JP2008504355A - 癌の処置 - Google Patents

Abstract

本発明は、癌、および白血病の処置において、一緒に効果を増強させる、抗Ｈｓｐ９０抗体とともに効果的な抗癌剤を含む、新規薬剤および調製物に関する。

Description

本発明は、結腸直腸癌を含む癌の処置において一緒に効果を増強させる、抗Ｈｓｐ９０抗体とともに効果的な医薬品を含む、新規薬剤および調製物に関する。本発明の他の態様は、白血病の処置に関する。

癌治療および白血病の処置
本発明の第一の態様は、癌の処置において一緒に効果を増強させる、抗Ｈｓｐ９０抗体とともに効果的な抗癌剤を含む、新規薬剤および調製物に関する。

タンパク質の熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）ファミリーのメンバーは、腫瘍形成および細胞死において重要な役割を持つとして、近年明らかになってきた。実際、熱ショックタンパク質が、長年、癌治療に関する可能性ある標的であるとして同定されてきており（Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ Ｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１９９４ Ａｕｇ ３０，９１（１８）：８３２４−８；ＰＭＩＤ：８０７８８８１）、アンサマイシンファミリーのメンバー（以前は、チロシンキナーゼ阻害剤と呼ばれていた）が、癌治療に影響を与えることに有用であることが示唆されてきた（Ｎｅｃｋｅｒｓ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ，１９９９，１７（４）：３６１−７３；ＰＭＩＤ：１０７５９４０３；Ｓｃｈｕｌｔｅ ＴＷ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９８，４２（４）：２７３−９；ＰＭＩＤ：９７４４７７１）。

１つの熱ショックタンパク質、Ｈｓｐ９０が、乳癌、前立腺癌、黒色腫、白血病およびリンパ腫、大腸癌および肺癌（Ｂａｎｅｒｊｉ Ｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，２００３ Ｏｃｔ；３（５）：３８５−９０；ＰＭＩＤ：１４５２９３９０）、ならびに甲状腺カルシノーマに関与することが明らかにされてきた。Ｈｓｐ９０の役割は、例えばシグナル伝達のような、広い範囲の細胞工程に関与する、「クライアントタンパク質」の正確なホールディングを確実にすることである。Ｈｓｐ９０クライアントタンパク質には、変異ｐ５３および低酸素症誘導因子１αのような転写因子、およびｖ−Ｓｒｃ、Ａｋｔ、Ｒａｆ−１およびＢｃｒ−Ａｂｌを含む可溶性キナーゼが含まれる。Ｈｓｐ９０は、正常細胞におけるレベルと比べて、腫瘍細胞では２〜１０倍高いレベルで構造的に発現しており、これは、腫瘍細胞の増殖／生存に関して重要でありうることを示唆している（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４０：ｐ８７−９６）。クライアントタンパク質のＨｓｐ９０への結合が、その配座、安定性および細胞内での運命を調節可能であるので、Ｈｓｐ９０は、細胞増殖、***、分化、移動および死を含む、細胞効果を調節する経路において、主要な影響をもちうる（Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｐ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２００４ Ａｐｒ ８；２０６（２）：１４９−５７；ＰＭＩＤ：１５０１３５２０）。細胞工程における、Ｈｓｐ９０の広く行き渡る役割は、本タンパク質が現在、治療薬物の開発にとって、可能性のある標的としてみられていることを意味する。単一の分子標的と特異的に相互作用することによって、Ｈｓｐ９０阻害剤が、Ｈｓｐ９０クライアントタンパク質の不安定化と、ひいては分解を引き起こす。

本発明の第二の態様は、白血病の処置において一緒に効果を増強させる、抗Ｈｓｐ９０抗体とともに効果的な抗癌剤を含む、新規薬剤および調製物に関する。

白血病は、骨髄に影響を与える癌である。白血病を患う人々においては、骨髄が多数の異常な白血球細胞を産出する。異常な白血球細胞が骨髄内に密集し、それにより骨髄は、十分な正常赤血球細胞、白血球細胞および血小板を産出できなくなる。

異なる型の白血病は、進展の速度（急性または慢性）と影響を受ける白血球細胞の型（骨髄性またはリンパ性細胞）によって分類可能である。骨髄性白血球細胞は、感染に対する防御の免疫系第一ラインであり、主に血中で見られ、外来有機物を飲み込み殺す。リンパ性白血球細胞はリンパ節および血中で見られる。

４つの最も一般的な白血病の型には、慢性リンパ性（リンパ球性）白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性（骨髄芽球性）白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）がある。

ＣＬＬはリンパ球の癌であるだけではなく、またＡＬＬよりさらにゆっくりと進展する。本疾患は、成人を襲う白血病の最も一般的な型であり、子供では非常にまれである。

ＡＭＬは、顆粒球として知られている骨髄細胞に主に影響を与える癌である。このＡＭＬは血管をブロック可能な非常に多くの骨髄芽球を産出するが、骨髄細胞まで十分に成熟しない。本疾患は主に成人で発生するが、子供も襲い得る。

（慢性顆粒球性白血病とも呼ばれている）ＣＭＬは、典型的には、好中球細胞のゆっくりと進行する癌であり、子供ではまれであり、一般的に、女性よりも成人男性に多い。ＣＭＬは通常、９５％を超える患者の白血病細胞が、異なる細胞遺伝学的異常、フィラデルフィア染色体（Ｐｈ１）を有するので、簡単に診断される（Ｋｕｒｚｒｏｃｋ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２００３，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３８（１０）：ｐ８１９−３０，ＰＭＩＤ：１２７５５５５４；Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ．およびＭｅｌｏ，Ｊ．Ｖ．，２００３，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９（１５）：ｐ１４５１−６４，ＰＭＩＤ：１４５３４３３９）。Ｐｈ１は、染色体９および２２の長腕間の相互関係転移の結果であり、全ての造血前駆体において実証される（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｌｏｏｄ ９６（１０）：ｐ３３４３−５６，ＰＭＩＤ：１１０７１６２６）。この転移は結果として、染色体９上のＡｂｅｌｓｏｎ（ａｂｌ）癌遺伝子の、ブレイクポイントクラスター領域（ＢＣＲ）と呼ばれる、染色体２２の領域への転移となる（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｌｏｏｄ ９６（１０）：ｐ３３４３−５６，ＰＭＩＤ：１１０７１６２６）。続いてこれが結果として、８．５ｋｂキメラｍＲＮＡをコードする、融合ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子となる。ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子は、マウス中でＣＭＬ様疾患を産出するのに十分な癌遺伝子である。ＢＣＲ／ＡＢＬ癌遺伝子の転写物が翻訳されて、２１０ｋＤａまたは１９０ｋＤａタンパク質が産出される。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質は、ＣＭＬ中で見られる無秩序な骨髄造血を引き起こす、異常なチロシンキナーゼタンパク質である。ＣＭＬは、慢性期、加速期および急性転化と呼ばれる、異なる臨床病期を通して進行する。ＢＣＲ／ＡＢＬ癌遺伝子は全ての期で発現されるが、急性転化は、多重のさらなる遺伝的および分子的変化によって特徴づけられる（Ｇｏｒｒｅ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ，１００（８）：ｐ３０４１−３０４４）。

Ｐｈ１陰性ＣＭＬは、結果としてＢｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡとなる、ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）転移の細胞遺伝学的または分子的（ＲＴ−ＰＣＲ）証拠なしの、ＣＭＬの臨床的特性によって特徴づけられる、まれな疾患である。Ｐｈ１陰性ＣＭＬは、他の骨髄増殖性症候群からはっきりと区別されない、よく定義されていない存在である。Ｂｃｒ−Ａｂｌｏ転写物に関するＲＴ−ＰＣＲ解析の通常の近接性とともに、全ての臨床ＣＭＬの５〜１０％を考慮した場合、この数字は現在５％未満である。興味深いことに、この状態の何人かの患者が、Ａｂｌへの異なる融合の結果であり得る。ｔ（９；１２）の結果としての、ＴＥＬ（ＥＴＶ６）−ＡＢＬ融合が、Ｐｈ−ＣＭＬの２つの場合で実証されてきている。Ｐｈ１陰性ＣＭＬの患者は一般的に、Ｐｈ１陽性患者と比べて、処置に対する応答が弱く、生存が短い（Ｏｎｉｄａ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，２００２：Ｃａｎｃｅｒ ９５（８）：ｐ１６７３−８４，ＰＭＩＤ：１２３６５０１５）。

ＡＬＬは、リンパ芽球として知られている、未熟リンパ球の癌である。この疾患は、若年小児、通常１〜７歳の間で最も一般的な白血病の型であり、成人では非常にまれである。ＡＬＬは、多くの異常なリンパ球を発生させ、これが、正常の赤血球細胞および血小板を押しのける。１８５ｋＤａ Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質が、ＡＬＬの発達に直接関与している。

Ｈｓｐ９０阻害剤として働く、２つの薬物、ゲルダナマイシン（ＧＡ）および１７−アルキルアミノ、１７−デスメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）が、臨床試験において、見込みのある生物学的および臨床的活性を示した。実際、２１０ｋＤａ Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質（ｐ２１０^{Ｂｃｒ−Ａｂｌ}）は、その安定性に関して、Ｈｓｐ９０とのその相互作用に依存しており、ＧＡまたは１７−ＡＡＧでの細胞の処置が、ｐ２１０^{Ｂｃｒ−Ａｂｌ}の急速な崩壊を導く。

従来の細胞毒性試薬または他の新規の試薬との組み合わせでの、１７ＡＡＧのようなＨｓｐ９０阻害剤がまた、多重段階腫瘍形成を攻撃するのに、治療的に価値があり得る（Ｗｏｒｋｍａｎ Ｐ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２００４ Ａｐｒ ８；２０６（２）：１４９−５７；ＰＭＩＤ：１５０１３５２０）。遺伝的不安定性によって特徴づけられる癌細胞において、Ｈｓｐ９０活性を阻害することによって、１７ＡＡＧが、腫瘍に対する「合成致死」を一緒に証明する、種々の変異を放出する。腫瘍細胞の遺伝的不安定性を持たない正常の細胞は、相対的に影響を受けない（Ｇａｒｂｅｒ，Ｋ．，２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｖｏｌ．９４，Ｎｏ．２２，ｐ１６６６−１６６８）。１７ＡＡＧでの明らかな問題は、薬物が長期治療に関してあまりにも毒性であり、結果として、非毒性の置換が必要であることである（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．，上記）。

メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（ＲＴＭ））は、単一試薬として、新生物疾患において主要な影響を持つ、小分子チロシンキナーゼ阻害剤である。病原性９；２２転移を有する悪性物の、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ特性の阻害剤として本来設計され、イマチニブは、穏やかな特異性を有すると証明されており、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）およびフィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ１＋）ＡＬＬの処置において主に影響を持つ（Ｋｒｙｓｔａｌ，ＧＷ，２００４，Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８Ｓ１：ｐＳ５３−Ｓ５９）。ＣＭＬのイマチニブ処置に関連した問題の１つは、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼにおける変異の結果としての薬物の耐性である。重要なことに、ｉｎ ｖｉｖｏでイマチニブに耐性となるＣＭＬ細胞は、そのＨｓｐ９０依存性を維持し、したがって、１７ＡＡＧに対する感受性を維持する。

最近の発行物によって、腫瘍Ｈｓｐ９０が、完全に、悪性進行を促進する多重シャペロン複合体において存在すること、およびこれらが、癌治療に対する魅力ある標的であることが示唆されている。特に、腫瘍細胞から由来した多重シャペロン複合体におけるＨｓｐ９０が、正常細胞からのＨｓｐ９０（すなわち潜在的な未複合化状態のＨｓｐ９０）よりも、１７ＡＡＧに対して１００倍高い結合親和性を有することが示され、これは、多重シャペロン複合体において、潜在的な未複合化Ｈｓｐ９０によって提示されないエピトープ（特に四つ組エピトープ（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｅｐｉｔｏｐｅｓ））を提示しうることが示唆される。ミコグラブ（ＲＴＭ）抗体は、結合速度論に逆の効果を持たずに、その潜在的未複合化状態、また多重シャペロン複合体でのＨｓｐ９０と結合可能である。

ＷＯ０１／７６６２７は、（ｉ）ポリエンまたはベータグルカンシンターゼ阻害剤抗真菌薬、および（ｉｉ）真菌Ｈｓｐ９０に対して特異的な抗体、の組み合わせを含む、真菌感染症の処置に対する組成物であって、本質的にその抗真菌薬に対する耐性にも関わらず、感染を引き起こす真菌に対して効果的な組成物を示している。

本発明の第一の態様によれば、癌の処置のための薬剤の製造方法における、
（ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
（ｉｉ）ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセルおよびシスプラチンからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤
の使用が提供される。

ドキソルビシンは、抗腫瘍剤であるとすでに認識されたアントラサイクリン抗生物質剤である。

エピルビシンは、これも抗腫瘍剤としてすでに認識された、毒性が低い合成アントラサイクリン抗生物質である。

ダウノルビシンは、抗癌剤を含む、多数の治療領域において使用される抗新生物薬である。

ハーセプチン（トラストゥズマブ）は、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現転移性乳癌の処置のために使用されるモノクローナル抗体である。

ドセタキセルは、認知された抗癌剤であり、有糸***阻害剤である。

シスプラチンは認知された抗癌剤であり、白金複合体を含む。

以下の実験結果（「実験Ａ」）で詳述するように、ドキソルビシンおよびダウノルビシンが特に好ましく、抗Ｈｓｐ９０抗体と特に良好な相乗効果を示す。ハーセプチンもまた、抗Ｈｓｐ９０抗体と良好な相乗効果を示す。相乗効果はまた、抗Ｈｓｐ９０抗体と組み合わせた場合に、ドセタキセルとシスプラチンで観察される。ダウノルビシンと抗体間の相乗効果は、エストロゲンレセプター陽性細胞で特に明白であり、したがって抗体およびダウノルビシンを用いる薬剤および治療が、特に、エストロゲンレセプターを有する細胞に対してである（または投与される）。

実験（「実験Ａ」）はまた、抗Ｈｓｐ９０抗体と一緒に使用した場合、他の抗癌剤が、可もなく不可もない結果（パクリタキセル）または拮抗作用（イマチニブ）いずれかを示すことを示している。これは、抗Ｈｓｐ９０抗体と組み合わせた場合に、上記の抗癌剤で達成された相乗効果の驚くべき／予想外の性質を確かにする。

また、癌の処置における、同時、分離または連続使用のための、
（ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
（ｉｉ）ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセルおよびシスプラチンからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
を含む組み合わせ調製物が提供される。

また、必要としている患者に、治療的に効果的な量の、
（ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
（ｉｉ）ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセルおよびシスプラチンからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
を投与することを含む、癌の処置方法が提供される。

本明細書で使用するところの、語句「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、他に特に言及しない限り、広い意味を有することが意図される。したがって、「処置」または「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、ヒトまたは動物体の疾患または機能異常の症状を治癒させる、緩和する、除去するまたは少なくさせる、またはその可能性を防止または減少させるために設計される任意の処置を意味する。したがって、語句「処置」は、疾患状態の処置、ならびにその予防の両方を意味する。

抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１の配列を含むペプチドによって提示されるエピトープに対して特異的でありうる。

以上で議論したように、多重シャペロン複合体中のＨｓｐ９０によって提示される四つ組エピトープが、治療の適切な標的であると示唆されてきているが、実験（以下）によって、実際に、直線エピトープが治療に対して有用であり、効果的な標的であることが示されている。

抗体、それらの製造および使用は周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９にて開示されている。

抗体は、当分野で公知の標準的な方法を用いて産出してよい。抗体には、例えば、（限定はしないが）、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産出されるフラグメント、および抗体の抗原結合フラグメントが含まれる。

抗体は、例えばヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなど、種々の宿主中で産出してよい。これらに、真菌ストレスタンパク質、または免疫原特性を有するそれらの任意のフラグメントまたはオリゴペプチドを注射することによって免疫性を与えてよい。宿主種に依存して、種々のアジュバントを使用して、免疫応答を増加させることができる。このようなアジュバントには、限定はしないが、フロイド、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、およびリソレシチン、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油エマルジョン類、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールのような表面活性基質が含まれる。ヒトで使用されるアジュバントのうち、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に有用である。

真菌タンパク質、またはその任意のフラグメントまたはオリゴペプチドに対するモノクローナル抗体を、培養中での連続細胞株によって、抗体分子を産出するために提供される、任意の技術を用いて調製してよい。これらには、限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７；Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２，Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８０：２０２６−２０３０；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ，，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．７７−９６）が含まれる。

さらに、「キメラ抗体」の産出のために開発された技術、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るための、マウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングを使用可能である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５４）。あるいは、真菌ストレスタンパク質特異的一本鎖抗体を産出するために、当分野で公知の方法を用いて、一本鎖抗体の産出のために記述された技術を適合してよい。関連した特異性を有するが、異なるイディオタイプ組成の抗体を、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖をシャッフルすることによって産出してよい（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，１９９１，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８８：１１１２０−１１１２３）。

抗体を、リンパ球集団中でのｉｎ ｖｉｖｏ産出を誘導することによって、または高特異性結合試薬の、組換え体免疫グロブリンライブラリーまたはパネルをスクリーニングすることによって、産出してもよい（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８６：３８３３−３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３−２９９）。

抗原結合フラグメント、例えば抗体分子のペプシン消化によって産出可能なＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントの二硫化物橋の還元によって産出可能なＦａｂフラグメントをまた産出してもよい。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で簡単な同定を可能にすることができる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２７５−１２８１）。

種々の免疫アッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリーングに使用してよい。確立された特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナル抗体いずれかを用いる、競合結合または免疫放射定量測定法のための多数のプロトコルが当分野で周知である。このような免疫アッセイには、典型的には、真菌ストレスタンパク質またはその任意のフラグメントまたはオリゴペプチドと、その特異的な抗体間での複合体形成の測定が含まれる。２つの干渉しない真菌ストレスタンパク質エピトープに対して特異的なモノクローナル抗体を用いる、二部位のモノクローナルに基づく免疫アッセイを使用してよいが、競合結合アッセイもまた利用してよい（Ｍａｄｄｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：１２１１−１２１６）。

例えば、組成物または組み合わせ調製物にて使用した抗体は、配列番号２の配列を含みうる。

本発明者は、通常処置しうる癌に、乳癌、前立腺癌、黒色腫、白血病、リンパ腫、白血病、大腸癌、精巣生殖細胞癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌および肺癌からなる群より選択される、線維肉腫および癌が含まれることを発見した。

本発明の第二の態様によれば、白血病の処置のための薬剤の製造方法における、
（ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、
の使用が提供される。

また、白血病の処置のための薬剤の製造方法における、
（ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
（ｉｉ）イマチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシンおよびヒドロキシウレアからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
の使用が提供される。

２−フェニルアミノピリミジンの誘導体である、イマチニブは、タンパク質チロシンキナーゼに対する活性を有する小分子拮抗薬であり、Ｂｃｒ−Ａｂｌの強力かつ特異的な阻害を示す。イマチニブは、急性転化、急性期における、またはＩＦＮ治療の失敗後の慢性期における、ＣＭＬを患う患者の処置に適応される。

パクリタキセルは、いくつかの型の癌の処置として考えられる化学療法剤である。卵巣癌、乳癌および非小細胞肺癌を処置するために、最も一般的に使用される。

ドセタキセルは、認知された抗癌剤であり、有糸***阻害剤である。

ダウノルビシンは、抗癌剤としてを含む、多数の治療領域で使用される抗新生物薬である。

ドキソルビシンは、抗腫瘍剤であるとすでに認識されたアントラサイクリン抗生物質剤である。

ヒドロキシウレアは、抗新生物、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤である。

以下の実験結果にて詳述するように（「実験Ｂ」）、ドキセタキセルおよびパクリタキセルが特に好ましく、抗Ｈｓｐ９０抗体と特に良好な相乗効果を示す。相乗効果はまた、抗Ｈｓｐ９０抗体と組み合わせた場合に、イマチニブ、ドキソルビシン、ダウノルビシンおよびヒドロキシウレアで観察される。抗Ｈｓｐ９０抗体と一緒に使用した場合に、抗癌剤シスプラチンは可もなく不可もない結果を示した。このことは、抗Ｈｓｐ９０抗体と組み合わせた場合に、上記の抗癌剤で達成された相乗効果の驚くべき／予想外の性質を確かにする。

また、白血病の処置における同時、分離または連続使用のための、
（ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
（ｉｉ）イマチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシンおよびヒドロキシウレアからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
を含む組み合わせ調製物が提供される。

組み合わせ調製物には、例えば、別々の用量で、（ｉ）の抗体と、（ｉｉ）の少なくとも１つの抗癌剤を含む医薬品パックが含まれる（すなわち、単一調製物中で一緒に混合されない）。

また、必要としている患者に、治療的に効果的な量の、
（ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
（ｉｉ）イマチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシンおよびヒドロキシウレアからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
を投与することを含む、白血病の処置方法が提供される。

白血病は、慢性骨髄性白血病または急性リンパ性白血病であってよく、少なくとも１つの抗癌剤はイマチニブであってよい。

抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１の配列を含むペプチドによって提示されるエピトープに対して特異的であってよい。

例えば、組成物または組み合わせ調製物中で使用する抗体は、配列番号２の配列を含んでよい。

抗癌剤はイマチニブであってよい。

本発明者は、通常処置されうる白血病には、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病および急性リンパ性白血病からなる群より選択される白血病が含まれる。

白血病は、慢性骨髄性白血病または急性リンパ性白血病であってよい。

慢性骨髄性白血病は、Ｐｈ１陽性またはＰｈ１陰性であり、すなわち、フィラデルフィア染色体を含む（Ｐｈ１陽性）、またはフィラデルフィア染色体を欠く（Ｐｈ１陰性）白血病細胞によって特徴づけられる。

本発明者は、通常イマチニブで処置されうる慢性骨髄性白血病が、Ｐｈ１陽性またはＰｈ１陰性のいずれかでありうることを発見した。

白血病は、Ｐｈ１陽性の慢性骨髄性白血病であってよく、抗癌剤はイマチニブであってよい。特に、本発明者は、Ｐｈ１陽性のＣＭＬの処置が、配列番号２の配列を含む抗体およびイマチニブの組み合わせによって影響を受けうることを発見した。いかなる理論にも固執する意図はないが、Ｈｓｐ９０が、配列番号２の配列を含む抗体によって、隔離され、したがって、（ＣＭＬにて発見された異常骨髄造血を引き起こす）異常なＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼが、例えば誤って折りたたまれ、タンパク質分解の標的となり、および／または骨髄造血経路においてその効果を発揮することを防止することを意味する。

この処置は、イマチニブ耐性ＣＭＬ Ｐｈ１陽性細胞においてさらに効果的である。いかなる理論にも固執する意図はないが、イマチニブに対する耐性が、例えばタンパク質に対する結合から薬物を防止する、および／または薬物の活性様式を干渉しうる、異常なＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼにおける集結変異による可能性がある。イマチニブ耐性細胞において、配列番号２の配列を含む抗体による、Ｈｓｐ９０の隔離によって、変異導入異常チロシンキナーゼが、例えば誤って折りたたまれ、タンパク質分解の標的となり、および／または骨髄造血経路におけるその効果を発揮することが防止される。通常、異常なタンパク質への結合およびその発現の阻害によって、癌細胞と関連した遺伝的変異を「緩衝する」ように働くＨｓｐ９０の隔離によって、腫瘍細胞に対して、一緒に合成致死を証明するように、種々の変異が放出されうる。腫瘍細胞の遺伝的不安定性を欠く正常の細胞は、比較的影響を受けない。

さらに、とくに驚くべきことに、本発明者は、Ｐｈ１陰性であるＣＭＬの処置が、配列番号２の配列を含む抗体とイマチニブの組み合わせによって影響を受けうることを発見した。

白血病は、Ｐｈ１陰性の慢性骨髄性白血病であってよく、抗癌剤はイマチニブであってよい。

この発見は、Ｐｈ１陰性ＣＭＬ細胞が、Ｐｈ１陽性細胞と関連する異常なチロシンキナーゼタンパク質を欠くことから、驚くべきことである。しかしながら、いかなる理論にも固執する意図はないが、Ｐｈ１陰性細胞中の本キナーゼが低レベルまたは基底レベル（異常またはそれ以外のいずれか）である可能性があり、上述したように、Ｈｓｐ９０の隔離が配列番号２の配列を有する抗体によってであることは、チロシンキナーゼタンパク質が、誤って折りたたまれ、タンパク質分解の標的となり、および／または骨髄造血経路におけるその効果を発揮することを防止されることを意味する。また、Ｈｓｐ９０の隔離によって、腫瘍細胞によって、一緒に合成致死を証明するように、種々の変異が放出されうる。

Ｐｈ１陰性細胞における、イマチニブおよび抗Ｈｓｐ９０抗体の驚くべき効果は、ＴＥＬ（ＥＴＶ６）−ＡＢＬ融合の存在による可能性があり、これは、Ｐｈ１陰性ＣＭＬの２つの場合で実証されており（Ｋｒｙｓｔａｌ，ＧＷ，２００４，Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８Ｓ１：ｐＳ５３−Ｓ５９）、イマチニブに対して感受性である。

白血病は、イマチニブ耐性の細胞によって特徴づけられうる。

本発明の組成物または調製物はさらに、公知のＨｓｐ９０阻害剤、例えばＧＡまたは１７−ＡＡＧを含んでよい。

本発明の第三の態様（実験Ｃ）は、結腸直腸癌または腺癌の処置において、一緒に効果を増強する、抗Ｈｓｐ９０抗体とともに効果的な抗癌剤を含む、新規薬剤および調製物に関する。

結腸直腸癌は、大腸または回腸の悪性腫瘍である。結腸直腸癌は、癌罹患率および死亡率の主要な原因である。英国では、男性で三番目に多い癌であり、女性においては、二番目に多い癌である。９５パーセントの結腸直腸癌がアデノカルシノーマであり、これは、大腸および回腸の内部に並ぶ腺細胞の癌である。

結腸直腸癌の標準的な処置は、通常、５−フルオロウラシルおよびロイコボリン（ホリニル酸）の組み合わせである。

５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）が、胃−消化管癌および乳癌を含む、多数の固形癌を処置するために使用される。進行性結腸直腸癌にて、ホリニル酸とともに一般的に使用される。５−ＦＵは、細胞内で、ＦｄＵＭＰに変換され、ＤＮＡ、タンパク質およびＲＮＡ合成を阻害するチミジン酸シンターゼ（ＴＳ）と複合体を形成する。

ホリニル酸（ロイコボリン）は、５−ＦＵとの組み合わせで与えられるビタミンである。ホリニル酸は、５−フルオロウラシルに対する応答速度を増加させ、疾患のない、そして全生存の有意な改善を伴う。ホリニル酸は、細胞内葉酸を増加させ、ＦｄＵＭＰ／ＴＳ複合体を安定化させる。

効果を持つと分かった他の薬剤には、５−フルオロウラシルおよびホリニル酸との組み合わせで、進行した結腸直腸癌の患者に最初に使用することが許諾されている、イリノテカンおよびオキサリプラチンが含まれる。イリノテカンまたはラルチトレキシドが、フルオロウラシルに基づく治療が失敗したとき、または不適切なときに、二次単剤療法として使用されることが許諾されている。

オキサリプラチンは、認知された抗癌剤であり、ＤＮＡ中に架橋を形成し、したがってＤＮＡ複製を阻害する、新規のジアミノシクロヘキサン白金化合物を含む。

「ＦＯＬＦＯＸ」は、５−フルオロウラシル、ホリニル酸およびオキサリプラチンの、一般的に使用される組み合わせ化学療法である。

イリノテカン（ＣＰＴ−１１、Ｃａｍｐｔｏ）は、細胞***のために必須のＤＮＡ巻き戻し酵素である、トポイソメラーゼＩを阻害し、結果として、一本鎖ＤＮＡ中で中断される複製停止となる。英国では、イリノテカンは、５ＦＵ／ＦＡとの組み合わせで、進行した結腸直腸癌の化学療法を受けたことがない患者での使用のために、そして、確立された５ＦＵに基づくレジメを失敗した患者での二次化学療法のための単剤として、許諾されている。

ラルチトレキシド（ＺＤ １６９４、Ｔｏｍｕｄｅｘ）は、ＤＮＡ合成に関与する酵素チミジン酸シンターゼを阻害する。これは、５ＦＵの標的にされる同一の酵素である。ラルチトレキシドは、英国において、５ＦＵ／ＦＡに基づくレジメが許容されないか、または不適切である、進行性結腸直腸癌の緩和処置のために許諾されている。

Ｔｅｂｂｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，３８：１０００−１０１５；Ｃｕｔｓｅｍ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１６：３１９−３３０；Ｂｅｒｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１３：６３−７３；進行性結腸直腸癌に対する、イリノテカン、キサリプラチンおよびラルチトレキシドに関するＮＩＣＥガイドライン、２００２。

本発明の第三の態様によれば、癌の処置のための薬剤の製造方法における、
（ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
（ｉｉ）５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカンおよびラルチトレキシドからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
の使用が提供される。

あるいは、癌の処置における、同時、分離または連続使用のための、
（ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
（ｉｉ）５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカンおよびラルチトレキシドからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
を含む組み合わせ調製物が提供される。

本発明のまたさらなる態様によれば、必要としている患者に、治療的に効果的な量の、
（ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
（ｉｉ）５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカンおよびラルチトレキシドからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
を投与することを含む、癌の処置方法が提供される。

好ましくは、癌は、結腸直腸癌または腺癌である。

最も好ましくは、抗癌剤５−フルオロウラシルがさらに含まれ、ホリニル酸（ロイコボリン）とともに投与される。

さらにまたはあるいは、５−フルオロウラシル、ホリニル酸およびオキサリプラチンが一緒に投与される。

本発明のいずれかの態様による組成物または調製物はさらに、薬理学的に許容可能な担体、希釈液または賦形剤を含んでよい。同様に、本発明の任意の製造方法、またはその利用にはまた、薬理学的に許容可能な担体、希釈液または賦形剤の利用が含まれうる。薬理学的に許容可能な担体、希釈液および賦形剤の例は、当分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（１９８４，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を参照のこと。

薬剤または組み合わせ調製物は例えば、他の投与経路が除外されることを意味しないが、経口で投与してよい。

本発明にしたがった抗体またはその抗原結合フラグメントは、従来の手順を用いて、検出可能な標識で標識してよく、またはエフェクタ分子、例えば薬物、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、ドセタキセルまたはシスプラチンまたは５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカンおよびラルチトレキシドのような抗癌剤、またはイマチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシンおよびヒドロキシウレアなどの白血病を処置する際に有用な医薬品、またはリシンのような毒性または酵素と共役してよく、本発明は、このような標識化された抗体または抗体共役物まで拡張する。

必要に応じて、例えば２つ以上の本発明にしたがったストレスタンパク質の異なるエピトープを認識する抗体の混合、および／または異なるクラスの抗体の混合、例えば、本発明の同一または異なるエピトープ（類）を認識するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の混合、を診断または処置のために使用してよい。

以上で議論したように、多重シャペロン複合体でのＨｓｐ９０によって提示される四つ組エピトープが、治療のための適切な標的として示唆されてきているが、実験（以下）により、実際に直線エピトープが治療のための有用で効果的な標的であることが示される。

そこで引用された参考文献を含む、本明細書で議論された各参考文献の内容全てが、参照により本明細書に組み込まれる。

「ＰＭＩＤ：」参考文献番号を、発行物に対して付ける場合、ＰｕｂＭｅｄ同定番号が、米国国立医学図書館（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）によって割り当てられ、それより、各発行物に対する完全な図書目録情報および要約が、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにて利用可能である。またこれにより、特に例えばＰＮＡＳ、ＪＢＣおよびＭＢＣ発行物の場合、完全な発行物の電子コピーに対して直接アクセスすることが可能になる。

本発明は、さらに、以下の記述から明らかであり、以下は、組成物およびそれによる実験の特異的な実施様態を、ほんの一例として示している。

実験
第一組の実験（「実験Ａ」）は、以下詳細に、それ自身、または抗癌剤ドキソルビシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ハーセプチン、イマチニブ、シスプラチンおよびパクリタキセルとの組み合わせで使用される、配列番号２の配列を有し、配列番号１の配列を有するペプチドによって提示されるエピトープに対して特異的な、抗Ｈｓｐ９０抗体の抗癌効果の調査を記述している。

第二組の実験（「実験Ｂ」）は、以下詳細に、白人慢性骨髄性白血病株Ｋ５６２、ヒト骨髄性白血病細胞株ＫＵ−８１２に対する、それ自身、または抗癌剤イマチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシン、パクリタキセル、シスプラチンおよびヒドロキシウレアとの組み合わせで使用される、配列番号２の配列を有し、配列番号１の配列を有するペプチドによって提示されるエピトープに対して特異的な、抗Ｈｓｐ９０抗体の効果の調査を記述している。

第三組の実験（「実験Ｃ」）は、以下詳細に、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ２９に対する、それ自身、または抗癌剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびホリニン酸（ロイコボリン、ＬＶ）および／またはオキサリプラチンとの組み合わせで使用される、配列番号２の配列を有し、配列番号１の配列を有するペプチドによって提示されるエピトープに対して特異的な、抗Ｈｓｐ９０抗体の効果の調査を記述している。

一般物質および方法
他に言及しない限り、全ての手順は、適用可能である場合に、標準のプロトコルおよび以下の取扱説明書を用いて実施した。ＰＣＲ、分子クローニング、操作およびシークエンシング、抗体の製造、エピトープマッピングとミモトープ設計、細胞培養およびファージディスプレイを含む、種々の技術に対する標準のプロトコルが、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ＭＪら（１９９１，ＰＣＲ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１，Ｈｕｙｎｈ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（１９８５，“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌ Ｉ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｄ．ＤＭ Ｇｌｏｖｅｒ），Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９７７，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７４（１２）：５４６３−５４６７），Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．（“Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８），Ｊｕｎｇ、Ｇ．ａｎｄ Ｂｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ，ＡＧ（１９９２，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．，３１：３６７−４８６），Ｈａｒｒｉｓ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｒａｅ，Ｉ．Ｆ．（“Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”，１９９７，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０５２１ ５７３６４５），“Ｐｈａｒｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｅｄｓ．Ｋａｙ，ＢＫ，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，１９９６，ＩＳＢＮ ０−１２−４０２３８０−０）のような文献に記載されている。

特に、本明細書で詳述した方法にて有用な試薬および機器は、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（ｗｗｗ．ａｍｅｒｓｈａｍ．ｃｏ．ｕｋ）、べーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）（ｗｗｗ．ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−ｉｎｇｅｌｔｈｅｉｍ．ｃｏｍ）、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）、ジェノシス（Ｇｅｎｏｓｙｓ）（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｓｙｓ．ｃｏｍ）、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）（ｗｗｗ．ｎｏｖａｇｅｎ．ｃｏｍ）、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）（ｗｗｗ．ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ．ｃｏｍ）、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ｗｗｗ．ｐｈａｒｍａｃｉａ．ｃｏｍ）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ）、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）、およびストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ）などから入手可能である。

抗体
以下実験ＡおよびＢで使用した抗体は、ＷＯ０１／７６６２７に開示されたものであり、本明細書でＭｙｃｏｇｒａｂ（ＲＴＭ）と呼ぶ。この抗体は、配列番号２の配列を有し、配列番号１の配列を有するペプチドによって提示されるエピトープに対して特異的である。基礎抗体溶液は、水中の４ｍｇ／ｍｌ保存溶液であった。さらなる希釈を、ＲＰＭＩ完全培地中で実施した。

簡単に記すと、英国特許第２２４０９７９号および欧州特許第０４０６０２９号に開示された、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｈｓｐ９０エピトープに対して特異的な元の抗体のＤＮＡ配列を、コドン最適化によって遺伝的に改変して大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（オペロン テクノロジーズ社（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．），Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で発現させ、大腸菌発現ベクター中に挿入した。抗Ｈｓｐ９０抗体のアミノ酸配列には、配列番号２（重鎖、軽鎖およびスペーサードメイン）の配列が含まれる。抗体は、配列番号１の配列を含むエピトープを認識する。

抗Ｈｓｐ９０抗体を、大腸菌宿主中で発現させ、次いでアフィニティクロマトグラフィーおよびイミダゾール交換カラムによって、９５％純度まで精製した。標準分子生物学的プロトコルを使用した（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒを参照のこと）。

薬物
シスプラチンは、ブリストル・マイヤーズ スクイーブ、Ｍａｙｎｅ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｍａｙｎｅ）より得、１ｍｇ／ｍｌで供給した。

ドセタキセルを、シグマ（Ｓｉｇｍａ）より得た。５ｍｇをまず、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）にて、１６ｍｇ／ｍｌまで希釈した。

ドキソルビシンをファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）より得た。塩酸ドキソルビシン２ｍｇ／ｍｌとして５ｍｌ供給した。

ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）から得た、イマチニブ（Ｇｌｉｖｅｃ（ＲＴＭ））を、１００ｍｇカプセルとして供給した。イマチニブをまず水中で希釈して、１０ｍｇ／ｍｌ保存溶液を作製した。

パクリタキセルをシグマより得、２５０μｌメタノール中で再構築して、水で２．５ｍｌまでにし、２ｍｇ／ｍｌを得た。

ダウノルビシンをシグマより得、５ｍｇを２．５ｍｌ水中で希釈して、２ｍｇ／ｍｌを得た。

ハーセプチン（ＲＴＭ）（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）をロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）より得、７．２ｍｌの水中で再構築し、２１ｍｇ／ｍｌを得た。

ヒドロキシウレアを、シグマより得、４ｍｌ水中で１ｇを希釈し、２５ｍｇ／ｍｌを得た。

５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）をシグマより得、９６ｍｇを完全ＲＰＭＩ培地中で１／１０希釈した１ｍｌ ＤＭＳＯ中で再構築し、９．６ｍｇ／ｍｌを得た。

ホリニル酸（ＬＶ）をシグマより得、１００ｍｇを２５ｍｌの水で再構築して、４ｍｇ／ｍｌ保存溶液を得た。

オキサリプラチンをシグマより得、１２．５ｍｇを２．５ｍｌの水で再構築して、５ｍｇ／ｍｌを得た。

各上記薬物をさらに、ＲＰＭＩ完全倍中で希釈した。

細胞濃度および生存率決定
細胞を計数し、等量の０．４％トリパンブルー溶液（シグマ）で染色した後、標準の血球計を用いて、パーセント生存を決定した。

細胞生存率アッセイ
細胞生存率を、細胞タイターブルーアッセイ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて、各実験後に査定した。培地を細胞から除去し、１００μｌの新鮮な完全培地、続いて２０μｌの細胞タイターブルー試薬を加えた。これを、３７℃、５％ＣＯ_２にて４時間インキュベートし、６００ｎｍを基準として、吸収度は５７０ｎｍであった。このアッセイは、インジケータ色素レサズリン（青色）を用いて細胞の代謝能力を測定する。生細胞は、レサズリンをレソルフィン（ピンク色）に還元する。

データ解釈
細胞増殖を、上述のように評価した。ＩＣ_５０（５０％の細胞で細胞毒性を引き起こすのに必要な用量）濃度を、４８時間インキュベーション期間にわたって、各薬物に関して単独で決定した。

平均効果解析、Ｈｉｌｌ等式に基づく相乗効果、相加効果、または拮抗作用の測定を、Ｃａｌｃｕｓｙｎ製品（バイオソフト（ＢｉｏＳｏｆｔ），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ−ｗｗｗ．ｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ）を用いて、Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙの方法によって決定した。１未満の場合相乗効果を、１と等しい場合相加効果を、そして１より大きい場合拮抗作用を反映するＣＩ（組み合わせ指標）を、薬物効果のレベルを変えて計算した。Ｎが個々の薬物のＩＣ_５０付近の値である場合、０．０１５６Ｎ〜８Ｎの範囲でＩＣ_５０（５０％細胞毒性効果を発揮するのに必要な薬物の濃度）より大きいまたは小さい１０の固定薬物比を、細胞と一緒に４８時間、薬物混合物をインキュベートし、次いで細胞傷害性の程度を決定することによって調査した。Ｆａ５０を、５０％の細胞が影響を受ける点で定義する。ＣＩ値をＦａ５０に関して示す。

実験Ａ
この結果から、抗体が、イマチニブとの拮抗作用の兆候（ｅｖｉｄｅｎｃｅ）を示し、パクリタキセルと無関連であることが分かる。シスプラチンと、そしてドセタキセルと相乗効果があるが、後者は、臨床的に達成不可能な濃度での可能性である。ドキソルビシンは、両方の細胞株と、臨床的に達成可能な薬物レベルで相乗効果を示し、エストロゲンレセプターが存在することに依存しない。ドキソルビシンで達成された結果は、非常に有意な相乗効果として評価する。ダウノルビシンの結果は、エストロゲンレセプターを有する細胞株で同様に目立つが、エストロゲンレセプター陰性細胞株でより低く、相乗効果は、６および１２．５ｍｇ／ｌに制限された。ハーセプチンに対する結果により、エストロゲンレセプター陽性細胞株に対して相乗効果がないが、エストロゲンレセプター陰性細胞株で相乗効果が観察されたことが示される。

物質と方法
細胞株および培養情報
野生型およびバリアントエストロゲンレセプターの両方、ならびにプロゲステロンレセプターを発現しているヒト白人乳癌細胞株ＭＣＦ７を、ＥＣＡＣＣ（ＥＣＡＣＣ番号−８６０１２８０３）より得た。

使用した他の細胞株は以下の通りである。
ＨＳ５７８Ｔ−ＥＣＡＣＣ番号８６０８２１０４、ヒト乳癌、上皮。免疫抑制マウス中で腫瘍形成し、半固体培地中でコロニーを形成する。エストロゲンレセプター陰性。
ＳＫ−ＢＲ−３−（ＡＴＣＣ）ヒト乳癌。エストロゲンレセプター陰性。ＨＥＲ２／Ｃ−ｅｒｂ−２遺伝子を過剰発現する。
ＵＡＣＣ−８１２−（ＡＴＣＣ）腺管癌。手術前に、患者が大規模な化学療法を受けた。エストロゲンレセプター陰性、プロゲステロンレセプター陰性、Ｐ糖タンパク質陰性。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子配列の増幅。
ＨＣＴ−１１６−ＡＴＣＣ結腸直腸癌。ＴＧＦベータ１およびベータ２発現に対して陽性。

細胞を、０．２５％ トリプシン／ＥＤＴＡ（シグマ）を用いて分画（ｓｐｌｉｔ）し、１０％ウシ胎児血清、１％非必須アミノ酸、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ）を含む、フェノールレッドなしのＲＰＭＩ培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２中で維持した。

実験Ａ
ＭＣＦ７細胞におけるミコグラブの効果
細胞株を分画し、細胞を計数した。細胞を１２ウェルまたは９６ウェル平底組織培養プレートに加えた。１２ウェルプレートの場合、１ｍｌの４×１０^４細胞／ｍｌを１ｍｌの培地とともに加えた。９６ウェルプレートの場合、１００μｌの４×１０^４細胞／ｍｌを加え、続いて、さらに１００μｌの完全培地をプレートに加えた。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ_２にて一晩インキュベートした。翌日、細胞を位相差顕微鏡下で観察して、プレートに接着したことを確かめ、吸引によって、上清培地を除去した。次いで、２倍増濃度のミコグラブ（１．５〜２００μｇ／ｍｌ）または処方緩衝液を含む新鮮な培地、または培地のみをウェルに加えた。プレートを、４８時間インキュベーターに戻し、続いて細胞タイターブルーアッセイを実施するか、可視計測を血球計を用いて実施した。

ＭＣＦ７細胞に対する、抗癌剤ドキソルビシン、ダウノルビシン、ハーセプチン、ドセタキセル、イマチニブ、パクリタキセルおよびシスプラチンの効果
細胞株を分画し、細胞を計数した。１００μｌの４×１０^４細胞／ｍｌを９６ウェル平底組織培養プレートに加え、さらに１００μｌの完全培地をこのプレートに加えた。次いでプレートを一晩、３７℃、５％ＣＯ_２にてインキュベートした。翌日、細胞を位相差顕微鏡下で観察して、プレートに接着したことを確かめ、吸引によって、上清培地を除去した。種々の濃度の試験薬物（ドキソルビシン０．５５〜６００μｇ／ｍｌ、ダウノルビシン０．４５〜１０００μｇ／ｍｌ、ハーセプチン０．２〜２００μｇ／ｍｌ、ドセタキセル０．７５〜８００μｇ／ｍｌ、イマチニブ４．５〜５０００μｇ／ｍｌ、シスプラチン０．０４〜５０μｇ／ｍｌ、パクリタキセル１．８〜１０００μｇ／ｍｌ）を含む新鮮な培地、または培地のみをウェルに加えた。プレートを４８時間インキュベーターに戻し、続いて細胞タイターブルーアッセイを実施した。

ＭＣＦ７細胞に対する、抗癌剤ドキソルビシン、ダウノルビシン、ハーセプチン、ドセタキセル、イマチニブ、パクリタキセルおよびシスプラチンとの組み合わせでの、ミコグラブの効果
細胞株をスプリットし、細胞を計数した。１００μｌの４×１０^４細胞／ｍｌを９６ウェル平底組織培養プレートに加え、さらに１００μｌの完全培地をこのプレートに加えた。次いでプレートを一晩、３７℃、５％ＣＯ_２にてインキュベートした。翌日、細胞を位相差顕微鏡下で観察して、プレートに接着したことを確かめ、吸引によって、上清培地を除去した。１００μｌの新鮮な培地をプレートに加え、ミコグラブ対他の薬物の交差（ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ）を（ドキソルビシンを例として用いて）以下の表１で概略したように設定し、ウェルあたり総量２００μｌとした。

プレートを４８時間インキュベーターに戻し、続いて細胞タイターブルーアッセイを実施した。

実験をまた、以上の方法を使用して、ＨＳ５７８Ｔ細胞で実施した。結果を以下に示す。

実験Ａの結果
ＭＣＦ７細胞株
シスプラチン
ＩＣ_５０は６ｍｇ／ｌであり、高濃度での相乗効果を除き、ミコグラブを加えたことにおいて効果はなかった。表２を参照。

イマチニブ
ＩＣ_５０は３７．５ｍｇ／ｌであり、３７．５ｍｇ／ｌ未満のイマチニブ濃度で、ミコグラブと、３．３〜１０の範囲のＣＩｓにて、拮抗作用がみられた。

ドセタキセル
ＩＣ_５０は２２５ｍｇ／ｌであり、高濃度のドセタキセルにて、ミコグラブとのわずかな相乗効果の兆候がみられた。表３を参照。

パクリタキセル
ＩＣ_５０は２２５ｍｇ／ｌであり、低濃度の薬物ではなにもなく、５００ｍｇ／ｌのパクリタキセルのような高レベルで穏やかな相乗効果があった。これらのレベルは、臨床的に関連するレベル外である。

ドキソルビシン
ＩＣ_５０は１．７５ｍｇ／ｌであった。広い範囲の薬物濃度にて、ミコグラブとの明確な相乗効果が存在した。表４を参照。

ダウノルビシン
ＩＣ_５０は１ｍｇ／ｌであった。広い範囲の薬物濃度にて、ミコグラブとの相乗効果の兆候がみられた。表５を参照。

ハーセプチン
ハーセプチンによる検出可能な活性は存在せず、相乗効果の兆候もなかった。

ＨＳ５７８Ｔ細胞株
本細胞株は、４００ｍｇ／ｌまで濃度を増加させても、ミコグラブに対して不感受性であった。これは、これらの腫瘍がステロイド感受性であり、したがって、ミコグラブのようなＨｓｐ９０阻害剤に対して応答を本質的にする可能性がないことから、驚くべきことではない。しかしながら、アントラサイクリン ドキソルビシンならびにダウノルビシン、およびハーセプチンとの組み合わせにおいて、予想しない相乗効果が存在した。

ドキソルビシン
ＩＣ_５０は１ｍｇ／ｌであった。広範囲の薬物濃度にて、ミコグラブとの相乗効果の兆候がみられた。表６を参照。

ダウノルビシン
ＩＣ_５０は１ｍｇ／ｌであった。ミコグラブとわずかな相乗効果の兆候はあったが、ほとんど無関係であった。表７を参照。

ハーセプチン
ＨＳ５７８Ｔにて、単独ハーセプチンは、２００ｍｇ／ｌまでの濃度で５０％の細胞を殺し損ねたが、ミコグラブの存在下で、相乗効果が観察された表８を参照。

ドセタキセル
細胞株ＨＳ５７８Ｔに関して、５０ｍｇ／ｌのＩＣ_５０を与え、ミコグラブとの相乗効果の兆候は示さなかった。

シスプラチン
シスプラチンは、細胞株ＨＳ５７８Ｔに関して、１２．５ｍｇ／ｌのＩＣ_５０を持ち、ミコグラブとの相乗効果の兆候はなかった。

結論
イマチニブとの拮抗作用の兆候があり、そしてパクリタキセルとは無関係であった。シスプラチンと、およびドセタキセルとはわずかな相乗効果があったが、後者はおそらく、臨床的に達成不可能な濃度においてである。ドキソルビシンは、両方の細胞株にて、エストロゲンレセプターが存在するかどうかに関係なく、臨床的に達成可能な薬物レベルにて相乗効果を示した。ドキソルビシンで達成された結果は、非常に有意な相乗効果と評価した。ダウノルビシンの結果は、エストロゲンレセプターを有する細胞株で同様に目立つが、エストロゲン陰性細胞株では少なく、相互作用は、６および１２．５ｍｇ／ｌに制限された。

以上の驚くべき相乗効果は、抗体と特定の抗癌剤で観察されたが、イマチニブのような他の抗癌剤では見られなかった。

実験Ｂ
第二組の実験（以下に記述）は、白人慢性骨髄性白血病株Ｋ５６２、ヒト骨髄性白血病細胞株ＫＵ−８１２に対する、それ自身、または抗癌剤イマチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシン、パクリタキセル、シスプラチンおよびヒドロキシウレアとの組み合わせで使用される、配列番号２の配列を有し、配列番号１の配列を有するペプチドによって提示されるエピトープに対して特異的である、抗Ｈｓｐ−９０抗体の効果の調査を詳述している。

この結果から、抗体はイマチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシンとの相乗効果の兆候を示したことが分かる。抗体は、ダウノルビシンおよびヒドロキシウレアとわずかな相乗効果の兆候を示した。この結果から、抗体は、シスプラチンと無関係である兆候を示したことが分かる。

ドセタキセルおよびパクリタキセルによって達成された結果を、非常に有意な相乗効果であると評価する。

物質と方法
細胞株および培養情報
ヒト骨髄性白血病細胞株ＫＵ−８１２を、ＥＣＡＣＣ（ＥＣＡＣＣ番号９００７１８０７）から得た。フィラデルフィア染色体（Ｐｈ１）が、本細胞株で検出されている。細胞は、好塩基球の形態学的特性である。

ヒト白人慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２を、ＥＣＡＣＣ（ＥＣＡＣＣ番号８９１２１４０７）より得た。Ｋ５６２は、末端芽危機にて慢性骨髄性白血病の５３歳女性の胸膜滲出より確立された。種々のＫ−５６２サブラインにおける核学的研究により、３つの群（Ａ、Ｂ、Ｃ）に分類された（Ｄｉｍｅｒｙ，Ｉ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．；１１（７）：ｐ６０１−１０）。本実験で使用した株は、Ｋ５６２Ｂであった。実験によって、これらの株が、形態、液体懸濁培養液中での増殖速度論、軟寒天培養中でのクローニング効率、抗Ｋ５６２モノクローナル抗体の結合および細胞表面タンパク質に関して、遺伝的に類似していることが示された。Ｋ５６２Ｂを、増殖速度、細胞表面タンパク質マーカー、表面抗原、細胞遺伝学およびヘモグロビン産出に関して、Ｋ５６２ＡおよびＫ５６２Ｃと比較した。細胞間で差異が観察され、最も重要な差異は、９０％を超えるＫ５６２ＡまたはＣ細胞がＰｈ１陽性であるように見え、１５％未満のＫ５６２Ｂ細胞がＰｈ１を含んだことである（Ｄｉｍｅｒｙ，ＩＷ，ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．；１１（７）：ｐ６０１−１０）。細胞毒性試験では、純粋なＰｈ１染色体の存在を明らかにしてはいないが、Ｋ５６２が、Ｐｈ１染色体の部分を含んでいるように見え、少なくとも４倍増幅されている。このＰｈ１染色体の部分は、キメラｂｃｒ／ｃ−ａｂｌ転写物をコードしており、転写された場合に、ｂｃｒ／ｃ−ａｂｌ融合タンパク質を産出する（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，Ｎｏ．２：ｐ６０７−６１６）。ｂｃｒ／ｂ−ａｂｌ融合タンパク質は、ＣＭＬの病因と関連する活性化チロシンキナーゼ活性を有する。

細胞を、フェノールレッドを含まず、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ）を含むＲＰＭＩ培地１６４０中で、３７℃、５％ＣＯ_２にて、２×１０^６〜９×１０^６細胞／ｍｌに維持した。

実験
Ｋ５６２細胞に対するミコグラブの効果
細胞株を計数した。細胞を、４×１０^５細胞／ｍｌを含む１００μｌの分液を用いて、９６ウェル平底組織培養プレートに加えた。２倍濃度の種々の濃度のミコグラブ（ＲＴＭ）（１．５〜２００μｇ／ｍｌ）を含む新鮮な培地、または培地のみをウェルに加えた。プレートを、４８時間インキュベーターに戻し、続いて細胞タイターブルーアッセイを実施するか、または血球計を用いて生計数を決定した。

Ｋ５６２細胞に対する抗癌剤ドキソルビシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、パクリタキセル、イマチニブ、シスプラチンおよびヒドロキシウレアの効果
細胞株を計数した。１００μｌの２×１０^５または４×１０^５細胞／ｍｌを、９６ウェル平底組織培養プレートに加えた。次いでプレートを３７℃、５％ＣＯ_２にて一晩インキュベートした。種々の濃度の試験薬物（ドキソルビシン０．５５〜６００μｇ／ｍｌ、ダウノルビシン０．０７〜１００μｇ／ｍｌ、ドセタキセル０．７５〜８００μｇ／ｍｌ、パクリタキセル０．５〜５００μｇ／ｍｌ、イマチニブ４．５〜５０００μｇ／ｍｌ、シスプラチン０．０４〜５０μｇ／ｍｌ）を含む新鮮な培地、または培地のみをウェルに加えた。プレートを４８時間インキュベーターに戻し、続いて細胞タイターブルーアッセイを実施した。

Ｋ５６２細胞に対する抗癌剤ドキソルビシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、パクリタキセル、イマチニブ、シスプラチンおよびヒドロキシウレアの効果
細胞株を計数した。１００μｌの２×１０^５または４×１０^５細胞／ｍｌを、９６ウェル平底組織培養プレートに加えた。次いでプレートを３７℃、５％ＣＯ_２にて一晩インキュベートした。１００μｌの新鮮な培地をプレートに加え、ミコグラブ対他の薬物の交差を、（ダウノルビシンを例として使用して）以下表９で概略したように設定し、ウェルあたり総量２００μｌとした。

実験をまた、以上の方法を用いて、ＫＵ−８１２細胞にて実施た。結果を以下に示す。

結果
Ｋ５６２細胞に対するミコグラブ（ＲＴＭ）の効果
細胞株Ｋ５６２にて、１２．５μｇ／ｍｌで、それ自身ミコグラブは、細胞生存率の４０％減少を示した。

Ｋ５６２細胞に対するミコグラブ（ＲＴＭ）と抗癌剤の効果
イマチニブ
ＩＣ_５０は１６μｇ／ｍｌであった。広範囲の薬物濃度にて、イマチニブとミコグラブ（ＲＴＭ）間で相乗効果のわずかな兆候が存在した（表１０を参照）。

ドキソルビシン
ＩＣ_５０は１μｇ／ｍｌであった。いくつかの薬物濃度で、ドキソルビシンとミコグラブ（ＲＴＭ）間で相乗効果のわずかな兆候が存在したが、ミコグラブ（ＲＴＭ）とはほとんど関係しなかった。

ダウノルビシン
ＩＣ_５０は０．７５μｇ／ｍｌであった。低薬物濃度で、ダウノルビシンとミコグラブ（ＲＴＭ）間で相乗効果のわずかな兆候が存在した（表１１を参照）。

ドセタキセル
ＩＣ_５０は７０μｇ／ｍｌであった。広範囲の薬物濃度で、ドセタキセルとミコグラブ（ＲＴＭ）間で相乗効果の明らかな兆候が存在した（表１２を参照）。

パクリタキセル
ＩＣ_５０は３２μｇ／ｍｌであった。広範囲の薬物濃度で、パクリタキセルとミコグラブ（ＲＴＭ）間で相乗効果の明らかな兆候が存在した（表１３を参照）。

シスプラチン
ＩＣ_５０は１２．５μｇ／ｍｌであった。シスプラチンとミコグラブ（ＲＴＭ）間で相乗効果の兆候は存在しなかった。

ヒドロキシウレア
ＩＣ_５０は、単剤としてのヒドロキシウレアに達しなかった。しかしながら、低薬物濃度にて、ヒドロキシウレアとミコグラブ（ＲＴＭ）間で相乗効果のわずかな兆候が存在した（表１４を参照のこと）。

ＫＵ−８１２細胞株
ＫＵ−８１２細胞に対するミコグラブ（ＲＴＭ）の効果
細胞株ＫＵ−８１２にて、５０μｇ／ｍｌで、それ自身ミコグラブは、細胞生存率の４０％減少を示した。

ＫＵ−８１２細胞に対するミコグラブ（ＲＴＭ）と抗癌剤の効果
イマチニブ
ＩＣ_５０は０．１２μｇ／ｍｌであった。低薬物濃度にて、イマチニブおよびミコグラブ（ＲＴＭ）間で相乗効果のわずかな兆候が存在した（表１５を参照のこと）。

要約
Ｋ５６２細胞株を用いて、イマチニブ、パクリタキセルおよびドセタキセルとの相乗効果の兆候が存在した。ダウノルビシン、ドキソルビシンおよびヒドロキシウレアとは、わずかな相乗効果の兆候が存在した。シスプラチンとは関連性は見られなかった。

ＫＵ−８１２細胞株を用いて、イマチニブとわずかな相乗効果の兆候が存在した。

結論
本明細書で示したデータは、ミコグラブ（ＲＴＭ）抗体がそれ自身で、Ｐｈ１陽性ＣＭＬ細胞株およびＰｈ１陰性ＣＭＬ細胞株の両方の生存率を減少させうることを明確に示している。さらに、Ｐｈ１陽性ＣＭＬ細胞株において、イマチニブを含む抗癌剤と、抗Ｈｓｐ９０抗体との間で驚くべき相乗効果が存在する。データはまた、Ｐｈ１陽性白血病細胞株において、抗Ｈｓｐ９０抗体と、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ヒドロキシウレアとの間で相乗効果が存在することも示している。これらの結果により、ＣＭＬの処置に対して、抗Ｈｓｐ９０抗体（ミコグラブ、ＲＴＭ）と一緒に、イマチニブのような抗癌剤を含む組成物の使用が可能である。抗癌剤とミコグラブ（ＲＴＭ）抗体の組み合わせによって示された相乗効果は、本質的に、特にイマチニブで、多くの抗癌剤の問題となる毒性を極めて有意に与えうる、より低い処置用量、または同一の用量で、より効果的でより長い処置のいずれかを可能にし、したがって、望ましくない副作用を減少させる。

本発明の臨床上の意義には、（ｉ）ＣＭＬの処置における、抗Ｈｓｐ９０抗体と、例えばイマチニブのような抗癌剤の相乗的組み合わせの産出が、選択処置となるべきであり、このことによっておそらく、ＣＭＬに対する死亡率の減少を導く；（ｉｉ）イマチニブは毒性であり、本発明によって提供された相乗効果が、効果を維持し、同時に毒性を減少させながら、低容量のイマチニブを使用可能であることを意味する；および（ｉｉｉ）抗ｈｓｐ９０の毒性節約効果によって、暴露されたより高用量のイマチニブの臨床効果を可能とし、さらに臨床結果の改善に関与する。

実験Ｃ
第三組の実験（「実験Ｃ」）は、ヒト結腸腺癌細胞株ＨＴ２９に対する、それ自身、または抗癌剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびホリニン酸（ロイコボリン、ＬＶ）および／またはオキサリプラチンとの組み合わせで使用される、配列番号２の配列を有し、配列番号１の配列を有するペプチドによって提示されるエピトープに対して特異的な、抗Ｈｓｐ９０抗体の効果の調査を詳述している。

この結果により、抗体は、５−ＦＵおよびホリニル酸と、およびオキサリプラチンと相乗効果の兆候を示したことが分かる。また、５−ＦＵ、ホリニル酸およびオキサリプラチンと、ミコグラブ／抗Ｈｓｐ９０抗体の薬物組み合わせで、相乗効果の兆候が見られた。７５μｇ／ｍｌを超える濃度の５−ＦＵと、１０．５μｇ／ｍｌのオキサリプラチンが特に有用であることが分かった。

物質と方法
細胞株と培養情報
ヒト白人結腸腺癌グレードＩＩ細胞株ＨＴ２９を、ＥＣＡＣＣ（ＥＣＡＣＣ番号９１０７２２０１）から得た。

細胞を、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（シグマ）を用いて分画し、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕペニシリン、０．１ｍｇストレプトマイシン（シグマ）を含む、ＭｏＣｏｙ’ｓ ５ａ培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２にて維持した。

他の細胞株にはＨＣＴ１１６が含まれた。

実験
ＨＴ２９細胞に対するミコグラブ（ＲＴＭ）の効果
細胞株を分画し、細胞を計数した。細胞を１２ウェルまたは９６ウェル平底組織培養プレートに加えた。１２ウェルプレートの場合、１ｍｌの４×１０^４細胞／ｍｌまたは４×１０^５細胞／ｍｌを各ウェルに加え、完全ＭｏＣｏｙ’ｓ ５ａ培地１ｍをさらに加えた。９６ウェルプレートの場合、１００μｌの４×１０^４細胞／ｍｌまたは４×１０^５細胞／ｍｌを加え、続いてさらに１００μｌの完全ＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ培地を各ウェルに加えた。次いでプレートを３７℃、５％ＣＯ_２にて一晩インキュベートした。翌日、細胞を位相差顕微鏡下で観察して、プレートに接着したことを確かめ、吸引によって、上清培地を除去した。次いで、２倍増濃度のミコグラブ（１．５〜２００μｇ／ｍｌ）を含む新鮮な培地、または培地のみをウェルに加えた。プレートを、４８時間インキュベーターに戻し、細胞タイターブルーアッセイを実施するか、生存計測を血球計を用いて実施した。

ＨＴ２９細胞に対する、抗癌剤５ＦＵおよびホリニル酸およびオキサリプラチンの効果
細胞株を分画し、細胞を計数した。１００μｌの４×１０^４細胞／ｍｌまたは４×１０^５細胞／ｍｌを９６ウェル平底組織培養プレートに加え、さらに１００μｌの完全ＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ培地をこのプレートに加えた。次いでプレートを３７℃、５％ＣＯ_２にて一晩インキュベートした。翌日、細胞を位相差顕微鏡下で観察して、プレートに接着したことを確かめ、吸引によって、上清培地を除去した。次いで、２倍増濃度の試験薬物（５−ＦＵ４．５〜２４００μｇ／ｍｌ＋１ｍｇ／ｍｌホリニル酸またはオキサリプラチン１〜５００μｇ／ｍｌ）を含む１００μｌの新鮮完全ＲＰＭＩ培地、または培地のみ（５−ＦＵ対照に対して培地＋２．５％ＤＭＳＯ）をウェルに加えた。プレートを４８時間インキュベーターに戻し、続いて、細胞タイターターブルーアッセイを実施した。

ＨＴ２９細胞に対する、抗癌剤５−ＦＵおよびホリニル酸またはオキサリプラチンとの組み合わせでのミコグラブ（ＲＴＭ）の効果
細胞株を分画し、細胞を計数した。１００μｌの４×１０^４細胞／ｍｌまたは４×１０^５細胞／ｍｌを９６ウェル平底組織培養プレートに加え、さらに１００μｌの完全ＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ培地をこのプレートに加えた。次いでプレートを３７℃、５％ＣＯ_２にて一晩インキュベートした。翌日、細胞を位相差顕微鏡下で観察して、プレートに接着したことを確かめ、吸引によって、上清培地を除去した。１００μｌの新鮮なＲＰＭＩ培地をプレートに加え、ミコグラブ（ＲＴＭ）対試験薬物（（５−ＦＵ４．５〜２４００μｇ／ｍｌ＋１ｍｇ／ｍｌホリニル酸またはオキサリプラチン１〜５００μｇ／ｍｌ）の交差または培地のみ（５−ＦＵ対照に対して培地＋２．５ＤＭＳＯ））を、表１６で概説したように設定し、ウェルあたり総量２００μｌとした。

ＨＴ２９細胞に対する、抗癌剤５−ＦＵおよびホリニル酸およびオキサリプラチンとの組み合わせでのミコグラブ（ＲＴＭ）の効果
細胞株を分画し、細胞を計数した。１００μｌの４×１０^４細胞／ｍｌまたは４×１０^５細胞／ｍｌを９６ウェル平底組織培養プレートに加え、さらに１００μｌの完全ＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ培地をこのプレートに加えた。次いでプレートを３７℃、５％ＣＯ_２にて一晩インキュベートした。翌日、細胞を位相差顕微鏡下で観察して、プレートに接着したことを確かめ、吸引によって、上清培地を除去した。１００μｌの新鮮なＲＰＭＩ培地をプレートに加え、ミコグラブ（ＲＴＭ）対試験薬物（（５−ＦＵ：ホリニル酸：オキサリプラチン＝３：１：０．４２）の交差または培地のみ（５−ＦＵ対照に対して培地＋２．５ＤＭＳＯ））を、表１６で概説したように設定し、ウェルあたり総量２００μｌとした。

結果
ＨＴ２９細胞に対するミコグラブ（ＲＴＭ）の効果
細胞株ＨＴ２９にて、ミコグラブ（ＲＴＭ）はそれ自身において、１２５μｇ／ｍｌにて、細胞生存率の５０％減少を示した。

ＨＴ２９細胞に対する、抗癌剤５ＦＵまたはオキサリプラチンのみ、および抗癌剤５ＦＵまたはオキサリプラチンとの組み合わせでのミコグラブ（ＲＴＭ）の効果
５−ＦＵ：
５−フルオロウラシルのＩＣ_５０は１５０μｇ／ｍｌであった。広い範囲の薬物濃度で、５−ＦＵとミコグラブ（ＲＴＭ）間の相乗効果の明確な兆候が存在した。表１７〜２０を参照のこと。

オキサリプラチン：
オキサリプラチンのＩＣ_５０は１６μｇ／ｍｌであった。広範囲の薬物濃度で、オキサリプラチンおよびミコグラブ（ＲＴＭ）間の相乗効果のわずかな兆候が存在した。表１８。

ＨＴ２９細胞に対する抗癌剤５ＦＵおよびオキサリプラチンとの組み合わせでのミコグラブ（ＲＴＭ）の効果
ＬＶ／５ＦＵ／ＯｘのＩＣ_５０は、２５／７５／１０．５μｇ／ｍｌであった。広範囲の薬物濃度にて、５−ＦＵおよびオキサリプラチンおよびミコグラブ（ＲＴＭ）間の相乗効果のわずかな兆候が存在した。表２２〜２４を参照のこと。

要約
この結果から、抗体は、５−ＦＵおよびホリニン酸またはオキサリプラチンとの相乗効果の兆候、および７５μｇ／ｍｌを超える５−ＦＵ、１０．５μｇ／ｍｌを超えるオキサリプラチンの濃度で、５−ＦＵおよびホリニン酸およびオキサリプラチンとの組み合わせで、４つの薬物での相乗効果のわずかな兆候を示したことが分かる。５−ＦＵおよびオキサリプラチンとの相乗効果の兆候が存在した。表２５は、ＥＤ_５０、ＥＤ_７５およびＥＤ_９０でのＣＩ値を要約している。

結論
本明細書で示したデータは、ミコグラブ（ＲＴＭ）抗体はそれ自身、結腸腺癌細胞株の生存率を減少させることができることを実証している。結腸腺癌細胞株において、５−フルオロウラシルおよびオキサリプラチンを含む抗癌剤と、抗Ｈｓｐ９０抗体間で相乗効果があった。データはまた、結腸腺癌株における、抗ＨＳＰ９０との、５−フルオロウラシルおよびオキサリプラチン間の相乗効果を実証している。

Claims (33)

1. 癌の処置のための薬剤の製造方法における、
   （ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
   （ｉｉ）ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセルおよびシスプラチンからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
   の使用。
2. 癌の処置における、同時、分離または連続使用のための、
   （ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
   （ｉｉ）ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセルおよびシスプラチンからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
   を含む組み合わせ調製物。
3. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１の配列を有するペプチドによって提示されるエピトープに特異的である、請求項１または２のいずれかに記載の使用または組み合わせ調製物。
4. 前記抗体は、配列番号２の配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用または組み合わせ調製物。
5. 前記癌は、線維肉腫、乳癌、前立腺癌、黒色肉腫、白血病、リンパ腫、大腸癌、精巣生殖細胞腫、膵臓癌、卵巣癌、子宮内膜腫瘍、甲状腺癌および肺癌からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用または組み合わせ調製物。
6. 必要とする患者に、治療的に効果的な量の、
   （ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
   （ｉｉ）ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセルおよびシスプラチンからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
   を投与することを含む、癌の処置方法。
7. 白血病の処置のための薬剤の製造方法における、
   （ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント
   の使用。
8. 白血病の処置のための薬剤の製造方法における、
   （ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
   （ｉｉ）イマチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシンおよびヒドロキシウレアからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
   の使用。
9. 白血病の処置における、同時、分離または連続使用のための、
   （ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
   （ｉｉ）イマチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシンおよびヒドロキシウレアからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
   を含む組み合わせ調製物。
10. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１の配列を有するペプチドによって提示されるエピトープに特異的である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の使用または組み合わせ調製物。
11. 前記抗体は、配列番号２の配列を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の使用または組み合わせ調製物。
12. 前記白血病は、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ性白血病からなる群より選択される、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の使用または組み合わせ調製物。
13. 前記少なくとも１つの抗癌剤は、イマチニブである、請求項７〜１２にいずれか一項に記載の私用または組み合わせ調製物。
14. 前記白血病は、慢性骨髄性白血病または急性リンパ性白血病である、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の使用または組み合わせ調製物。
15. 前記白血病は、フィラデルフィア染色体陽性の細胞、またはフィラデルフィア染色体陽性陰性の細胞によって特徴づけられる、請求項１４に記載の使用または組み合わせ調製物。
16. 前記抗癌剤はイマチニブであり、前記白血病は、フィラデルフィア染色体陽性の細胞によって特徴づけられる、請求項１４に記載の使用または組み合わせ調製物。
17. 前記抗癌剤はイマチニブであり、前記白血病は、フィラデルフィア染色体陰性の細胞によって特徴づけられる、請求項１４に記載の使用または組み合わせ調製物。
18. 前記白血病は、イマチニブ耐性の細胞によって特徴づけられる、請求項７〜１７のいずれか一項に記載の使用または組み合わせ調製物。
19. 必要としている患者に、治療的に効果的な量の、
    （ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
    （ｉｉ）イマチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシンおよびヒドロキシウレアからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
    を投与することを含む、白血病の処置方法。
20. 前記白血病は慢性骨髄性白血病であり、前記少なくとも１つの抗癌剤はイマチニブである、請求項１９に記載の方法。
21. 癌の処置のための薬剤の製造方法における、
    （ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
    （ｉｉ）５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカンおよびラルチトレキシドからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
    の使用。
22. 癌の処置における、同時、分離または連続使用のための、
    （ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
    （ｉｉ）５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカンおよびラルチトレキシドからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
    を含む組み合わせ調製物。
23. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１の配列を有するペプチドによって提示されるエピトープに特異的である、請求項２１または２２のいずれかに記載の使用または組み合わせ調製物。
24. 前記抗体は、配列番号２の配列を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の使用または組み合わせ調製物。
25. 前記癌は、線維肉腫、乳癌、前立腺癌、黒色肉腫、白血病、リンパ腫、大腸癌、精巣生殖細胞腫、膵臓癌、卵巣癌、子宮内膜腫瘍、甲状腺癌および肺癌からなる群より選択される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の使用または組み合わせ調製物。
26. 前記癌は、結腸直腸癌または腺癌である、請求項２５に記載の使用または組み合わせ調製物。
27. 必要としている患者に、治療的に効果的な量の、
    （ｉ）Ｈｓｐ９０の少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント、および
    （ｉｉ）５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカンおよびラルチトレキシドからなる群より選択される少なくとも１つの抗癌剤、
    を投与することを含む、癌の処置方法。
28. 前記抗癌剤は５−フルオロウラシルであり、さらにホリニン酸（ロイコボリン）を含む、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の利用、組み合わせ調製物または方法。
29. 前記抗癌剤は、５−フルオロウラシル、ホリニン酸（ロイコボリン）およびオキサリプラチンを含む、請求項２８に記載の利用、組み合わせ調製物または方法。
30. 前記組成物または組み合わせ調製物は経口投与される、請求項６、１９、２０、２７、２８および２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識で標識化される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の利用、組み合わせ調製物または方法。
32. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、エフェクタ分子と共役する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の利用、組み合わせ調製物または方法。
33. 実施例を参照して本明細書にて本質的に記述したような発明。