JP2008525040A - Definitive endoderm cell proliferation - Google Patents

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Abstract

本明細書中で開示されるのは、増殖した胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物、並びに培養で胚体内胚葉細胞を増殖するための方法である。  Disclosed herein are cell cultures containing expanded definitive endoderm cells, as well as methods for growing definitive endoderm cells in culture.

Description

[発明の分野]
本発明は、医学及び細胞生物学の分野に関する。特に本発明は、富化、単離及び／又は精製の前又は後に増殖した胚体内胚葉細胞の組成物、並びにこのような細胞を産生及び使用する方法に関する。 [Field of the Invention]
The present invention relates to the fields of medicine and cell biology. In particular, the present invention relates to compositions of definitive endoderm cells grown before or after enrichment, isolation and / or purification, and methods of producing and using such cells.

［関連出願］
本出願は、米国特許仮出願第６０／６９３，３１７号（表題「単離された胚体内胚葉細胞の増殖」、２００５年６月２３日出願）の非仮出願であり、それに対する優先権を主張し、そして米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号（表題「胚体内胚葉のマーカー」、２００５年１１月１４日出願）の非仮出願であり、それに対する優先権を主張する；本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、米国特許仮出願第６０／５８７，９４２号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体」、２００４年７月１４日出願）；米国特許仮出願第６０／５８６，５６６号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体」、２００４年７月９日出願）；及び米国特許仮出願第６０／５３２，００４号（表題「胚体内胚葉」、２００３年１２月２３日出願）に対する非仮出願として優先権を主張する米国特許出願第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉」、２００４年１２月２３日出願）の一部継続出願であり、それに対する優先権を主張する。 [Related applications]
This application is a non-provisional application of US Provisional Application No. 60 / 693,317 (titled “Proliferation of Isolated Definitive Endoderm Cells”, filed Jun. 23, 2005), and priority is given thereto. And is a non-provisional application of US Provisional Patent Application No. 60 / 736,598 (titled “Definitive Endoderm Marker”, filed November 14, 2005) and claims priority thereto; No. 119 (e), US Provisional Patent Application No. 60 / 587,942, entitled “Chemokine Cell Surface Receptor for Isolation of Definitive Endoderm”, July 14, 2004 U.S. Provisional Application No. 60 / 586,566 (Title "Chemokine Cell Surface Receptor for Isolation of Definitive Endoderm", filed July 9, 2004); and U.S. Provisional Application No. 60 / No. 532,004 (titled “embryonic body Part of US patent application Ser. No. 11 / 021,618 (titled “definitive endoderm”, filed December 23, 2004) claiming priority as a non-provisional application for “leaf”, filed December 23, 2003) It is a continuation application and claims priority.

［背景］
ヒト多能性（pluripotent）幹細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞及び胚性生殖（ＥＧ）細胞は、１９９４年に線維芽細胞フィーダーを含有しない（Bongso et al., 1994）そして線維芽細胞フィーダーを含有する（Hogan, 1997）培養でまず単離された。後に、Thomson、Reubinoff及びShamblottは、有糸***不活性化マウスフィーダー層を用いたヒトＥＳ及びＥＧ細胞の連続培養を確立した（Reubinoff et al., 2000；Shamblott et al., 1998；Thomson et al., 1998）。 [background]
Human pluripotent stem cells, such as embryonic stem (ES) cells and embryonic germ (EG) cells, do not contain fibroblast feeders in 1994 (Bongso et al., 1994) and fibroblast feeders (Hogan, 1997) was first isolated in culture. Later, Thomson, Reubinoff and Shamblott established a continuous culture of human ES and EG cells using a mitotically inactivated mouse feeder layer (Reubinoff et al., 2000; Shamblott et al., 1998; Thomson et al. ., 1998).

ヒトＥＳ及びＥＧ細胞（ｈＥＳＣ）は、ヒト発生の早期段階を研究するための、並びにいくつかの疾患状態、例えば真性糖尿病及びパーキンソン病における療法的介入のための独自の機会を提供する。例えばｈＥＳＣ由来のインスリン生産β細胞の使用は、糖尿病の治療のためにドナー膵臓からの細胞を利用する現在の細胞療法手順を上回る膨大な改善を提供する。しかしながら現在、ｈＥＳＣからインスリン生産β細胞を生成する方法は分かっていない。したがって、ドナー膵臓からの島細胞を利用する真性糖尿病のための現在の細胞療法処置は、移植に必要とされる高品質の島細胞の不足により制限される。一人のＩ型糖尿病患者のための細胞療法は、約８×１０8個の膵臓島細胞の移植を要する（Shapiro
et al., 2000；Shapiro et al., 2001a；Shapiro et al., 2001b）。したがって、少なくとも２つの健常ドナー器官が、上首尾の移植のために十分な島細胞を得るために必要とされる。ヒト胚性幹細胞は、ヒト細胞療法のための相当量の高品質分化細胞を発生させるための出発材料の供給源を提供する。 Human ES and EG cells (hESC) provide a unique opportunity to study the early stages of human development and for therapeutic intervention in several disease states such as diabetes mellitus and Parkinson's disease. For example, the use of hESC-derived insulin-producing β cells provides enormous improvements over current cell therapy procedures that utilize cells from donor pancreas for the treatment of diabetes. However, there is currently no known method for generating insulin-producing β cells from hESC. Thus, current cell therapy treatments for diabetes mellitus that utilize islet cells from the donor pancreas are limited by the lack of high-quality islet cells required for transplantation. Cell therapy for a single type I diabetic patient requires transplantation of approximately 8 × 10 8 pancreatic islet cells (Shapiro
et al., 2000; Shapiro et al., 2001a; Shapiro et al., 2001b). Thus, at least two healthy donor organs are required to obtain sufficient islet cells for successful transplantation. Human embryonic stem cells provide a source of starting material for generating significant amounts of high quality differentiated cells for human cell therapy.

ｈＥＳＣを細胞療法用途に独特に適合させる２つの特性は、多能性、並びに培養でこれらの細胞を長期間維持する能力である。多能性は、３つの一次胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）すべての誘導体に分化し、次に胚体外組織（例えば胎盤）及び生殖細胞のほかに、成熟生物体のすべての体細胞型を形成するｈＥＳＣの能力により確定される。多能性はｈＥＳＣに並外れた有用性を付与するが、この特性は、これらの細胞及びそれらの誘導体の研究及び操作のための独特のチャレンジを提起する。ｈＥＳＣ培養物を分化するに際して
生じ得る非常に種々の細胞型のために、混合された細胞集団において膨大な数の細胞型が極めて低い効率で産生される。ｈＥＳＣを、細胞療法用途に有用な細胞を生成するための出発材料として用いるために、上記の問題を克服することは有益であろう。 Two properties that make hESC uniquely suited for cell therapy applications are pluripotency, as well as the ability to maintain these cells in culture for long periods of time. Pluripotency differentiates into derivatives of all three primary germ layers (endoderm, mesoderm, ectoderm), then all somatic cells of the mature organism, in addition to extraembryonic tissues (eg placenta) and germ cells Determined by hESC's ability to form a mold. Although pluripotency confers exceptional utility to hESCs, this property poses a unique challenge for the study and manipulation of these cells and their derivatives. Due to the large variety of cell types that can occur in differentiating hESC cultures, a vast number of cell types are produced in a mixed cell population with very low efficiency. To use hESC as a starting material for generating cells useful for cell therapy applications, it would be beneficial to overcome the above problems.

［発明の概要］
本発明の実施形態は、増殖した胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に関する。本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、培養で富化、単離及び／又は精製された胚体内胚葉細胞を増殖するための方法に関する。 [Summary of Invention]
Embodiments of the invention relate to cell cultures comprising expanded definitive endoderm cells. Further embodiments described herein relate to methods for growing definitive endoderm cells enriched, isolated and / or purified in culture.

本明細書中に記載される方法のいくつかは、細胞培養物中での胚体内胚葉細胞の維持、増殖(growth)、継代培養及び／又は増殖(expansion)に関する。このような実施形態では、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が得られる。次に細胞は単離され、胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかが細胞培養物中の他の細胞の少なくともいくつかから分離され、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団は、胚体内胚葉細胞の増殖を可能にする条件下で培養される。   Some of the methods described herein relate to the maintenance, growth, subculture and / or expansion of definitive endoderm cells in cell culture. In such an embodiment, a cell culture comprising definitive endoderm cells is obtained. The cells are then isolated and at least some of the definitive endoderm cells are separated from at least some of the other cells in the cell culture, thereby producing a cell population enriched in definitive endoderm cells. In some embodiments, the cell population enriched in definitive endoderm cells is cultured under conditions that permit proliferation of definitive endoderm cells.

本明細書中に記載される方法のその他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である。好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を分化させることにより得られるヒト胚体内胚葉細胞である。このような実施形態では、胚体内胚葉細胞は、このような細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子、例えばアクチビンＡと接触させることにより、ｈＥＳＣから得られる。他の実施形態では、ヒト及び／又はその他の胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞の既存の培養物から得られる。このような実施形態では、培養物の一部分又は全部が、本明細書中に記載される胚体内胚葉細胞の増殖方法に用いられ得る。   In other embodiments of the methods described herein, the definitive endoderm cells are multipotent cells that can differentiate into cells of the intestinal tract or organs derived therefrom. In a preferred embodiment, the definitive endoderm cells are human definitive endoderm cells obtained by differentiating human embryonic stem cells (hESC). In such embodiments, definitive endoderm cells are obtained from hESCs by contacting such cells with at least one growth factor of the TGFβ superfamily, such as activin A. In other embodiments, human and / or other definitive endoderm cells are obtained from an existing culture of definitive endoderm cells. In such embodiments, some or all of the culture can be used in the definitive endoderm cell expansion methods described herein.

胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を得るほかに、本明細書中に記載される増殖方法のいくつかの実施形態は、富化された胚体内胚葉細胞集団を産生する工程も含む。いくつかの実施形態では、このような富化された胚体内胚葉細胞集団は、細胞培養物中の他の細胞の少なくともいくつかから胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかを分離することにより産生される。したがって、胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかが、細胞培養物中に残存する他の細胞の少なくともいくつかから単離される。いくつかの実施形態では、単離する工程は、上記の胚体内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、細胞培養物中に存在する上記の他の細胞中で実質的に発現されない試薬を細胞培養物中の細胞に提供することを含む。試薬結合胚体内胚葉細胞は次に、試薬非結合細胞から分離され、それにより富化された胚体内胚葉細胞集団を産生する。いくつかの実施形態では、マーカーはＣＸＣＲ４であり、そして試薬はＣＸＣＲ４に対する親和性を有する抗体である。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により分離される。   In addition to obtaining a cell culture comprising definitive endoderm cells, some embodiments of the growth methods described herein also include producing an enriched definitive endoderm cell population. In some embodiments, such an enriched definitive endoderm cell population is produced by separating at least some of the definitive endoderm cells from at least some of the other cells in the cell culture. . Thus, at least some of the definitive endoderm cells are isolated from at least some of the other cells remaining in the cell culture. In some embodiments, the isolating step binds to a marker expressed in the definitive endoderm cells, but is not substantially expressed in the other cells present in the cell culture. Providing to a cell in a cell culture. Reagent-bound definitive endoderm cells are then separated from reagent-unbound cells, thereby producing an enriched definitive endoderm cell population. In some embodiments, the marker is CXCR4 and the reagent is an antibody with affinity for CXCR4. In some embodiments, definitive endoderm cells are separated by fluorescence activated cell sorting (FACS).

さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかは、培養中の胚体内胚葉細胞を特異的に蛍光標識し、次にＦＡＣＳにより標識細胞を非標識細胞から分離することにより、培養物中の他の細胞の少なくともいくつかから分離される。いくつかの実施形態では、蛍光は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）により発生される。いくつかの実施形態では、ＧＦＰ及び／又はＥＧＦＰは、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターの制御下で発現される。   In still other embodiments, at least some of the definitive endoderm cells are specifically labeled by fluorescently labeling the definitive endoderm cells in culture and then separating the labeled cells from unlabeled cells by FACS. Separated from at least some of the other cells in it. In some embodiments, the fluorescence is generated by green fluorescent protein (GFP) or enhanced green fluorescent protein (EGFP). In some embodiments, GFP and / or EGFP are expressed under the control of a SOX17 or CXCR4 promoter.

いくつかの実施形態では、上記のように産生される富化された胚体内胚葉細胞集団は、
胚体内胚葉細胞以外の細胞を実質的に含有しない。他の実施形態では、富化された胚体内胚葉細胞集団は、少なくとも約９６％〜少なくとも約１００％の胚体内胚葉細胞を含む。 In some embodiments, the enriched definitive endoderm cell population produced as described above is
It contains substantially no cells other than definitive endoderm cells. In other embodiments, the enriched definitive endoderm cell population comprises at least about 96% to at least about 100% definitive endoderm cells.

本明細書中に記載される方法の付加的な実施形態は、胚体内胚葉細胞に富んだ集団又は当該集団の一部分をプレーティングすることを含む、培養する工程も含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトフィブロネクチン及び／又はポリ−オルニチンで被覆された表面でプレーティングされる。他の実施形態では、培養する工程は、約２％（ｖ／ｖ）の血清を含む培地中に富んだ胚体内胚葉細胞集団又はその一部分をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、培地は、少なくとも１つの成長因子も含む。或る特定の実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーの一成員、例えばアクチビンＡを含む成長因子である。或いは、成長因子は、ＩＧＦ１、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ又は別の成長因子であり得る。このような実施形態では、成長因子は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で培地中に存在し得る。いくつかの実施形態では、成長因子の組合せが培地中に存在する。   Additional embodiments of the methods described herein also include a culturing step comprising plating a population enriched in definitive endoderm cells or a portion of the population. In some embodiments, the cells are plated on a surface coated with human fibronectin and / or poly-ornithine. In other embodiments, the culturing comprises incubating the enriched definitive endoderm cell population or a portion thereof in a medium comprising about 2% (v / v) serum. In some embodiments, the medium also includes at least one growth factor. In certain embodiments, the at least one growth factor is a growth factor that comprises a member of the TGFβ superfamily, eg, activin A. Alternatively, the growth factor can be IGF1, bFGF, EGF or another growth factor. In such embodiments, the growth factor may be present in the medium at a concentration ranging from about 1 ng / ml to about 5000 ng / ml. In some embodiments, a combination of growth factors is present in the medium.

本明細書中に記載される付加的な実施形態は、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を得て、次に胚体内胚葉細胞を継代培養し、それにより胚体内胚葉細胞を含む複数の細胞培養物を産生することにより培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法に関する。いくつかの実施形態では、細胞培養物中で得られる胚体内胚葉細胞は基材、例えば細胞培養フラスコの表面又はマイクロタイタープレートの表面に付着される。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は酵素的方法を用いて継代培養される。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は機械的に継代培養される。さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は細胞分散緩衝液を用いて継代培養される。   Additional embodiments described herein provide a plurality of cell cultures comprising definitive endoderm cells and then subcultured definitive endoderm cells, thereby comprising definitive endoderm cells. The present invention relates to a method for growing definitive endoderm cells in culture by producing a cell culture. In some embodiments, definitive endoderm cells obtained in cell culture are attached to a substrate, such as the surface of a cell culture flask or the surface of a microtiter plate. In some embodiments, definitive endoderm cells are subcultured using enzymatic methods. In other embodiments, the definitive endoderm cells are mechanically subcultured. In yet other embodiments, definitive endoderm cells are subcultured using a cell dispersion buffer.

本明細書中に記載されるさらに他の実施形態は、本明細書中に記載される方法により産生される増殖胚体内胚葉細胞の培養物及び／又は集団に関する。このような実施形態では、胚体内胚葉細胞は、腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である。   Still other embodiments described herein relate to cultures and / or populations of expanded definitive endoderm cells produced by the methods described herein. In such embodiments, definitive endoderm cells are multipotent cells that can differentiate into cells of the intestinal tract or organs derived therefrom.

或る特定の権限において、「〜を含む（comprising）」という用語の任意の一般的に許容可能な定義は存在し得ない。本明細書中で用いる場合、「〜を含む」という用語は、任意の付加的な要素の含入を可能にする「オープン」言語を表すよう意図される。これに留意して、本発明の付加的な実施形態を、以下の番号を付した段落を参照しながら説明する。   In a particular authority, there cannot be any generally acceptable definition of the term “comprising”. As used herein, the term “comprising” is intended to denote an “open” language that allows the inclusion of any additional elements. With this in mind, additional embodiments of the present invention will be described with reference to the following numbered paragraphs.

１． 培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法であって、以下：（ａ）胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程；（ｂ）上記細胞培養物中の他の細胞のうちの少なくともいくつかから上記胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかを単離する工程であって、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を作り出す、工程；及び（ｃ）上記胚体内胚葉細胞の増殖を可能にする条件下で上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を培養する工程を含む、方法。   1. A method of proliferating definitive endoderm cells in culture comprising: (a) obtaining a cell culture containing definitive endoderm cells; (b) at least some of the other cells in the cell culture. Isolating at least some of the definitive endoderm cells from thereby creating a cell population enriched in definitive endoderm cells; and (c) expanding the definitive endoderm cells Culturing the population of cells enriched in definitive endoderm cells under conditions that allow.

２． 上記胚体内胚葉細胞が腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である、段落１記載の方法。   2. The method according to paragraph 1, wherein the definitive endoderm cells are multipotent cells capable of differentiating into cells of the intestinal tract or organs derived therefrom.

３． 上記胚体内胚葉細胞がヒト胚体内胚葉細胞である、段落１記載の方法。   3. The method of paragraph 1, wherein the definitive endoderm cells are human definitive endoderm cells.

４． 上記胚体内胚葉細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来する、段落３記載の方法。   4). The method according to paragraph 3, wherein the definitive endoderm cells are derived from human embryonic stem cells (hESC).

５． 上記取得する工程が、上記ｈＥＳＣのうちの少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞への分化を可能にするために、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子とｈＥＳＣを接触させることを含む、段落４記載の方法。   5. Paragraph 4 wherein the obtaining step comprises contacting hESC with at least one growth factor of the TGFβ superfamily to allow differentiation into at least some of the hESCs into definitive endoderm cells. the method of.

６． 上記ＴＧＦβスーパーファミリーの上記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、段落５記載の方法。   6). 6. The method of paragraph 5, wherein the at least one growth factor of the TGFβ superfamily comprises activin A.

７． 胚体内胚葉細胞を含む上記細胞培養物を取得する工程が、現存する胚体内胚葉培養物の一部分を取得することをさらに含む、段落１記載の方法。   7. The method of paragraph 1, wherein obtaining the cell culture comprising definitive endoderm cells further comprises obtaining a portion of an existing definitive endoderm culture.

８． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が胚体内胚葉細胞以外の細胞を実質的に含有しない、段落１記載の方法。   8). The method of paragraph 1, wherein the cell population rich in definitive endoderm cells is substantially free of cells other than definitive endoderm cells.

９． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９６％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。   9. The method of paragraph 1, wherein the cell population enriched in definitive endoderm cells comprises at least about 96% definitive endoderm cells.

１０． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９７％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。   10. The method of paragraph 1, wherein the definitive endoderm-rich cell population comprises at least about 97% definitive endoderm cells.

１１． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９８％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。   11. The method of paragraph 1, wherein the cell population enriched in definitive endoderm cells comprises at least about 98% definitive endoderm cells.

１２． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９９％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。   12 The method of paragraph 1, wherein the cell population enriched in definitive endoderm cells comprises at least about 99% definitive endoderm cells.

１３． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が約１００％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。   13. The method of paragraph 1, wherein the cell population enriched in definitive endoderm cells comprises about 100% definitive endoderm cells.

１４． 上記単離する工程が、上記胚体内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、細胞培養物中に存在する上記他の細胞中で実質的に発現されない試薬を上記細胞培養物に提供すること、及び、細胞培養物中に存在する上記他の細胞から上記試薬に結合された上記胚体内胚葉細胞を分離することであって、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を生じることを含む、段落１記載の方法。   14 The isolating step provides to the cell culture a reagent that binds to a marker expressed in the definitive endoderm cells but is not substantially expressed in the other cells present in the cell culture. Separating the definitive endoderm cells bound to the reagent from the other cells present in the cell culture, thereby producing a cell population enriched in definitive endoderm cells. The method of paragraph 1, comprising.

１５． 上記マーカーがＣＸＣＲ４である、段落１４記載の方法。   15. The method of paragraph 14, wherein the marker is CXCR4.

１６． 上記試薬が抗体である、段落１４記載の方法。   16. The method of paragraph 14, wherein the reagent is an antibody.

１７． 上記抗体がＣＸＣＲ４に対する親和性を有する、段落１６の方法。   17. The method of paragraph 16, wherein said antibody has affinity for CXCR4.

１８． 上記試薬に結合される上記胚体内胚葉細胞が蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により細胞培養物中に存在する上記他の細胞から分離される、段落１４記載の方法。   18. 15. The method of paragraph 14, wherein the definitive endoderm cells bound to the reagent are separated from the other cells present in the cell culture by fluorescence activated cell sorting (FACS).

１９． 上記単離する工程が非標識細胞から蛍光標識胚体内胚葉細胞を分離することを含む、段落１記載の方法。   19. The method of paragraph 1, wherein said isolating step comprises separating fluorescently labeled definitive endoderm cells from unlabeled cells.

２０． 上記蛍光標識胚体内胚葉細胞が強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現の結果として標識される、段落１９記載の方法。   20. 20. The method of paragraph 19, wherein the fluorescently labeled definitive endoderm cells are labeled as a result of expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP).

２１． ＥＧＦＰの発現がＳＯＸ１７プロモーターの制御下にある、段落２０記載の方
法。 21. The method of paragraph 20, wherein expression of EGFP is under the control of a SOX17 promoter.

２２． ＥＧＦＰの発現がＣＸＣＲ４プロモーターの制御下にある、段落２０記載の方法。   22. The method of paragraph 20, wherein expression of EGFP is under the control of the CXCR4 promoter.

２３． 上記蛍光標識胚体内胚葉細胞がＦＡＣＳにより非標識細胞から分離される、段落１９の方法。   23. The method of paragraph 19, wherein the fluorescently labeled definitive endoderm cells are separated from unlabeled cells by FACS.

２４． 上記培養する工程が上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をプレーティングすることを含む、段落１記載の方法。   24. The method of paragraph 1, wherein said culturing comprises plating the population enriched in definitive endoderm cells or a portion thereof.

２５． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分がヒトフィブロネクチンで被覆された表面でプレーティングされる、段落２４記載の方法。   25. 25. The method of paragraph 24, wherein the definitive endoderm-rich population or a portion thereof is plated on a surface coated with human fibronectin.

２６． 上記表面がポリオルニチンで被覆される、段落２５記載の方法。   26. 26. The method of paragraph 25, wherein the surface is coated with polyornithine.

２７． 上記培養する工程が約２％（ｖ／ｖ）の血清を含む培地中で上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、段落１記載の方法。   27. The method of paragraph 1, wherein the culturing comprises incubating the definitive endoderm cell rich population or a portion thereof in a medium comprising about 2% (v / v) serum.

２８． 上記培養する工程が約２％（ｖ／ｖ）よりも多い血清を含む培地中で上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、段落１記載の方法。   28. The method of paragraph 1, wherein the culturing comprises incubating the definitive endoderm cell rich population or a portion thereof in a medium comprising greater than about 2% (v / v) serum.

２９． 上記培養する工程が約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、段落１記載の方法。   29. The method of paragraph 1, wherein the culturing comprises incubating the definitive endoderm cell rich population or a portion thereof in a medium comprising less than about 2% (v / v) serum.

３０． 上記培養する工程が少なくとも１つの成長因子を含む培地中で上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、段落１記載の方法。   30. The method of paragraph 1, wherein said culturing comprises incubating said definitive endoderm cell rich population or a portion thereof in a medium comprising at least one growth factor.

３１． 上記少なくとも１つの成長因子がＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子の一成長因子である、段落３０記載の方法。   31. The method of paragraph 30, wherein the at least one growth factor is a growth factor of a growth factor of the TGFβ superfamily.

３２． 上記ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子の少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、段落３１記載の方法。   32. 32. The method of paragraph 31, wherein at least one growth factor of the TGFβ superfamily growth factor comprises activin A.

３３． 上記アクチビンＡが約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、段落３２記載の方法。   33. The method of paragraph 32, wherein the activin A is present in the medium at a concentration of about 100 ng / ml.

３４． 上記少なくとも１つの成長因子がＩＧＦ１を含む、段落３０記載の方法。   34. The method of paragraph 30, wherein the at least one growth factor comprises IGF1.

３５． 上記ＩＧＦ１が約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、段落３４記載の方法。   35. 35. The method of paragraph 34, wherein the IGF1 is present in the medium at a concentration of about 100 ng / ml.

３６． 上記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡとＩＧＦ１との組合せを含む、段落３０記載の方法。   36. The method of paragraph 30, wherein the at least one growth factor comprises a combination of activin A and IGF1.

３７． 上記少なくとも１つの成長因子がｂＦＧＦを含む、段落３０記載の方法。   37. The method of paragraph 30, wherein the at least one growth factor comprises bFGF.

３８． 上記ｂＦＧＦが約１２ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、段落３７記
載の方法。 38. 38. The method of paragraph 37, wherein the bFGF is present in the medium at a concentration of about 12 ng / ml.

３９． 上記少なくとも１つの成長因子がＥＧＦを含む、段落３０記載の方法。   39. The method of paragraph 30, wherein the at least one growth factor comprises EGF.

４０． 上記ＥＧＦが約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、段落３９記載の方法。   40. 40. The method of paragraph 39, wherein the EGF is present in the medium at a concentration of about 10 ng / ml.

４１． 上記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡと、ｂＦＧＦと、ＥＧＦとの組合せを含む、段落３０記載の方法。   41. The method of paragraph 30, wherein the at least one growth factor comprises a combination of activin A, bFGF, and EGF.

４２． 段落１記載の方法により産生される増殖した胚体内胚葉細胞集団。   42. An expanded definitive endoderm cell population produced by the method of paragraph 1.

４３． 培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法であって、以下：（ａ）胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程、及び（ｂ）上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程であって、それにより胚体内胚葉細胞を含む複数の細胞培養物を産生する工程を含む、方法。   43. A method for proliferating definitive endoderm cells in culture, comprising: (a) obtaining a cell culture containing definitive endoderm cells; and (b) subculturing the definitive endoderm cells. And thereby producing a plurality of cell cultures comprising definitive endoderm cells.

４４． 上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、上記細胞培養物に少なくとも１つの酵素を提供することを含む、段落４３記載の方法。   44. 44. The method of paragraph 43, wherein the step of subculturing the definitive endoderm cells comprises providing at least one enzyme to the cell culture.

４５． 上記少なくとも１つの酵素が少なくとも１つのプロテアーゼを含む、段落４４記載の方法。   45. 45. The method of paragraph 44, wherein the at least one enzyme comprises at least one protease.

４６． 上記少なくとも１つのプロテアーゼがトリプシンを含む、段落４５記載の方法。   46. 46. The method of paragraph 45, wherein the at least one protease comprises trypsin.

４７． 上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、上記胚体内胚葉細胞間の接触を機械的に妨げることを含む、段落４３記載の方法。   47. 44. The method of paragraph 43, wherein the step of subculturing the definitive endoderm cells comprises mechanically preventing contact between the definitive endoderm cells.

４８． 上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、細胞分散緩衝液中で上記胚体内胚葉細胞をインキュベートすることを含む、段落４３記載の方法。   48. 44. The method of paragraph 43, wherein the step of subculturing the definitive endoderm cells comprises incubating the definitive endoderm cells in a cell dispersion buffer.

４９． 上記胚体内胚葉細胞が基材に付着される、段落４３記載の方法。   49. 44. The method of paragraph 43, wherein the definitive endoderm cells are attached to a substrate.

５０． 上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、上記基材から上記胚体内胚葉細胞を剥離することを含む、段落４９記載の方法。   50. 50. The method of paragraph 49, wherein the step of subculturing the definitive endoderm cells comprises detaching the definitive endoderm cells from the substrate.

５１． 上記基材が組織培養フラスコの表面である、段落５０記載の方法。   51. The method of paragraph 50, wherein the substrate is the surface of a tissue culture flask.

５２． 上記基材がマイクロタイタープレートの表面である、段落５０記載の方法。   52. The method of paragraph 50, wherein the substrate is the surface of a microtiter plate.

５３． 段落４３記載の方法により産生される増殖した胚体内胚葉細胞集団。   53. 44. An expanded definitive endoderm cell population produced by the method of paragraph 43.

上記の方法及び組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞に関することが理解されよう。しかしながら上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ用途のために用いられ得る。   It will be appreciated that the above methods and compositions relate to cells that are cultured in vitro. However, the above in vitro differentiated cell composition can be used for in vivo applications.

本発明の付加的な実施形態は、米国特許仮出願第６０／５３２，００４号（表題「胚体内胚葉」、２００３年１２月２３日出願）；米国特許仮出願第６０／５６６，２９３号（表題「ＰＤＸ１発現内胚葉」、２００４年４月２７日出願）；米国特許仮出願第６０／５
８６，５６６号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体」、２００４年７月９日出願）；米国特許仮出願第６０／５８７，９４２号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体」、２００４年７月１４日出願）；米国特許出願第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉」、２００４年１２月２３日出願）；米国特許出願第１１／１１５，８６８号（表題「ＰＤＸ１発現内胚葉」、２００５年４月２６日出願）；米国特許出願第１１／１６５，３０５号（表題「胚体内胚葉を分化させるための因子の同定方法」、２００５年６月２３日出願）；米国特許仮出願第６０／６９３３６４号（表題「前原始線条及び中内胚葉細胞；米国特許仮出願第６０／６９３，３１７号（表題「単離された胚体内胚葉細胞の増殖」、２００５年６月２３日出願）；及び米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号（表題「胚体内胚葉のマーカー」、２００５年１１月１４日出願）（これらの開示はその全体が参照により本明細書に援用される）にも見出され得る。 Additional embodiments of the present invention are described in US Provisional Application No. 60 / 532,004 (titled “Definitive Endoderm”, filed December 23, 2003); US Provisional Application No. 60 / 566,293 ( Title “PDX1-expressing endoderm”, filed Apr. 27, 2004); US Provisional Patent Application No. 60/5
86,566 (title “Chemokine Cell Surface Receptor for Isolation of Definitive Endoderm”, filed July 9, 2004); US Provisional Application No. 60 / 587,942 (title “Definitive Endoderm Chemokine Cell Surface Receptor for Isolation ”, filed July 14, 2004); US Patent Application No. 11 / 021,618 (title“ Definitive Endoderm ”, filed December 23, 2004); US Patent Application 11 / 115,868 (Title “PDX1-expressing endoderm”, filed Apr. 26, 2005); US Patent Application 11 / 165,305 (Title “Identification of factors for differentiating definitive endoderm” Methods ", filed Jun. 23, 2005); US Provisional Application No. 60/69364 (title" Preprimitive Streak and Mesendoderm cells; US Provisional Application No. 60 / 693,317 (title "Isolation"). Definitive endoderm No. 60 / 736,598 (title “Definitive endoderm marker”, filed Nov. 14, 2005) (the disclosure of which is incorporated in its entirety) Are also incorporated herein by reference).

［詳細な説明］
原腸陥入と呼ばれる初期ヒト発生におけるきわめて重大な段階は、受精後２〜３週間で起こる。原腸陥入は、３つの一次胚葉が最初に特定化され、そして器官形成されるのがこの時期であるため、非常に重要である（Lu et al., 2001；Schoenwolf and Smith, 2000）。外胚葉は、身体の外被及び全神経系の終局的形成を担うが、一方、心臓、血液、骨、骨格筋及びその他の結合組織は中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃並びに小腸及び大腸を含む全腸管、並びに腸管に由来する器官、例えば肺、肝臓、胸腺、上皮小体及び甲状腺、胆嚢及び膵臓の形成を担う胚葉として定義される（Grapin-Botton and Melton, 2000；Kimelman and Griffin, 2000；Tremblay et al., 2000；Wells and Melton, 1999；Wells and Melton, 2000）。非常に重要な区別は、胚体内胚葉と原始内胚葉と呼ばれる細胞の完全に別個の系統との間でなされるべきである。原始内胚葉は主として、胚体外組織、主に胎盤卵黄嚢の壁側及び臓側内胚葉部分、並びにライヘルト膜の細胞外マトリックス物質の形成を担う。 [Detailed description]
A crucial stage in early human development called gastrulation occurs 2-3 weeks after fertilization. Gastroenteric invagination is very important because it is at this time that the three primary germ layers are first specified and organized (Lu et al., 2001; Schoenwolf and Smith, 2000). The ectoderm is responsible for the ultimate formation of the body coat and the entire nervous system, while the heart, blood, bone, skeletal muscle and other connective tissues are derived from the mesoderm. Definitive endoderm is defined as the ectoderm responsible for the formation of the esophagus, stomach and whole intestinal tract including the small and large intestines, and organs derived from the intestinal tract, such as lung, liver, thymus, parathyroid and thyroid, gallbladder and pancreas ( Grapin-Botton and Melton, 2000; Kimelman and Griffin, 2000; Tremblay et al., 2000; Wells and Melton, 1999; Wells and Melton, 2000). A very important distinction should be made between completely separate lineages of cells called definitive endoderm and primitive endoderm. Primitive endoderm is primarily responsible for the formation of extraembryonic tissue, mainly the wall-side and visceral endoderm portions of the placental yolk sac, and the Reichert membrane extracellular matrix material.

原腸陥入中、胚体内胚葉形成のプロセスは、中内胚葉細胞（中胚葉又は内胚葉を形成するための細胞構成成分）が原始線条と呼ばれる構造を介して移動する細胞移動事象で開始する。胚体内胚葉は、線条の前部分を通して、そして結節（線条の最前領域での特定構造）を通って移動する細胞に由来する。移動が起こると、胚体内胚葉はまず最前腸管に集合し、そして腸管の後端を形成する。   During gastrulation, the process of definitive endoderm formation begins with a cell migration event in which mesendoderm cells (cell constituents that form mesoderm or endoderm) move through structures called primitive streak To do. The definitive endoderm is derived from cells that travel through the front part of the striatum and through the nodules (specific structures in the foremost region of the striatum). When migration occurs, the definitive endoderm first collects in the foreground and forms the posterior end of the intestine.

胚体内胚葉及びそれに由来する内胚葉細胞は、胚体内胚葉系統由来の最終的分化組織及び／又は器官を構成する細胞の誘導のための重要な多分化能出発点を表す。このような細胞、組織及び／又は器官は、細胞療法に非常に有用である。上首尾の細胞療法用途のためには多数の細胞が通常必要であるため、単一細胞型の多数の細胞を用いて分化手順を開始することが有益である。培養中の胚性幹細胞は胚体内胚葉に分化する場合、すべての胚性幹細胞が胚体内胚葉細胞型に転換されるというわけではない。この問題を克服するために、混合細胞培養物中で増殖中の胚体内胚葉細胞は、本明細書中に記載される方法を用いて、富化され、単離され及び／又は精製され得る。このような富化、単離及び／又は精製後、その結果生じた胚体内胚葉細胞は培養で増殖することが容易でないかもしれない。本明細書中に記載される方法は、富化、単離及び／又は精製された胚体内胚葉細胞が細胞培養物中で増殖(grow)及び増殖(expand)する能力を改良する。胚体内胚葉細胞はここで、富化、単離及び／又は精製後に培養で増殖され得るため、胚体内胚葉細胞由来の細胞、組織及び／又は器官がより多数産生され得る。   Definitive endoderm and endoderm cells derived therefrom represent an important multipotent starting point for the induction of cells that make up the final differentiated tissues and / or organs derived from the definitive endoderm lineage. Such cells, tissues and / or organs are very useful for cell therapy. Since a large number of cells are usually required for successful cell therapy applications, it is beneficial to initiate the differentiation procedure with a large number of cells of a single cell type. When embryonic stem cells in culture differentiate into definitive endoderm, not all embryonic stem cells are converted to definitive endoderm cell types. To overcome this problem, definitive endoderm cells growing in mixed cell cultures can be enriched, isolated and / or purified using the methods described herein. After such enrichment, isolation and / or purification, the resulting definitive endoderm cells may not be easy to grow in culture. The methods described herein improve the ability of enriched, isolated and / or purified definitive endoderm cells to grow and expand in cell culture. Since definitive endoderm cells can now be expanded in culture after enrichment, isolation and / or purification, more cells, tissues and / or organs derived from definitive endoderm cells can be produced.

本発明のいくつかの実施形態は、細胞培養物中で胚体内胚葉細胞を増殖する方法に関する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、混合細胞培養物中の他の細胞からこれ
らの細胞を分離することにより富化される。富化された胚体内胚葉細胞は次に、それらの増殖を可能にする条件下で培養される。 Some embodiments of the invention relate to methods of growing definitive endoderm cells in cell culture. In some embodiments, definitive endoderm cells are enriched by separating these cells from other cells in the mixed cell culture. Enriched definitive endoderm cells are then cultured under conditions that allow their growth.

定義
本出願全体を通して用いられるような或る特定のいくつかの用語及び語句は、以下のように提示される意味を有する： Definitions Certain terms and phrases as used throughout this application have the meanings presented as follows:

本明細書中で用いる場合、「胚性」とは、単一接合子で開始し、発生した配偶子細胞以外の多能性又は全能性細胞をもはや含まない多細胞構造で終わる生物体の一連の発生段階を指す。配偶子融合により得られる胚のほかに、「胚性」という用語は、体細胞核移行により得られる胚を指す。   As used herein, “embryonic” refers to a series of organisms that begin with a single zygote and end with a multicellular structure that no longer contains pluripotent or totipotent cells other than the generated gamete cells. Refers to the stage of occurrence. In addition to embryos obtained by gamete fusion, the term “embryonic” refers to embryos obtained by somatic cell nuclear transfer.

本明細書中で用いる場合、「多分化能」又は「多分化能細胞」は、限られた数の他の特定の細胞型を生じ得る細胞型を指す。   As used herein, “multipotent” or “multipotent cell” refers to a cell type that can give rise to a limited number of other specific cell types.

本明細書中で用いる場合、「発現」とは、材料又は物質の産生、並びに材料又は物質の産生のレベル又は量を指す。したがって特定マーカーの発現の確定は、発現されるマーカーの相対量又は絶対量の検出、或いは単にマーカーの存在又は非存在の検出を指す。   As used herein, “expression” refers to the production of a material or substance, as well as the level or amount of production of the material or substance. Thus, determining the expression of a particular marker refers to detecting the relative or absolute amount of the marker expressed, or simply detecting the presence or absence of the marker.

本明細書中で用いる場合、「マーカー」とは、観察され得るか又は検出され得る任意の分子を指す。例えばマーカーとしては、核酸、例えば特定遺伝子の転写物、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質又は低分子（例えば１００００ａｍｕ未満の分子量を有する分子）が挙げられるが、これらに限定されない。   As used herein, “marker” refers to any molecule that can be observed or detected. For example, markers include nucleic acids such as transcripts of specific genes, polypeptide products of genes, non-gene product polypeptides, glycoproteins, carbohydrates, glycolipids, lipids, lipoproteins or small molecules (eg, molecules having a molecular weight of less than 10,000 amu) ), But is not limited thereto.

細胞培養物及び／又は細胞集団に関連して用いられる場合、「一部分」という用語は、単一細胞から細胞培養物又は細胞集団の全体までの範囲である任意のゼロでない量の細胞培養物又は細胞集団を意味する。   The term “portion” when used in connection with a cell culture and / or cell population is any non-zero amount of cell culture or range from a single cell to the entire cell culture or cell population. Refers to a cell population.

細胞培養物中又は細胞集団中の細胞に関して、「〜を実質的に含有しない」という語句は、細胞培養物又は細胞集団を含有しない特定細胞型が、細胞培養物又は細胞集団中に存在する細胞の総数の約５％未満の量で存在する、ということを意味する。   With respect to cells in a cell culture or cell population, the phrase “substantially free of” means that a particular cell type that does not contain a cell culture or cell population is present in the cell culture or cell population. Is present in an amount less than about 5% of the total number of

細胞培地に関して、本明細書中で用いる場合、「低血清ＲＰＭＩ」は、所定の時間中に血清濃度が徐々に増大される低血清含有培地を指す。例えば一実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、細胞増殖第１日目に約０．２％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、細胞増殖第２日目に約０．５％ＦＢＳ、そして細胞増殖の第３〜５日目に約２％のＦＢＳの濃度を含む。別の実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、１日目に約０％、２日目に約０．２％、そして３日目及びその後日に約２％の濃度を含む。   With respect to cell culture media, as used herein, “low serum RPMI” refers to low serum-containing media in which the serum concentration is gradually increased during a given time. For example, in one embodiment, low serum RPMI is about 0.2% fetal bovine serum (FBS) on day 1 of cell growth, about 0.5% FBS on day 2 of cell growth, and On days 3-5, it contains a concentration of about 2% FBS. In another embodiment, the low serum RPMI comprises a concentration of about 0% on day 1, about 0.2% on day 2, and about 2% on day 3 and on subsequent days.

本明細書中で用いる場合、「ｂＦＧＦ」及び「ＦＧＦ２」という用語は、互換的に用いられる。   As used herein, the terms “bFGF” and “FGF2” are used interchangeably.

胚体内胚葉細胞及びそれらに関連するプロセス
本明細書中に記載する実施形態は、幹細胞のような多能性細胞を、多分化能胚体内胚葉細胞へ分化させることにより培養で胚体内胚葉細胞を産生するための新規の所定のプロセスに関する。上述したように、胚体内胚葉細胞は、外胚葉又は中胚葉から産生される組織へ分化するのではなく、腸管並びに腸管に由来する器官へ分化する。或る特定の好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ｈＥＳＣに由来する。かかるプロセスは、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺及び胸腺のような組織に由来するヒト内胚葉の効率的な産生に関す
る基盤を提供することができる。例えば、胚体内胚葉の産生は、機能的インスリン生産β細胞への幹細胞の分化における第１の工程であり得る。有用な量のインスリン生産β細胞を得るためには、膵臓島／β細胞運命(fate)に到達する前に起きる分化工程のそれぞれに関して、高効率の分化が望まれる。胚体内胚葉細胞への幹細胞の分化は、機能的膵臓島／β細胞の産生に対しておそらく一番初めの工程を表す（図１に示されるように）ため、この工程での高効率の分化が特に望まれる。 Definitive endoderm cells and processes associated therewith Embodiments described herein can be used to differentiate definitive endoderm cells in culture by differentiating pluripotent cells, such as stem cells, into multipotent definitive endoderm cells. It relates to a new predetermined process for producing. As described above, definitive endoderm cells do not differentiate into tissues produced from ectoderm or mesoderm, but differentiate into intestinal tract and organs derived from the intestinal tract. In certain preferred embodiments, the definitive endoderm cells are derived from hESC. Such a process can provide the basis for the efficient production of human endoderm from tissues such as pancreas, liver, lung, stomach, intestine, thyroid and thymus. For example, the production of definitive endoderm may be the first step in the differentiation of stem cells into functional insulin-producing β cells. In order to obtain useful amounts of insulin-producing β cells, high efficiency differentiation is desired for each of the differentiation steps that occur before reaching pancreatic islet / β cell fate. Differentiation of stem cells into definitive endoderm cells probably represents the very first step for the production of functional pancreatic islets / β cells (as shown in FIG. 1), so high efficiency differentiation in this step Is particularly desirable.

胚体内胚葉細胞への多能性細胞の効率的分化の望ましさに鑑みて、本明細書中に記載される分化プロセスのいくつかの態様は、胚体内胚葉細胞への多能性細胞の約５０〜８０％の転換を生じるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。典型的には、このような方法は、所定の且つ一時的に特定化された様式での培養及び成長因子条件の適用を包含する。胚体内胚葉細胞に関する細胞集団のさらなる富化は、胚体内胚葉細胞と特異的に結合する試薬を用いることにより、集団中の他の細胞からの胚体内胚葉細胞の単離及び／又は精製により達成され得る。したがって、本明細書において記載されるいくつかの実施形態は、胚体内胚葉細胞並びにこのような細胞を産生するための方法及び単離するための方法及び／又は精製するための方法に関する。   In view of the desirability of efficient differentiation of pluripotent cells into definitive endoderm cells, some aspects of the differentiation process described herein may include about the pluripotent cells into definitive endoderm cells. It relates to in vitro methods that produce 50-80% conversion. Typically, such methods involve the application of culture and growth factor conditions in a predetermined and temporarily specified manner. Further enrichment of the cell population for definitive endoderm cells is achieved by isolation and / or purification of definitive endoderm cells from other cells in the population by using reagents that specifically bind to definitive endoderm cells. Can be done. Accordingly, some embodiments described herein relate to definitive endoderm cells and methods for producing and isolating and / or purifying such cells.

細胞培養物又は細胞集団中の胚体内胚葉細胞の量を確定するためには、培養物中又は集団中の他の細胞からこの細胞型を区別する方法が望ましい。したがって、本明細書中に記載される或る特定の実施形態は、その存在、非存在及び／又は相対発現レベルが胚体内胚葉に特異的である細胞マーカー、並びにこのようなマーカーの発現を検出し、確定するための方法に関する。   In order to determine the amount of definitive endoderm cells in a cell culture or cell population, a method of distinguishing this cell type from other cells in the culture or population is desirable. Accordingly, certain embodiments described herein detect cell markers whose presence, absence and / or relative expression levels are specific for definitive endoderm, and expression of such markers. And a method for confirming.

本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、マーカーの存在、非存在及び／又は発現レベルは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により確定される。例えば或る特定の遺伝子マーカー、例えばＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１、ＣＲＩＰ１、並びに本明細書中に記載される他のマーカーにより産生される転写物の量が、定量的Ｑ−ＰＣＲにより確定される。他の実施形態では、免疫組織化学を用いて、上記遺伝子により発現されるタンパク質を検出する。さらに他の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫組織化学的技法が、このようなマーカーの量又は相対的な比率を同定すると共に確定するために用いられる。   In some embodiments described herein, the presence, absence and / or expression level of the marker is determined by quantitative PCR (Q-PCR). For example, certain genetic markers such as SOX17, CXCR4, OCT4, AFP, TM, SPARC, SOX7, MIXL1, GATA4, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1, CRIP1, and as described herein The amount of transcript produced by the other markers to be determined is determined by quantitative Q-PCR. In other embodiments, immunohistochemistry is used to detect proteins expressed by the gene. In yet other embodiments, Q-PCR and immunohistochemical techniques are used to identify and determine the amount or relative ratio of such markers.

１つ又は複数の適切なマーカーの発現を確定するための上述に記載したような方法を使用することにより、胚体内胚葉細胞を同定すること、並びに細胞培養物又は細胞集団における胚体内胚葉細胞の比率を確定することが可能である。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、産生される胚体内胚葉細胞又は細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型又は細胞集団よりも約２桁大きいレベルでＳＯＸ１７及び／又はＣＸＣＲ４遺伝子を発現する。他の実施形態では、産生される胚体内胚葉細胞又は細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型又は細胞集団よりも２桁を超えるレベルでＳＯＸ１７及び／又はＣＸＣＲ４遺伝子を発現する。さらに他の実施形態では、産生される胚体内胚葉細胞又は細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型又は細胞集団よりも約２桁以上大きいレベルでＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択されるマーカーの１つ又は複数を発現する。本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１を実質的に発現しない。   Identifying definitive endoderm cells by using a method as described above for determining the expression of one or more suitable markers, and identifying definitive endoderm cells in a cell culture or cell population It is possible to determine the ratio. For example, in some embodiments of the invention, the definitive endoderm cells or cell population produced express SOX17 and / or CXCR4 genes at a level about 2 orders of magnitude greater than non-definitive endoderm cell types or cell populations. . In other embodiments, the definitive endoderm cells or cell populations that are produced express the SOX17 and / or CXCR4 gene at a level that is more than two orders of magnitude higher than non-definitive endoderm cell types or cell populations. In still other embodiments, the definitive endoderm cells or cell populations produced are at least about two orders of magnitude greater than non-definitive endoderm cell types or cell populations, SOX17, CXCR4, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1. Expresses one or more of the markers selected from the group consisting of CMKOR1 and CRIP1. In some embodiments described herein, the definitive endoderm cells do not substantially express PDX1.

本明細書中に記載される実施形態は、胚体内胚葉組成物にも関する。例えばいくつかの実施形態は胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に関するが、一方、他の実施形態は、胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団に関する。いくつかの好ましい実施形態は、培養中の細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に関す
る。特に好ましい実施形態は、培養中のヒト細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞であるヒト細胞を含む細胞培養物に関する。分化手順の効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞成長条件、成長因子濃度及び培養工程の時期（これらに限定されない）を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手順は、胚体内胚葉細胞への多能性細胞の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９５％より多い転換を生じ得る。他の好ましい実施形態では、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団への多能性細胞集団、例えば幹細胞集団の転換が意図される。 The embodiments described herein also relate to definitive endoderm compositions. For example, some embodiments relate to cell cultures comprising definitive endoderm cells, while other embodiments relate to cell populations enriched in definitive endoderm cells. Some preferred embodiments relate to cell cultures comprising definitive endoderm cells, wherein at least about 50-80% of the cells in culture are definitive endoderm cells. Particularly preferred embodiments relate to cell cultures comprising human cells in which at least about 50-80% of the human cells in culture are definitive endoderm cells. Since the efficiency of the differentiation procedure can be adjusted by modifying certain parameters such as, but not limited to, cell growth conditions, growth factor concentrations, and the timing of the culture process, the differentiation described herein. The procedure includes about 5%, about 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about 30%, about 35%, about 40%, about 45% of pluripotent cells into definitive endoderm cells, More than about 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, or more than about 95% conversion can occur. . In other preferred embodiments, conversion of a pluripotent cell population, such as a stem cell population, to a substantially pure definitive endoderm cell population is contemplated.

本明細書中に記載される組成物及び方法は、いくつかの有用な特徴を有する。例えば胚体内胚葉を含む細胞培養物及び細胞集団、並びにこのような細胞培養物及び細胞集団を産生する方法は、ヒト発生の初期をモデリングするのに有用である。さらに、本明細書中に記載される組成物及び方法は、疾患状態、例えば真性糖尿病における治療的介入にも役立ち得る。例えば胚体内胚葉は限られた数のみの組織のための供給源として役立つため、それは純粋組織又は細胞型の発生に用いられ得る。   The compositions and methods described herein have several useful features. For example, cell cultures and cell populations containing definitive endoderm and methods for producing such cell cultures and cell populations are useful for modeling the early stages of human development. Furthermore, the compositions and methods described herein can also be useful for therapeutic intervention in disease states such as diabetes mellitus. For example, because the definitive endoderm serves as a source for only a limited number of tissues, it can be used for the development of pure tissues or cell types.

多能性細胞からの胚体内胚葉の産生
胚体内胚葉を含む細胞培養物及び富化された細胞集団を産生するように多能性細胞を分化させるプロセスは、以下に、また米国特許第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉」２００４年１２月２３日出願）に記載されている。その開示は、参照により本明細書に全体が援用される。これらのプロセスのいくつかでは、出発材料として使用される多能性細胞は、幹細胞である。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉細胞を含む胚体内胚葉細胞培養物及び富化された細胞集団は、胚性幹細胞から産生される。胚体内胚葉細胞を派生させる好ましい方法は、胚体内胚葉産生のための出発材料として、ヒト胚性幹細胞を利用することである。かかる多能性細胞は、桑実胚に由来する細胞、胚の内部細胞塊又は胚の生殖腺***に由来する細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して、実質的な分化なしで多能性状態で培養物中に維持されることができる。かかる方法は、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、同第５，６７０，３７２号、同第５，６９０，９２６号、同第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号及び同第６，２５１，６７１号に記載されている。これらの開示は参照により本明細書に全体が援用される。 Production of definitive endoderm from pluripotent cells The process of differentiating pluripotent cells to produce a cell culture containing the definitive endoderm and an enriched cell population is described below and also in US No. 021,618 (titled “definitive endoderm” filed December 23, 2004). The disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety. In some of these processes, the pluripotent cells used as starting material are stem cells. In certain processes, definitive endoderm cell cultures and enriched cell populations comprising definitive endoderm cells are produced from embryonic stem cells. A preferred method of deriving definitive endoderm cells is to utilize human embryonic stem cells as starting material for definitive endoderm production. Such pluripotent cells can be cells derived from morulae, inner cell mass of embryos or cells derived from gonad protuberances of embryos. Human embryonic stem cells can be maintained in culture in a pluripotent state without substantial differentiation using methods known in the art. Such methods include, for example, U.S. Pat. Nos. 5,453,357, 5,670,372, 5,690,926, 5,843,780, and 6,200,806. And in US Pat. No. 6,251,671. These disclosures are incorporated herein by reference in their entirety.

胚体内胚葉細胞を産生するためのいくつかのプロセスにおいて、ｈＥＳＣは、フィーダー層上に維持される。このようなプロセスでは、ｈＥＳＣを多能性状態に維持させる任意のフィーダー層が用いられ得る。ヒト胚性幹細胞を培養するために一般的に用いられる１つのフィーダー層は、マウス線維芽細胞の層である。さらに近年、ヒト線維芽細胞フィーダー層が、ｈＥＳＣの培養に用いるために開発された（その開示は参照により本明細書に全体が援用される、米国特許出願第２００２／００７２１１７号参照）。胚体内胚葉を産生するための代替的プロセスは、フィーダー層の使用を伴わずに多能性ｈＥＳＣの維持を可能にする。フィーダーを使用しない条件下での多能性ｈＥＳＣの維持方法は、米国特許出願第２００３／０１７５９５６号に記載されている。その開示は参照により本明細書に全体が援用される。   In some processes for producing definitive endoderm cells, hESCs are maintained on the feeder layer. In such a process, any feeder layer that maintains the hESC in a pluripotent state can be used. One feeder layer commonly used for culturing human embryonic stem cells is a layer of mouse fibroblasts. More recently, human fibroblast feeder layers have been developed for use in culturing hESCs (the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety, see US Patent Application No. 2002/0072117). An alternative process for producing definitive endoderm allows maintenance of pluripotent hESCs without the use of a feeder layer. A method for maintaining pluripotent hESC under conditions that do not use a feeder is described in US Patent Application 2003/0175956. The disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety.

本明細書中で用いられるヒト胚性幹細胞は、血清を含有するか又は含有しない培養物中に維持され得る。いくつかの胚性幹細胞維持手順では、血清代替物が用いられる。他の場合には、無血清培養技法、例えば米国特許出願第２００３／０１９０７４８号（その開示は参照により本明細書に全体が援用される）に記載される技法が用いられる。   As used herein, human embryonic stem cells can be maintained in cultures that contain or do not contain serum. In some embryonic stem cell maintenance procedures, serum replacement is used. In other cases, serum-free culture techniques are used, such as those described in US Patent Application No. 2003/0190748, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety.

幹細胞は、それらが胚体内胚葉へ分化されることを望まれるまで、日常的な継代培養に
より多能性状態で培養で維持される。いくつかのプロセスでは、胚体内胚葉への分化は、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子を幹細胞培養物へ供給することにより達成される。胚体内胚葉の産生に有用であるＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子は、ノーダル／アクチビン又はＢＭＰサブグループから選択される。いくつかの好ましい分化プロセスでは、成長因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰ４から成る群から選択される。さらに、成長因子Ｗｎｔ３ａ及び他のＷｎｔファミリー成員は、胚体内胚葉細胞の産生に有用である。或る特定の分化プロセスでは、上述の成長因子のいずれかの組合せが使用され得る。 Stem cells are maintained in culture in a pluripotent state by routine subculture until they are desired to be differentiated into definitive endoderm. In some processes, differentiation into definitive endoderm is achieved by supplying TGFβ superfamily growth factors to the stem cell culture in an amount sufficient to promote differentiation into definitive endoderm. TGFβ superfamily growth factors useful for the production of definitive endoderm are selected from nodal / activin or BMP subgroups. In some preferred differentiation processes, the growth factor is selected from the group consisting of nodal, activin A, activin B and BMP4. In addition, growth factor Wnt3a and other Wnt family members are useful for the production of definitive endoderm cells. In certain differentiation processes, any combination of the growth factors described above can be used.

胚体内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のためのプロセスのいくつかに関しては、胚体内胚葉細胞への幹細胞の少なくとも一部分の分化を促すのに十分な濃度で成長因子が培養物中に存在するように、上記成長因子が細胞に提供される。いくつかのプロセスでは、上記成長因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で細胞培養物中に存在する。   For some of the processes for differentiation of pluripotent stem cells into definitive endoderm cells, the growth factor is present in the culture at a concentration sufficient to promote differentiation of at least a portion of the stem cells into definitive endoderm cells As such, the growth factor is provided to the cell. In some processes, the growth factor is at least about 5 ng / ml, at least about 10 ng / ml, at least about 25 ng / ml, at least about 50 ng / ml, at least about 75 ng / ml, at least about 100 ng / ml, at least about 200 ng. / Ml, at least about 300 ng / ml, at least about 400 ng / ml, at least about 500 ng / ml, at least about 1000 ng / ml, at least about 2000 ng / ml, at least about 3000 ng / ml, at least about 4000 ng / ml, at least about 5000 ng / ml Or present in the cell culture at a concentration greater than about 5000 ng / ml.

胚体内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のための或る特定のプロセスでは、上記の成長因子は、それらの付加後、細胞培養物から除去される。例えば成長因子は、それらの付加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、又は約１０日以内に除去され得る。好ましいプロセスでは、成長因子は、それらの付加後約４日で除去される。   In certain processes for the differentiation of pluripotent stem cells into definitive endoderm cells, the growth factors described above are removed from the cell culture after their addition. For example, the growth factors may be about 1 day, about 2 days, about 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days, about 9 days, or about 10 days after their addition. Can be removed within. In a preferred process, growth factors are removed about 4 days after their addition.

胚体内胚葉細胞の培養物は、低血清又は無血清を含有する培地中で増殖され得る。或る特定の培養条件下では、血清濃度は約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えばいくつかの分化プロセスでは、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、又は約１５％（ｖ／ｖ）未満又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。いくつかのプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、血清を用いずに、又は血清代替物を用いて増殖される。さらに他のプロセスでは、胚体内胚葉細胞はＢ２７の存在下で増殖される。このようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。   A culture of definitive endoderm cells can be grown in a medium containing low serum or serum free. Under certain culture conditions, the serum concentration can range from about 0.05% (v / v) to about 20% (v / v). For example, in some differentiation processes, the serum concentration of the medium is less than about 0.05% (v / v), less than about 0.1% (v / v), less than about 0.2% (v / v), Less than about 0.3% (v / v), less than about 0.4% (v / v), less than about 0.5% (v / v), less than about 0.6% (v / v), about 0 Less than 7% (v / v), less than about 0.8% (v / v), less than about 0.9% (v / v), less than about 1% (v / v), about 2% (v / v) v), less than about 3% (v / v), less than about 4% (v / v), less than about 5% (v / v), less than about 6% (v / v), about 7% (v / v) v), less than about 8% (v / v), less than about 9% (v / v), less than about 10% (v / v), or less than about 15% (v / v) or about 20% (v / V). In some processes, definitive endoderm cells are grown without serum or with serum replacement. In yet another process, definitive endoderm cells are grown in the presence of B27. In such a process, the concentration of B27 supplement can range from about 0.1% (v / v) to about 20% (v / v).

胚体内胚葉への多能性細胞の分化のモニタリング
胚体内胚葉へのｈＥＳＣ培養物の進行は、胚体内胚葉に特徴的なマーカーの発現を確定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより確定される。或いは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより確定され得る。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。マーカー遺伝子により産生されるマーカーの発現を定量する一方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の使用による。Ｑ−ＰＣＲを実施する方法は、当該技術分野で既知である。当該技術分野で既知である他の方法も、マーカー遺伝子発現を定
量するために用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、目的のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにｈＥＳＣ及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意の発現の欠如が確定される。 Monitoring the differentiation of pluripotent cells into definitive endoderm Progress of hESC cultures into definitive endoderm can be monitored by determining the expression of markers characteristic of definitive endoderm. In some processes, the expression of certain markers is determined by detecting the presence or absence of the marker. Alternatively, the expression of certain markers can be determined by measuring the level at which the marker is present in the cells of the cell culture or cell population. In such a process, the measurement of marker expression can be qualitative or quantitative. One method for quantifying the expression of a marker produced by a marker gene is by use of quantitative PCR (Q-PCR). Methods for performing Q-PCR are known in the art. Other methods known in the art can also be used to quantify marker gene expression. For example, the expression of a marker gene product can be detected by using an antibody specific for the marker gene product of interest. In certain processes, the expression of marker genes characteristic of definitive endoderm and the lack of significant expression of marker genes characteristic of hESC and other cell types is determined.

以下の実施例でさらに記載するように、胚体内胚葉の信頼性の大きいマーカーは、ＳＯＸ１７遺伝子である。したがって、本明細書中に記載するプロセスにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現し、それによりＳＯＸ１７遺伝子産物を産生する。胚体内胚葉の他のマーカーは、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１である。胚体内胚葉細胞は、原始内胚葉及び臓側内胚葉に特徴的であるＳＯＸ７マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現する（表１を参照）ため、いくつかのプロセスでは、ＳＯＸ１７及びＳＯＸ７の両方の発現がモニタリングされる。他のプロセスでは、ｈＥＳＣに特徴的であるＳＯＸ１７マーカー遺伝子及びＯＣＴ４マーカー遺伝子の両方の発現がモニタリングされる。さらに、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ又はトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現するため、これらの遺伝子の発現もまたモニタリングされ得る。   As described further in the examples below, a reliable marker of definitive endoderm is the SOX17 gene. Thus, definitive endoderm cells produced by the processes described herein express the SOX17 marker gene, thereby producing the SOX17 gene product. Other markers of definitive endoderm are MIXL1, GATA4, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 and CRIP1. Since definitive endoderm cells express the SOX17 marker gene at a level higher than that of the SOX7 marker gene that is characteristic of primitive and visceral endoderm (see Table 1), in some processes SOX17 And SOX7 expression is monitored. In other processes, the expression of both the SOX17 marker gene and the OCT4 marker gene that are characteristic of hESC is monitored. In addition, since definitive endoderm cells express SOX17 marker genes at levels higher than those of AFP, SPARC or thrombomodulin (TM) marker genes, the expression of these genes can also be monitored.

胚体内胚葉の別のマーカーは、ＣＸＣＲ４遺伝子である。ＣＸＣＲ４遺伝子は、細胞表面ケモカイン受容体をコードし、そのリガンドは、化学誘引物質ＳＤＦ−１である。成体におけるＣＸＣＲ４受容体保有細胞の主要な役割は、骨髄への造血細胞の遊走、リンパ球輸送並びに様々なＢ細胞及びマクロファージ血液細胞系統の分化であると考えられる［Kim, C., and Broxmeyer, H.J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)］。ＣＸＣＲ４受容体はまた、Ｔ細胞へのＨＩＶ−１の進入のための共受容体として機能する［Feng, Y., et al.
Science, 272, 872-877 (1996)］。［McGrath, K.E. et al. Dev. Biology 213, 442-456 (1999)］により実施された広範囲の一連の研究では、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４及びその特有のリガンドであるＳＤＦ−１［Kim, C., and Broxmyer, H., J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)］の発現は、マウスにおいて初期発生及び成体期中に描写された。発生におけるＣＸＣＲ４／ＳＤＦ１相互作用は、いずれかの遺伝子がトランスジェニックマウスで破壊される［Nagasawa et al. Nature, 382, 635-638 (1996), Ma, Q., et al Immunmity, 10, 463-471 (1999)］場合、それが後期胚性致死をもたらしたことが実証された際に明らかとなった。McGrath他は、ＣＸＣＲ４は、RNA分解酵素保護及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成方法論の組合せを使用して初期原腸陥入胚（Ｅ７．５）中に検出される最も豊富なケモカイン受容体メッセンジャーＲＮＡであることを実証した。原腸陥入胚では、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１シグナル伝達は、原始線条胚葉細胞の遊走を誘導することに主に関与するようであり、この時期に存在する胚体内胚葉、中胚葉及び胚体外中胚葉上で発現される。Ｅ７．２−７．８マウス胚では、ＣＸＣＲ４及びα−フェトプロテインは、相互排他的であり、臓側内胚葉における発現の欠如を示している［McGrath, K.E. et al.
Dev. Biology 213, 442-456 (1999)］。 Another marker for definitive endoderm is the CXCR4 gene. The CXCR4 gene encodes a cell surface chemokine receptor whose ligand is the chemoattractant SDF-1. The major role of CXCR4 receptor-bearing cells in adults is thought to be hematopoietic cell migration to the bone marrow, lymphocyte transport, and differentiation of various B cells and macrophage blood cell lineages [Kim, C., and Broxmeyer, HJ Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)]. The CXCR4 receptor also functions as a co-receptor for HIV-1 entry into T cells [Feng, Y., et al.
Science, 272, 872-877 (1996)]. [McGrath, KE et al. Dev. Biology 213, 442-456 (1999)] has conducted a series of studies in which the chemokine receptor CXCR4 and its unique ligand, SDF-1 [Kim, C., and Broxmyer, H., J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)] was expressed during early development and adulthood in mice. The CXCR4 / SDF1 interaction in development is either gene disrupted in transgenic mice [Nagasawa et al. Nature, 382, 635-638 (1996), Ma, Q., et al Immunmity, 10, 463- 471 (1999)] was revealed when it was demonstrated that it resulted in late embryonic lethality. McGrath et al., CXCR4 is the most abundant chemokine receptor messenger RNA detected in early gastrulation embryos (E7.5) using a combination of RNase protection and in situ hybridization methodology Proved. In gastrulation embryos, CXCR4 / SDF-1 signaling appears to be primarily involved in inducing primitive streak germ cell migration, and the definitive endoderm, mesoderm and extraembryonic bodies present at this time It is expressed on the mesoderm. In E7.2-7.8 mouse embryos, CXCR4 and α-fetoprotein are mutually exclusive, indicating lack of expression in visceral endoderm [McGrath, KE et al.
Dev. Biology 213, 442-456 (1999)].

多能性細胞を分化させることにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、胚体内胚葉細胞の産生を追跡するために、ＣＸＣＲ４の発現をモニタリングすることができる。さらに、本明細書中に記載する方法により産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１を包含するが、これらに限定されない胚体内胚葉の他のマーカーを発現する。胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ７マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ７の両方の発現がモニタリングされ得る。他のプロセスでは、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子及びＯＣＴ４マーカー遺伝子の両方の発現がモニタリングされる。さら
に、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ又はトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、これらの遺伝子の発現もまたモニタリングされ得る。 Since definitive endoderm cells produced by differentiating pluripotent cells express the CXCR4 marker gene, the expression of CXCR4 can be monitored to follow the production of definitive endoderm cells. Further, definitive endoderm cells produced by the methods described herein include, but are not limited to, SOX17, MIXL1, GATA4, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 and CRIP1. Expresses other markers of definitive endoderm. Since definitive endoderm cells express the CXCR4 marker gene at a level higher than that of the SOX7 marker gene, the expression of both CXCR4 and SOX7 can be monitored. In other processes, the expression of both CXCR4 and OCT4 marker genes is monitored. Furthermore, since definitive endoderm cells express CXCR4 marker genes at levels higher than those of AFP, SPARC or thrombomodulin (TM) marker genes, the expression of these genes can also be monitored.

内胚葉細胞におけるＣＸＣＲ４の発現は、ＳＯＸ１７の発現を妨げないことが理解されよう。したがって、本明細書中に記載するプロセスにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４を大いに発現するが、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ又はＰＤＸ１を大いには発現するものではない。   It will be appreciated that CXCR4 expression in endoderm cells does not interfere with SOX17 expression. Thus, definitive endoderm cells produced by the processes described herein greatly express SOX17 and CXCR4, but not AFP, TM, SPARC or PDX1.

ＳＯＸ１７及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、分化条件に応じて、胚体内胚葉細胞において多種多様なレベルにわたって誘導されることが理解されよう。したがって、本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団（例えば、多能性幹細胞）におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現よりも少なくとも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍高い。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団（例えば、多能性幹細胞）におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現よりも、少なくとも約４倍高いか、少なくとも約６倍高いか、少なくとも約８倍高いか、少なくとも約１０倍高いか、少なくとも約１５倍高いか、少なくとも約２０倍高いか、少なくとも約４０倍高いか、少なくとも約８０倍高いか、少なくとも約１００倍高いか、少なくとも約１５０倍高いか、少なくとも約２００倍高いか、少なくとも約５００倍高いか、少なくとも約７５０倍高いか、少なくとも約１０００倍高いか、少なくとも約２５００倍高いか、少なくとも約５０００倍高いか、少なくとも約７５００倍高いか、或いは少なくとも約１００００倍高い。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団（例えば、多能性幹細胞）におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現よりも飛躍的に高い。   It will be appreciated that the expression of SOX17 and / or CXCR4 markers is induced across a wide variety of levels in definitive endoderm cells, depending on the differentiation conditions. Thus, in some embodiments described herein, the expression of a SOX17 marker and / or CXCR4 marker in a definitive endoderm cell or cell population is a non-definitive endoderm cell or cell population (eg, a pluripotent stem cell). ) At least about 2-fold to at least about 10,000-fold higher than the expression of the SOX17 marker and / or CXCR4 marker. In other embodiments, the expression of a SOX17 marker and / or CXCR4 marker in a definitive endoderm cell or cell population is the expression of a SOX17 marker and / or a CXCR4 marker in a non-definitive endoderm cell or cell population (eg, a pluripotent stem cell). At least about 4 times higher, at least about 6 times higher, at least about 8 times higher, at least about 10 times higher, at least about 15 times higher, at least about 20 times higher, or at least about 40 times higher than expression High, at least about 80 times higher, at least about 100 times higher, at least about 150 times higher, at least about 200 times higher, at least about 500 times higher, at least about 750 times higher, or at least about 1000 times higher Or at least about 2500 times higher, at least about 5000 times higher or less Even or about 7500-fold higher, or at least about 10,000 times higher. In some embodiments, expression of a SOX17 marker and / or CXCR4 marker in a definitive endoderm cell or cell population is a SOX17 marker and / or a CXCR4 marker in a non-definitive endoderm cell or cell population (eg, a pluripotent stem cell). Is significantly higher than the expression of.

同様に、本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択されるマーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現と比較して増大されていることが理解されよう。   Similarly, in some embodiments described herein, selected from the group consisting of GATA4, MIXL1, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 and CRIP1 in definitive endoderm cells or cell populations. It will be appreciated that the expression of such markers is increased compared to the expression of GATA4, MIXL1, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 and CRIP1 in non-definitive endoderm cells or cell populations.

さらに、胚体内胚葉細胞中でのＳＯＸ１７マーカーの発現レベルと、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現レベルとの間に或る範囲の差が存在することが理解されよう。同様に、胚体内胚葉細胞中でのＣＸＣＲ４マーカーの発現レベルと、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現レベルとの間に或る範囲の差が存在する。したがって、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現より少なくとも約２倍〜少なくとも約１００００倍高い。他の実施形態では、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現レベルより少なくとも約４倍高い、少なくとも約６倍高い、少なくとも約８倍高い、少なくとも約１０倍高い、少なくとも約１５倍高い、少なくとも約２０倍高い、少なくとも約４０倍高い、少なくとも約８０倍高い、少なくとも約１００倍高い、少なくとも約１５０倍高い、少なくとも約２００倍高い、少なくとも約５００倍高い、少なくとも約７５０倍高い、少なくとも約１０００倍高い、少なくとも約２５００倍高い、少なくとも約５０００倍高い、少なくとも約７５００倍高いか又は少なくとも約１００００倍高い。いくつかの実施形
態では、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーは、胚体内胚葉細胞中で有意に発現されない。 Furthermore, it will be appreciated that there is a range of differences between the expression levels of SOX17 markers in definitive endoderm cells and the expression levels of OCT4, SPARC, AFP, TM and / or SOX7 markers. Similarly, there is a range of differences between the expression levels of CXCR4 markers in definitive endoderm cells and the expression levels of OCT4, SPARC, AFP, TM and / or SOX7 markers. Thus, in some embodiments described herein, expression of a SOX17 marker or CXCR4 marker is at least about 2-fold to at least about 10000-fold that of an OCT4, SPARC, AFP, TM and / or SOX7 marker. high. In other embodiments, the expression of the SOX17 marker or the CXCR4 marker is at least about 4 times higher, at least about 6 times higher, at least about 8 times higher than the expression level of the OCT4, SPARC, AFP, TM and / or SOX7 markers, at least About 10 times higher, at least about 15 times higher, at least about 20 times higher, at least about 40 times higher, at least about 80 times higher, at least about 100 times higher, at least about 150 times higher, at least about 200 times higher, at least about 500 2 times higher, at least about 750 times higher, at least about 1000 times higher, at least about 2500 times higher, at least about 5000 times higher, at least about 7500 times higher, or at least about 10000 times higher. In some embodiments, OCT4, SPARC, AFP, TM and / or SOX7 markers are not significantly expressed in definitive endoderm cells.

本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択されるマーカーの発現は、胚体内胚葉細胞におけるＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７の発現と比較して増大されていることが理解されよう。   In some embodiments described herein, the expression of a marker selected from the group consisting of GATA4, MIXL1, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 and CRIP1 in definitive endoderm cells is It will be appreciated that there is an increase compared to the expression of OCT4, SPARC, AFP, TM and / or SOX7 in definitive endoderm cells.

胚体内胚葉の富化、単離及び／又は精製
上述のプロセスのいずれかにより産生される胚体内胚葉細胞は、かかる細胞に特異的である親和性タグを使用することにより、富化、単離及び／又は精製することができる。胚体内胚葉細胞に特異的な親和性タグの例は、胚体内胚葉細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書中に記載する方法により産生される細胞培養物中に見出されるであろう他の細胞型上には実質的に存在しないマーカー分子（例えば、ポリペプチド）に特異的である抗体、リガンド又は他の結合剤である。いくつかのプロセスでは、ＣＸＣＲ４に結合する抗体は、胚体内胚葉細胞の富化、単離又は精製用の親和性タグとして使用される。他のプロセスでは、ケモカインＳＤＦ−１又はＳＤＦ−１に基づく他の分子もまた、親和性タグとして使用され得る。かかる分子としては、ＳＤＦ−１フラグメント、ＳＤＦ−１融合体又はＳＤＦ−１模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。 Enrichment, isolation and / or purification of definitive endoderm The definitive endoderm cells produced by any of the processes described above are enriched, isolated by using an affinity tag that is specific for such cells. And / or can be purified. An example of an affinity tag specific for definitive endoderm cells is present on the cell surface of definitive endoderm cells but will be found in cell cultures produced by the methods described herein. An antibody, ligand or other binding agent that is specific for a marker molecule (eg, a polypeptide) that is substantially absent from other cell types. In some processes, antibodies that bind to CXCR4 are used as affinity tags for enrichment, isolation or purification of definitive endoderm cells. In other processes, the chemokine SDF-1 or other molecules based on SDF-1 can also be used as affinity tags. Such molecules include, but are not limited to, SDF-1 fragments, SDF-1 fusions or SDF-1 mimetics.

抗体を作製し、また細胞単離のためにそれらを使用する方法は当該技術分野で既知であり、かかる方法は、本明細書中に記載する抗体及び胚体内胚葉細胞を用いた使用に実施することができる。一プロセスでは、ＣＸＣＲ４に結合する抗体を磁気ビーズへ結合させた後、細胞間接着及び基材接着を低減させるように酵素的に処理した細胞培養物中の胚体内胚葉細胞へ結合させる。続いて、ビーズ結合された胚体内胚葉細胞と未結合細胞を分離するのに使用される可動性磁界へ細胞／抗体／ビーズ複合体を暴露させる。胚体内胚葉細胞が培養中の他の細胞と物理的に分離されると、抗体結合は妨げられて、細胞は、適切な組織培養培地中で再度プレーティングされる。   Methods for making antibodies and using them for cell isolation are known in the art, and such methods are practiced for use with the antibodies and definitive endoderm cells described herein. be able to. In one process, an antibody that binds CXCR4 is bound to magnetic beads and then bound to definitive endoderm cells in a cell culture that has been enzymatically treated to reduce cell-cell and substrate adhesion. Subsequently, the cell / antibody / bead complex is exposed to a mobile magnetic field used to separate bead-bound definitive endoderm cells and unbound cells. When definitive endoderm cells are physically separated from other cells in culture, antibody binding is prevented and the cells are re-plated in an appropriate tissue culture medium.

富化、単離又は精製された胚体内胚葉細胞培養物又は集団を得るためのさらなる方法もまた使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ４抗体を、細胞間接着及び基材接着を低減させるように処理した胚体内胚葉含有細胞培養物とともにインキュベートさせる。続いて、細胞を洗浄して、遠心分離して、再懸濁させる。次に、細胞懸濁液を、一次抗体に結合することが可能な二次抗体（例えば、ＦＩＴＣ結合抗体）とともにインキュベートさせる。続いて、細胞を洗浄して、遠心分離して、緩衝液中に再懸濁させる。次に、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用して、細胞懸濁液を分析及び選別する。ＣＸＣＲ４陽性細胞を、ＣＸＣＲ４陰性細胞と分離して収集して、それによりかかる細胞型の単離をもたらす。望ましい場合、単離された細胞組成物は、代替的な親和性ベースの方法を使用することにより、或いは胚体内胚葉に特異的な同じか又は異なるマーカーを使用したさらなる一連の選別によりさらに精製することができる。   Additional methods for obtaining enriched, isolated or purified definitive endoderm cell cultures or populations can also be used. For example, in some embodiments, the CXCR4 antibody is incubated with a definitive endoderm-containing cell culture that has been treated to reduce cell-cell adhesion and substrate adhesion. Subsequently, the cells are washed, centrifuged and resuspended. The cell suspension is then incubated with a secondary antibody (eg, a FITC-conjugated antibody) that can bind to the primary antibody. Subsequently, the cells are washed, centrifuged and resuspended in buffer. The cell suspension is then analyzed and sorted using a fluorescence activated cell sorter (FACS). CXCR4 positive cells are collected separately from CXCR4 negative cells, thereby resulting in isolation of such cell types. If desired, the isolated cell composition is further purified by using alternative affinity-based methods or by a further series of selections using the same or different markers specific for definitive endoderm. be able to.

さらに他のプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４に結合するリガンド又は他の分子を使用して、富化、単離及び／又は精製される。いくつかのプロセスでは、分子はＳＤＦ−１又はそれらのフラグメント、融合体又は模倣物である。   In yet other processes, definitive endoderm cells are enriched, isolated and / or purified using a ligand or other molecule that binds to CXCR4. In some processes, the molecule is SDF-1 or a fragment, fusion or mimetic thereof.

本明細書中に記載されるプロセスのいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は蛍光標識され、次に蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いて非標識細胞から単離される。このような実施形態では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸又は発現可能蛍光マーカー遺伝子をコードする別の核酸を用いて、ＰＤＸ１陽性細胞を標識する。例えば
いくつかの実施形態では、ＧＦＰ遺伝子産物又はその生物学的活性断片の発現がＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターの制御下にあるように、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片の少なくとも１つのコピーが、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターの下流の多能性細胞、好ましくはヒト胚性幹細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４をコードする核酸の全コード領域が、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片により取って代わられる。他の実施形態では、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片は、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４をコードする核酸の少なくとも一部分とフレーム内で融合され、それにより融合タンパク質を形成する。このような実施形態では、融合タンパク質はＧＦＰと類似の蛍光活性を保有する。 In some embodiments of the processes described herein, definitive endoderm cells are fluorescently labeled and then isolated from unlabeled cells using a fluorescence activated cell sorter (FACS). In such embodiments, PDX1-positive cells are labeled with a nucleic acid encoding green fluorescent protein (GFP) or another nucleic acid encoding an expressible fluorescent marker gene. For example, in some embodiments, at least one copy of a nucleic acid encoding GFP or biologically active fragment thereof, such that expression of the GFP gene product or biologically active fragment thereof is under the control of a SOX17 or CXCR4 promoter. Are introduced into pluripotent cells downstream of the SOX17 or CXCR4 promoter, preferably human embryonic stem cells. In some embodiments, the entire coding region of a nucleic acid encoding SOX17 or CXCR4 is replaced by a nucleic acid encoding GFP or a biologically active fragment thereof. In other embodiments, a nucleic acid encoding GFP or biologically active fragment thereof is fused in frame with at least a portion of a nucleic acid encoding SOX17 or CXCR4, thereby forming a fusion protein. In such embodiments, the fusion protein possesses fluorescent activity similar to GFP.

蛍光標識する細胞、例えば上記の多能性細胞は、上記のように胚体内胚葉に分化される。胚体内胚葉細胞は蛍光マーカー遺伝子を発現するが、一方、他の細胞型はそうではないため、胚体内胚葉細胞は他の細胞型から分離され得る。いくつかの実施形態では、蛍光標識胚体内胚葉細胞及び非標識非胚体内胚葉細胞の混合物を含む細胞懸濁液は、ＦＡＣＳを用いて分類される。胚体内胚葉細胞は非蛍光細胞と別個に収集され、それにより胚体内胚葉の単離を生じる。所望であれば、単離された細胞組成物は、胚体内胚葉に特異的である同一の又は異なるマーカーを用いて、さらに一連の分類によりさらに精製され得る。   Cells that are fluorescently labeled, such as the pluripotent cells described above, are differentiated into definitive endoderm as described above. Definitive endoderm cells express fluorescent marker genes, while other cell types do not, so definitive endoderm cells can be separated from other cell types. In some embodiments, cell suspensions comprising a mixture of fluorescently labeled definitive endoderm cells and unlabeled non-definitive endoderm cells are classified using FACS. Definitive endoderm cells are collected separately from non-fluorescent cells, thereby resulting in the isolation of definitive endoderm. If desired, the isolated cell composition can be further purified by a series of further classifications using the same or different markers that are specific for definitive endoderm.

好ましいプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、幹細胞培養物が胚体内胚葉系統へと分化するように誘導された後、他の非胚体内胚葉細胞から富化、単離及び／又は精製される。上述の富化、単離及び精製手法は、分化の任意の段階でかかる培養物を用いて使用することができることが理解されよう。   In a preferred process, definitive endoderm cells are enriched, isolated and / or purified from other non-definitive endoderm cells after the stem cell culture is induced to differentiate into a definitive endoderm lineage. It will be appreciated that the enrichment, isolation and purification techniques described above can be used with such cultures at any stage of differentiation.

直ぐ上で記載された手法のほかに、胚体内胚葉細胞は、細胞単離のための他の技法によっても単離され得る。さらに胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞の選択的生存又は選択的増殖を促す成長条件で連続継代培養する方法によっても、富化されるか又は単離され得る。   In addition to the procedure described immediately above, definitive endoderm cells can also be isolated by other techniques for cell isolation. Furthermore, definitive endoderm cells can also be enriched or isolated by methods of continuous subculture under growth conditions that promote selective survival or selective proliferation of definitive endoderm cells.

本明細書中に記載される方法を用いて、富化、単離及び／又は精製された胚体内胚葉細胞の集団又は組織が、少なくとも何らかの分化を受けた多能性細胞培養物又は細胞集団、例えば幹細胞培養物又は集団からｉｎ ｖｉｔｒｏで産生され得る。いくつかの方法では、細胞は無作為な分化を受ける。しかしながら好ましい方法では、細胞は主に胚体内胚葉に分化するよう指図される。いくつかの好ましい富化、単離及び／又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に関する。   A pluripotent cell culture or cell population in which a population or tissue of definitive endoderm cells enriched, isolated and / or purified using the methods described herein has undergone at least some differentiation, For example, it can be produced in vitro from a stem cell culture or population. In some methods, the cells undergo random differentiation. However, in a preferred method, the cells are directed to differentiate mainly into definitive endoderm. Some preferred enrichment, isolation and / or purification methods relate to in vitro production of definitive endoderm from human embryonic stem cells.

本明細書中に記載される方法を用いて、細胞集団又は細胞培養物は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２〜約１０００倍、胚体内胚葉含量が富化され得る。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約５〜約５００倍、富化され得る。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約１０〜約２００倍、富化され得る。さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２０〜約１００倍、富化され得る。さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約４０〜約８０倍、富化され得る。或る特定の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２〜約２０倍、富化され得る。   Using the methods described herein, a cell population or cell culture is enriched in definitive endoderm content by at least about 2 to about 1000 times compared to an untreated cell population or cell culture. obtain. In some embodiments, definitive endoderm cells can be enriched by at least about 5 to about 500-fold compared to an untreated cell population or cell culture. In other embodiments, definitive endoderm cells can be enriched by at least about 10 to about 200-fold compared to an untreated cell population or cell culture. In still other embodiments, definitive endoderm cells can be enriched at least about 20 to about 100 times compared to an untreated cell population or cell culture. In yet other embodiments, definitive endoderm cells can be enriched by at least about 40 to about 80 times compared to an untreated cell population or cell culture. In certain embodiments, definitive endoderm cells can be enriched at least about 2 to about 20 times compared to an untreated cell population or cell culture.

胚体内胚葉細胞を含む組成物
上記の方法により産生される細胞組成物としては、胚体内胚葉を含む細胞培養物、並びに胚体内胚葉に富んだ細胞集団が挙げられる。例えば、培養中の細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が産生され得る。分化
プロセスの効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞増殖条件、成長因子濃度及び培養工程の時期（これらに限定されない）を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手順は、胚体内胚葉への多能性細胞の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９５％より多い転換を生じ得る。胚体内胚葉細胞の単離が用いられるプロセスでは、例えばＣＸＣＲ４受容体と結合する親和性試薬を用いることにより、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団が回収され得る。 Compositions containing definitive endoderm cells Cell compositions produced by the above method include cell cultures containing definitive endoderm and cell populations rich in definitive endoderm. For example, a cell culture can be produced that includes definitive endoderm cells, wherein at least about 50-80% of the cells in culture are definitive endoderm cells. Since the efficiency of the differentiation process can be adjusted by modifying certain parameters such as, but not limited to, cell growth conditions, growth factor concentrations, and the timing of the culturing process, the differentiation described herein. The procedure involves about 5%, about 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about 30%, about 35%, about 40%, about 45%, about 45% of pluripotent cells into the definitive endoderm. More than 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, or more than about 95% conversion can occur. In processes where isolation of definitive endoderm cells is used, a substantially pure definitive endoderm cell population can be recovered, for example, by using an affinity reagent that binds to the CXCR4 receptor.

本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、多能性細胞、例えば幹細胞と、胚体内胚葉細胞との両方を含む細胞集団及び細胞培養物のような組成物に関する。例えば本明細書中に記載される方法を用いて、ｈＥＳＣ及び胚体内胚葉細胞の混合物を含む組成物が産生され得る。いくつかの実施形態では、約９５個の多能性細胞につき少なくとも約５個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が産生される。他の実施形態では、約５個の多能性細胞につき少なくとも約９５個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が産生される。さらに、胚体内胚葉細胞対多能性細胞の他の比を含む組成物が意図される。例えば約１，０００，０００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１００，０００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１０，０００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１，０００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約５００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１０個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約５個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約２個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約２個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約５個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１０個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約２０個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約５０個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１００個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１，０００個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１０，０００個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１００，０００個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１，０００，０００個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が意図される。いくつかの実施形態では、多能性細胞はヒト多能性幹細胞である。或る特定の実施形態では、幹細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊、又は胚の生殖腺***に由来する。或る特定の他の実施形態では、多能性細胞は、胚期が終わって発生した多細胞構造の生殖腺又は胚組織に由来する。   Some embodiments described herein relate to compositions such as cell populations and cell cultures comprising both pluripotent cells, such as stem cells and definitive endoderm cells. For example, using the methods described herein, a composition comprising a mixture of hESCs and definitive endoderm cells can be produced. In some embodiments, a composition comprising at least about 5 definitive endoderm cells for about 95 pluripotent cells is produced. In other embodiments, a composition comprising at least about 95 definitive endoderm cells per about 5 pluripotent cells is produced. In addition, compositions comprising other ratios of definitive endoderm cells to pluripotent cells are contemplated. For example, at least about 1 definitive endoderm cell for about 1,000,000 pluripotent cells, at least about 1 definitive endoderm cell for about 100,000 pluripotent cells, about 10,000 At least about 1 definitive endoderm cell per about 1000 pluripotent cells, at least about 1 definitive endoderm cell per about 1,000 pluripotent cells, at least about 1 per about 500 pluripotent cells Definitive endoderm cells, at least about 1 definitive endoderm cells per about 100 pluripotent cells, at least about 1 definitive endoderm cells per about 10 pluripotent cells, about 5 pluripotent cells At least about 1 definitive endoderm cells per sex cell, at least about 1 definitive endoderm cells per about 2 pluripotent cells, at least about 2 definitive endoderm cells per about 1 pluripotent cell About one pluripotent cell At least about 5 definitive endoderm cells, at least about 10 definitive endoderm cells per about 1 pluripotent cell, at least about 20 definitive endoderm cells per about 1 pluripotent cell, about At least about 50 definitive endoderm cells per pluripotent cell, at least about 100 definitive endoderm cells per about one pluripotent cell, at least about 1, per about one pluripotent cell 000 definitive endoderm cells, at least about 10,000 definitive endoderm cells per about 1 pluripotent cell, at least about 100,000 definitive endoderm cells per about 1 pluripotent cell, Compositions comprising at least about 1,000,000 definitive endoderm cells per about one pluripotent cell are contemplated. In some embodiments, the pluripotent cell is a human pluripotent stem cell. In certain embodiments, the stem cells are derived from a morula, an embryonic inner cell mass, or an embryonic gonadal ridge. In certain other embodiments, the pluripotent cells are derived from multicellular gonads or embryonic tissues that develop after the embryonic stage.

本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、少なくとも約５％の胚体内胚葉細胞〜少なくとも約９９％の胚体内胚葉細胞から成る細胞培養物又は細胞集団に関する。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団は、哺乳類細胞を含む。好ましい実施形態では、細胞培養物又は細胞集団はヒト細胞を含む。例えばいくつかの特定の実施形態は、ヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約９５％が胚体内胚葉細胞であるヒト細胞から成る細胞培養物に関する。他の実施形態は、ヒト細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は９０％より多くが胚体内胚葉細胞であるヒト細胞から成る細胞培養物に関する。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。   Some embodiments described herein relate to cell cultures or cell populations comprised of at least about 5% definitive endoderm cells to at least about 99% definitive endoderm cells. In some embodiments, the cell culture or cell population comprises mammalian cells. In preferred embodiments, the cell culture or cell population comprises human cells. For example, some specific embodiments relate to cell cultures consisting of human cells in which at least about 5% to at least about 95% of the human cells are definitive endoderm cells. Other embodiments are at least about 5%, at least about 10%, at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 35%, at least about 40%, at least about human cells About 45%, at least about 50%, at least about 55%, at least about 60%, at least about 65%, at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 90%, or It relates to a cell culture consisting of human cells, more than 90% being definitive endoderm cells. In embodiments where the cell culture or cell population comprises human feeder cells, the above percentages are calculated without considering the human feeder cells in the cell culture or cell population.

本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、ヒト細胞、例えばヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、この場合、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現は、少なくとも約５％のヒト細胞では、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現より多い。他の実施形態では、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、少なくとも約１０％のヒト細胞では、少なくとも約１５％のヒト細胞では、少なくとも約２０％のヒト細胞では、少なくとも約２５％のヒト細胞では、少なくとも約３０％のヒト細胞では、少なくとも約３５％のヒト細胞では、少なくとも約４０％のヒト細胞では、少なくとも約４５％のヒト細胞では、少なくとも約５０％のヒト細胞では、少なくとも約５５％のヒト細胞では、少なくとも約６０％のヒト細胞では、少なくとも約６５％のヒト細胞では、少なくとも約７０％のヒト細胞では、少なくとも約７５％のヒト細胞では、少なくとも約８０％のヒト細胞では、少なくとも約８５％のヒト細胞では、少なくとも約９０％のヒト細胞では、少なくとも約９５％のヒト細胞では、又は９５％より多くのヒト細胞では、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現より多い。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。   Further embodiments described herein relate to compositions such as cell cultures or cell populations comprising human cells, eg, human definitive endoderm cells, in which case either the SOX17 marker or the CXCR4 marker Expression is greater than expression of OCT4, SPARC, α-fetoprotein (AFP), thrombomodulin (TM) and / or SOX7 marker in at least about 5% human cells. In other embodiments, the expression of the SOX17 marker or CXCR4 marker is at least about 10% human cells, at least about 15% human cells, at least about 20% human cells, at least about 25% human cells. At least about 30% human cells, at least about 35% human cells, at least about 40% human cells, at least about 45% human cells, at least about 50% human cells, at least about 55% In at least about 60% human cells, in at least about 65% human cells, in at least about 70% human cells, in at least about 75% human cells, in at least about 80% human cells, At least about 85% human cells, at least about 90% human cells, at least about 95% The bets cells, or in many human cells than 95%, OCT4, SPARC, AFP, greater than the expression of the TM and / or SOX7 markers. In embodiments where the cell culture or cell population comprises human feeder cells, the above percentages are calculated without considering the human feeder cells in the cell culture or cell population.

本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞のようなヒト細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約５％〜少なくとも約９５％を上回るヒト細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きいことが理解されよう。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。   Some embodiments described herein relate to compositions such as cell cultures or cell populations comprising human cells, such as human definitive endoderm cells, where GATA4, MIXL1, HNF3b, GSC, FGF17 Expression of one or more markers selected from the group consisting of VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 and CRIP1 is at least about 5% to at least about 95% more human cells than OCT4, SPARC, AFP, TM and / or Or it will be appreciated that it is greater than the expression of the SOX7 marker. In embodiments where the cell culture or cell population comprises human feeder cells, the above percentages are calculated without considering the human feeder cells in the cell culture or cell population.

本明細書中に記載するさらに他の実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞のようなヒト細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約５％のヒト細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。他の実施形態では、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約１０％のヒト細胞において、少なくとも約１５％のヒト細胞において、少なくとも約２０％のヒト細胞において、少なくとも約２５％のヒト細胞において、少なくとも約３０％のヒト細胞において、少なくとも約３５％のヒト細胞において、少なくとも約４０％のヒト細胞において、少なくとも約４５％のヒト細胞において、少なくとも約５０％のヒト細胞において、少なくとも約５５％のヒト細胞において、少なくとも約６０％のヒト細胞において、少なくとも約６５％のヒト細胞において、少なくとも約７０％のヒト細胞において、少なくとも約７５％のヒト細胞において、少なくとも約８０％のヒト細胞において、少なくとも約８５％のヒト細胞において、少なくとも約９０％のヒト細胞において、少なくとも約９５％のヒト細胞において、或いは少なくとも約９５％を上回るヒト細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。   Still other embodiments described herein relate to compositions such as cell cultures or cell populations comprising human cells, such as human definitive endoderm cells, wherein expression of both SOX17 and CXCR4 markers is Greater than the expression of OCT4, SPARC, AFP, TM and / or SOX7 markers in at least about 5% of human cells. In other embodiments, expression of both the SOX17 and CXCR4 markers is at least about 10% human cells, at least about 15% human cells, at least about 20% human cells, at least about 25% human cells. At least about 30% human cells, at least about 35% human cells, at least about 40% human cells, at least about 45% human cells, at least about 50% human cells, at least about 55%. % Of human cells, at least about 60% human cells, at least about 65% human cells, at least about 70% human cells, at least about 75% human cells, at least about 80% human cells. At least about 85% human cells There, at least about 90% of the human cells, in at least about 95% of the human cells, or in human cells that over at least about 95%, OCT4, SPARC, AFP, greater than the expression of TM and / or SOX7 markers. In embodiments where the cell culture or cell population comprises human feeder cells, the above percentages are calculated without considering the human feeder cells in the cell culture or cell population.

本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞のようなヒト細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１マーカーの発現は、少なくとも約５％〜少なくとも約９５％を上回るヒト細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大
きいことが理解されよう。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。 Some embodiments described herein relate to compositions such as cell cultures or cell populations comprising human cells, such as human definitive endoderm cells, where GATA4, MIXL1, HNF3b, GSC, FGF17 It is understood that the expression of the VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 and CRIP1 markers is greater than the expression of the OCT4, SPARC, AFP, TM and / or SOX7 markers in at least about 5% to more than at least about 95% human cells Like. In embodiments where the cell culture or cell population comprises human feeder cells, the above percentages are calculated without considering the human feeder cells in the cell culture or cell population.

本明細書中に記載するさらなる実施形態は、ヒト内胚葉細胞のような哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現は、少なくとも約５％の内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。他の実施形態では、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現は、少なくとも約１０％の内胚葉細胞において、少なくとも約１５％の内胚葉細胞において、少なくとも約２０％の内胚葉細胞において、少なくとも約２５％の内胚葉細胞において、少なくとも約３０％の内胚葉細胞において、少なくとも約３５％の内胚葉細胞において、少なくとも約４０％の内胚葉細胞において、少なくとも約４５％の内胚葉細胞において、少なくとも約５０％の内胚葉細胞において、少なくとも約５５％の内胚葉細胞において、少なくとも約６０％の内胚葉細胞において、少なくとも約６５％の内胚葉細胞において、少なくとも約７０％の内胚葉細胞において、少なくとも約７５％の内胚葉細胞において、少なくとも約８０％の内胚葉細胞において、少なくとも約８５％の内胚葉細胞において、少なくとも約９０％の内胚葉細胞において、少なくとも約９５％の内胚葉細胞において、或いは少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。   Further embodiments described herein relate to compositions such as cell cultures or cell populations comprising mammalian endoderm cells, such as human endoderm cells, wherein expression of either the SOX17 or CXCR4 marker is Greater than the expression of OCT4, SPARC, AFP, TM and / or SOX7 markers in at least about 5% of the endoderm cells. In other embodiments, expression of either the SOX17 or CXCR4 marker is at least about 25 in at least about 10% endoderm cells, at least about 15% endoderm cells, at least about 20% endoderm cells. % Of endoderm cells, at least about 30% endoderm cells, at least about 35% endoderm cells, at least about 40% endoderm cells, at least about 45% endoderm cells, at least about 50%. % Of endoderm cells, at least about 55% endoderm cells, at least about 60% endoderm cells, at least about 65% endoderm cells, at least about 70% endoderm cells, at least about 75%. % Of endoderm cells, at least about 80% of endoderm cells OCT4, SPARC, AFP, TM, at least about 85% endoderm cells, at least about 90% endoderm cells, at least about 95% endoderm cells, or at least more than about 95% endoderm cells. And / or greater than the expression of the SOX7 marker.

本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約５％〜少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きいことが理解されよう。   Some embodiments described herein relate to compositions such as cell cultures or cell populations comprising mammalian endoderm cells, where GATA4, MIXL1, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1 Wherein the expression of one or more markers selected from the group consisting of CMKOR1 and CRIP1 is expression of OCT4, SPARC, AFP, TM and / or SOX7 markers in at least about 5% to more than at least about 95% endoderm cells It will be understood that it is larger than.

本明細書中に記載するさらなる他の実施形態は、ヒト内胚葉細胞のような哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約５％の内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。他の実施形態では、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約１０％の内胚葉細胞において、少なくとも約１５％の内胚葉細胞において、少なくとも約２０％の内胚葉細胞において、少なくとも約２５％の内胚葉細胞において、少なくとも約３０％の内胚葉細胞において、少なくとも約３５％の内胚葉細胞において、少なくとも約４０％の内胚葉細胞において、少なくとも約４５％の内胚葉細胞において、少なくとも約５０％の内胚葉細胞において、少なくとも約５５％の内胚葉細胞において、少なくとも約６０％の内胚葉細胞において、少なくとも約６５％の内胚葉細胞において、少なくとも約７０％の内胚葉細胞において、少なくとも約７５％の内胚葉細胞において、少なくとも約８０％の内胚葉細胞において、少なくとも約８５％の内胚葉細胞において、少なくとも約９０％の内胚葉細胞において、少なくとも約９５％の内胚葉細胞において、或いは少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。   Still other embodiments described herein relate to compositions such as cell cultures or cell populations comprising mammalian endoderm cells, such as human endoderm cells, where expression of both SOX17 and CXCR4 markers. Is greater than the expression of OCT4, SPARC, AFP, TM and / or SOX7 markers in at least about 5% of the endoderm cells. In other embodiments, the expression of both SOX17 and CXCR4 markers is at least about 25% in at least about 10% endoderm cells, in at least about 15% endoderm cells, in at least about 20% endoderm cells. At least about 30% endoderm cells, at least about 35% endoderm cells, at least about 40% endoderm cells, at least about 45% endoderm cells, at least about 50% At least about 55% endoderm cells, at least about 60% endoderm cells, at least about 65% endoderm cells, at least about 70% endoderm cells, at least about 75% In at least about 80% of the endoderm cells, OCT4, SPARC, AFP, TM in at least about 85% endoderm cells, in at least about 90% endoderm cells, in at least about 95% endoderm cells, or in at least about 95% endoderm cells And / or greater than the expression of the SOX7 marker.

本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１マーカーの発現は、少なくとも約５％〜少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きいことが理解さ
れよう。 Some embodiments described herein relate to compositions such as cell cultures or cell populations comprising mammalian endoderm cells, where GATA4, MIXL1, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1 It will be appreciated that the expression of the CMKOR1 and CRIP1 markers is greater than the expression of the OCT4, SPARC, AFP, TM and / or SOX7 markers in at least about 5% to more than at least about 95% endoderm cells.

本明細書中に記載される方法を用いて、他の細胞型を実質的に含有しない胚体内胚葉細胞を含む組成物が産生され得る。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法により産生される胚体内胚葉細胞集団又は細胞培養物は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭ、ＺＩＣ１又はＢＲＡＣＨマーカー遺伝子を有意に発現する細胞を実質的に含有しない。   Using the methods described herein, compositions comprising definitive endoderm cells that are substantially free of other cell types can be produced. In some embodiments described herein, the definitive endoderm cell population or cell culture produced by the methods described herein is OCT4, SOX7, AFP, SPARC, TM, ZIC1. Or substantially free of cells that significantly express the BRACH marker gene.

一実施形態では、マーカー遺伝子の発現に基づいた胚体内胚葉細胞の説明は、ＳＯＸ１７高、ＭＩＸＬ１高、ＡＦＰ低、ＳＰＡＲＣ低、トロンボモジュリン低、ＳＯＸ７低及びＣＸＣＲ４高である。   In one embodiment, descriptions of definitive endoderm cells based on marker gene expression are SOX17 high, MIXL1 high, AFP low, SPARC low, thrombomodulin low, SOX7 low and CXCR4 high.

胚体内胚葉細胞の増殖
本明細書中に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法のいくつかによれば、胚体内胚葉細胞は、細胞培養で維持され、増殖され、継代培養され、及び／又は増殖される。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、いかなる有意の分化も伴わずに、維持され、増殖され、継代培養され、及び／又は増殖される。言い換えれば、このような実施形態では、胚体内胚葉細胞は、細胞培養で維持され、増殖され、継代培養され、及び／又は増殖される間、胚体内胚葉表現型を維持する。 Proliferation of definitive endoderm cells According to some of the in vitro methods described herein, definitive endoderm cells are maintained, expanded, subcultured, and / or expanded in cell culture. . In some embodiments, definitive endoderm cells are maintained, expanded, subcultured, and / or expanded without any significant differentiation. In other words, in such embodiments, definitive endoderm cells maintain a definitive endoderm phenotype while maintained, expanded, subcultured and / or expanded in cell culture.

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される増殖方法に用いられる胚体内胚葉細胞は、腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である。このような細胞としては、膵臓、肝臓、肺、胃、小腸、甲状腺、胸腺、咽頭、胆嚢及び膀胱の細胞、並びにこのような細胞の前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。さらにこれらの細胞は、より高等な構造、例えば組織及び／又は器官にさらに発達し得る。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞はヒト胚体内胚葉細胞である。   In some embodiments, the definitive endoderm cells used in the expansion methods described herein are multipotent cells that can differentiate into cells of the intestinal tract or organs derived therefrom. Such cells include, but are not limited to, pancreatic, liver, lung, stomach, small intestine, thyroid, thymus, pharynx, gallbladder and bladder cells, and precursors of such cells. Furthermore, these cells can further develop into higher structures, such as tissues and / or organs. In some embodiments, the definitive endoderm cells are human definitive endoderm cells.

本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態は、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程を含む。細胞培養物は、胚体内胚葉細胞の純粋培養物、或いは胚体内胚葉細胞並びに他の型の細胞を含む混合細胞培養物であり得る。例えば細胞培養物は、胚体内胚葉細胞及びヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の両方を含む培養物であり得る。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞培養物は、ｈＥＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物を分化させることにより得られる。或る特定の実施形態では、ｈＥＳＣは、桑実胚、胚の内部細胞塊又は胚の生殖腺***から得られる。或る特定の他の実施形態では、多能性細胞は、胚期が終わって発生した多細胞構造の生殖腺又は胚組織に由来する。   Some embodiments of the methods described herein include obtaining a cell culture comprising definitive endoderm cells. The cell culture can be a pure culture of definitive endoderm cells or a mixed cell culture containing definitive endoderm cells as well as other types of cells. For example, the cell culture can be a culture containing both definitive endoderm cells and human embryonic stem cells (hESC). In some embodiments, definitive endoderm cell cultures are obtained by differentiating hESC in vitro cell cultures. In certain embodiments, hESCs are obtained from morula, embryonic inner cell mass or embryonic gonadal ridge. In certain other embodiments, the pluripotent cells are derived from multicellular gonads or embryonic tissues that develop after the embryonic stage.

ヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を産生するためのｈＥＳＣの分化方法は、本出願全体に、そして米国特許出願第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉」、２００４年１２月２３日出願）（この開示は参照により本明細書にその全体が援用される）に記載されている。しかしながら、ｈＥＳＣから、又は他のヒト細胞型からヒト胚体内胚葉細胞を産生するための任意の既知の方法が用いられ得ることが理解されよう。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、ｈＥＳＣを分化させることにより産生される胚体内胚葉細胞の培養物は、胚体内胚葉細胞及び1つ又は複数の型の他の細胞を含む混合された胚体内胚葉培養物、富化された胚体内胚葉細胞培養物及び／又は精製された胚体内胚葉細胞培養物であり得る。ｈＥＳＣから胚体内胚葉細胞を取得するためのいくつかの方法は、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子とｈＥＳＣを接触させるか、そうでなければそれらの因子をｈＥＳＣに提供することを含む。このような成長因子としては、ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、成長因子は、５ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でｈＥＳＣに提供される。或る特定の実施形態では、成長因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍ
ｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で培養中のｈＥＳＣに提供される。 Methods for differentiating hESCs to produce cell cultures containing human definitive endoderm cells are described throughout this application and in US patent application Ser. No. 11 / 021,618 (title “Definitive Endoderm”, December 23, 2004). (The disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety). However, it will be appreciated that any known method for producing human definitive endoderm cells from hESCs or from other human cell types may be used. In some embodiments described herein, a culture of definitive endoderm cells produced by differentiating hESC comprises definitive endoderm cells and one or more types of other cells. It can be a mixed definitive endoderm culture, an enriched definitive endoderm cell culture and / or a purified definitive endoderm cell culture. Some methods for obtaining definitive endoderm cells from hESCs include contacting hESCs with at least one growth factor of the TGFβ superfamily or otherwise providing those factors to hESCs. Such growth factors include, but are not limited to, nodal, activin A and activin B. In some embodiments, growth factors are provided to hESCs at concentrations ranging from 5 ng / ml to 5000 ng / ml. In certain embodiments, the growth factor is at least about 5 ng / m.
1, at least about 10 ng / ml, at least about 25 ng / ml, at least about 50 ng / ml, at least about 75 ng / ml, at least about 100 ng / ml, at least about 200 ng / ml, at least about 300 ng / ml, at least about 400 ng / ml, Provide to hESCs in culture at a concentration of at least about 500 ng / ml, at least about 1000 ng / ml, at least about 2000 ng / ml, at least about 3000 ng / ml, at least about 4000 ng / ml, at least about 5000 ng / ml or higher than about 5000 ng / ml Is done.

本明細書中に記載される方法の他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞の既存の培養物から得られる。このような実施形態では、培養物の一部分又は全部が、本明細書中に記載される胚体内胚葉増殖方法に用いられ得る。   In other embodiments of the methods described herein, definitive endoderm cells are obtained from an existing culture of definitive endoderm cells. In such embodiments, a portion or all of the culture can be used in the definitive endoderm propagation methods described herein.

胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を得るほかに、本明細書中に記載される増殖方法のいくつかの実施形態は、細胞培養物から胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかを単離する工程も包含する。このような実施形態では、胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかは、細胞培養物中の他の細胞のうちの少なくともいくつかから分離され、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかは細胞培養物から除去されるが、一方他の細胞のうちの少なくともいくつかは細胞培養物中に残存する。細胞培養物中に存在する他の細胞としては、ｈＥＳＣ、原始内胚葉、栄養外胚葉、中胚葉及び外胚葉が挙げられるが、これらに限定されない。   In addition to obtaining a cell culture comprising definitive endoderm cells, some embodiments of the growth methods described herein isolate at least some of the definitive endoderm cells from the cell culture. A process is also included. In such embodiments, at least some of the definitive endoderm cells are separated from at least some of the other cells in the cell culture, thereby producing a cell population enriched in definitive endoderm cells. To do. In some embodiments, at least some of the definitive endoderm cells are removed from the cell culture while at least some of the other cells remain in the cell culture. Other cells present in the cell culture include, but are not limited to, hESC, primitive endoderm, trophectoderm, mesoderm and ectoderm.

本明細書中に記載される他の実施形態では、単離する工程は、上記胚体内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、細胞培養物中に存在する上記他の細胞中では実質的に発現されない試薬を細胞培養物中の細胞に提供することを含む。本明細書中で上記されたように、いくつかの実施形態では、マーカーは、胚体内胚葉細胞に特異的である任意の細胞表面マーカーであり得る。本出願全体に（特に以下の実施例参照）記載されるこのような一マーカーは、ＣＸＣＲ４マーカーである。本明細書中に上記されたように、試薬結合胚体内胚葉細胞は、多数の方法により試薬非結合細胞から分離され得る。例えば胚体内胚葉細胞の表面に選択的に存在するＣＸＣＲ４受容体に対する抗体は、細胞培養物中の胚体内胚葉細胞に提供され得る。抗体結合胚体内胚葉細胞は次に、例えば蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、抗体を固体支持体に結合すること、或いは磁界で適切にタグされた抗体を単離することにより、培養物中の他の細胞から分離される。いくつかの実施形態では、抗体は、分離プロセス後に胚体内胚葉細胞から放出される。   In other embodiments described herein, the isolating step binds to a marker expressed in the definitive endoderm cells, but is substantially in the other cells present in the cell culture. Providing a non-expressed reagent to cells in a cell culture. As described hereinabove, in some embodiments, the marker can be any cell surface marker that is specific for definitive endoderm cells. One such marker described throughout this application (see in particular the examples below) is the CXCR4 marker. As described hereinabove, reagent-bound definitive endoderm cells can be separated from reagent-unbound cells by a number of methods. For example, antibodies against CXCR4 receptor that are selectively present on the surface of definitive endoderm cells can be provided to definitive endoderm cells in cell culture. The antibody-bound definitive endoderm cells are then cultured in the culture, for example by fluorescence activated cell sorting (FACS), binding the antibody to a solid support, or isolating the antibody appropriately tagged with a magnetic field. Isolated from other cells. In some embodiments, the antibody is released from definitive endoderm cells after the separation process.

分離の代替的手段として、胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかは、培養中の胚体内胚葉細胞を特異的に蛍光標識し、次にＦＡＣＳにより非標識細胞から標識細胞を分離することにより、培養物中の他の細胞の少なくともいくつかから分離される。上記のようにそして実施例に記載されるように、このような実施形態では、ｈＥＳＣは、胚体内胚葉細胞中で高度に発現されるが、他の細胞型中では有意に発現されないマーカー遺伝子のプロモーターの制御下で、蛍光レポーター遺伝子を含むベクターでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、蛍光レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＧＦＰ及び／又はＥＧＦＰは、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターの制御下で発現される。トランスフェクトされたｈＥＳＣは次に、胚体内胚葉の産生を特異的に誘導する分化因子の存在下で培養で増殖される。好ましい実施形態では、分化因子はアクチビンＡである。他の好ましい実施形態では、アクチビンＡは、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物に付加される。   As an alternative to separation, at least some of the definitive endoderm cells can be cultured by specifically fluorescently labeling the definitive endoderm cells in culture and then separating the labeled cells from unlabeled cells by FACS. Separated from at least some of the other cells in it. As described above and in the examples, in such embodiments, hESCs are highly expressed in definitive endoderm cells, but of marker genes that are not significantly expressed in other cell types. It is transfected with a vector containing a fluorescent reporter gene under the control of a promoter. In some embodiments, the fluorescent reporter gene is a gene encoding green fluorescent protein (GFP) or enhanced green fluorescent protein (EGFP). In some embodiments, GFP and / or EGFP are expressed under the control of a SOX17 or CXCR4 promoter. The transfected hESCs are then grown in culture in the presence of differentiation factors that specifically induce definitive endoderm production. In a preferred embodiment, the differentiation factor is activin A. In another preferred embodiment, activin A is added to the cell culture at a concentration of 100 ng / ml.

本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、単離する工程の結果として産生され
る富化された胚体内胚葉細胞集団は、胚体内胚葉細胞以外の細胞を実質的に含有しない。他の実施形態では、富化された胚体内胚葉細胞集団は、少なくとも約９６％〜少なくとも約１００％の胚体内胚葉細胞を含む。さらに他の実施形態では、富化された胚体内胚葉細胞集団は、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％並びに少なくとも約１００％の胚体内胚葉細胞を含む。 In some embodiments described herein, the enriched definitive endoderm cell population produced as a result of the isolating step is substantially free of cells other than definitive endoderm cells. In other embodiments, the enriched definitive endoderm cell population comprises at least about 96% to at least about 100% definitive endoderm cells. In still other embodiments, the enriched definitive endoderm cell population comprises at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, at least about 99%, and at least about 100% definitive endoderm cells.

本明細書中に記載される増殖方法のさらなる実施形態によれば、細胞培養工程が意図される。例えばいくつかの実施形態は、胚体内胚葉細胞に富んだ集団又は集団の一部分をプレーティングすることを含む、培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、細胞はヒトフィブロネクチンで被覆された表面でプレーティングされる。他の実施形態では、プレートは、ポリオルニチンで被覆される。さらに他の実施形態では、プレートはポリオルニチン及びヒトフィブロネクチンで被覆される。好ましい実施形態では、プレートは、ポリオルニチン及びヒトフィブロネクチンの両方で被覆されたＩＶＦプレートである。ヒトフィブロネクチンは本明細書中に記載されるプレートのための好ましいコーティングであり、他の供給源からのフィブロネクチンはプレートをコーティングするために十分であることは理解されよう。   According to further embodiments of the growth methods described herein, a cell culture step is contemplated. For example, some embodiments include culturing comprising plating a population or a portion of a population enriched in definitive endoderm cells. In some embodiments, the cells are plated on a surface coated with human fibronectin. In other embodiments, the plate is coated with polyornithine. In yet another embodiment, the plate is coated with polyornithine and human fibronectin. In a preferred embodiment, the plate is an IVF plate coated with both polyornithine and human fibronectin. It will be appreciated that human fibronectin is the preferred coating for the plates described herein, and fibronectin from other sources is sufficient to coat the plates.

他の実施形態では、培養する工程は、約２％（ｖ／ｖ）の血清を含む増殖培地中に富んだ胚体内胚葉細胞集団又はその一部分をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、血清濃度は、約０％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えば本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）又は約２０％（ｖ／ｖ）であり得る。いくつかの実施形態では、血清代替物が培地中に含まれる。   In other embodiments, the culturing comprises incubating the enriched definitive endoderm cell population or a portion thereof in a growth medium comprising about 2% (v / v) serum. In some embodiments, the serum concentration can range from about 0% (v / v) to about 20% (v / v). For example, in some embodiments described herein, the serum concentration of the medium is about 0.05% (v / v), about 0.1% (v / v), about 0.2% ( v / v), about 0.3% (v / v), about 0.4% (v / v), about 0.5% (v / v), about 0.6% (v / v), about 0.7% (v / v), about 0.8% (v / v), about 0.9% (v / v), about 1% (v / v), about 2% (v / v), About 3% (v / v), about 4% (v / v), about 5% (v / v), about 6% (v / v), about 7% (v / v), about 8% (v / V), about 9% (v / v), about 10% (v / v), about 15% (v / v), or about 20% (v / v). In some embodiments, a serum replacement is included in the medium.

本明細書中に記載される増殖方法のさらに他の実施形態では、増殖培地は、少なくとも１つの成長因子も含む。或る特定の実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーの一成員を含む成長因子である。このような実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子としては、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びこれらの成長因子の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。或いは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ＩＧＦ１又はＩＧＦとＴＧＦβスーパーファミリーの一成長因子の組合せであり得る。他の実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ又は別の成長因子であり得る。さらに他の実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦβスーパーファミリーの一成長因子の組合せであり得る。上記実施形態の各々において、1つ又は複数の成長因子は、約１ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在し得る。このような実施形態では、培地中の成長因子の濃度は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度である。或る特定の実施形態では、成長因子の組合せが培地中に存在する。このような実施形態では、各成長因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少な
くとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で培地中に存在する。 In yet other embodiments of the growth methods described herein, the growth medium also includes at least one growth factor. In certain embodiments, the at least one growth factor is a growth factor that comprises a member of the TGFβ superfamily. In such embodiments, the at least one growth factor of the TGFβ superfamily includes, but is not limited to, nodal, activin A, activin B, and combinations of these growth factors. Alternatively, in some embodiments, the at least one growth factor can be IGF1 or a combination of IGF and a growth factor of the TGFβ superfamily. In other embodiments, the at least one growth factor can be bFGF, EGF, or another growth factor. In still other embodiments, the at least one growth factor may be a combination of a growth factor of the bFGF, EGF, and TGFβ superfamily. In each of the above embodiments, the one or more growth factors may be present at a concentration ranging from about 1 ng / ml to 5000 ng / ml. In such embodiments, the concentration of the growth factor in the medium is at least about 5 ng / ml, at least about 10 ng / ml, at least about 25 ng / ml, at least about 50 ng / ml, at least about 75 ng / ml, at least about 100 ng / ml. ml, at least about 200 ng / ml, at least about 300 ng / ml, at least about 400 ng / ml, at least about 500 ng / ml, at least about 1000 ng / ml, at least about 2000 ng / ml, at least about 3000 ng / ml, at least about 4000 ng / ml, Concentration of at least about 5000 ng / ml or higher than about 5000 ng / ml. In certain embodiments, a combination of growth factors is present in the medium. In such embodiments, each growth factor is at least about 5 ng / ml, at least about 10 ng / ml, at least about 25 ng / ml, at least about 50 ng / ml, at least about 75 ng / ml, at least about 100 ng / ml, at least about 200 ng / ml, at least about 300 ng / ml, at least about 400 ng / ml, at least about 500 ng / ml, at least about 1000 ng / ml, at least about 2000 ng / ml, at least about 3000 ng / ml, at least about 4000 ng / ml, at least about 5000 ng / ml present in the medium at a concentration greater than ml or about 5000 ng / ml.

上記の増殖方法のほかに、いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、まず、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得し、次に胚体内胚葉細胞を継代培養することによって増殖し、それにより胚体内胚葉細胞を含む複数の細胞培養物を産生する。細胞を継代培養することによる胚体内胚葉細胞のこれらの増殖方法は、このような培養物が得られる方法に関係なく、任意の胚体内胚葉培養物を用いて実施され得る。例えばこれらの方法は、上記の増殖方法において細胞を単離する工程の次に起こる、培養する工程の一部分として実施され得るし、或いはこの方法は、ｈＥＳＣから新たに分化された胚体内胚葉細胞を用いて実施され得る。   In addition to the growth method described above, in some embodiments, definitive endoderm cells are propagated by first obtaining a cell culture comprising definitive endoderm cells and then subculturing the definitive endoderm cells. Thereby producing a plurality of cell cultures comprising definitive endoderm cells. These methods of propagation of definitive endoderm cells by subculturing the cells can be performed using any definitive endoderm culture, regardless of the method by which such a culture is obtained. For example, these methods can be performed as part of the culturing step that follows the step of isolating cells in the above-described growth method, or the method can be performed on newly differentiated definitive endoderm cells from hESCs. Can be implemented.

本明細書中に記載される増殖方法の或る特定の態様に従って、胚体内胚葉細胞を継代培養する工程は、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に少なくとも１つの酵素を提供することを含む。例えば少なくとも１つの酵素は、パパイン、プロナーゼ、Ｉ型コラゲナーゼ、ＩＩ型コラゲナーゼ、ＩＩＩ型コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、DNase Ｉ及びディスパーゼから成る群から選択される１つ又は複数の酵素であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの酵素は、少なくとも１つのプロテアーゼを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つのプロテアーゼは、トリプシンを含む。例えば或る特定の実施形態では、培養容器中で増殖中の胚体内胚葉細胞は、まず細胞から培地を除去することにより、トリプシンを用いて継代培養される。次に滅菌トリプシン溶液が、室温で数分間、胚体内胚葉細胞に提供される。トリプシン溶液は次に、細胞を撹乱しないよう、静かに除去される。トリプシン溶液が除去された後、胚体内胚葉細胞は２％（ｖ／ｖ）の血清を含有するＲＰＭＩのような培地を提供され、そして次に、細胞培養容器を撹拌し、細胞接着を妨げ、細胞懸濁液を生成する。いくつかの実施形態では、細胞培地は、残留トリプシンを不活性化するためにトリプシン阻害剤を含む。   In accordance with certain aspects of the expansion methods described herein, the step of subculturing definitive endoderm cells comprises providing at least one enzyme to a cell culture comprising definitive endoderm cells. . For example, the at least one enzyme is one or more enzymes selected from the group consisting of papain, pronase, type I collagenase, type II collagenase, type III collagenase, type IV collagenase, trypsin, hyaluronidase, elastase, DNase I and dispase. It can be. In some embodiments, the at least one enzyme comprises at least one protease. In preferred embodiments, the at least one protease comprises trypsin. For example, in certain embodiments, definitive endoderm cells growing in a culture vessel are subcultured with trypsin by first removing the medium from the cells. A sterile trypsin solution is then provided to the definitive endoderm cells for several minutes at room temperature. The trypsin solution is then gently removed so as not to disturb the cells. After the trypsin solution is removed, the definitive endoderm cells are provided with a medium such as RPMI containing 2% (v / v) serum, and then the cell culture vessel is agitated to prevent cell adhesion, A cell suspension is produced. In some embodiments, the cell culture medium includes a trypsin inhibitor to inactivate residual trypsin.

トリプシンは種々の滅菌溶液中に提供され得る、例えばトリプシンはハンクス緩衝塩溶液のような平衡塩溶液中の胚体内胚葉細胞に提供され得ることが理解されよう。或いはトリプシンは、例えば低血清ＲＰＭＩ中で、血清を含有するか又は含有しない培地中の胚体内胚葉に提供され得る。   It will be appreciated that trypsin can be provided in a variety of sterile solutions, eg, trypsin can be provided to definitive endoderm cells in a balanced salt solution such as Hanks buffered salt solution. Alternatively, trypsin can be provided to definitive endoderm in a medium with or without serum, eg, in low serum RPMI.

本明細書中に記載される増殖方法の他の態様に従って、胚体内胚葉細胞を継代培養する工程は、上記胚体内胚葉細胞間の接触を機械的に妨げることを包含する。このような機械的阻害技法は、細胞接触及び基材を実質的に妨げるのに十分であるべきであるが、しかしながらこれらの技法は細胞生存度に影響を及ぼすほど厳しくあるべきではない。機械的細胞阻害技法、例えば研和(trituration)は、当業者に既知である。   According to another aspect of the expansion method described herein, the step of subculturing definitive endoderm cells comprises mechanically preventing contact between the definitive endoderm cells. Such mechanical inhibition techniques should be sufficient to substantially interfere with cell contact and substrate, however, these techniques should not be so severe as to affect cell viability. Mechanical cell inhibition techniques, such as trituration, are known to those skilled in the art.

本明細書中に記載される増殖方法のさらに他の態様に従って、胚体内胚葉細胞を継代培養する工程は、細胞分散緩衝液中で上記の胚体内胚葉細胞をインキュベートすることを含む。細胞分散緩衝液は、当該技術分野で既知の任意の分散緩衝液、例えば市販の化学解離緩衝液であり得る。   According to yet another aspect of the growth methods described herein, the step of subculturing definitive endoderm cells comprises incubating the definitive endoderm cells in a cell dispersion buffer. The cell dispersion buffer can be any dispersion buffer known in the art, such as a commercially available chemical dissociation buffer.

本明細書中に記載される増殖方法のいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、細胞培養容器中で増殖される。細胞培養容器としては、例えば組織培養フラスコ及び細胞培養プレート、例えばマイクロタイタープレートが挙げられるが、これらに限定されない。い
くつかの実施形態では、培養中の胚体内胚葉細胞は、基材に付着される。或る特定の実施形態では、上記の胚体内胚葉細胞を継代培養する工程は、基材から上記胚体内胚葉細胞を引き剥がすことを含む。好ましい実施形態では、基材は組織培養フラスコの表面である。他の好ましい実施形態では、基材はマイクロタイタープレートの表面である。 In some embodiments of the growth methods described herein, definitive endoderm cells are grown in cell culture vessels. Examples of cell culture containers include, but are not limited to, tissue culture flasks and cell culture plates such as microtiter plates. In some embodiments, the definitive endoderm cells in culture are attached to a substrate. In certain embodiments, the step of subculturing the definitive endoderm cells comprises detaching the definitive endoderm cells from the substrate. In a preferred embodiment, the substrate is the surface of a tissue culture flask. In another preferred embodiment, the substrate is the surface of a microtiter plate.

以下の実施例の多くは、多能性ヒト細胞の使用を記載する。多能性ヒト細胞の産生方法は当該技術分野で周知であり、そして多数の科学出版物、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、第５，６７０，３７２号、第５，６９０，９２６号、第６，０９０，６２２号、第６，２００，８０６号及び第６，２５１，６７１号、並びに米国特許出願公開第２００４／０２２９３５０号（これらの開示は参照により本明細書中にその全体が援用される）に記載されている。   Many of the examples below describe the use of pluripotent human cells. Methods for producing pluripotent human cells are well known in the art and are numerous scientific publications such as US Pat. Nos. 5,453,357, 5,670,372, 5,690,926. 6,090,622, 6,200,806 and 6,251,671, and U.S. Patent Application Publication No. 2004/0229350, the disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entirety. Incorporated).

ヒトＥＳ細胞
内胚葉発生についてのわれわれの研究のために、多能性であり、そして正常核型を維持しながら培養中に外見上無限に***し得るヒト胚性幹細胞を用いた。単離のために免疫学的又は機械的方法を用いて、５日齢胚内部細胞塊からＥＳ細胞を得た。特にヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５を、患者によるインフォームドコンセント後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精周期からの過剰凍結胚から得た。解凍時に、ＥＳ培地（ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、及びＦＧＦ２）中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に孵化胚盤胞をプレーティングした。胚が培養皿に接着し、そして約２週間後、非分化ｈＥＳＣの領域を、ＭＥＦとともに新たな皿に移した。機械的に切断し、ディスパーゼで手短に消化し、その後、細胞クラスターを機械的に取り出して、洗浄し、再度プレーティングすることにより移動を成し遂げた。誘導以来、ｈＥＳＣｙｔ−２５を、１００回にわたって連続継代培養した。胚体内胚葉の産生のための出発物質として、ｈＥＳＣｙｔ−２５ヒト胚性幹細胞株を用いた。 Human ES cells For our study of endoderm development, human embryonic stem cells that were pluripotent and capable of apparently dividing in culture while maintaining normal karyotype were used. ES cells were obtained from 5-day-old embryo inner cell mass using immunological or mechanical methods for isolation. In particular, the human embryonic stem cell line hESCyt-25 was obtained from over-frozen embryos from the in vitro fertilization cycle after informed consent by the patient. Upon thawing, hatched blastocysts were plated on mouse embryonic fibroblasts (MEF) in ES medium (DMEM, 20% FBS, non-essential amino acids, β-mercaptoethanol, and FGF2). The embryos adhered to the culture dish and after about 2 weeks, the area of undifferentiated hESC was transferred to a new dish along with MEF. Migration was accomplished by mechanically cutting and digesting briefly with dispase, after which the cell clusters were mechanically removed, washed and re-plated. Since induction, hESCyt-25 has been serially subcultured 100 times. The hESCyt-25 human embryonic stem cell line was used as starting material for the production of definitive endoderm.

幹細胞又は他の多能性細胞は本明細書中に記載される分化手順のための出発物質としても用いられ得ることが当業者には理解されよう。例えば当該技術分野で既知の方法により単離され得る胚性生殖腺***から得られる細胞は、多能性細胞出発物質として用いられ得る。   One skilled in the art will appreciate that stem cells or other pluripotent cells can also be used as starting materials for the differentiation procedures described herein. For example, cells obtained from embryonic gonad protuberances that can be isolated by methods known in the art can be used as pluripotent cell starting materials.

ｈＥＳＣｙｔ−２５特徴付け
ヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、培養で１８ヶ月にわたって、正常形態学、核型、増殖及び自己再生特性を維持した。この細胞株は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ−４及びＴＲＡ−１−６０抗原（これらはすべて、非分化ｈＥＳＣに特有である）に対する強免疫反応性を示し、そしてアルカリホスファターゼ活性、並びに他の確立されたｈＥＳＣ株と同一の形態学を示す。さらにヒト幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、懸濁液中で培養される場合、胚様体（ＥＢ）も容易に形成する。その多能性性質の実証として、ｈＥＳＣｙＴ−２５は、３つの主要な胚葉を表す種々の細胞型に分化する。ＺＩＣ１に関するＱ−ＰＣＲ、並びにネスチン及びより成熟したニューロンマーカーに関する免疫細胞化学（ＩＣＣ）により、外胚葉産生を実証した。β−ＩＩＩチューブリンに関する免疫細胞化学染色を、初期ニューロンに特徴的な伸長細胞のクラスター中で観察した。予め、レチノイン酸で懸濁液中のＥＢを処理して、臓側内胚葉（ＶＥ）、胚体外系統への多能性幹細胞の分化を誘導した。処理細胞は、高レベルのα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）及びＳＯＸ７（ＶＥの２つのマーカー）を５４時間の処理により発現した。単層中で分化された細胞は、免疫細胞化学染色により実証されるように、散在性パッチ中でＡＦＰを発現した。以下で記載するように、ｈＥＳＣｙＴ−２５細胞株は、ＡＦＰ発現の非存在下でのＳＯＸ１７に関するリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）及び免疫細胞化学により立証される
ように、胚体内胚葉も形成し得た。中胚葉への分化を実証するために、分化中のＥＢを、いくつかの時点でのブラキュリ（Brachyury）遺伝子発現に関して分析した。ブラキュリ発現は、実験経過中に漸進的に増大した。上記に鑑みて、三胚葉を表す細胞を形成する能力により示されるように、ｈＥＳＣｙＴ−２５株は多能性である。 hESCyt-25 Characterization The human embryonic stem cell line hESCyt-25 maintained normal morphology, karyotype, proliferation and self-renewal properties over 18 months in culture. This cell line exhibits strong immunoreactivity for OCT4, SSEA-4 and TRA-1-60 antigens, all of which are unique to non-differentiated hESCs, and alkaline phosphatase activity, as well as other established hESCs. Shows the same morphology as the strain. Furthermore, the human stem cell line hESCyt-25 readily forms embryoid bodies (EBs) when cultured in suspension. As a demonstration of its pluripotent nature, hESCyT-25 differentiates into various cell types that represent the three major germ layers. Ectodermal production was demonstrated by Q-PCR for ZIC1 and immunocytochemistry (ICC) for nestin and more mature neuronal markers. Immunocytochemical staining for β-III tubulin was observed in clusters of elongated cells characteristic of early neurons. In advance, EBs in suspension were treated with retinoic acid to induce differentiation of pluripotent stem cells into visceral endoderm (VE) and extraembryonic lineages. Treated cells expressed high levels of α-fetoprotein (AFP) and SOX7 (two markers of VE) by treatment for 54 hours. Cells differentiated in monolayers expressed AFP in scattered patches as demonstrated by immunocytochemical staining. As described below, the hESCyT-25 cell line is also a definitive endoderm as demonstrated by real-time quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) and immunocytochemistry for SOX17 in the absence of AFP expression. Could be formed. To demonstrate differentiation into mesoderm, differentiating EBs were analyzed for Brachyury gene expression at several time points. Brachyury expression increased progressively over the course of the experiment. In view of the above, the hESCyT-25 strain is pluripotent, as shown by its ability to form cells representing the three germ layers.

ＳＯＸ１７抗体の産生
ｈＥＳＣ培養物における胚体内胚葉の同定に対する主要な妨害は、適切なツールの欠如である。したがって、本発明者等は、ヒトＳＯＸ１７タンパク質に対して産生される抗体の産生に着手した。 Production of SOX17 antibody A major obstacle to the identification of definitive endoderm in hESC cultures is the lack of appropriate tools. Therefore, the present inventors set out to produce antibodies produced against human SOX17 protein.

マーカーＳＯＸ１７は、それが原腸陥入中に形成する際に胚体内胚葉全体にわたって発現され、その発現は、器官形成の開始まで腸管で維持される（しかし、発現のレベルは、Ａ−Ｐ軸に沿って様々である）。ＳＯＸ１７はまた、胚体外内胚葉細胞のサブセットでも発現される。このタンパク質の発現はまた、中胚葉又は外胚葉では観察されていない。ＳＯＸ１７は、胚体外系統を排除するためのマーカーと併用される場合、胚体内胚葉系統に適切なマーカーであることが現在発見されている。   The marker SOX17 is expressed throughout the definitive endoderm as it forms during gastrulation, and its expression is maintained in the intestine until the onset of organogenesis (but the level of expression is expressed in the AP axis). Along with various). SOX17 is also expressed in a subset of extraembryonic endoderm cells. Expression of this protein has also not been observed in mesoderm or ectoderm. It has now been discovered that SOX17 is a suitable marker for the definitive endoderm lineage when used in combination with a marker to eliminate extraembryonic lines.

本明細書中で詳述するように、ＳＯＸ１７抗体を、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の産生を目的とした様々な処理及び分化手順の影響を具体的に検査するのに利用した。ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ及びトロンボモジュリンに対して反応性の他の抗体もまた、臓側及び壁側内胚葉（胚体外内胚葉）の産生を除外するのに使用された。   As detailed herein, the SOX17 antibody was utilized to specifically examine the effects of various treatments and differentiation procedures aimed at producing SOX17 positive definitive endoderm cells. Other antibodies reactive to AFP, SPARC and thrombomodulin were also used to rule out the production of visceral and parietal endoderm (extraembryonic endoderm).

ＳＯＸ１７に対する抗体を産生するために、ＳＯＸ１７タンパク質のカルボキシ末端におけるアミノ酸１７２〜４１４（配列番号２）に相当するヒトＳＯＸ１７ ｃＤＮＡ（配列番号１）の一部分（図２）を、抗体産生会社GENOVAC(Freiberg, Germany)にて、そこで開発された手順に従って、ラットにおける遺伝子免疫化に使用した。遺伝子免疫化に関する手順は、米国特許第５，８３０，８７６号、同第５，８１７，６３７号、同第６，１６５，９９３号及び同第６，２６１，２８１号、並びに国際特許出願公開第ＷＯ００／２９４４２号及び同第ＷＯ９９／１３９１５号に見出すことができる。それらの開示は参照により本明細書に全体が援用される。   To produce an antibody against SOX17, a portion of human SOX17 cDNA (SEQ ID NO: 1) corresponding to amino acids 172 to 414 (SEQ ID NO: 2) at the carboxy terminus of the SOX17 protein was obtained from the antibody production company GENOVAC (Freiberg, Germany) was used for gene immunization in rats according to the procedure developed there. Procedures for gene immunization are described in US Pat. Nos. 5,830,876, 5,817,637, 6,165,993 and 6,261,281, and International Patent Application Publication No. It can be found in WO 00/29442 and WO 99/13915. The disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entirety.

遺伝子免疫化に関する他の適切な方法はまた、非特許文献にも記載されている。例えば、Barry他は、Biotechniques 16: 616-620, 1994（その開示が参照により本明細書に全体が援用される）において遺伝子免疫化によるモノクローナル抗体の産生について記載している。特異的タンパク質に対する抗体を産生するための遺伝子免疫化方法の具体例は、例えば、Costaglia et al., (1998) Genetic immunization against the human thyrotropin receptor causes thyroiditis and allows production of monoclonal antibodies recognizing the native receptor, J. Immunol. 160: 1458-1465、Kilpatrick et al (1998) Gene gun delivered DNA-based immunizations mediate rapid production of murine monoclonal antibodies to the Flt-3 receptor, Hybridoma 17: 569-576、Schmolke et al., (1998) Identification of hepatitis G virus particles in human serum by E2-specific monoclonal antibodides generated by DNA immunization, J. Virol. 72: 4541-4545、Krasemann et al., (1999) Generation of monoclonal antibodides against proteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy, J. Biotechnol. 73: 119-129、及びUlivieri et al, (1996) Generation of a monoclonal antibody to a defined portion of the Heliobacter pylori vacuolating cytotoxin by DNA immunization, J. Biotechnol. 51: 191-194に見出すことができる。それらの開示は参照により本明細書に全体が援用される。   Other suitable methods for gene immunization are also described in non-patent literature. For example, Barry et al. Describe the production of monoclonal antibodies by gene immunization in Biotechniques 16: 616-620, 1994, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety. Specific examples of gene immunization methods for producing antibodies against specific proteins include, for example, Costaglia et al., (1998) Genetic immunization against the human thyrotropin receptor causes thyroiditis and allows production of monoclonal antibodies recognizing the native receptor, J Immunol. 160: 1458-1465, Kilpatrick et al (1998) Gene gun delivered DNA-based immunizations mediate rapid production of murine monoclonal antibodies to the Flt-3 receptor, Hybridoma 17: 569-576, Schmolke et al., (1998 ) Identification of hepatitis G virus particles in human serum by E2-specific monoclonal antibodides generated by DNA immunization, J. Virol. 72: 4541-4545, Krasemann et al., (1999) Generation of monoclonal antibodides against proteins with an unconventional nucleic acid -based immunization strategy, J. Biotechnol. 73: 119-129, and Ulivieri et al, (1996) Generation of a monoclonal antibody to a defined portion of the Heliobacter pylori vacuolating cytotoxin by DNA im munization, J. Biotechnol. 51: 191-194. The disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entirety.

ＳＯＸ７及びＳＯＸ１８は、図３に示される関係樹状図に表されるようにＳＯＸ１７に対して最も密接なＳｏｘファミリーである。本発明者等は、遺伝子免疫化により産生されるＳＯＸ１７抗体がＳＯＸ１７に特異的であり、またその最も密接なファミリー成員と反応しないことを実証するために、陰性対照としてヒトＳＯＸ７ポリペプチドを用いた。特に、ＳＯＸ７及び他のタンパク質は、ヒト線維芽細胞において発現させ、続いてウェスタンブロット及びＩＣＣによりＳＯＸ１７抗体との交差反応性に関して分析した。例えば、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７及びＥＧＦＰ発現ベクターの産生、ヒト線維芽細胞へのそれらのトランスフェクション、並びにウェスタンブロットによる分析に関して以下の方法を利用した。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７及びＥＧＦＰの産生に用いられる発現ベクターは、それぞれｐＣＭＶ６(OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD)、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６(Invitrogen, Carlsbad, CA)及びｐＥＧＦＰ−Ｎ１(Clonetech, Palo Alto, CA)であった。タンパク質産生に関して、テロメラーゼ不死化ＭＤＸヒト線維芽細胞を、リポフェクタミン２０００(Invitrogen Carlsbad, CA)の存在下で、スーパーコイルＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。総細胞溶解産物は、トランスフェクションの３６時間後に、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)を含有する５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸中に収集した。ＮｕＰＡＧＥ（４〜１２％勾配ポリアクリルアミド、Invitrogen, Carlsbad, CA)上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、且つＰＤＶＦ膜(Hercules, CA)上へのエレクトロブロッティングにより移動された細胞タンパク質１００μｇのウェスタンブロット分析は、１０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０(Sigma, St. Louis, MO)中のラットＳＯＸ１７抗血清の１／１０００希釈で、続いてアルカリホスファターゼ結合抗ラットＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)プローブして、ベクターブラックアルカリホスファターゼ染色(Vector Laboratories, Burlingame, CA)により明らかにした。使用されるタンパク質サイズ標準物質は、広範囲の色彩マーカー(Sigma, St. Louis, MO)であった。   SOX7 and SOX18 are the closest Sox families to SOX17 as represented in the relational dendrogram shown in FIG. We used human SOX7 polypeptide as a negative control to demonstrate that the SOX17 antibody produced by gene immunization is specific for SOX17 and does not react with its closest family members. . In particular, SOX7 and other proteins were expressed in human fibroblasts and subsequently analyzed for cross-reactivity with SOX17 antibody by Western blot and ICC. For example, the following method was utilized for the production of SOX17, SOX7 and EGFP expression vectors, their transfection into human fibroblasts, and analysis by Western blot. Expression vectors used for production of SOX17, SOX7 and EGFP are pCMV6 (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD), pCMV-SPORT6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) and pEGFP-N1 (Clonetech, Palo Alto, CA), respectively. Met. For protein production, telomerase immortalized MDX human fibroblasts were transiently transfected with supercoiled DNA in the presence of Lipofectamine 2000 (Invitrogen Carlsbad, CA). Total cell lysate was obtained 36 mM after transfection in 50 mM TRIS-HCl (pH 8) containing a cocktail of protease inhibitors (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5 Collected in% deoxycholic acid. Western blot analysis of 100 μg of cellular protein separated by SDS-PAGE on NuPAGE (4-12% gradient polyacrylamide, Invitrogen, Carlsbad, Calif.) And transferred by electroblotting onto PDVF membrane (Hercules, Calif.) Is a 1/1000 dilution of rat SOX17 antiserum in 10 mM TRIS-HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 10% BSA, 0.05% Tween-20 (Sigma, St. Louis, Mo.) followed by alkaline phosphatase. Bound anti-rat IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.) Probed and revealed by vector black alkaline phosphatase staining (Vector Laboratories, Burlingame, Calif.). The protein size standard used was a wide range of color markers (Sigma, St. Louis, MO).

図４では、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７又はＥＧＦＰ ｃＤＮＡで一過的にトランスフェクトされたヒト線維芽細胞から作製されるタンパク質抽出物を、ＳＯＸ１７抗体によりウェスタンブロットでプローブした。ｈＳＯＸ１７トランスフェクト細胞からのタンパク質抽出物のみが、ヒトＳＯＸ１７タンパク質の予測された４６Ｋｄａ分子量に近い約５１Ｋｄａのバンドを生じた。ヒトＳＯＸ７又はＥＧＦＰトランスフェクト細胞のいずれかから作製される抽出物に対してＳＯＸ１７抗体の反応性は見られなかった。さらに、ＳＯＸ１７抗体は、ｈＳＯＸ１７発現構築物でトランスフェクトしたヒト線維芽細胞の核を明らかに標識したが、ＥＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞は標識しなかった。したがって、ＳＯＸ１７抗体は、ＩＣＣによる特異性を示す。   In FIG. 4, protein extracts made from human fibroblasts transiently transfected with SOX17, SOX7 or EGFP cDNA were probed by Western blot with SOX17 antibody. Only the protein extract from hSOX17 transfected cells yielded a band of approximately 51 Kda that was close to the predicted 46 Kda molecular weight of human SOX17 protein. There was no reactivity of the SOX17 antibody to extracts made from either human SOX7 or EGFP transfected cells. Furthermore, the SOX17 antibody clearly labeled the nuclei of human fibroblasts transfected with the hSOX17 expression construct, but not the cells transfected with EGFP alone. Therefore, the SOX17 antibody shows specificity by ICC.

胚体内胚葉のマーカーとしてのＳＯＸ１７抗体の確証
部分的に分化させたｈＥＳＣをＳＯＸ１７及びＡＦＰ抗体で同時標識して、ＳＯＸ１７抗体がヒトＳＯＸ１７タンパク質に特異的であり、さらに胚体内胚葉をマークすることを実証した。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７（これは、ＳＯＸ遺伝子ファミリーサブグループＦの密接に関連する成員である（図３））及びＡＦＰはそれぞれ、臓側内胚葉で発現されることが実証されている。しかしながら、ＡＦＰ及びＳＯＸ７は、ＩＣＣにより検出可能なレベルでは、胚体内胚葉細胞では発現されず、したがってそれらは、真正の胚体内胚葉細胞に関する陰性マーカーとして用いることができる。ＳＯＸ１７抗体は、細胞の別個の分類として存在するか、或いはＡＦＰ陽性細胞と混合される細胞の集団を標識することが示された。特に、図５Ａは、少数のＳＯＸ１７細胞がＡＦＰで同時標識されることを示すが、ＳＯＸ１７+細胞の視野においてＡＦＰ+細胞がほとんど存在しないか、或いは全く存在しない領域も見られた（図５Ｂ）。同様に、壁側内胚葉は、ＳＯＸ１７を発現することが報告
されているため、壁側マーカーＳＰＡＲＣ及び／又はトロンボモジュリン（ＴＭ）と共にＳＯＸ１７による抗体同時標識を使用して、壁側内胚葉であるＳＯＸ１７+細胞を同定することができる。図６Ａ〜図６Ｃに示されるように、トロンボモジュリン及びＳＯＸ１７で同時標識された壁側内胚葉細胞は、ｈＥＳ細胞の無作為分化により産生された。 Confirmation of SOX17 antibody as a marker of definitive endoderm Co-labeling partially differentiated hESCs with SOX17 and AFP antibodies, indicating that SOX17 antibody is specific for human SOX17 protein and further marks definitive endoderm Demonstrated. SOX17, SOX7 (which is a closely related member of SOX gene family subgroup F (FIG. 3)) and AFP are each demonstrated to be expressed in visceral endoderm. However, AFP and SOX7 are not expressed in definitive endoderm cells at levels detectable by ICC, and therefore they can be used as negative markers for authentic definitive endoderm cells. The SOX17 antibody has been shown to label a population of cells that exist as a separate class of cells or that are mixed with AFP positive cells. In particular, FIG. 5A shows that a small number of SOX17 cells are co-labeled with AFP, but there were also areas where there was little or no AFP + cells in the field of SOX17 + cells (FIG. 5B). . Similarly, because the parietal endoderm has been reported to express SOX17, using co-labeling of antibodies with SOX17 in conjunction with the parietal markers SPARC and / or thrombomodulin (TM), SOX17, the parietal endoderm, is used. + Cells can be identified. As shown in FIGS. 6A-6C, mural endoderm cells co-labeled with thrombomodulin and SOX17 were produced by random differentiation of hES cells.

上記細胞標識実験を考慮して、胚体内胚葉細胞の同一性は、マーカープロフィールＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／［ＴＭlo又はＳＰＡＲＣlo］により樹立され得る。換言すると、ＳＯＸ１７マーカーの発現は、臓側内胚葉に特徴的であるＡＦＰマーカー、及び壁側内胚葉に特徴的であるＴＭ又はＳＰＡＲＣマーカーの発現よりも多い。したがって、ＳＯＸ１７に関して陽性であるが、ＡＦＰに対して陰性であり、且つＴＭ又はＳＰＡＲＣに対して陰性である細胞は、胚体内胚葉である。 In view of the above cell labeling experiments, the identity of definitive endoderm cells can be established by the marker profile SOX17 hi / AFP lo / [TM lo or SPARC lo ]. In other words, the expression of the SOX17 marker is greater than the expression of the AFP marker that is characteristic of visceral endoderm and the TM or SPARC marker that is characteristic of parietal endoderm. Thus, cells that are positive for SOX17 but negative for AFP and negative for TM or SPARC are definitive endoderm.

胚体内胚葉の予測となるようなＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／ＴＭlo／ＳＰＡＲＣloマーカープロフィールの特異性のさらなる徴候として、ＳＯＸ１７及びＡＦＰ遺伝子発現が、抗体標識細胞の相対数と定量的に比較された。図７Ａに示されるように、レチノイン酸（臓側内胚葉誘導物質）又はアクチビンＡ（胚体内胚葉誘導物質）で処理したｈＥＳＣは、ＳＯＸ１７ ｍＲＮＡ発現のレベルにおいて１０倍の差をもたらした。この結果は、ＳＯＸ１７抗体標識細胞数における１０倍の差を反映している（図７Ｂ）。さらに、図８Ａに示されるように、ｈＥＳＣのアクチビンＡ処理は、処理なしと比較して６．８倍分ＡＦＰ遺伝子発現を抑制した。これは、図８Ｂ及び図８Ｃに示されるように、これらの培養物におけるＡＦＰ標識細胞の数の劇的な減少により可視的に反映された。これをさらに定量化するために、ＡＦＰ遺伝子発現におけるこのおよそ７倍の減少は、フローサイトメトリーにより測定される場合のＡＦＰ抗体標識細胞数における同様の７倍の減少の結果であることが実証された（図９Ａ及び図９Ｂ）。この結果は、Ｑ−ＰＣＲにより観察されるような遺伝子発現の定量的変化は、抗体染色により観察されるような細胞型特定化における変化を反映することを示すという点で極めて重要である。 As a further indication of the specificity of the SOX17 hi / AFP lo / TM lo / SPARC lo marker profile as predictive of definitive endoderm, SOX17 and AFP gene expression was quantitatively compared with the relative number of antibody-labeled cells. . As shown in FIG. 7A, hESCs treated with retinoic acid (visceral endoderm inducer) or activin A (definitive endoderm inducer) resulted in a 10-fold difference in the level of SOX17 mRNA expression. This result reflects a 10-fold difference in the number of SOX17 antibody-labeled cells (FIG. 7B). Furthermore, as shown in FIG. 8A, activin A treatment of hESC suppressed AFP gene expression by 6.8 times compared with no treatment. This was visibly reflected by a dramatic decrease in the number of AFP-labeled cells in these cultures, as shown in FIGS. 8B and 8C. To further quantify this, it has been demonstrated that this approximately 7-fold decrease in AFP gene expression is the result of a similar 7-fold decrease in the number of AFP antibody-labeled cells as measured by flow cytometry. (FIGS. 9A and 9B). This result is extremely important in that it shows that quantitative changes in gene expression as observed by Q-PCR reflect changes in cell type specification as observed by antibody staining.

ノーダルファミリー成員（ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢ−ＮＡＡ）の存在下でのｈＥＳＣのインキュベーションは、経時的にＳＯＸ１７抗体標識細胞の有意な増大をもたらした。連続的なアクチビン処理の５日目までには、５０％を超える細胞がＳＯＸ１７で標識された（図１０Ａ〜図１０Ｆ）。アクチビン処理の５日後にはＡＦＰで標識された細胞はほとんど存在しなかったか、或いは全く存在しなかった。   Incubation of hESC in the presence of nodal family members (Nodal, Activin A and Activin B-NAA) resulted in a significant increase in SOX17 antibody-labeled cells over time. By day 5 of continuous activin treatment, more than 50% of the cells were labeled with SOX17 (FIGS. 10A-10F). There were few or no cells labeled with AFP 5 days after activin treatment.

要約すると、ヒトＳＯＸ１７タンパク質のカルボキシ末端の２４２個のアミノ酸に対して産生される抗体は、ウェスタンブロットでヒトＳＯＸ１７タンパク質を同定したが、その最も密接なＳｏｘファミリー類縁体であるＳＯＸ７を認識しなかった。ＳＯＸ１７抗体は、主としてＳＯＸ１７+／ＡＦＰlo/-である分化ｈＥＳＣ培養物における細胞のサブセット（９５％を超える標識細胞）並びにＳＯＸ１７及びＡＦＰ（臓側内胚葉）に関して同時標識する少量パーセント（５％未満）の細胞を認識した。アクチビンによるｈＥＳＣ培養物の処理は、ＳＯＸ１７遺伝子発現並びにＳＯＸ１７標識細胞の顕著な増大をもたらし、ＡＦＰ ｍＲＮＡの発現及びＡＦＰ抗体で標識した細胞の数を劇的に抑制した。 In summary, antibodies raised against the carboxy-terminal 242 amino acids of human SOX17 protein identified human SOX17 protein by Western blot but did not recognize its closest Sox family analog, SOX7. . The SOX17 antibody co-labels for a subset of cells (greater than 95% labeled cells) and differentiated SES17 and AFP (visceral endoderm) in differentiated hESC cultures that are primarily SOX17 + / AFP lo / − (less than 5%) ) Was recognized. Treatment of hESC cultures with activin resulted in a marked increase in SOX17 gene expression as well as SOX17 labeled cells, dramatically reducing AFP mRNA expression and the number of cells labeled with AFP antibodies.

Ｑ−ＰＣＲ遺伝子発現アッセイ
以下の実験では、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）が、ｈＥＳＣ分化に対する様々な処理の影響をスクリーニングするのに使用される主要なアッセイであった。特に、遺伝子発現のリアルタイム測定値が、Ｑ−ＰＣＲにより多数の時点で多数のマーカー遺伝子に関して分析された。細胞集団の全体的な動態のより良好な理解を得るために、所望の細胞型並びに望ましくない細胞型のマーカー遺伝子の特徴を評価した。Ｑ−ＰＣＲ分析の長所として、ゲノム配列が容易に入手可能である場合、その極度の感受性及び必要
なマーカーを開発することが比較的容易であることが挙げられる。さらに、Ｑ−ＰＣＲの極めて高い感受性により、相当大きな集団内での比較的少数の細胞からの遺伝子発現の検出が可能となる。さらに、非常に低レベルの遺伝子発現を検出する能力は、集団内の「分化の偏り」に関する指標を提供する。これらの細胞の表現型の明白な分化に先立つ特定の分化経路に向かう偏りは、免疫細胞化学的技法を使用して認知することができない。このため、Ｑ−ＰＣＲは、分化処理の成功をスクリーニングするための、免疫組織化学的技法に対して少なくとも補完的であり且つ免疫組織化学的技法よりも潜在的に相当優れている分析の方法を提供する。さらに、Ｑ−ＰＣＲは、半ハイスループットスケール(semi-high
throughput scale)の分析にて定量的方式で分化プロトコルの成功を評価するメカニズムを提供する。 Q-PCR Gene Expression Assay In the following experiments, real-time quantitative RT-PCR (Q-PCR) was the primary assay used to screen the effects of various treatments on hESC differentiation. In particular, real-time measurements of gene expression were analyzed for multiple marker genes at multiple time points by Q-PCR. In order to gain a better understanding of the overall dynamics of the cell population, the characteristics of the marker gene of the desired cell type as well as the undesirable cell type were evaluated. The advantage of Q-PCR analysis is that, if the genomic sequence is readily available, it is relatively easy to develop its extreme sensitivity and the necessary markers. Furthermore, the extremely high sensitivity of Q-PCR allows detection of gene expression from a relatively small number of cells within a fairly large population. Furthermore, the ability to detect very low levels of gene expression provides an indication of “differentiation bias” within a population. The bias towards specific differentiation pathways prior to the apparent differentiation of these cell phenotypes cannot be recognized using immunocytochemical techniques. For this reason, Q-PCR provides an analytical method that is at least complementary to and potentially significantly superior to immunohistochemical techniques for screening for successful differentiation treatments. provide. Furthermore, Q-PCR is a semi-high throughput scale (semi-high
Provides a mechanism to evaluate the success of differentiation protocols in a quantitative manner in the analysis of throughput scale).

本実施例で採用するアプローチは、Ｒｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ ３０００機器(Corbett Research)上でのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ化学及び２段階ＲＴ−ＰＣＲ方式を使用して相対定量を実施することであった。かかるアプローチにより、今後のさらなるマーカー遺伝子の分析用のｃＤＮＡサンプルの積上げが可能となり、このようにして、サンプル間の逆転写効率における可変性を回避した。   The approach taken in this example was to perform relative quantification using SYBR Green chemistry and a two-step RT-PCR format on a Rotor Gene 3000 instrument (Corbett Research). Such an approach allowed the accumulation of cDNA samples for further marker gene analysis in the future, thus avoiding variability in reverse transcription efficiency between samples.

プライマーは、これが混入ゲノムＤＮＡからの増殖を排除すると実験的に確定されているため、エクソン間境界にわたって存在するか、又は可能であれば少なくとも８００ｂｐのイントロンにまたがるように設計された。イントロンを含まないマーカー遺伝子を使用したか、又はマーカー遺伝子が偽遺伝子を保有した場合、ＲＮＡサンプルのDNase Ｉ処理を実施した。   The primer was designed to exist across the inter-exon boundary, or possibly span at least 800 bp introns, as this has been experimentally determined to eliminate growth from contaminating genomic DNA. When a marker gene containing no intron was used, or when the marker gene carried a pseudogene, DNase I treatment of the RNA sample was performed.

本発明者等は、細胞サンプルにおける遺伝子発現の広範囲のプロフィール描写を提供するために、日常的にＱ−ＰＣＲを使用して、標的及び非標的細胞型の多数のマーカーの遺伝子発現を測定した。ｈＥＳＣ分化の初期（具体的には、外胚葉、中胚葉、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉）に関連し、且つ確証されたプライマー組が利用可能であるマーカーを以下の表１に提供する。これらのプライマー組のヒト特異性もまた実証されている。ｈＥＳＣが多くの場合マウスフィーダー層上で増殖するため、このことは重要な事実である。最も典型的には、三重反復サンプルが各条件に関して採取され、各定量的確定に関連した生物学的可変性を評価するために二重反復で個別に分析した。   The inventors routinely used Q-PCR to measure gene expression of numerous markers of target and non-target cell types in order to provide a broad profiling of gene expression in cell samples. Table 1 below provides markers that are relevant to early stages of hESC differentiation (specifically, ectoderm, mesoderm, definitive endoderm and extraembryonic endoderm) and for which validated primer sets are available. The human specificity of these primer sets has also been demonstrated. This is an important fact since hESCs often grow on the mouse feeder layer. Most typically, triplicate samples were taken for each condition and analyzed individually in duplicate to assess the biological variability associated with each quantitative determination.

ＰＣＲ鋳型を生成するために、総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ(Qiagen)を使用して単離して、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ(Molecular Probes)を用いて定量化した。総ＲＮＡ ３５０〜５００ｎｇからの逆転写を、オリゴｄＴ及びランダムプライマーのミックスを含有するｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット(BioRad)を使用して実施した。続いて、反応物それぞれ２０μＬを総容量１００μＬにまで希釈して、このうち３μＬを、それぞれ４００ｎＭ順方向プライマー及び逆方向プライマー並びに２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス(Qiagen) ５μＬを含有するＱ−ＰＣＲ反応物１０μＬにおいて使用した。２段階サイクリングパラメータは、８５〜９４℃（具体的には各プライマー組に関するアンプリコンの融点に従って選択される）で５秒の変性、続く６０℃での４５秒のアニール／伸長を用いて使用した。各伸長段階の最後の１５秒の間に、蛍光データを収集した。３点の１０倍希釈シリーズを使用して、各実施に関する標準曲線を作成して、サイクル閾値（Ｃｔ）をこの標準曲線に基づいて定量値へ変換した。各サンプルに関する定量値は、ハウスキーピング遺伝子性能に対して標準化し、続いて平均値及び標準偏差は、三重反復サンプルに関して算出した。ＰＣＲサイクリングの終わりには、融解曲線分析を実施して、反応物の特異性を確かめた。単一の特異的産物は、そのＰＣＲアンプリコンに適したＴmでの単一ピークにより示された。さらに、逆転写酵素なしで実施される反応は、陰性対照として役立ち、増殖しない。 To generate PCR templates, total RNA was isolated using RNeasy (Qiagen) and quantified using RiboGreen (Molecular Probes). Reverse transcription from 350-500 ng of total RNA was performed using an iScript reverse transcriptase kit (BioRad) containing a mix of oligo dT and random primers. Subsequently, 20 μL of each reaction was diluted to a total volume of 100 μL, of which 3 μL was each Q-PCR reaction containing 5 μL of 400 nM forward and reverse primers and 2 × SYBR Green master mix (Qiagen). Used in 10 μL. Two-step cycling parameters were used with a 5-second denaturation at 85-94 ° C. (specifically selected according to the melting point of the amplicon for each primer set) followed by a 45-second anneal / extension at 60 ° C. . Fluorescence data was collected during the last 15 seconds of each extension step. A standard curve for each run was generated using a three-point 10-fold dilution series and the cycle threshold (Ct) was converted to a quantitative value based on this standard curve. Quantitative values for each sample were normalized to housekeeping gene performance, followed by mean values and standard deviations calculated for triplicate samples. At the end of PCR cycling, a melting curve analysis was performed to confirm the specificity of the reaction. A single specific product was indicated by a single peak at T m suitable for the PCR amplicon. Furthermore, reactions performed without reverse transcriptase serve as negative controls and do not grow.

Ｑ−ＰＣＲ方法論を確立する際の第１の工程は、実験系における適切なハウスキーピング遺伝子（ＨＧ）の検証であった。ＨＧは、ＲＮＡインプット、ＲＮＡ完全性及びＲＴ効率に関してサンプルにわたって標準化するのに使用されるため、標準化が意味のあるものであるためには、ＨＧがすべてのサンプル型において経時的に一定レベルの発現を示すことが重要であった。本発明者等は、分化ｈＥＳＣにおけるサイクロフィリンＧ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、β−２−ミクログロブリン、ヒドロキシメチルビランシンターゼ(hydroxymethylbiane synthase)（ＨＭＢＳ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）及びグルクロニダーゼβ（ＧＵＳ）の発現レベルを測定した。本発明者等の結果により、β−２−ミクログロブリン発現レベルが、分化の間に増大されることが示され、したがって本発明者等は、標準化のためにこの遺伝子の使用を排除した。他の遺伝子は、経時的に、並びに複数の処理にわたって一貫した発現レベルを示した。本発明者等は日常的に、サイクロフィリンＧ及びＧＵＳの両方を使用して、すべてのサンプルに関して標準化因子を算出した。多数のＨＧの使用は、同時に標準化プロセスに対する固有の可変性を低減し、相対遺伝子発現値の信頼性を増大させる。   The first step in establishing the Q-PCR methodology was the verification of the appropriate housekeeping gene (HG) in the experimental system. Since HG is used to normalize across samples with respect to RNA input, RNA integrity and RT efficiency, for normalization to be meaningful, HG is expressed at a constant level over time in all sample types. It was important to show. We have identified cyclophilin G, hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT), β-2-microglobulin, hydroxymethylbiane synthase (HMBS), TATA binding protein (TBP) and glucuronidase in differentiated hESCs. The expression level of β (GUS) was measured. Our results indicate that β-2-microglobulin expression levels are increased during differentiation, so we have eliminated the use of this gene for normalization. Other genes showed consistent expression levels over time as well as across multiple treatments. We routinely calculated standardization factors for all samples using both cyclophilin G and GUS. The use of multiple HGs simultaneously reduces the inherent variability to the standardization process and increases the reliability of relative gene expression values.

標準化において使用するための遺伝子を取得した後、続いてＱ−ＰＣＲを利用して、種々の実験処理を施したサンプルにわたる多くのマーカー遺伝子の相対遺伝子発現レベルを確定した。用いたマーカー遺伝子は、それらが初期胚葉の代表的な特異的集団において富化を示すことから選択されており、特に胚体内胚葉及び胚体外内胚葉で差次的に発現される遺伝子の組に焦点を当てている。これらの遺伝子並びにそれらの関連富化プロフィールを表１に強調している。   After obtaining a gene for use in normalization, Q-PCR was subsequently utilized to determine the relative gene expression levels of a number of marker genes across samples subjected to various experimental treatments. The marker genes used were selected because they show enrichment in a representative specific population of early germ layers, especially in the set of genes that are differentially expressed in definitive endoderm and extraembryonic endoderm. Focused. These genes and their associated enrichment profiles are highlighted in Table 1.

多くの遺伝子が、２つ以上の多い胚葉で発現されるため、同じ実験内で多くの遺伝子の発現レベルを定量的に比較することが有用である。ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉で、またより程度は低いが、臓側及び壁側内胚葉で発現される。ＳＯＸ７及びＡＦＰは、この初期発生時点で、臓側内胚葉で発現される。ＳＰＡＲＣ及びＴＭは、壁側内胚葉で発現され、ブラキュリは、初期中胚葉で発現される。   Since many genes are expressed in two or more germ layers, it is useful to quantitatively compare the expression levels of many genes within the same experiment. SOX17 is expressed in definitive endoderm and, to a lesser extent, in visceral and parietal endoderm. SOX7 and AFP are expressed in the visceral endoderm at this early developmental point. SPARC and TM are expressed in the parietal endoderm and Brachyury is expressed in the early mesoderm.

胚体内胚葉細胞は、高レベルのＳＯＸ１７ ｍＲＮＡ並びに低レベルのＡＦＰ及びＳＯＸ７（臓側内胚葉）、ＳＰＡＲＣ（壁側内胚葉）及びブラキュリ（中胚葉）を発現すると予測された。さらに、ＺＩＣ１は、初期外胚葉の誘導をさらに除外するのに本明細書で使用した。最後に、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂは、胚体及び胚体外内胚葉の両方で発現され、したがって、胚体内胚葉におけるＳＯＸ１７発現と相関する（表１）。表１に記載する
マーカー遺伝子が、様々なサンプル間でどのように互いに相関するかを実証し、したがって、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉への、並びに中胚葉及び神経細胞型への分化の特異的パターンを強調する代表的な実験を図１１〜図１４に示している。 Definitive endoderm cells were predicted to express high levels of SOX17 mRNA and low levels of AFP and SOX7 (visceral endoderm), SPARC (mural endoderm) and Brachyury (mesoderm). Furthermore, ZIC1 was used herein to further rule out early ectoderm induction. Finally, GATA4 and HNF3b are expressed in both definitive and extraembryonic endoderm and thus correlate with SOX17 expression in definitive endoderm (Table 1). Demonstrating how the marker genes listed in Table 1 correlate with each other between the various samples and thus specific for differentiation into definitive endoderm and extraembryonic endoderm, and into mesoderm and neuronal cell types Representative experiments that emphasize the target pattern are shown in FIGS.

上記データを考慮すると、漸増用量のアクチビンが、ＳＯＸ１７遺伝子発現の増大をもたらしたことが明らかである。さらに、このＳＯＸ１７発現は、胚体外内胚葉とは対照的に主として胚体内胚葉を表した。この結論は、ＳＯＸ１７遺伝子発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７及びＳＰＡＲＣ遺伝子発現と逆相関したという観察から生じる。   In view of the above data, it is clear that increasing doses of activin resulted in increased SOX17 gene expression. Furthermore, this SOX17 expression primarily represented definitive endoderm as opposed to extraembryonic endoderm. This conclusion comes from the observation that SOX17 gene expression was inversely correlated with AFP, SOX7 and SPARC gene expression.

胚体内胚葉へのヒトＥＳ細胞の定方向分化
ヒトＥＳ細胞培養物は、それらの未分化状態を能動的に維持しない条件下で培養される場合に、無作為に分化する。この不均一分化は、壁側及び臓側内胚葉の両方から構成される胚体外内胚葉細胞（ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ及びＳＯＸ７発現）並びにＺＩＣ１及びネスチン（外胚葉）及びブラキュリ（中胚葉）発現によりマークされるような初期外胚葉誘導体及び中胚葉誘導体の産生をもたらす。胚体内胚葉細胞出現は、ＥＳ細胞培養物における特異的抗体マーカーの欠如に関して検査又は特定されていない。それ自体で、また初期状態で、ＥＳ細胞培養物における初期胚体内胚葉産生は、十分研究されていない。胚体内胚葉細胞に関する満足のいく抗体試薬が入手不可能であったため、特性化の大部分が、外胚葉及び胚体外内胚葉に焦点を当ててきた。概して、無作為に分化されたＥＳ細胞培養物においてＳＯＸ１７hi胚体内胚葉細胞と比較して、有意により多数の胚体外細胞型及び神経外胚葉細胞型が存在する。 Directed differentiation of human ES cells into definitive endoderm Human ES cell cultures differentiate randomly when cultured under conditions that do not actively maintain their undifferentiated state. This heterogeneous differentiation is marked by extraembryonic endoderm cells (AFP, SPARC and SOX7 expression) composed of both mural and visceral endoderm and ZIC1 and nestin (ectodermal) and brachyury (mesoderm) expression. Resulting in the production of such early ectoderm and mesoderm derivatives. Definitive endoderm cell appearance has not been examined or identified for the lack of specific antibody markers in ES cell cultures. As such, and in its initial state, early definitive endoderm production in ES cell cultures has not been well studied. Since satisfactory antibody reagents for definitive endoderm cells have not been available, most of the characterization has focused on ectoderm and extraembryonic endoderm. In general, there are significantly more extraembryonic and neuroectodermal cell types in randomly differentiated ES cell cultures compared to SOX17 hi definitive endoderm cells.

未分化ｈＥＳＣコロニーは線維芽細胞フィーダーの床上で増殖するため、コロニーの縁にある細胞は、コロニーの内部に存在する細胞とは異なった別の形態を呈する。これらの外側の縁細胞の多くが、それらのあまり一様ではない、より大きな細胞体の形態により、またより高いレベルのＯＣＴ４の発現により識別され得る。ＥＳ細胞が分化し始めると、ＥＳ細胞は、未分化ＥＳ細胞に対して、ＯＣＴ４発現のレベルを上方又は下方へ変更させることが記載されている。未分化閾値を上回るか、又は下回るＯＣＴ４レベルの変更は、多能性状態から離れた分化の初期段階の表れであり得る。   Because undifferentiated hESC colonies grow on the fibroblast feeder bed, the cells at the edge of the colony exhibit a different morphology than the cells present inside the colony. Many of these outer marginal cells can be distinguished by their less uniform, larger cell body morphology and by higher levels of OCT4 expression. It has been described that when ES cells begin to differentiate, ES cells change the level of OCT4 expression upward or downward relative to undifferentiated ES cells. Changes in the OCT4 level above or below the undifferentiation threshold may be an indication of an early stage of differentiation away from the pluripotent state.

未分化コロニーがＳＯＸ１７免疫細胞化学により検査される場合、時折ＳＯＸ１７陽性細胞の小さな１０〜１５個の細胞クラスターが、外縁上の無作為な位置で、また未分化ｈＥＳＣコロニー間の接合部で検出された。上述したように、外側コロニー縁のこれらの散在ポケットは、コロニーのサイズが拡大し、且つより混雑してくるため、古典的なＥＳ細胞形態から離れて分化するための第１の細胞のいくつかであるようであった。より若くてより小さな完全未分化コロニー（１ｍｍ未満、４〜５日齢）は、コロニー内で又はコロニーの縁でＳＯＸ１７陽性細胞を示さなかったのに対して、より老齢のより大きなコロニー（直径１〜２ｍｍ、５日齢超）は、いくつかのコロニーの外縁で、或いは上述の古典的なｈＥＳＣ形態を示さない縁に対して内部の領域で、ＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞の散発的な単離パッチを有していた。これが有効なＳＯＸ１７抗体の第１の発達であると考えると、かかる初期「未分化」ＥＳ細胞培養物で発生する胚体内胚葉細胞は、これまでに実証されていない。   When undifferentiated colonies are examined by SOX17 immunocytochemistry, occasionally small 10-15 cell clusters of SOX17 positive cells are detected at random locations on the outer edge and at the junction between undifferentiated hESC colonies. It was. As mentioned above, these scattered pockets at the outer colony edge are some of the first cells to differentiate away from the classic ES cell morphology as the colony size increases and becomes more congested It seemed to be. Younger and smaller fully undifferentiated colonies (less than 1 mm, 4-5 days old) did not show SOX17 positive cells within the colony or at the edge of the colony, whereas older colonies (diameter 1) ~ 2mm,> 5 days old) is a sporadic isolated patch of SOX17 positive AFP negative cells at the outer edge of some colonies or in the area internal to the edge that does not show the classic hESC morphology described above Had. Given that this is the first development of an effective SOX17 antibody, definitive endoderm cells that develop in such early “undifferentiated” ES cell cultures have not been demonstrated to date.

Ｑ−ＰＣＲによるＳＯＸ１７及びＳＰＡＲＣ遺伝子発現レベルの逆相関に基づくと、これらのＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞の大部分が、抗体同時標識による壁側内胚葉マーカーに関して陰性であろう。これは、図１５Ａ及び図１５Ｂに示されるように、ＴＭ発現壁側内胚葉細胞に関して具体的に実証された。ノーダル因子であるアクチビンＡ及びＢへの暴露は、ＴＭ発現の強度及びＴＭ陽性細胞の数の劇的な減少をもたらした。アクチビン処理培養物に関するＳＯＸ１７、ＡＦＰ及びＴＭ抗体を使用した三重標識により、ＡＦＰ及
びＴＭに関しても陰性であるＳＯＸ１７陽性細胞のクラスターが観察された（図１６Ａ〜図１６Ｄ）。これらは、分化ｈＥＳＣ培養物におけるＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の第１の細胞標示である（図１６Ａ〜図１６Ｄ及び図１７）。 Based on the inverse correlation of SOX17 and SPARC gene expression levels by Q-PCR, the majority of these SOX17 positive AFP negative cells will be negative for mural endoderm markers by antibody co-labeling. This was specifically demonstrated for TM expressing mural endoderm cells as shown in FIGS. 15A and 15B. Exposure to the nodal factors activins A and B resulted in a dramatic decrease in the intensity of TM expression and the number of TM positive cells. Triple labeling using SOX17, AFP and TM antibodies on activin treated cultures observed clusters of SOX17 positive cells that were also negative for AFP and TM (FIGS. 16A-16D). These are the first cell markings of SOX17 positive definitive endoderm cells in differentiated hESC cultures (FIGS. 16A-16D and FIG. 17).

上述のＳＯＸ１７抗体及びＱ−ＰＣＲツールを用いて、本発明者等は、ＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／ＳＰＡＲＣ／ＴＭlo胚体内胚葉細胞となるようにｈＥＳＣを効率的にプログラミングすることが可能な多数の手順を探究してきた。本発明者等は、ＳＯＸ１７遺伝子発現に関してＱ−ＰＣＲにより集団レベルで、及びＳＯＸ１７タンパク質の抗体標識により個々の細胞のレベルで測定される場合、これらの細胞の数及び増殖能力を増大させることを目的とした様々な分化プロトコルを適用した。 Using the SOX17 antibody and Q-PCR tool described above, we are able to efficiently program hESCs to become SOX17 hi / AFP lo / SPARC / TM lo definitive endoderm cells. I have been exploring the procedure. The inventors have aimed to increase the number and proliferative capacity of these cells as measured by Q-PCR at the population level for SOX17 gene expression and at the level of individual cells by antibody labeling of SOX17 protein. Various differentiation protocols were applied.

本発明者等はまず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物において胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を創出するのに使用するためのノーダル／アクチビン／ＢＭＰのようなＴＧＦβファミリー成長因子の影響を分析及び記載した。通常の実験では、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ又はこれらの成長因子の組合せを未分化ヒト幹細胞系ｈＥＳＣｙｔ−２５の培養物へ添加して、分化プロセスを開始させた。   We first analyzed and described the effects of TGFβ family growth factors such as nodal / activin / BMP for use in creating definitive endoderm cells from embryonic stem cells in in vitro cell culture. In routine experiments, activin A, activin B, BMP or a combination of these growth factors was added to cultures of undifferentiated human stem cell line hESCyt-25 to initiate the differentiation process.

図１９に示されるように、１００ｎｇ／ｍｌでのアクチビンＡの添加は、分化の４日目までに、未分化ｈＥＳＣに対して、ＳＯＸ１７遺伝子発現の１９倍の誘導をもたらした。アクチビンＡと共に、アクチビンファミリーの第２の成員であるアクチビンＢを添加することにより、併用アクチビン処理の４日目までに、未分化ｈＥＳＣを上回る３７倍の誘導がもたらされた。最後に、アクチビンＡ及びアクチビンＢと共に、ノーダル／アクチビン由来のＴＧＦβファミリーの第３の成員、並びにＢＭＰサブグループであるＢＭＰ４を添加することにより、未分化ｈＥＳＣの誘導の５７倍に誘導を増大させた（図１９）。アクチビン及びＢＭＰによるＳＯＸ１７誘導を、因子なしの培地対照と比較した場合、５倍、１０倍及び１５倍の誘導が４日目の時点で生じた。アクチビンＡ、Ｂ及びＢＭＰによる三重処理の５日目までに、ＳＯＸ１７は、ｈＥＳＣの７０倍より高く誘導された。これらのデータは、ノーダル／アクチビン ＴＧＦβファミリー成員のより高い用量及びより長い処理時間がＳＯＸ１７の増大された発現をもたらすことを示している。   As shown in FIG. 19, addition of activin A at 100 ng / ml resulted in a 19-fold induction of SOX17 gene expression over undifferentiated hESCs by day 4 of differentiation. The addition of activin B, a second member of the activin family, along with activin A resulted in a 37-fold induction over undifferentiated hESC by day 4 of combined activin treatment. Finally, the addition of Activin A and Activin B along with a third member of the TGFβ family derived from Nodal / Activin and the BMP subgroup BMP4 increased the induction to 57 times that of undifferentiated hESCs. (FIG. 19). When SOX17 induction by activin and BMP was compared to the factor-free medium control, 5-fold, 10-fold and 15-fold induction occurred at day 4. By day 5 of the triple treatment with activin A, B and BMP, SOX17 was induced more than 70 times hESC. These data indicate that higher doses and longer treatment times of Nodal / Activin TGFβ family members result in increased expression of SOX17.

ノーダル並びに関連分子アクチビンＡ、Ｂ及びＢＭＰは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＯＸ１７の発現及び胚体内胚葉形成を促進する。さらに、ＢＭＰの添加は、おそらくノーダル補助受容体であるＣｒｉｐｔｏのさらなる誘導により、改善されたＳＯＸ１７の誘導をもたらす。   Nodal and related molecules activin A, B and BMP promote SOX17 expression and definitive endoderm formation in vivo or in vitro. Moreover, the addition of BMP results in improved induction of SOX17, possibly by further induction of Cripto, a nodal co-receptor.

本発明者等は、ＢＭＰ４と一緒のアクチビンＡ及びＢの組合せが、ＳＯＸ１７誘導、したがって胚体内胚葉形成の相加的増大をもたらすことを実証している。アクチビンＡ及びＢと組み合わせた長期間（４日を超える）のＢＭＰ４添加は、壁側及び臓側内胚葉並びに胚体内胚葉においてＳＯＸ１７を誘導し得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、添加の４日以内に処理からＢＭＰ４を除去することは有益である。   The inventors have demonstrated that the combination of activins A and B together with BMP4 results in an additive increase in SOX17 induction and thus definitive endoderm formation. Long-term (> 4 days) BMP4 addition in combination with activins A and B can induce SOX17 in the parietal and visceral endoderm and definitive endoderm. Therefore, in some embodiments of the invention, it is beneficial to remove BMP4 from the treatment within 4 days of addition.

個々の細胞レベルでのＴＧＦβ因子処理の影響を確定するために、経時的なＴＧＦβ因子添加を、ＳＯＸ１７抗体標識を使用して検査した。すでに図１０Ａ〜図１０Ｆで示したように、経時的にＳＯＸ１７標識細胞の相対数の劇的な増大が見られた。相対定量化（図２０）は、ＳＯＸ１７標識細胞の２０倍を超える増大を示す。この結果は、細胞の数並びにＳＯＸ１７遺伝子発現レベルの両方が、ＴＧＦβ因子暴露の時間とともに増大していることを示す。図２１に示されるように、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰ４への暴露の４日後に、ＳＯＸ１７誘導のレベルは、未分化ｈＥＳＣに対して１６８倍に到達した。図２２は、ＳＯＸ１７陽性細胞の相対数もまた、用量応答性であったことを示す。１００ｎｇ／ｍｌ又はそれ以上のアクチビンＡ用量は、ＳＯＸ１７遺伝子発現及び
細胞数を強力に誘導することが可能であった。 To determine the effect of TGFβ factor treatment at the individual cell level, TGFβ factor addition over time was examined using SOX17 antibody labeling. As already shown in FIGS. 10A-10F, there was a dramatic increase in the relative number of SOX17 labeled cells over time. Relative quantification (Figure 20) shows a greater than 20-fold increase in SOX17 labeled cells. This result indicates that both the number of cells as well as the SOX17 gene expression level increase with time of TGFβ factor exposure. As shown in FIG. 21, after 4 days of exposure to nodal, activin A, activin B and BMP4, the level of SOX17 induction reached 168-fold over undifferentiated hESC. FIG. 22 shows that the relative number of SOX17 positive cells was also dose responsive. Activin A doses of 100 ng / ml or higher were able to strongly induce SOX17 gene expression and cell number.

ＴＧＦβファミリー成員のほかに、Ｗｎｔファミリーの分子が、胚体内胚葉の特定化及び／又は維持において役割を果たし得る。Ｗｎｔ分子の使用もまた、アクチビン単独を上回るアクチビン＋Ｗｎｔ３ａで処理したサンプルにおける増大したＳＯＸ１７遺伝子発現により示されるように、胚体内胚葉へのｈＥＳＣの分化に有益であった（図２３）。   In addition to TGFβ family members, Wnt family molecules may play a role in definitive endoderm specification and / or maintenance. The use of Wnt molecules was also beneficial for hESC differentiation into definitive endoderm, as shown by increased SOX17 gene expression in samples treated with activin plus Wnt3a over activin alone (FIG. 23).

上述の実験はすべて、添加因子を伴って１０％血清を含有する組織培養培地を使用して実施した。驚くべきことに、図２４Ａ〜図２４Ｃに示されるように、血清の濃度が、添加アクチビンの存在下でＳＯＸ１７発現のレベルに対して影響することを本発明者等は発見した。血清レベルが１０％から２％へ低減すると、ＳＯＸ１７発現は、アクチビンＡ及びＢの存在下で３倍になった。   All the above experiments were performed using tissue culture medium containing 10% serum with added factors. Surprisingly, the inventors have discovered that the concentration of serum affects the level of SOX17 expression in the presence of added activin, as shown in FIGS. 24A-24C. When serum levels were reduced from 10% to 2%, SOX17 expression was tripled in the presence of activins A and B.

最後に、本発明者等は、アクチビン誘導ＳＯＸ１７+細胞が、図２５Ａ〜図２５Ｄに表されるように培養中に***することを実証した。矢印は、ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩ標識有糸***プレートパターン及び位相コントラスト有糸***プロフィールにより明らかなように有糸***中であるＳＯＸ１７／ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩで標識された細胞を示す。 Finally, we demonstrated that activin-induced SOX17 + cells divide during culture as represented in FIGS. 25A-25D. The arrows indicate cells labeled with SOX17 / PCNA / DAPI that are in mitosis as evidenced by the PCNA / DAPI labeled mitotic plate pattern and phase contrast mitotic profile.

ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）発現は、胚体内胚葉に関するマーカーと相関し、中胚葉、外胚葉又は臓側内胚葉に関するマーカーとは相関しない
上述したように、ｈＥＳＣは、ＴＧＦβファミリー、より具体的にはアクチビン／ノーダルサブファミリーのサイトカインの適用により、胚体内胚葉の胚葉へ分化するように誘導することができる。さらに、本発明者等は、分化培養培地におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）の比率が、ｈＥＳＣからの胚体内胚葉分化の効率に影響を及ぼすことを示している。この影響は、培地においてアクチビンＡの所定濃度で、より高いレベルのＦＢＳが胚体内胚葉への最大限の分化を阻害するようなものである。外因性アクチビンＡの非存在下では、胚体内胚葉系統へのｈＥＳＣの分化は、非常に非効率であり、ＦＢＳ濃度は、ｈＥＳＣの分化プロセスに対して相当穏やかに影響する。 Chemokine receptor 4 (CXCR4) expression correlates with markers for definitive endoderm and not with markers for mesoderm, ectoderm or visceral endoderm As noted above, hESCs are more Can be induced to differentiate into definitive endoderm by application of activin / nodal subfamily cytokines. Furthermore, the inventors have shown that the ratio of fetal bovine serum (FBS) in the differentiation culture medium affects the efficiency of definitive endoderm differentiation from hESCs. This effect is such that at a given concentration of activin A in the medium, higher levels of FBS inhibit maximal differentiation into definitive endoderm. In the absence of exogenous activin A, the differentiation of hESCs into definitive endoderm lineage is very inefficient, and FBS concentration has a rather modest effect on the hESC differentiation process.

これらの実験では、０．５％、２．０％又は１０％ＦＢＳを補充し、且つ１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを伴うか、又は伴わないＲＰＭＩ培地（Invitrogen, Carlsbad, CA；ｃａｔ＃６１８７０−０３６）中で６日間増殖させることにより、ｈＥＳＣを分化させた。さらに、分化の最初の３日間にわたる０．５％〜２．０％に及ぶＦＢＳのグラジエントもまた、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと併用した。６日後に、反復サンプルを各培養条件から収集して、リアルタイム定量的ＰＣＲにより相対遺伝子発現に関して分析した。残存細胞は、ＳＯＸ１７タンパク質の免疫蛍光検出用に固定した。   In these experiments, RPMI medium (Invitrogen, Carlsbad, CA; cat # 61870-036) supplemented with 0.5%, 2.0% or 10% FBS and with or without 100 ng / ml of activin A. HESCs were differentiated by growth for 6 days. In addition, a gradient of FBS ranging from 0.5% to 2.0% over the first 3 days of differentiation was also combined with 100 ng / ml of activin A. After 6 days, replicate samples were collected from each culture condition and analyzed for relative gene expression by real-time quantitative PCR. The remaining cells were fixed for immunofluorescence detection of SOX17 protein.

ＣＸＣＲ４の発現レベルは、使用した７つの培養条件にわたって劇的に変化した（図２６）。概して、ＣＸＣＲ４発現は、アクチビンＡ処理培養物（Ａ１００）では高く、外因性アクチビンＡを施さない培養物（ＮＦ）では低かった。さらに、Ａ１００処理培養物の中でも、ＣＸＣＲ４発現は、ＦＢＳ濃度が最も低かった場合に最も高かった。相対発現が、アクチビンＡを施さない条件（ＮＦ）により一致するように、１０％ＦＢＳ条件におけるＣＸＣＲ４レベルの顕著な低減が見られた。   The expression level of CXCR4 changed dramatically across the seven culture conditions used (FIG. 26). In general, CXCR4 expression was high in activin A-treated cultures (A100) and low in cultures that did not receive exogenous activin A (NF). Furthermore, among the A100 treated cultures, CXCR4 expression was highest when the FBS concentration was the lowest. There was a significant reduction in CXCR4 levels in the 10% FBS condition so that the relative expression was more consistent with the condition without Activin A (NF).

上述したように、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＨＮＦ３β遺伝子の発現は、胚体内胚葉としての細胞の特徴づけと一致する。７つの分化条件にわたるこれらの４つの遺伝子の相対発現は、ＣＸＣＲ４の相対発現を反映する（図２７Ａ〜図２７Ｄ）。このことは、ＣＸＣＲ４もまた胚体内胚葉のマーカーであることを実証する。   As described above, the expression of SOX17, GSC, MIXL1, and HNF3β genes is consistent with the characterization of cells as definitive endoderm. The relative expression of these four genes across the seven differentiation conditions reflects the relative expression of CXCR4 (FIGS. 27A-27D). This demonstrates that CXCR4 is also a marker of definitive endoderm.

外胚葉及び中胚葉系統は、各種マーカーのそれらの発現により胚体内胚葉と識別することができる。初期中胚葉は、遺伝子ブラキュリ及びＭＯＸ１を発現する一方で、新生神経外胚葉は、ＳＯＸ１及びＺＩＣ１を発現する。図２８Ａ〜図２８Ｄは、外因性アクチビンＡを施さない培養物が、中胚葉及び外胚葉遺伝子発現に関して優先的に富化されたこと、及びアクチビンＡ処理培養物の中でも、１０％ＦＢＳ条件がまた、中胚葉及び外胚葉マーカー発現の増大レベルを有したことを実証している。これらのパターンの発現はＣＸＣＲ４のパターンの逆であって、ＣＸＣＲ４が、この発生期間にｈＥＳＣに由来する中胚葉又は外胚葉中ではそれほど高度に発現されないことを示した。   The ectoderm and mesoderm lines can be distinguished from definitive endoderm by their expression of various markers. The early mesoderm expresses the genes Brachyury and MOX1, while the neoneural ectoderm expresses SOX1 and ZIC1. Figures 28A-28D show that cultures without exogenous activin A were preferentially enriched for mesoderm and ectoderm gene expression, and among the activin A treated cultures, 10% FBS conditions were also Demonstrating having increased levels of mesoderm and ectoderm marker expression. The expression of these patterns was the reverse of that of CXCR4, indicating that CXCR4 is not very highly expressed in mesoderm or ectoderm from hESC during this development period.

哺乳類発生中の初期に、胚体外系統への分化もまた起こる。ここでは、ＳＯＸ１７を包含する胚体内胚葉と共通して多くの遺伝子の発現を共有する臓側内胚葉の分化が特に関連している。胚体内胚葉を胚体外臓側内胚葉と識別するためには、これらの２つの間を識別できるマーカーを検査するべきである。ＳＯＸ７は、臓側内胚葉では発現されるが、胚体内胚葉系統では発現されないマーカーを表す。したがって、ＳＯＸ７発現の非存在下での強健なＳＯＸ１７遺伝子発現を示す培養条件は、胚体内胚葉を含有し、臓側内胚葉を含有しない可能性が高い。ＳＯＸ７が、アクチビンＡを施さない培養において高度に発現され、ＳＯＸ７はまた、ＦＢＳが１０％で包含される場合に、アクチビンＡの存在下でさえ増大された発現を示したことが図２８Ｅに示されている。このパターンは、ＣＸＣＲ４発現パターンの逆であり、ＣＸＣＲ４が、臓側内胚葉ではあまり高度に発現されないことを示唆する。   Early in mammalian development, differentiation into extraembryonic lines also occurs. Here, the differentiation of visceral endoderm that shares the expression of many genes in common with definitive endoderm including SOX17 is particularly relevant. In order to distinguish definitive endoderm from definitive endoderm, a marker that can distinguish between these two should be examined. SOX7 represents a marker that is expressed in visceral endoderm but not in the definitive endoderm lineage. Therefore, culture conditions that show robust SOX17 gene expression in the absence of SOX7 expression are likely to contain definitive endoderm and no visceral endoderm. FIG. 28E shows that SOX7 was highly expressed in cultures that did not receive activin A, and that SOX7 also showed increased expression even in the presence of activin A when FBS was included at 10%. Has been. This pattern is the reverse of the CXCR4 expression pattern, suggesting that CXCR4 is not highly expressed in the visceral endoderm.

上述の分化条件それぞれに存在するＳＯＸ１７免疫反応性（ＳＯＸ１７+）細胞の相対数もまた確定した。ｈＥＳＣは、高用量アクチビンＡ及び低ＦＢＳ濃度（０．５％〜２．０％）の存在下で分化させた場合、ＳＯＸ１７+細胞は、培養物全体にわたって遍在的に分布した。高用量アクチビンＡを使用したが、ＦＢＳは１０％（ｖ／ｖ）で包含された場合、ＳＯＸ１７+細胞は、相当低い頻度で出現し、培養物全体にわたって均一に分布されるのではなく、常に単離クラスターで出現した（図２９Ａ及び図２９Ｃ、並びに図２９Ｂ及び図２９Ｅ）。外因性アクチビンＡが使用されなかった場合に、ＳＯＸ１７+細胞のさらなる減少が観察された。これらの条件下では、ＳＯＸ１７+細胞はまたクラスターで出現し、これらのクラスターは、高アクチビンＡ低ＦＢＳ処理で見出されるものよりも小さく、且つ相当稀であった（図２９Ｃ及び図２９Ｆ）。これらの結果は、ＣＸＣＲ４発現パターンが、各条件下で胚体内胚葉遺伝子発現に対応するだけでなく、胚体内胚葉細胞の数にも対応することを実証している。 The relative number of SOX17 immunoreactive (SOX17 + ) cells present in each of the above differentiation conditions was also determined. When hESCs were differentiated in the presence of high dose activin A and low FBS concentrations (0.5% -2.0%), SOX17 + cells were ubiquitously distributed throughout the culture. When high dose activin A was used, but FBS was included at 10% (v / v), SOX17 + cells appeared fairly infrequently and were always distributed rather than distributed uniformly throughout the culture. Appeared in isolated clusters (FIGS. 29A and 29C, and FIGS. 29B and 29E). A further reduction in SOX17 + cells was observed when exogenous activin A was not used. Under these conditions, SOX17 + cells also appeared in clusters, which were smaller and considerably rarer than those found with high activin A low FBS treatment (FIGS. 29C and 29F). These results demonstrate that the CXCR4 expression pattern not only corresponds to definitive endoderm gene expression under each condition, but also corresponds to the number of definitive endoderm cells.

胚体内胚葉に関して富化する分化条件は、ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率を増大させる
アクチビンＡの用量はまた、胚体内胚葉がｈＥＳＣから得られ得る効率に影響を及ぼす。この実施例は、アクチビンＡの用量を増大させることにより培養物におけるＣＸＣＲ４+細胞の比率が増大することを実証する。 Differentiation conditions enriched for definitive endoderm increase the proportion of CXCR4 positive cells The dose of activin A also affects the efficiency with which definitive endoderm can be obtained from hESCs. This example demonstrates that increasing the activin A dose increases the proportion of CXCR4 + cells in culture.

ｈＥＳＣは、０．５％〜２％ＦＢＳ（分化の最初の３日にわたって０．５％から１．０％、そして２．０％へ増大される）及び０、１０又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを補充したＲＰＭＩ培地中で分化させた。分化の７日後に、２％ＦＢＳ及び２ｍＭ（ＥＤＴＡ）を含有するＣａ2+／Ｍｇ2+を伴わないＰＢＳ中で、室温で５分間、細胞を解離させた。細胞は、３５μｍナイロンフィルタに通して濾過して、計数して、ペレット化した。ペレットは、小容量の５０％ヒト血清／５０％正常ロバ血清中に再懸濁させて、氷上で２分間インキュベートして、非特異的抗体結合部位をブロックした。これに、５０μｌ（およそ１０5個の細胞を含有する）当たりマウス抗ＣＸＣＲ４抗体（Abcam、ｃａｔ＃ ａｂ１０４０３−１００）１μｌを添加して、標識を氷上で４５分間進めた。細胞は、２％ヒト血清を含有するＰＢＳ（緩衝液）５ｍｌを添加することにより洗浄して、ペレット化した
。緩衝液５ｍｌによる第２の洗浄を完了させた後、細胞は、１０5個の細胞当たり緩衝液５０μｌ中に再懸濁させた。二次抗体（ＦＩＴＣ結合ロバ抗マウス、Jackson ImmunoResearch、ｃａｔ＃ ７１５−０９６−１５１）を最終濃度５μｇ／ｍｌで添加して、３０分間標識させた後、上述のように緩衝液中で２回洗浄を行った。細胞は、緩衝液中に５×１０6個の細胞／ｍｌで再懸濁させて、フローサイトメトリーの中心的な施設(The Scripps Research Institute)にてスタッフによりＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ(Beckton Dickenson)を使用して分析及び選別した。細胞は、これに続くリアルタイム定量的ＰＣＲによる遺伝子発現分析用の総ＲＮＡの単離のために、ＲＬＴ溶解緩衝液(Qiagen)へ直接収集した。 hESC is 0.5% to 2% FBS (increased from 0.5% to 1.0% and 2.0% over the first 3 days of differentiation) and 0, 10 or 100 ng / ml of activin A Differentiated in RPMI medium supplemented with Seven days after differentiation, cells were dissociated in PBS without Ca 2+ / Mg 2+ containing 2% FBS and 2 mM (EDTA) for 5 minutes at room temperature. Cells were filtered through a 35 μm nylon filter, counted and pelleted. The pellet was resuspended in a small volume of 50% human serum / 50% normal donkey serum and incubated on ice for 2 minutes to block non-specific antibody binding sites. To this was added 1 μl of mouse anti-CXCR4 antibody (Abcam, cat # ab 10403-100) per 50 μl (containing approximately 10 5 cells) and labeling was allowed to proceed on ice for 45 minutes. The cells were washed and pelleted by adding 5 ml of PBS (buffer) containing 2% human serum. After completing the second wash with 5 ml of buffer, the cells were resuspended in 50 μl of buffer per 10 5 cells. A secondary antibody (FITC-conjugated donkey anti-mouse, Jackson ImmunoResearch, cat # 715-096-151) was added at a final concentration of 5 μg / ml, labeled for 30 minutes, and then washed twice in buffer as described above. Went. Cells are resuspended in buffer at 5 × 10 6 cells / ml and used by FACS Vantage (Beckton Dickenson) by staff at the center of flow cytometry (The Scripps Research Institute). Were analyzed and sorted. Cells were collected directly into RLT lysis buffer (Qiagen) for subsequent isolation of total RNA for gene expression analysis by real-time quantitative PCR.

フローサイトメトリーにより確定される場合のＣＸＣＲ４+細胞の数は、アクチビンＡの用量が分化培養培地中で増大されると、劇的に増大することが観察された（図３０Ａ〜図３０Ｃ）。ＣＸＣＲ４+細胞は、Ｒ４ゲート内に納まり、このゲートは、事象の０．２％がＲ４ゲートに位置される二次抗体のみの対照を使用して設定された。劇的に増大するＣＸＣＲ４+細胞数は、アクチビンＡ用量が増大される場合に、胚体内胚葉遺伝子発現における強健な増大と相関する（図３１Ａ〜図３１Ｄ）。 It was observed that the number of CXCR4 + cells, as determined by flow cytometry, increased dramatically as the activin A dose was increased in the differentiation culture medium (FIGS. 30A-30C). CXCR4 + cells fit within the R4 gate, which was set up using a secondary antibody only control where 0.2% of the events were located at the R4 gate. The dramatically increasing number of CXCR4 + cells correlates with a robust increase in definitive endoderm gene expression when activin A dose is increased (FIGS. 31A-31D).

ＣＸＣＲ４陽性細胞の単離は、胚体内胚葉遺伝子発現に関して富化し、また中胚葉、外胚葉及び臓側内胚葉のマーカーを発現する細胞を枯渇させる
上記実施例８で同定されるＣＸＣＲ４+及びＣＸＣＲ４-細胞を収集して、相対遺伝子発現に関して分析し、母集団の遺伝子発現を同時に確定した。 Isolation of CXCR4 positive cells is enriched for definitive endoderm gene expression and depletes cells expressing markers of mesoderm, ectoderm and visceral endoderm CXCR4 + and CXCR4 − identified in Example 8 above Cells were collected and analyzed for relative gene expression, and the gene expression of the population was determined simultaneously.

ＣＸＣＲ４遺伝子発現の相対レベルは、アクチビンＡの用量の増大に伴って劇的に増大した（図３２）。これは、ＣＸＣＲ４+細胞のアクチビンＡ用量依存的増大と極めて強く相関した（図３０Ａ〜図３０Ｃ）。また、各集団からのＣＸＣＲ４+細胞の単離は、この集団におけるほぼすべてのＣＸＣＲ４遺伝子発現を占めたことも明らかである。これは、これらの細胞を収集するためのＦＡＣＳ方法の効率を実証している。 The relative level of CXCR4 gene expression increased dramatically with increasing activin A dose (FIG. 32). This correlated very strongly with the activin A dose-dependent increase in CXCR4 + cells (FIGS. 30A-30C). It is also clear that the isolation of CXCR4 + cells from each population accounted for almost all CXCR4 gene expression in this population. This demonstrates the efficiency of the FACS method for collecting these cells.

遺伝子発現分析により、ＣＸＣＲ４+細胞は、ＣＸＣＲ４遺伝子発現の大部分を含有するだけでなく、ＣＸＣＲ４+細胞はまた、胚体内胚葉の他のマーカーに関する遺伝子発現も含有することが明らかとなった。図３１Ａ〜図３１Ｄに示されるように、ＣＸＣＲ４+細胞はさらに、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＨＮＦ３Ｂ及びＭＩＸＬ１に関して母Ａ１００集団を上回って富化した。さらに、ＣＸＣＲ４-画分は、これらの胚体内胚葉マーカーに関して非常に少ない遺伝子発現を含有した。さらに、ＣＸＣＲ４+及びＣＸＣＲ４-集団は、中胚葉、外胚葉及び胚体外内胚葉のマーカーに関して逆パターンの遺伝子発現を示した。図３３Ａ〜図３３Ｄは、ＣＸＣＲ４+細胞が、Ａ１００母集団に対してブラキュリ、ＭＯＸ１、ＺＩＣ１及びＳＯＸ７の遺伝子発現に関して枯渇したことを示す。このＡ１００母集団は、低用量条件又はアクチビンＡなしの条件に対して、これらのマーカーの発現がすでに低かった。これらの結果は、高アクチビンＡの存在下で分化されるｈＥＳＣからのＣＸＣＲ４+細胞の単離は、胚体内胚葉に関して高度に富化され、且つ実質的に純粋な胚体内胚葉である集団を生じることを示す。 Gene expression analysis revealed that CXCR4 + cells not only contain the majority of CXCR4 gene expression, but CXCR4 + cells also contain gene expression for other markers of definitive endoderm. As shown in FIGS. 31A-31D, CXCR4 + cells were further enriched over the mother A100 population for SOX17, GSC, HNF3B and MIXL1. Moreover, CXCR4 - fraction contained very little gene expression for these definitive endoderm markers. Furthermore, the CXCR4 + and CXCR4 − populations showed a reverse pattern of gene expression with respect to mesoderm, ectoderm and extraembryonic endoderm markers. FIGS. 33A-33D show that CXCR4 + cells were depleted for gene expression of Brachyury, MOX1, ZIC1, and SOX7 relative to the A100 population. This A100 population already had low expression of these markers for low dose conditions or conditions without activin A. These results indicate that isolation of CXCR4 + cells from hESCs differentiated in the presence of high activin A results in a population that is highly enriched for definitive endoderm and is substantially pure definitive endoderm It shows that.

ＣＸＣＲ４を使用した細胞集団における胚体内胚葉細胞の定量
本明細書中ですでに確定されるような、及び２００３年１２月２３日に出願された「胚体内胚葉」と題する米国仮特許出願第６０／５３２，００４号（その開示が参照により全体が本明細書に援用される）で確定されるような細胞培養物又は細胞集団中に存在する胚体内胚葉細胞の比率の定量を確認するために、ＣＸＣＲ４及び胚体内胚葉の他のマーカーを発現する細胞をＦＡＣＳにより分析した。 Quantification of definitive endoderm cells in a cell population using CXCR4 US Provisional Patent Application No. 60 entitled “Definitive Endoderm” as previously determined herein and filed on December 23, 2003. To ascertain the quantification of the proportion of definitive endoderm cells present in a cell culture or cell population as determined in US Pat. No. 5,532,004 (the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety) Cells expressing CXCR4 and other markers of definitive endoderm were analyzed by FACS.

上記実施例に記載されるような方法を使用して、ｈＥＳＣを分化させて、胚体内胚葉を産生した。特に、分化細胞培養物における収率及び純度を増大させるために、培地の血清濃度を以下の通りに制御した：１日目には０．２％ＦＢＳ、２日目には１．０％ＦＢＳ及び３〜６日目には２．０％ＦＢＳ。分化培養物は、３つの細胞表面エピトープであるＥ−カドヘリン、ＣＸＣＲ４及びトロンボモジュリンを使用して、ＦＡＣＳにより選別した。続いて、選別した細胞集団をＱ−ＰＣＲにより分析して、胚体及び胚体外内胚葉並びに他の細胞型に関するマーカーの相対発現レベルを確定した。最適に分化させた培養物から採取されるＣＸＣＲ４選別した細胞は、９８％を超える純度の胚体内胚葉細胞の単離をもたらした。   Using methods as described in the above examples, hESCs were differentiated to produce definitive endoderm. In particular, in order to increase yield and purity in differentiated cell cultures, the serum concentration of the medium was controlled as follows: 0.2% FBS on day 1; 1.0% FBS on day 2. And 2.0% FBS on days 3-6. Differentiation cultures were sorted by FACS using three cell surface epitopes, E-cadherin, CXCR4 and thrombomodulin. Subsequently, the sorted cell population was analyzed by Q-PCR to determine the relative expression levels of the markers for embryonic body and extraembryonic endoderm and other cell types. CXCR4 sorted cells harvested from optimally differentiated cultures resulted in the isolation of definitive endoderm cells with purity greater than 98%.

表２は、本明細書中に記載する方法を使用してｈＥＳＣから分化させた胚体内胚葉培養物に関するマーカー分析の結果を示す。   Table 2 shows the results of marker analysis for definitive endoderm cultures differentiated from hESCs using the methods described herein.

特に、表２は、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７陽性細胞（内胚葉）が細胞培養物における細胞の７０〜８０％を構成していたことを示す。これらのＳＯＸ１７発現細胞のうち、２％未満がＴＭ（壁側内胚葉）を発現し、１％未満がＡＦＰ（臓側内胚葉）を発現した。ＴＭ陽性細胞及びＡＦＰ陽性細胞の比率（組み合わせた壁側内胚葉及び臓側内胚葉、総計３％）をＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率から差し引きした後、細胞培養物の約６７％〜約７７％が胚体内胚葉であったことが観察され得る。およそ１０％の細胞が、ｈＥＳＣに関するマーカーであるＥ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）に関して陽性であり、細胞の約１０〜２０％が他の細胞型であった。   In particular, Table 2 shows that CXCR4 and SOX17 positive cells (endoderm) comprised 70-80% of the cells in the cell culture. Of these SOX17 expressing cells, less than 2% expressed TM (mural endoderm) and less than 1% expressed AFP (visceral endoderm). After subtracting the ratio of TM positive cells and AFP positive cells (combined wall endoderm and visceral endoderm, 3% total) from the ratio of SOX17 / CXCR4 positive cells, about 67% to about 77% of the cell culture Can be observed to be definitive endoderm. Approximately 10% of cells were positive for E-cadherin (ECAD), a marker for hESC, and about 10-20% of the cells were other cell types.

ＦＡＣＳ分離前に得られる分化細胞培養物における胚体内胚葉の純度は、５〜６日の分化手順全体にわたって０．５％以下でＦＢＳ濃度を維持することにより、上述の低血清手順と比較して改善させることができることを本発明者等は発見している。しかしながら、５〜６日の分化手順全体にわたって０．５％以下で細胞培養物を維持することはまた、産生される総胚体内胚葉細胞数の低減をもたらす。   The purity of definitive endoderm in differentiated cell cultures obtained before FACS separation is compared to the low serum procedure described above by maintaining the FBS concentration below 0.5% throughout the 5-6 day differentiation procedure. The inventors have discovered that this can be improved. However, maintaining a cell culture at 0.5% or less throughout the 5-6 day differentiation procedure also results in a reduction in the total definitive endoderm cell number produced.

本明細書中に記載する方法により産生される胚体内胚葉細胞は、それほどの分化を伴わずに５０日よりも長い間、アクチビンの存在下で培養において維持及び増殖されている。かかる場合では、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β発現は、培養期間にわたって維持される。さらに、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＺＩＣ１及びＢＲＡＣＨは、これらの培養物では検出されなかった。かかる細胞は、それほどの分化を伴わずに５０日よりも実質的に長い間、培養において維持及び増殖させることができる可能性が高い。   Definitive endoderm cells produced by the methods described herein have been maintained and grown in culture in the presence of activin for more than 50 days without significant differentiation. In such a case, SOX17, CXCR4, MIXL1, GATA4, HNF3β expression is maintained over the culture period. Furthermore, TM, SPARC, OCT4, AFP, SOX7, ZIC1 and BRACH were not detected in these cultures. Such cells are likely to be able to be maintained and expanded in culture for substantially longer than 50 days without significant differentiation.

胚体内胚葉細胞のさらなるマーカー
以下の実験では、精製胚体内胚葉及びヒト胚性幹細胞集団からＲＮＡを単離した。続いて、遺伝子発現は、各精製集団由来のＲＮＡの遺伝子チップ分析により分析した。Ｑ−ＰＣＲも実施して、胚体内胚葉に関するマーカーとして、胚体内胚葉では発現されるが、胚性幹細胞では発現されない遺伝子の可能性をさらに研究した。 Additional markers of definitive endoderm cells In the following experiments, RNA was isolated from purified definitive endoderm and human embryonic stem cell populations. Subsequently, gene expression was analyzed by gene chip analysis of RNA from each purified population. Q-PCR was also performed to further study the possibility of genes that are expressed in definitive endoderm but not in embryonic stem cells as markers for definitive endoderm.

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、２０％ノックアウト血清代替物、４ｎｇ／ｍｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で維持された。ｈＥＳＣは、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトアクチビンＡ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地中で５日間培養することにより胚体内胚葉へ分化させた。ＦＢＳの濃度は、毎日以下の通りに変化させた：０．１％（１日目）、０．２％（２日目）、２％（３〜５日目）。   Human embryonic stem cells (hESC) are a 20% knockout serum replacement, 4 ng / ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, L-glutamine, non-essential amino acids and Maintained in DMEM / F12 medium supplemented with penicillin / streptomycin. hESCs were differentiated into definitive endoderm by culturing in RPMI medium supplemented with 100 ng / ml recombinant human activin A, fetal bovine serum (FBS) and penicillin / streptomycin for 5 days. The concentration of FBS was varied daily as follows: 0.1% (Day 1), 0.2% (Day 2), 2% (Days 3-5).

遺伝子発現分析のためにｈＥＳＣ及び胚体内胚葉の精製集団を得るために、細胞を蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により単離した。免疫精製は、ｈＥＳＣに関してはＳＳＥＡ４抗原（R&D Systems、ｃａｔ＃ＦＡＢ１４３５Ｐ）を使用して、また胚体内胚葉に関してはＣＸＣＲ４（R&D Systems、ｃａｔ＃ＦＡＢ１７０Ｐ）を使用して達成した。細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen、ｃａｔ＃２５３００−０５４）を使用して解離させて、２％ヒト血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄して、氷上で１０分間１００％ヒト血清中に再懸濁させて、非特異的結合をブロックした。染色は、ヒト血清８００μｌ中で５×１０6個の細胞にフィコエリトリン結合抗体２００μｌを添加することにより氷上で３０分間実施した。細胞をＰＢＳ緩衝液８ｍｌで２度洗浄して、同１ｍｌ中に再懸濁させた。ＦＡＣＳ単離は、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ(BD Biosciences)を使用して、The Scripps Research Instituteの中心的な施設により実施された。細胞は、ＲＬＴ溶解緩衝液へ直接収集して、ＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮｅａｓｙ(Qiagen)により単離した。 To obtain a purified population of hESCs and definitive endoderm for gene expression analysis, cells were isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). Immunopurification was achieved using SSEA4 antigen (R & D Systems, cat # FAB1435P) for hESC and CXCR4 (R & D Systems, cat # FAB170P) for definitive endoderm. Cells are dissociated using trypsin / EDTA (Invitrogen, cat # 25300-054), washed in phosphate buffered saline (PBS) containing 2% human serum and 100 minutes on ice for 100 minutes. Resuspended in% human serum to block non-specific binding. Staining was performed for 30 minutes on ice by adding 200 μl of phycoerythrin-conjugated antibody to 5 × 10 6 cells in 800 μl of human serum. The cells were washed twice with 8 ml PBS buffer and resuspended in the same 1 ml. FACS isolation was performed by the central facility of The Scripps Research Institute using FACS Vantage (BD Biosciences). Cells were harvested directly into RLT lysis buffer and RNA was isolated by RNeasy (Qiagen) according to manufacturer's instructions.

精製ＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォーム及びＵ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用して、発現プロフィールデータの作成のためにExpression Analysis(Durham, NC)へ二連で提出した。提示されたデータは、２つの集団、すなわちｈＥＳＣと胚体内胚葉の間で差次的に発現する遺伝子を同定する群の比較である。ｈＥＳＣに見出される発現レベルを上回る発現レベルの頑強な上方変化を示す遺伝子は、胚体内胚葉に高度に特徴的な新たな候補マーカーとして選択された。選択遺伝子は、上述のようにＱ−ＰＣＲによりアッセイして、遺伝子チップ上に見られる遺伝子発現変化を確証し、またｈＥＳＣ分化の経時変化中のこれらの遺伝子の発現パターンを研究した。   Purified RNA was submitted in duplicate to Expression Analysis (Durham, NC) for generation of expression profile data using the Affymetrix platform and U133 Plus 2.0 high-density oligonucleotide array. The data presented is a comparison of two populations, a group that identifies genes that are differentially expressed between hESCs and definitive endoderm. Genes that showed a robust upward change in expression levels above that found in hESCs were selected as new candidate markers highly characteristic of definitive endoderm. Selected genes were assayed by Q-PCR as described above to confirm gene expression changes seen on gene chips and to study the expression patterns of these genes during the time course of hESC differentiation.

図３４Ａ〜図３４Ｍは、或る特定のマーカーに関する遺伝子発現の結果を示す。結果は、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの添加の１日後、３日後及び５日後に分析した細胞培養物、５日目の分化手順の終わりに精製されたＣＸＣＲ４発現性胚体内胚葉細胞（ＣＸＤＥ）に関して、及び精製ｈＥＳＣにおいて表示される。図３４Ｃ及び図３４Ｇ〜図３４Ｍの比較により、６つのマーカー遺伝子、すなわちＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１が、互いにほぼ一致し、且つまたＣＸＣＲ４の発現のパターン及びＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比と同一である発現パターンを示す。上述したように、ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉並びにＳＯＸ７発現胚体外内胚葉の両方において発現される。ＳＯＸ７は胚体内胚葉で発現されないため、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比は、全体として集団において証明されるＳＯＸ１７発現への胚体内胚葉の寄与の信頼性の高い推定を提供する。パネルＣに対するパネルＧ〜Ｌ及びＭの類似性は、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１が、胚体内胚葉のマーカーである可能性
が高いこと、及びそれらが胚体外内胚葉細胞で有意に発現されないことを示す。 Figures 34A-34M show the results of gene expression for certain markers. Results are for cell cultures analyzed 1 day, 3 days and 5 days after the addition of 100 ng / ml activin A, for CXCR4-expressing definitive endoderm cells (CXDE) purified at the end of the 5 day differentiation procedure. And in purified hESC. Comparison of FIGS. 34C and 34G-34M shows that the six marker genes, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 and CRIP1, are almost identical to each other, and also the expression pattern of CXCR4 and the ratio of SOX17 / SOX7 The expression pattern is the same. As mentioned above, SOX17 is expressed in both definitive endoderm as well as SOX7 expressing extraembryonic endoderm. Since SOX7 is not expressed in definitive endoderm, the SOX17 / SOX7 ratio provides a reliable estimate of the definitive endoderm's contribution to SOX17 expression as evidenced in the population as a whole. The similarity of panels G-L and M to panel C shows that FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 and CRIP1 are likely markers of definitive endoderm and that they are significant in extraembryonic endoderm cells Is not expressed.

本明細書中に記載されるＱ−ＰＣＲの結果は、ＩＣＣによりさらに確認することができることが理解されよう。   It will be appreciated that the Q-PCR results described herein can be further confirmed by ICC.

ＳＯＸ１７プロモーター−ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣ系統及びＣＸＣＲ４プロモーター−ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣ系統の産生
ＣＸＣＲ４特異的抗体を用いる胚体内胚葉の精製の代替方法として、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターとのＥＧＦＰ融合が用いられ得る。特に本実施例は、ＳＯＸ１７調節領域の制御下でのレポーター遺伝子を含むレポーターカセットを含むベクターの構築を記載する。さらに、ＣＸＣＲ４調節領域の制御下でのレポーター遺伝子を含むレポーターカセットを含むベクターの構築が記載される。本実施例は、これらのベクターのうちの１つ又は複数でトランスフェクトされた細胞、例えばヒト胚性幹細胞、並びにそのゲノムに結合されるこれらのレポーターカセットのこの一方又は両方を有する細胞の調製も記載する。 Production of SOX17 Promoter-EGFP Transgenic hESC Line and CXCR4 Promoter-EGFP Transgenic hESC Line As an alternative to purification of definitive endoderm using CXCR4-specific antibodies, EGFP fusion with SOX17 or CXCR4 promoter can be used. In particular, this example describes the construction of a vector containing a reporter cassette containing a reporter gene under the control of the SOX17 regulatory region. Furthermore, the construction of a vector comprising a reporter cassette comprising a reporter gene under the control of the CXCR4 regulatory region is described. This example also illustrates the preparation of cells transfected with one or more of these vectors, eg, human embryonic stem cells, and cells having either or both of these reporter cassettes bound to their genome. Describe.

レポーター遺伝子で遺伝的に標識されたＳＯＸ１７発現胚体内胚葉細胞系統及びＣＸＲＣ４発現胚体内胚葉細胞系統を、それぞれＳＯＸ１７遺伝子又はＣＸＣＲ４遺伝子の調節領域（プロモーター）の制御下にＧＦＰレポーター遺伝子を置くことにより構築する。まず、ＥＧＦＰ発現がヒトＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４遺伝子プロモーターにより駆動されるプラスミド構築物を、ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clonetech）のＣＭＶプロモーターをヒトＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４制御領域と取り替えることにより作製する。これらの制御領域はＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４遺伝子の特性化調節エレメントを含有し、そしてそれらはトランスジェニックマウスにおけるこれらの遺伝子の正常発現パターンを付与するのに十分である。その結果生じるベクターでは、ＥＦＧＰの発現はＳＯＸ１７プロモーター又はＣＸＣＲ４プロモーターにより駆動される。いくつかの実験において、このベクターをｈＥＳＣ中にトランスフェクトし得る。   Construction of SOX17-expressing definitive endoderm cell line and CXRC4-expressing definitive endoderm cell line genetically labeled with a reporter gene by placing a GFP reporter gene under the control of the regulatory region (promoter) of SOX17 gene or CXCR4 gene, respectively. To do. First, a plasmid construct in which EGFP expression is driven by a human SOX17 or CXCR4 gene promoter is generated by replacing the CMV promoter of the vector pEGFP-N1 (Clonetech) with a human SOX17 or CXCR4 regulatory region. These control regions contain characterization regulatory elements of the SOX17 or CXCR4 gene and they are sufficient to confer a normal expression pattern of these genes in transgenic mice. In the resulting vector, EFGP expression is driven by the SOX17 promoter or the CXCR4 promoter. In some experiments, this vector can be transfected into hESC.

ＳＯＸ１７プロモーター／ＥＧＦＰカセット又はＣＸＣＲ４プロモーター／ＥＧＦＰカセットを上記のベクターから切り出し、次に、ホスホグリセレートキナーゼ−１プロモーターの制御下でネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有する選択ベクター中にサブクローニングする。カセットの除去を可能にするために、選択カセットは、ｆｌｐリコンビナーゼ認識部位に隣接する。この選択ベクターを直線化し、次に標準リポフェクション方法を用いてｈＥＳＣ中に導入する。Ｇ４１８における選択の１０〜１４日後、非分化トランスジェニックｈＥＳＣクローンを単離し、増殖させる。   The SOX17 promoter / EGFP cassette or CXCR4 promoter / EGFP cassette is excised from the above vector and then subcloned into a selection vector containing the neomycin phosphotransferase gene under the control of the phosphoglycerate kinase-1 promoter. The selection cassette is adjacent to the flp recombinase recognition site to allow removal of the cassette. This selection vector is linearized and then introduced into hESC using standard lipofection methods. After 10-14 days of selection in G418, non-differentiated transgenic hESC clones are isolated and expanded.

レポーターがＦＡＣＳによる細胞分離を可能にするという条件で、ＧＦＰ又はＥＧＦＰ以外のレポーター遺伝子が上記の構築物のいずれかで用いられ得ることが理解されよう。   It will be appreciated that reporter genes other than GFP or EGFP can be used in any of the above constructs, provided that the reporter allows cell separation by FACS.

胚体内胚葉の代替的単離
以下の実施例は、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーター／ＥＧＦＰカセットを含むｈＥＳＣが胚体内胚葉細胞に分化し、次に蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によりその後単離される、ということを実証する。 Alternative isolation of definitive endoderm The following example shows that hESCs containing SOX17 or CXCR4 promoter / EGFP cassettes are differentiated into definitive endoderm cells and then isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). I will prove that.

ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーター／ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣを、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有し、血清を含有しない増殖培地中で約６、１２及び１８時間分化させる。次に分化細胞をトリプシン消化により収穫し、Becton DickinsonＦＡＣＳ Ｄｉｖａで直接ＲＮＡ溶解緩衝液又はＰＢＳ中に分類する。単一生細胞の試料を
ＥＧＦＰに関するゲーティングなしに採取し、そして単一生細胞をＥＧＦＰ陽性及びＧＦＰ陰性集団にゲーティングする。別個の実験で、蛍光強度（高低）によってＥＧＦＰ陽性画分を２つの等サイズ集団に分離する。 SOX17 or CXCR4 promoter / EGFP transgenic hESCs are differentiated for about 6, 12 and 18 hours in growth medium containing 100 ng / ml activin A and no serum. The differentiated cells are then harvested by trypsin digestion and sorted directly into RNA lysis buffer or PBS with Becton Dickinson FACS Diva. Single live cell samples are taken without gating for EGFP, and single live cells are gated into EGFP positive and GFP negative populations. In a separate experiment, the EGFP positive fraction is separated into two equal sized populations by fluorescence intensity (high and low).

分類後、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫細胞化学により、細胞集団を分析する。Ｑ−ＰＣＲ分析のために、QiagenＲＮｅａｓｙカラムを用いてＲＮＡを調製し、次にｃＤＮＡに転換する。前記のようにＱ−ＰＣＲを実行する。免疫細胞化学分析のために、細胞をＰＢＳ中に分類し、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ遠心分離を用いてガラススライドに接着させる。一次抗体はＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４である。ＦＩＴＣ（緑色）又はローダミン（赤色）に結合される適切な二次抗体を用いて、第１の抗体の結合を検出する。   After classification, the cell population is analyzed by Q-PCR and immunocytochemistry. For Q-PCR analysis, RNA is prepared using a Qiagen RNeasy column and then converted to cDNA. Perform Q-PCR as described above. For immunocytochemical analysis, cells are sorted into PBS, fixed in 4% paraformaldehyde for 10 minutes, and attached to glass slides using a Cytospin centrifuge. The primary antibody is SOX17 or CXCR4. The binding of the first antibody is detected using an appropriate secondary antibody that is bound to FITC (green) or rhodamine (red).

分類細胞をさらにＱ−ＰＣＲ分析に付す。分化細胞は、ＥＧＦＰ蛍光と内因性ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４発現遺伝子発現との相関を示す。非蛍光細胞と比較して、ＥＧＦＰ陽性細胞は、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４発現レベルの２倍より大きい増大を示す。高及び低ＥＧＦＰ強度細胞の分離は、ＥＧＦＰ発現レベルがＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４発現レベルと相関する、ということを示す。ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡ分析のほかに、分類細胞をＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４ポリペプチドの免疫細胞化学分析に付す（ＣＸＣＲ４／ＥＧＦＰ融合体を用いる実施形態では、ＳＯＸ１７ポリペプチド発現を分析し、そしてＳＯＸ１７／ＥＧＦＰ融合体を用いる場合には、ＣＸＣＲ４ポリペプチド発現を分析する）。ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４ポリペプチドの実質的発現は、富化ＥＧＦＰ陽性画分で観察され得る。それに対して、ＥＧＦＰ陰性画分中では、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４ポリペプチドの発現はほとんど観察されない。   Sorted cells are further subjected to Q-PCR analysis. Differentiated cells show a correlation between EGFP fluorescence and endogenous SOX17 or CXCR4 expressing gene expression. Compared to non-fluorescent cells, EGFP positive cells show a greater than 2-fold increase in SOX17 or CXCR4 expression levels. Separation of high and low EGFP intensity cells indicates that EGFP expression levels correlate with SOX17 or CXCR4 expression levels. In addition to SOX17 or CXCR4 mRNA analysis, the sorted cells are subjected to immunocytochemical analysis of SOX17 or CXCR4 polypeptide (in embodiments using CXCR4 / EGFP fusion, SOX17 polypeptide expression is analyzed and SOX17 / EGFP fusion To analyze CXCR4 polypeptide expression). Substantial expression of SOX17 or CXCR4 polypeptide can be observed in the enriched EGFP positive fraction. In contrast, little expression of SOX17 or CXCR4 polypeptide is observed in the EGFP negative fraction.

これらの結果を考えると、分類前に分化細胞培養物中に存在する細胞の少なくとも約５％は、ＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性胚体内胚葉細胞である。分類細胞集団中の細胞の少なくとも約９０％は、ＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性胚体内胚葉細胞である。   Given these results, at least about 5% of the cells present in the differentiated cell culture prior to classification are SOX17 / CXCR4-positive definitive endoderm cells. At least about 90% of the cells in the sorted cell population are SOX17 / CXCR4-positive definitive endoderm cells.

培養での胚体内胚葉細胞の継代培養
本実施例は、本明細書中に記載される胚体内胚葉細胞が細胞培養で維持されて、さらなる分化を伴わずに継代培養され得る、ということを実証する。 Subculture of definitive endoderm cells in culture This example indicates that the definitive endoderm cells described herein can be maintained in cell culture and subcultured without further differentiation. To demonstrate.

低血清ＲＭＰＩ中の１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下で、ＣｙＴ２５ ｈＥＳＣ系統の２つの関連継代培養（ＥＢ及びＥＶと呼ばれる）から、胚体内胚葉細胞を分化させた。低血清ＲＰＭＩは、０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を１日目に、０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを２日目に、そして２％血清をそれ以後の各日目に含有した。４日間の分化後、分化の誘導から測定して合計で３６日間、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下又は非存在下で培養で細胞を維持した。３６日間の培養期間中、胚体内胚葉細胞を２回、継代培養した。さらに２９〜３６日目に、ＥＶと呼ばれる群の細胞をさらに５０ｍｇ／ｍｌのＥＧＦと接触させた。培養の４、９、２３、２９及び３６日目に、Ｑ−ＰＣＲを用いて、胚体内胚葉を示すマーカー遺伝子の発現を測定した。   Definitive endoderm cells were differentiated from two related subcultures of the CyT25 hESC line (referred to as EB and EV) in the presence of 100 ng / ml activin A in low serum RMPI. Low serum RPMI was determined with 0% (v / v) fetal bovine serum (FBS) on day 1, 0.2% (v / v) FBS on day 2, and 2% serum on each subsequent day. Contained in the eye. After 4 days of differentiation, cells were maintained in culture in the presence or absence of 100 ng / ml activin A for a total of 36 days as measured from induction of differentiation. During the 36-day culture period, definitive endoderm cells were subcultured twice. On days 29-36, a group of cells called EV was further contacted with 50 mg / ml EGF. On days 4, 9, 23, 29 and 36 of the culture, the expression of a marker gene indicating definitive endoderm was measured using Q-PCR.

図３５Ａ〜図３５Ｄは、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを提供された細胞培養物中で、ｈＥＳＣからの胚体内胚葉細胞の誘導（４〜３６日目）後、３２日間の培養期間中、胚体内胚葉マーカーＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＣＸＣＲ４の発現が維持された、ということを示す。アクチビンＡの非存在下で増殖した細胞培養物中では、これらのマーカーの発現はほとんど観察されなかった。５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの付加は、胚体内胚葉マーカーのいずれの発現も有意に増大するように見えなかった。   FIGS. 35A-35D show the definitive body during the 32-day culture period after induction of definitive endoderm cells from hESCs (days 4-36) in cell culture provided with 100 ng / ml of activin A. It shows that the expression of germ layer markers SOX17, GSC, MIXL1 and CXCR4 was maintained. Little expression of these markers was observed in cell cultures grown in the absence of activin A. The addition of 50 ng / ml EGF did not appear to significantly increase the expression of any definitive endoderm marker.

精製胚体内胚葉細胞の増殖
本実施例は、本明細書中に記載される胚体内胚葉細胞がｈＥＳＣから分化され、精製され、次に再増殖されて、細胞培養で増殖され得る、ということを実証する。 Proliferation of Purified Definitive Endoderm Cells This example demonstrates that definitive endoderm cells described herein can be differentiated from hESCs, purified, then re-propagated and propagated in cell culture. Demonstrate.

図３６は、胚体内胚葉精製／増殖実験の計画を示す。特に、低血清ＲＭＰＩ中で１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下で、ｈＥＳＣ系統ＣｙＴ２５の９６回目の継代培養から、胚体内胚葉細胞を分化させた。低血清ＲＰＭＩは、０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を１日目に、０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを２日目に、そして２％血清をそれ以後の各日目に含有した。５日間の分化後、上記実施例に記載したように、ＣＸＣＲ４に対する抗体を用いて、細胞をＦＡＣＳ精製に付した。次に精製細胞集団を、以下の４つの成長因子条件のうちの１つの下で、２％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中でポリオルニチン及び１０μｇ／ｍｌヒトフィブロネクチンで被覆されたＩＶＦ皿上で培養した：因子添加なし（ＮＦ）；１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ａ）；１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１（ＡＩ）；又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（ＡＦＥ）。１１日目に、標準トリプシン処理法を用いて、増殖胚体内胚葉細胞を継代培養した。次に細胞培養物の各々を、継代培養後さらに１０日間増殖させた（アクチビンＡとの最初の接触後、全体で２１日）。図３６に示すように、ｍＲＮＡの試料を、０、５、１１及び２１日目に得た。   FIG. 36 shows the design of the definitive endoderm purification / proliferation experiment. In particular, definitive endoderm cells were differentiated from the 96th passage of hESC line CyT25 in the presence of 100 ng / ml activin A in low serum RMPI. Low serum RPMI was determined with 0% (v / v) fetal bovine serum (FBS) on day 1, 0.2% (v / v) FBS on day 2, and 2% serum on each subsequent day. Contained in the eye. After 5 days of differentiation, the cells were subjected to FACS purification using an antibody against CXCR4 as described in the above examples. The purified cell population was then cultured on IVF dishes coated with polyornithine and 10 μg / ml human fibronectin in RPMI containing 2% FBS under one of the following four growth factor conditions: No factor addition (NF); 100 ng / ml activin A (A); 100 ng / ml activin A and 100 ng / ml IGF1 (AI); or 100 ng / ml activin A, 12 ng / ml bFGF and 10 ng / ml EGF (AFE). On day 11, proliferating definitive endoderm cells were subcultured using standard trypsinization methods. Each of the cell cultures was then grown for an additional 10 days after subculture (21 days total after the first contact with activin A). As shown in FIG. 36, mRNA samples were obtained on days 0, 5, 11, and 21.

図３７Ａ〜図３７Ｅは、培養条件の各々に関して試料時点の各々での種々の胚性細胞型に関するマーカー遺伝子の発現を示す。図３７Ａ及び図３７Ｂに示すように、胚体内胚葉マーカーＳＯＸ１７及びＧＳＣは、５日齢非精製胚体内胚葉培養物中で高度に発現されたが、ｈＥＳＣ中では発現されなかった。この発現は、ｈＥＳＣマーカーＯＣＴ４の発現と対照を成す（図３７Ｃ）。胚体内胚葉細胞の精製の６日後（１１日目）、ＳＯＸ１７の発現及びＧＳＣ発現は、成長因子（単数又は複数）で処理された細胞培養物の各々においては高度に残存したが、アクチビンＡの非存在下で増殖した細胞培養物中には残存しなかった（図３７Ａ及び図３７Ｂ）。継代培養の１０日後（２１日目）に、これらのマーカーに関して類似の発現パターンを観察した（図３７Ａ及び図３７Ｂ）。ｈＥＳＣ（ＯＣＴ４）、中胚葉（ブラキュリ）又は外胚葉（ＺＩＣ１及びＳＯＸ１）のマーカーに関するｍＲＮＡの発現は、精製後の細胞培養物のいずれにおいても観察されなかった。この結果は、アクチビンＡの非存在下でさえ、精製胚体内胚葉細胞がｈＥＳＣ又は他の２つの胚性細胞系統の細胞を形成しない、ということを示す（図３７Ｃ〜図３７Ｆ）。   Figures 37A-37E show the expression of marker genes for various embryonic cell types at each of the sample time points for each of the culture conditions. As shown in FIGS. 37A and 37B, definitive endoderm markers SOX17 and GSC were highly expressed in 5 day old non-purified definitive endoderm cultures but not in hESCs. This expression is in contrast to the expression of the hESC marker OCT4 (FIG. 37C). Six days after purification of definitive endoderm cells (day 11), SOX17 expression and GSC expression remained highly in each of the cell cultures treated with growth factor (s), but with activin A It did not remain in cell cultures grown in the absence (FIGS. 37A and 37B). Similar expression patterns for these markers were observed 10 days after subculture (day 21) (FIGS. 37A and 37B). Expression of mRNA for markers of hESC (OCT4), mesoderm (brachyury) or ectoderm (ZIC1 and SOX1) was not observed in any of the purified cell cultures. This result shows that even in the absence of activin A, purified definitive endoderm cells do not form cells of hESCs or two other embryonic cell lineages (FIGS. 37C-37F).

本明細書中に記載される方法、組成物及び装置は、目下、好ましい実施形態を代表するものであり、例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。その変更及びその他の使用は当業者に思い付かれ、これらは本発明の精神に包含され、そして開示の範囲により規定される。したがって本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、本明細書に開示される発明に種々の置換及び修正がなされ得るということは、当業者には明らかである。   The methods, compositions, and devices described herein are presently representative of preferred embodiments and are exemplary and not intended as limitations on the scope of the invention. Variations and other uses will occur to those skilled in the art and are encompassed within the spirit of the invention and are defined by the scope of the disclosure. Thus, it will be apparent to one skilled in the art that various substitutions and modifications can be made to the invention disclosed herein without departing from the scope and spirit of the invention.

添付の特許請求の範囲及び本開示全体を通して用いられる場合、「本質的に〜から成る」という語句は、当該語句の後ろに列挙される任意の要素を含むことを意味し、列挙した要素に関する開示において特定される活性又は作用を妨害しないか又は寄与しない他の要素に限定される。したがって「本質的に〜から成る」という語句は、列挙した要素が必要とされるか又は必須であるが、他の要素は任意であり、それらが列挙した要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かによって、存在してもよいし存在しなくてもよい、ということを示す。   As used throughout the appended claims and throughout this disclosure, the phrase “consisting essentially of” means including any element listed after the phrase, and disclosure relating to the listed elements. Limited to other elements that do not interfere with or contribute to the activity or action specified in. Thus, the phrase “consisting essentially of” means that the listed elements are required or required, but other elements are optional and do they affect the activity or action of the listed elements It indicates that it may or may not exist depending on whether or not.

［参考文献］
多数の文献及び特許参考文献を、本特許出願中で引用してきた。本特許出願で引用され
る参考文献のそれぞれ及び全てが、参照として本明細書中に全体が援用される。 [References]
A number of documents and patent references have been cited in this patent application. Each and every reference cited in this patent application is hereby incorporated by reference in its entirety.

いくつかの参考文献に関しては、全引用が文書の本文中に存在する。他の参考文献に関しては、文書の本文中における引用は著者及び年で示しているが、全引用を以下に示す：   For some references, full citations are present in the body of the document. For other references, citations in the body of the document are given by author and year, but full citations are given below:

ｈＥＳＣからのβ細胞の産生のための提案された分化経路の模式図である。当該経路の第１の工程は、ＥＳ細胞を胚体内胚葉細胞系列に関係付け(commit)、そして膵臓内胚葉、内分泌性内胚葉又は島／β細胞へのＥＳ細胞のさらなる分化における既知の最も初期の工程のうちの１つを表す。この移行を媒介するために有用ないくつかの因子は、ＴＧＦβファミリーの成員であり、例としては、アクチビン及びノーダルが挙げられるが、これらに限定されない。胚体内胚葉標的細胞を規定するための例示的マーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＭＩＸ１及びＣＸＣＲ４である。FIG. 2 is a schematic diagram of the proposed differentiation pathway for production of β cells from hESC. The first step of the pathway is to commit ES cells to the definitive endoderm cell lineage and the earliest known in further differentiation of ES cells into pancreatic endoderm, endocrine endoderm or islet / β cells Represents one of the processes. Some factors useful for mediating this transition are members of the TGFβ family, examples include but are not limited to activin and nodal. Exemplary markers for defining definitive endoderm target cells are SOX17, GATA4, HNF3b, MIX1 and CXCR4. 保存モチーフの位置を表示し、且つＧＥＮＯＶＡＣによる免疫化手順に使用される領域を強調するヒトＳＯＸ１７ ｃＤＮＡの略図である。Figure 3 is a schematic representation of human SOX17 cDNA displaying the location of conserved motifs and highlighting the regions used for immunization procedures with GENOVAC. ＳＯＸ１７が、ＳＯＸ７に、また幾分劣るがＳＯＸ１８に最も密接に関連することを示す相関系統樹である。ＳＯＸ１７タンパク質は、同種内のＳＯＸ Ｆ群サブファミリーの他の成員に対するよりも種相同体間でより密接に関連する。A correlated phylogenetic tree showing that SOX17 is most closely related to SOX7 and to a lesser extent SOX18. SOX17 protein is more closely related among species homologs than to other members of the SOX F group subfamily within the same species. ラット抗ＳＯＸ１７抗体でプローブしたウェスタンブロットである。このブロットは、線維芽細胞において過剰発現されるヒトＳＯＸ１７タンパク質に関するこの抗体の特異性（レーン１）及びＥＧＦＰとの免疫反応性の欠如（レーン２）或いは最も密接に関連するＳＯＸスーパーファミリー成員であるＳＯＸ７（レーン３）を実証する。It is a Western blot probed with a rat anti-SOX17 antibody. This blot is the specificity of this antibody for human SOX17 protein overexpressed in fibroblasts (lane 1) and lack of immunoreactivity with EGFP (lane 2) or the most closely related SOX superfamily member Demonstrate SOX7 (lane 3). 図５Ａ及び図５Ｂは、相当数のＡＦＰ+同時標識細胞を表示するＳＯＸ１７+細胞のクラスター（Ａ）を示す顕微鏡写真である。これは、ＡＦＰ+細胞がほとんど又は全く観察されない他のＳＯＸ１７+クラスター（Ｂ）と著しい対比を成す。FIGS. 5A and 5B are photomicrographs showing a cluster of SOX17 + cells (A) displaying a significant number of AFP + co-labeled cells. This is in marked contrast to other SOX17 + clusters (B) where little or no AFP + cells are observed. 図６Ａ〜図６Ｃは、壁側内胚葉及びＳＯＸ１７を示す顕微鏡写真である。パネルＡは、ｈＥＳ細胞の無作為に分化された培養物における壁内胚葉細胞の細胞表面上に位置するヒトトロンボモジュリン（ＴＭ）タンパク質に関する免疫細胞化学を示す。パネルＢは、ＴＭ及びＳＯＸ１７に関して二重標識されたＡで示されるのと同一視野である。パネルＣは、ＤＡＰＩ標識された核を伴う同一視野の位相コントラスト画像である。ＤＡＰＩ標識された核とＳＯＸ１７ラベリングの完全な相関に留意されたい。6A to 6C are photomicrographs showing wall-side endoderm and SOX17. Panel A shows immunocytochemistry for human thrombomodulin (TM) protein located on the cell surface of mural endoderm cells in randomly differentiated cultures of hES cells. Panel B is the same field of view as shown with double labeled A for TM and SOX17. Panel C is a phase contrast image of the same field with DAPI labeled nuclei. Note the complete correlation between DAPI labeled nuclei and SOX17 labeling. 図７Ａ及び図７Ｂは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によるＳＯＸ１７遺伝子発現及びＳＯＸ１７特異的抗体による抗ＳＯＸ１７陽性細胞を示す棒グラフである。パネルＡは、未分化対照培地（ＳＲ２０）と比較して、アクチビンＡがＳＯＸ１７遺伝子発現を増大させる一方で、レチノイン酸（ＲＡ）はＳＯＸ１７発現を強力に抑制することを示す。パネルＢは、これらの変化の同一パターン並びに類似した規模が、ＳＯＸ１７+細胞数に反映されることを示しており、ＳＯＸ１７遺伝子発現のＱ−ＰＣＲ測定は、単一細胞レベルでの変化を大きく反映することを示す。7A and 7B are bar graphs showing SOX17 gene expression by quantitative PCR (Q-PCR) and anti-SOX17 positive cells by SOX17-specific antibodies. Panel A shows that activin A increases SOX17 gene expression while retinoic acid (RA) strongly suppresses SOX17 expression compared to undifferentiated control medium (SR20). Panel B shows that the same pattern of these changes as well as a similar magnitude is reflected in the number of SOX17 + cells, and the Q-PCR measurement of SOX17 gene expression largely reflects changes at the single cell level. Indicates to do. 図８Ａは、アクチビンＡの存在下での分化ｈＥＳＣの培養は、低レベルのＡＦＰ遺伝子発現を維持するのに対して、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で無作為に分化することが可能とされる細胞は、ＡＦＰの強力なアップレギュレーションを示すことを示す棒グラフである。発現レベルの差異は、およそ７倍である。図８Ｂ及び図８Ｃは、１０％ＦＢＳ単独（上）に対するアクチビンＡ処理状態（下）で観察されるＡＦＰ+細胞の非常に希少且つ小さなクラスターにより示されるように、アクチビンＡによるＡＦＰ発現の抑制もまた単一細胞レベルで明白であることを示す２つの顕微鏡写真の画像である。FIG. 8A shows that cultures of differentiated hESCs in the presence of activin A can randomly differentiate in 10% fetal bovine serum (FBS), while maintaining low levels of AFP gene expression. Cells shown are bar graphs showing that the cells exhibit strong up-regulation of AFP. The difference in expression level is approximately 7 times. FIGS. 8B and 8C also show suppression of AFP expression by activin A, as shown by the very rare and small clusters of AFP + cells observed in the activin A treatment state (bottom) against 10% FBS alone (top). It is also an image of two micrographs showing that it is evident at the single cell level. 図９Ａ及び図９Ｂは、フローサイトメトリーを使用したＡＦＰ+細胞数の定量化を示す比較画像である。この図は、アクチビンＡの存在（右パネル）及び非存在（左パネル）下でのＡＦＰ遺伝子発現の変化の規模（図８Ａ）がＡＦＰ+細胞の数に正確に対応することを実証し、さらに個々の細胞レベルで起こる変化を示すためのＱ−ＰＣＲ分析の有用性を支持する。9A and 9B are comparative images showing quantification of AFP + cell numbers using flow cytometry. This figure demonstrates that the magnitude of changes in AFP gene expression in the presence (right panel) and absence (left panel) of activin A (FIG. 8A) accurately corresponds to the number of AFP + cells, It supports the usefulness of Q-PCR analysis to show the changes that occur at the individual cell level. 図１０Ａ〜図１０Ｆは、ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢ（ＮＡＡ）へのｈＥＳＣの暴露が、５日間にわたってＳＯＸ１７+細胞の数の著しい増大をもたらすことを示す顕微鏡写真である（Ａ〜Ｃ）。ＤＡＰＩ染色された核により示されるように（Ｄ〜Ｆ）、ＳＯＸ１７+細胞の相対存在量を、各視野に存在する細胞の総数と比較することにより、すべての細胞のおよそ３０〜５０％が、ＮＡＡによる５日の処理後にＳＯＸ１７に対して免疫反応性であることがわかる。FIGS. 10A-10F are photomicrographs showing that exposure of hESCs to nodal, activin A and activin B (NAA) results in a significant increase in the number of SOX17 + cells over 5 days (AC). By comparing the relative abundance of SOX17 + cells with the total number of cells present in each field, as shown by DAPI stained nuclei, approximately 30-50% of all cells It can be seen that it is immunoreactive to SOX17 after 5 days of treatment with NAA. アクチビンＡ（０、１０、３０又は１００ｎｇ／ｍｌ）は、分化ｈＥＳＣにおけるＳＯＸ１７遺伝子発現を用量依存的に増大させることを実証する棒グラフである。増大された発現は、接着培養物上での３日間の処理後にすでに強健であり、同様に続く１、３及び５日の懸濁培養まで継続する。Activin A (0, 10, 30 or 100 ng / ml) is a bar graph demonstrating that dose-dependently increases SOX17 gene expression in differentiated hESCs. Increased expression is already robust after 3 days of treatment on adherent cultures and continues to the subsequent 1, 3 and 5 day suspension cultures as well. 図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＭＩＸＬ１（パネルＡ）、ＧＡＴＡ４（パネルＢ）及びＨＮＦ３ｂ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの影響を実証する棒グラフである。アクチビンＡ用量依存的増大はまた、胚体内胚葉の３つの他のマーカーであるＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂに関しても観察される。アクチビン用量に応答した増大された発現の規模は、ＳＯＸ１７に関して観察される規模と際立って類似しており、アクチビンＡが、４つすべての遺伝子（ＳＯＸ１７+、ＭＩＸＬ１+、ＧＡＴＡ４+及びＨＮＦ３ｂ+）を同時発現する細胞の集団を特定していることを強力に示している。FIGS. 12A-12C are bar graphs demonstrating the effect of activin A on the expression of MIXL1 (panel A), GATA4 (panel B) and HNF3b (panel C). Activin A dose-dependent increase is also observed for three other markers of definitive endoderm, MIXL1, GATA4 and HNF3b. The magnitude of increased expression in response to activin dose is remarkably similar to that observed for SOX17, with activin A expressing all four genes (SOX17 + , MIXL1 + , GATA4 + and HNF3b + ). It is a strong indication that it has identified a population of co-expressing cells. 図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＡＦＰ（パネルＡ）、ＳＯＸ７（パネルＢ）及びＳＰＡＲＣ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの影響を実証する棒グラフである。臓側内胚葉マーカーＡＦＰの発現においてアクチビンＡ用量依存的減少が見られる。原始内胚葉（ＳＯＸ７）及び壁側内胚葉（ＳＰＡＲＣ）のマーカーは、未変化のままであるか、或いはいくつかの時点で抑制を示すことから、アクチビンＡが、これらの胚体外内胚葉細胞型を特定するように作用しないことを示している。このことはさらに、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂの増大された発現が、アクチビンＡに応答した胚体内胚葉細胞の数の増大に起因し得るという事実を支持する。13A-13C are bar graphs demonstrating the effect of activin A on the expression of AFP (panel A), SOX7 (panel B) and SPARC (panel C). There is a dose-dependent decrease in activin A in the expression of visceral endoderm marker AFP. Since primordial endoderm (SOX7) and parietal endoderm (SPARC) markers remain unchanged or show repression at several time points, activin A is one of these extraembryonic endoderm cell types. It does not act to specify. This further supports the fact that increased expression of SOX17, MIXL1, GATA4 and HNF3b may be due to an increased number of definitive endoderm cells in response to activin A. 図１４Ａ及び図１４Ｂは、ＺＩＣ１（パネルＡ）及びブラキュリ発現（パネルＢ）に対するアクチビンＡの影響を示す棒グラフである。神経マーカーＺＩＣ１の一貫した発現は、神経分化に対するアクチビンＡの用量依存的影響が見られないことを実証する。ブラキュリの減少された発現により示されるように、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ処理により媒介される中胚葉分化の顕著な抑制が見られる。これは、中内胚葉前駆体からの胚体内胚葉の増大された特異化の結果である可能性が高い。より低レベルのアクチビンＡ処理（１０及び３０ｎｇ／ｍｌ）は、未処理対照培養物に対して分化のより後期の時点でブラキュリの発現を維持する。14A and 14B are bar graphs showing the effect of activin A on ZIC1 (panel A) and Brachyury expression (panel B). The consistent expression of the neuronal marker ZIC1 demonstrates that there is no dose-dependent effect of activin A on neuronal differentiation. There is a marked suppression of mesoderm differentiation mediated by 100 ng / ml activin A treatment, as shown by the reduced expression of Brachyury. This is likely the result of increased specification of definitive endoderm from mesendoderm precursors. Lower levels of activin A treatment (10 and 30 ng / ml) maintain Brachyury expression at later time points of differentiation relative to untreated control cultures. 図１５Ａ及び図１５Ｂは、アクチビンによる処理に応答した減少された壁側内胚葉分化を示す顕微鏡写真である。ＴＭhi壁側内胚葉の領域は、血清単独中で分化される場合、培養物の至るところで見られる（Ａ）のに対して、アクチビンが包含される場合、ＴＭ+細胞への分化は乏しく（Ｂ）、ＴＭ免疫反応性の全体的な強度はより低い。Figures 15A and 15B are photomicrographs showing reduced mural endoderm differentiation in response to treatment with activin. The region of the TM hi mural endoderm is found throughout the culture when differentiated in serum alone (A), whereas when activin is included, differentiation into TM + cells is poor ( B) The overall intensity of TM immunoreactivity is lower. 図１６Ａ〜図１６Ｄは、アクチビンＡ及びアクチビンＢによる処理に応答したマーカー発現を示す顕微鏡写真である。ｈＥＳＣは、アクチビンＡ及びアクチビンＢにより連続４日間処理して、ＳＯＸ１７、ＡＦＰ及びＴＭ抗体で三重標識した。パネルＡ−ＳＯＸ１７、パネルＢ−ＡＦＰ、パネルＣ−ＴＭ及びパネルＤ−相／ＤＡＰＩ。ＡＦＰ（Ｂ）及びＴＭ（Ｃ）免疫反応性の完全な非存在と関連した無数のＳＯＸ１７陽性細胞（Ａ）に注目されたい。16A to 16D are photomicrographs showing marker expression in response to treatment with activin A and activin B. FIG. hESCs were treated with Activin A and Activin B for 4 consecutive days and triple labeled with SOX17, AFP and TM antibodies. Panel A-SOX17, Panel B-AFP, Panel C-TM and Panel D-Phase / DAPI. Note the myriad SOX17 positive cells (A) associated with the complete absence of AFP (B) and TM (C) immunoreactivity. ｈＥＳＣからのｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚体内胚葉及び臓側内胚葉の出現を示す顕微鏡写真である。臓側内胚葉の領域は、ＡＦＰhi／ＳＯＸ１７lo/-により同定される一方で、胚体内胚葉は、完全に反対のプロフィールであるＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo/-を示す。この視野は、これらの２つの領域の互いに対する近接性に起因して選択的に選択された。しかしながら、何度もＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo/-領域がＡＦＰhi細胞の任意の領域からの絶対的な単離で観察され、これは臓側内胚葉細胞とは別個の胚体内胚葉細胞の起源を示唆する。It is a microscope picture which shows the appearance of the definitive endoderm and the visceral endoderm in vitro from hESC. The visceral endoderm area is identified by AFP hi / SOX17 lo /- , while the definitive endoderm shows a completely opposite profile, SOX17 hi / AFP lo /- . This field of view was selectively chosen due to the proximity of these two regions to each other. However, many times the SOX17 hi / AFP lo / − region has been observed with absolute isolation from any region of the AFP hi cells, which represents the origin of definitive endoderm cells distinct from visceral endoderm cells. Suggest. ＴＧＦβファミリーのリガンド及び受容体を表す略図である。ＡＲ Ｓｍａｄ及びＢＲ Ｓｍａｄを活性化する因子は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉の産生に有用である（J Cell Physiol. 187: 265-76を参照）。1 is a schematic representation of TGFβ family ligands and receptors. Factors that activate AR Smad and BR Smad are useful for the production of definitive endoderm from human embryonic stem cells (see J Cell Physiol. 187: 265-76). 個々のＴＧＦβ因子及びＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。FIG. 5 is a bar graph showing the induction of SOX17 expression over time as a result of treatment with individual TGFβ factors and combinations of TGFβ factors. ＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７+細胞数の増大を示す棒グラフである。FIG. 5 is a bar graph showing the increase in the number of SOX17 + cells over time as a result of treatment with a combination of TGFβ factors. ＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。FIG. 6 is a bar graph showing the induction of SOX17 expression over time as a result of treatment with a combination of TGFβ factors. アクチビンＡが、ＳＯＸ１７+細胞数の用量依存的増大を誘導することを示す棒グラフである。FIG. 6 is a bar graph showing that activin A induces a dose-dependent increase in SOX17 + cell number. アクチビンＡ及びアクチビンＢ処理培養物へのＷｎｔ３ａの添加が、アクチビンＡ及びアクチビンＢ単独により誘導されるレベルを上回ってＳＯＸ１７発現を増大させることを示す棒グラフである。FIG. 6 is a bar graph showing that the addition of Wnt3a to activin A and activin B treated cultures increases SOX17 expression above the level induced by activin A and activin B alone. 図２４Ａ〜図２４Ｃは、胚体内胚葉への分化が低ＦＢＳ条件で増強されることを示す棒グラフである。２％ＦＢＳを含有する培地中（２ＡＡ）でのアクチビンＡ及びＢによるｈＥＳＣの処理は、１０％ＦＢＳ培地（１０ＡＡ）中での同じ処理と比較して、２〜３倍高いレベルのＳＯＸ１７発現をもたらす（パネルＡ）。胚体内胚葉マーカーＭＩＸＬ１の誘導（パネルＢ）はまた、同じ方法で影響を及ぼされ、ＡＦＰ（臓側内胚葉）の抑制（パネルＣ）は、１０％ＦＢＳ条件よりも２％ＦＢＳにおいて高い。Figures 24A-24C are bar graphs showing that differentiation into definitive endoderm is enhanced under low FBS conditions. Treatment of hESC with activin A and B in medium containing 2% FBS (2AA) resulted in 2-3 times higher levels of SOX17 expression compared to the same treatment in 10% FBS medium (10AA). (Panel A). Induction of definitive endoderm marker MIXL1 (panel B) is also affected in the same way, and suppression of AFP (visceral endoderm) (panel C) is higher in 2% FBS than in 10% FBS conditions. 図２５Ａ〜図２５Ｄは、ＳＯＸ１７+細胞が培養中に***していることを示す顕微鏡写真である。ＳＯＸ１７免疫反応性細胞は、ｈＥＳＣコロニーの分化の瀬戸際(edge)に存在し（Ｃ、Ｄ）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）で標識される（パネルＢ）が、ＯＣＴ４では共同標識されていない（パネルＣ）。さらに、明確な有糸***の形が、ＳＯＸ１７+細胞（矢印）並びにＯＣＴ４+の未分化ｈＥＳＣ（矢じり）の両方において核のＤＡＰＩラベリングにより観察することができる（Ｄ）。25A-25D are photomicrographs showing that SOX17 + cells are dividing during culture. SOX17 immunoreactive cells are present at the edge of hESC colony differentiation (C, D) and are labeled with proliferating cell nuclear antigen (PCNA) (panel B) but not co-labeled with OCT4 (panel) C). Furthermore, a clear mitotic shape can be observed by nuclear DAPI labeling in both SOX17 + cells (arrows) as well as OCT4 + undifferentiated hESCs (arrowheads) (D). 様々な培地条件下での分化ｈＥＳＣにおけるＣＸＣＲ４の相対発現レベルを示す棒グラフである。2 is a bar graph showing the relative expression level of CXCR4 in differentiated hESCs under various media conditions. 図２７Ａ〜図２７Ｄは、胚体内胚葉マーカーのパネルが、どのようにして図２６で示されるのと同じ分化処理にわたってＣＸＣＲ４と非常に類似した発現のパターンを共有するかを示す棒グラフである。27A-27D are bar graphs showing how a panel of definitive endoderm markers shares a pattern of expression very similar to CXCR4 over the same differentiation process shown in FIG. 図２８Ａ〜図２８Ｅは、中胚葉（ブラキュリ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＳＯＸ１、ＺＩＣ１）及び臓側内胚葉（ＳＯＸ７）に関するマーカーが、どのようにして図２６で示されるのと同じ処理にわたってＣＸＣＲ４発現に対する逆相関を示すかを示す棒グラフである。FIGS. 28A-28E show how markers for mesoderm (Braculi, MOX1), ectoderm (SOX1, ZIC1) and visceral endoderm (SOX7) are expressed over the same process as shown in FIG. It is a bar graph which shows whether an inverse correlation with respect to is shown. 図２９Ａ〜図２９Ｆは、図２６〜図２８で示される３つの培地条件にわたってＳＯＸ１７免疫反応性細胞における相対的な差異を示す顕微鏡写真である。Figures 29A-29F are photomicrographs showing the relative differences in SOX17 immunoreactive cells over the three media conditions shown in Figures 26-28. 図３０Ａ〜図３０Ｃは、分化培地に添加されるアクチビンＡの増大濃度によるＣＸＣＲ４+細胞数の増大を実証するフローサイトメトリードットプロットである。Figures 30A-30C are flow cytometry dot plots demonstrating an increase in CXCR4 + cell number with increasing concentrations of activin A added to the differentiation medium. 図３１Ａ〜図３１Ｄは、高用量アクチビンＡ処理から単離されるＣＸＣＲ４+細胞（Ａ１００−ＣＸ＋）が、母集団（Ａ１００）よりも胚体内胚葉マーカーに関してさらに一層富化されることを示す棒グラフである。31A-31D are bar graphs showing that CXCR4 + cells (A100-CX +) isolated from high dose activin A treatment are further enriched for definitive endoderm markers than the population (A100). . 蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して単離されるＣＸＣＲ４+細胞及びＣＸＣＲ４-細胞からの遺伝子発現、並びに母集団における遺伝子発現を示す棒グラフである。これは、ＣＸＣＲ４+細胞が各母集団に存在する本質的にすべてのＣＸＣＲ４遺伝子発現を含有し、またＣＸＣＲ４-集団がＣＸＣＲ４遺伝子発現をほとんど含有しないか、或いは全く含有しないことを実証する。 2 is a bar graph showing gene expression from CXCR4 + and CXCR4 − cells isolated using fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression in a population. This demonstrates that CXCR4 + cells contain essentially all CXCR4 gene expression present in each population, and that the CXCR4 − population contains little or no CXCR4 gene expression. 図３３Ａ〜図３３Ｄは、これらの非胚体内胚葉マーカーの発現においてすでに抑制されている高用量アクチビンＡ処理から単離されるＣＸＣＲ４+細胞における中胚葉（ブラキュリ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＺＩＣ１）及び臓側内胚葉（ＳＯＸ７）遺伝子発現の欠乏を実証する棒グラフである。Figures 33A-33D show mesoderm (Braculi, MOX1), ectoderm (ZIC1) and viscera in CXCR4 + cells isolated from high-dose activin A treatment that is already repressed in the expression of these non-definitive endoderm markers. FIG. 5 is a bar graph demonstrating deficiency in lateral endoderm (SOX7) gene expression. 図３４Ａ〜図３４Ｍは、胚体内胚葉細胞を同定するのに使用することができるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーであるＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現分析は、それぞれパネルＧ〜Ｌに示される。これまでに記載した系統マーキング遺伝子であるＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１及びＭＯＸ１の発現分析は、それぞれパネルＡ〜Ｆに示される。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現分析を示す。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと標識した欄は、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理した細胞（アクチビン添加なし）を示し、０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。34A-34M are bar graphs showing marker gene expression patterns that can be used to identify definitive endoderm cells. The expression analyzes of definitive endoderm markers FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1, and CRIP1 are shown in panels G to L, respectively. The expression analysis of SOX17, SOX7, SOX17 / SOX7, TM, ZIC1 and MOX1, which have been described so far, is shown in panels A to F, respectively. Panel M shows the expression analysis of CXCR4. For each of panels A to M, the column labeled hESC shows gene expression from purified human embryonic stem cells, 2NF shows cells treated with 2% FBS (no activin added), 0.1A100 is 0 . Shows cells treated with 1% FBS, 100 ng / ml activin A, 1A100 shows cells treated with 1% FBS, 100 ng / ml activin A, 2A100 treated with 2% FBS, 100 ng / ml activin A Cells are shown. 図３４Ａ〜図３４Ｍは、胚体内胚葉細胞を同定するのに使用することができるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーであるＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現分析は、それぞれパネルＧ〜Ｌに示される。これまでに記載した系統マーキング遺伝子であるＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１及びＭＯＸ１の発現分析は、それぞれパネルＡ〜Ｆに示される。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現分析を示す。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと標識した欄は、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理した細胞（アクチビン添加なし）を示し、０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。34A-34M are bar graphs showing marker gene expression patterns that can be used to identify definitive endoderm cells. The expression analyzes of definitive endoderm markers FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1, and CRIP1 are shown in panels G to L, respectively. The expression analysis of SOX17, SOX7, SOX17 / SOX7, TM, ZIC1 and MOX1, which have been described so far, is shown in panels A to F, respectively. Panel M shows the expression analysis of CXCR4. For each of panels A to M, the column labeled hESC shows gene expression from purified human embryonic stem cells, 2NF shows cells treated with 2% FBS (no activin added), 0.1A100 is 0 . Shows cells treated with 1% FBS, 100 ng / ml activin A, 1A100 shows cells treated with 1% FBS, 100 ng / ml activin A, 2A100 treated with 2% FBS, 100 ng / ml activin A Cells are shown. 図３４Ａ〜図３４Ｍは、胚体内胚葉細胞を同定するのに使用することができるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーであるＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現分析は、それぞれパネルＧ〜Ｌに示される。これまでに記載した系統マーキング遺伝子であるＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１及びＭＯＸ１の発現分析は、それぞれパネルＡ〜Ｆに示される。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現分析を示す。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと標識した欄は、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理した細胞（アクチビン添加なし）を示し、０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。34A-34M are bar graphs showing marker gene expression patterns that can be used to identify definitive endoderm cells. The expression analyzes of definitive endoderm markers FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1, and CRIP1 are shown in panels G to L, respectively. The expression analysis of SOX17, SOX7, SOX17 / SOX7, TM, ZIC1 and MOX1, which have been described so far, is shown in panels A to F, respectively. Panel M shows the expression analysis of CXCR4. For each of panels A to M, the column labeled hESC shows gene expression from purified human embryonic stem cells, 2NF shows cells treated with 2% FBS (no activin added), 0.1A100 is 0 . Shows cells treated with 1% FBS, 100 ng / ml activin A, 1A100 shows cells treated with 1% FBS, 100 ng / ml activin A, 2A100 treated with 2% FBS, 100 ng / ml activin A Cells are shown. 図３５Ａ〜図３５Ｄは、種々の増殖条件下で３６日間維持された細胞培養物中の胚体内胚葉マーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＣＸＣＲ４の発現分析を、それぞれパネルＡ〜Ｄに示す。ＥＢ及びＥＶは、ｈＣｙＴ２５ ｈＥＳＣ系列から各々細胞集団を分離することを意味するために使用される。略号ＮＦはアクチビンＡの非存在下での細胞成長を示し、一方、Ａ１００は、１００ｎｇ／ｍｌのこの因子の存在下での細胞増殖を示す。ＥＧＦは、５０ｎｇ／ｍｌの上皮細胞成長因子を示す。FIGS. 35A-35D are bar graphs showing expression patterns of definitive endoderm marker genes in cell cultures maintained for 36 days under various growth conditions. The expression analysis of definitive endoderm markers SOX17, GSC, MIXL1 and CXCR4 are shown in panels AD respectively. EB and EV are used to mean separating each cell population from the hCyT25 hESC line. The abbreviation NF indicates cell growth in the absence of activin A, while A100 indicates cell proliferation in the presence of 100 ng / ml of this factor. EGF represents 50 ng / ml epidermal growth factor. 胚体内胚葉細胞に関する細胞分化、単離及び増殖手順を示す線図である。略号は以下の通りである：ｈＥＳＣはヒト胚性幹細胞を指す；ｄ５ ｈＥＳＣ−ＤＥは非精製胚体内胚葉細胞を指す；ｄ６ ＦＡＣＳ−ＤＥはＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞を指す；そしてｐ１ ｄ１０ ＦＡＣＳ−ＤＥは、１回継代培養され、そして継代培養後さらに１０日間増殖した精製胚体内胚葉細胞を指す。ＲＮＡ試料を採取し、指定日の各々でマーカー発現に関して分析した。FIG. 2 is a diagram showing cell differentiation, isolation and proliferation procedures for definitive endoderm cells. Abbreviations are as follows: hESC refers to human embryonic stem cells; d5 hESC-DE refers to unpurified definitive endoderm cells; d6 FACS-DE refers to CXCR4 antibody / FACS purified definitive endoderm cells; and p1 d10 FACS-DE refers to purified definitive endoderm cells that have been subcultured once and grown for an additional 10 days after subculture. RNA samples were taken and analyzed for marker expression at each designated day. 図３７Ａ〜図３７Ｆは、胚体内胚葉に分化され、次にその後ＣＸＣＲ４抗体を蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）と共に用いて精製された細胞培養物中の種々の胚性細胞系統マーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。略号は以下の通りである：ｐ９６ ｈＥＳＣは、ＣｙＴ２５ヒト胚性幹細胞の９６回目の継代培養からのｍＲＮＡを指す；ｄ５ ＤＥは、ｐ９６ ｈＥＳＣからの分化の５日目の非精製胚体内胚葉細胞からのｍＲＮＡを指す；ＮＦ ｄ６−ＦＡＣＳは、アクチビンＡの非存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞から分化後１１日目に採取されたｍＲＮＡを指す；Ａは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの分化後１１日目に採取されたｍＲＮＡを指す；ＡＩは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１の存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの分化後１１日目に採取されたｍＲＮＡを指す；ＡＦＥは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ、１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの分化後１１日目に採取されたｍＲＮＡを指す；ＮＦ ｐ１−ｄ１０−ＦＡＣＳは、アクチビンＡの非存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞の継代培養後１０日目に採取されたｍＲＮＡを指す；Ａは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの継代培養後１０日目に採取されたｍＲＮＡを指す；ＡＩは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１の存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの継代培養後１０日目に採取されたｍＲＮＡを指す；そしてＡＦＥは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ、１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの継代培養後１０日目に採取されたｍＲＮＡを指す。パネルＡ−ＳＯＸ１７；Ｂ−ＧＳＣ；Ｃ−ＯＣＴ４；Ｄ−ブラキュリ；Ｅ−ＺＩＣ１；Ｆ−ＳＯＸ１。Figures 37A-F show the expression of various embryonic cell lineage marker genes in cell cultures that were differentiated into definitive endoderm and then purified using CXCR4 antibody with fluorescence activated cell sorting (FACS). It is a bar graph which shows a pattern. Abbreviations are as follows: p96 hESC refers to mRNA from the 96th passage of CyT25 human embryonic stem cells; d5 DE refers to unpurified definitive endoderm cells on day 5 of differentiation from p96 hESC NF d6-FACS refers to mRNA collected 11 days after differentiation from CXCR4 antibody / FACS purified definitive endoderm cells incubated in the absence of activin A; A is 100 ng / refers to mRNA taken 11 days after differentiation from CXCR4 antibody / FACS purified definitive endoderm cells incubated in the presence of ml activin A; AI refers to the presence of 100 ng / ml activin A and 100 ng / ml IGF1 11 days after differentiation from CXCR4 antibody / FACS purified definitive endoderm cells incubated under AFE is 11 days after differentiation from CXCR4 antibody / FACS purified definitive endoderm cells incubated in the presence of 100 ng / ml activin A, 12 ng / ml bFGF and 10 ng / ml EGF NF p1-d10-FACS refers to mRNA collected 10 days after subculture of CXCR4 antibody / FACS purified definitive endoderm cells incubated in the absence of activin A. A refers to mRNA collected 10 days after subculture from CXCR4 antibody / FACS purified definitive endoderm cells incubated in the presence of 100 ng / ml activin A; AI refers to 100 ng / ml activin CXCR incubated in the presence of A and 100 ng / ml IGF1 Refers to mRNA collected 10 days after subculture from antibody / FACS purified definitive endoderm cells; and AFE in the presence of 100 ng / ml activin A, 12 ng / ml bFGF and 10 ng / ml EGF It refers to mRNA collected on day 10 after subculture from incubated CXCR4 antibody / FACS purified definitive endoderm cells. Panel A-SOX17; B-GSC; C-OCT4; D-brachyury; E-ZIC1; F-SOX1.

Claims (49)

培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法であって、以下：
（ａ）胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程；
（ｂ）前記細胞培養物中の他の細胞のうちの少なくともいくつかから前記胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかを単離する工程であって、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を作り出す、工程；及び
（ｃ）前記胚体内胚葉細胞の増殖を可能にする条件下で前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を培養する工程
を含む、方法。 A method for growing definitive endoderm cells in culture comprising:
(A) obtaining a cell culture containing definitive endoderm cells;
(B) isolating at least some of the definitive endoderm cells from at least some of the other cells in the cell culture, thereby enriching the cell population enriched in definitive endoderm cells And (c) culturing a cell population enriched in the definitive endoderm cells under conditions that allow the definitive endoderm cells to proliferate. 前記胚体内胚葉細胞が腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である、請求項１記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the definitive endoderm cell is a multipotent cell capable of differentiating into an intestinal cell or an organ derived therefrom. 前記胚体内胚葉細胞がヒト胚体内胚葉細胞である、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the definitive endoderm cells are human definitive endoderm cells. 前記胚体内胚葉細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来する、請求項３記載の方法。   4. The method of claim 3, wherein the definitive endoderm cells are derived from human embryonic stem cells (hESC). 前記取得する工程が、前記ｈＥＳＣのうちの少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞への分化を可能にするために、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子とｈＥＳＣを接触させることを含む、請求項４記載の方法。   5. The obtaining step comprises contacting hESC with at least one growth factor of the TGFβ superfamily to allow differentiation of at least some of the hESCs into definitive endoderm cells. The method described. 前記ＴＧＦβスーパーファミリーの前記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、請求項５記載の方法。   6. The method of claim 5, wherein the at least one growth factor of the TGFβ superfamily comprises activin A. 胚体内胚葉細胞を含む前記細胞培養物を取得する工程が、現存する胚体内胚葉培養物の一部分を取得することをさらに含む、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein obtaining the cell culture comprising definitive endoderm cells further comprises obtaining a portion of an existing definitive endoderm culture. 前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が胚体内胚葉細胞以外の細胞を実質的に含有しない、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the cell population enriched in definitive endoderm cells is substantially free of cells other than definitive endoderm cells. 前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９６％の胚体内胚葉細胞を含む、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the definitive endoderm-rich cell population comprises at least about 96% definitive endoderm cells. 前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９８％の胚体内胚葉細胞を含む、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the definitive endoderm-rich cell population comprises at least about 98% definitive endoderm cells. 前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が約１００％の胚体内胚葉細胞を含む、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the definitive endoderm-rich cell population comprises about 100% definitive endoderm cells. 前記単離する工程が、前記胚体内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、細胞培養物中に存在する前記他の細胞中で実質的に発現されない試薬を前記細胞培養物に提供すること、及び、細胞培養物中に存在する前記他の細胞から前記試薬に結合された前記胚体内胚葉細胞を分離することであって、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を生じることを含む、請求項１記載の方法。   The isolating step provides the cell culture with a reagent that binds to a marker expressed in the definitive endoderm cells but is not substantially expressed in the other cells present in the cell culture. And separating the definitive endoderm cells bound to the reagent from the other cells present in the cell culture, thereby producing a population of cells enriched in definitive endoderm cells. The method of claim 1 comprising: 前記マーカーがＣＸＣＲ４である、請求項１２記載の方法。   The method of claim 12, wherein the marker is CXCR4. 前記試薬が抗体である、請求項１２記載の方法。   The method of claim 12, wherein the reagent is an antibody. 前記試薬に結合された前記胚体内胚葉細胞が蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により細胞培養物中に存在する前記他の細胞から分離される、請求項１２記載の方法。   13. The method of claim 12, wherein the definitive endoderm cells bound to the reagent are separated from the other cells present in a cell culture by fluorescence activated cell sorting (FACS). 前記単離する工程が非標識細胞から蛍光標識胚体内胚葉細胞を分離することを含む、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the isolating comprises separating fluorescently labeled definitive endoderm cells from unlabeled cells. 前記蛍光標識胚体内胚葉細胞が強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現の結果として標識される、請求項１６記載の方法。   17. The method of claim 16, wherein the fluorescently labeled definitive endoderm cells are labeled as a result of expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP). ＥＧＦＰの発現がＳＯＸ１７プロモーターの制御下にある、請求項１７記載の方法。   18. The method of claim 17, wherein expression of EGFP is under the control of the SOX17 promoter. ＥＧＦＰの発現がＣＸＣＲ４プロモーターの制御下にある、請求項１７記載の方法。   18. The method of claim 17, wherein expression of EGFP is under the control of the CXCR4 promoter. 前記培養する工程が、前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をプレーティングすることを含む、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the culturing comprises plating the population enriched in the definitive endoderm cells or a portion thereof. 前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分がヒトフィブロネクチンで被覆された表面でプレーティングされる、請求項２０記載の方法。   21. The method of claim 20, wherein the definitive endoderm-rich population or a portion thereof is plated on a surface coated with human fibronectin. 前記表面がポリオルニチンで被覆される、請求項２１記載の方法。   The method of claim 21, wherein the surface is coated with polyornithine. 前記培養する工程が、約２％（ｖ／ｖ）の血清を含む培地中で前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、請求項１記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the culturing comprises incubating the definitive endoderm cell rich population or a portion thereof in a medium comprising about 2% (v / v) serum. 前記培養する工程が、約２％（ｖ／ｖ）よりも多い血清を含む培地中で前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the culturing comprises incubating the definitive endoderm cell rich population or a portion thereof in a medium comprising greater than about 2% (v / v) serum. 前記培養する工程が、約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the culturing comprises incubating the definitive endoderm cell rich population or a portion thereof in a medium comprising less than about 2% (v / v) serum. 前記培養する工程が、少なくとも１つの成長因子を含む培地中で前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the culturing comprises incubating the definitive endoderm cell rich population or a portion thereof in a medium comprising at least one growth factor. 前記少なくとも１つの成長因子がＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子の一成長因子である、請求項２６記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the at least one growth factor is a growth factor of a growth factor of the TGFβ superfamily. 前記ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、請求項２７記載の方法。   28. The method of claim 27, wherein the at least one growth factor of the TGFβ superfamily comprises activin A. 前記アクチビンＡが約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培地中に存在する、請求項２８記載の方法。   29. The method of claim 28, wherein the activin A is present in the medium at a concentration of about 100 ng / ml. 前記少なくとも１つの成長因子がＩＧＦ１を含む、請求項２６記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the at least one growth factor comprises IGF1. 前記ＩＧＦ１が約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培地中に存在する、請求項３０記載の方法。   31. The method of claim 30, wherein the IGF1 is present in the medium at a concentration of about 100 ng / ml. 前記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡとＩＧＦ１との組合せを含む、請求項２６記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the at least one growth factor comprises a combination of activin A and IGF1. 前記少なくとも１つの成長因子がｂＦＧＦを含む、請求項２６記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the at least one growth factor comprises bFGF. 前記ｂＦＧＦが約１２ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培地中に存在する、請求項３３記載の方法。   34. The method of claim 33, wherein the bFGF is present in the medium at a concentration of about 12 ng / ml. 前記少なくとも１つの成長因子がＥＧＦを含む、請求項２６記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the at least one growth factor comprises EGF. 前記ＥＧＦが約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培地中に存在する、請求項３５記載の方法。   36. The method of claim 35, wherein the EGF is present in the medium at a concentration of about 10 ng / ml. 前記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡと、ｂＦＧＦと、ＥＧＦとの組合せを含む、請求項２６記載の方法。   27. The method of claim 26, wherein the at least one growth factor comprises a combination of activin A, bFGF, and EGF. 請求項１記載の方法により産生される増殖した胚体内胚葉細胞集団。   An expanded definitive endoderm cell population produced by the method of claim 1. 培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法であって、以下：
（ａ）胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程、及び
（ｂ）前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程であって、それにより胚体内胚葉細胞を含む複数の細胞培養物を産生する工程を含む、方法。 A method for growing definitive endoderm cells in culture comprising:
(A) obtaining a cell culture containing definitive endoderm cells, and (b) subculturing the definitive endoderm cells, whereby a plurality of cell cultures containing definitive endoderm cells are obtained. A method comprising the step of producing. 前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、前記細胞培養物に少なくとも１つの酵素を提供することを含む、請求項３９記載の方法。   40. The method of claim 39, wherein subculturing the definitive endoderm cells comprises providing at least one enzyme to the cell culture. 前記少なくとも１つの酵素が少なくとも１つのプロテアーゼを含む、請求項４０記載の方法。   41. The method of claim 40, wherein the at least one enzyme comprises at least one protease. 前記少なくとも１つのプロテアーゼがトリプシンを含む、請求項４１記載の方法。   42. The method of claim 41, wherein the at least one protease comprises trypsin. 前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、前記胚体内胚葉細胞間の接触を機械的に妨げることを含む、請求項３９記載の方法。   40. The method of claim 39, wherein subculturing the definitive endoderm cells comprises mechanically preventing contact between the definitive endoderm cells. 前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、細胞分散緩衝液中で前記胚体内胚葉細胞をインキュベートすることを含む、請求項３９記載の方法。   40. The method of claim 39, wherein the step of subculturing the definitive endoderm cells comprises incubating the definitive endoderm cells in a cell dispersion buffer. 前記胚体内胚葉細胞が基材に付着される、請求項３９記載の方法。   40. The method of claim 39, wherein the definitive endoderm cells are attached to a substrate. 前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、前記基材から前記胚体内胚葉細胞を剥離することを含む、請求項４５記載の方法。   46. The method of claim 45, wherein subculturing the definitive endoderm cells comprises detaching the definitive endoderm cells from the substrate. 前記基材が組織培養フラスコの表面である、請求項４６記載の方法。   48. The method of claim 46, wherein the substrate is the surface of a tissue culture flask. 前記基材がマイクロタイタープレートの表面である、請求項４６記載の方法。   48. The method of claim 46, wherein the substrate is the surface of a microtiter plate. 請求項３９記載の方法により産生される増殖した胚体内胚葉細胞集団。   40. An expanded definitive endoderm cell population produced by the method of claim 39.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013512658A (en) * 2008-12-03 2013-04-18 インターナショナル ステム セル コーポレイション Method for obtaining differentiated cells from stem cells
KR20180055931A (en) * 2009-10-30 2018-05-25 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 Multipotent stem cells from the extrahepatic biliary tree and methods of isolating same
JPWO2018139600A1 (en) * 2017-01-27 2019-11-21 株式会社カネカ Endoderm cell population and method for producing any of the three germ layers from pluripotent cells
JP2020146042A (en) * 2016-04-14 2020-09-17 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Differentiation of pluripotent stem cells to midgut endoderm cells

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003304106C1 (en) * 2002-05-17 2010-10-28 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Mesoderm and definitive endoderm cell populations
EA200601231A1 (en) * 2003-12-23 2007-06-29 Китера, Инк. DEFINITIVE ENTODERMA

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013512658A (en) * 2008-12-03 2013-04-18 インターナショナル ステム セル コーポレイション Method for obtaining differentiated cells from stem cells
KR20180055931A (en) * 2009-10-30 2018-05-25 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 Multipotent stem cells from the extrahepatic biliary tree and methods of isolating same
KR102016870B1 (en) 2009-10-30 2019-08-30 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 Multipotent stem cells from the extrahepatic biliary tree and methods of isolating same
JP2020146042A (en) * 2016-04-14 2020-09-17 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Differentiation of pluripotent stem cells to midgut endoderm cells
JPWO2018139600A1 (en) * 2017-01-27 2019-11-21 株式会社カネカ Endoderm cell population and method for producing any of the three germ layers from pluripotent cells
JP7107504B2 (en) 2017-01-27 2022-07-27 株式会社カネカ Endoderm lineage cell population and method for producing cell population of any of the three germ layers from pluripotent cells
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