JP2008525050A - ゼブラフィッシュのヘテロ三量体Gタンパク質γ2サブユニット(GNG2) - Google Patents
ゼブラフィッシュのヘテロ三量体Gタンパク質γ2サブユニット(GNG2) Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008525050A JP2008525050A JP2007549595A JP2007549595A JP2008525050A JP 2008525050 A JP2008525050 A JP 2008525050A JP 2007549595 A JP2007549595 A JP 2007549595A JP 2007549595 A JP2007549595 A JP 2007549595A JP 2008525050 A JP2008525050 A JP 2008525050A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gng2
- seq
- angiogenesis
- vegf
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
- C12N2310/3233—Morpholino-type ring
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
Abstract
Description
本出願は、2004年12月29日提出の米国暫定出願第60/640,802号、および2005年12月28日提出の米国非暫定出願(番号未指定)の利益を請求するものであり、これらの各々の開示は完全に引用によって本明細書に組み入れられている。
本明細書における開示の部分は、国立保健研究所補助金番号GM58191によって一部支援されてきた。米国政府は本出願において一定の権利を有するであろう。
本発明は、抗新脈管形成(anti−angiogenesisおよびプロ新脈管形成(pro−angiogenesis)に関連する治療のための薬物標的としての、いかなる種に由来してもよいヒト、マウス、ゼブラフィッシュおよび他の脊椎動物を含む、脊椎動物のヘテロ三量体Gタンパク質γ2サブユニット(GNG2)に関する。
する組織および器官の観察を容易にする。ゼブラフィッシュの脈管系は、特に、良く記述されており、ゼブラフィッシュからヒトまで高度に保存されていることが分っている(非特許文献5;非特許文献6)。さらにまた、ゼブラフィッシュの胚は有意な血液供給なしに数日間生存することができるので、血管欠損のある胚の研究を容易にする。腫瘍の新脈管形成およびこのプロセスに非常に類似する新脈管形成性発芽(angiogenic sprouting)によるゼブラフィッシュ胚形態における体節間の血管は、哺乳動物における血管成長のために必要であることが示された同じタンパク質を要求するようである。例えば、抗新脈管形成化合物PTK787/ZK222584、血管内皮成長因子(VEGF)受容体のチロシンキナーゼの阻害剤は、ゼブラフィッシュ血管の形成に影響を与えることが分っている(非特許文献7)。ゼブラフィッシュにおける血管を可視化する現在の方法は、血管内皮細胞マーカーの全載(whole mount)インサイチューハイブリダイゼーション(非特許文献8;非特許文献9)、血管における内因性アルカリホスファターゼ活性の検出および循環する心臓血管系の微細血管造影法を含む。後者の技術は、生存するゼブラフィッシュ幼生の循環中への蛍光ビーズの注入(非特許文献10)を伴い、そして完全な循環系における血管の可視化のために有用である。VEGF受容体を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤の適用によってブロックされる体節間血管の形成は、血管系中で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックフィッシュにおいて容易に可視化できることが見出された。ヘテロ三量体Gタンパク質は、真核細胞における受容体シグナル伝達(signaling)のために要求される膜会合タンパク質である。適当なリガンドの結合に応じて、受容体はαサブユニットにおいて結合GDPのGTPへの交換を刺激して、βおよびγサブユニットからαサブユニットの解離をもたらす。GTP結合αサブユニットは、下流のエフェクターの活性を直接調節することが示されている(非特許文献11;非特許文献12;非特許文献13)。Gilmanは、GTP結合αサブユニットからの解離後、βγサブユニットはインビボで緊密に会合された複合体として存在することを例証した。この複合体は、アデニリルシクラーゼ・サブタイプIIおよびIV、ホスホリパーゼA2、ホスホリパーゼCサブタイプβ1,2,3および種々のK+およびCa2+イオンチャンネルを含む、下流のエフェクターの特定のサブセットの活性を調節することが見出された(非特許文献14;非特許文献15;非特許文献16)。かくして、Gタンパク質αおよびβγサブユニットは、これらのエフェクターの機能を調節する二又状シグナルを生じる。さらに、βγサブユニットは受容体に直接結合でき(非特許文献17)、そして膜に対してβ−アドレナリン作動性(β−ARK)キナーゼを直接相互作用させ、そして回復させることによってアゴニスト依存性リン酸化および脱感作を増進することができる(非特許文献18;非特許文献19)。かくして、βγサブユニットはエフェクター調節と受容体認識の両方のために重要である。
γサブユニットの異なるcDNAが単離された、例えば、ウシ網膜からのγ1サブユニット(非特許文献23)、ウシの脳からのγ2、γ3およびγ7サブユニット(非特許文献24;非特許文献25;非特許文献26;非特許文献27)、およびウシおよびラット肝臓からのγ5サブユニット(非特許文献28)。また、推定されるγ4サブユニットの存在は、マウス腎臓および網膜からPCRフラグメントの単離により報告された(非特許文献26)。さらに、RobishawおよびKunschは、ヒトのγ2、γ3、γ4、γ5、γ7、γ10およびγ11サブユニットのクローニングおよび特性決定を報告した(特許文献2)。
アミノ酸配列を含む。ある実施態様では、GNG2ポリペプチドは配列番号:2のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、GNG2ポリペプチドは配列番号:4のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、GNG2ポリペプチドは配列番号:5のアミノ酸配列を含む。
いて、あるいは治療のすべての組み合わせ療法の効力を増進するであろう量において、GNG2の発現を抑制するポリヌクレオチド、改変ポリヌクレオチドを単独で、または細胞または組織中にポリヌクレオチドの有効な送達を可能にする担体と組み合わせて投与することによって、新脈管形成依存性腫瘍を有する患者を処置することを包含する。ポリヌクレオチドまたは改変ポリヌクレオチドは、GNG2をコードしている核酸に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、モルホリノ(morpholino)オリゴヌクレオチドまたはリボザイムであってもよい。また本発明は、GNG2と他のαまたはβサブユニット、上流の受容体または下流のエフェクターとの相互作用を抑制する細胞透過性ペプチドにより患者を処置する方法を提供する。本発明の方法は、VEGF活性の細胞透過性ペプチド抑制をさらに含んでもよい。
成化合物である。そのような化合物は当該技術分野において既知の化合物であってもよく、または本明細書に記述されるスクリーニング方法を用いて同定されてもよい。そのような化合物は、例えば、GNG2の発現、GNG2の翻訳後の修飾(例えば、プレニル化に影響)を抑制しても、GNG2のアロステリックコンホメーションを変えても、そして/またはβγ二量体の相互作用に影響を与えてもよい。
図1は、ゼブラフィッシュGNG2(配列番号:1)のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸配列(配列番号:2)の整列を示す。
5);AAF04571(GNG12)(配列番号:26);AAM12587(GNG5)(配列番号:27);AAF04568(GNG5L)(配列番号:28);AAM12591(GNG10)(配列番号:29);AAM12594(GNG13)(配列番号:30)である。
れるスプライス結合モルホリノ。(B)cDNAおよびゲノムPCR産物に対してモルホリノ注入された胚における潜在性スプライス転写物を比較して、野生型(WT)およびgng2−MO(100μM)モルホリノ注入された胚における尾芽期のgng2転写物のRT−PCR。
βγ dimer signaling.Elsevier,USA.Handbook of Cell Signaling,v.2.pp623−629)(参照、図4および5)。これらのサブクラスは、アミノ酸相同性のみならず、機能的類似性にもまた基づいている。かくして、サブクラス内で、メンバーは、類似する翻訳後修飾およびGタンパク質のβおよびαサブユニットと相互作用する類似能力を表す。例えば、γ2サブユニットはゲラニルゲラニル基によって修飾され、β2サブユニットと相互作用し、そしてα0サブユニットと、少なくともある程度まで相互作用すると考えられる。
Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York,1989;Kaufman et al.,Eds.,Handbook of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine,CRC Press,Boca Raton,1995;McPherson,Ed.,Directed Mutagenesis:A Pratical Approach,IRL Press,Oxford,1991を含む。当業者には既知であるゼブラフィッシュを用いる研究のための一般原理およびプロトコルを記述している標準業績は、限定されるものではないが、The Zebrafish Book:A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish(Danio Rerio),Westerfield,M.,4th ed.,Univ.of Oregon Press,Eugene,2000を含む。
A.脊椎動物GNG2
本発明は、ゼブラフィッシュGNG2をコードしているポリヌクレオチドを提供し、そしてまた、本発明の方法における使用のための他の脊椎動物由来のGNG2をコードしているポリヌクレオチドを提供する。本明細書で使用されるように、「ポリヌクレオチド」は、核酸分子を指し、そしてゲノムDNA、cDNA、RNA、mRNA、混合ポリマー、組み換え核酸、それらのフラグメントおよび変異体などを含む。本発明において有用なポリヌクレオチドのフラグメントは、参照ポリヌクレオチドの少なくとも10、好ましくは少なくとも12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、75または100個の連続するヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドはセンスおよびアンチセンス鎖を含む。本発明のポリヌクレオチドは、自然に存在するか、または自然には存在しないポリヌクレオチドであってもよい。本明細書で使用されるように、「合成されたポリヌクレオチド」は、酵素的方法とは別に、純粋に化学的方法によって作成されたポリヌクレオチドを指す。したがって、「完全に」合成されたDNA配列は、完全に化学的手段によって作成され、そして「部分的に」合成されたDNAは、選られるDNAの一部分のみが化学的手段によって作成されたDNAを包含する。本発明のポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、化学的に改変されてもよく、そして当業者には容易に評価できるように、非天然または誘導ヌクレオチド塩基であってもよい。そのような改変は、例えば、標識、メチル化、類似体による1個以上のヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間の改変、例えば非荷電の結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど)、荷電結合(例えば、ホスホロチオエート(phosphorothioate)、ホスホロジチオエートなど)、ペンデント部分(pendent moiety)(例えば、ポリペプチドなど)、インターカレーター(intercalator)(例えば、アクリジン、プソラレン(psoralen)など)、キレーター、アルキレーター、および改変結合(例えば、α−アノマー核酸など)を含む。また、水素結合および他の化学的相互作用を介して指定された配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子が含まれる。そのような分子は当該技術分野において既知であり、そして例えば、ペプチド結合が分子の骨格におけるホスフェート結合を置換している分子を含む。
って導入することができ、そして得られる突然変異体が活性を保持する変異体を同定するために生物学的活性についてスクリーニングすることができる。突然変異に続いて、コードされているタンパク質が、当該技術分野において既知のいずれかの組み換え技術によって発現されてもよく、そしてタンパク質の活性が決定できる。
本発明のその他の態様は、ゼブラフィッシュGNG2ポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、類似体もしくは同族体をコードしている核酸を含有する、ベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で使用されるように、用語「ベクター」は、それが結合されたその他の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの1つのタイプは「プラスミド」であり、これは付加されるDNAセグメントが結合できる環状二本鎖DNAループを指す。ベクターのその他のタイプは、ウイルスベクターであり、この場合、付加されるDNAセグメントはウイルスゲノム中に結合できる。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的に複製することができる(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが操作可能に結合された遺伝子の発現を指導することができる。そのようなベクターは、ここでは「発現ベクター」として言及される。一般に、組み換えDNA技術における有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態で存在する。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターのもっとも普通に使用される形態物であるので、交換可能に使用することができる。しかしながら、本発明は、発現ベクターのそのような他の形態物、例えばウイルスベクター(例えば、複製能欠陥レトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含むことが意図され、これらは等価の機能を果たす。
の他の戦略は、各アミノ酸のための個々のコドンがE.コリにおいて優先的に利用されるものであるように、発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を変えることである(Wada et al.,(1992)Nucleic acids Res.20:2111−2118)。本発明の核酸配列のそのような変更は、標準DNA合成技術によって実施することができる。
and Baltimore(1983)Cell 33:741−748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えば、神経フィラメントプロモーター;Byme and Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473−5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund et al.,(1985)Science 230:912−916)および乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿プロモーター;米国特許第4,873,316号および欧州特許出願公開第264,166号)を含む。また、発生上調節されるプロモーターは、例えば、マウスhoxプロモーター(Kessel and Gruss(1990)Science 249:374−379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman(1989)Gene Dev.3:537−546)を包含する。適当なベクターおよびプロモーターの選択は当業者のレベル内で周知である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトにおける疾病状態の処置において治療学的部分として使用されてもよい。リボザイムを含むアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド薬物は、ヒトに安全かつ有効に投与されており、そして多くの臨床試行が現在進行中である。かくして、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織および動物、特にヒトの処置のための処置法において有用であるように構成することができる有用な治療学的モダリティー(modality)になり得ることが確立される。
ホスホトリエステル、3’−アルキレンホスホネート、5’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常な3’−5’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの2’−5’結合類似体、および1個以上のヌクレオチド間結合が3’〜3’,5’〜5’または2’〜2’結合である反転極性を有するそれらのものを含む。反転極性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、3’−大多数ヌクレオチド間結合における単一の3’〜3’結合、すなわち、塩基性であってもよい単一の反転ヌクレオシド残基(核酸塩基が失われているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する)を含む。
アンチセンス技術の特定の形態物はモルホリノオリゴヌクレオチドである(Summerton,J.and D.Weller(1997)Antisense Ncul.Acid Drug Dev.7:187−195;Nasevicius,A.and
S.C.Ekker(2000) Nat.Genet.26:216−220;Yan,Y−K.et al.(2002)Development 129:5065−5079)。モルホリノオリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNAと比較して変更された骨格結合をもつDNA類似体であるが、相補的配列をもつWatson−Crick塩基対にしたがう。典型的には、モルホリノは少なくとも長さ約18〜25ヌクレオチドであり、ある実施態様では、モルホリノは少なくとも長さ約25〜30ヌクレオチドであり、あるなおさらなる実施態様では、モルホリノは少なくとも長さ約30〜35ヌクレオチド以上である。脊椎動物の発生を研究するための道具としてのモルホリノの長さは、Ekker S.C.(2000)Yeast 17:302−306による最近の説に十分記述されており、この開示は引用によって本明細書に組み入れられている。
そしてこれらの改変オリゴヌクレオチドにより処置された動物における新脈管形成を妨害する。
本発明の核酸構築物は当該技術分野において既知のいずれの手段によって送達されてもよい。ある実施態様では、核酸はエクスビボ戦略を用いて細胞中に送達される。他の実施態様では、核酸はインビボ戦略を用いて細胞中に送達される。
本発明のその他の態様は、本発明の組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」は、本明細書においては交換可能に使用される。そのような用語は特定の細胞のみならず、またそのような細胞の子孫または潜在的子孫を指す。ある種の改変が、突然変異または環境の影響によって後続世代において起きるかもしれないので、そのような子孫は、実際に、親細胞と同一でなくてもよいが、なお本明細書に使用される用語の範囲内に含まれる。
また、本発明の宿主細胞は、非ヒト・トランスジェニック動物を作成するために使用することができる。例えば、1つの実施態様では、本発明の宿主細胞は、脊椎動物GNG2をコードしている配列が導入された受精卵母細胞または胚性幹細胞である。そのような宿主細胞は、次に、内因性の脊椎動物GNG2配列が変更されているそれらのゲノムまたは相同の(homologous)組み換え動物中に、外因性の脊椎動物GNG2配列が導入された非ヒト・トランスジェニック動物を作成するために使用できる。そのような動物は、脊椎動物GNG2の機能および/または活性を研究するため、および脊椎動物GNG2活性のモジュレーターを同定および/または評価するために有用である。本明細書で使用されるように、「トランスジェニック動物」は非ヒト動物であり、ある実施態様では、動物は魚であり、他の実施態様では、動物は哺乳動物(例えば、ラットまたはマウスのような齧歯類)であり、この場合、動物の1個以上の細胞がトランスジーンを含む。トランスジェニック動物の他の例は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれた外因性DNAであり、そしてこれが成熟動物のゲノム中に留まって、トランスジェニック動物の1種以上の細胞タイプまたは組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指導する。本明細書で使用されるように、「相同の組み換え動物」は非ヒト動物、例えば哺乳動物(例えば、マウス)であり、この動物では、内因性GNG2遺伝子は、内因性遺伝子と、動物の細胞、例えば、動物の発生前の動物の胚性細胞中に導入された外因性DNAとの間の相同組み換えによって変更されている。
列の相同染色体による置換物を有する。あるいはまた、脊椎動物GNG2遺伝子の相同染色体が脊椎動物GNG2cDNAに対するハイブリダイゼーション(さらなる前記)に基づいて単離され、そしてトランスジーンとして使用されてもよい。また、イントロン配列およびポリアデニル化シグナルがトランスジーンに含まれてトランスジーンの発現効率が増強されてもよい。組織特異的調節配列が操作可能に脊椎動物GNG2トランスジーンに連結されて、特定の細胞に対して脊椎動物GNG2ポリペプチドの発現を指導してもよい。胚の操作およびミクロインジェクションを介するトランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は、当該技術分野において慣用になっており、例えば、米国特許第4,736,866号;同第4,870,009号および同第4,873,191号;およびHogan 1986,In:Manipulating The Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.において記述されている。同様の方法は他のトランスジェニック動物の作成のために使用される。トランスジェニック創始動物は、そのゲノムにおける脊椎動物GNG2トランスジーンの存在および/または動物の組織または細胞における脊椎動物GNG2mRNAの発現に基づいて同定することができる。トランスジェニック創始動物は、次いで、トランスジーンを担持しているさらなる動物の繁殖のために使用できる。さらに、脊椎動物GNG2をコードしているトランスジーンを担持するトランスジェニック動物は、他のトランスジーンを担持している他のトランスジェニック動物とさらに交配させられてもよい。
et al.(1987)Cell 51:503。ベクターは胚性幹細胞系中に(例えば、エレクトロポレーションによって)導入され、そして導入された脊椎動物GNG2遺伝子が内因性脊椎動物GNG2遺伝子と相同的に組み換えられた細胞が選ばれる(参照、例えば、Li et al.(1992)Cell 69:915)。トランスジェニック非ヒト動物を作成する方法は当該技術分野において周知である(マウスについては、参照、Brinster et al.,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:4438−42;米国特許第4,736,866号、同4,870,009第号、同第4,873,191号、同第6,127,598号;Hogan,B.,Manipulating The Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986);相同組み換えについては、参照、Capecchi(1989)Science 244:1288−1292;Joyner et al.(1989)Nature 338:153−156;粒子衝撃については、参照、米国特許第4,945,050号;ドロソフィラ(Drosophila)については、参照、Rubin and Spradling(1982)Science 218:348−53、米国特許第4,670,388号;トランスジェニック昆虫については、参照、Berghmmer A.J.et al.(1999)Nature 402:370−37;ゼブラフィッシュについては、参照、Lin S.(2000)Methods Mol.Biol.136:375−3830;魚、両生類および鳥については、参照、Houdebine and Chourrout,(1991)Experientia 47:397−905;ラットについては、参照、Hammer et al,(1990)Cell 63:1099−1112;胚性幹(ES)細胞については、参照、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells,a Pratical Approach,E.J.Robertson,ed.,IRL Press(1987);家畜については、参照、Pursel et al.(1989)Science 244:1281−1288;非ヒト動物クローンについては、参照、Wilmut、I.et al.(1997)Nature 385:810−813、PCT公開WO97/07668およびWO97/07669;調節されたトランスジーン発現のためのリコンビナーゼ系については、参照、Lakso et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89:6232−6236;米国特許第4,959,317号(cre.loxPについて)およびO’Gorman et al.(1991)Science 251:1351−1355;米国特許第5,654,182号(FLP/FRTについて))。cre/loxPリコンビナーゼ系がトランスジーンの発現を調節するために使用される場合、両Creリコンビナーゼと選ばれたタンパク質をコードしているトランスジーンを含有する動物が要求される。そのような動物は、「二重の」トランスジェニック動物の構築をとおして、例えば、2種のトランスジェニック動物、選ばれたタンパク質をコードしているトランスジーンを含有する一方と、リコンビナーゼをコードしているトランスジーンを含有する他方との交配によって提供できる。
また本発明は、脊椎動物のGNG2ポリペプチドを提供する。GNG2ポリペプチド、その変異体、フラグメントおよび抗原部分は、いかなる脊椎動物種から得られてもよい。ある実施態様では、GNG2ポリペプチドはマウスまたはラットから得られる。他の実施態様では、GNG2ポリペプチドはヒトから得られる。他の実施態様では、GNG2ポリペプチドは魚、例えばゼブラフィッシュから得られる。ある実施態様では、ポリペプチドは配列番号:2のアミノ酸配列を有する。
本発明は、脊椎動物GNG2、またはエピトープが配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4配列番号:5、配列番号:6および/または配列番号:57のアミノ酸配列の少
なくとも一部分を含む脊椎動物GNG2のフラグメントを、特異的に認識するCDR配列を含む化合物を含む、抗体(例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二価/二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体および相補性決定部(CDR)をグラフトされた抗体)を提供する。
成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の脊椎動物GNG2ポリペプチドに対する単一の結合親和力を表す。特定のGNG2ポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、類似体または同族体に対向されるモノクローナル抗体の調製のためには、連続細胞系培養による抗体分子の生産のために提供するいかなる技術が利用されてもよい。そのような技術は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術(参照、Kohler & Milstein,1975 Nature 256:495−497);トリオーマ技術;ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(参照、Kozbor,et al.,(1983)Immunol Today 4:72)およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBVハイブリドーマ技術(参照、Cole,et al,.1985 In:Monoclonal Antiodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77−96)を含む。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用されてもよく、そしてヒトハイブリドーマを使用することによって(参照、Cote,et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026−2030)またはインビトロにおいてエプスタイン・バールウイルスによるヒトB細胞の形質転換によって(参照、Cole,et al.(1985)In:Monoclonal Antiodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77−96)生産されてもよい。
GNG2核酸分子、GNG2ポリペプチド(タンパク質の細胞透過性改変バージョンを含む)および抗GNG2抗体(また、本明細書では「有効成分」と呼ばれる)、およびその誘導体、フラグメント、類似体および同族体は、投与のために適当な治療学的に有効な量において製薬学的組成物中に組み入れることができる。そのような組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質または抗体および製薬学的に許容され得る担体を含む。本明細書で使用されるように、「製薬学的に許容され得る担体」は、製薬学的投与に適合する、いずれかおよび全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むことを意図している。適当な担体は、Remington’s Pharmaceutical Science、当該分野における標準的参考テキストの最新版に記述されており、これは引用によって本明細書に組み入れられている。そのような担体または賦形剤の好適な例は、限定されるものではないが、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液および5%ヒト血清アルブミンを含む。リポソームおよび非水性媒質、例えば不揮発油がまた使用されてもよい。製薬学的活性物質のためのそのような媒質および作用物の使用は当該技術分野においては周知である。いずれか慣用の媒質または作用物が活性化合物と適合しない限りそれを除いて、組成物におけるその使用が考えられる。補足的な活性化合物がまた組成物中に組み入れられてもよい。
、基剤の分散媒質および先に列挙されたものからの要求される他の成分を含有する無菌媒質中に活性化合物を組み入れることによって調製される。無菌注射用液剤の調製のための無菌散剤の場合には、調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、この方法は、予め無菌濾過された溶液から、有効成分プラスいずれかさらなる所望の成分の粉末を生成する。
各単位物は、要求される製薬学的担体と合わせて所望される治療効果を生じるように計算された活性化合物の予定量を含有する。本発明の用量単位形態物に関する明細は、活性化合物の独特な特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個人の処置のためにそのような活性化合物を調合することの技術上固有の制約によって指示され、そしてそれらに直接依存する。
新脈管形成に関連する疾病は、治療剤の開発のための薬物標的として、本発明の脊椎動物GNG2タンパク質を用いて診断および処置されてもよい。新脈管形成に関連する疾病は、限定されるものではないが、例えば、固形腫瘍、血液発生の(blood born)腫瘍、例えば白血病、および腫瘍転移物を含む、新脈管形成依存性のがん;良性腫瘍、例えば血管腫、聴覚性神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫;リウマチ様関節炎;乾癬;眼の新脈管形成疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、皮膚潮紅;Osler−Webber症候群;心筋新脈管形成;プラーク新生新脈管形成;末梢血管拡張症;血友病性関節;線維性血管腫;創傷肉芽を含む。ある実施態様では、最終目的は被験者における新脈管形成を促進することである。かくして、GNG2またはその生産物は、限定されることなく、創傷治癒を促進し、血管移植手術における内皮形成を促進し、そして心筋梗塞後の血管損傷を治癒するように内皮形成を促進するために使用することができる。
本発明のある実施態様では、新脈管形成はGNG2の発現を増強することによって細胞において促進される。本発明の方法では、GNG2をコードしている核酸配列は、GNG2の増強された発現を促進するように細胞に投与される。核酸配列は、GNG2核酸分子が生物活性を有するGNG2をコードしていれば、いかなるGNG2であってもよい(すなわち、いかなる種から得られてもよい)。GNG2をコードしているポリヌクレオチドは本明細書に記述されるような発現ベクターの一部であってもよい。細胞および動物中に核酸を導入する方法は当該技術分野において既知である。GNG2をコードしている使用されてもよいポリヌクレオチドは、限定されるものではないが配列番号:1、配列番号;7、配列番号:11、配列番号:13および配列番号:15を含む。他の配列は、他の種のGNG2をコードしているそれらの配列、例えばウシ(配列番号:56)、マウス(配列番号:58および配列番号:60)およびヒト(配列番号:59)を含む。GNG2発現の量は、プロモーターの強さ、および適当な系のために選ばれる組織特異的因子によって指導されてもよい。一般に、発現量は新脈管形成が促進されるようでなければならない
。ある実施態様では、GNG2単独が十分であり、しかし、他の実施態様では、GNG2の発現に加えて特異的なGタンパク質βサブユニットの同時発現が生物学的経路を活性化するために使用される。かくして、また本発明は新脈管形成の促進のためのGNG2およびGタンパク質βサブユニットの同時発現を含む。2種のサブユニットの同時発現は、当該技術分野における既知のいかなる手段によって達成されてもよい。2種のサブユニットをコードしている核酸は、同じ発現ベクター中に組込まれてもよく、または別々の発現ベクターにおいて存在してもよい。細胞へのベクターのトランスフェクションは同時でも連続であってもよい。2種のサブユニットの発現は、1種または両サブユニットの制御発現を可能にするために、同じ調節要素または異なる調節要素の制御下に存在してもよい。あるいはまた、いずれかまたは両サブユニットの発現は構成的であるように作成されてもよい。
本発明のある実施態様では、新脈管形成は、GNG2の発現を減少させるか、またはGNG2の機能を抑制することによって細胞において抑制される。新脈管形成は、GNG2に対して標的化される化合物、例えば天然または合成の低分子を含む化学化合物、アンチセンスGNG2分子またはGNG2に対する抗体の使用をとおして抑制されてもよい。新脈管形成を抑制するポリヌクレオチドは、GNGポリヌクレオチドに結合し、そしてGNG2の発現またはGNG2RNAの正確なスプライシングを抑制するそれらのものである。GNG2発現を抑制するアンチセンス分子の例は、限定されるものではないが配列番号:8 MO−gng2(翻訳):5’−gccatgaggctggcggttcaggc−3’(配列番号:8)、GNG2(センス):5’−gcctgaaccgccagcctcatggc−3’(配列番号:9)、MO−gng2(アンチセンス):5’−gccatgaggctggcggttcaggc−3’(配列番号:10)、およびMO−GNG2(スプライシング):5’−tatgctctttctgacctttattctg−3’(配列番号:12)を含む。
本発明の他の実施態様では、新脈管形成は、血管内皮成長因子(VEGF)の発現および/または機能の調節と組み合わせて、GNG2の発現および/または機能を操作することによって調節される。ある実施態様では、新脈管形成は、VEGFをコードしている核酸と組み合わせて、GNG2をコードしている核酸を投与することによって刺激される。GNG2およびVEGF核酸は、単一の発現ベクターまたは別々の発現ベクターにおいて存在してもよい。VEGFおよびGNG2核酸は同時または別々に投与されてもよい。他の実施態様では、新脈管形成は、GNG2の発現または機能を低下させる化合物およびVEGFの発現または機能を低下させる化合物を投与することによって抑制される。ある実施態様では、GNG2の発現を低下させる化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の実施態様では、GNG2の発現を低下させる化合物はGNG2に対向されるモルホリノである。ある実施態様では、VEGFの発現を低下させる化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の実施態様では、VEGFの発現を低下させる化合物はVEGFに対向されるモルホリノである。ある実施態様では、GNG2の機能を抑制する化合物は抗GNG2ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。ある実施態様では、VEGFの機能を抑制する化合物は抗VEGFポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。
本発明のその他の態様は、GNG2またはGNG2をコードしている核酸分子を試験化合物と接触させ、そして試験化合物がGNG2またはGNG2をコードしている核酸分子を結合するか否かを決定することを含んでなる、いずれかGNG2またはGNG2をコードしている核酸分子に結合する化合物を同定する方法に対向される。
ウエスタン解析、ELISAなどを含む、当該技術分野において既知のいかなる結合アッセイによっても決定することができ、これらは、例えば、Current Protocols In Molecular Biology,1999,John Wiley
& Sons,N.Y.に記述されている。そのような試験において使用されるGNG2ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、溶液中で遊離であっても、固体支持体に接着されていても、または細胞内に局在していても、または細胞画分と会合されていてもよい。本発明の1つの実施態様では、GNG2に対して適当な結合親和力を有する化合物の高処理能スクリーニング(「HTS」)が用いられる。多数の試験化合物が固定されたGNG2に曝露されてもよい。結合されたGNG2が、次に当該技術分野において周知の方法によって検出される。
保存魚:
ダニオ・レリオ(Danio rerio):Florida野生種(Lancaster,Pennsylvania)およびLongfin種(Scientific Hatcheries,Huntington Beach,California)。
VEGFmRNA過発現構築物は、Dr.Brant Weinstein(Lawson,N.D.et al.(2003)Genes Dev.17(11):1346−1351)によって親切に提供された。キャップ構造のセンスRNAは、SP6RNAポリメラーゼおよびmMESSAGEmMACHINE系(Ambion)を用いて合成された。VEGFmRNAまたはモルホリノアンチセンスオリゴのミクロインジェクションでは、ゼブラフィッシュ胚が、早期1細胞期の卵黄中に0.25〜0.5nlを注射され、続いて、28.5℃で0.3xDanieau’s培地においてインキュベートされた。胚は、それらが発芽期(bud stage)または受精後24時間に達するまで上記条件下で維持され、次いで、RNA調製のために回収されるか、または全載(whole−mount)インサイチューハイブリダイゼーションのために4%パラホルムアルデヒドにおいて固定された。
flkインサイチュー構築物は、Dr.Brant Weinstein(Lawson,N.D.et al.(2003)Genes Dev.17(11):1346−
1351)によって親切に提供された。インサイチューハイブリダイゼーション手法は、Leung,T.et al.(2003)Development 130(6):3639−3649から改変された。簡単に言えば、胚が、68℃で一夜ハイブリダイズされ、次いで66%Hyb/33%2XSSCにより30分間洗浄され、次いで33%Hyb/66%2XSSCによって68℃で30分間、次いで2XSSCによって68℃で15分間、続いて0.2XSSCによって68℃で1時間洗浄された。ハイブリダイズされたプローブは、NBT/BCIP染色(Roche)によって検出された。カラー染色後、胚は100%エタノール中で1時間洗浄された。
Biosciences)を用いてcDNAにおいて実施された。GNG2プライマーは、次のとおりである:
正:5’−atcgatatggccaccaacaacacagcta−3’(配列番号:31)および逆:ttacaggatggcacagaagaac−3’(配列番号:32)。28Sサブユニットプライマーは次のとおりである:
正:5’−cctcacgatccttctggctt−3’(配列番号:33)および逆:5’−attctgcttcacaatgata−3’(配列番号:34)。GNG2ゲノム配列またはcDNA配列を含有するプラスミドは正の対照として増幅された。PCR産物は臭化エチジウムを含有する2%アガロースゲルにおいて展開された。
MOの効能および特異性が、インビトロの転写および翻訳共役系(TNT Coupled Reticlocyte Lysate Systems,Promega)において調査された。BamHI/XhoIgng2PCRフラグメントが、pcDNA3.1/V5−His−TOPO(Invitrogen)中にクローン化された。gng2cDNAの0.5μgが鋳型として使用され、そして種々のMOオリゴが添加された。ウエスタンブロッティングは抗V5抗体(Invitrogen)を用いて実施された。免疫反応性タンパク質は、増進された化学発光(Amersham Pharmacia)によって検出された。
胚は、4%パラホルムアルデヒドにおいて一夜固定され、PBST中で洗浄され、そして2%ヤギ血清および2%BSAを含有するPBST中で4℃で2時間ブロックされた。ホスホ−AKTおよびホスホ−PLCγ1(Cell Signaling Technology)に対する第1抗体が、4℃で一夜、ブロッキングバッファー中で1:100希釈において使用された。PBST中で洗浄後、第2抗体が4℃で一夜1:300希釈において使用された。全上記溶液は20mMフッ化ナトリウムおよび2mMオルトバナジン酸ナトリウム(Sigma)を含有する。発色検出はDAB染色(Sigma)によって実施された。
第1段階として、本研究者らは、ゼブラフィッシュ胚の発生中の血管系において特異的に発現されるそれらのGγサブタイプを同定しようと努めた。ゼブラフィッシュ配列データベースをプローブするためにヒトおよびマウスのGタンパク質配列を用いて、脊椎動物中で高度に保存されている71のアミノ酸γ2タンパク質をコードしているゼブラフィッ
シュgng2遺伝子が同定された(図2およびA)。ゼブラフィッシュgng2の発現パターンは、胚の発生において非常に劇的であった。RT−PCR分析で示されたgng2転写物は、1細胞期から母性系で(maternally)提供され(B)、そして原腸胚形成および胚形成を通じて接合体として(zygotically)検出された。アンチセンスプローブを用いる全載インサイチューハイブリダイゼーションは、gng2が原腸胚形成中に至る所で発現されることを表した(データ未記載)。続いて、転写物は、形態形成の間、終脳、腹側の間脳、腹側の後脳および脊髄ニューロンを含む、中枢神経系(CNS)に空間的に限定された。CNSの外は、転写物はまた、体節間の血管に沿って検出可能なシグナルはなかったけれども、受精後(dpf)1日における背側大動脈を含む軸血管系において発現された(図7Aおよび図7B)。2dpfでは、転写物は、血管系では下方調節されたが、それらは、腹側の中脳、後脳および耳胞(耳内)のような他の組織ではなお検出された(図7C)。3dpfでは、転写物は全載インサイチューハイブリダイゼーションによってはほとんど検出できなかった(データ未記載)。gng2の発現をその哺乳動物の対応部分と比較するために、E8.5およびE9.5マウス胚の全載インサイチューハイブリダイゼーションが実施された。マウス胚発生のこの期には、軸血管系は確立されつつあり、そして体節間血管は背側大動脈からの新脈管形成発芽を続けつつある。このプロセスにおける可能な役割と一致して、これらの結果は、マウスgng2転写物が、E9.5期の胚における血管系および発芽中の血管において検出されたことを示した(図20)。新脈管形成プロセスのこの発生段階は、1dpfのゼブラフィッシュ胚に非常に類似している。かくして、保存されたタンパク質配列および発現パターンにおける類似性は、ゼブラフィッシュGγ2がマウスタンパク質の真のオーソローガス体であるという考えを強めた。
新脈管形成におけるgng2の可能な役割を明らかにするために、ゼブラフィッシュ胚においてモルホリノアンチセンス・ノックダウンアプローチが使用された(Nasevicius,A.and SC Ekker(2000)Nat.Genet.26:216−220)。インビボにおける抑制の効力を例証するために、第1のコーディングエクソン−イントロン境界に対して標的化されたスプライシング部位モルホリノが設計された(図11A)。ゼブラフィッシュ胚中に注入された場合、スプライシングモルホリノは、RT−PCR産物の配列決定によって確認されるように、gng2のコーディング配列の末端切断をもたらす潜在性スプライシング部位を誘導した(図11Bおよび図12)。新脈管形成欠如の最初の形態学的兆候は3dpfに検出され、この場合、ノックダウン胚は体節間血管を通しての血流の低下または不足を示したが、背側大動脈と主静脈には血液循環は存在した(図19、映画S1,WT;映画S2,gng2−MOスプライシングノックダウン)。このノックダウンアプローチの特異性は、翻訳を抑制するようにATG開始コドンにまたがる5’UTRに対向される第2のモルホリノを用いて確認された(図18A;図18CおよびD;図19;映画S3)。翻訳ブロッキングモルホリノは、インビトロの翻訳アッセイによって評価されるように、Gγ2タンパク質発現を特異的に抑制した(図18B)。両モルホリノ戦略は、インビボで類似する血液循環表現型を生じ、これは、5塩基ミスマッチの対照モルホリノを注入された胚では観察されなかった(図19、映画S4、ミスマッチ対照モルホリノ)。したがって、2つの独立したモルホリノおよびミスマッチ対照を用いて、gng2遺伝子が特異的に標的化されること、ならびにgng2の標的化ノックダウンがゼブラフィッシュ胚の軸血管系からの体節間血管の発芽を破壊することが例証された(また参照、図10)。
gng2ノックダウン胚における新脈管形成欠如の性質を試験するために、本研究者らは、VEGFR−2受容体(Flk−1/KDR)をコードしている内皮の特異的マーカーflk1を使用して、発生する血管系を可視化した(Liao W et al.(1997)Development 124:381−389)。1dpfの対照胚のインサイチューハイブリダイゼーションによって示されるように、flk1転写物は、頭蓋血管、軸血管系(背側大動脈および主静脈を含む)において、そしてより重要には、背側大動脈から発芽する体節間血管において豊富に発現された(図13Aおよび図13D)。同期におけるgng2ノックダウン胚のインサイチューハイブリダイゼーション解析は、背側大動脈および主静脈に沿ってflk1転写物の発現を表し、これは、軸血管系に沿った内皮細胞分化が欠損してなかったことを示している。しかしながら、gng2ノックダウン胚は、軸血管系から発芽する体節間血管の非常に低下した染色を示した(図13C、図13E−F;図13E−Fにおいてより拡大)ので、この欠損が新脈管形成プロセスに特異的であったことを示唆している。定量的分析は、すべてが正常でかつ十分に確立された背側大動脈からの体節間血管の発芽を示した対照の胚(図13Aおよび図13D)に較べて、gng2ノックダウン胚の96%が、体節間血管の部分的(図13Cおよび図13F)ないし完全な(図13Bおよび図13E)喪失を示したことを表した。この表現型は受精後30時間においてさえ持続し(データ未掲載)、このことは、gng2ノックダウン胚における体節間血管の確立の遅延というよりむしろ事実上の欠如を示唆する。gng2が新脈管形成において絶対的な役割を演じているという本研究者らの発見は、生体(organismo)レベルにおけるこのプロセスにおけるGタンパク質シグナル伝達の研究への進入点を提供する。さらにまた、それは、インビボのGγ2サブタイプに対して特異的な機能は、他のファミリーメンバーによって置き換えることができないことを例証している。さらなる研究は、他のGγサブタイプがこの機能を置換できないことが、生体に関して、その特徴的発現パターンによるか、またはその独特の機能によるか否かを探査するであろう。
gng2ノックダウン表現型は、vegfノックダウン胚のそれと驚くべき類似性を共有しており(Nasevicius A.et al.(2000)Yeast 17:294−301;Childs S.et al.(2002)Development
129:973−982)、これは、それらが、共通または収斂する経路において機能しているかもしれないことを示唆する。この可能性を探究するために、対照およびgng2抑制胚においてvegfに対する新脈管形成応答が比較された。興味あることには、両vegfおよびgng2転写物のモルホリノノックダウンは、ゼブラフィッシュ胚における新脈管形成に相乗効果を現した(図13G−H)。いずれのモルホリノ単独の有効以下の用量では、新脈管形成に及ぼす影響はなかった(図13G、vegfノックダウン;gng2ノックダウンデータは未記載)。しかしながら、同じ有効以下の用量における両vegfおよびgng2の同時抑制は、ゼブラフィッシュモデルにおける新脈管形成発芽のプロセスを有意に除去した(図13H)。
VEGFR−2受容体(Flk−1/KDR)の活性化は、血管内皮細胞におけるAKTキナーゼおよびPLCγ1シグナル伝達分子を刺激する(Tanimoto T.et
al.(2002)J.Biol.Chem.277:42997−43001;Claesson−Welsh L.(2003)Biochem.Soc.Trans.31:20−24;Takahashi T.et al.(2001)EMBO J.20:2768−2778)。新脈管形成中にGγ2がVEGFR−2と相互作用する分子経路を精査するために、発生中のゼブラフィッシュ胚の血管系におけるAKTキナーゼおよびPLCγ1の活性形態物を検出する特異的な抗ホスホ抗体が使用された。ゼブラフィッシュ胚におけるvegfmRNAの過発現において、全載免疫組織化学によって軸血管系におけるPLCγ1およびAKTキナーゼの活性化を検出した(図15Iおよび図15L)。かくして、Gγ2は、インビボのvegfシグナル伝達経路の下流構成要素をブロックすることによって新脈管形成において決定的かつ特異的な役割を演じることが示された。
本研究者らは、発生中のゼブラフィッシュ胚における新脈管形成中の新規プレイヤーとしてのGγ2を確立した。さらに、gng2の喪失が、PLCγ1およびAKTへの下流シグナル伝達を破壊することによって新脈管形成発芽を促進するVEGFの能力をブロックすることが示された。図17に示されるように、メカニズムまたは実施可能性のいかなる特定の理論によっても拘束されないことを願えば、本研究者らは、Gγ2−およびVEGF依存性のシグナル伝達経路の間の相互作用を説明する3つの可能なシナリオ:1)VEGF発現の誘導;2)VEGFR−2(Flk−1/KDR)のトランスアクチベーション(transactivation);および/または3)VEGFR−2への直接カップリングを考慮した。第1の可能なシナリオに関しては、数種の研究は、トロンビン、アンギオテンシンおよびエンドテリン(endothelin)によるGPCRの活性化がVEGF発現を誘導することによって血管の改造を調節できることを示した(Bagnato A,and F.Spinella(2003)Trends Endocrinol.Metab.14:44−50;Richard DE et al.(2000)J.Biol.Chem.275:26765−26771;Willams B.et al.(1995)Hypertension 25:913−917)。しかしながら、vegfが過発現され、そして明らかに速度限定的ではない条件下でさえも、gng2の喪失がvegfシグナル伝達における欠如を生じたので、この説明は、近年の研究ではあり得ないように思われる。
インサイチューのマウスgng2は、cDNA配列(NM 010315、2692bpmRNA、ムス・ムスクラス(Mus musculus)グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)、γ2サブユニット(Gng2)、mRNA)(配列番号:60)のフラグメントに対するRNAプローブ相補性を用いて実施された。
Claims (38)
- (a)配列番号:1および
(b)配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている配列:
からなるポリヌクレオチドを含んでなる単離された発現ベクター。 - 請求項1の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 配列番号:2のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに高い親和力により特異的に結合するが、配列番号:4または配列番号:5のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドには高い親和力で結合しない抗体。
- 抗体がモノクローナルである、請求項3の抗体。
- 抗体がポリクローナルである、請求項3の抗体。
- ゼブラフィッシュGNG2の発現のために適当な条件下で請求項2の宿主細胞を培養し、そして該GNG2を単離することを含んでなる、ゼブラフィッシュGNG2の生産方法。
- ゼブラフィッシュGNG2をコードしている核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドおよび製薬学的に許容され得る担体を含んでなる、治療学的組成物。
- 核酸配列が配列番号:2のポリペプチドをコードしている、請求項7の治療学的組成物。
- 請求項3の抗体および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる治療学的組成物。
- 配列番号:2のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドおよび製薬学的に許容され得る担体を含んでなる治療学的組成物。
- 新脈管形成を抑制するのに十分な量において、GNG2の発現を抑制するポリヌクレオチドを、新脈管形成に関連する疾病の処置を必要とする患者に投与することを含んでなる、新脈管形成に関連する疾病の処置方法。
- 新脈管形成に関連する疾病が、新脈管形成依存性がん;良性腫瘍;リウマチ様関節炎;乾癬;眼の新脈管形成疾患;オスラー−ウェーバー(Osler−Webber)症候群;心筋新脈管形成;プラーク新生新脈管形成;毛細血管拡張症;血友病性関節;線維性血管腫;創傷肉芽;腸癒着、アテローム性動脈硬化症、強皮症、肥大瘢痕、ネコ掻爬疾患およびヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)潰瘍からなる群から選ばれる、請求項11の方法。
- 新脈管形成に関連する疾病が新脈管形成依存性がんである、請求項11の方法。
- 新脈管形成に関連する疾病が新脈管形成依存性腫瘍であり、そして該ポリヌクレオチドが腫瘍の退行を惹起するのに十分な量において投与される、請求項11の方法。
- GNG2ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの有効量を動物に投与することを含んでなる、血管形成の促進を必要とする動物における新脈管形成の促進方法。
- GNG2ポリペプチドが、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:5および配列番号:6からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項15の方法。
- GNG2ポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸配列を含む、請求項15の方法。
- GNG2の発現を抑制する第1のポリヌクレオチドおよびVEGFの発現を抑制する第2のポリヌクレオチドを、新脈管形成に関連する疾病の処置を必要とする患者に投与することを含んでなる新脈管形成に関連する疾病の処置方法であって、該第1のポリヌクレオチドおよび該第2のポリヌクレオチドが新脈管形成を抑制するのに十分な量において提供される、方法。
- 該第1のポリヌクレオチドが、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:12およびそれらの組み合わせ物からなる群から選ばれる核酸配列を含む、請求項18の方法。
- 該第2のポリヌクレオチドが、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:55およびそれらの組み合わせ物からなる群から選ばれる核酸配列を含む、請求項18の方法。
- 新脈管形成に関連する疾病が新脈管形成依存性がんである、請求項18の方法。
- GNG2の発現または機能を抑制する第1の化合物およびVEGFの発現または機能を抑制する第2の化合物を、新脈管形成依存性腫瘍の処置を必要とする患者に投与することを含んでなるそのような腫瘍を有する患者の処置方法であって、該第1の化合物および該第2の化合物が腫瘍の退行を惹起するのに十分な量において提供される、方法。
- GNG2ポリペプチドをコードしている第1のポリヌクレオチドの有効量およびVEGFポリペプチドをコードしている第2のポリヌクレオチドの有効量を動物に投与することを含んでなる、血管形成の促進を必要とする動物における新脈管形成の促進方法。
- GNG2ポリペプチドが、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:5および配列番号:6からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項23の方法。
- VEGFポリペプチドが、配列番号:36、配列番号:38、配列番号;40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50および配列番号:52からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項23の方法。
- GNG2ポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸配列を含み、そして該VEGFポリペプチドが、配列番号:36、配列番号:38、配列番号;40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50および配列番号:52のアミノ酸配列を含む、請求項23の方法。
- 第2の化合物がVEGFに特異的に結合する抗体である、請求項22の方法。
- GNG2の機能を抑制する第1の化合物およびVEGFの機能を抑制する第2の化合物を、新脈管形成に関連する疾病の処置を必要とする患者に投与することを含んでなる新脈管形成に関連する疾病の処置方法であって、該第1の化合物および該第2化合物が新脈管形成を抑制するのに十分な量において提供される、方法。
- 該第2の化合物がVEGFに特異的に結合する抗体である、請求項28の方法。
- 試験化合物をGNG2ポリペプチドと接触させ、そして該試験化合物がGNG2の活性を抑制するか否かを決定することを含んでなる、GNG2活性を抑制する化合物の同定方法であって、GNG2の活性を抑制する化合物がGNG2のアンタゴニストとして同定される、方法。
- GNG2の生物学的活性が、GNG2に対する該試験化合物の結合によって測定される、請求項30の方法。
- GNG2の生物学的活性が、βサブユニットに対するGNG2の結合の抑制によって測定される、請求項30の方法。
- GNG2の生物学的活性が、モデル系における新脈管形成の抑制によって測定される、請求項30の方法。
- 該モデル系がゼブラフィッシュ発生系である、請求項33の方法。
- 該モデル系がトランスジェニック動物系である、請求項33の方法。
- 該モデル系がインビトロ細胞系である、請求項33の方法。
- GNG2の生物学的機能を抑制する細胞透過性ペプチドの有効量を細胞に投与することを含んでなる、新脈管形成を抑制する方法。
- VEGFの発現または生物学的機能を抑制する化合物の投与をさらに含む、請求項37の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US64080204P | 2004-12-29 | 2004-12-29 | |
US11/320,422 US20060154285A1 (en) | 2004-12-29 | 2005-12-28 | Zebrafish heterotrimer G-protein gamma 2 subunit (GNG2) |
PCT/US2005/047288 WO2006071949A2 (en) | 2004-12-29 | 2005-12-29 | Zebrafish heterotrimer g-protein gamma 2 subunit (gng2) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008525050A true JP2008525050A (ja) | 2008-07-17 |
Family
ID=36615511
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007549595A Pending JP2008525050A (ja) | 2004-12-29 | 2005-12-29 | ゼブラフィッシュのヘテロ三量体Gタンパク質γ2サブユニット(GNG2) |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20060154285A1 (ja) |
EP (1) | EP1836315A4 (ja) |
JP (1) | JP2008525050A (ja) |
WO (1) | WO2006071949A2 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8642067B2 (en) | 2007-04-02 | 2014-02-04 | Allergen, Inc. | Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions |
WO2011087855A1 (en) * | 2009-12-22 | 2011-07-21 | Columbia University | Method for evaluating inhibitory polynucleotide efficiency and efficacy |
WO2015110701A1 (en) * | 2014-01-21 | 2015-07-30 | University Of Helsinki | Therapeutic use of vegfr-3 ligands |
KR102684884B1 (ko) * | 2021-08-05 | 2024-07-15 | 성균관대학교산학협력단 | 신경줄기세포의 줄기세포능 증진을 위한 gng2의 용도 |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4394448A (en) * | 1978-02-24 | 1983-07-19 | Szoka Jr Francis C | Method of inserting DNA into living cells |
US4873191A (en) * | 1981-06-12 | 1989-10-10 | Ohio University | Genetic transformation of zygotes |
EP0088046B1 (de) * | 1982-02-17 | 1987-12-09 | Ciba-Geigy Ag | Lipide in wässriger Phase |
US4522811A (en) * | 1982-07-08 | 1985-06-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides |
US4870009A (en) * | 1982-11-22 | 1989-09-26 | The Salk Institute For Biological Studies | Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals |
US4670388A (en) * | 1982-12-30 | 1987-06-02 | Carnegie Institution Of Washington | Method of incorporating DNA into genome of drosophila |
US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4736866B1 (en) * | 1984-06-22 | 1988-04-12 | Transgenic non-human mammals | |
US4945050A (en) * | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
CA1293460C (en) * | 1985-10-07 | 1991-12-24 | Brian Lee Sauer | Site-specific recombination of dna in yeast |
US5225539A (en) * | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
US4946778A (en) * | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US4873316A (en) * | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
US5328470A (en) * | 1989-03-31 | 1994-07-12 | The Regents Of The University Of Michigan | Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor |
WO1992015694A1 (en) * | 1991-03-08 | 1992-09-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Flp-mediated gene modification in mammalian cells, and compositions and cells useful therefor |
US5719262A (en) * | 1993-11-22 | 1998-02-17 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having amino acid side chains |
US5539082A (en) * | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
US5714331A (en) * | 1991-05-24 | 1998-02-03 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility |
US5837693A (en) * | 1995-03-24 | 1998-11-17 | The Regents Of The University Of California | Intravenous hormone polypeptide delivery by salivary gland expression |
US20040220128A1 (en) * | 1995-10-26 | 2004-11-04 | Sirna Therapeutics, Inc. | Nucleic acid based modulation of female reproductive diseases and conditions |
WO1998040402A2 (en) * | 1997-03-10 | 1998-09-17 | Boehringer Mannheim Gmbh | INHIBITORS OF G-PROTEIN-β/η SUBUNIT FUNCTION |
US6127598A (en) * | 1997-07-25 | 2000-10-03 | The Regents Of The University Of California | NKX-2.2 and NKX-6.1 transgenic mouse models for diabetes, depression, and obesity |
US20020106678A1 (en) * | 1998-06-30 | 2002-08-08 | Robishaw Janet D. | cDNA clones encoding human G protein gamma subunits |
US20040009537A1 (en) * | 2002-01-11 | 2004-01-15 | Jack Roos | Methods of modulating and of identifying agents that modulate intracellular calcium |
EP1380644A1 (en) * | 2002-07-08 | 2004-01-14 | Kylix B.V. | The use of specified TCF target genes to identify drugs for the treatment of cancer, in particular colorectal cancer, in which TCF/beta-catenin/WNT signalling plays a central role |
US20040143865A1 (en) * | 2002-12-06 | 2004-07-22 | Rubinstein Amy L. | Transgenic zebrafish models for angiogenesis |
AU2003901511A0 (en) * | 2003-03-28 | 2003-04-17 | Bionomics Limited | Nucleic acid molecules associated with angiogenesis II |
-
2005
- 2005-12-28 US US11/320,422 patent/US20060154285A1/en not_active Abandoned
- 2005-12-29 WO PCT/US2005/047288 patent/WO2006071949A2/en active Application Filing
- 2005-12-29 EP EP05855790A patent/EP1836315A4/en not_active Withdrawn
- 2005-12-29 JP JP2007549595A patent/JP2008525050A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2006071949A2 (en) | 2006-07-06 |
WO2006071949A3 (en) | 2007-10-04 |
EP1836315A4 (en) | 2009-11-25 |
EP1836315A2 (en) | 2007-09-26 |
US20060154285A1 (en) | 2006-07-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4689956B2 (ja) | 増殖因子イソ型 | |
US7285535B2 (en) | Toll/interleukin-1 receptor adapter protein (TIRAP) | |
JP3626206B2 (ja) | Smad6及びその使用 | |
AU2009200385A1 (en) | Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization by tumor necrosis factor ligand/receptor homologs | |
TW200536859A (en) | Gastrointestinal proliferative factor and uses thereof | |
WO1998057621A1 (en) | Angiogenic modulation by notch signal transduction | |
KR20070085342A (ko) | vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질 | |
JP2008525050A (ja) | ゼブラフィッシュのヘテロ三量体Gタンパク質γ2サブユニット(GNG2) | |
US20030220249A1 (en) | Factors for angiogenesis, vasculogenesis, cartilage formation, bone formation, and methods of use thereof | |
JP2005509430A (ja) | G蛋白共役型受容体をコード化する遺伝子およびその使用法 | |
JP2009526861A (ja) | 血管新生標的としてのgpcr | |
JP2003530841A (ja) | 治療的化合物および方法 | |
AU770018B2 (en) | Human N-type calcium channel isoform and uses thereof | |
US20030148382A1 (en) | PanCAM nucleic acids and polypeptides | |
JP4224395B2 (ja) | PanCAM核酸およびポリペプチド | |
JP2005521424A (ja) | 新規パンコルチン−パブロ蛋白相互作用およびそれらの使用方法 | |
CA2487939A1 (en) | Semaphorin-like proteins and methods of using same | |
JP2004501630A (ja) | Gp286核酸およびポリペプチド | |
WO2001051632A2 (en) | Odorant receptor polypeptides and nucleic acids encoding same | |
WO2001098483A1 (fr) | Gene codant une nouvelle proteine de type protocadherine | |
WO2000034310A9 (en) | Purified and isolated serine-threonine kinase receptors associated protein | |
KR20080011474A (ko) | Eg-vegf 핵산 및 폴리펩티드 및 사용 방법 | |
NZ530696A (en) | Pancam nucleic acids and polypeptides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A625 | Written request for application examination (by other person) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A625 Effective date: 20081226 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20081226 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20100125 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100125 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110726 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120110 |