JP2008525002A - Bcmaポリペプチド及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規なBCMAポリペプチド変異体及びそれらの使用、特にヒトの対象者における治療的又は予防的な処置のための使用を開示する。本発明はまた、前記ポリペプチドをコードする核酸、かかる核酸を含んで成るベクター及び当該ベクターを含む組換え細胞、並びに相当の医薬組成物、に関する。本発明は更に、前記ポリペプチドを産生する方法、並びに、任意の試料中にあるこれらのポリペプチドを検出し、又は試料に薬注する方法、を開示する。更に、本発明の新規なBCMAポリペプチド変異体に特異的な抗体も含む。
本発明は、新規な生物学的に活性なヒトBCAAポリペプチド変異体の同定及びキャラクタリゼーションに起因する。これらのポリペプチドは典型的に、機能的膜貫通ドメインを欠いた成熟ヒトBCMAのポリペプチドを含んで成る。更に、この中には本発明のBCMAポリペプチド変異体の成体活性を保持する特徴的なフラグメントも含まれる。本発明は、天然又は合成のBCMAポリペプチド変異体であってもよく、そして有益な治療分子でありうる。更に、機能的な膜貫通ドメインの不在により、本発明のBCMAポリペプチド変異体は細胞膜内に固着されておらず、そして体液、特に血液、血漿、血清、リンパ液等において循環することがある。かかる可溶性BCMAポリペプチド変異体は、BCMAの天然の内因性リガンド(例えば、BAFF又はAPRIL)に結合しうるデコイの役割を果たし、それによりBCMAが媒介する活性が低下する。本発明の可溶性BCMAポリペプチド変異体は、BCMAの天然のアゴニストの役割を果たし、そして、それ自体で、又は、例えば融合タンパク質、コンジュゲート又は受容体複合体の形態で、B細胞の機能に関連する障害、特に免疫関連障害又は癌を処置するために使用されうる。
−APRILについてBCMAと競合する能力
−正常マウス内で循環しているB細胞の数を減少する能力
−無胸腺マウスの腫瘍容積を減少させる能力
が含まれうる。
1.SMART cDNA合成(プールの産生)
A)第一鎖cDNA合成
キット番号634914 Clontech
1 プレパレーションを混合する:
−0.5μlのRNA試料
−1μlの3’SMART CDSプライマーII A(10μM)
−1μlのSMART II A オリゴヌクレオチド(10μm)
−2.5μlの脱イオン水
2 内容物を混合し、そしてチューブを手短に微量遠心機でスピンさせる。
3 72℃で2分間インキュベートする。
4 チューブを氷上で2分間インキュベートする。
5 次のものを各反応チューブに添加する:
−2μlの5×First−Strandバッファー
−1μlのDTT(20mM)
−1μlの50×dNTP(10mM)
−1μlのPowerScript逆転写酵素
6 チューブを42℃で1時間インキュベートする。
7 190μlのTE1×(pH7.5)を添加する。
8 72℃で7分間インキュベートする。
9 −20℃で保存する。
1 最初のPCR用の組成物(1反応)を混合する
−24.4μlのH2O
−1μlの逆転写酵素Th(rTTH、参照番号808.0188 Perkin)
−15μlのバッファーrTTH3,3×(Perkin)
−0.4μlのdNTP(25mM;参照番号10297−018 Invitrogene)
−1μlのミックスオリゴPCR1(10μM)
−6μlのSMART cDNA(0.4ng/μl)
−2.2μlのMg(OAc)2
−38.8μlのH2O
−5μlのバッファーTaq+(10×)
−0.4μlのdNTP(25mM;参照番号10297−018 Invitrogene)
−0.3μlのTaq+プレシジョン(600 211 Sire)
−1μlのミックスオリゴPCR2(10μM)
−s2μlの最初のPCR産物
2.5μlのDMSO(100%)
BCMA_ショートの組織分布は、RT−PCRを用いて、Clontech(ヒトポリA RNA膵臓、cod.636119;ヒトポリA RNA骨格筋、cod.636120;ヒトポリA RNA小腸、cod.636125;ヒトポリA RNA精巣、cod.636115;ヒトポリA RNA肝臓、cod.636101;ヒトポリA RNA脳、cod.636102)又はInvitrogen(ヒト全RNA、正常脂肪、lot A5040004)のいずれかから購入したヒト組織から生成した一連のRNAライブラリーにおいて上文の「SMART cDNA合成」に記載のように決定した。
本発明のポリペプチドの生体活性は、当業界で本質的に知られている複数の生物学的アッセイを用いて確認することができる。ポリペプチドは、直接(sc、ip、iv)動物に注射することもできるし、あるいは、例えばFAST TRACKテクノロジー(EP04405494.8)を用いて送達することもできる。
本発明のBCMA突然変異体は、BCMAのリガンド結合ドメインを保持している。リガンドAPRILについてBCMAと競合するBCMA突然変異体の能力は、BIACORE3000(Uppsala, Sweden)を用いる以下のアッセイによって試験することができる。
BCMAは、そのリガンドBlys及びAPRILの作用を通じて、B細胞の発生及び増殖と関連している。BCMA突然変異体がBCMAリガンドの活性を拮抗し、そして正常なマウスにおいて循環しているB細胞の数の低下をもたらす能力は、当業界で知られており、そしてUS20030082175に記載されている、B細胞増殖アッセイによって決定することができる。
BCMA活性のアンタゴニストは、多数の腫瘍細胞系を注射した無胸腺マウスの腫瘍容積を低下させる能力を有すると説明されている(US20030082175)。BCMA突然変異体は、US20030082175に記載されているように試験することができる。無胸腺マウスは、精製したBCMA突然変異タンパク質、生理食塩水、ネガティブコントロールタンパク質又はポジティブコントロールタンパク質のいずれかで注射される。腫瘍サイズは注射後の適切な時間に、例えば30〜45日後に測定される。本発明のBCMA突然変異体は、未処理の、又はネガティブコントロールタンパク質で処理したものと比較した場合に、有意に腫瘍容積を低下させる。
Claims (33)
- BCMAポリペプチドのリガンド結合ドメイン及びNF−κB活性化ドメインの配列を含んで成り、そして機能的膜貫通ドメインを欠いている単離したBCMAポリペプチド変異体、又はその特有フラグメント。
- 配列番号1のアミノ酸残基7−41、好ましくは配列番号1のアミノ酸残基1−43
を含んでなる、請求項1に記載の単離したBCMAポリペプチド変異体。 - 配列番号1のアミノ酸残基119−143、好ましくは配列番号1のアミノ酸残基94−184を含んでなる、請求項1又は2に記載の単離したBCMAポリペプチド。
- 配列番号1のアミノ酸残基55−77、好ましくは配列番号1のアミノ酸残基44−93を含んでなる、請求項1、2又は3に記載の単離したBCMAポリペプチド。
- 配列番号3又はその特有フラグメントを含んで成る、請求項1に記載の単離したBCMAポリペプチド変異体。
- アミノ酸配列NARSG(配列番号3の残基42−46)を含んで成る、請求項1に記載の単離したBCMAポリペプチド変異体。
- 可溶性である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の単離したBCMAポリペプチド変異体。
- BAFF及び/又はAPRILと結合する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の単離したBCMAポリペプチド変異体。
- 追加のアミノ酸ドメインと作用可能に連結した、請求項1〜8のいずれか1項に記載のBCMAポリペプチドを含んで成る融合タンパク質。
- 追加のアミノ酸ドメインがシグナルペプチド、タグ、ターゲティングペプチド、イムノグロブリンの定常領域、多量体化ドメイン又は生体活性タンパク質若しくはそのフラグメントを含んで成る、請求項9に記載の融合タンパク質。
- イムノグロブリンの定常領域と作用可能に連結した請求項1〜8のいずれか1項に記載のBCMAポリペプチドを含んで成る、請求項10に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のBCMAポリペプチド又は請求項9〜11のいずれか1項に記載の融合タンパク質を含んで成る受容体複合体。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のBCMAポリペプチド又は請求項9〜11のいずれか1項に記載の融合タンパク質を含んで成るコンジュゲート。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする単離した核酸分子。
- cDNA分子である、請求項14に記載の単離した核酸分子。
- 配列番号2、又はその相補鎖若しくは縮重配列、から選択されるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項14に記載の単離した核酸分子。
- 請求項14〜16のいずれか1項に記載の核酸分子を含んで成るベクター。
- 請求項14〜16のいずれか1項に記載の核酸分子又は請求項17に記載のベクターを含んで成る、組換え宿主細胞。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリペプチドを発現する、請求項18に記載の宿主細胞。
- 原核細胞又は真核細胞である、請求項18又は19に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリペプチドを産生する方法であって、請求項18〜20のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞を、核酸分子を発現させる条件下で培養し、そして産生したポリペプチドを回収すること、を含んで成る方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリペプチド変異体、請求項14〜16のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項17に記載のベクター又は請求項18、19又は20に記載の細胞、及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含んで成る医薬組成物。
- 請求項5に記載のポリペプチド及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含んで成る、請求項22に記載の医薬組成物。
- 対象者の免疫障害又は癌を処置するための医薬組成物の製造のための、請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリペプチド変異体、請求項14〜16のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項17に記載のベクター、請求項18〜20のいずれか1項に記載の細胞、の使用。
- 対象者の癌を処置するための請求項24に記載の使用。
- 対象者の自己免疫疾患を処置するための、請求項24に記載の使用。
- 対象者のB細胞成熟又は成長を阻害するための医薬組成物の製造のための、請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリペプチド変異体、請求項14〜16のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項17に記載のベクター、請求項18〜20のいずれか1項に記載の細胞、の使用。
- 対象者の炎症性疾患を処置するための医薬組成物の製造のための、請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリペプチド変異体、請求項14〜16のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項17に記載のベクター、請求項18〜20のいずれか1項に記載の細胞、の使用。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のBCMAポリペプチドと選択的に結合する、抗体、又はそのフラグメント若しくは誘導体。
- アミノ酸残基CNARSGL(配列番号3の残基41−47)を含んで成る又はこれに含まれるエピトープと選択的に結合する、請求項29に記載の抗体、フラグメント又は誘導体。
- モノクローナル抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体である、請求項29又は30に記載の抗体。
- 請求項14〜16のいずれか1項で定義した核酸又はその相補鎖と選択的にハイブリダイズする、核酸プローブ。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のBCMAポリペプチドをコードする核酸分子の特有フラグメントを少なくとも増幅するのに使用することができる核酸プライマー。
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