JP2008524221A - Epimedium属植物の抽出液を用いた方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
[0001] 本出願は、2004年12月17日付出願の米国仮出願番号60/637,188の利益を主張し、その全ての内容はここに参考文献として援用されている。
[0002] 本発明は、植物抽出物組成物、より具体的にはEpimedium属に属する植物種の抽出物を含む組成物に関する。本発明はさらに、前記植物抽出物組成物の使用方法および作製方法に関する。
[0003] ホルモン補充療法(hormone replacement therapy;HRT)は、骨粗鬆症、閉経後女性の心臓血管疾患のリスク増加、一過性熱感や***減退およびうつ状態などの更年期症状など、様々な症状の改善に用いられている。しかしながら、エストラジオール(E2)を単独で、またはプロゲスチンと組み合わせて用いるホルモン補充療法(HPT)は望ましくない効果を引き起こすことがある。実際、予備的な結果においてホルモン補充療法(HPT)が乳癌のリスクの35%増加に関連していることを示したとき、最近のウィミンズ・ヘルス・イニシアティブ(WHI)の研究は突然中止された。
[0007] 本発明は、Epimedium属の植物種の抽出液を含む植物抽出物組成物を提供する。
[0012] 本明細書で言及された全ての刊行物と特許出願は、あたかもそれぞれの刊行物または特許出願が参考文献として援用されるために具体的におよび個別に示されたと匹敵する程度に参考文献として本明細中に援用される。
[0016] 本発明は、分類学的にEpimedium属に相当するハーブ植物由来の抽出液を含む植物抽出物組成物を提供する。本発明はまた、本発明の組成物を用いたエストロゲン様の方法を提供する。このようなエストロゲン様の方法はin vivoでの方法およびin vitroでの方法を含む。適したin vivoでの方法には、エストロゲン補充療法に応答性の医学的適応症の治療および/または予防が含まれる。適したin vitroでの方法には、エストロゲン応答要素(ERE)の制御下で遺伝子を活性化する方法と、腫瘍壊死因子応答要素(TNF-RE)の制御下で遺伝子の発現を抑制する方法における使用が含まれる。本発明はさらに、本発明の抽出物の作成方法を提供する。
(a)ホルモン補充療法(HRT)は、51の研究のメタ・アナリシス(meta-analysis)から、乳癌のリスクの35%増加と関連する;
(b)乳癌は、ERに結合し***細胞においてエストロゲンの作用をアンタゴナイズするタモキシフェンまたはラロキシフェンによって予防出来る;
(c)乳癌を有する閉経前女性の両側の卵巣摘出は、生存率を増加させる;
(d)エストロゲンへの曝露が多いほど、(早発月経または遅い閉経期での相対的リスクはそれぞれ1.3および1.5から2.0)乳癌の発生率を増加させる;
(e)エストロゲンは、ER陽性の乳癌細胞の増殖を増大する;そして
(f)エストロゲンは、サイクリンD1、c-myc、c-fosのような、増殖促進遺伝子の産生を増加する。
[0035] Epimedium属の植物種は、Epimedium brevicornum Maxim、Epimedium sagittatum (Sieb. Et Zucc) Maxim、Epimedium pubecens Maxim、Epimedium wushanensis T. S. Yang、およびEpimedium koreanum Nakaiである。いくつかの具体的な態様では、植物種はEpimedium grandiflorum Morrである。
[0042] 本発明による植物抽出物は、エストロゲン応答要素(ERE)の調節下で遺伝子のエストロゲンの活性化を提供する。したがって、いくつかの細胞では、本発明の植物抽出物はエストロゲン様特性を持つ:EREおよびER(ERα、ERβ、またはその両方)を含む細胞と本発明の植物抽出物との接触が、EREの調節下で遺伝子の刺激を生じさせた。in vitroの細胞系において、本発明のエストロゲン様植物抽出物によるEREにより媒介された活性化は、EREに機能可能に連結した遺伝子発現の増幅を引き起こす。具体的な態様では、最小チミジンキナーゼプロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子を連結したEREとのERのエストロゲン的な相互作用は、ルシフェラーゼ発現の増加が生じる。したがって、本発明の植物抽出物は、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子と機能的に連結したEREを含むプロモーターを有するERα+細胞株、ERβ+細胞株、および/またはERα+/ERβ+細胞株の同定に使用することが出来る。本発明の植物抽出物はまた、ER+細胞株中のエストロゲン様効果を有する化合物の同定に、標準品としても含む、アッセイ試薬として使用することも出来る。
実施例1
[0074] ERE-tk-Lucの活性化に、ERβはERαよりも弱い:E2の転写活性化に対する作用は、ルシフェラーゼレポーターcDNAを連結した最小チミジンキナーゼ(tk)プロモーター、およびERαまたはERβの発現ベクターをトランスフェクトすることによって調査された。E2は、ヒト単球U937細胞において、ERα存在下ではERβ存在下に比べてEREの活性化を10倍高くしたが、EC50値は同程度であった。
[0075] TNF-RE-tk-Lucの抑制にERβはERαよりも効果的である:E2のERαおよびERβ媒介性転写抑制に対する効果は、TNF-RE(tumor necrosis factor-response element: TNF-RE)を用いて比較された。TNF-αは、tkプロモーターの上流にTNF-REを有するもの(TNF-RE-tk-Luc)の3コピーを5-10倍活性化した。E2は、ERαおよびERβの存在下で、TNF-RE-tk-LucのTNF-α活性を60-80%抑制した。しかしながら、ERβはERαに比べて、抑制におよそ20倍効果的であった(それぞれの50%IC50は、ERαで241 pMであったのに対して、ERβで15 pM)。未変性のTNF-αプロモーターの抑制に、ERβはERαに比べてより効果的であることが見いだされた。したがって、ERβはERαよりも転写抑制に効果的である一方、ERαはERβよりも転写活性に非常に効果的である。E2と対照的に、抗エストロゲン剤であるタモキシフェン、ラロキシフェンおよびICI 182780は、TNF-RE-tk-Lucを2倍活性化した。さらに、これらの抗エストロゲン剤はE2によって誘発された抑制を無効にした。
[0076] ERβは、ERE-tk-LucのERα媒介性転写活性化を阻害する:驚くべきことに、ERαまたはERβがU937細胞において共発現された場合、ERαにより活性化が著しく阻害された(図1)。これらのデータは、ERβがERαによるERE-tk-Lucの活性化に対して抑制的効果を有することを示す。同様の結果が乳癌細胞株、MDA-MB-435で観察された(図2)。他の研究者は異なる細胞型で、ERβのERαのトランス活性化に対する同様の抑制効果を見いだしている。これらの研究は、ERαおよびERβのERE-tk-Lucに対する異なる活性化、およびERα媒介性転写に対するERβの抑制効果が細胞型特異的ではないこと、ならびにERの内因的性質による結果であることを示唆する。二量体形成を防ぐERβのヘリックス11の変異がその抑制活性を阻害するため、ERβによるERαの抑制は、ERα/ERβヘテロ二量体の形成を必要とする(データ非掲載)。
[0077] 材料および方法:試薬。フェノールレッドフリーのDulbecco改変Eagle's/F-12クーン修飾培地はSigma社から入手した。Biobreneはアプライドバイオシステムズ社から購入した。U937細胞株はAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手した。ヒト組換えTNF-αはR & D Systems社から入手した。
Claims (52)
- 分類学的にEpimedium属の植物から選択される植物種の抽出物を含む、植物抽出物組成物。
- 抽出物が、水溶性抽出物またはエタノール抽出物である、請求項1に記載の組成物。
- 抽出物が、エタノール抽出物である、請求項1に記載の組成物。
- 植物種が、Epimedium grandiflorum Morr.、Epimedium brevicornum Maxim、Epimedium sagittatum (Sieb. Et Zucc) Maxim、Epimedium pubecens Maxim、Epimedium wushanensis T.S. Yang、およびEpimedium koreanum Nakaiからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 植物種が、Epimedium grandiflorum Morr.である、請求項1に記載の組成物。
- 被検体に対して、エストロゲン様作用の発現を促すために(estrogenically)有効な量の請求項1に記載の組成物を投与することを含む、エストロゲン様作用を誘導する方法。
- 抽出物が、水溶性抽出物またはエタノール抽出物のいずれかである、請求項6に記載の方法。
- 抽出物が、エタノール抽出物である、請求項6に記載の方法。
- 植物種が、Epimedium grandiflorum Morr.、Epimedium brevicornum Maxim、Epimedium sagittatum (Sieb. Et Zucc) Maxim、Epimedium pubecens Maxim、Epimedium wushanensis T.S. Yang、およびEpimedium koreanum Nakaiからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 植物種が、Epimedium grandiflorum Morr.である、請求項6に記載の方法。
- エストロゲン様作用が:少なくとも1つの更年期症状を治療または予防すること;骨粗鬆症を治療または予防すること;子宮癌を治療または予防すること;そして心臓血管疾患を治療または予防すること;からなる群から選択される少なくとも1つの作用である、請求項6に記載の方法。
- エストロゲン様作用が、一過性熱感、不眠症、膣の乾燥、***減退、尿失禁、およびうつを治療または予防することからなる群から選択される少なくとも1つの更年期症状を治療または予防することを含む、請求項11に記載の方法。
- エストロゲン様作用が、骨粗鬆症を治療または予防することを含む、請求項11に記載の方法。
- エストロゲン様作用が、一過性熱感を治療または予防することを含む、請求項11に記載の方法。
- エストロゲン様作用が、子宮癌を治療または予防することを含む、請求項11に記載の方法。
- ある遺伝子に対して機能可能に連結されたエストロゲン応答要素およびエストロゲン受容体を有する細胞に対して、その遺伝子を活性化するために十分な量の請求項1に記載の組成物を投与することを含む、エストロゲン応答要素の調節下、ある遺伝子を活性化する方法。
- 細胞がin vitroのものである、請求項16に記載の方法。
- 細胞がin vivoのものである、請求項16に記載の方法。
- 細胞が、ERα+***組織中のものである、請求項16に記載の方法。
- 細胞が、ERβ+***組織中のものである、請求項16に記載の方法。
- 細胞が、ERα+/ERβ+***組織中のものである、請求項16に記載の方法。
- エストロゲン応答要素が、形質転換細胞中で発現される、請求項16に記載の方法。
- エストロゲン応答要素およびエストロゲン受容体の両方ともが、形質転換細胞中で発現される、請求項22に記載の方法。
- エストロゲン応答要素が、細胞中で異種的に発現される、請求項16に記載の方法。
- エストロゲン応答要素およびエストロゲン受容体の両方ともが、細胞中で異種的に発現される、請求項24に記載の方法。
- 細胞が、EREにより調節される遺伝子により形質転換されたU937、U2OS、MDA-MB-435、およびMCF-7細胞からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 細胞が、ERαを発現する、請求項26に記載の方法。
- 細胞がERβを発現する、請求項26に記載の方法。
- EREにより調節される遺伝子が、ERE-tk-Lucである、請求項26に記載の方法。
- TNF応答要素の調節下におけるある遺伝子およびエストロゲン受容体を含む細胞に対して、TNF-REにより調節される遺伝子を抑制するために有効な量の請求項1に記載の組成物を投与することを含む、TNF-REにより調節される遺伝子の発現を抑制する方法。
- TNF-REにより調節される遺伝子が、TNF-αである、請求項30に記載の方法。
- TNF-REにより調節される遺伝子が、TNF-RE-Lucである、請求項30に記載の方法。
- 細胞が、in vitroのものである、請求項30に記載の方法。
- 細胞が、in vivoのものである、請求項30に記載の方法。
- 細胞が、ER+***組織中のものである、請求項30に記載の方法。
- 細胞が、ERα+***組織中のものである、請求項30に記載の方法。
- 細胞が、ERβ+***組織中のものである、請求項30に記載の方法。
- TNF応答要素が、細胞中で内在性に発現される、請求項30に記載の方法。
- TNF応答要素とエストロゲン受容体が両方とも、細胞中で内在性に発現される、請求項38に記載の方法。
- TNF応答要素が、細胞中で異種的に発現される、請求項30に記載の方法。
- TNF応答要素およびエストロゲン受容体の両方ともが、細胞中で異種的に発現される、請求項40に記載の方法。
- 細胞が、エストロゲン受容体遺伝子を含有し、TNF応答要素により調節される遺伝子により形質転換されており、U937、U2OS、MDA-MB-435、およびMCF-7細胞からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
- エストロゲン受容体遺伝子が、ERαを発現する遺伝子である、請求項42に記載の方法。
- エストロゲン受容体遺伝子が、ERβを発現する遺伝子である、請求項42に記載の方法。
- Epimedium属の植物からある量の植物材料(plant matter)を得ること、そしてその植物材料(plant matter)を水を含む抽出媒体と約25℃〜100℃の間の温度で接触させること、そして抽出媒体をその植物材料から分離すること、を含む、請求項1に記載の植物抽出物を作製する方法。
- 温度が、約50℃〜80℃のあいだである、請求項45に記載の方法。
- 温度が、約75℃である、請求項45に記載の方法。
- Epimedium属の植物からある量の植物材料(plant matter)を得ること、そしてその植物材料(plant matter)をエタノールを含む抽出媒体と約25℃〜約78℃の間の温度で接触させること;そして抽出媒体をその植物材料(plant matter)から分離すること、を含む、請求項1に記載の植物抽出物を作製する方法。
- 温度が、約50℃〜78℃のあいだである、請求項47に記載の方法。
- 温度が、約75℃である、請求項47に記載の方法。
- 治療的有効量の請求項1に記載の組成物を含む、医薬組成物。
- 医薬的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項51に記載の医薬組成物。
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