JP2008514186A - URLC8のtRNA−ジヒドロウリジンシンターゼ活性によって非小細胞肺癌を診断する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、肺癌、より具体的には非小細胞肺癌ならびにその診断および処置に関する。
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2004年9月24日に提出された米国特許仮出願第60/612,937号の恩典を主張する。
肺癌は、世界全体での癌による死亡の最も一般的な原因の一つであり、非小細胞肺癌(NSCLC)は、それらの症例のほぼ80%を占める(Greenlee, R.T., et al., (2001) CA Cancer J. Clin, 51:15〜36(非特許文献1))。肺癌の発症および進行に関連した多くの遺伝的変化が報告されているが、正確な分子メカニズムはなお不明確である(Sozzi, G. Eur. J. Cancer(2001)37 Suppl 7:S63〜73(非特許文献2))。過去10年のあいだに、パクリタキセル、ドセタキセル、ジェムシタビン、およびビノレルビンを含む新たに開発された細胞毒性剤が出現して、進行NSCLCを有する患者に多数の治療選択肢を提供している;しかし、新しい治療法のそれぞれは、シスプラチンに基づく治療と比較して多少の延命効果を提供できるに過ぎない(Schiller, J.H. et al.(2002) N Engl J Med, 346:92〜98(非特許文献3);Kelly, K., et al. (2001) J Clin Oncol, 19:3210〜3218(非特許文献4))。したがって、分子ターゲティング物質および抗体、ならびに癌ワクチンのような新しい治療戦略の開発が切望される。
それぞれの遺伝子産物の生物学的および臨床病理学的重要性を証明するために、臨床肺癌材料の腫瘍組織マイクロアレイ分析が行われている。この系統的アプローチによって、仮にIMS-E21(URLC8: upregulated in lung caner 8としても知られる、アクセッション番号AB101210;以前のFLJ20399)と命名される新規遺伝子が、原発性NSCLCにおいて高頻度に過剰発現されることが判明した。
a.SCCの予後を予測すべき被験者から採取した検体におけるURLC8発現レベルを検出する段階、および
b.URLC8発現レベルの上昇が検出された場合、予後が不良であることが示される段階。
概説:
癌治療のための分子ターゲティング薬剤の開発は進歩しているが、反応する腫瘍タイプの範囲ならびに処置の有効性はなおも非常に限定されている(Ranson, M. et al.(2002) J Clin Oncol, 20:2240〜2250;Blackledge, G. and Averbuch, S.(2004) Br J Cancer 90:566〜572)。したがって、有害反応が最小であるかまたはない、悪性細胞に対して非常に特異的な新規抗癌物質を開発することが急務である。これらの目標に向けた効果的な戦略とは、cDNAマイクロアレイにおいて得られた遺伝子情報に基づく癌細胞においてアップレギュレートされた遺伝子のスクリーニングと、RNAiシステムによって機能喪失表現型を誘導することによって得られた細胞増殖に及ぼすそれらの効果のハイスループットスクリーニングと組み合わせること、および組織マイクロアレイにおいて数百の臨床試料を分析することにより得られた薬物標的候補の検証と組み合わせることであろう(Sauter, G. et al.(2003) Nat Rev Drug Discov, 2:962〜972;Kononen, J. et al.(1998) Nat Med, 4:844〜847)。そのような戦略を追求することによって、本発明者らは、本明細書において、IMS-E21(URLC8)が臨床NSCLC試料および細胞株においてしばしば共過剰発現されているのみならず、疾患の進行ならびにNSCLC細胞の増殖のために遺伝子産物の高レベルの発現が不可欠であることを証明した。
本明細書において、本明細書において用いられる用語「一つの(a)」、「一つの(an)」、および「その(the)」は、特に明記していなければ「少なくとも一つ」を意味する。
a.SCCの予後が予測されるべき被験者から採取した検体におけるURLC8発現レベルを検出する段階、および
b.URLC8発現レベルの上昇が検出された場合、予後が不良であることが示される段階。
(a)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列をコードするmRNAを検出する段階;
(b)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する段階;および
(c)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出する段階。
(a)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列をコードするmRNAを検出するための試薬;
(b)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出するための試薬;および
(c)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
反応混合物:
100 mMトリス-HCl(pH 8.0)、
100 mM酢酸アンモニウム、
5 mM MgCl2、
2 mM DTT、
0.1 mM EDTA、
1 mM NADPH、
1 mM NADH、および
50,000 cpmのtRNA(6 fmol)の標識転写物
本発明は、本発明のスクリーニング法によって選択される任意の化合物を含む、NSCLCを処置または予防するための組成物を提供する。
[B]は3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり;かつ
[A']は、[A]の相補的配列からなるリボヌクレオチド配列である。領域[A]は[A']とハイブリダイズし、そして領域[B]からなるループが形成される。ループ配列は、好ましくは長さが3〜23ヌクレオチドであってもよい。ループ配列は、例えば以下の配列(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)からなる群より選択されうる。さらに、23ヌクレオチドからなるループ配列も同様に活性なsiRNAを提供する(Jacque, J.M., et al., (2002)Nature 418:435〜438)。
UUCG:Lee, N.S. et al., (2002) Nature Biotechnology 20:500〜505;Fruscoloni, P., et al., (2003)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:1639〜1644。
UUCAAGAGA:Dykxhoorn, D.M., (2003)Nature Reviews Molecular Cell Biology 4:457〜467。
ugaggugcucagcacagug-[b]-cacugugcugagcaccuca (SEQ ID NO:10の標的配列)
guuggcacagccuguguau-[b]-auacacaggcugugccaac (SEQ ID NO:11の標的配列)
5’-TGAGGTGCTCAGCACAGTG-3’ (SEQ ID NO:10)、および
5’-GTTGGCACAGCCTGTGTAT-3’ (SEQ ID NO:11)
を含む、URLC8遺伝子に対する低分子干渉RNA(siRNA)の薬学的有効量を含む、非小細胞肺癌(NSCLC)を処置または予防するための組成物を提供する。または、本発明はさらに、低分子干渉RNAの薬学的有効量を投与する段階を含む、NSCLCを処置または予防するための方法をさらに提供する。
実施例1:材料および方法
(a)肺癌細胞株および組織試料
本研究において用いたヒトNSCLC細胞株19種およびSCLC細胞株4種は、以下の通りであった:肺ADC A427、A549、LC319、PC3、PC9、PC14、およびNCI-H1373;気管支肺胞細胞癌(BAC)NCI-H1666およびNCI-H1781;肺腺扁平上皮癌(ASC)NCI-H226およびNCI-H647;肺SCC RERF-LC-AI、SK-MES-1、EBC-1、LU61、NCI-H520、NCI-H1703、およびNCI-H2170;肺大細胞癌(LCC)LX1;ならびにSCLC DMS114、DMS273、SBC-3、およびSBC-5。細胞は全て、10%ウシ胎児血清(FCS)を添加した適切な培地において単層で増殖させて、5%CO2を含む湿潤雰囲気中で37℃で維持した。ヒト小気道上皮細胞、SAECは、Cambrex Bio Science Inc.(Walkersville, MD)から購入した最適化培地(SAGM)において増殖させた。
総RNAを、Trizol試薬(Life Technologies, Inc.)を用いて製造元のプロトコールに従って培養細胞および臨床組織から抽出した。抽出したRNAおよび正常ヒト組織ポリ(A)RNAをDNアーゼI(Nippon Gene)によって処理して、オリゴ(dT)プライマーおよびSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen)を用いて逆転写した。以下の合成された遺伝子特異的プライマーによって、または内部対照としてACTB特異的プライマーによって半定量的RT-PCR実験を行った。
以下のプライマーを用いてIMS-E21(URLC8)を単離した:
5’- GACCACATCCAACAGTATTCG-3’ (SEQ ID NO:3) および
5’- TGCCAGGACATCTAACTTCTG -3’ (SEQ ID NO:4);
ACTB、
5’-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3’ (SEQ ID NO:5) および
5’-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3’ (SEQ ID NO:6)。
対数増幅相において産物の強度を確保するために、PCR反応をサイクル数に関して最適化した。
ヒト多組織ブロット(BD Biosciences Clontech)を、IMS-E21(URLC8)の32P標識PCR産物とハイブリダイズさせた。IMS-E21(URLC8)のcDNAプローブを、上記と同じプライマーを用いてRT-PCRによって調製した。供給業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。ブロットを増感BASスクリーン(BIO-RAD, Hercules, CA)によって室温で30時間オートラジオグラフに供した。
最初に、IMS-E21(URLC8)配列を、BLASTプログラムによってESTデータベースに対して検索したところ、一つのESTクローン(FLJ20399、NM_017803)と高度に相同であることが見出された。製造業者の使用説明書に従ってSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen)を用いるランダムプライミングによって正常な臓器混合試料12例に由来する総RNAからcDNAを生成した。RT-PCR産物をpcDNA3.1-myc-Hisベクター(Invitrogen)にクローニングして、シークエンシングによって確認した。
個々のタンパク質のNH2末端でHisタグエピトープを含むIMS-E21(URLC8)(全長)を発現するプラスミドを、pET28ベクター(Novagen, Madison, WI)を用いて調製した。組換え型タンパク質を大腸菌BL21 codon-plus株(Stratagene, LaJolla, CA)において発現させて、TALON樹脂(BD Bioscience)を用いて供給業者のプロトコールに従って精製した。SDS-PAGEゲルにおいて抽出したタンパク質をウサギに接種して、免疫血清を標準的な方法論に従ってアフィニティーカラム上で精製した。アフィニティー精製した抗IMS-E21(URLC8)抗体を、ウェスタンブロット分析、免疫沈降、および免疫染色のために用いた。
N末端FLAGタグおよびC末端HAタグ-pCAGGS-IMS-E21(URLC8)ベクター、またはモックベクター(対照)を発現するプラスミドをトランスフェクトした肺癌細胞株LC319由来の細胞抽出物を、プロテナーゼ阻害剤の存在下で、IP緩衝液(0.5%NP-40、50 mMトリス-HCl、150 mM NaCl)の最終容積2 mlにおいてプロテインG-アガロースビーズ100μlと共に4℃で1時間インキュベートすることによって、予備清浄した。4℃で1000 rpm、5分間遠心分離した後、上清を抗Flag M2アガロースと共に4℃で2時間インキュベートした。次に、ビーズを5000 rpmで2分間の遠心分離によって回収して、免疫沈降緩衝液各1mlによって6回洗浄した。次に、洗浄したビーズをFlag-ペプチド(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO)によって溶出した。溶出液を抗HAアガロースと共に4℃で2時間インキュベートした。洗浄したビーズをLaemmli試料緩衝液50μlに再懸濁させ、5分間沸騰させて、タンパク質を5〜10%SDS-PAGEゲル(BIO RAD)によって分離した。電気泳動後、ゲルを銀染色した。IMS-21(URLC8)トランスフェクト抽出物において特異的に見出されたタンパク質バンドを切り出して、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF-MS)(AXIMA-CFR plus, SHIMADZU BIOTECH, Kyoto, Japan)に供した。
ベクターに基づくRNA干渉(RNAi)システム、psiH1BX3.0は、哺乳動物細胞においてsiRNAの合成を方向付けるために既に確立された(Suzuki, C. et al.(2003)Cancer Res, 63:7038〜7041)。本明細書において、siRNA発現ベクター10μgを、Lipofectamine 2000(Invitrogen)30μlを用いて、いずれも内因性にIMS-E21(URLC8)を過剰発現するNSCLC細胞株A549およびLC319にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞の80%超が合成siRNAを発現して、それらの細胞において、IMS-E21(URLC8)遺伝子の内因性の発現は有効に抑制された。トランスフェクトされた細胞を適当な濃度のジェネティシン(G418)の存在下で7日間培養した後、細胞数および生存率をギムザ染色および三連のMTTアッセイによって測定した。RNAiに関する合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りであった:
5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’ (SEQ ID NO:7);
対照2(ルシフェラーゼ、ホタル(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ遺伝子)、
5’-CGTACGCGGAATACTTCGA-3’ (SEQ ID NO:8);
対照3(Scramble:5Sおよび16S rRNAをコードする葉緑体ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)遺伝子)
5’-GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3’ (SEQ ID NO:9);
siRNA-IMS-E21-#2(si-IMS-E21-#2)
5’-TGAGGTGCTCAGCACAGTG-3’ (SEQ ID NO:10);
siRNA-IMS-E21-#3(si-IMS-E21-#3)
5’-GTTGGCACAGCCTGTGTAT-3’ (SEQ ID NO:11)。
対照1(EGFP)
5’-TCCCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’ (SEQ ID NO:12);
5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’ (SEQ ID NO:13);
対照2(ルシフェラーゼ)
5’-TCCCCGTACGCGGAATACTTCGATTCAAGAGATCGAAGTATTCCGCGTACG-3’ (SEQ ID NO:15);
5’-AAAACGTACGCGGAATACTTCGATCTCTTGAAATCGAAGTATTCCGCGTACG-3’ (SEQ ID NO:16);
対照3(Scramble)
5’-TCCCGCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCGC-3’ (SEQ ID NO:18);
5’-AAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGTCTCTTGAACGAATCCTACAAAGCGCGC-3’ (SEQ ID NO:19);
siRNA-IMS-E21-#2(si-IMS-E21-#2)
5’-TCCCTGAGGTGCTCAGCACAGTGTTCAAGAGACACTGTGCTGAGCACCTCA-3’ (SEQ ID NO:21);
5’-AAAATGAGGTGCTCAGCACAGTGTCTCTTGAACACTGTGCTGAGCACCTCA-3’ (SEQ ID NO:22);
siRNA-IMS-E21-#3(si-IMS-E21-#3)
5’-TCCCGTTGGCACAGCCTGTGTATTCAAGAGAATACACAGGCTGTGCCAAC-3’ (SEQ ID NO:24);
5’-AAAAGTTGGCACAGCCTGTGTATCTCTTGAAATACACAGGCTGTGCCAAC-3’ (SEQ ID NO:25);
ホルマリン固定NSCLCを用いる腫瘍組織マイクロアレイを、他に刊行されたように構築した。試料採取の組織領域は、スライドガラス上で対応するHE染色切片との視覚的アラインメントに基づいて選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取した組織コア3、4、または5個(直径0.6 mm;高さ3〜4 mm)を、組織マイクロアレイアー(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI)を用いてレシピエントパラフィンブロックに配置した。正常組織のコアを各症例から穿孔した。得られたマイクロアレイブロックの5μm切片を免疫組織化学分析のために用いた。IMS-E21(URLC8)の陽性率は、臨床追跡データを前もって知らない異なる試験者3人により、なし(スコア0)、弱い(スコア1+)、または強い陽性(スコア2+)として染色強度を記録し、半定量的に評価した。症例は、検査者が独立にそのように定義した場合に限って陽性であると認められた。
NSCLCの治療物質および/または診断マーカーを開発するための新規標的分子を得るために、cDNAマイクロアレイにおいて分析したNSCLC 37例の50%超の症例において5倍高い発現を示した遺伝子をスクリーニングした(Kikuchi, et al.(2003) Oncogene, 22:2192〜2205)。スクリーニングした遺伝子23,040種において、一つのEST転写物(FLJ20399、NM_017803)が、NSCLCにおいて頻繁に過剰発現されていると同定され;その過剰発現は半定量的RT-PCR実験によって代表的な8例において確認された。この転写物の全長クローンを得るために、cDNAマイクロアレイ実験によって当初単離されたcDNA断片を用いてFASTAデータベースをスクリーニングして、いくつかのESTを同定した。これらのクローンのDNA配列を集合させて、この遺伝子の全コードヌクレオチド配列を決定した。cDNAは、493アミノ酸のペプチドをコードする1,479ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2,020ヌクレオチドからなった。FASTAプログラムを用いる相同性検索によって、この予想タンパク質が、tRNA-ジヒドロウリジンシンターゼ(DUS)ファミリーに属するタンパク質、特にtRNA上のウリジン残基の5,6-二重結合の還元を触媒する出芽酵母のDus1(ジヒドロウリジンシンターゼ1)と相同であることが判明した(それぞれ、アミノ酸において30%の同一性、図1、a〜c)。したがって、この遺伝子は、仮にIMS-E21(URLC8:up-regulated in lung cancer 8とも呼ばれる、アクセッション番号AB101210)と命名された。SMARTプログラム(http://smart.embl-heidelberg.de/)(Letunic I, et al., (2004)Nucleic Acids Res, 32(Database issue):D142〜4;Schultz J, et al., (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.;95:5857〜64)を用いてIMS-E21(URLC8)の配列内に二つのモチーフが同定された;それぞれ、N末端DusドメインおよびC末端DSRM(図1、a)である。ヒトIMS-E21(URLC8)は、ネズミ(マウス(M. musculus)およびラット(R. Norvegicus))の産物とアミノ酸において90%の同一性、キイロショウジョウバエ(D. melanogaster)タンパク質と48%の同一性、およびC.エレガンス(C. elegans)タンパク質と40%の同一性を保存すると考えられた(図1、b)。
入手可能なNSCLC 292例の組織マイクロアレイにおいて、アフィニティー精製抗IMS-E21(URLC8)ポリクローナル抗体によって免疫組織化学分析を行った。本研究から、細胞質においてIMS-E21(URLC8)の陽性染色を示した症例数が、それぞれ、NSCLC症例292例中254例(87%);ADC症例158例中132例(84%)、SCC症例99例中89例(90%)、LCC症例21例中19例(90%)、BAC症例10例中10例(100%)、およびASC症例4例中4例(100%)であったことが示された。それらの腫瘍は全て外科的に切除可能なNSCLCであり、それらが隣接する任意の正常肺組織において染色は観察されなかった(図3、a)。IMS-E21(URLC8)の発現パターンを、組織アレイにおいて、なし/弱い(スコア0〜1+)から強い(スコア+2)の範囲で分類した。次に、IMS-E21(URLC8)発現と臨床転帰との関連を試験した。統計分析によって、試験した肺癌患者において、任意のIMS-E21(URLC8)発現レベルとpTまたはpN因子との有意な相関がないことが判明した。しかし、SCCにおけるIMS-E21(URLC8)の発現は、カプラン-メイヤー法を用いて、腫瘍特異的5年生存率に有意に関連することが見出された(Log-rank検定によってP=0.0091)(図3、b)。単変量分析によって、pT、pN、性別、およびIMS-E21(URLC8)発現(P=0.0111)は、それぞれSCC患者における不良な腫瘍特異的生存と有意に関連した。さらに、IMS-E21(URLC8)染色は、SCC患者のコックス比例ハザードモデルを用いる多変量分析によって、独立した予後因子であることが決定された(P=0.0234)。
IMS-E21(URLC8)が肺癌細胞の増殖または生存にとって必須であるか否かを評価するために、IMS-E21(URLC8)に対するsiRNA(si-IMS-E21)を発現するプラスミドおよび対照プラスミド(EGFP、Scramble、およびルシフェラーゼに関するsiRNA)を設計して構築し、それらをA549およびLC319細胞にトランスフェクトして内因性のIMS-E21(URLC8)の発現を抑制した。si-IMS-E21-#2および-#3をトランスフェクトした細胞におけるIMS-E21(URLC8)転写物の量およびタンパク質レベルは、対照をトランスフェクトした細胞と比較して有意に減少した(図3、c、左のパネル);si-IMS-E21-#2および-#3のトランスフェクションはまた、コロニー形成アッセイにおけるコロニー数(図3、c、下のパネル)およびMTT細胞生存率アッセイによって測定したコロニー数(図3、c、右のパネル)の有意な減少を引き起こした。
肺癌細胞における内因性のIMS-E21(URLC8)の細胞内局在を決定するために、アフィニティー精製抗IMS-E21(URLC8)ポリクローナル抗体を用いて免疫細胞化学を行った。共焦点顕微鏡により、IMS-E21(URLC8)タンパク質がA549細胞の細胞質に分布することが判明した(データは示していない)。IMS-E21(URLC8)タンパク質の細胞内局在をさらに調べるために、本発明者らは、ヒトIMS-E21(URLC8)タンパク質のC-末端にc-myc-Hisエピトープ配列(LDEESILKQE-HHHHHH)を含むプラスミドをLC319細胞にトランスフェクトした。抗c-myc抗体および小胞体(ER)において豊富に発現される内因性のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)に対する抗体を用いる共免疫染色により、IMS-E21(URLC8)タンパク質が主にERに分布することが示唆された(図4、a)。
肺癌細胞におけるIMS-E21(URLC8)の機能を解明するために、IMS-E21(URLC8)と相互作用するタンパク質を同定した。N末端FLAG-タグおよびC末端HAタグpCAGGS-IMS-E21ベクターまたはモックベクター(対照)をトランスフェクトしたLC319細胞の溶解物を抽出して、抗FLAG M2モノクローナル抗体によって免疫沈降した後、抗HAモノクローナル抗体による免疫沈降を行った。IMS-E21(URLC8)を含むタンパク質複合体を、SDS-PAGEゲルにおいてSilverQuest(Invitrogen)によって染色した。IMS-E21(URLC8)発現プラスミドをトランスフェクトした細胞溶解物の免疫沈降物において認められるが、モックプラスミドをトランスフェクトした細胞溶解物においては認められない180 kDaのバンドを抽出して、MALDI-TOF質量分析シークエンシング(データは示していない)によってEPRS(グルタミル-プロリルtRNAシンテターゼ)であると決定した。内因性のIMS-E21(URLC8)とEPRSとの相互作用が、共免疫沈降および免疫細胞化学によって確認され(図4、bおよびc)、ER依存的翻訳においてIMS-E21(URLC8)-アミノアシルtRNAシンテターゼ複合体が存在する可能性を示唆した。
IMS-E21(URLC8)がジヒドロウリジンシンターゼ酵素ファミリーをコードするという仮説を試験するために、NSCLC細胞株におけるDUS活性に対するsiRNAによるIMS-E21(URLC8)遺伝子の抑制効果を調べた。総tRNAを、HPLC技術によって、siRNA構築物をトランスフェクトしたA549およびLC319細胞の総RNAから精製して、各細胞株のジヒドロウリジン含有量に関して試料を分析した(Jacobson, M. and Hedgcoth, C.(1970)Anal Biochem, 34:459〜469;Hunninghake, D. and Grisolia, S.(1966)Anal Biochem. 16:200〜205)。上記のようにIMS-E21(URLC8)の転写物レベルを抑制することができる最も有効なIMS-E21(URLC8)siRNA構築物(siRNA-IMS-E21-#2)はまた、対応する対照siRNA構築物(si-EGFP)と比較した場合に、tRNA-ジヒドロウリジン含有量のレベルの低減を引き起こした(図4、d)。これらの腫瘍細胞においてsiRNA-IMS-E21-#2によって誘導されたt-RNAジヒドロウリジンの欠損は、腫瘍増殖抑制に密接に関連し(図3、c)、IMS-E21(URLC8)のtRNA-DUS活性が腫瘍細胞の生存および/または進行にとって不可欠であることを意味している。
本発明者らは、URLC8がt-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性を有すること、および活性の抑制によって肺癌細胞の細胞増殖の阻害が起こることを示した。このように、URLC8のt-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性を阻害する物質は、NSCLCのような肺癌を処置するための抗癌物質として治療的に有用である。
Claims (20)
- 以下の段階を含む、肺扁平上皮癌(SCC)の予後を予測する方法:
a.SCCの予後を予測すべき被験者から採取した検体におけるURLC8発現レベルを検出する段階、および
b.対照レベルと比較して上昇したURLC8発現レベルが検出される場合、予後が不良であることが示される段階。 - 発現レベルが以下からなる群より選択される方法の任意の一つによって検出される、請求項1記載の方法:
(a)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列をコードするmRNAを検出する段階;
(b)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する段階;および
(c)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出する段階。 - (c)の生物活性がt-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性である、請求項2記載の方法。
- 以下からなる群より選択される任意の一つの成分を含む、肺扁平上皮癌(SCC)の予後を予測するためのキット:
(a)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列をコードするmRNAを検出するための試薬;
(b)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出するための試薬;および
(c)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出するための試薬。 - 被験者に由来する生体試料においてt-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性および/またはt-RNAジヒドロウリジンのレベルを決定する段階を含み、正常対照レベルと比較して増加したレベルにより、被験者が非小細胞肺癌を有すること、または非小細胞肺癌の発症のリスクを有することが示される、被験者における非小細胞肺癌または非小細胞肺癌の発症の素因を診断する方法。
- URLC8のt-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性および/またはt-RNAジヒドロウリジンを検出するための試薬を含む、肺扁平上皮癌(SCC)の予後を予測するためのキット。
- 以下の段階を含む、ポリペプチドのt-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性を測定する方法:
a.以下からなる群より選択されるポリペプチドを、t-RNAジヒドロウリジンの合成にとって適切な条件下でインキュベートする段階:
i.SEQ ID NO:2(URLC8)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有する条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されているSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有する条件で、SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;
b.t-RNAジヒドロウリジン合成レベルを検出する段階;および
c.段階(b)において検出されたt-RNAジヒドロウリジン合成レベルをt-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性と関連付けることによって、t-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性を測定する段階。 - 条件が、ポリペプチドを発現する細胞を培養する段階を含む、請求項7記載の方法。
- 細胞が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有する形質転換細胞である、請求項8記載の方法。
- 以下の段階を含む、t-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性を調節する物質を同定する方法:
a.以下からなる群より選択されるポリペプチドをt-RNAジヒドロウリジンの合成にとって適切な条件下、試験化合物の存在下でインキュベートする段階:
i.SEQ ID NO:2(URLC8)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有する条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されているSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有する条件で、SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;
b.t-RNAジヒドロウリジン合成レベルを検出する段階;および
c.t-RNAジヒドロウリジン合成レベルを対照レベルと比較する段階であって、対照レベルと比較したt-RNAジヒドロウリジン合成レベルの増加または減少により、試験化合物がt-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性を調節することが示される、段階。 - 以下の段階を含む、非小細胞肺癌を処置および/または予防するための化合物をスクリーニングする方法:
a.請求項10記載の方法によってt-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性を調節する試験化合物を同定する段階、および
b.対照レベルと比較して、t-RNAジヒドロウリジン合成レベルを減少させる化合物を選択する段階。 - 以下の成分を含む、試験化合物がt-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性を調節する能力を検出するためのキット:
A)以下からなる群より選択されるポリペプチド:
i.SEQ ID NO:2(URLC8)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有する条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されているSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有する条件で、SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;および
B)t-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性を検出するための試薬。 - 以下の成分を含む、試験化合物がt-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性を調節する能力を検出するためのキット:
A)以下からなる群より選択されるポリペプチドを発現する細胞:
i.SEQ ID NO:2(URLC8)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.ポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有する条件で、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されているSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
iii.ポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有する条件で、SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;および
B)t-RNAジヒドロウリジンシンターゼ活性を検出するための試薬。 - URLC8媒介性t-RNAジヒドロウリジン合成を減少させる化合物の薬学的有効量と薬学的に許容される担体とを含む、非小細胞肺癌(NSCLC)を処置または予防するための組成物。
- 非小細胞肺癌(NSCLC)細胞を、URLC8媒介性t-RNAジヒドロウリジン合成を減少させる化合物の薬学的有効量に接触させる段階を含む、非小細胞肺癌(NSCLC)を処置または予防するための方法。
- 標的配列としてヌクレオチド配列
5’-GTTGGCACAGCCTGTGTAT-3’ (SEQ ID NO:11)
を含む、URLC8遺伝子に対する低分子干渉RNAの薬学的有効量を含む、非小細胞肺癌(NSCLC)を処置または予防するための組成物。 - siRNAが一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有し、
式中、
[A]は、SEQ ID NO:11のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列であり;
[B]は、3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり;かつ
[A']は、[A]の相補的配列からなるリボヌクレオチド配列である、
請求項16記載の組成物。 - トランスフェクション増強剤を含む、請求項16記載の組成物。
- 標的配列としてヌクレオチド配列
5’-GTTGGCACAGCCTGTGTAT-3’ (SEQ ID NO:11)
を含む、URLC8遺伝子に対する低分子干渉RNAの薬学的有効量を投与する段階を含む、非小細胞肺癌(NSCLC)を処置または予防するための方法。 - siRNAが一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有し、
式中、
[A]は、SEQ ID NO:11のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列であり;
[B]は、3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり;かつ
[A']は、[A]の相補的配列からなるリボヌクレオチド配列である、
請求項19記載の方法。
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