これは、結果として、ＣＤ２０またはＣＤ４０抗原を提示する標的細胞の溶解を促進し、定量することができる内部蛍光色素を放出させる。標的細胞の⁵¹Ｃｒ標識に代えてアラマーブルー蛍光を使用する。５０μｌのＣＤ２０提示Ｒａｊｉ細胞懸濁液（１×１０⁴細胞）を、９６ウェル組織培養プレート中で、５０μｌ量の抗ＤＸ−ＩｇＧまたは抗ＪＣ−ＩｇＧｍＡｂ（さまざまな濃度）および５０μｌ量の上述のように単離されたＰＢＭＣエフェクター細胞（エフェクター対標的細胞比は１００：１、５０：１、２５：１および１２．５：１にすることができる）と混合し、３７℃および５％ＣＯ２で、４時間インキュベートすることにより、ＲａｊｉまたはＢＣＬ１−３Ｂ３細胞の溶解を助長する。５０μｌのアラマーブルーを加え、インキュベーションをさらに５時間続けることにより、色素を取り込ませて、その蛍光状態へと代謝させる。プレートを振とう機上で室温まで冷却し、蛍光計を使って、励起波長５３０ｎｍおよび放射波長５９０ｎｍで、蛍光を読み取る。相対蛍光単位（ＲＦＵ）をｍＡｂ濃度に対してプロットし、対照抗体−例えばＲｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）−を使った標準曲線から、試料濃度を計算する。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを用いるインビボＡＤＣＣ（Niwaら, 2004, Cancer Research, 64:2127-2133）。インビボＡＤＣＣ活性は、ヘテロ接合（ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ／ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶ）遺伝子型およびホモ接合（ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶ／ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶおよびＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ／ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ）遺伝子型を含む健常ドナーから得られるヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を移植したマウスモデルを使ってアッセイすることができる。このモデル系を用いて、ある主要Ｎ−グリカンを有するＩｇを、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）または他の対照抗体との比較で、強化されたＡＤＣＣ活性についてアッセイする。このインビボＡＤＣＣアッセイの詳細かつ十分なプロトコールは、Niwaら, 2004（前出）に見出される。 For ADCC assayed using blood matrix studies (eg B cell depletion) as described in Vugmeyster and Howell, 2004, Int. Immunopharm. 4: 1117-1124. Whole blood depleted of plasma and red blood cells (RBC) is reconstituted in staining buffer (Hanks balanced salt solution (HBSS) containing 1% BSA and 0.1% sodium azide) and leukocyte suspension in staining buffer is recovered. A turbid liquid is obtained. That is, the whole blood sample is centrifuged at 1000 g for 5 minutes, the supernatant (plasma) is discarded, the pellet is treated with ammonium chloride lysis (ACL) reagent, washed and resuspended in an equal volume of staining buffer. For B cell depletion assay: Add 10 μl of 100 μg / ml antibody solution or staining buffer to 90 μl SB matrix and incubate at 37 ° C. for 1 hour. Samples are stained immediately with anti-CD19-FITC and anti-CD45-PE for 30 minutes at 25 ° C. The sample is then fixed with 1% formaldehyde and the sample is tested in triplicate. Quantification of B cell depletion is obtained by flow cytometry. Flow cytometry assay for B cell depletion: All samples were collected and analyzed using an FACS Calibur (BD Biosciences) instrument equipped with an automated FACS Loader and Cell Quest Software. Cytometer QC and settings include testing of CaliBrite and SpheroTech rainbow beads to verify instrument function and detector linearity. Isotype controls and correction controls are tested with each assay to verify instrument settings. The percentage of B cells to total lymphocytes is obtained with the following gating strategy. The lymphocyte population is marked on the forward scatter / side scatter scatter plot to define region 1 (R1). Using events in R1, fluorescence intensity dot plots are displayed for CD19 and CD45 markers. A fluorescence labeled isotype control is used to determine each cutoff point for CD19 and CD45 positivity. Using CellQuest,% B is determined as the percentage of cells in the R1 region with CD19 positive and CD45 positive phenotypes. Triplicate samples are tested for each treatment group. The percent B cell depletion is calculated using the formula: mean [100 * (1−% B treated with control antibody) / mean [% B treated with SB]). Fluorescent dye release ADCC assay: PBMC isolation: Peripheral venous blood is collected from healthy individuals or blood donors (10-20) in heparinized vacutainer tubes (Becton Dickinson Vacutainer Systems, Rutherford, NJ). Approximately 5 ml of blood is required for transplantation into two mice. Using OptiPrep, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are separated by centrifugation according to the manufacturer's instructions. RPMI1640, 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml penicillin, 100 g / ml Streptomycin (Gibco / BRL), complete culture medium (CM) with 20% fetal calf serum, washed once with PBMC Resuspend at a concentration of 10 ⁶ / ml CM and transfer to a 250 ml culture flask (Falcon ™, NJ) for monocyte depletion. After 1 hour incubation at 37 ° C. and 5% CO ₂ , non-adherent cells were collected and washed once with culture medium to adjust peripheral blood lymphocytes (PBL) to a concentration of 2.5 × 10 ⁷ / ml CM To do. Fluorescent dye release ADCC. The premise behind the ADCC assay is that antibody binding to CD20 or CD40 antigen presenting target cells (Raji cell line or BCL1-3B3 cells, respectively) stimulates target cell binding to Fcγ receptors on effector cells. It is. This results in the lysis of target cells presenting the CD20 or CD40 antigen and releasing an internal fluorescent dye that can be quantified. Alamar blue fluorescence is used instead of ⁵¹ Cr labeling of target cells. 50 μl of CD20-presenting Raji cell suspension (1 × 10 ⁴ cells) in a 96-well tissue culture plate with 50 μl volume of anti-DX-IgG or anti-JC-IgG mAb (various concentrations) and 50 μl volume of the above-mentioned Mixed with PBMC effector cells (effector to target cell ratio can be 100: 1, 50: 1, 25: 1 and 12.5: 1) at 37 ° C. and 5% CO 2 Incubating for 4 hours promotes lysis of Raji or BCL1-3B3 cells. The dye is incorporated and metabolized to its fluorescent state by adding 50 μl of alamar blue and continuing the incubation for an additional 5 hours. The plate is cooled to room temperature on a shaker and the fluorescence is read using a fluorometer at an excitation wavelength of 530 nm and an emission wavelength of 590 nm. Relative fluorescence units (RFU) are plotted against mAb concentration, and the sample concentration is calculated from a standard curve using a control antibody—eg, Rituximab®. In vivo ADCC using severe combined immunodeficiency (SCID) mice (Niwa et al., 2004, Cancer Research, 64: 2127-2133). In vivo ADCC activity is expressed in human peripheral blood from healthy donors including heterozygous (FcγRIIIa-LF / FcγRIIIa-LV) and homozygous (FcγRIIIa-LV / FcγRIIIa-LV and FcγRIIIa-LF / FcγRIIIa-LF) genotypes. It can be assayed using a mouse model transplanted with mononuclear cells (PMBC). Using this model system, Ig with certain major N-glycans is assayed for enhanced ADCC activity compared to Rituximab® or other control antibodies. A detailed and sufficient protocol for this in vivo ADCC assay is found in Niwa et al., 2004 (supra).

ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有するＩｇＧの概略図。Schematic of IgG with GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ glycan structure. ＹＡＳ３８５−１で発現させ（実施例２に記載のとおり）、プロテインＡカラム（レーン１）およびフェニルセファロースカラム（レーン２）で培養培地から精製した（実施例３に記載のとおり）ＪＣ−ＩｇＧのクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（２．５μｇタンパク質／レーン）。Expressed with YAS385-1 (as described in Example 2) and purified from culture medium with protein A column (lane 1) and phenyl sepharose column (lane 2) (as described in example 3) Coomassie blue stained SDS-PAGE gel (2.5 μg protein / lane). ＹＡＳ３８５−１で発現させ（実施例２に記載のとおり）、プロテインＡカラム（レーン１）およびフェニルセファロースカラム（レーン２）で培養培地から精製した（実施例３に記載のとおり）ＤＸ−ＩｇＧのクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（２．５μｇタンパク質／レーン）。Expressed in YAS385-1 (as described in Example 2) and purified from the culture medium with a protein A column (lane 1) and a phenyl sepharose column (lane 2) (as described in example 3) Coomassie blue stained SDS-PAGE gel (2.5 μg protein / lane). Ａ：主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂Ｎ−グリカンを有する、ガラクトシルトランスフェラーゼで処理した、ＹＡＳ３８５−１で発現させたＪＣ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル。Ｂ：主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有する、ガラクトシルトランスフェラーゼで処理した、ＹＡＳ３８５−１で発現させたＤＸ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル。A: MALDI-TOF spectrum of JC-IgG expressed in YAS385-1 treated with galactosyltransferase, primarily with GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycans. B: MALDI-TOF spectrum of DX-IgG expressed in YAS385-1 treated with galactosyltransferase, with predominantly GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycans. Ａ：ＪＣ−ＩｇＧおよびＲｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）によるＦｃγＲＩＩＩｂのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。Ｂ：ＤＸ−ＩｇＧおよびＲｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）によるＦｃγＲＩＩＩＢのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。（ＧＧＭ５＝ＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン）。A: ELISA binding assay of FcγRIIIb with JC-IgG and Ruximab®. B: ELISA binding assay of FcγRIIIB with DX-IgG and Rituximab®. (GGM5 = GlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycan). ＪＣ−ＩｇＧおよびＲｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）によるＦｃγＲＩＩＩａ−１５８ＦのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。（ＧＭ５＝ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン）。ELISA binding assay of FcγRIIIa-158F with JC-IgG and Rituximab®. (GM5 = GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycan). Ａ：ＪＣ−ＩｇＧおよびＲｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）によるＦｃγＲＩＩｂのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。Ｂ：ＤＸ−ＩｇＧおよびＲｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）によるＦｃｇＲＩＩｂのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。（ＧＧＭ５＝ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン）。A: ELISA binding assay of FcγRIIb with JC-IgG and Rituximab®. B: FcgRIIb ELISA binding assay with DX-IgG and Rituximab®. (GGM5 = GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycan).

配列番号１は、ＤＸ−ＩｇＧ１軽鎖のマウス可変領域およびヒト定常領域のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号２は、ＤＸ−ＩｇＧ１重鎖のマウス可変領域およびヒト定常領域のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号３は、ＩｇＧ１軽鎖のヒト定常領域のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号４は、ＩｇＧ１重鎖のヒト定常領域のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号５〜１９は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＤＸ−ＩｇＧ１のマウス軽鎖可変領域を合成するために使用した、１５個のオーバーラップオリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号２０〜２３は、ＤＸ−ＩｇＧ１マウス軽鎖可変領域をヒト軽鎖定常領域にライゲートするために使用した４つのオリゴヌクレオチドプライマーをコードする。
配列番号２４〜４０は、ＰＣＲによってＤＸ−ＩｇＧ１のマウス重鎖可変領域を合成するために使用した、１７個のオーバーラップオリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号４１〜４４は、ＤＸ−ＩｇＧ１マウス重鎖可変領域をヒト重鎖定常領域にライゲートするために使用した、４つのオリゴヌクレオチドプライマーをコードする。
配列番号４５は、Ｎ末端ＥｃｏＲＩ部位を持つＫａｒ２（Ｂｉｐ）シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をコードする。
配列番号４６〜４９は、Ｋａｒ２シグナル配列をＤＸ−ＩｇＧ１の軽鎖および重鎖にライゲートするために使用した、４つのオリゴヌクレオチドプライマーをコードする。
配列番号５０は、ＪＣ−ＩｇＧ１軽鎖のマウスＩｇＧ１可変領域に相当するヌクレオチド配列をコードする（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＦ０１３５７６）。
配列番号５１は、ＪＣ−ＩｇＧ１重鎖のマウスＩｇＧ１可変領域に相当するヌクレオチド配列をコードする（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＦ０１３５７７）。
配列番号５２〜６３は、ＪＣ−ＩｇＧ１のマウス軽鎖可変領域をＰＣＲ合成するために使用した、１２個のオーバーラップオリゴヌクレオチド配列をコードする。
配列番号６４〜７５は、ＪＣ−ＩｇＧ１のマウス重鎖Ｆａｂ断片をＰＣＲ合成するために使用した、１２個のオーバーラップオリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号７６〜８７は、ＰＣＲによってＪＣ−ＩｇＧ１のマウス重鎖Ｆｃ断片を合成するために使用した、１２個のオーバーラップオリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号８８は、Ｆｃ断片の３'末端に相当する３'Ｋｐｎ１プライマーをコード
する。
配列番号８９は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号９０は、本発明で使用したトロンビン切断用のヌクレオチド配列をコードする。 SEQ ID NO: 1 encodes the nucleotide sequence of the mouse variable region and human constant region of the DX-IgG1 light chain.
SEQ ID NO: 2 encodes the nucleotide sequence of the mouse variable region and human constant region of the DX-IgG1 heavy chain.
SEQ ID NO: 3 encodes the nucleotide sequence of the human constant region of the IgG1 light chain.
SEQ ID NO: 4 encodes the nucleotide sequence of the human constant region of the IgG1 heavy chain.
SEQ ID NOs: 5-19 encode 15 overlapping oligonucleotides used to synthesize the mouse light chain variable region of DX-IgG1 by polymerase chain reaction (PCR).
SEQ ID NOs: 20-23 encode the four oligonucleotide primers used to ligate the DX-IgG1 mouse light chain variable region to the human light chain constant region.
SEQ ID NOs: 24-40 encode 17 overlapping oligonucleotides used to synthesize the mouse heavy chain variable region of DX-IgG1 by PCR.
SEQ ID NOs: 41-44 encode the four oligonucleotide primers used to ligate the DX-IgG1 mouse heavy chain variable region to the human heavy chain constant region.
SEQ ID NO: 45 encodes a nucleotide sequence that encodes a Kar2 (Bip) signal sequence with an N-terminal EcoRI site.
SEQ ID NOs: 46-49 encode the four oligonucleotide primers used to ligate the Kar2 signal sequence to the light and heavy chains of DX-IgG1.
SEQ ID NO: 50 encodes the nucleotide sequence corresponding to the mouse IgG1 variable region of the JC-IgG1 light chain (GenBank # AF013576).
SEQ ID NO: 51 encodes the nucleotide sequence corresponding to the mouse IgG1 variable region of the JC-IgG1 heavy chain (GenBank # AF013577).
SEQ ID NOs: 52-63 encode the 12 overlapping oligonucleotide sequences used to PCR synthesize the mouse light chain variable region of JC-IgG1.
SEQ ID NOs: 64-75 encode the 12 overlapping oligonucleotides used to PCR synthesize the mouse heavy chain Fab fragment of JC-IgG1.
SEQ ID NOs: 76-87 encode the 12 overlapping oligonucleotides used to synthesize the mouse heavy chain Fc fragment of JC-IgG1 by PCR.
SEQ ID NO: 88 encodes a 3 ′ Kpn1 primer corresponding to the 3 ′ end of the Fc fragment.
SEQ ID NO: 89 encodes the nucleotide sequence of human serum albumin (HSA).
SEQ ID NO: 90 encodes the nucleotide sequence for cleavage of thrombin used in the present invention.

Claims

複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各免疫グロブリンがそこに結合された少なくとも一つのＮ−グリカンを含むことにより、主要Ｎ−グリカンが本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなっている複数のＮ−グリカンを含む組成物。 A composition comprising a plurality of immunoglobulins, wherein each immunoglobulin comprises at least one N-glycan bound thereto, whereby a plurality of primary N-glycans consisting essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ A composition comprising N-glycan.

前記複数のＮ−グリカンの５０モルパーセントを越える量が本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなる、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the amount of said plurality of N-glycans in excess of 50 mole percent consists essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ .

前記複数のＮ−グリカンの７５モルパーセントを越える量が本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなる、請求項１に記載の組成物。 The amount exceeding 75 mole percent of the plurality of N- glycans consists essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc _2, The composition of claim 1.

前記複数のＮ−グリカンの９０モルパーセントを越える量が本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなる、請求項１に記載の組成物。 The amount exceeding 90 mole percent of the plurality of N- glycans consists essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc _2, The composition of claim 1.

前記ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンが、前記複数のＮ−グリカンの、その次に最も主要なＮ−グリカン構造よりも、約５モルパーセント〜約５０モルパーセント多いレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。 The GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ N-glycan is present at a level of about 5 mole percent to about 50 mole percent greater than the next most dominant N-glycan structure of the plurality of N-glycans. The composition as described.

前記免疫グロブリンがＦｃγＲＩＩｂ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す、請求項１に記載の組成物。 2. The composition of claim 1, wherein the immunoglobulin exhibits reduced binding affinity for the FcγRIIb receptor.

前記免疫グロブリンがＦｃγＲＩＩＩ受容体に対して増加した結合アフィニティを示す、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the immunoglobulin exhibits increased binding affinity for the FcγRIII receptor.

前記ＦｃγＲＩＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＩａ受容体である、請求項７に記載の組成物。 8. The composition of claim 7, wherein the FcγRIII receptor is an FcγRIIIa receptor.

前記ＦｃγＲＩＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＩｂ受容体である、請求項７に記載の組成物。 8. The composition of claim 7, wherein the FcγRIII receptor is an FcγRIIIb receptor.

前記免疫グロブリンが増加した抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す、請求項１に記載の組成物。 2. The composition of claim 1, wherein the immunoglobulin exhibits increased antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity.

前記免疫グロブリンが本質的にフコースを含まない、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the immunoglobulin is essentially free of fucose.

前記免疫グロブリンがフコースを欠く、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the immunoglobulin lacks fucose.

前記免疫グロブリンが、成長因子類、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、白血球抗原、ＣＤ２０、ＣＤ３３、サイトカイン類、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βからなる群より選択される抗原に結合する、請求項１に記載の組成物。 The said immunoglobulin binds to an antigen selected from the group consisting of growth factors, FGFR, EGFR, VEGF, leukocyte antigen, CD20, CD33, cytokines, TNF-α and TNF-β. Composition.

前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４領域からなる群より選択されるＦｃ領域を含む、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the immunoglobulin comprises an Fc region selected from the group consisting of IgGl, IgG2, IgG3 and IgG4 regions.

請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物と医薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising the composition according to any one of claims 1 to 14 and a pharmaceutically acceptable carrier.

前記免疫グロブリンが本質的にフコースを含まない、請求項１５に記載の医薬組成物。 16. A pharmaceutical composition according to claim 15, wherein the immunoglobulin is essentially free of fucose.

前記免疫グロブリンがフコースを欠く、請求項１５に記載の医薬組成物。 16. The pharmaceutical composition according to claim 15, wherein the immunoglobulin lacks fucose.

前記免疫グロブリンが、成長因子類、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、白血球抗原、ＣＤ２０、ＣＤ３３、サイトカイン類、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βからなる群より選択される抗原に結合する抗体を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。 16. The immunoglobulin comprises an antibody that binds to an antigen selected from the group consisting of growth factors, FGFR, EGFR, VEGF, leukocyte antigen, CD20, CD33, cytokines, TNF-α and TNF-β. A pharmaceutical composition according to 1.

前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４領域からなる群より選択されるＦｃ領域を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。 16. The pharmaceutical composition of claim 15, wherein the immunoglobulin comprises an Fc region selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 regions.

請求項１に記載の組成物を含むキット。 A kit comprising the composition of claim 1.

免疫グロブリンまたはその断片をコードする外因性遺伝子を含む真核宿主細胞であって、前記真核宿主細胞は前記免疫グロブリンまたはその断片を発現するように操作または選択され、その結果、、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各免疫グロブリンがそこに結合された少なくとも一つのＮ−グリカンを含むことにより、主要Ｎ−グリカンが本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなっている複数のＮ−グリカンを含む組成物を産生する真核宿主細胞。 A eukaryotic host cell comprising an exogenous gene encoding an immunoglobulin or fragment thereof, wherein the eukaryotic host cell is engineered or selected to express the immunoglobulin or fragment thereof, resulting in a plurality of immune cells A composition comprising a globulin, wherein each immunoglobulin comprises at least one N-glycan bound thereto, whereby a plurality of N-glycans wherein the major N-glycan consists essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ A eukaryotic host cell producing a composition comprising:

下等真核宿主細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。 The host cell according to claim 21, which is a lower eukaryotic host cell.

複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各免疫グロブリンがそこに結合された少なくとも一つのＮ−グリカンを含むことにより、その組成物は複数のＮ−グリカンを含み、前記複数のＮ−グリカン内の主要Ｎ−グリカンが本質的にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂からなる組成物を、真核宿主内で生産する方法。 A composition comprising a plurality of immunoglobulins, each composition comprising at least one N-glycan bound thereto, wherein the composition comprises a plurality of N-glycans, said plurality of N-glycans A method for producing a composition in a eukaryotic host, wherein the major N-glycan in the core consists essentially of GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ .

宿主細胞が下等真核宿主細胞である、請求項２３に記載の方法。 24. The method of claim 23, wherein the host cell is a lower eukaryotic host cell.