JP2008517065A - Ｂｒｃａ２−ｒａｄ５１相互作用の破壊のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

企図された化合物は、ＲＡＤ５１と結合することによりＢＲＣＡ２とＲＡＤ５１との間の相互作用を破壊する。ＤＮＡ修復におけるＢＲＣＡ２−ＲＡＤ５１複合体形成の重大な役割、及びＧ１からＳ期への移行の調節におけるＲＡＤ５１の役割に基づき、多数の組成物及び方法が提示される。数ある有利な使用の中でも、企図された化合物は、化学療法薬への細胞の曝露の前の化学療法における非腫瘍性細胞の保護剤として、及び／又は腫瘍性細胞のＤＮＡ傷害感作剤として、利用され得る。

Description

（発明の分野）
本発明の分野は、特に、ＲＡＤ５１及びＢＲＣＡ２に関係するような、哺乳動物におけるＤＮＡ修復に関する組成物及び方法である。

（発明の背景）
ＤＮＡ二本鎖切断は、放射線照射及び／又は架橋薬（例えば、シスプラチン、マイトマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン等）への曝露に起因する主要な致死的傷害であると考えられている。典型的には、二本鎖切断は、細胞周期進行の停止及び細胞ＤＮＡ修復機構の活性化をもたらし、ＤＮＡ修復の失敗は、一般に、ゲノムの異常をもたらし、及び最終的には細胞死をもたらす。

数あるメカニズムの中でも、相同的組み換えは、ＤＮＡ傷害、特に二重鎖切断の修復に大きく寄与する。いくつかの遺伝子が、相同的組み換えに関与しており、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５４、ＸＲＣＣ２、及びＸＲＣＣ３を含む。これらの遺伝子が変異している場合、細胞は、高レベルのゲノム不安定性、並びに放射線照射及び／又は架橋剤に対する過敏を高頻度に示すであろう。他方、多くの癌細胞、特にゲノム的に不安定なものにおいては、上昇した相同的組み換え率が観察されている。これらの癌細胞においては、野生型ＲＡＤ５１の上昇した発現レベルが観察されており、このことは、（ゲノム安定性の維持にも関与している）ＲＡＤ５１が、ＤＮＡ傷害性の放射線療法又は化学療法に対する癌細胞の抵抗性の原因ともなっていることを示唆しているようである。

ＲＡＤ５１は、真核生物リコンビナーゼであり、大腸菌ＲｅｃＡタンパク質に相同である。ＲＡＤ５１は、ＡＴＰ依存性ＤＮＡ結合活性を有し、多量体化して一本鎖ＤＮＡ上で核タンパク質フィラメントを形成し、インビトロで相同的ＤＮＡ対合及び鎖交換反応を触媒することが報告されている。放射線照射及び／又はＤＮＡ傷害剤により細胞を治療した後、ＤＮＡ傷害の部位には、劇的な量のＲＡＤ５１フォーカスが観察され得、これには、相同的組み換えに関連している他のタンパク質（例えば、ＢＲＣＡ１、Ｒａｄ５４、ＢＬＭ、及びＲＰＡ）、特にＢＲＣＡ２がさらに含まれ得る。

ＢＲＣＡ２は、家族性乳癌の様々な研究に基づき、***腫瘍抑制因子として同定されており、ＢＲＣＡ２の欠損は、染色体切断、異常な有系***交換、及び異数性を含む累積的な染色体異常をしばしば特徴とする。さらに最近、ＢＲＣＡ２は、相同性により指図される染色体切断の修復のためにも必要とされることが証明された。ＤＮＡ修復への関与と一致して、ＢＲＣＡ２を欠くマウス胚は、ＲＡＤ５１を欠くマウス胚の特徴でもある放射線過敏を示す。

ＤＮＡ修復におけるＢＲＣＡ２の可能性のある役割は、まず、ＲＡＤ５１との相互作用の同定により明らかにされた。６つの高度に保存されたＢＲＣリピートがＲＡＤ５１とＢＲＣＡ２との相互作用に関与しており、ＢＲＣＡ２及びＲＡＤ５１のＢＲＣリピート間の相互作用が、メタンスルホン酸メチルにより引き起こされるＤＮＡ傷害に対する細胞の応答にとって重要であることが示されている。数ある証拠の中でも、このような重要性は、ＢＲＣＡ２欠損細胞、及びＢＲＣＡ２とＲＡＤ５１との間の相互作用がＢＲＣペプチドを使用して破壊された細胞においては、放射線により誘導されるＲＡＤ５１フォーカス形成が減弱するとの所見に反映されている。また、インビトロで、過剰のＢＲＣペプチドの存在下では、ＲＡＤ５１−ＤＮＡ結合能力が特に消失し、さらにＲＡＤ５１核タンパク質フィラメント形成が破壊される。

このように、多数のデータが、ＤＮＡ修復におけるＢＲＣＡ２／ＲＡＤ５１相互作用の意義を強調しているようであるが、ＢＲＣＡ２関連癌の治療モダリティとして、このような相互作用に選択的に干渉する有効な戦略は、達成されていない。従って、特に、腫瘍性疾患の治療及び化学予防に関して、ＤＮＡ修復におけるＢＲＣＡ２／ＲＡＤ５１相互作用に干渉する組成物及び方法が、依然として必要とされている。

（発明の概要）
本発明は、化合物が、ＢＲＣＡ２／ＲＡＤ５１相互作用及び／又はＲＡＤ５１多量体化に干渉し、最も典型的にはこれらを破壊又は防止する組成物及び方法に関する。典型的には、このような干渉により、腫瘍性細胞のＤＮＡ傷害に対する感受性が増加し、非腫瘍性細胞はＧ１期からＳ期へと進行し得なくなるであろう。

本発明の主題の１つの態様において、医薬的組成物は、医薬的に許容される担体及び式１：

［式中、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルカリル、及び

からなる群より選択される基であり；
Ｙは、存在しないか、又は１から４個の炭素原子を有するアルキレン基であり（及び式１のＲがアルキレンと共有結合的に結合しているか、又はＹが存在しない場合、Ｚを含む環の任意の原子）；Ｑは、Ｎ又はＣ−Ｒ_２であり；Ｚは、−Ｃ（Ｒ_１２）＝Ｃ（Ｒ_１３）−、−ＣＨ−Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ_１４（ここで、Ｒ_１４は、Ｈ、アルキル、アリール、アラルキル、又はアシルである）］より選択され；Ｘは、ＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ_１４（ここで、Ｒ_１４は独立して前記定義の通りである）より選択され；Ｒ’及びＲ_１−Ｒ_１３は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ハロ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキシアルキル、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、Ｎ−アルキル、Ｎ−シクロアルキル、アミノ、チオ、アルキルチオ、及びハロアルキルからなる群より選択され；但し、Ｒ_１２及びＲ_１３は、場合により、化合して炭素環式又は複素環式の環を形成していてもよく；及びｎは０から４（両端を含む）であり、及び＊はＲ又はＳ配置を示す］による化合物を含む。より好ましくは、Ｒ_１−Ｒ_１1はＨであり、ＸはＮＲ_１４であり、及びＲは

である。

このような化合物において、Ｚが−Ｃ（Ｒ_１２）＝Ｃ（Ｒ_１３）−であり、及びＹが存在しないことが特に好ましい。従って、特に好ましい化合物には、式２及び式３：

によるものが含まれる。

このような組成物においては、化合物が、（ａ）細胞が化合物に曝された場合に、放射線及び／又はＤＮＡ傷害剤に対する腫瘍性細胞の感受性を増加させるのに有効な濃度、又は（ｂ）ＢＲＣＡ２−ＲＡＤ５１複合体が化合物に曝された場合に、ＢＲＣＡ２のＲＡＤ５１との結合を減少させるのに有効な濃度で存在することがさらに企図される。望まれる場合、企図された組成物は、さらに１つ以上のＤＮＡ傷害剤を含み得る。又は、化合物は、細胞が化合物と接触した場合に、細胞（最も典型的には、非腫瘍性細胞）をＧ１期に停止するのに有効な濃度で組成物中に存在することも企図される。このような場合、化合物は、植込装置に近位の複数の細胞の細胞増殖を減少させるのに有効な濃度で、植込装置（例えば、血管内ステント）にカップリングされる。

従って、本発明の主題のもう一つの態様において、腫瘍性細胞が化合物に曝された場合に、放射線及び／又はＤＮＡ傷害剤に対する腫瘍性細胞の感受性を増加させるのに有効な濃度（例えば、１μＭから１００μＭ）の企図された化合物と、腫瘍性細胞が接触させられる、腫瘍性細胞を治療する方法が企図される。次いで、このような方法のさらなる工程において、腫瘍性細胞は、放射線照射（例えば、ガンマ線照射又はＵＶ−Ｃ線照射）及び／又はＤＮＡ傷害剤（例えば、アルキル化剤又は架橋剤）に曝され得る。典型的には、好ましい腫瘍性細胞には、乳癌細胞及び卵巣癌細胞が含まれる。

本発明の主題のさらなる態様において、非腫瘍性細胞をＧ期に停止する方法は、細胞が、企図された化合物、このプロドラッグ又は代謝産物と接触させられ、及びこのような化合物が、非腫瘍性細胞をＧ期に停止するのに有効な濃度で存在する工程を含むであろう。最も好ましくは、このような方法は、接触工程の後に非腫瘍性細胞をＤＮＡ傷害条件に曝す工程をさらに含むであろう（この場合、接触工程は、接触工程がない場合に入手されるであろうＤＮＡ傷害と比較して細胞のＤＮＡ傷害を減少させる条件の下で実施される）。上記のように、適切なＤＮＡ傷害条件は、特に、放射線照射（例えば、ガンマ線照射又はＵＶ−Ｃ）並びに／又はＤＮＡ傷害剤（例えば、シスプラチン、マイトマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、シクロホスファミド、クロラムブシル、及びブレオマイシン）への曝露である。望ましい場合には、細胞を接触させる工程は、化合物がカップリングされている植込装置と細胞が接触するよう実施されてもよい。

本発明の様々な目的、特質、態様、及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明から、より明白になるであろう。

ＤＮＡ傷害剤及び放射線は、後期転移性癌のための最も広範に使用されている療法の一つであり、典型的には、腫瘍性細胞の少なくとも一部の根絶において有効である。残念ながら、腫瘍性細胞も、このようにして誘導されたＤＮＡ傷害を修復するために様々なメカニズムを使用する。数ある修復メカニズムの中でも、ＢＲＣＡ２により媒介される修復は、ＤＮＡ傷害剤及び放射線に対する癌の抵抗性に密接に関与していることが本発明者らにより示された。

ＢＲＣＡ２は、このＢＲＣリピートを通してＲＡＤ５１に結合し、この相互作用はＤＮＡ修復にとって重要であるようである。本発明者らは、ここで、ＢＲＣリピートとＲＡＤ５１との間の相互作用を破壊し、これにより最も不可欠なエラーフリーのＤＮＡ修復機構のうちの１つの効果を減少させるか、又は排除すら行い、従って、放射線又はＤＮＡ傷害化学療法に対して癌細胞をより感受性にする低分子が調製され得ることを企図する。

ＢＲＣリピートがＲＡＤ５１多量体化モチーフを模倣するＢＲＣ４−ＲＡＤ５１複合体の結晶構造が最近解明された。従って、ＢＲＣＡ２が、ＲＡＤ５１により媒介される相同的組み換えを調節する役割を果たすことが最近示唆された。ＢＲＣＡ２は、３つのオリゴヌクレオチド結合（ＯＢ）フォールド及び１つのヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフを含有していることも既知であった。これらの観察及び他の要因に基づき、本発明者らは、ＤＮＡ傷害が起こる場合には、ＢＲＣＡ２がｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡ結合部を認識し、次いで、結合したＢＲＣＡ２のＢＲＣリピートがＲＡＤ５１を傷害部位に運び、次いで、これがｓｓＤＮＡ上で核タンパク質フィラメントを形成し、ＲＡＤ５１フォーカスの形成をもたらし、このようにして、続く相同的組み換え過程を可能にすることを、企図した。従って、ＢＲＣＡ２−ＲＡＤ５１複合体形成に干渉する（即ち、減少させる）か、又はブロックすら行い、これにより、放射線及び他のＤＮＡ傷害剤の効果に対してＢＲＣＡ２完全（非変異）乳癌細胞を感作する分子を開発することが、望ましいであろうと本発明者らは企図する。

本発明者らは、ここで、ＢＲＣＡ２−ＲＡＤ５１を、特定の分子及びこれらの分子を含む組成物に曝すことにより、ＢＲＣＡ２−ＲＡＤ５１複合体及び／又は複合体形成が、破壊され得るか、又は完全に阻害すらされ得ることを発見した。さらに、このような分子は、ＲＡＤ５１多量体化に干渉する能力も示した。

従って、ＢＲＣＡ２−ＲＡＤ５１複合体形成及び／又はＲＡＤ５１多量体化に関連した全ての過程及び疾患が、このような分子の投与によって修飾され得ることが一般に企図される。数ある企図される過程及び疾患の中でも、本発明の主題による化合物及び組成物は、（ａ）化学療法薬の効果に対して腫瘍性細胞を感作し、（ｂ）細胞***を破壊することにより腫瘍性細胞の増殖に干渉し、（ｃ）細胞をＧ１期に停止することにより化学療法薬の効果から非腫瘍性細胞を保護し、及び（ｄ）通常であれば細胞増殖を刺激するであろう環境における細胞（典型的には、非腫瘍性細胞）の増殖を減少させるために使用され得ることが特に企図される。

企図される化合物及び組成物
ＢＲＣＡ２−ＲＡＤ５１複合体の形成又は存在を防止するか、減少させるか、又は他の妨害をする全ての分子が、適切であることが、一般に企図される。従って、多数の分子の中でも、ペプチド（例えば、ＢＲＣリピート及びこれらのアナログ、抗体又は他の高特異性／親和性結合ペプチド等）、並びに（例えば、市販されているような化合物のライブラリーに由来する）低分子薬物、並びにプロドラッグ及び代謝産物を含むこれらの誘導体が企図される。しかしながら、特に企図される分子には、下記式１

［式中、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルカリル（各々、Ｒ_１で置換されていてもよく、さらにＮ、Ｓ、Ｏ、Ｓｅ、又はＯのようなヘテロ原子を含んでいてもよい）、及び

［式中、Ｙは、存在しないか、又は１から４個の炭素原子を有するアルキレン基（及び式１のＲがアルキレンと共有結合的に結合しているか、又はＹが存在しない場合、Ｚを含む環の任意の原子）；Ｑは、Ｎ又はＣ−Ｒ_２であり；Ｚは、−Ｃ（Ｒ_１２）＝Ｃ（Ｒ_１３）−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ_１４（ここで、Ｒ_１４は、Ｈ、又は場合により置換されているアルキル、アリール、アラルキル、又はアシルである）］より選択され；Ｘは、ＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ_１４（ここで、Ｒ_１４は独立して前記定義の通りである）より選択され；Ｒ’及びＲ_１−Ｒ_１３は、独立して、場合により置換されていてもよく、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ハロ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキシアルキル、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、Ｎ−アルキル、Ｎ−シクロアルキル、アミノ、チオ、アルキルチオ、及びハロアルキルからなる群より選択され；但し、Ｒ_１２及びＲ_１３は、場合により、化合して炭素環式又は複素環式の環を形成していてもよく；ｎは０から４（両端を含む）である］によるものが含まれる。当然、全ての異性体（例えば、ジアステレオマー、鏡像異性体、互変異性体等）及びこれらの混合物が企図されることが認識されるべきである。例えば、企図された分子がキラル中心（例えば、式１中のＣ^＊）を有する場合には、Ｒ配置及びＳ配置の両方、並びにこれらの混合物が、本明細書において明示的に企図される。式１中の芳香環系（イソキノリン、インドール、及びベンゼン環）は、各々、一つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよく、又はさらにもう一つの（場合により芳香族の）環系と縮合していてもよいことも、認識されるべきである。

さらに好ましい化合物は、Ｒ_１−Ｒ_１１がＨであり、ＸがＮＲ_１４であり、及びＲが

である式１による構造を有し、Ｚが−Ｃ（Ｒ_１２）＝Ｃ（Ｒ_１３）−であり、及びＹが存在しない直前の化合物が最も好ましい。従って、特に企図される化合物には、様々な置換型及び非置換型のフェニルスルホニルインドリルイソキノリン、特に下記式２及び３

による構造を有するものが含まれる。

本明細書において使用されるように、「ハロゲン」という用語は、フッ素、臭素、塩素又はヨウ素をさし、これは、典型的には、もう一つの原子（例えば、炭素）と共有結合的に結合している。さらに本明細書において使用されるように、「ヒドロキシル」という用語は−ＯＨ基をさす。さらに本明細書において使用されるように、「カルボニル原子」という用語は、３個の原子が共有結合的に結合しており、３個の原子のうちの１個が（部分的に非局在化され得る）二重結合を介して炭素原子に結合している炭素原子をさす。従って、特に企図されるカルボニル原子には、カルボキサミド基、カルボキサミジン基、及びチオカルボキサミド基の中の炭素原子が含まれる。

本明細書において使用されるような「アルキル」という用語は、炭素−炭素結合のすべてが単結合である環式、分岐型、又は直鎖型の炭化水素をさし、「低級アルキル」という用語は、炭素原子１から１０個の環式、分岐型、又は直鎖型のアルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル（又は２−メチルプロピル）、シクロプロピルメチル、ｉ−アミル、ｎ−アミル、ヘキシル等）をさす。本明細書において使用されるような「アルキレン」という用語は、対応するアルカンより２個少ない水素原子を有するアルキルをさす（すなわち、Ｃ_ｎＨ_２ｎ）。例えば、適切なアルキレンには、メチレン基、エチレン基、プロピレン基等が含まれる。本明細書において使用されるような「シクロアルキル」という用語は、３から１５個の炭素を含有している環式又は多環式のアルキル基をさす。多環式の基について、これらは、末端環のうちの１つが芳香族であってもよい複数の縮合した環（例えば、インダニル及びテトラヒドロナフタレン等）であってもよい。本明細書において使用されるような「アルカリール」という用語は、アリール部分に共有結合的にカップリングされたアルキルをさす。例えば、ベンジル基は、本明細書に提供された定義の下でアルカリールと見なされる。

同様に、本明細書において使用されるような「アルケニル」という用語は、少なくとも一つの炭素−炭素結合が二重結合であるアルキルをさす。従って、「低級アルケニル」という用語には、１から１０個の炭素原子を有する全てのアルケニルが含まれる。本明細書において使用されるような「シクロアルケニル」という用語は、３から１５個の炭素及び少なくとも１個の二重結合を含有している環式又は多環式の基をさす。同様に、本明細書において使用されるような「アルキニル」という用語は、少なくとも一つの炭素−炭素結合が三重結合であるアルキル又はアルケニルをさす。従って、「低級アルキニル」という用語には、１から１０個の炭素原子を有する全てのアルキニルが含まれる。

さらに本明細書において使用されるように、「アルコキシ」という用語は、−ＯＲ基（式中、Ｒは、低級アルキル、置換された低級アルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロへテロアルキル、又は置換されたシクロへテロアルキルである）をさす。同様に、「アリールオキシ」という用語は、−ＯＡｒ基（式中、Ａｒは、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、又は置換されたヘテロアリール基である）をさす。

さらに、「アリール」という用語は、少なくとも一つの芳香環を有する芳香族炭素環式基（例えば、フェニル又はビフェニル）又は少なくとも一つの環が芳香族である複数の縮合した環（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、ナフチル、アントリル、又はフェナントリル）をさす。本明細書において使用されるような「ヘテロ原子」という用語は、例えば、水素、ハロゲン、低級アルキル、アルコキシ、低級アルキルチオ、トリフルオロメチル、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ニトロ、シアノ、アルキルチオ、チオール、スルファミド等により場合により置換されていてもよい、炭素以外の原子（例えば、Ｓ、Ｏ、又はＮ）をさす。

さらに、本明細書において使用されるような「置換された」という用語は、基又は原子（又は原子の二重結合の自由電子対又は電子対）と共有結合的に結合している水素原子が、ヒドロキシル、チオール、アルキルチオール、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アミド、ニトロ、カルボキシル、シクロアルキル、複素環、シクロへテロアルキル、アシル、カルボキシル、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｎｙｌ）、及びシアノを含む共有結合的に結合した非水素置換基に交換されていることを意味する。

本明細書において使用されるような「プロドラッグ」という用語は、修飾された化合物が、（修飾された化合物と比較して）より低い薬理学的活性を示し、修飾された化合物が、標的細胞（例えば、腫瘍性細胞）又は標的器官（例えば、卵巣）において修飾型へと戻し変換される、企図された化合物の修飾をさす。例えば、企図された化合物のプロドラッグへの変換は、活性薬物が、あまりにも毒性なため安全に全身投与され得ない場合、又は企図された化合物が、消化管又は他のコンパートメント又は細胞により不十分に吸収される場合、又は標的に到達する前に、企図された化合物を身体が分解する場合、有用である。従って、本発明の主題による化合物は、多数の様式で修飾され得、特に好ましい修飾には、１つ以上の薬物動態学的及び／又は薬力学的パラメーターを改良するものが含まれることが認識されるべきである。例えば、１つ以上の置換基が、血清中のより高いＡＵＣを達成するために追加又は交換され得る。他方、特に、増加した溶解度が望まれる場合には、親水基が追加され得る。企図された化合物の対応するプロドラッグ型への変換のために適している例示的なプロトコルは、”Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ）”ｂｙ Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｂ．Ｓｌｏａｎ（ＩＳＢＮ：０８２４７８６２９７）及び”Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ ａｎｄ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”ｂｙ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｔｅｓｔａ，Ｊｏａｃｈｉｍ Ｍ．Ｍａｙｅｒ（ＩＳＢＮ：３９０６３９０２５Ｘ）（これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。さらに、特に、企図された化合物が、化合物が代謝（例えば、ヒドロキシル化、グルクロニド化等）された場合に、より高い活性を有する場合には、企図された化合物の代謝産物も、明らかに本発明において企図されることが認識されるべきである。

特定の目的に依って、企図された化合物は、少なくとも一つの他の医薬的に活性な成分と（インビボで、又は医薬的製剤又は投与計画において）組み合わせられ得ることが認識されるべきであり、特に企図される他の成分には、ＤＮＡ傷害剤、細胞***阻害及び／又は細胞毒性薬、代謝拮抗薬、ヌクレオシドアナログ等が含まれる。例えば、適切な薬剤には、シスプラチン、マイトマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、シクロホスファミド、クロラムブシル、及び／又はブレオマイシンのようなアルキル化剤及び／又は架橋剤が含まれる。第２の医薬的に活性な成分の濃度は、典型的には、単独投与の場合に推奨されるものであるが、より低い（いくつかの場合には、より高い）濃度も、本発明において使用するのに適していると見なされる。

従って、企図された医薬的組成物には、特に、企図された化合物（及び付加的な医薬的に活性な成分）が適切な担体と共に提供されるものが含まれるであろう（ここで、企図された化合物は、好ましくは、細胞が化合物に曝された場合に、放射線（例えば、ＵＶ−Ｃ線及び／又はガンマ線）又はＤＮＡ傷害剤（例えば、架橋又はアルキル化剤）に対する腫瘍性細胞の感受性を増加させるのに有効な濃度で存在する）。さらに好ましい組成物において、化合物は、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、及び／又はＢＲＣＡ２−ＲＡＤ５１複合体が化合物に曝された場合に、ＢＲＣＡ２のＲＡＤ５１との結合を減少させるか又は防止するのに有効な濃度で存在することも企図される。企図された組成物が少なくとも一時的に細胞周期において細胞を停止するために利用される場合、化合物は、細胞が化合物と接触した場合に、細胞（典型的には、非腫瘍性細胞）をＧ１期に停止するのに有効な濃度で存在することが好ましい。従って、濃度は、これらが、細胞（例えば、血管内ステントに近位の内膜細胞を特に含む、化合物がカップリングされた植込装置に近位の細胞）の細胞増殖を減少させるのに有効な濃度で存在するよう選択され得る。

従って、特定の使用及び構造に依って、本発明の主題による化合物は、一投薬単位当たり１マイクログラムから１０００ミリグラム、より典型的には１０マイクログラムから５００ミリグラム、最も典型的には５０マイクログラムから５００ミリグラムの量で組成物中に存在することが企図される。従って、インビボ又はインビトロの企図された化合物の好ましい濃度は、一般に、０．１ｎＭから５００マイクロＭ、より典型的には５０ｎＭから４００マイクロＭ、最も典型的には１００ｎＭから２００マイクロＭであろう。

さらに、全ての製剤が、本発明において使用するのに適していると見なされ、特に、経口及び非経口の製剤を含むことが認識されるべきである。例えば、経口投与の場合、企図された組成物は、錠剤、カプセル、懸濁物、又は液体の形態をとり得る。医薬的組成物は、好ましくは、特定の量の活性成分を含有している投薬単位の形態で作成される。このような投薬単位の例は、錠剤又はカプセルである。活性成分は、例えば、生理食塩水、デキストロース、又は水が適切な担体として使用され得る組成物として注射により投与され得る。

投与される治療的に活性な化合物の量、並びに本発明の化合物及び／又は組成物により疾患状態を治療するための投薬計画は、対象の年齢、体重、性別、及び医学的状態、疾患の重度、投与の経路及び頻度、並びに利用される特定の化合物を含む多様な要因に依り、従って、広範に変動し得る。しかしながら、特に適切な量は、上に提供されたものであり、従って、体重１ｋｇ当たり約０．００１（又はさらにそれ未満）から１００ｍｇ、好ましくは、体重１ｋｇ当たり約０．０１から約５０ｍｇ、最も好ましくは、体重１ｋｇ当たり約０．１から２０ｍｇの１日用量を可能にし得る。典型的には、１日用量は、１日１から４回で投与され得る。

治療的又は予防的な目的のため、企図された化合物は、通常、示された投与経路にとって適切な１つ以上の補助剤と組み合わせられる。経口投与される場合、化合物は、乳糖、ショ糖、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム及びカルシウム塩、ゼラチン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、及び／又はポリビニルアルコールと混和され、次いで、便利な投与のために錠剤化又はカプセル化され得る。このようなカプセル又は錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース中の活性化合物の分散物に提供され得るような放出制御製剤を含有し得る。非経口投与用の製剤は、水性又は非水性の等張の無菌の注射溶液又は懸濁物の形態をとり得る。これらの溶液及び懸濁物は、経口投与用の製剤において使用するための前述の担体又は希釈剤のうちの１つ以上を有する無菌の粉末又は顆粒から調製され得る。化合物は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、綿実油、落花生油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、及び／又は様々な緩衝液に溶解させられ得る。他の補助剤及び投与モードは、薬学分野において十分に広範に既知である。

企図される使用
本発明の主題による化合物及び組成物は、ＢＲＣＡ２−ＲＡＤ５１相互作用に関連した状態及び／又は疾患に影響を与えるために利用され得ることが一般に企図される。従って、特に企図される状態及び疾患には、放射線及び／又はＤＮＡ傷害剤に対して細胞を感受性にすることが望まれるもの、並びに／又は刺激又は腫瘍性表現型への形質転換に応答して細胞***が異常制御されるものが含まれる。さらに好ましい状態には、細胞増殖を一時的に停止することが望ましいものが含まれる。

例えば、企図される化合物及び組成物は、このような化合物及び組成物がＤＮＡ傷害剤及び／又は放射線に対して腫瘍性細胞をより感受性にする化学療法において、特に有用である。従って、このような治療においては、化学療法剤の投薬量が減少し、及び／又は殺傷率（ｋｉｌｌ ｒａｔｅ）が増加し得る。他方、企図された化合物は、非腫瘍性細胞をＧ１期に停止するため、このような化合物は、一時的に細胞増殖を停止し、これにより化学療法剤により通常であれば誘導される傷害から非腫瘍性細胞を保護する化学予防剤として投与され得ることが認識されるべきである。さらに、細胞周期停止は、再狭窄の発生及び／又は重度を減少させるため、植込装置（例えば、血管内ステント）においても利用され得る。このような方法においては、本発明の主題による化合物が、植込装置へコーティングされることが企図される。当然、植込装置にこのような化合物をカップリングさせる多数の別の方式も、適切であると見なされ、装置にカップリングされた足場又は放出部分への共有結合性の接着、生浸食性（ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ）又は生分解性の材料への組み込み等が含まれる。

従って、分子的な観点から考察すると、企図された方法は、放射線により誘導されるＲＡＤ５１フォーカスを抑制し、細胞***阻害的な細胞増殖を促進し、シスプラチンと組み合わせられた場合には、細胞死の共同作用的な誘導を提供し、及び／又はこのような処理された細胞（最も典型的には、癌細胞）をＧ１期に停止するための治療的に活性な分子として、ＢＲＣＡ２−Ｒａｄ５１相互作用に干渉する化合物を利用するであろう。企図された化合物は、ＢＲＣリピートのＲＡＤ５１との結合を阻害し得るため、これらはＲａｄ５１多量体化を防止するか又は減少させるためにも利用され得、これは、最終的にはＢＲＣＡ２及びＲＡＤ５１の分解をもたらすであろう。従って、適切な方法には、細胞におけるＢＲＣＡ２及びＲＡＤ５１の分解が望ましい結果を生ずるであろう全ての方法が含まれる。

例示的な化合物の合成
多数の企図された化合物の合成が、化合物の３つの成分の直接反応により化合物が調製される、以下に概説されるような一般的なプロトコルに従うであろうことが認識されるべきである。例えば、適切な反応は、（ａ）（適宜）場合により置換及び保護されているイソキノリン、（ｂ）（適宜）場合により置換及び保護されているα−フェニルメチルスルホニルクロリド又はα−フェニルスルホニルクロリド、ならびに（ｃ）（適宜）場合により置換及び保護されているインドールを含み、各成分は、下記スキーム１に例示的に概説されるようにして化合させられる。

２−（ベンジルスルホニル）−１−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１，２−ジヒドロイソキノリン（ＩＢＲ２）：イソキノリン（１０．３ｇ、８０ミリモル）を無水ベンゼン（１４０ｍｌ）に溶解させた。α−フェニルメチルスルホニルクロリド（７．６４ｇ、４０ミリモル）を数回に分けて添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。インドール（４．６８ｇ、４０ミリモル）を添加し、反応を室温で２０時間継続させた。反応中、明るい色の沈殿物が形成された。次いで、固体を収集し、トルエン及びヘキサン（各５０ｍｌ）により洗浄した。得られた粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１００％ジクロロメタン）を使用してさらに精製し、淡黄色の固体として１１．１ｇ（９７．５％）を得た。生成物（６．０ｇ）をエタノール（２００ｍｌ）からの再結晶（ｒｅｃｒｙｓｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）によりさらに精製し、白色粉末として最終生成物（５．７ｇ）を得た。

ＭＳ（ｍ／ｅ）：４２３．０５（ＩＶＨ−Ｎａ^＋）。^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ、δ／ｐｐｍ）：４．００（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１３．８８Ｈｚ）、４．１６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１３．９２Ｈｚ）、６．０６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．５３Ｈｚ）、６．３０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．４５Ｈｚ）、６．３７（ｓ、１Ｈ）、６．７０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．５３Ｈｚ）、６．８６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）、６．９１（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．７８Ｈｚ）、７．０８（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．７６Ｈｚ）、７．１３−７．３２（ｍ、７Ｈ）、７．９６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０２Ｈｚ）、８．００（ｓ、ｂｒ、１Ｈ）。

実施例１の手順に従い、０．２５ミリモルの場合により置換されているインドールを、０．５ミリモルの場合により置換されているイソキノリン及び０．２５ミリモルのフェニルメチルスルホニルクロリドにより処理し、下記表に示される置換された２（ベンジルスルホニル）−１−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１，２−ジヒドロイソキノリンを得た（収率は、単一の実験に由来し、最適化されていない）。

２（ベンジルスルホニル）−１−（７−アザ−１Ｈ−インドール−３−イル）−１，２−ジヒドロイソキノリン：実施例１の手順に従い、２９．５４ｍｇ（０．２５ミリモル）の７−アザインドールを、６４．５８ｍｇ（０．５ミリモル）のイソキノリン及び４７．６７ｍｇ（０．２５ミリモル）のα−フェニルメチルスルホニルクロリドにより処理し、５８．９５ｍｇ（収率６０％）の２（ベンジルスルホニル）−１−（７−アザ−１Ｈ−インドール−３−イル）−１，２−ジヒドロイソキノリンを得た。

２（ベンジルスルホニル）−１−（７−アザ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−ブロモ−１，２−ジヒドロイソキノリン：実施例１の手順に従い、２９．５４ｍｇ（０．２５ミリモル）の７−アザインドールを、１０４．０３ｍｇ（０．５ミリモル）の４−ブロモイソキノリン及び４７．６７ｍｇ（０．２５ミリモル）のα−フェニルメチルスルホニルクロリドにより処理し、７１．９８ｍｇ（収率６１％）の２（ベンジルスルホニル）−１−（７−アザ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−ブロモ−１，２−ジヒドロイソキノリンを得た。

実験
ＢＲＣＡ２−ＲＡＤ５１複合体に干渉する化合物の同定
ＢＲＣ−Ｒａｄ５１相互作用を阻害することができる化合物を同定するため、２４，０００の合成化合物のライブラリー（Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、図１Ａに概略的に示される誘導可能逆酵母ツーハイブリッド法（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４，１３３９６−１３４０１）によりスクリーニングした。２つの融合タンパク質、ＴｅｔＲ−ＢＲＣ融合タンパク質（ＴｅｔＲ／ＮＣＢ、構成的に発現される）及びＲａｄ５１−活性化ドメイン融合タンパク質（ＧＡＬ１プロモーターの下で発現されるＡＤ／Ｒａｄ５１）は、ＴｅｔＯｐにより駆動されるＵＲＡ３遺伝子（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４，１２４７３−１２４７８）を保持している酵母株において転写活性化因子として共に作用した。これらの２つの融合タンパク質の間の相互作用は、ＵＲＡ３遺伝子の発現を誘導し；次いで、培地中の５−ＦＯＡの毒性代謝産物が細胞死を引き起こした（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５４，１６４−１７５）。試験された低分子が、ＴｅｔＲ／ＢＲＣ／ＡＤ／Ｒａｄ５１相互作用を阻害した場合には、ＵＲＡ３発現が排除され、細胞は増殖することができた。逆酵母ツーハイブリッドスクリーニングからの陽性ヒットの例は、図１Ｂに示される。ライブラリーをスクリーニング中、１６の化合物が１０μＭ未満の濃度で酵母増殖を促進することが見出された。次いで、これらの化合物を、ＭＣＦ−７乳癌細胞におけるＩＲにより誘導されるＲａｄ５１フォーカス形成に対する効果に関して試験した。２つの化合物（ＩＢＲ１及びＩＢＲ２、図１Ｃに示された構造）が、Ｒａｄ５１フォーカス形成を劇的に減少させ（図１Ｆ）、さらなる調査のために選出された。特に、ＩＢＲ１よりわずかに強い活性を有していたＩＢＲ２を、本明細書において実施された実験の大半において研究した。

著しく、ＩＢＲ１及びＩＢＲ２は分子構造が類似している。これらは、両方とも、化合物の性質を極めて疎水性にする３つの芳香環、イソキノリン、インドール、及びベンゼン環を含む。これらの２つの化合物の間の唯一の違いは、ベンゼン環をコア構造へと接続しているメチレン基にある。構造的類似性は、これらの化合物が類似した機能メカニズムを共有し得ることを示唆する。興味深いことに、ＩＢＲ化合物アナログのいくつかの逆酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより開示されたように、ベンゼン環の他の基への置換は、ＲＡＤ５１／ＢＲＣ相互作用の破壊に失敗し、このことは、ベンゼン環が、この標的との結合において役割を果たしていることを示唆し得る。一次スクリーニングにおいて、フェニル環上により大きな置換基を有する他のＩＢＲアナログが、ＢＲＣ／Ｒａｄ５１相互作用を破壊し得ないことも見出された。図１Ｇは、選択された試験された化合物の例示的な構造を示す。これら及び他の結果は、フェニル環が、標的結合において役割を果たし得ることを示唆している。インドール環のＮ位に置換基を有するＩＢＲアナログも、クローン原性アッセイにおいて活性を失い（データ示さず）、このことは、おそらく水素結合を通した、ＮＨ基の結合における役割の可能性を示唆している。

結合のメカニズムの調査
ＢＲＣリピートは、ＲＡＤ５１との結合に関与している高度に保存されたヘアピン構造（例えば、ＢＲＣ４中の１５２４−ＦＨＴＡＳＧＫ−１５３０）を有する。ＢＲＣＡ２配列１５２４−ＦＨＴＡ−１５２７は、逆平行ベータ鎖（ｓｔａｎｄ）対合（ｐａｒｉｎｇ）を通してＲＡＤ５１のＢ３と相互作用し；類似した結合パターンがＲａｄ５１フィラメント形成においても観察された。重要なこととして、ＢＲＣ４−ＲＡＤ５１複合体内のＢＲＣ４のＦ１５２４又はヒトＲＡＤ５１のＦ８６（酵母Ｒａｄ５１中のＦ１４４又はＰ．フリオサス（ｆｕｒｉｏｓｕｓ）Ｒａｄ５１中のＦ９７と等価）の両方が、ＲＡＤ５１のＭ２１０、Ｍ１５８、Ａ２０７、Ａ１９０、Ａ１９２、Ｑ２０６、Ｌ２０３、及びＩ１６０により形成されるＢ３とＡ４との間の疎水性ポケットに深く到達することができる。ＩＢＲ２構造のＢＲＣ４ヘアピン構造及びＲａｄ５１多量体化モチーフとの注意深い整列化は、フェニル環がＢＲＣ４のＦ１５２４を模倣することができ、残りの環系が隣接ベータ鎖に取って代わることを示唆している。ＩＢＲ２のＲＡＤ５１との分子ドッキングは、ＩＢＲ２が、ＢＲＣＡ２結合又は多量体化のためと同一の結合ポケットへとベンゼン基を伸長することにより、ＲＡＤ５１に結合することを示唆している（図１Ｄ及び１Ｅを参照）。ＩＢＲ化合物のベンゼン環がこれらの有効性に不可欠であるらしいという観察に基づき、本発明者らは、さらに、ＩＢＲ１／２作用メカニズムの一つの可能性が、ＢＲＣＡ２のＦ１５２４を模倣し、Ｆ１５２４のための疎水性結合ポケットの入口を遮断することにより、従って、ＢＲＣＡ２／ＲＡＤ５１ドッキングの失敗を引き起こすことを仮定した。

結合標的の調査
次いで、本発明者らは、企図された化合物がＲａｄ５１と結合し、ＢＲＣＡ２とは結合しないか否かを調査した。この目的のため、Ｒａｄ５１又はＢＲＣリピートが低分子化合物に結合するか否かを直接決定するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した。極めて弱いシグナルを与えるであろう低分子の結合を直接検出する代わりに、タンパク質結合の阻害を検出する別の方法を使用した。簡単に説明すると、タンパク質のうちの１つをセンサーチップに接着させ、ＩＢＲ化合物を、表面を通過させた。次いで、第２のタンパク質の結合を測定した。ＩＢＲ化合物が固定化されたタンパク質に結合する場合、第２のタンパク質の結合は減少するであろう（これは、図２Ａ及び２Ｃ概略的に示される）。図２Ｂ及び２Ｄに示されるように、ＩＢＲ化合物前処理により、固定化されたＲａｄ５１はＢＲＣリピートに結合する能力を失ったが（図２Ｂ）、化合物前処理は、固定化されたＢＲＣリピートのＲａｄ５１との結合には影響を与えなかった（図２Ｄ）。これらの結果は、ＩＢＲ化合物が、ＢＲＣリピートではなくＲａｄ５１と結合することを示す。

ＩＢＲ化合物がＢＲＣＡ２内のＰｈｅ１５２４の入口のための疎水性ポケットを実際に占めるのであれば、Ｒａｄ５１の多量体化も、同一の結合領域を共有しているため、影響を受けるはずである。以前の研究は、ＢＲＣリピートがＲａｄ５１多量体の解離を引き起こし得ることを示した。従って、ＩＢＲ２がＢＲＣヘアピン構造を模倣するのであれば、Ｒａｄ５１多量体化もＩＢＲ２により阻害されるであろう。本発明者らは、Ｒａｄ５１のゲル濾過プロファイルを、ＩＢＲ２の存在下と非存在下との間で比較した。Ｒａｄ５１は、以前に記載されたような、多量体種及び単量体種の存在を示す広い溶出プロファイルを示した。しかしながら、ＩＢＲ２の存在下では、Ｒａｄ５１溶出プロファイルは、図２Ｅに示されるような単量体の分子量と一致する主要ピークを示した。これらの結果は、ＩＢＲ２が、ＢＲＣリピートと同様に、Ｒａｄ５１多量体を解離させることを示す。Ｒａｄ５１とＢＲＣリピートとの結合の阻害を、以前に記載されたような（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３，８４４−８４８参照）溶液競合フォーマットにおけるＳＰＲ技術によりさらに分析した。図２Ｆより明らかなように、ＩＢＲ２化合物は、約１１５ｎＭという中央阻害濃度（ＩＣ５０）値で、Ｒａｄ５１との複合体においてＢＲＣリピートに置き換わった。

上記の観察に基づき、本発明者らは、ＩＢＲ化合物のフェニル環が、実際にＢＲＣ４リピートのＰｈｅ１５２４を模倣し、結合ポケットに達するのであれば、フェニル部分の適切なサイズが活性にとって重大であるに違いないことを企図する。このような仮説は、フェニル環が存在しないか（ＮＳ１６８５６）、又はイソキノリン環とベンゼン（ｂｅｎｚｎｅ）環との間のリンカーが長すぎる場合（ＮＳ７７８６、ＮＳ７７８７、ＮＳ７７８８、ＮＳ３４２４０、及びＮＳ４０２９８）、これらの化合物の活性が、逆酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて無視し得る程度であることが見出された様々な実験により支持された（図１Ｇ参照）。本発明者らは、さらに、既に逆酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて陰性の結果を示した、フェニル環のパラ位に大きな置換基（ｔｅｒｔ−ブチル）を有するＩＢＲ２アナログ（ＮＳ３５５５２）を調査した。図２Ｅに示されるように、ＮＳ３５５５２の存在下で、Ｒａｄ５１はまだ多量体を形成することができ、このことは、企図された化合物上のフェニル環構造のサイズが、これらの効果にとって少なくともある程度重大であることをさらに示唆している。

従って、本発明者らは、企図された化合物のメカニズムが、Ｒａｄ５１多量体形成を破壊するとともにＢＲＣリピートの結合を防止する、Ｒａｄ５１コアドメイン上の同一結合ポケットとの疎水的相互作用に、少なくともある程度、基づくことを企図する。

企図された化合物の様々な細胞及び動物モデルに対する生物学的効果
様々な生物学的効果（示されないデータ）の中でも、企図された化合物、特にＩＢＲ２は、培養物中の***腫瘍細胞の増殖を遅らせ、ヌードマウスにおける腫瘍原性を有意に減少させた。さらに、企図された化合物により処理された癌細胞は、Ｇ１期における停止及び有系***移行の欠陥を示した。これは、プロテアソーム経路を介したＲａｄ５１の加速された分解とも相関していた。企図された化合物は、さらに、ＶＰ−１６、タキソール、カンプトテシンを含む選択された化学療法剤、及び電離放射線照射の、腫瘍細胞を処理した際の細胞障害活性を強化した。従って、以下のデータ及び他の考慮に基づき、本発明者らは、本発明の主題による化合物が、ＢＲＣＡ２とＲａｄ５１との間の相互作用を標的とするのに適しており、従って、ＢＲＣＡ２−Ｒａｄ５１複合体形成及び／又はＲａｄ５１作用の異常に関連した疾患の治療に適していることを企図する。

企図された化合物を使用した癌細胞の増殖阻害
本発明者らは、乳癌細胞系のパネルの増殖及び生存率に対するＩＢＲ２の効果を調査した。５つの指数増殖期の乳癌細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫＢＲ３、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５）を、様々な期間（１、２、３、４、及び５日）、様々な濃度（０、５、１０、及び２０μＭ）で、ＩＢＲ２と共にインキュベートした。次いで、生存可能細胞の数をトリパンブルー排除アッセイにより計数した。結果は、図３Ａに示されるように、ＩＢＲ２が、用量依存的及び時間依存的に５つ全ての乳癌細胞系の増殖を有意に阻害することを示した。また、本発明者らは、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを使用して、培養乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ）の増殖及び生存率に対するＩＢＲ２の効果を調査した。結果は、試験された細胞系におけるＩＢＲ２のＩＣ５０値が、約１０μＭであることを示した（図３Ｄ参照）。さらに、非小細胞肺癌細胞系（ＣＡＬＵ−１、Ａ４２７、Ｓｋｌｕ−１、及びＣＡＬＵ−６）、骨肉腫細胞系（ＳａｏＳ２及びＵ２ＯＳ）、並びに神経膠芽腫細胞系（Ｔ９８Ｇ）の増殖も、ＩＢＲ２処理により有意に阻害された（図３Ｅ参照）。

ヌードマウスにおける確立された腫瘍異種移植片の増殖に対するＩＢＲ２の阻害効果を試験するため、本発明者らは、この研究のためにヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を選出した。およそ８５ｍｍ３の腫瘍サイズを有するマウスを、最長５週間、３つの用量のＩＢＲ２（１０、５０、及び１５０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）により隔日処理した。対照群（ビヒクル単独）と比較して、ＩＢＲ２により処理された群は、用量依存的に最大６５％の腫瘍増殖の有意な遅延を示したが（図３Ｂ参照）、ヌードマウスの平均体重はほぼ一定のままであった（図３Ｃ参照）。これらの結果は、ＩＢＲ２が、動物に対する明白な毒性なしに、***腫瘍増殖を阻害するために使用され得ることを証明している。

ＭＣＦ−７細胞の細胞周期に対するＩＢＲ２の効果
ＩＢＲ２が癌細胞増殖を阻害するメカニズムを探究するため、本発明者らは、ＩＢＲ２により処理されたＭＣＦ−７細胞の細胞周期進行をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により分析した。図４Ａに示されるように、時間依存的に、Ｇ１画分が増加し、Ｓ及びＧ２／Ｍ画分が枯渇し、アポトーシス細胞を示すサブ−Ｇ１画分が有意に増加した。

ＩＢＲ２により処理された細胞は、Ｇ１で停止され、従って、Ｓ期に移行することができないのか否かを試験するために、ＭＣＦ−７細胞をノコダゾール処理によりＭ期で同期化し、次いで、Ｇ１期への移行を可能にするために再び播いた。異なる時点で、Ｓ期移行をモニタリングするため、細胞をＢｒｄＵによりパルス標識した。図４Ｂに示されるように、ＩＢＲ２により処理された細胞は、Ｇ１で完全に停止され、Ｓ期に移行することができなかった。

さらに、ＩＢＲ２処理によるＳ期の細胞の運命を調査するために、ＭＣＦ−７細胞をヒドロキシ尿素処理によりＧ１／Ｓ移行期で同期化し、次いで、試薬の洗浄によりＳ期移行を可能にするために放出した。これらの細胞を、２０μＭ ＩＢＲ２及びＢｒｄＵにより処理し、１８時間、ＤＮＡ合成に関するＢｒｄＵ取り込みを、***指数及び生存可能細胞の数と共に測定した。図４Ｃに示されるように、偽処理された細胞及びＩＢＲ２により処理された細胞両方において、ＤＮＡ合成が類似した速度で低下し、このことから、ＩＢＲ２処理がＳ期進行には干渉しないことが示唆された。偽処理された細胞は、１２時間でＭ期極大に達したが、ＩＢＲ２処理細胞は全く又はほとんどＭ期に移行しなかった（図４Ｄ）。さらに、偽処理された細胞の数はＭ期の完了時に２倍になったが、ＩＢＲ２により処理された細胞の数はおよそ５０％にまで低下した。これは、ＩＢＲ２により処理された細胞が、おそらくはＳ／Ｇ２期における細胞死のため、Ｍ期に移行し得なかったことを示唆している（図４Ｅ）。

Ｒａｄ５１タンパク質発現に対するＩＢＲ２の影響を調査するため、ＩＢＲ２により処理されたＭＣＦ−７細胞を、ＢＲＣＡ２、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５０、ｐ８４、及びＲｂに対する抗体のパネルによりプローブされた直接（ｓｔｒａｉｇｈｔ）ウエスタンブロットにより調査した。図４Ｆに示されるように、ＢＲＣＡ２及びＲａｄ５１の両方が時間依存的に劇的に低下したが、ｐ８４及びＲａｄ５０の両方は一定のままであった。ＦＡＣＳ分析（図４Ａ）と一致して、Ｇ１期のマーカーであるＲｂの低リン酸化型が、後の時点で観察された主要な型であり、ＩＢＲ２がＧ１期で細胞を停止することがさらに確認された（図４Ａ）。ＢＲＣＡ２レベルは、細胞周期依存性であり、Ｇ１期には低発現し、Ｇ１／Ｓ境界においてピークに達することが報告されている。従って、ＩＢＲ２により処理された細胞におけるＢＲＣＡ２の低下したレベルは、Ｇ１期停止により得る。ＢＲＣＡ２タンパク質とは異なり、Ｒａｄ５１タンパク質は、ＭＣＦ−７細胞において細胞周期の全体を通して一定に発現される（データ示さず）。従って、Ｒａｄ５１タンパク質の欠損は、Ｇ１停止の結果ではなく、ＩＢＲ２処理の直接効果であり得る。ＩＢＲ２が不安定化によりＲａｄ５１レベルを低下させるか否かを試験するため、本発明者らは、新規タンパク質合成を阻害するシクロヘキサミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｍｉｄｅ）（ＣＨＸ）を添加することにより、安定性アッセイを実施した。次いで、図４Ｇ及び４Ｈに証明されるように、Ｒａｄ５１の半減期は、対照細胞における５．５時間と比較して１．５時間に短縮されるが、Ｒａｄ５０は短縮されないことが観察された。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の添加により、Ｒａｄ５１の半減期は、ＩＢＲ２により処理された細胞及び対照細胞の両方においてＲａｄ５０のものに類似した程度にまで延長され（図４Ｇ及び４Ｈ）、このことから、ＩＢＲ２が、プロテアソームにより媒介される分解のためＲａｄ５１を標的とすることが示唆された。従って、本発明者らは、ＩＢＲ２により処理されたＭＣＦ−７細胞が、Ｇ１で停止され、Ｍ期移行時にブロッキングされ、Ｓ／Ｇ２期で死滅したことを企図する。

インビボにおけるＲａｄ５１及びＩＲにより誘導されるＲａｄ５１フォーカスに対する企図された化合物の効果
本明細書に提示された観察に基づき、本発明者らは、ＩＢＲ２が、インビトロで、Ｒａｄ５１に結合し、ＢＲＣＡ２−Ｒａｄ５１複合体の形成を破壊することを発見した。細胞において、ＩＢＲ２処理は、Ｒａｄ５１の分解、Ｇ１停止、及びＳ期における細胞死をもたらす。インビボの効果が、ＩＢＲ２がＲａｄ５１を標的とすることに起因するのであれば、ＩＢＲ２により処理された細胞における外因性Ｒａｄ５１タンパク質の過剰発現は、このような効果を救済すると予想される。この可能性を試験するため、本発明者らは、ＭＣＦ−７細胞においてＧＦＰと共にＲａｄ５１を発現させ、ＧＦＰ単独も発現させた。ＩＢＲ２による処理の後、図５Ｃから明らかなように、細胞は、Ｒａｄ５１を過剰発現し、図５Ａ及び５Ｂから明白であるように、ＢｒｄＵ取り込み分析に基づくＳ期移行を有意に救済し、このことから、Ｒａｄ５１が、ＩＢＲ２により特異的に標的とされることが示唆される。

次に、本発明者らは、ＢＲＣＡ２−／−：ｐ５３−／−、ＢＲＣＡ１−／−：ｐ５３−／−、及びｐ５３−／−という遺伝子型を有する同質遺伝子ＭＥＦのＩＢＲ２処理に対する感受性を調査した。図５Ｄより明らかなように、ＢＲＣＡ２／−：ｐ５３−／−ＭＥＦは、ＢＲＣＡ１−／−：ｐ５３−／−及びｐ５３−／−ＭＥＦと比較してＩＢＲ２に対して最も感受性であった。次いで、これらのＭＥＦにおいてＲａｄ５１タンパク質の安定性を比較したところ、ＢＲＣＡ２−／−：ｐ５３−／−ＭＥＦにおけるＲａｄ５１の半減期が、他のものより短いことが見出された（図５Ｅ参照）。これらの結果は、内因性ＢＲＣＡ２が、会合によりＲａｄ５１を安定化し得、ＢＲＣＡ２の非存在下では、Ｒａｄ５１は、短縮された半減期を有し、容易にＩＢＲ２による分解の標的とされることを示唆している。

ＢＲＣＡ２とＲａｄ５１との間の相互作用が、ＩＲにより誘導されるＲａｄ５１フォーカスの形成にとって重大であるようであるため、ＩＢＲ２は、ＢＲＣリピートを模倣して、ＢＲＣＡ２−Ｒａｄ５１相互作用を破壊し、これによりＩＲにより誘導されるＲａｄ５１フォーカス形成を減弱させ得ることが企図された。この可能性を試験するため、ＩＲにより誘導されるＲａｄ５１フォーカスを形成したＭＣＦ−７細胞の数を、ＩＢＲ２処理の後に測定した。図５Ｆに示されるように、ＩＢＲ２処理は、ＩＲにより誘導されるＲａｄ５１フォーカス形成を有意に減少させ、このことから、Ｒａｄ５１の二本鎖切断（ＤＳＢ）修復機能がＩＢＲ２により損なわれることが示唆された。次いで、この効果がＤＳＢ修復に関与する他の分子にも当てはまるか否かを試験するため、本発明者らは、Ｒａｄ５１ではなくＮＢＳ１、５３ＢＰ、及びＢＲＣＡ１の動員のためのＡＴＭによりセリン１３９においてリン酸化されたヒストンＨ２ＡＸであるｇ−Ｈ２ＡＸのＩＲにより誘導されるフォーカス形成を調査した。図５Ｇに示されるように、ＩＢＲ２は、ＩＲ処理時にｇ−Ｈ２ＡＸフォーカス形成に効果を及ぼさず、このことから、ＩＢＲ２が、ＤＮＡ傷害部位へのｇ−Ｈ２ＡＸの動員には影響を与えることなく、Ｒａｄ５１ ＨＲ経路に特異的に干渉することが示唆された。

企図された化合物の化学療法剤との相乗作用
明らかに、ＩＢＲ２は、細胞周期進行においてもＨＲにおいてもＲａｄ５１の機能を阻害する。従って、ＩＢＲ２の他の化学療法剤との組み合わせは、相乗効果を有する可能性が高い。この可能性を試験するため、８μＭ ＩＢＲ２＋異なる用量のＶＰ−１６、タキソール、カンプトテシン、又はガンマ線照射により処理されたＭＣＦ−７乳癌細胞の生存率を測定した。乳癌細胞を死滅させる際の、ＩＢＲ２の、ＶＰ−１６（図５Ｈ）、タキソール（図５Ｉ）、カンプトテシン（Ｃａｍｐ）（図５Ｊ）、及びガンマ線照射（図５Ｋ）との有意な相乗効果が見出された。従って、ＩＢＲ２の他の従来の治療剤との組み合わせは、様々な癌の治療における臨床的な適用を有する可能性があることが認識されるべきである。

以前の研究は、癌細胞が正常細胞より高いＳ画分を有することを示した。この相違は、この特性を標的とする多くの伝統的な薬物を開発するのに有用である。多くの癌細胞におけるＲａｄ５１の強化された発現レベルも観察された。従って、癌細胞と正常細胞との間のＲａｄ５１機能の有意な違いは、癌治療のためのＲａｄ５１の可能性のある治療域を提供し得る。一貫して、企図された化合物は、動物研究において、１５０ｍｇ／ｋｇの投薬量まで明白な体重減少なしに、５０ｍｇ／ｋｇの投薬量で最大６５％腫瘍増殖を遅らせることができた。この結果は、企図された化合物が、体細胞組織に対してほとんど効果を及ぼさず、明白な全身毒性なしに、***腫瘍増殖を阻害することを確認するものであると考えられる。しかしながら、ＩＢＲ自体は、Ｇ０／Ｇ１期における死滅活性をほとんど有しないため、ＩＢＲ単独による治療は、癌細胞を排除するのに不十分であり得る。従って、他の化学療法剤との組み合わせが、より良好な結果を達成するために必要であり得る。この点に関して、ＶＰ−１６、タキソール、及びカンプトテシンのような他の化学療法試薬又は電離放射線照射とのＩＢＲ２の同時治療は、相乗効果を生ずることができ、このことから、この化合物が、従来の化学療法又は放射線療法の感作剤として使用され得ることが示唆される。

細胞におけるＢＲＣＡ２の欠如も、Ｒａｄ５１安定性に対して有意な影響を及ぼし、これらをＩＢＲ２処理に対してはるかに感受性にするようである。一貫して、予備結果は、短縮型ＢＲＣＡ２を含有している膵臓癌細胞系ＣＡＰＡＮ−１が、ＩＢＲ２に対する有意な感受性を示したことを示している。従って、ＩＢＲ２は、癌の極一部であるとはいえ、機能性のＢＲＣＡ２を欠く（又は、減少したＢＲＣＡ２発現を有する）癌細胞の治療において特に有用であり得ることが企図される。

実験手順
逆酵母ツーハイブリッドスクリーニング：ケミカルライブラリーを、ナノシン社（Ｎａｎｏｓｙｎ，Ｉｎｃ．）（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）より購入した。ＢＲＣ１−４リピートを含有しているＴｅｔＲ／ＮＣＢは構成的に発現され；ＡＤ／Ｒａｄ５１の発現はＧＡＬ１プロモーターの下でガラクトースにより誘導可能であった。酵母を、５−ＦＯＡを含有しているガラクトース培地において増殖させた。アッセイは、１００μｌの全容量で１０μＭの化合物を用いて９６穴プレートにおいて実施された。ＢＲＣ−Ｒａｄ５１相互作用を破壊することができる化合物が、酵母の生存率により同定された。

分子モデリング：ＩＢＲ２構造をシビル（Ｓｙｂｙｌ）（Ｔｒｉｐｏｓ ｃｏ．ｌｔｄ．）を用いて作成し、電荷をガステイガー−ヒュッケル（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ−Ｈｕｃｋｅｌ）法（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｓｉｌｉ，１９８０）を使用して追加した。分子ドッキングは、フレキシブルドッキング法によりＵＣＳＦドック（Ｄｏｃｋ）（Ｅｗｉｎｇ ａｎｄ Ｋｕｎｔｚ，１９９７）を使用して実施され、結果はキメラ（Ｃｈｉｍｅｒａ）（Ｈｕａｎｇら．，１９９６）により観察された。Ｒａｄ５１及びＢＲＣ４の座標は、ＰＤＢ（登録番号：１ＮＯＷ）からのものであった。Ｒａｄ５１多量体化モチーフ座標は、ＰＤＢ（登録番号：１ＰＺＮ）からのものであった。３Ｄ構造整列化のためのＩＢＲ２座標は、ドッキングしたコンフォメーションのうちの１つからのものであった。

表面プラズモン共鳴結合アッセイ：ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）において、ＨＢＳＤ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＤＭＳＯ）で２５℃でアッセイを実施された。センサーチップＮＴＡ又はグルタチオン修飾されたＣＭ５を、それぞれＨｉｓ−Ｒａｄ５１又はＧＳＴ−ＢＲＣ１を捕獲するために使用した。捕獲レベルは、５μｌ／分の流速で約１３０共鳴単位であった。逐次結合アッセイの場合には、チップを、化合物（１μＭ）、次いでタンパク質（５０μｇ／ｍｌ）により処理した。保持された共鳴単位（ＲＵ）を記録し、トリプリケートの実験から平均化した。競合アッセイ（Ｖａｓｓｉｌｅｖら．，２００４）の場合には、ＩＢＲ２を、使用前に１５分間２５℃で５０μｇ／ｍｌ ＢＲＣと共にインキュベートした。ＩＢＲ２の非存在下での結合に対する相対結合百分率を計算し、２つの独立の実験から平均化した。

ゲル濾過：Ｒａｄ５１（３．２μｇ）及び低分子化合物の混合物（モル比１：１０）を、３７℃で１５分間インキュベートし、緩衝液（５０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、０．５ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ ＡＴＰ、及び１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（全容量２０μｌ））を補足し、さらに１５分間インキュベートした。次いで、この混合物を、記載されたのと同一の緩衝液（Ｄａｖｉｅｓら．，２００１）により平衡化された２．４ｍｌのスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ ＰＣ ３．２／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷した。画分（５０μｌ）を収集し、各画分０．５μｌをＰＶＤＦ膜上にブロットした。Ｒａｄ５１を、抗Ｒａｄ５１抗体（ｍＡｂ １４Ｂ４）を使用して検出した。

細胞培養、細胞同期化、ＢｒｄＵ標識、及び***指数の決定：乳癌細胞系及びＭＥＦ細胞系は、１０％胎児ウシ血清を含有している高グルコースダルベッコ修飾イーグル培地において培養した。ＭＣＦ−１０Ａ細胞は、以前に記載されたようにして（Ｄｅｂｎａｔｈら，２００３）、培養した。Ｍ期における細胞同期化は、８時間の０．１μｇ／ｍｌノコダゾールによる処理により達成した。Ｇ１／Ｓ境界における細胞同期化は、１７時間の１ｍＭヒドロキシ尿素による処理、９時間の放出、及び再び１４時間の１ｍＭヒドロキシ尿素による処理により達成した。ＢｒｄＵ標識のため、細胞を、３０分間ＢｒｄＵと共にインキュベートされ、ＢｒｄＵ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したＢｒｄＵ免疫染色のため固定した。***指数の決定のため、細胞を、室温で３０分間０．１μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ含有ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡検により調査された。１試料当たり５００から１０００個の核を、前中期、中期、後期、及び終期のみを含むＭ期細胞の数を決定するために計数した。

細胞増殖アッセイ及びクローン原性生存率アッセイ：細胞増殖曲線を入手するため、１×１０４個の細胞を２４時間１２穴プレートに播いた。次いで、細胞を、０．４％ＤＭＳＯの存在下で様々な濃度のＩＢＲ２によりデュプリケートで処理した。生存可能細胞を、トリパンブルー排除アッセイにより毎日計数した。ＭＴＴアッセイは、以前に記載されたようにして（Ａｌｌｅｙら．，１９８８）、実施した。

クローン原性生存率アッセイを実施するため、１．５×１０３個のＭＣＦ−７細胞を２４時間１０ｃｍディッシュに播いた。次いで、細胞を、１２時間、５μＭ ＩＢＲ２によりトリプリケートで処理し、次いでｇ線照射した。細胞を、５μＭ ＩＢＲ２に絶えず曝し、４日毎に新鮮な培地及びＩＢＲ２を再供給した。１４から１６日後、細胞を固定し、２％メチレンブルーにより染色した。５０個超の細胞からなるコロニーを計数した。

ウエスタンブロット分析：細胞を、２０ｍＭ ＩＢＲ２又は５０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（ＣＨＸ）又は１μＭ ＭＧ１３２により処理し、ウエスタンブロット分析のため異なる時点で採集した。溶解（Ｌｙｓｉｓ）２５０緩衝液に再懸濁させた細胞を、３回の凍結／解凍サイクル（液体窒素／３７℃）に供し、次いで、室温で２分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。タンパク質濃度を測定した後、等量の全細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、イムノブロット分析を、以前に記載されたようにして（Ｃｈｅｎら．，１９９９）、実施した。使用された抗体は、以下の通りであった：Ｒａｄ５１（ウサギ５９５２）；ＢＲＣＡ２（ウサギＰＣ１４６、癌遺伝子）；Ｒｂ（ｍＡｂ １１Ｄ７）；Ｒａｄ５０（ｍＡｂ １３Ｂ３）、及びｐ８４（ｍＡｂ ５Ｅ１０）。バンドの強度は、Ｌａｂｗｏｒｋｓ ４．５ソフトウェアを使用して、濃度測定により定量化した。バンド強度の相対値は、ｐ８４シグナルによる規準化の後、未処理試料のものに対して計算した。

Ｒａｄ５１及びｇ−Ｈ２ＡＸのフォーカスの免疫染色：ＭＣＦ−７細胞を、７又は１９時間、２０μＭ ＩＢＲ２により処理し、次いで、２０Ｇｙでｇ線照射した。細胞を２０μＭ ＩＢＲ２と共にさらに５時間インキュベートし、次いで０．５％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定された細胞を、ａ−Ｒａｄ５１抗体（ｍＡｂ １Ｆ５）又はａ−ｇ−Ｈ２ＡＸ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）と共にインキュベートした。続いて、Ｒａｄ５１及びｇ−Ｈ２ＡＸのフォーカス陽性細胞を、記載されたようにして（Ｃｈｅｎら，１９９９）、計数した。

フローサイトメトリーによる細胞周期分析：細胞周期分布を分析するため、５’１０５ ＭＣＦ−７細胞を２４時間１０ｃｍディッシュに播き、様々な時間、２０ｍＭ ＩＢＲ２により処理した。次いで、細胞をトリプシン処理し、７０％エタノール（−２０℃）により固定し、３０分間、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色溶液（Ｙｕｎら．，２００５）（ＰＢＳ中の５０μｇ／ｍｌ ＰＩ、０．１％クエン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ、０．０３％ＮＰ−４０）により染色した。フローサイトメトリー分析を、ファックスキャリバー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）フローサイトメーターを使用して実施し、細胞周期分布を、セルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）ソフトウェア（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ）により分析した。各試料について１０，０００イベントを分析し、実験を２回繰り返した。

ＭＣＦ−７細胞におけるＲａｄ５１タンパク質の構築物及び過剰発現：Ｒａｄ５１−ＥＧＦＰを、レトロウイルスベクターｐＣＬｐＧＫＥＧＦＰへ１．１ｋｂのＲａｄ５１断片を挿入することにより作成した。次いで、Ｒａｄ５１−ＥＧＦＰレトロウイルスを作製し、ＭＣＦ−７細胞へと感染させた。Ｒａｄ５１−ＥＧＦＰに安定的に感染した細胞を、２４時間２０μＭ ＩＢＲ２により処理し、次いでＢｒｄＵにより標識するか、又はウエスタンブロット分析のために溶解させた。

ヌードマウスにおける腫瘍阻害アッセイ：１００μｌのＰＢＳ中の５×１０^６個のＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、６から８週齢無胸腺雌ＢＡＬＢ／ｃ−ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の***脂肪パッドへ導入した。腫瘍が８５ｍｍ^３にまで増殖した後（１２日目）、ＩＢＲ２（１０、５０、又は１５０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクル（１５％ＤＭＳＯ、２０％トゥイーン２０、１０％ＰＥＧ４００、５５％生理食塩水）の腹腔内注射を５週間隔日受容する４つの群（各群ｎ＝５）へとマウスをランダム化した。マウスの体重及び腫瘍容積を、薬物治療の間、週２回、測定した。スチューデントｔ検定を、Ｐ値を決定するために使用した。

こうして、ＢＲＣＡ２−Ｒａｄ５１相互作用の破壊のための組成物及び方法の特定の実施形態及び適用が開示された。しかしながら、本明細書中の本発明の概念から逸脱することなく、既に記載されたものに加えてさらに多くの修飾が可能であることが、当業者には明白であるはずである。従って、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の本旨以外には制限されない。さらに、明細書及び特許請求の範囲の両方の解釈において、全ての用語が、情況と一致する可能な限り広い様式で解釈されるべきである。特に、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非排他的にエレメント、成分、又は工程をさし、参照されたエレメント、成分、又は工程が、明示的に参照されていない他のエレメント、成分、又は工程と共に存在するか、又は利用されるか、又は組み合わせられてもよいことを示すことが解釈されるべきである。さらに、参照により本明細書に組み込まれる参照における用語の定義又は使用が、本明細書に提供された用語の定義と一致しないか又は反対である場合には、本明細書に提供されたこの用語の定義が適用され、参照におけるこの用語の定義は適用されない。

例示的な逆酵母ツーハイブリッドスクリーニング系の概略図である。 図１Ａの逆酵母ツーハイブリッドスクリーニング系を使用した培養プレートの写真である。 逆酵母ツーハイブリッドスクリーニング系を使用して同定された、選択された化合物の例示的な構造を示す。 左パネルにＢＲＣ４−Ｒａｄ５１複合体のコンピューターシミュレーション、右パネルにＩＢＲ２−Ｒａｄ５１複合体のコンピューターシミュレーションを示す。 ＩＢＲ２のＢＲＣ４及びＲＡＤ５１多量体化モチーフとの構造整列化のコンピューターシミュレーションを示す。 企図された化合物対対照を使用して処理された細胞におけるＲａｄ５１フォーカスの減少を示すマイクロ写真である。 試験された化合物の例示的な構造及び酵母スクリーニングアッセイにおけるこれらの活性を示す。 ＩＢＲ２の結合パートナーを決定するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験の概略図である。 選択された表面プラズモン共鳴実験の結果を示すグラフである。 ＩＢＲ２の結合パートナーを決定するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験の概略図である。 選択された表面プラズモン共鳴実験の結果を示すグラフである。 ゲル濾過により分析されるような、ＩＢＲ２により媒介されたＲａｄ５１多量体の解離のドットブロット分析である。 ＩＣ_５０決定のための溶液競合フォーマットのＳＰＲを使用したＲａｄ５１−ＢＲＣ１リピート結合の阻害を示すグラフである。 ***上皮細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫＢＲ３及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５）の増殖に対するＩＢＲ２の効果を示す一連のグラフである。 ヒト乳癌異種移植片（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）を保有しているヌードマウスにおける様々な投薬量のＩＢＲ２のインビボ抗腫瘍活性を示すグラフである。 図３Ｂの実験において使用された動物の体重を示すグラフである。 様々な細胞系に対するＩＢＲ２のＩＣ_５０値を示すグラフである。 様々な濃度のＩＢＲ２を使用した、様々な癌細胞の増殖を示すグラフである。 ２０μＭ ＩＢＲ２又はＤＭＳＯと共にインキュベートされた細胞についてのＦＡＣＳによる細胞周期分布分析の結果が記載された表である。 ＩＢＲ２により処理されたＢｒｄＵ陽性細胞の百分率を示すグラフである。 ＩＢＲ２により処理されたＢｒｄＵ陽性細胞のＢｒｄＵ取り込み（Ｃ）、***指数（前期を除く）（Ｄ）、及び生存可能細胞の数（Ｅ）を示すグラフである。 ＩＢＲ２により処理されたＢｒｄＵ陽性細胞のＢｒｄＵ取り込み（Ｃ）、***指数（前期を除く）（Ｄ）、及び生存可能細胞の数（Ｅ）を示すグラフである。 ＩＢＲ２により処理されたＢｒｄＵ陽性細胞のＢｒｄＵ取り込み（Ｃ）、***指数（前期を除く）（Ｄ）、及び生存可能細胞の数（Ｅ）を示すグラフである。 ＩＢＲ２により処理された細胞のタンパク質プロファイルを示すウエスタンブロットである。 ＩＢＲ２により処理された細胞のタンパク質プロファイルを示すウエスタンブロットである。 図４Ｇの実験からの結果を表わすグラフである。 Ｓ期移行を救済するために外因性Ｒａｄ５１を過剰発現したＩＢＲ２により処理されたＭＣＦ−７細胞の顕微鏡写真である。 全ＧＦＰ発現細胞の画分として表されたＢｒｄＵ陽性細胞を示すグラフである。 Ｒａｄ５１の発現レベルを示すウエスタンブロットである。 選択された細胞系の相対感受性を示すグラフである。 選択された細胞系における残存Ｒａｄ５１量を示す。 選択された処理条件におけるＭＣＦ−７細胞の中のＲａｄ５１フォーカスを有する細胞の数を示す。 選択された処理条件におけるＭＣＦ−７細胞の中のＨ２ＡＸフォーカスを有する細胞の数を示す。 企図された化合物の選択された化学療法剤との相乗効果を示すグラフである。 企図された化合物の選択された化学療法剤との相乗効果を示すグラフである。 企図された化合物の選択された化学療法剤との相乗効果を示すグラフである。 γ線照射後のＭＣＦ−７細胞のクローン原性生存率を示すグラフである。

Claims (20)

1. 医薬的に許容される担体及び式１による化合物を含む医薬的組成物
   

   

   ［式中、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルカリル、及び
   

   

   ［Ｙは、存在しないか、又は１から４個の炭素原子を有するアルキレン基であり；
   Ｚは、−Ｃ（Ｒ_１２）＝Ｃ（Ｒ_１３）−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ_１４（ここで、Ｒ_１４は、Ｈ、アルキル、アリール、アラルキル、又はアシルである）］からなる群より選択される基であり；
   Ｑは、Ｎ又はＣ−Ｒ_２であり、
   Ｘは、ＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ_１４（ここで、Ｒ_１４は独立して前記定義の通りである）より選択され；
   Ｒ’及びＲ_１からＲ_１３は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ハロ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキシアルキル、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、Ｎ−アルキル、Ｎ−シクロアルキル、アミノ、チオ、アルキルチオ、及びハロアルキルからなる群より選択され；但し、Ｒ_１２及びＲ_１３は、場合により、結合して炭素環式又は複素環式の環を形成していてもよく；及び
   ｎは０から４（両端を含む）であり、及び^＊はＲ又はＳ配置を示す］。
2. Ｒ_１からＲ_１１がＨであり、ＸがＮＲ_１４であり、及びＲが
   

   

   である、請求項１の医薬的組成物。
3. Ｚが−Ｃ（Ｒ_１２）＝Ｃ（Ｒ_１３）−であり、及びＹが存在しない、請求項２の医薬的組成物。
4. 化合物が式２
   

   

   による構造を有する、請求項１の医薬的組成物。
5. 化合物が式３
   

   

   による構造を有する、請求項１の医薬的組成物。
6. 化合物が、細胞が化合物に曝された場合に、放射線及びＤＮＡ傷害剤のうちの少なくとも一つに対する腫瘍性細胞の感受性を増加させるのに有効な濃度で組成物中に存在する、請求項１の医薬的組成物。
7. 化合物が、ＢＲＣＡ２−ＲＡＤ５１複合体が化合物に曝された場合に、ＢＲＣＡ２のＲＡＤ５１との結合を減少させるのに有効な濃度で組成物中に存在する、請求項１の医薬的組成物。
8. ＤＮＡ傷害剤をさらに含む、請求項１の医薬的組成物。
9. 化合物が、細胞が化合物と接触した場合に、細胞をＧ１期に停止するのに有効な濃度で組成物中に存在する、請求項１の医薬的組成物。
10. 化合物が、植込装置に近位の複数の細胞の細胞増殖を減少させるのに有効な濃度で植込装置にカップリングされる、請求項１の医薬的組成物。
11. 腫瘍性細胞を治療する方法であって、式１による化合物、このプロドラッグ又は代謝産物と接触させることを含み、化合物が、腫瘍性細胞が化合物に曝された場合に、放射線及びＤＮＡ傷害剤のうちの少なくとも一つに対する腫瘍性細胞の感受性を増加させるのに有効な濃度で存在する、前記方法
    

    

    ［式中、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルカリル、及び
    

    

    ［Ｙは、存在しないか、又は１から４個の炭素原子を有するアルキレン基であり；
    Ｚは、−Ｃ（Ｒ_１２）＝Ｃ（Ｒ_１３）−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ_１４（ここで、Ｒ_１４は、Ｈ、アルキル、アリール、アラルキル、又はアシルである）］からなる群より選択される基であり；
    Ｑは、Ｎ又はＣ−Ｒ_２であり、
    Ｘは、ＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ_１４（ここで、Ｒ_１４は独立して前記定義の通りである）より選択され；
    Ｒ’及びＲ_１−Ｒ_１３は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ハロ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキシアルキル、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、Ｎ−アルキル、Ｎ−シクロアルキル、アミノ、チオ、アルキルチオ、及びハロアルキルからなる群より選択され；但し、Ｒ_１２及びＲ_１３は、場合により、化合して炭素環式又は複素環式の環を形成していてもよく；及び
    ｎは０から４（両端を含む）であり、及び^＊はＲ又はＳ配置を示す］。
12. 細胞を放射線照射及びＤＮＡ傷害剤のうちの少なくとも一つに曝す工程をさらに含む、請求項１１の方法。
13. 放射線照射がガンマ線照射又はＵＶ−Ｃ線照射であり、及びＤＮＡ傷害剤がアルキル化剤又は架橋剤である、請求項１１の方法。
14. 腫瘍性細胞が乳癌細胞又は卵巣癌細胞である、請求項１１の方法。
15. 濃度が１μＭから１００μＭである、請求項１１の方法。
16. 非腫瘍性細胞をＧ期に停止する方法であり、式１による化合物、このプロドラッグ又は代謝産物と接触させることを含み、化合物が、非腫瘍性細胞をＧ期に停止するのに有効な濃度で存在する、前記方法
    

    

    式１
    ［式中、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルカリル、及び
    

    

    ［Ｙは、存在しないか、又は１から４個の炭素原子を有するアルキレン基であり；
    Ｚは、−Ｃ（Ｒ１２）＝Ｃ（Ｒ１３）−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ１４（ここで、Ｒ_１４は、Ｈ、アルキル、アリール、アラルキル、又はアシルである）］からなる群より選択される基であり；
    Ｑは、Ｎ又はＣ−Ｒ_２であり、
    Ｘは、ＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ_１４（ここで、Ｒ_１４は独立して前記定義の通りである）より選択され；
    Ｒ’及びＲ_１からＲ_１３は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ハロ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキシアルキル、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、Ｎ−アルキル、Ｎ−シクロアルキル、アミノ、チオ、アルキルチオ、及びハロアルキルからなる群より選択され；但し、Ｒ_１２及びＲ_１３は、場合により、化合して炭素環式又は複素環式の環を形成していてもよく；及び
    ｎは０から４（両端を含む）であり、及び^＊はＲ又はＳ配置を示す］。
17. 接触工程の後に非腫瘍性細胞をＤＮＡ傷害条件に曝す工程をさらに含み、及び接触工程が、接触工程がない場合に得られるであろうＤＮＡ傷害と比較して、細胞のＤＮＡ傷害を減少させる条件の下で実施される、請求項１６の方法。
18. ＤＮＡ傷害条件が、放射線照射及びＤＮＡ傷害剤への曝露のうちの少なくとも一つである、請求項１７の方法。
19. ＤＮＡ傷害剤が、シスプラチン、マイトマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、シクロホスファミド、クロラムブシル、及びブレオマイシンからなる群より選択される、請求項１８の方法。
20. 細胞を接触させる工程が、化合物がカップリングされている植込装置と細胞が接触するよう実施される、請求項１６の方法。

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