JP2008503205A

JP2008503205A - Peptide derived from decorin leucine rich repeat and use thereof

Info

Publication number: JP2008503205A
Application number: JP2007515003A
Authority: JP
Inventors: ルオウェンゲ，; マンジュナサキニ，
Original assignee: National University of Singapore
Current assignee: National University of Singapore
Priority date: 2004-05-31
Filing date: 2005-05-31
Publication date: 2008-02-07
Also published as: WO2005116066A1; EP1758931A1

Abstract

本発明の第１の態様は、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含有している、デコリンの一部由来の５〜４０個のアミノ酸からなるペプチド、または前記ペプチドの変異体を提供する。本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の２種以上のペプチド、または本発明の第１の態様の１種のペプチドおよびデコリン由来でない追加のペプチド配列を含む２５０個以下のアミノ酸残基からなるペプチド、あるいは２５０個以下のアミノ酸残基の前記ペプチドの変異体を提供する。本発明のペプチドは、例えば癌の治療などにおいて、有害な血管新生を阻害するために用いることができる。
【選択図】なしThe first aspect of the present invention provides a peptide consisting of 5 to 40 amino acids derived from a part of decorin, which contains leucine rich repeat (LRR), or a variant of said peptide. A second aspect of the present invention provides no more than 250 peptides comprising two or more peptides of the first aspect of the invention, or one peptide of the first aspect of the invention and an additional peptide sequence not derived from decorin. A peptide comprising amino acid residues, or a variant of the peptide having 250 amino acid residues or less is provided. The peptides of the present invention can be used to inhibit harmful angiogenesis, for example, in the treatment of cancer.
[Selection figure] None

Description

本発明は化合物およびその使用に関し、特に、ペプチドおよびその変異体ならびに血管新生の阻害におけるその使用に関する。本ペプチドおよびその変異体は、癌の治療で用いることができる。 The present invention relates to compounds and their uses, in particular peptides and variants thereof and their use in inhibiting angiogenesis. The peptide and its variants can be used in the treatment of cancer.

血管新生（新しい血管の形成）は、癌、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、関節リウマチおよび乾癬をはじめとする、多くのヒト疾患に関与している。腫瘍増殖および転移はともに、腫瘍細胞から放出される様々な血管新生増殖因子により刺激される血管新生に依存している。従って、抗血管新生は、従来の癌治療に比べて優れたいくつかの利点（例えば、低毒性、癌が治療に対して耐性を有するようになる可能性の低減、広範囲の腫瘍が治療可能など）をもつ抗癌剤開発における有望な代替手法である。 Angiogenesis (the formation of new blood vessels) is implicated in many human diseases, including cancer, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration, rheumatoid arthritis and psoriasis. Both tumor growth and metastasis depend on angiogenesis stimulated by various angiogenic growth factors released from tumor cells. Therefore, anti-angiogenesis has several advantages over conventional cancer treatments (eg, low toxicity, reduced likelihood of cancer becoming resistant to treatment, a wide range of tumors can be treated, etc.) ) Is a promising alternative method for the development of anti-cancer drugs.

デコリンは、スモールロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）プロテオグリカンファミリーに属するマトリックスプロテオグリカンである。これは、Ｃ末端に１０個のＬＲＲリピートを含んでいる。主として、これは線維芽細胞より分泌される。その正常な生理機能は、コラーゲン線維素生成を微調整することである。これは、他のマトリックス分子、例えばフィブロネクチン、トロンボスポンジン、コラーゲンおよび増殖因子ＴＧＦ−β、ＥＧＦ受容体、ならびにいくつかの金属イオンに関する数種類の結合ドメインを持っている。 Decorin is a matrix proteoglycan belonging to the small leucine rich repeat (LRR) proteoglycan family. This contains 10 LRR repeats at the C-terminus. Primarily it is secreted from fibroblasts. Its normal physiology is to fine-tune collagen fibrin production. It has several binding domains for other matrix molecules such as fibronectin, thrombospondin, collagen and growth factor TGF-β, EGF receptor, and several metal ions.

デコリンはＩ型、ＩＩ型およびＩＶ型のコラーゲンに結合し、安定性の高い線維の形成を促進する。これが抗血管新生特性を有することは既に発見されている。これは、腫瘍細胞によるＶＥＧＦ産生を阻害することによって腫瘍細胞介在性血管新生を抑制する（例えば、Ｓｃｈｏｎｈｅｒｒら、（１９９９）、ＥｕｒＪＣｅｌｌＢｉｏｌ７８、４４〜５５；Ｓｔａｎｄｅｒら、（１９９９）、ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ２９６、２２１〜２２７；Ｍｅｒｌｅら、（１９９９）、ＪＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ７５、５３８〜５４６；Ｎｅｌｉｍａｒｋｋａら、（２００１）、ＡｍＪＰａｔｈｏｌ１５８、３４５〜３５３；Ｄａｖｉｅｓら、（２００１）、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ６２、２６〜４２；および、Ｇｒａｎｔら、（２００２）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２１、４７６５〜４７７７を参照されたい）。 Decorin binds to type I, type II, and type IV collagen and promotes the formation of highly stable fibers. It has already been discovered that this has anti-angiogenic properties. This suppresses tumor cell-mediated angiogenesis by inhibiting VEGF production by tumor cells (see, eg, Schonherr et al. (1999), Eur J Cell Biol 78, 44-55; Standard et al. (1999), Cell Tissue Res 296, 221-227; Merle et al. (1999), J CellBiochem 75, 538-546; Nelimarkka et al. (2001), Am J Pathol 158, 345-353; Davies et al. (2001), Microvasc. Res 62 26-42; and Grant et al. (2002), Oncogene 21, 4765-4777).

国際公開第９０／００１９４号パンフレットには、デコリンが細胞増殖を抑制し得ることが報告されている。米国特許第５７０５６０９号はデコリンのＴＧＦβへの結合に関するものであり、デコリンのＴＧＦβへの結合を阻害するデコリンのＮ末端領域由来ペプチドが記載されている。さらにこの特許には、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とデコリンの一部との間の融合が記載されているが、そのいくつかは、デコリンのＴＧＦβへの結合を阻害する。米国特許第６２７７８１２Ｂ１号は、創傷にデコリンを投与することによって瘢痕形成を予防または低減させることに関するものである。しかし、これらの刊行物はいずれも、デコリンの一部の使用により血管新生が阻害されることは記載しておらず、またそれらの刊行物はいずれも、デコリンの中央部分またはＣ末端部分由来の遊離ペプチドについては記載していない。 WO90 / 00194 reports that decorin can suppress cell growth. US Pat. No. 5,705,609 relates to the binding of decorin to TGFβ and describes peptides derived from the N-terminal region of decorin that inhibit the binding of decorin to TGFβ. The patent further describes fusions between maltose binding protein (MBP) and a portion of decorin, some of which inhibit the binding of decorin to TGFβ. US Pat. No. 6,277,812 B1 relates to preventing or reducing scar formation by administering decorin to a wound. However, none of these publications states that angiogenesis is inhibited by the use of some decorin, and neither of these publications is derived from the central part or the C-terminal part of decorin. The free peptide is not described.

この明細書の既に刊行されている文献のすべてのリストまたは記述は、必ずしも、その文献が現況技術の一部であること、または通常の一般知識であるということを承認するものとして受け取られるべきものではない。 Any list or description of any previously published document in this specification is not necessarily to be accepted as an admission that the document is part of the state of the art or is common general knowledge. is not.

驚いたことに、本発明者らは、デコリンの中央部分の一部を含有している合成ペプチドが血管新生阻害剤として機能することを見出した。特に、完全な５番目のＬＲＲを表すペプチド（ＬＲＲ５；ペプチドｄＬＲＲ５、２６個のアミノ酸）は特有のロイシン構成を有し、デコリン中の他のすべてのＬＲＲと比較した場合、これは、余剰アミノ酸を含む長い配列を持ち、コラーゲンＩに結合するがＴＦＧ−βには結合しない（前記両分子は血管新生で役割を果たすことが知られている）能力を有する。また、ＬＲＲ３、ＬＲＲ４に基づくペプチド、およびＬＲＲ５の突然変異バージョン（ＬＲＲ５由来の短くしたペプチドを含む）について、これらの抗血管新生機能を評価した。本発明者らは、様々なインビトロでの血管新生アッセイを用いてデコリンペプチドの機能を分析した。これらのアッセイには、血管新生中に起こる主要事象に関連する、内皮細胞遊走アッセイ、マトリゲル管腔形成アッセイおよびアポトーシスアッセイが含まれる。 Surprisingly, the inventors have found that a synthetic peptide containing part of the central part of decorin functions as an angiogenesis inhibitor. In particular, the peptide representing the complete fifth LRR (LRR5; peptide dLRR5, 26 amino acids) has a unique leucine configuration, which when compared to all other LRRs in decorin It has a long sequence that contains and has the ability to bind to collagen I but not to TFG-β (both molecules are known to play a role in angiogenesis). These anti-angiogenic functions were also evaluated for LRR3, peptides based on LRR4, and mutant versions of LRR5 (including shortened peptides derived from LRR5). We analyzed the function of decorin peptides using various in vitro angiogenesis assays. These assays include endothelial cell migration assays, Matrigel lumen formation assays and apoptosis assays that are associated with major events that occur during angiogenesis.

本発明の目的は、血管新生関連疾患の治療で使用するための抗血管新生ペプチドおよびその変異体を提供することである。現在、多数の抗血管新生タンパク質が臨床試験にある。薬剤としてタンパク質を使用する場合の主な欠点には、それらのバイオアベイラビリティーおよび生物学的安定性が低いこと、それらの大量生産が困難であること、宿主の免疫反応、ならびに患者に注射で投与する必要があることがある。これらの問題は、小型ペプチドおよび／またはペプチド模倣物を用いて回避することができる。また、ペプチドは水に溶解しやすく、細胞膜に浸透可能であって、治療用途の経***性剤または鼻内噴霧型製剤へさらに開発される可能性がある。 An object of the present invention is to provide anti-angiogenic peptides and variants thereof for use in the treatment of angiogenesis-related diseases. A number of anti-angiogenic proteins are currently in clinical trials. The main drawbacks of using proteins as drugs are their low bioavailability and biological stability, their difficulty in mass production, host immune response, and administration to patients by injection There is a need to do. These problems can be avoided using small peptides and / or peptidomimetics. Peptides are also readily soluble in water and can penetrate cell membranes and may be further developed into therapeutically active orally-nasal spray formulations.

これらのペプチドは、癌、関節リウマチ、乾癬、不妊、創傷治癒の遅延、潰瘍、黄斑変性、糖尿病性網膜症等をはじめとする、不均衡性血管新生と関係しているすべての疾患の薬剤として用いることができる。 These peptides are used as drugs for all diseases associated with imbalanced angiogenesis, including cancer, rheumatoid arthritis, psoriasis, infertility, delayed wound healing, ulcers, macular degeneration, diabetic retinopathy, etc. Can be used.

本発明の第１の態様は、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含有するデコリンの一部由来の５〜４０個のアミノ酸からなるペプチド、または前記ペプチドの変異体を提供する。 The first aspect of the present invention provides a peptide consisting of 5 to 40 amino acids derived from a part of decorin containing leucine rich repeat (LRR), or a variant of said peptide.

図１８にヒトデコリンのアミノ酸配列を示すが、ヒトデコリン中の前記一部は、アミノ酸残基８２〜３１６に対応する。 FIG. 18 shows the amino acid sequence of human decorin. The part of human decorin corresponds to amino acid residues 82 to 316.

また他の種のデコリンに由来する同等な一部も、本発明のペプチドおよびその変異体の設計および合成に用いることができる。ヒトデコリンのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＭ９８２６３であり、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔについてはＰ０７５８５である。 Equivalent parts derived from other species of decorin can also be used in the design and synthesis of the peptides of the invention and their variants. The GenBank accession number for human decorin is M98263 and for Swiss-Prot is P07585.

本ペプチドは、５〜３５残基、５〜３０残基、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９残基であってよい。１０〜３０残基のペプチドが好ましく、例えば、１２、１３、２１、２４および２６残基のペプチドである。 This peptide has 5 to 35 residues, 5 to 30 residues, for example, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, There may be 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 or 29 residues. Peptides with 10 to 30 residues are preferred, for example peptides with 12, 13, 21, 24 and 26 residues.

典型的には、本ペプチドは、ロイシンリッチリピートのＬＲＲ１、ＬＲＲ２、ＬＲＲ３、ＬＲＲ４、ＬＲＲ５、ＬＲＲ６、ＬＲＲ７、ＬＲＲ８、ＬＲＲ９またはＬＲＲ１０由来のアミノ酸配列を有している。図４にヒトデコリンのＬＲＲを示すが、特に、それぞれのアミノ酸残基は、順に以下の残基の位置を占めている：（１）８２〜１０５；（２）１０６〜１２９；（３）１３０〜１５０；（４）１５１〜１７４；（５）１７５〜２００；（６）２０１〜２２１；（７）２２２〜２４５；（８）２４６〜２６９；（９）２７０〜２９２；および（１０）２９３〜３１６。 Typically, the peptide has an amino acid sequence derived from a leucine rich repeat LRR1, LRR2, LRR3, LRR4, LRR5, LRR6, LRR7, LRR8, LRR9 or LRR10. FIG. 4 shows the LRR of human decorin. In particular, each amino acid residue occupies the following residue positions in order: (1) 82-105; (2) 106-129; (3) 130- 150; (4) 151-174; (5) 175-200; (6) 201-221; (7) 222-245; (8) 246-269; (9) 270-292; and (10) 293 316.

特に、デコリンのＬＲＲ５由来の５〜２６個のアミノ酸からなるペプチド、またはかかるペプチドの変異体が好ましい。好適なかかるペプチドとしては、ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号２）；ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫ（配列番号４）；ＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号５）；もしくはＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥ（配列番号６）またはより小型のその一部、あるいは前記ペプチドの変異体が挙げられる。好ましくは、本ペプチドがＬＲＲ５由来の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基を有しているか、またはかかるペプチドの変異体である。 In particular, a peptide consisting of 5 to 26 amino acids derived from LRR5 of decorin or a variant of such a peptide is preferred. Suitable such peptides include QMIVIELGTNPLKSSGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 2); QMIVIELGTNPLK (SEQ ID NO: 4); SSGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 5); Can be mentioned. Preferably, the peptide is from 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or 25 from LRR5 It has amino acid residues or is a variant of such a peptide.

また、デコリンのＬＲＲ４由来の５〜２４個のアミノ酸からなるペプチド、または前記ペプチドの変異体も好ましい。かかるペプチドとしては、ＴＬＱＥＬＲＡＨＥＮＥＩＴＫＶＲＫＶＴＦＮＧＬＮ（配列番号８）またはその一部あるいはその変異体が挙げられる。好ましくは、本ペプチドは、ＬＲＲ４由来の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２３個のアミノ酸残基を有しているか、またはかかるペプチドの変異体である。 Moreover, the peptide which consists of 5-24 amino acids derived from LRR4 of decorin, or the variant of the said peptide is also preferable. Examples of such a peptide include TLQELRAHENEITKVRKVTFNGLN (SEQ ID NO: 8), a part thereof, or a variant thereof. Preferably, the peptide has 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 or 23 amino acid residues from LRR4. Or a variant of such a peptide.

また、デコリンのＬＲＲ３由来の５〜２１個のアミノ酸からなるペプチド、またはその変異体も好ましい。かかるペプチドとしては、ＫＬＥＲＬＹＬＳＫＮＱＬＫＥＬＰＥＫＭＰＫ（配列番号７）またはその一部、あるいはその変異体が挙げられる。好ましくは、本ペプチドは、ＬＲＲ３由来の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸残基を有しているか、またはかかるペプチドの変異体である。 Moreover, the peptide which consists of 5-21 amino acids derived from LRR3 of decorin, or its variant is also preferable. Examples of such peptides include KLERLYLSKNQLKELPEKMPK (SEQ ID NO: 7), a part thereof, or a variant thereof. Preferably, the peptide has 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 amino acid residues from LRR3, Or a variant of such a peptide.

また本発明は、上に定義した２種以上のペプチド、または上に定義した１種もしくは複数のペプチドとデコリンに由来しない追加のペプチド配列を含む２５０個以下のアミノ酸残基からなるペプチド、あるいは２５０個以下のアミノ酸残基の前記ペプチドの変異体を提供する。特に、追加のペプチド配列が細菌性マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）の配列ではないのが好ましい。 The present invention also relates to a peptide comprising 250 or less amino acid residues including two or more peptides as defined above, or one or more peptides as defined above and an additional peptide sequence not derived from decorin, or 250 Variants of the peptide of no more than amino acid residues are provided. In particular, it is preferred that the additional peptide sequence is not a bacterial maltose binding protein (MBP) sequence.

上に定義した２種以上の同一ペプチドまたは異種ペプチドを結合させて、より大型のペプチド（ただし、前記ペプチドは２５０個のアミノ酸残基を超えず、好ましくは２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０または５０個を超えない）を形成することができることは理解されよう。好ましくは、同一ペプチドを配列中で２回以上直列させる。好ましくは、本デコリンペプチド部分は、（本発明の第１の態様のペプチドが配列中に直列に存在する場合）１００個以下のアミノ酸残基を含み、好ましくは、本デコリンペプチドの一部は、８０または７０または６０または５０または４０または３０または２０または１０個のアミノ酸残基を含む。本発明のこの態様の好ましい実施形態は、１〜２０個、好ましくは１から１０個のアミノ酸残基のリンカーによって直列に結合されている、配列中に２つのヒトＬＲＲ５ペプチドを含むペプチドである。 Two or more identical peptides or heterologous peptides as defined above are combined to give a larger peptide (wherein the peptide does not exceed 250 amino acid residues, preferably 200, 150, 100, 90, 80, It will be understood that no more than 70, 60 or 50) can be formed. Preferably, the same peptide is serialized two or more times in the sequence. Preferably, the decorin peptide moiety comprises no more than 100 amino acid residues (when the peptide of the first aspect of the invention is present in tandem in the sequence), preferably a portion of the decorin peptide is Contains 80 or 70 or 60 or 50 or 40 or 30 or 20 or 10 amino acid residues. A preferred embodiment of this aspect of the invention is a peptide comprising two human LRR5 peptides in sequence, connected in series by a linker of 1 to 20, preferably 1 to 10 amino acid residues.

この実施形態のペプチドは、本デコリンアミノ酸配列に基づいたペプチドまたは変異体の他に、配列がデコリンに基づいていない追加のアミノ酸残基を含んでいてもよいことは理解されよう。追加の配列は、他の公知のタンパク質配列、例えば、別の抗血管新生ペプチドまたは足場ペプチドまたは腫瘍血管に対する本ペプチドを標的とするペプチド（例えば、アミノ酸配列ＲＤＧを含有しているもの）に基づいていてもよく、自然界に存在しない配列に基づいていてもよい。追加のアミノ酸残基は、追加の配列がデコリンに基づくペプチドに隣接するように、デコリンに基づくペプチドのＮ末端であってもよく、デコリンに基づくペプチドのＣ末端であってもよく、またその両方であってもよい。典型的には、１〜１０個の追加のアミノ酸残基であるが、８０個もの残基であってもよい。典型的には、この実施形態では、本ペプチドのトータルサイズは、８０または７０または６０または５０または４０または３０または２０または１５個のアミノ酸残基を超えない。また、この実施形態のペプチドの変異体も、本発明の範囲内に含まれる。 It will be appreciated that the peptide of this embodiment may include additional amino acid residues whose sequence is not based on decorin, in addition to peptides or variants based on the decorin amino acid sequence. Additional sequences are based on other known protein sequences, such as another anti-angiogenic peptide or scaffold peptide or peptides that target this peptide against tumor blood vessels (eg, those containing the amino acid sequence RDG). It may be based on a sequence that does not exist in nature. The additional amino acid residue may be the N-terminus of the decorin-based peptide, the C-terminus of the decorin-based peptide, or both, such that the additional sequence is adjacent to the decorin-based peptide. It may be. Typically 1 to 10 additional amino acid residues, but as many as 80 residues. Typically, in this embodiment, the total size of the peptide does not exceed 80 or 70 or 60 or 50 or 40 or 30 or 20 or 15 amino acid residues. Moreover, the variant of the peptide of this embodiment is also included in the scope of the present invention.

本発明のペプチドは、典型的には、また好ましくは、Ｌ−立体配置のアミノ酸を含むが、これは下記を参照されたい。本発明のペプチドまたはその変異体は、環化されていてもよく（すなわち、遊離のＮ末端またはＣ末端を持っていない）、直鎖または分枝鎖であってもよい。 The peptides of the present invention typically and preferably comprise amino acids in the L-configuration, see below. The peptides of the invention or variants thereof may be cyclized (ie do not have a free N-terminus or C-terminus), and may be linear or branched.

本発明の上述のペプチドの変異体には、これらに限定されるものではないが、デコリン含有部分のデコリンアミノ酸配列の４０％以下（例えば３０％、２０％または１０％）が他のアミノ酸で置換されているものが含まれる。典型的には、デコリン配列由来の１または２または３または４または５または６または７個のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている。別の天然アミノ酸で置換されていてもよく、非天然のアミノ酸で置換されていてもよい。典型的な置換には、Ｌ−アミノ酸を対応Ｄ−アミノ酸で置換、あるいは１個のアミノ酸を保存的アミノ酸（例えば、基Ａ、Ｖ；Ｆ、Ｙ、Ｗ；Ｔ、Ｓ；Ｉ、Ｌ、Ｖ；Ｄ、Ｅ；およびＱ、Ｎ、Ｈの範囲内のもの）で置換することが含まれるが、非保存的置換も考えられる。 The above-described peptide variants of the present invention include, but are not limited to, 40% or less (for example, 30%, 20%, or 10%) of the decorin amino acid sequence of the decorin-containing portion substituted with other amino acids Is included. Typically, 1 or 2 or 3 or 4 or 5 or 6 or 7 amino acids from the decorin sequence are replaced with another amino acid. It may be substituted with another natural amino acid or may be substituted with a non-natural amino acid. Typical substitutions include replacing an L-amino acid with the corresponding D-amino acid, or replacing one amino acid with a conservative amino acid (eg, groups A, V; F, Y, W; T, S; I, L, V D, E; and Q, N, H)), but non-conservative substitutions are also contemplated.

またペプチドの変異体には、ペプチド結合の代わりに１種または複数の非ペプチド結合を含有しているものが含まれる。また変異体は、Ｎ末端またはＣ末端またはその両方が加水分解に対する耐性を付与するために遮断されているペプチドも含んでいる。同様に、アミノ酸残基の１種または複数の側鎖を修飾して、かかる耐性または他の望ましい特性を付与することもできる。ペプチドの安定性およびバイオアベイラビリティーを改善し、かつそれらを薬剤としてより有効にする方法は、当技術分野で周知である。特に、Ａｄｅｓｓｉ＆Ｓｏｔｏ、（２００２）、ＣｕｒｒｅｎｔＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ９、９６３〜９７８（これは参照によって本明細書に援用するものとする）を参照されたいが、この中に、かかる方法が詳細に記載されている。 Peptide variants also include those containing one or more non-peptide bonds instead of peptide bonds. Variants also include peptides where the N-terminus or C-terminus or both are blocked to confer resistance to hydrolysis. Similarly, one or more side chains of amino acid residues can be modified to confer such resistance or other desirable properties. Methods for improving the stability and bioavailability of peptides and making them more effective as drugs are well known in the art. See, in particular, Addresses & Soto, (2002), Current Medicinal Chemistry 9, 963-978, which is hereby incorporated by reference, in which such methods are described in detail. ing.

ペプチドの変異体は、都合に応じて「修飾ペプチド」、「偽ペプチド」および「ペプチド模倣物」と呼称することができる数種類のクラスに分類される。 Peptide variants fall into several classes that can be referred to as “modified peptides”, “pseudopeptides”, and “peptidomimetics” for convenience.

修飾ペプチドの例は、Ｎ末端および／またはＣ末端が、例えば、アミノアシル化またはカルボキシアミド化によって、あるいはＮ末端のピログルタミン酸基の結合によって修飾される場合である。他の修飾ペプチドは、ペプチドの環化（すなわち、−ＮＨ_２と−ＣＯＯＨ末端を縮合してペプチド結合を形成させる場合）、アミド窒素アルキル化、Ｄ−アミノ酸置換および側鎖修飾である。 Examples of modified peptides are when the N-terminus and / or C-terminus is modified, for example by aminoacylation or carboxyamidation, or by attachment of an N-terminal pyroglutamate group. Other modified peptides, peptide cyclization (i.e., if by condensation of -NH ₂ and -COOH end to form a peptide bond), amide nitrogen alkylating a D- amino acid substitutions and side chain modifications.

偽ペプチドとは、分子中のごく部分的なペプチドで起こる、ペプチド骨格に関係している一部の原子に改変または置換があるものである。これらには、アミド結合代用物（例えば、−ＣＯＮＨ−基の−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ_２Ｓ−、−ＣＨ_２ＳＯ−、−ＣＨＣＨ_３Ｓ−による置換など）、ペプトイドおよびアザペプチドが含まれる。ペプトイドは、ペプチド構造中のＩ−炭素に結合している側鎖が、アミド窒素へ同じ位置で「切り替えられている」場合である。アザペプチドは、１種または複数のＩ−炭素原子が窒素原子で置換されている分子である。Ｉ−炭素が全部置換されている場合、その分子はアザチド（ａｚａｔｉｄｅ）と呼ばれる。 Pseudopeptides are those that have alterations or substitutions at some atoms associated with the peptide backbone that occur with only a partial peptide in the molecule. These include amide bond surrogates (e.g., -CONH- _-CH group _{_{2 CH 2 -, - CH 2}} NH -, - CH = CH -, - CH 2 S -, - CH 2 SO -, - CHCH 3 Substitution with S-), peptoids and azapeptides. A peptoid is when the side chain attached to the I-carbon in the peptide structure is “switched” to the amide nitrogen at the same position. Azapeptides are molecules in which one or more I-carbon atoms are replaced with nitrogen atoms. When all of the I-carbons are substituted, the molecule is called an azatide.

本発明のペプチドおよび変異体は、典型的には抗血管新生の活性を有しており、これはインビトロまたはインビボで評価することができる。好ましくは、ペプチドまたは変異体は、インビトロおよびインビボの両方で抗血管新生活性を有する。抗血管新生活性は、インビボで、新しい血管新生を異種移植片腫瘍モデルなどにおいて評価するモデル系を用いて評価することができる。また抗血管新生活性は、インビトロで、例えば、ＶＥＧＦ誘導性内皮細胞遊走アッセイ（以下の実施例で記載のＨＵＶＥＣアッセイなど）を用いて、評価することができる。典型的には、本発明のペプチドまたは変異体は、コラーゲン、ゼラチンまたはフィブロネクチンの任意の１種または複数に結合する可能性があり、これらの分子への結合を測定する試験は当技術分野で周知である。 The peptides and variants of the invention typically have anti-angiogenic activity, which can be assessed in vitro or in vivo. Preferably, the peptide or variant has anti-angiogenic activity both in vitro and in vivo. Anti-angiogenic activity can be assessed in vivo using a model system that assesses new angiogenesis, such as in a xenograft tumor model. Anti-angiogenic activity can also be assessed in vitro using, for example, a VEGF-induced endothelial cell migration assay (such as the HUVEC assay described in the Examples below). Typically, the peptides or variants of the invention may bind to any one or more of collagen, gelatin or fibronectin, and tests to measure binding to these molecules are well known in the art. It is.

ペプチドＭ−ｈｄＬＲＲ５（配列番号６；ＬＲＲ５Ｍともいう）は、管腔形成を阻害し得る。ペプチドＣ−ｈｄＬＲＲ５（配列番号５；ＬＲＲ５Ｃともいう）は、内皮細胞遊走を阻害し得る。これら両ペプチドは、血管新生阻害に有用であると考えられる。従って、本発明の好ましいペプチドは、これらのペプチド、これらのアミノ酸配列を含有している４０個以下のアミノ酸残基のペプチド、または前記ペプチドの変異体である。 The peptide M-hdLRR5 (SEQ ID NO: 6; also referred to as LRR5M) can inhibit tube formation. Peptide C-hdLRR5 (SEQ ID NO: 5; also referred to as LRR5C) can inhibit endothelial cell migration. Both these peptides are thought to be useful for inhibiting angiogenesis. Accordingly, preferred peptides of the present invention are these peptides, peptides of 40 amino acid residues or less containing these amino acid sequences, or variants of said peptides.

従って、本発明のペプチドおよび変異体には、インビトロのアッセイで、例えば、実施例のＨＵＶＥＣ遊走アッセイで、ｄＬＲＲ５ペプチド（配列番号２）と同様の活性を実質的に有しているものが含まれることは理解されるであろう。好適には、本ペプチド模倣物は、上述の特定のペプチドのいずれか１種（特に、ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号２））と実質的に同一の電荷分布および／または空間立体配置を有する部分を含む。 Accordingly, the peptides and variants of the present invention include those having substantially the same activity as the dLRR5 peptide (SEQ ID NO: 2) in in vitro assays, eg, in the HUVEC migration assay of the Examples. It will be understood. Suitably, the peptidomimetic comprises a moiety having substantially the same charge distribution and / or spatial configuration as any one of the specific peptides described above (particularly QMIVIELGTNPLKSSGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 2)).

一部の変異体は、本ペプチドの非ペプチド模倣物であってもよく、上述の特定のペプチド（特に、ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号２））のいずれか１種と同一の電荷分布および／または空間立体配置を有する分子が含まれる。 Some variants may be non-peptidomimetics of the peptide and have the same charge distribution and / or spatial stericity as any one of the specific peptides described above (particularly QMIVIELGTNPLKSSGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 2)). Molecules having a configuration are included.

本発明のペプチドおよび変異体は、典型的には、分子量が約８００〜１００００であり、典型的には約２０００〜５０００である。 The peptides and variants of the present invention typically have a molecular weight of about 800-10000, typically about 2000-5000.

本発明の化合物がペプチドである場合、当技術分野で周知の方法を用いてそれを合成することができる。例えばペプチドは、Ｌｕら、（１９８１）、ＪＯｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６、３４３３とその中の引用文献に記載されている、固相ペプチド合成のＦｍｏｃポリアミド法によって合成することができる。一時的なＮ−アミノ基保護は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基により得られる。この高度塩基易変性保護基の反復開裂は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを用いることにより行われる。側鎖の機能性は、それらのブチルエーテル（セリン、スレオニンおよびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、ならびに４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護することができる。グルタミンまたはアスパラギンがＣ末端残基である場合、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル基が側鎖のアミド機能性の保護に利用される。固相支持体は、３種類のモノマー、すなわち、ジメチルアクリルアミド（主鎖モノマー）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（官能基化剤）から構成されるポリジメチルアクリルアミドポリマーがベースとなっている。使用するペプチド−樹脂間の開裂可能な結合剤は、酸易変性の４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体である。アミノ酸誘導体はすべて、アスパラギンとグルタミンを除き、予成形したそれらの対称的な無水物誘導体として加え、アスパラギンとグルタミンは、逆Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール使用カップリング法を用いて加える。カップリング反応および脱保護反応はすべて、ニンヒドリン試験法、トリニトロベンゼンスルホン酸試験法またはイソスズ試験法を用いて観察する。合成完了後、ペプチドは、５０％捕捉剤混合物を含有する９５％トリフルオロ酢酸で処理することにより、側鎖保護基の除去と同時に樹脂支持体から開裂される。一般に用いられる捕捉剤は、エタンジチオール、フェノール、アニソールおよび水であるが、正確な選択は、合成するペプチドの構成アミノ酸によって決まる。トリフルオロ酢酸は真空蒸発により除去し、その後ジエチルエーテルで滴定することにより粗製ペプチドが得られる。存在するすべての捕捉剤は簡易抽出法によって除去されるが、この方法で、水相を凍結乾燥することにより捕捉剤を含まない粗製ペプチドが得られる。一般に、ペプチド合成用の試薬は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ（ノッティンガム（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ）ＮＧ７２ＱＪ、英国）から購入することができる。精製は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび（基本的には）逆相高速液体クロマトグラフィーなどの方法のいずれか１つの方法、またはそれらの組合せによって実施することができる。ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析を用いて、また、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、エレクトロスプレーまたはマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分光分析により実施することができる。 If the compound of the present invention is a peptide, it can be synthesized using methods well known in the art. For example, peptides are described in Lu et al. (1981), J Org. Chem. 46, 3433 and references cited therein, and can be synthesized by the Fmoc polyamide method of solid phase peptide synthesis. Temporary N-amino group protection is provided by the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group. This repetitive cleavage of the highly base-modifying protecting group is performed by using 20% piperidine in N, N-dimethylformamide. The functionality of the side chains is their butyl ether (for serine, threonine and tyrosine), butyl ester (for glutamic acid and aspartic acid), butyloxycarbonyl derivatives (for lysine and histidine), trityl derivatives (for cysteine) As well as 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl derivatives (in the case of arginine). When glutamine or asparagine is the C-terminal residue, the 4,4'-dimethoxybenzhydryl group is utilized for protecting the side chain amide functionality. The solid support is based on a polydimethylacrylamide polymer composed of three types of monomers: dimethylacrylamide (main chain monomer), bisacryloylethylenediamine (crosslinking agent) and acryloyl sarcosine methyl ester (functionalizing agent). It has become. The peptide-resin cleavable binder used is an acid-modified 4-hydroxymethyl-phenoxyacetic acid derivative. All amino acid derivatives, except for asparagine and glutamine, are added as their preformed symmetrical anhydride derivatives, and asparagine and glutamine use a reverse N, N-dicyclohexyl-carbodiimide / 1-hydroxybenzotriazole coupling method. Add. All coupling and deprotection reactions are observed using the ninhydrin test method, the trinitrobenzene sulfonic acid test method or the isotin test method. After synthesis is complete, the peptide is cleaved from the resin support upon removal of the side chain protecting groups by treatment with 95% trifluoroacetic acid containing a 50% capture agent mixture. Commonly used capture agents are ethanedithiol, phenol, anisole and water, but the exact choice depends on the constituent amino acids of the peptide being synthesized. Trifluoroacetic acid is removed by evaporation in vacuo, followed by titration with diethyl ether to give the crude peptide. Any capture agent present is removed by a simple extraction method, but in this way, the aqueous phase is lyophilized to obtain a crude peptide free of the capture agent. In general, reagents for peptide synthesis can be purchased from Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd (Nottingham NG7 2QJ, UK). Purification can be performed, for example, by any one of methods such as size exclusion chromatography, ion exchange chromatography and (basically) reverse phase high performance liquid chromatography, or a combination thereof. Peptides can be analyzed using thin-layer chromatography, reversed-phase high-performance liquid chromatography, amino acid analysis after acid hydrolysis, and by fast atom bombardment (FAB), electrospray or matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Can be implemented.

従って、本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはその変異体を製造する方法であって、前記ペプチドまたは変異体を化学的に合成することを含む方法を提供する。 Accordingly, a further aspect of the invention provides a method for producing a peptide of the invention or a variant thereof, comprising chemically synthesizing said peptide or variant.

あるいは、本発明のペプチドが好適な大きさである場合、例えば、長さが約５０個の残基を超える場合には、組換えＤＮＡ技術によって本ペプチドを生成することが望まれ得る。従って、本発明のさらなる態様は、ペプチドの製造方法であって、前記方法が、下により詳細に記載している通り、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターから、あるいは宿主細胞中で、前記ペプチドを発現することを含む方法を提供する。 Alternatively, if the peptide of the present invention is of a suitable size, eg, if it exceeds about 50 residues in length, it may be desirable to produce the peptide by recombinant DNA technology. Accordingly, a further aspect of the invention is a method for producing a peptide, said method expressing the peptide from a polynucleotide or expression vector or in a host cell, as described in more detail below. A method comprising:

本発明のペプチドは、好適なポリヌクレオチドによってコードされ得るが、これは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ、（２００１）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ」（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、米国）に記載されているような当技術分野で周知の方法によって取得または合成することができる。 The peptides of the present invention may be encoded by suitable polynucleotides, which include, for example, Sambrook & Russell, (2001) “Molecular cloning, a laboratory manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold HarN Spring, Cold Harbour, Or can be obtained or synthesized by methods well known in the art as described in US).

次いで、ポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）は、好適な宿主中で発現され、本発明の化合物を含むペプチドが生成される。従って、本発明の化合物を構成するペプチドをコードしているＤＮＡは、本明細書に記載されている内容を考慮して適切に変更された公知の技術に従って用い、発現ベクターを構築することができる。次いで、これは、本発明のペプチドを発現し産生させるのに適した宿主細胞を形質転換するのに用いられる。 The polynucleotide (typically DNA) is then expressed in a suitable host to produce a peptide comprising the compound of the invention. Therefore, the DNA encoding the peptide constituting the compound of the present invention can be used in accordance with a known technique appropriately modified in consideration of the contents described in this specification, and an expression vector can be constructed. . This is then used to transform a host cell suitable for expressing and producing the peptide of the invention.

本発明の化合物を構成しているペプチドをコードするＤＮＡは、適切な宿主へ導入する際、各種の別のＤＮＡ配列に結合することができる。随伴するＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入方法、およびエピゾームの維持または組込みを所望するか否かによって決まる。一般に、発現のための適切な方向および正確なリーディングフレームで、ＤＮＡをプラスミドなどの発現ベクターに挿入する。必要に応じて、ＤＮＡは、所望の宿主により認識される適切な転写および翻訳を制御する調節ヌクレオチド配列に結合させることができるが、かかる調節ヌクレオチド配列は一般に発現ベクターで入手できる。次いで、標準法によりベクターを宿主へ導入する。次いで、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞は、本明細書に記載の技術を考慮して当業者に周知の十分な時間と適切な条件下で培養し、ペプチドを発現させ、次いで、これを回収することができる。 The DNA encoding the peptide constituting the compound of the present invention can be bound to various other DNA sequences when introduced into an appropriate host. The accompanying DNA depends on the nature of the host, how the DNA is introduced into the host, and whether it is desired to maintain or integrate the episome. In general, DNA is inserted into an expression vector, such as a plasmid, in the proper orientation for expression and in the correct reading frame. If desired, the DNA can be ligated to regulatory nucleotide sequences that control proper transcription and translation recognized by the desired host, but such regulatory nucleotide sequences are generally available in expression vectors. The vector is then introduced into the host by standard methods. The host cells transformed with the recombinant DNA of the invention are then cultured for a sufficient time and under appropriate conditions well known to those skilled in the art in view of the techniques described herein to express the peptide, This can then be recovered.

多数の発現系が知られており、例えば、細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞が挙げられる。 Numerous expression systems are known, such as bacteria (eg E. coli and Bacillus subtilis), yeast (eg Saccharomyces cerevisiae), filamentous fungi (eg Aspergillus). )), Plant cells, animal cells and insect cells.

また本発明は、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物で形質転換した宿主細胞に関する。宿主細胞は原核生物であっても、真核生物であってもよい。細菌細胞は、原核生物の宿主細胞であるのが好ましく、典型的には、大腸菌の菌株であって、例えば、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、米国）から入手可能な大腸菌ＤＨ５株、およびＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）から入手可能な大腸菌株ＲＲｌ株（ＡＴＣＣ番号３１３４３）である。好ましい真核生物の宿主細胞としては、酵母細胞および哺乳動物細胞が挙げられ、好ましくは例えば、マウス、ラット、サルまたはヒトの線維芽細胞系由来の脊椎動物細胞である。酵母宿主細胞としてはＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられるが、これらは、一般に、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ９２０３７、米国）から入手可能である。好ましい哺乳動物宿主細胞としては、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ１６５８としてＡＴＣＣから入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、およびＣＲＬ１６５０としてＡＴＣＣから入手可能なサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞が挙げられる。形質転換した宿主細胞それ自体の他に、本発明はさらに、栄養培地中のそれらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に同質である）培養物、またはモノクローナル培養物から誘導される培養物を意図する。 The present invention also relates to a host cell transformed with the polynucleotide vector construct of the present invention. The host cell may be prokaryotic or eukaryotic. The bacterial cell is preferably a prokaryotic host cell, typically a strain of E. coli, for example, Bethesda Research Laboratories Inc. E. coli DH5 strain available from (Bethesda, MD, USA) and E. coli strain RRl strain (ATCC No. 31343) available from American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA). Preferred eukaryotic host cells include yeast cells and mammalian cells, preferably vertebrate cells derived from, for example, mouse, rat, monkey or human fibroblast cell lines. Yeast host cells include YPH499, YPH500 and YPH501, which are generally available from Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, USA). Preferred mammalian host cells include Chinese hamster ovary (CHO) cells available from ATCC as CCL61, NIH Swiss mouse embryo cells NIH / 3T3 available from ATCC as CRL 1658, and monkeys available from ATCC as CRL 1650. Examples include kidney-derived COS-1 cells. In addition to the transformed host cells themselves, the present invention further provides a culture of those cells in nutrient medium, preferably a monoclonal (clonally homogeneous) culture, or a culture derived from a monoclonal culture. Intended for things.

本発明のペプチドは、例えばヒトまたは動物の患者における血管新生を阻害するのに有用である。従って、本発明のさらなる態様は、薬剤として使用するための本発明のペプチドまたは変異体を提供する。また本発明は、本発明のペプチドまたは変異体と薬剤として許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。 The peptides of the invention are useful for inhibiting angiogenesis, for example in human or animal patients. Accordingly, a further aspect of the present invention provides a peptide or variant of the present invention for use as a medicament. The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the peptide or variant of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

本組成物または製剤は、好適には単位剤形で提供することができ、それは薬学分野で周知の任意の方法により調製することができる。かかる方法は、有効成分（本発明のペプチドまたは変異体）を１種または複数の副成分が構成する担体と一緒に会合体へ取り入れるステップを含む。一般に、製剤は、有効成分を液体担体もしくは微粉固体担体またはその両方と一緒に会合体へ均一かつ密に取り入れることによって、その後必要に応じて、生成物を成形することによって調製する。 The composition or formulation can suitably be provided in unit dosage form, which can be prepared by any method well known in the pharmaceutical art. Such a method includes the step of incorporating an active ingredient (a peptide or variant of the present invention) into an aggregate together with a carrier constituted by one or more accessory ingredients. In general, the formulations are prepared by uniformly and intimately bringing into association the active ingredient with liquid carriers or finely divided solid carriers or both, and then, if necessary, shaping the product.

経口投与に好適な本発明による製剤は、不連続単位として、例えば、それぞれ所定量の有効成分を含有しているカプセル剤、カシェ剤または錠剤として；散剤または顆粒剤として；水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁液として；あるいは水中油滴型乳濁液または油中水滴型乳濁液として提供することができる。また、有効成分はボーラス剤、舐剤またはペースト剤として提供することもできる。 Formulations according to the present invention suitable for oral administration are as discrete units, eg as capsules, cachets or tablets each containing a predetermined amount of the active ingredient; as a powder or granules; aqueous or non-aqueous liquids Or as an oil-in-water emulsion or a water-in-oil emulsion. The active ingredient can also be provided as a bolus, electuary or paste.

錠剤は、圧縮または成形によって、場合により１種または複数の副成分と一緒に製造することができる。圧縮錠剤は、例えば、粉剤または粒剤などの流動性形態の有効成分を、場合により結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、ナトリウムスターチグリコレート、架橋結合ポビドン、架橋結合カルボキシルメチルセルロースナトリウム）、界面活性または分散剤と一緒に混合して、好適な機械で圧縮することにより製造することができる。成形錠剤は、好適な機械で、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を成形することにより製造することができる。錠剤は、場合により被覆されていてもよく、刻み目を入れられていてもよく、また、例えば、所望の放出プロファイルを提供するために異なる割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、そこでの有効成分の徐放または制御放出が提供されるように製剤化することができる。 A tablet may be made by compression or molding, optionally with one or more accessory ingredients. Compressed tablets contain the active ingredient in a flowable form, such as a powder or granules, optionally with a binder (eg, povidone, gelatin, hydroxypropylmethylcellulose), a lubricant, an inert diluent, a preservative, a disintegrant (eg, , Sodium starch glycolate, cross-linked povidone, sodium cross-linked carboxymethylcellulose), mixed with surfactants or dispersants and compressed by a suitable machine. Molded tablets can be made by molding in a suitable machine a mixture of the powdered compound moistened with an inert liquid diluent. The tablets may optionally be coated and scored, for example, using different proportions of hydroxypropylmethylcellulose to provide the desired release profile, Formulations may be such that release or controlled release is provided.

局所経口投与に好適である製剤としては、風味付けした基剤（通常、ショ糖およびアラビアゴムまたはトラガカントゴム）中に有効成分を含むロゼンジ剤；ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアラビアゴムなどの不活性基剤中に有効成分を含む錠剤；ならびに好適な液体担体中に有効成分を含む洗口剤が挙げられる。 Formulations suitable for topical oral administration include lozenges containing the active ingredient in a flavored base (usually sucrose and gum arabic or tragacanth); gelatin and glycerin, or inert such as sucrose and gum arabic Tablets containing the active ingredient in a base; and mouthwashes containing the active ingredient in a suitable liquid carrier.

非経口投与に好適である製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤に対象の服用者の血液との等張性を付える溶質を含有していてもよい、水溶性および非水溶性の殺菌注射溶液；ならびに懸濁化剤および粘稠化剤を含んでいてもよい水溶性および非水溶性の殺菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位投与用量容器または多回投与用量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供することができ、使用直前に、殺菌液体担体（例えば、注射剤用の水）を添加することだけが必要であるフリーズドライされた（凍結乾燥された）状態で保管することができる。 Formulations suitable for parenteral administration may contain antioxidants, buffers, bacteriostatic agents, and solutes that can be made isotonic with the blood of the intended user in the formulation. And water-insoluble sterile injectable solutions; and water-soluble and water-insoluble sterile suspensions that may contain suspending and thickening agents. The formulation can be provided in unit-dose containers or multi-dose containers (eg, sealed ampoules and vials), just by adding a sterile liquid carrier (eg, water for injection) just prior to use. It can be stored in the necessary freeze-dried (lyophilized) state.

即時調合注射液および懸濁液は、前述の種類の殺菌済み粉剤、粒剤および錠剤から調製することができる。 Extemporaneous injection solutions and suspensions can be prepared from sterile powders, granules, and tablets of the kind previously described.

好ましい単位用量製剤は、日用量もしくは日用単位、日用副用量またはその適切な分割量の有効成分を含有しているものである。 Preferred unit dosage formulations are those containing a daily dose or daily unit, a daily sub-dose or an appropriate divided amount thereof of an active ingredient.

上で詳しく説明した成分以外に、本発明の製剤は、当該製剤のタイプを考慮して、当技術分野で慣用の他の薬剤を含んでいてもよく、例えば、経口投与に好適なものは着香剤を含んでいてもよいことは理解すべきである。 In addition to the components described in detail above, the formulations of the present invention may contain other drugs commonly used in the art, taking into account the type of formulation, for example those suitable for oral administration. It should be understood that flavoring agents may be included.

本発明の化合物の一部は、塩の形態であることは理解されよう。 It will be appreciated that some of the compounds of the present invention are in the form of salts.

治療で好適に用いられ得る塩としては、例えば、適切な塩基から誘導される生理学的に許容される塩基塩が挙げられ、例としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、アンモニウム塩およびＮＸ_４ ^＋（式中、ＸはＣ_１〜４アルキルである）塩がある。生理学的に許容される酸性塩としては、塩酸塩、硫酸塩、メシル酸塩、ベシル酸塩、リン酸塩およびグルタミン酸塩などが挙げられる。 Salts that can be suitably used in therapy include, for example, physiologically acceptable base salts derived from appropriate bases, such as alkali metal (eg, sodium) salts, alkaline earth metals ( For example, magnesium) salts, ammonium salts, and NX ₄ ⁺ (wherein X is C _1-4 alkyl) salts. Examples of physiologically acceptable acidic salts include hydrochloride, sulfate, mesylate, besylate, phosphate, and glutamate.

本発明による塩は、慣用の方法で、例えば、親化合物を適切な塩基と反応させて対応する塩基塩を形成させることによって、または親化合物を適切な酸と反応させて対応する酸性塩を形成させることによって調製することができる。 The salts according to the invention are prepared in a conventional manner, for example by reacting the parent compound with a suitable base to form the corresponding base salt or by reacting the parent compound with a suitable acid to form the corresponding acid salt. Can be prepared.

本発明の前述の化合物またはその製剤は、経口投与および非経口投与（例えば、皮下投与または筋肉内投与）をはじめとする、すべての慣用の方法によって投与することができる。この治療は、単回投与、またはある期間にわたる複数回投与から構成され得る。 The aforementioned compounds of the invention or formulations thereof can be administered by any conventional method, including oral and parenteral (eg, subcutaneous or intramuscular). This treatment may consist of a single dose or multiple doses over a period of time.

本発明の化合物は単独で投与することができるが、１種または複数の許容される担体と一緒に医薬製剤として提供することが望ましい。１種または複数の担体は、本発明の化合物と適合し、その服用者にとって有害でないという点で許容可能でなければならない。典型的には、担体は、殺菌され、発熱性物質を含まない、水または生理食塩水である。 While it is possible for a compound of the present invention to be administered alone, it is preferable to provide it as a pharmaceutical formulation with one or more acceptable carriers. The carrier or carriers must be acceptable in that it is compatible with the compound of the present invention and not deleterious to the user. Typically, the carrier is water or saline that is sterilized and free of pyrogens.

本ペプチドまたはその変異体が、口腔粘膜（頬粘膜、舌下粘膜または歯肉粘膜を含む）を介して送達される場合、あるいは液体の形態で（例えば、水溶液で）静脈内投与、皮下投与または筋肉内投与により投与される場合が特に好ましい。 When the peptide or variant thereof is delivered via the oral mucosa (including buccal mucosa, sublingual mucosa or gingival mucosa), or in liquid form (eg, in aqueous solution) intravenously, subcutaneously or muscle It is particularly preferred to administer by internal administration.

本発明のペプチドまたはその変異体の１回または複数回の用量は医師によって決定され得るが、それは治療する疾患に応じて変わり得る。典型的には、その用量は、疾病または疾患の症状を有効範囲まで改善するのに効果的である。 The single or multiple doses of the peptides of the invention or variants thereof can be determined by the physician, but can vary depending on the disease being treated. Typically, the dose is effective to ameliorate the symptoms of the disease or disorder to the effective range.

本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドもしくは変異体、または前記ペプチドをコードしているポリヌクレオチドもしくは発現ベクターを投与することを含む、患者の血管新生を阻害する方法を提供する。典型的には、患者は、有害な血管新生がある疾患、または血管新生を阻害することが望ましい疾患に罹患しているか、これに罹患しやすい。 A further aspect of the invention provides a method of inhibiting angiogenesis in a patient comprising administering a peptide or variant of the invention, or a polynucleotide or expression vector encoding said peptide. Typically, a patient is suffering from or susceptible to a disease with deleterious angiogenesis, or a disease where it is desirable to inhibit angiogenesis.

有害な血管新生は様々な疾病および病状に関係している。これらには、癌、特定の感染症、特定の自己免疫障害、血管奇形、ディジョージ症候群、ＨＨＴ、海綿状血管腫、アテローム性動脈硬化症、移植動脈症、肥満、乾癬、疣贅、アレルギー性皮膚炎、傷跡ケロイド、化膿性肉芽腫、水疱形成疾患、ＡＩＤＳ患者のカポジ肉腫、硝子体過形成遺残症、糖尿病性網膜症、末熟児網膜症、脈絡膜血管新生、原発性肺高血圧症、喘息、鼻茸、炎症性腸疾患および歯槽膿漏症、腹水、腹膜癒着、子宮内膜症、不正子宮出血、卵巣嚢胞、卵巣過剰刺激、関節炎、滑膜炎、骨髄炎および骨増殖体形成が挙げられる（例えば、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ、２００３、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ９、６５３〜６６０を参照されたい。なお、これは参照により本明細書に援用するものとする）。従って、本発明のさらなる態様は、これらの疾患または症状（特に、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、潰瘍、子宮内膜症および乾癬）のいずれかに罹患している患者または罹患しやすい患者を治療する方法であって、前記方法が、患者に、有効量の本発明のペプチドもしくは変異体またはそれをコードしているポリヌクレオチドもしくは発現ベクターを投与することを含む、方法を含んでいる。 Adverse angiogenesis is associated with a variety of diseases and conditions. These include cancer, specific infections, specific autoimmune disorders, vascular malformations, DiGeorge syndrome, HHT, spongiform hemangioma, atherosclerosis, transplant arterial disease, obesity, psoriasis, warts, allergic Dermatitis, scar keloid, purulent granuloma, blistering disease, Kaposi's sarcoma of AIDS patients, remnant vitreous hyperplasia, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, choroidal neovascularization, primary pulmonary hypertension, Asthma, nasal polyposis, inflammatory bowel disease and alveolar pyorrhea, ascites, peritoneal adhesions, endometriosis, malformed uterine bleeding, ovarian cyst, ovarian hyperstimulation, arthritis, synovitis, osteomyelitis and bone growth (See, eg, Carmelite, 2003, Nature Medicine 9, 653-660, which is hereby incorporated by reference). Accordingly, a further aspect of the present invention provides a patient or affliction suffering from any of these diseases or symptoms (particularly cancer, diabetic retinopathy, macular degeneration, rheumatoid arthritis, ulcers, endometriosis and psoriasis). A method of treating a patient susceptible to treatment comprising administering to a patient an effective amount of a peptide or variant of the invention or a polynucleotide or expression vector encoding the same. It is out.

本発明のさらなる態様は、患者の有害な血管新生を治療する薬剤の製造における本発明のペプチドもしくは変異体またはそれをコードしているポリヌクレオチドもしくは発現ベクターの使用；ならびに、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、潰瘍、子宮内膜症および乾癬のいずれかに罹患している患者または罹患しやすい患者を治療する薬剤の製造における本発明のペプチドもしくは変異体またはそれをコードしているポリヌクレオチドもしくは発現ベクターの使用を含んでいる。 A further aspect of the invention is the use of a peptide or variant of the invention or a polynucleotide or expression vector encoding it in the manufacture of a medicament for treating adverse angiogenesis in a patient; and cancer, diabetic retinopathy , Peptides or variants of the invention in the manufacture of a medicament for the treatment of patients suffering from or susceptible to macular degeneration, rheumatoid arthritis, ulcers, endometriosis and psoriasis, or encoding the same Including the use of polynucleotides or expression vectors.

ここでは、以下の実施例および図を参照して、より詳細に本発明を記載する。 The invention will now be described in more detail with reference to the following examples and figures.

デコリンは配列番号１であり；ＬＲＲ３は配列番号６であり；ＬＲＲ４は配列番号７であり；ＬＲＲ５は配列番号２であり；スクランブルＬＲＲ５は配列番号３である。 Decorin is SEQ ID NO: 1; LRR3 is SEQ ID NO: 6; LRR4 is SEQ ID NO: 7; LRR5 is SEQ ID NO: 2; scrambled LRR5 is SEQ ID NO: 3.

実施例１：ヒトデコリンコアタンパク質ロイシンリッチリピート５由来のペプチドは、複数の機序によって血管新生を強く阻害する
本実施例で用いられる略語は次の通りである：ＤＣＮ：デコリン；ＬＲＲ：ロイシンリッチリピート；ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子；ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子；ＴＧＦ：トランスフォーミング増殖因子；ＴＮＦ：腫瘍壊死因子；ＦＢＳ：ウシ胎児血清；ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン；ＧＡＧ：グリコサミノグリカン；ＰＧ：プロテオグリカン；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート；ＴＵＮＥＬ：ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介性ｄＵＴＰニック末端標識；ＨＵＶＥＣ：ヒト臍帯血管内皮細胞；ＦＡＫ：局所接着キナーゼ；ＥＣ：内皮細胞、ＣＤ：円偏光二色性。 Example 1: Peptide derived from human decorin core protein leucine rich repeat 5 strongly inhibits angiogenesis by multiple mechanisms Abbreviations used in this example are as follows: DCN: decorin; LRR: leucine rich VEGF: Vascular endothelial growth factor; bFGF: Basic fibroblast growth factor; TGF: Transforming growth factor; TNF: Tumor necrosis factor; FBS: Fetal bovine serum; BSA: Bovine serum albumin; GAG: Glycosaminoglycan PG: proteoglycan; PBS: phosphate buffered saline; FITC: fluorescein isothiocyanate; TUNEL: terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling; HUVEC: human umbilical cord vascular endothelial cells; FAK: local adhesion kinase; E C: Endothelial cells, CD: Circular dichroism.

過度の血管新生は多くのヒトの疾患に関係しており、血管新生を阻害することは薬剤開発の重要な分野である。デコリンが、細胞外の可溶性因子として用いられた場合に血管新生阻害剤として機能し得るかどうかについて相反する報告があった。本研究で、本発明者らは、精製デコリンだけでなく、デコリンコアタンパク質の２６残基ロイシンリッチリピート５（ＬＲＲ５）が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）誘導性血管新生および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）誘導性血管新生の両方を阻害することにより血管新生阻害剤として強く機能することを証明する。ペプチドＬＲＲ５は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の刺激による内皮細胞（ＥＣ）遊走、マトリゲル上の管腔形成、フィブロネクチンへの細胞接着、ならびにＥＣアポトーシスの誘導をはじめとする血管新生の複数の局面を、それらの増殖に有意な影響を及ぼすことなく、阻害した。さらに本発明者らは、ＬＲＲ５の異なるサブ領域に由来するペプチドが血管新生の異なる局面を阻害し、中央領域（ＬＲＲ５Ｍ、１２残基）がＬＲＲ５よりも最高１０００倍まで内皮細胞管腔形成を阻害することを証明した。Ｃ末端領域（ＬＲＲ５Ｃ）はＶＥＧＦの刺激による内皮細胞遊走を強く阻害したが、Ｎ末端領域（ＬＲＲ５Ｎ）は、フィブロネクチンへの内皮細胞接着の阻害活性がＬＲＲ５と同程度である。ＬＲＲ５ＭおよびＬＲＲ５Ｎはともにカスパーゼ依存的経路を介してＬＲＲ５と同様に用量依存的にＥＣアポトーシスを誘導したが、ＬＲＲ５Ｃはかかる機能を持っていない。さらに本発明者らは、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍによる管腔形成阻害は、それらがＶＥＧＦ誘導性局所接着キナーゼの活性化と局所接着およびＥＣでのアクチンストレスファイバーの構築を抑制する能力と連動しているが、マトリックスへの内皮細胞接着を阻害するそれらの能力とは連動していないことを証明した。円偏光二色性による研究では、ＬＲＲ５が溶液中で３_１０ヘリックスとβ−シート構造の間の相互変換を受けること（これは、この抗血管新生活性に関する潜在的に重要な特性である）を明らかにした。従って、ペプチドＬＲＲ５およびその誘導体は、抗血管新生剤のさらなる開発において基本型として役立ち得る新規の血液新生阻害剤である。 Excessive angiogenesis is associated with many human diseases, and inhibiting angiogenesis is an important area of drug development. There have been conflicting reports as to whether decorin can function as an angiogenesis inhibitor when used as an extracellular soluble factor. In this study, we not only purified decorin but also decorin core protein 26-residue leucine rich repeat 5 (LRR5), vascular endothelial growth factor (VEGF) -induced angiogenesis and basic fibroblast proliferation. It demonstrates that it functions strongly as an angiogenesis inhibitor by inhibiting both factor (bFGF) -induced angiogenesis. Peptide LRR5 exhibits multiple aspects of angiogenesis including endothelial cell (EC) migration by stimulation of vascular endothelial growth factor (VEGF), lumen formation on Matrigel, cell adhesion to fibronectin, and induction of EC apoptosis. Inhibited without significant effect on their growth. In addition, we found that peptides derived from different subregions of LRR5 inhibit different aspects of angiogenesis, and the central region (LRR5M, 12 residues) inhibits endothelial cell lumen formation up to 1000 times that of LRR5. Prove to do. The C-terminal region (LRR5C) strongly inhibited endothelial cell migration by VEGF stimulation, whereas the N-terminal region (LRR5N) has the same activity of inhibiting endothelial cell adhesion to fibronectin as LRR5. Both LRR5M and LRR5N induced EC apoptosis in a dose-dependent manner similar to LRR5 via a caspase-dependent pathway, but LRR5C does not have such a function. In addition, we found that the inhibition of lumen formation by LRR5 and LRR5M is linked to their ability to suppress VEGF-induced local adhesion kinase activation and local adhesion and the assembly of actin stress fibers in EC. Proved not to be linked to their ability to inhibit endothelial cell adhesion to the matrix. In a study by circular dichroism, to undergo mutual conversion between 3 ₁₀ helices and β- sheet structure LRR5 is in solution (which is a potentially important properties for this anti-angiogenic activity) Was revealed. Thus, peptide LRR5 and its derivatives are novel angiogenesis inhibitors that can serve as a basic type in the further development of anti-angiogenic agents.

タンパク質は、それらの機能性ドメインを介して他の分子と相互作用することによってそれらの機能を実行する。これらのドメインは、大きさ、組成および構造の点で多様である。近年、治療用途のためのタンパク質の開発に多大な努力が払われてきた。しかし、薬剤としてタンパク質を使用する場合、その低いバイオアベイラビリティー、抗原性、好ましくない薬物動態、およびバッチ間生産の生物活性における不均一により制限がある（１）。一方、小型ペプチドは、自動ペプチド合成機を用いる合成によって生産が容易であること、抗原性が低いこと、水への溶解性が高いこと、およびバイオアベイラビリティーが改善され経口送達に有効であることといった長所を有する（２）。かかるペプチドは、完全または部分的タンパク質機能モジュール、ならびに有望なタンパク質間相互作用部位を示し得る（３〜６）。 Proteins perform their functions by interacting with other molecules through their functional domains. These domains vary in size, composition and structure. In recent years, great efforts have been made to develop proteins for therapeutic use. However, the use of protein as a drug is limited by its low bioavailability, antigenicity, unfavorable pharmacokinetics, and heterogeneity in bioactivity of batch-to-batch production (1). Small peptides, on the other hand, are easy to produce by synthesis using an automated peptide synthesizer, have low antigenicity, have high solubility in water, and have improved bioavailability and are effective for oral delivery. (2). Such peptides may exhibit complete or partial protein function modules as well as potential protein-protein interaction sites (3-6).

血管新生（現存の脈管構造からの新しい血管の形成）は、細胞外マトリックスの分解、内皮細胞増殖および遊走、毛細血管形成およびマトリックスリモデリングが関与する多重ステップ工程である（７、８）。増殖因子およびそれらの細胞表面受容体、細胞外マトリックス分子、インテグリン、マトリックスメタロプロテアーゼをはじめとする多くのタンパク質とその阻害剤は、この工程に関与している。エンドスタチンおよびアンギオスタチン（それぞれ、コラーゲンおよびプラスミノーゲンのフラグメントである）などの数種類の内因性タンパク質は、血管新生の強力な阻害剤である（９、１０）。過度の血管新生はヒトの多くの疾患に関与するので、血管新生阻害剤の開発は薬剤開発の重要な分野である。 Angiogenesis (formation of new blood vessels from existing vasculature) is a multi-step process involving extracellular matrix degradation, endothelial cell proliferation and migration, capillary formation and matrix remodeling (7, 8). Many proteins and their inhibitors are involved in this process, including growth factors and their cell surface receptors, extracellular matrix molecules, integrins, matrix metalloproteases. Several endogenous proteins such as endostatin and angiostatin (which are fragments of collagen and plasminogen, respectively) are potent inhibitors of angiogenesis (9, 10). Since excessive angiogenesis is involved in many human diseases, the development of angiogenesis inhibitors is an important area of drug development.

小型デルマタン硫酸プロテオグリカン（ＰＧ）であるデコリンは、細胞外マトリックスに遍在する成分であるが、そこでデコリンは、コラーゲン細線維と結合して優先的に見出される。その主要な機能は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦβ１）の貯蔵部として役立つだけでなく、コラーゲン線維素生成の制御、フィブロネクチンおよびトロンボスポンジンとの結合を介した組織完全性の維持が含まれる（１１〜１４）。デコリンは、フィブロネクチンにおける細胞接着と伸展を阻害する（１５）。さらにデコリンが腫瘍細胞中で過剰発現されるか、組換えタンパク質として提供された場合、様々な組織学的バックグラウンドを有する各種の腫瘍細胞の増殖を、主として表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼの持続的不活性化を介して阻害する（１６、１７）。デコリンの発現は、血管新生中に内皮細胞で誘導されるが、遊走および増殖が刺激される時には誘導されない。従って、デコリンは、血管新生の後期段階の期間に、分化内皮表現型を安定させる原線維性細胞周囲マトリックスの形成をサポートし得ると仮定された（１８）。しかし、血管新生阻害剤としてのデコリンの相反する報告があった。デコリンは、腫瘍細胞によるＶＥＧＦ産生を阻害することにより、腫瘍血管新生を間接的に抑制することが報告された（１９）。レトロウイルスを形質導入することによる内皮細胞でのデコリンの高発現は、ＥＣ遊走を阻害した（１８）。さらに、ＥＣがデコリンをコートした表面で増殖した場合、精製デコリンは、内皮細胞遊走とコラーゲンＩ格子内の管腔形成を阻害した（２０）。一方、組換えデコリンは、マトリゲル上での内皮細胞管腔形成に対して効果がないこと（１９）、及び、アデノウイルス形質導入によるＥＡ．ｈｙ９２６ＥＣでのデコリン発現が、ＥＣアポトーシスを阻害しながらコラーゲン格子内の管腔形成を促進したこと（２１）が報告されている。 Decorin, a small dermatan sulfate proteoglycan (PG), is a ubiquitous component in the extracellular matrix, where it is found preferentially in association with collagen fibrils. Its primary function not only serves as a reservoir for transforming growth factor (TGFβ1), but also includes control of collagen fibrinogenesis and maintenance of tissue integrity through binding to fibronectin and thrombospondin (11 -14). Decorin inhibits cell adhesion and spreading in fibronectin (15). In addition, when decorin is overexpressed in tumor cells or provided as a recombinant protein, the growth of various tumor cells with various histological backgrounds is mainly induced by epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase. Through persistent inactivation of (16, 17). Decorin expression is induced in endothelial cells during angiogenesis but not when migration and proliferation are stimulated. Thus, it was postulated that decorin could support the formation of a fibrillar pericellular matrix that stabilizes the differentiated endothelial phenotype during the late stages of angiogenesis (18). However, there have been conflicting reports of decorin as an angiogenesis inhibitor. Decorin has been reported to indirectly suppress tumor angiogenesis by inhibiting VEGF production by tumor cells (19). High expression of decorin in endothelial cells by transducing retrovirus inhibited EC migration (18). Furthermore, when EC was grown on decorin-coated surfaces, purified decorin inhibited endothelial cell migration and lumen formation within the collagen I lattice (20). On the other hand, recombinant decorin has no effect on endothelial cell lumen formation on Matrigel (19) and EA. It has been reported that decorin expression in hy926 EC promoted lumen formation in the collagen lattice while inhibiting EC apoptosis (21).

構造上、デコリンは、スモールロイシンリッチリピートＰＧの増殖ファミリーに属している。デコリンは、１つのコンドロイチン硫酸塩またはデルマタン硫酸グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に結合している３５９個のアミノ酸のコアタンパク質を含んでいる（１１）。この成熟タンパク質は種を超えて高度に保存されており、ジスルフィド結合した末端配列に隣接した１０個のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を保持している中央ドメインからなる。アミノ末端は、ＧＡＧに対する１つの付着部位を有しているが、中央ドメインは３つのＮ−結合可能なグリコシル化部位を有している。ＬＲＲはタンパク質間相互作用に関与し、ビグリカン（ｂｉｇｌｙｃａｎ）、フィブロモジュリン（ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）およびルミカン（ｌｕｍｉｃａｎ）などのＰＧをはじめとする多数のタンパク質中で発見されている（２２）。デコリンは、主としてコアタンパク質のＬＲＲ４およびＬＲＲ５を介してコラーゲンに結合する（２３）。さらに、ＴＧＦβに対する高親和性結合部位がＬＲＲ３とＬＲＲ５の間に位置する（２４）。デコリンのＴＧＦβへの結合は、ＴＧＦβがその受容体へ結合することを妨げ、ＴＧＦβ介在性細胞シグナル伝達を制御する（２５）。最近、生物学的活性デコリンは、溶液中でモノマーであり、従って、デコリンは、種々の様々な細胞外マトリックスタンパク質、増殖因子および細胞表面受容体に対する１価のリガンドであるとの報告があった（２６）。しかし、デコリンの結晶構造分析により、それが大きな界面部を有する安定した二量体であることが示された（２７）。 Structurally, decorin belongs to the growth family of small leucine-rich repeat PG. Decorin contains a core protein of 359 amino acids linked to one chondroitin sulfate or dermatan sulfate glycosaminoglycan (GAG) (11). This mature protein is highly conserved across species and consists of a central domain that retains 10 leucine-rich repeats (LRRs) flanked by disulfide-linked terminal sequences. The amino terminus has one attachment site for GAG, while the central domain has three N-linkable glycosylation sites. LRR is involved in protein-protein interactions and has been found in many proteins, including PGs such as biglycan, fibromodulin and lumican (22). Decorin binds to collagen primarily through the core proteins LRR4 and LRR5 (23). Furthermore, a high affinity binding site for TGFβ is located between LRR3 and LRR5 (24). Decorin binding to TGFβ prevents TGFβ from binding to its receptor and regulates TGFβ-mediated cell signaling (25). Recently, biologically active decorin has been reported to be a monomer in solution and therefore decorin is a monovalent ligand for a variety of different extracellular matrix proteins, growth factors and cell surface receptors. (26). However, the crystal structure analysis of decorin showed that it was a stable dimer with a large interface (27).

血管新生におけるデコリンコアタンパク質とそのＬＲＲリピートの役割を特徴づけ、小型ペプチドの血管新生阻害剤を開発する試みの中で、本発明者らは、合成ペプチド手法を用いて、血管新生におけるデコリンコアタンパク質とＬＲＲ３、ＬＲＲ４およびＬＲＲ５の役割を分析した。この２６残基のＬＲＲ５ペプチドは、強力な血管新生阻害剤であることが確認され、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよび血清誘導性血管新生を阻害した。ＬＲＲ５は、マトリゲル上のＶＥＧＦ誘導性ＥＣ管腔形成、ＥＣ遊走、ならびにフィブロネクチンへのＥＣ結合をはじめとする複数の機序により血管新生を阻害する。さらに、それはまた、カスパーゼ依存的経路によりＥＣアポトーシスを誘導した。機能的マッピングにより、血管新生の異なる局面を阻害したＬＲＲ５のサブ領域を同定した。重要なことに、中央の１２残基（ＬＲＲ５Ｍ）が、ＬＲＲ５に比べて最高１０００倍まで強くＥＣ管腔形成を特異的に阻害した。Ｃ末端の１３残基（ＬＲＲ５Ｃ）はＥＣ遊走を阻害する能力を維持したが、Ｎ末端の１３残基（ＬＲＲ５Ｎ）はフィブロネクチンへのＥＣ結合の阻害に非常に有効である。さらに、ＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５ＭはともにＥＣアポトーシスを誘導し、ＬＲＲ５ＭはＬＲＲ５と同様の効果があった。さらにメカニズム的研究を行ったところ、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５ＭのＥＣ管腔形成阻害能力は、ＶＥＧＦ誘導性ＦＡＫＹ３９７のリン酸化と、その後のＥＣにおける局所接着およびアクチンストレスファイバーの構築とをＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍが阻害していることに連動していることが示唆された。 In an attempt to characterize the role of decorin core protein and its LRR repeat in angiogenesis and develop a small peptide angiogenesis inhibitor, we used a synthetic peptide approach to determine the decorin core protein in angiogenesis. And the roles of LRR3, LRR4 and LRR5 were analyzed. This 26-residue LRR5 peptide was confirmed to be a potent angiogenesis inhibitor and inhibited VEGF, bFGF and serum-induced angiogenesis. LRR5 inhibits angiogenesis by multiple mechanisms including VEGF-induced EC tube formation on Matrigel, EC migration, and EC binding to fibronectin. Furthermore, it also induced EC apoptosis via a caspase-dependent pathway. Functional mapping identified LRR5 subregions that inhibited different aspects of angiogenesis. Importantly, the central 12 residues (LRR5M) specifically inhibited EC lumen formation up to 1000 times stronger than LRR5. The C-terminal 13 residue (LRR5C) maintained the ability to inhibit EC migration, while the N-terminal 13 residue (LRR5N) is very effective at inhibiting EC binding to fibronectin. Furthermore, both LRR5N and LRR5M induced EC apoptosis, and LRR5M had the same effect as LRR5. Further mechanistic studies showed that LRR5 and LRR5M's ability to inhibit EC tube formation was inhibited by LRR5 and LRR5M in VEGF-induced phosphorylation of FAK Y397, followed by local adhesion and construction of actin stress fibers in EC. It is suggested that it is linked to what is being done.

実験手順
試薬および抗体− 組換えヒトＶＥＧＦ_１６５および組換えヒトデコリン（ｒｈＤＣＮ）は、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．（ミネアポリス、米国）から購入した。塩基性ＦＧＦは、Ｐｒｏｍｅｇａ（マディション（Ｍａｄｄｉｓｉｏｎ）、米国）から入手した。ウシ関節軟骨由来の精製デコリン（ＤＣＮ）、ゼラチンおよびギムザ溶液は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）製であった。Ｆａｌｃｏｎ細胞培養インサート（８．０μｍ孔径）およびマトリゲルは、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ベッドフォード、マサチューセッツ州、米国）製であった。ヒト血漿フィブロネクチンはインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製であった。内皮培養培地ＣＳＣは、ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア、米国）製であった。汎用カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、メルク（Ｍｅｒｃｋ）製であった。シグマのウシ関節ＤＣＮタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０色素結合アッセイを用い、Ｓｉｇｍａウシ血清アルブミンを基準として測定した。ＤＣＮ純度は、ｎａｔｉｖｅおよびＳＤＳＰＡＧＥの双方によってチェックしたところ、９５％以上純粋であることが示された。ＤＣＮおよびｒｈＤＣＮ中のエンドトキシンレベルは、シグマ製のＥＴ０２００キットを用いて測定した。 Experimental Procedures Reagents and Antibodies-Recombinant human VEGF ₁₆₅ and recombinant human decorin (rhDCN) are available from R & D Systems Inc. (Minneapolis, USA). Basic FGF was obtained from Promega (Madition, USA). Purified decorin (DCN) derived from bovine articular cartilage, gelatin and Giemsa solution were from Sigma. Falcon cell culture inserts (8.0 μm pore size) and Matrigel were from BD Biosciences (Bedford, Massachusetts, USA). Human plasma fibronectin was from Invitrogen. Endothelial culture medium CSC was from Cell Systems (California, USA). The general-purpose caspase inhibitor z-VAD-fmk was manufactured by Merck. Sigma bovine joint DCN protein concentration was measured using the Bio-Rad protein Coomassie brilliant blue G-250 dye binding assay and based on Sigma bovine serum albumin. DCN purity was checked by both native and SDS PAGE and was shown to be over 95% pure. Endotoxin levels in DCN and rhDCN were measured using Sigma ET0200 kit.

ペプチド合成− ペプチドは、内部にＦＭＯＣ（フルオレニルメトキシカルボニル）化学を採用しているＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ペプチド合成機を用いて固相法により合成するか、市販原料（ＳｙｎＰｅｐ、カリフォルニア、米国）から購入した。ペプチドは、逆相ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥し、使用するまで−２０℃で保存した。 Peptide synthesis-Peptides can be synthesized by solid phase methods using a Perceptive Biosystems automated peptide synthesizer employing FMOC (fluorenylmethoxycarbonyl) chemistry or purchased from commercial sources (SynPep, California, USA) did. The peptide was purified by reverse phase HPLC, lyophilized and stored at −20 ° C. until use.

細胞培養− ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ヒト臍の緒から単離し、加湿した５％ＣＯ_２雰囲気下で３７℃にてＣＳＣ完全培地中で培養した。実験に使用したすべての細胞は３〜６継代であった。 Cell Culture-Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated from human umbilical cord and cultured in CSC complete medium at 37 ° C. in a humidified 5% CO ₂ atmosphere. All cells used in the experiment were between 3 and 6 passages.

内皮細胞管腔形成アッセイ− ２．５×１０^４のＨＵＶＥＣをペプチド（１ｎＭ〜１００μＭ）の様々な濃度で３０分間プレインキュベートした後、９６ウェルプレート中の固化した増殖因子低減マトリゲルに播種した。４〜６時間３７℃で、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ含有培地または非含有培地中でインキュベーションした後、細胞を固定化し、光学顕微鏡法（×１００）により管腔形成を分析した。各ウェルで４ヶ所のランダムフィールドを選択し、ＮＩＨＩｍａｇｅＪ１．３２ソフトウェアを使用して管腔長の合計を計測した。 Endothelial cell tube formation assay—2.5 × 10 ⁴ HUVECs were preincubated with various concentrations of peptide (1 nM-100 μM) for 30 minutes before seeding on solidified growth factor-reduced matrigel in 96 well plates. After incubation for 4-6 hours at 37 ° C. in 10 ng / ml VEGF or bFGF containing or non-containing media, cells were fixed and analyzed for lumen formation by light microscopy (× 100). Four random fields were selected in each well and the total lumen length was measured using NIH ImageJ 1.32 software.

細胞遊走アッセイ− 遊走アッセイは、以前に記載されたファルコン細胞培養インサートに改変を加えたものを用いて行った（２８）。簡単に説明すると、ＨＵＶＥＣを一晩飢餓させ、トリプシン処理し、３×１０^５細胞／ｍｌの最終濃度で懸濁した。ゼラチンコーティングした細胞培養インサート上に播種する前に、様々な濃度のペプチドを、２〜３×１０^４細胞とともに３７℃で３０分間プレインキュベートした。ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を下方チャンバーに入れた。次いで、構築した細胞培養インサートチャンバーを３７℃で１０〜１２時間インキュベートした。遊走しない細胞を綿球で除去した後、培養インサートの下方表面上の遊走細胞を固定化し、０．４％ギムザで染色し、光学顕微鏡（×２００）下で写真撮影した。各インサート中で５ヶ所のランダムフィールドを選択し、ＮＩＨＩｍａｇｅＪ１．３２ソフトウェアを用いて細胞数を測定した。 Cell migration assay-The migration assay was performed using a previously described Falcon cell culture insert with modifications (28). Briefly, HUVECs were starved overnight, trypsinized, and suspended at a final concentration of 3 × 10 ⁵ cells / ml. Various concentrations of peptide were preincubated with 2-3 × 10 ⁴ cells at 37 ° C. for 30 minutes before seeding on gelatin-coated cell culture inserts. VEGF (10 ng / ml) was placed in the lower chamber. The constructed cell culture insert chamber was then incubated at 37 ° C. for 10-12 hours. Non-migrated cells were removed with a cotton ball, and then migrated cells on the lower surface of the culture insert were fixed, stained with 0.4% Giemsa, and photographed under a light microscope (× 200). Five random fields were selected in each insert and the cell number was determined using NIH ImageJ 1.32 software.

増殖および細胞毒性の分析− 増殖と細胞毒性は、非放射性ＥＺ４Ｕ細胞増殖および細胞毒性アッセイキット（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ、ウィーン、オーストリア）を用いて、メーカーの取扱説明書に従って測定した。この方法は、生細胞がほとんど色調のないテトラゾリウム塩を強い色調のホルマザン誘導体に還元し得るという事実に基づいていた。この還元方法では機能的なミトコンドリアが必要であるが、これは細胞死後、数分以内に不活性化される。典型的な９６ウェルプレートアッセイにおいて、本発明者らは約３０００ＨＵＶＥＣ／ウェルを用いて、４６０ｎｍのホルマザン吸光度をミトコンドリア活性として示した。細胞は、２％ＦＢＳを入れたＣＳＣ培地中、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦまたはｂＦＧＦを含有または非含有で、各種濃度（１ｎＭから１００Ｍ）のペプチドとともに４８時間インキュベートした。細胞毒性分析については、ＨＵＶＥＣをペプチドと６時間インキュベートし、一方、増殖の測定には、４８時間のペプチドインキュベーションを用いた。 Proliferation and cytotoxicity analysis-Proliferation and cytotoxicity were measured using a non-radioactive EZ4U cell proliferation and cytotoxicity assay kit (Biomedica, Vienna, Austria) according to the manufacturer's instructions. This method was based on the fact that living cells can reduce tetrazolium salts with little color to strong formazan derivatives. This reduction method requires functional mitochondria, which are inactivated within minutes after cell death. In a typical 96 well plate assay, we showed 460 nm formazan absorbance as mitochondrial activity using approximately 3000 HUVEC / well. Cells were incubated for 48 hours with various concentrations (1 nM to 100 M) of peptides with or without 10 ng / ml VEGF or bFGF in CSC medium with 2% FBS. For cytotoxicity analysis, HUVECs were incubated with peptides for 6 hours, while 48 hours peptide incubation was used to measure proliferation.

細胞接着アッセイ− ＨＵＶＥＣを異なるペプチドで２０分間事前処理した後、フィブロネクチンをコーティングした２４ウェルプレート上にプレーティングし、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、接着した細胞を固定し、ギムザで染色した。接着した細胞数をウェル当たり５つのランダムフィールドで定量した。アッセイは二重に行い、別の日に３回繰り返した。 Cell adhesion assay-HUVECs were pretreated with different peptides for 20 minutes, then plated on fibronectin-coated 24-well plates and incubated at 37 ° C for 30 minutes. The adhered cells were then fixed and stained with Giemsa. The number of adherent cells was quantified in 5 random fields per well. The assay was performed in duplicate and repeated three times on another day.

アポトーシスアッセイ− アポトーシスは、以前に記載されたクロマチン断片形成の形態学的検出により分析した（２９）。４ウェルのチャンバースライド中で６０〜７０％細胞密度に増殖させたＨＵＶＥＣをペプチドと共に、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在または不在下、０．５％ＦＢＳ中にて４８時間インキュベートした。細胞を固定化し、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８で染色し、蛍光顕微鏡（×６３０）下で観察した。あるいは、ＴＵＮＥＬ染色は、ＡｐｏＡｌｅｒｔＤＮＡ断片形成アッセイキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）を用いて行った。アポトーシスは、細胞死検出ＥＬＩＳＡキット（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）を用いて数量化した。簡単に説明すると、２０，０００ＨＵＶＥＣ／ウェルを、０．２％ゼラチンでコーティングした２４ウェルプレート上に２４時間播種した後、ペプチドで処理した。細胞を異なる濃度のペプチドと共に、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと一緒に、またはＶＥＧＦなしで２４時間処理し、その後、トリプシンを用いて回収した。ＤＮＡ断片形成は、メーカーの取扱説明書に従い、細胞質ゾルのオリゴヌクレオソーム結合ＤＮＡを数量化することにより測定した。プレートに被覆されている抗ヒトヒストン抗体と、検出用ペルオキシダーゼに結合されている第２の抗ＤＮＡ抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下および不在下で、ペプチドで処理したＨＵＶＥＣの細胞画分（１３，０００×ｇ）を抗原源として用いた。アポトーシス誘導におけるペプチドの効果は、４０５ｎｍの吸光度値として示した。またこの実験は、１０μＭのベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトン（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）（汎用カスパーゼ阻害剤）の存在下で実施した。 Apoptosis assay-Apoptosis was analyzed by morphological detection of chromatin fragment formation as previously described (29). HUVECs grown to 60-70% cell density in 4-well chamber slides were incubated with peptides for 48 hours in 0.5% FBS in the presence or absence of 10 ng / ml VEGF. Cells were fixed, stained with Hoechst dye 33258, and observed under a fluorescence microscope (x630). Alternatively, TUNEL staining was performed using the ApoAlert DNA fragment formation assay kit (Clontech, USA). Apoptosis was quantified using a cell death detection ELISA kit (Roche Applied sciences, Germany). Briefly, 20,000 HUVEC / well were seeded on a 24-well plate coated with 0.2% gelatin for 24 hours and then treated with peptide. Cells were treated with different concentrations of peptide with or without 10 ng / ml VEGF for 24 hours and then harvested with trypsin. DNA fragment formation was measured by quantifying cytosolic oligonucleosome-bound DNA according to the manufacturer's instructions. In a sandwich ELISA using anti-human histone antibody coated on a plate and a second anti-DNA antibody conjugated to detection peroxidase, HUVEC treated with peptide in the presence and absence of 10 ng / ml VEGF. The cell fraction (13,000 × g) was used as the antigen source. The effect of the peptide in inducing apoptosis was expressed as an absorbance value of 405 nm. This experiment was also performed in the presence of 10 μM benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (OMe) fluoromethyl ketone (Z-VAD-FMK) (general-purpose caspase inhibitor).

固相結合アッセイ− ９６ウェルマイクロタイタープレートを４℃で一晩、１００μｇ／ｍｌのコラーゲンＩまたはフィブロネクチン溶液で被覆した。コントロールのウェルは、ＰＢＳに溶解した０．１％ＢＳＡでコーティングした。０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０ですすいだ後、ウェルを０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡで２時間プレインキュベートし、その後、様々な濃度のＦＩＴＣ標識したペプチドで４時間室温にてインキュベートした。ウェルに結合した蛍光は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（登録商標）ＧｅｍｉｎｉＸＳ二重走査分光蛍光計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、ドイツ）を用いて測定した。飽和グラフは、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．、米国）により、単一部位結合の非線形回帰分析を用いて取得した。分析はすべて三連で実施した。 Solid phase binding assay-96-well microtiter plates were coated overnight at 4 ° C with 100 μg / ml collagen I or fibronectin solution. Control wells were coated with 0.1% BSA dissolved in PBS. After rinsing with 0.15 M NaCl, 0.05% (v / v) Tween-20, the wells were preincubated with 0.1% (w / v) BSA for 2 hours, after which various concentrations of Incubated with FITC-labeled peptide for 4 hours at room temperature. Fluorescence bound to the wells was measured using a Spectramax® Gemini XS double scanning spectrofluorometer (Molecular Devices, Germany). Saturation graphs were obtained by Graph Pad Prism 4 (GraphPad Software Inc., USA) using single site binding nonlinear regression analysis. All analyzes were performed in triplicate.

ウェスタンブロットおよび免疫沈降− 飢餓ＨＵＶＥＣを別々に３０μＭの各種ペプチドで２時間処理した後、１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ_１６５に３０分間暴露した。これらの細胞を溶菌緩衝液（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）中に溶解させた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質濃度を調整した後、各試料からのタンパク質１００ｇをウェスタンブロット解析に用いた。ブロットは、ウサギ抗ＦＡＫ第１抗体（ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）と西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した第２抗体を用いて探索した。生成物は、高感度の化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）により可視化した。一方、同一試料からのタンパク質５００μｇをウサギ抗ＦＡＫ抗体で一晩４℃にて免疫沈降し、マウス抗リンＦＡＫ（Ｙ３９７）第１抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国）を用いて探索した。 Western Blot and Immunoprecipitation—Starved HUVECs were treated separately with 30 μM of various peptides for 2 hours before exposure to 15 ng / ml VEGF ₁₆₅ for 30 minutes. These cells were lysed in lysis buffer (Cell Signaling Technology, USA). After adjusting the protein concentration by the Bradford method, 100 g of protein from each sample was used for Western blot analysis. Blots were probed with a rabbit anti-FAK primary antibody (Upstate Biotechnologies, USA) and a secondary antibody labeled with horseradish peroxidase. The product was visualized with a highly sensitive chemiluminescent reagent (Pierce, USA). On the other hand, 500 μg of protein from the same sample was immunoprecipitated with rabbit anti-FAK antibody at 4 ° C. overnight and probed using mouse anti-phospho FAK (Y397) primary antibody (Chemicon, USA).

ＨＵＶＥＣにおける局所接着とアクチンストレスファイバーの分析− 細胞は、チャンバースライド上でほぼ集密するまで増殖させた。ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびペプチド（１００μＭ）をウェルへ添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。細胞を固定化し、透過処理し、パキシリンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）で染色した。スライドは、共焦点顕微鏡（オリンパス１×７０）下で観察した。アクチン細胞骨格の染色にはＴＲＩＴＣ結合ファロイジン（Ｓｉｇｍａ）を用い、核小体の対比染色にはＨｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８を用いた。 Analysis of local adhesion and actin stress fiber in HUVEC-Cells were grown to near confluence on chamber slides. VEGF (10 ng / ml) and peptide (100 μM) were added to the wells and incubated at 37 ° C. for 90 minutes. Cells were fixed, permeabilized, and stained with mouse monoclonal antibody to Paxillin (Upstate technology, USA) and FITC-labeled anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotechnology, USA). The slides were observed under a confocal microscope (Olympus 1 × 70). TRITC-conjugated phalloidin (Sigma) was used for staining of the actin cytoskeleton, and Hoechst dye 33258 was used for counterstaining of nucleoli.

円偏光二色性スペクトル解析− すべてのペプチドの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、１ｍＭ濃度で１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１ｍｍ路長石英セルを用いて室温にてＪＡＳＣＯＪ−８１０分光旋光計で記録した。スペクトルは５０ｎｍ／分の走査速度で１９０〜２６０ｎｍの間を記録し、３回の走査の平均を求めた。最終表示に対して基線を差し引いた。 Circular dichroism spectrum analysis-Circular dichroism (CD) spectra of all peptides are JASCO at room temperature using a 1 mm path length quartz cell in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) at 1 mM concentration. Recorded on a J-810 spectropolarimeter. The spectrum was recorded between 190 and 260 nm at a scanning speed of 50 nm / min, and the average of three scans was determined. The baseline was subtracted from the final display.

結果
デコリンおよびＬＲＲ５の抗血管新生作用
血管新生の阻害におけるデコリンの役割に関して、可溶性因子として用いた場合に相反する報告があった。ＥＣ管腔形成におけるデコリンの役割を明らかにするために、本発明者らは、ウシ関節軟骨由来の精製デコリンおよび昆虫細胞で発現される組換えヒトデコリンについて、マトリゲル上でのＨＵＶＥＣ管腔形成アッセイを用いて試験した。両デコリンは、増殖因子低減マトリゲル上で、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦで刺激したＨＵＶＥＣの管腔形成を強く阻害すること、また組換えヒトデコリンよりも精製ウシ関節デコリンが強く阻害することを見出した（図１Ａおよび図１Ｂ）。両デコリン調製物は、ｂＦＧＦ誘導性管腔形成よりもＶＥＧＦ誘導性管腔形成を強く阻害した。従って、この明細書は、その後の研究において主にＶＥＧＦ誘導性血管新生に焦点を合わせている。エンドトキシン混入はデコリン調製物では確認されておらず（方法の節を参照されたい）、このことは、抗血管新生活性がデコリンの比活性であることを裏付けている（データは示さず）。 Results Anti-angiogenic effects of decorin and LRR5 There have been conflicting reports regarding the role of decorin in inhibiting angiogenesis when used as a soluble factor. To elucidate the role of decorin in EC tube formation, we conducted a HUVEC tube formation assay on Matrigel for purified decorin from bovine articular cartilage and recombinant human decorin expressed in insect cells. And tested. Both decorins were found to strongly inhibit VEGF and bFGF-stimulated HUVEC tube formation on growth factor-reduced matrigel, and purified bovine joint decorin more strongly than recombinant human decorin (Figure 1A and FIG. 1B). Both decorin preparations inhibited VEGF-induced lumen formation more strongly than bFGF-induced lumen formation. Thus, this specification focuses primarily on VEGF-induced angiogenesis in subsequent studies. Endotoxin contamination has not been confirmed in decorin preparations (see methods section), confirming that anti-angiogenic activity is the specific activity of decorin (data not shown).

デコリンコアタンパク質中のＬＲＲドメインはデコリン機能において重要な役割を果たし、ＬＲＲ３〜５領域は、コラーゲンＩおよびＴＧＦβに結合する主要領域であることが明らかになっている（１４、２５）。本発明者らは、合成ペプチド手法を用いて、各ＬＲＲ３、ＬＲＲ４およびＬＲＲ５がＨＵＶＥＣ管腔形成を阻害し得るか否かについて試験を試みた。この試験で使用したすべてのペプチドを図２Ａに挙げる。ペプチドＬＲＲ５は、用量依存的にＥＣ管腔形成を効果的に阻害したが、１００μＭのＬＲＲ３およびＬＲＲ４は限界効果がわずかにあっただけであった（図２Ｂおよび図２Ｃ）。重要なことは、ＬＲＲ５アミノ酸配列がスクランブル化された場合（ＬＲＲ５Ｓ）、阻害作用が完全に失われたことである。表１から明らかなように、これらのペプチドは、１００μＭ以下で試験した場合にはＥＣに対して細胞傷害性ではない。従って、ＬＲＲ５は、配列依存的にマトリゲル上のＶＥＧＦ誘導性ＥＣ管腔形成を特異的に阻害し、血管新生阻害剤として機能する。血管新生は複数の工程を含んでいることから、本発明者らは、ＬＲＲペプチドについて、ＥＣ増殖と遊走を阻害するそれらの能力を試験した。図３から明らかなように、ペプチドＬＲＲ５は、推定ＥＤ_５０が１００ｎＭ〜１μＭで、用量依存的および配列依存的にＶＥＧＦ刺激によるＥＣ遊走を強く阻害したが、ＬＲＲ５Ｓにはかかる活性はなかった。また精製ウシデコリンもｎＭ濃度でＥＣ遊走を強く阻害した（図３Ａ）。また、デコリンおよびＬＲＲ５はともにｂＦＧＦ誘導性ＥＣ遊走を阻害したが（図３Ｂ）、ＶＥＧＦ刺激の場合と比べるとそれほど効果はなかった。 The LRR domain in decorin core protein plays an important role in decorin function, and the LRR 3-5 region has been shown to be the main region that binds collagen I and TGFβ (14, 25). The inventors attempted to test whether each LRR3, LRR4 and LRR5 could inhibit HUVEC lumen formation using a synthetic peptide approach. All peptides used in this study are listed in Figure 2A. Peptide LRR5 effectively inhibited EC tube formation in a dose-dependent manner, whereas 100 μM LRR3 and LRR4 had only marginal effects (FIGS. 2B and 2C). Importantly, when the LRR5 amino acid sequence was scrambled (LRR5S), the inhibitory effect was completely lost. As is apparent from Table 1, these peptides are not cytotoxic to EC when tested below 100 μM. Therefore, LRR5 specifically inhibits VEGF-induced EC lumen formation on Matrigel in a sequence-dependent manner and functions as an angiogenesis inhibitor. Since angiogenesis involves multiple steps, we tested their ability to inhibit EC proliferation and migration for LRR peptides. As is clear from FIG. 3, peptide LRR5 strongly inhibited VEGF-stimulated EC migration in a dose-dependent and sequence-dependent manner with an estimated ED ₅₀ of 100 nM to 1 μM, whereas LRR5S had no such activity. Purified bovine decorin also strongly inhibited EC migration at nM concentration (FIG. 3A). Both decorin and LRR5 inhibited bFGF-induced EC migration (FIG. 3B), but were not as effective as compared to VEGF stimulation.

一方、デコリンおよびＬＲＲ５はどちらも、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ刺激によるＥＣ増殖に対して有意な阻害作用を有しておらず、ＬＲＲ５にのみ１００μＭで穏やかな阻害作用があった（図４Ａおよび図４Ｂ）。 On the other hand, neither decorin nor LRR5 had a significant inhibitory effect on EC proliferation induced by VEGF or bFGF, and only LRR5 had a mild inhibitory effect at 100 μM (FIGS. 4A and 4B).

内皮細胞におけるアポトーシスの誘導は、血管新生を阻害するために抗血管新生分子により利用される機序の１つである。ＬＲＲ５がＨＵＶＥＣのアポトーシスを誘導する能力を有しているか否かについて試験するため、ペプチド処理細胞において、クロマチン断片の形態学的検出、ＴＵＮＥＬ染色、ならびに断片化ＤＮＡの定量的ＥＬＩＳＡ測定によりアポトーシスを分析した。図５Ａから明らかなように、ＬＲＲ５は、濃度依存的にＨＵＶＥＣでのアポトーシスを特異的に誘導した。１００μＭで、断片化クロマチンを有する多数の細胞が認められた。またＴＵＮＥＬ染色では、形態学的観察が認められた（図５Ｂ）。ＤＮＡ断片化のＥＬＩＳＡ測定では、ＬＲＲ５が、１００μＭでＶＥＧＦの存在下または不在下におけるアポトーシスを強く誘導し、またこの阻害は、汎用カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋがそのアポトーシス誘導活性を効果的に防止したので、カスパーゼ依存性であることが示唆された（図５Ｃ）。１００ｎＭのデコリンは、ＥＣアポトーシスを誘導しなかった（図５Ｃ）。 Induction of apoptosis in endothelial cells is one of the mechanisms utilized by anti-angiogenic molecules to inhibit angiogenesis. To test whether LRR5 has the ability to induce HUVEC apoptosis, analyze apoptosis in peptide-treated cells by morphological detection of chromatin fragments, TUNEL staining, and quantitative ELISA measurements of fragmented DNA did. As is clear from FIG. 5A, LRR5 specifically induced apoptosis in HUVEC in a concentration-dependent manner. At 100 μM, a large number of cells with fragmented chromatin were observed. In TUNEL staining, morphological observation was observed (FIG. 5B). In an ELISA measurement of DNA fragmentation, LRR5 strongly induced apoptosis in the presence or absence of VEGF at 100 μM, and this inhibition was achieved by the general caspase inhibitor z-VAD-fmk effectively Since it was prevented, it was suggested that it is caspase-dependent (FIG. 5C). 100 nM decorin did not induce EC apoptosis (FIG. 5C).

要約すると、デコリンおよびそのコアタンパク質ＬＲＲ５ドメインは、有効な血管新生阻害剤である。ＬＲＲ５ペプチドは、ＥＣ管腔形成、走化性遊走、およびアポトーシス誘導の阻害をはじめとする複数の機序によって血管新生を阻害する。ＬＲＲ５の抗血管新生活性は、配列依存性であり、かつ用量依存性である。 In summary, decorin and its core protein LRR5 domain are effective angiogenesis inhibitors. The LRR5 peptide inhibits angiogenesis by multiple mechanisms, including inhibition of EC lumen formation, chemotaxis migration, and apoptosis induction. The anti-angiogenic activity of LRR5 is sequence dependent and dose dependent.

ＬＲＲ５の異なる領域は各種抗血管新生機能を仲介する
この抗血管新生活性に関与しているＬＲＲ５内のサブ領域をマッピングし、より短鎖のペプチド血管新生阻害剤を取得するため、２６残基のＬＲＲ５を、さらにＬＲＲ５のＮ末端（ＬＲＲ５Ｎ、１３残基）部分、中央（ＬＲＲ５Ｍ、１２残基）部分およびＣ末端（ＬＲＲ５Ｃ、１３残基）部分を示す３種類のオーバーラップするペプチドに切り出した（図２Ａ）。興味深いことに、ＬＲＲ５Ｍペプチドが、マトリゲル上のＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ管腔形成をＬＲＲ５ペプチド以上に非常に強く阻害した（図６Ａ）。ＬＲＲ５は、約１００ｎＭのＥＤ_５０で用量依存的に管腔形成を阻害したが、ＬＲＲ５Ｍは、１０ｎＭ濃度で管腔形成を完全に阻害した。そのＥＤ_５０は１００ｐＭであり、ＬＲＲ５と比べると、最高１０００倍の強い効力があると推定された（図６Ｂ）。一方、ペプチドのＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５Ｃは、ＶＥＧＦ誘導性ＥＣ管腔形成を効果的に阻害することができない。またＬＲＲ５ペプチドは、不活性なＬＲＲ５Ｃを除き、用量依存的にｂＦＧＦ誘導性管腔形成も阻害した（図６Ｃ）。実験をＨＵＶＥＣの異なるバッチで繰り返した場合、一貫した結果が認められた（データは示さず）。 Different regions of LRR5 mediate various anti-angiogenic functions To map subregions within LRR5 involved in this anti-angiogenic activity and to obtain shorter peptide angiogenesis inhibitors, 26 residues Was further excised into three overlapping peptides showing the N-terminal (LRR5N, 13 residues), central (LRR5M, 12 residues) and C-terminal (LRR5C, 13 residues) portions of LRR5. (FIG. 2A). Interestingly, the LRR5M peptide inhibited VEGF-induced HUVEC lumen formation on Matrigel much more strongly than the LRR5 peptide (FIG. 6A). LRR5 inhibited tube formation in a dose-dependent manner with an ED ₅₀ of approximately 100 nM, whereas LRR5M completely inhibited tube formation at a concentration of 10 nM. Its ED ₅₀ was 100 pM and was estimated to be up to 1000 times more potent compared to LRR5 (FIG. 6B). On the other hand, the peptides LRR5N and LRR5C cannot effectively inhibit VEGF-induced EC lumen formation. The LRR5 peptide also inhibited bFGF-induced lumen formation in a dose-dependent manner with the exception of inactive LRR5C (FIG. 6C). Consistent results were observed when the experiment was repeated with different batches of HUVEC (data not shown).

３種類の短鎖ペプチドについて、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ遊走を阻害する能力を分析したところ、１３残基のＬＲＲ５ＣペプチドにＬＲＲ５と同じ効力があった（図７Ａ）。ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｃはともに、１００ｎＭ〜１μＭのＥＤ_５０で、用量依存的にＶＥＧＦ誘導性ＥＣ遊走を阻害した。ＬＲＲ５Ｎでいくつかの阻害が認められたが、その作用は用量依存的ではなく、一方、ＬＲＲ５Ｍは不活性である。これに対し、ｂＦＧＦ誘導性ＥＣ遊走の阻害において、ＬＲＲ５Ｃは効果を示さないが、ＬＲＲ５Ｍは高い濃度でわずかに穏やかな阻害作用がある（図７Ｂ）。 Three short peptides were analyzed for their ability to inhibit VEGF-induced HUVEC migration and the 13-residue LRR5C peptide had the same potency as LRR5 (FIG. 7A). Both LRR5 and LRR5C inhibited VEGF-induced EC migration in a dose-dependent manner with an ED ₅₀ of 100 nM to 1 μM. Some inhibition was observed with LRR5N, but its effect is not dose-dependent, while LRR5M is inactive. In contrast, LRR5C has no effect in inhibiting bFGF-induced EC migration, whereas LRR5M has a slightly milder inhibitory effect at higher concentrations (FIG. 7B).

ＥＣ増殖に対してＬＲＲ５の阻害が小さいことと一貫して（図４Ａおよび４Ｂ）、ＶＥＧＦ刺激によるＥＣ増殖に対しては、ＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５Ｃが高濃度で穏やかに阻害するのみであり、ｂＦＧＦ刺激によるＥＣ増殖に対しては、短鎖ペプチドはいずれも阻害しなかった（図８Ａおよび８Ｂ）。 Consistent with the small inhibition of LRR5 on EC proliferation (FIGS. 4A and 4B), for VEGF-stimulated EC proliferation, LRR5N and LRR5C only moderately inhibit at high concentrations, and by bFGF stimulation None of the short peptides inhibited EC growth (FIGS. 8A and 8B).

３種類の短鎖ペプチドについて、ＥＣアポトーシスを誘導する能力を試験したところ、ＬＲＲ５ＭにはＬＲＲ５と同じ活性があったが、ＬＲＲ５Ｎは活性が低かった（図５Ｂ；図９Ａおよび９Ｂ）。ＬＲＲ５と同じく、両者の短鎖ペプチドはカスパーゼ依存的にＥＣアポトーシスを誘導した。一方、ＬＲＲ５Ｃは、アポトーシス誘導機能を欠いている。 Three short peptides were tested for their ability to induce EC apoptosis. LRR5M had the same activity as LRR5, but LRR5N was less active (FIG. 5B; FIGS. 9A and 9B). Like LRR5, both short peptides induced EC apoptosis in a caspase-dependent manner. On the other hand, LRR5C lacks an apoptosis-inducing function.

要約すると、上記の結果は、ＬＲＲ５の異なるサブ領域が血管新生の異なる局面を阻害することを示唆している。中央領域はＥＣ管腔形成を阻害するが、Ｃ末端領域はＶＥＧＦに関するＥＣ遊走を阻害することに関与している。Ｎ末端領域（ＬＲＲ５Ｎ）および中央領域（ＬＲＲ５Ｍ）は共に、カスパーゼ介在性アポトーシス経路によりＥＣアポトーシスを誘導することに関与する。 In summary, the above results suggest that different subregions of LRR5 inhibit different aspects of angiogenesis. The central region inhibits EC tube formation, while the C-terminal region is involved in inhibiting EC migration for VEGF. Both the N-terminal region (LRR5N) and the central region (LRR5M) are involved in inducing EC apoptosis through a caspase-mediated apoptotic pathway.

ＬＲＲ５は血管新生を阻害したが、マトリックスへのＥＣ接着の抑制によるものではない
デコリンは、フィブロネクチンおよびコラーゲンをはじめとする多数のＥＣＭタンパク質、ならびに、ＴＧＦβなどの増殖因子と結合することが知られている（１１〜１５）。ＬＲＲ５およびその短鎖ペプチドもまた、これらのタンパク質と結合するか否かについて試験するため、ゼラチン、コラーゲンＩ、フィブロネクチンをはじめとする様々なマトリックスタンパク質、増殖因子（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦ）、フィブリノーゲンおよびＢＳＡをニトロセルロース膜上に固定化し、ＦＩＴＣ標識ペプチドで検索した。すべてのペプチドがマトリックスタンパク質のゼラチン、コラーゲンＩおよびフィブロネクチンには直接結合することができたが、試験した他のタンパク質には結合しなかった（データは示さず）。次いで、固相結合アッセイを用いて、フィブロネクチンおよびコラーゲンＩへのそれらの結合親和力を測定した。ペプチドＬＲＲ５と３種類のすべての短鎖ペプチドは、フィブロネクチンよりもコラーゲンＩに対する結合親和力がわずかに高かったが、一般にこの結合親和力は非常に低く、そのＫｄはμＭまたは低ｍＭの範囲でさえある（表２）。 LRR5 inhibited angiogenesis but not due to suppression of EC adhesion to the matrix Decorin is known to bind to many ECM proteins, including fibronectin and collagen, and growth factors such as TGFβ (11-15). To test whether LRR5 and its short peptides also bind to these proteins, various matrix proteins including gelatin, collagen I, fibronectin, growth factors (TGFβ1, TGFβ2, VEGF and bFGF), Fibrinogen and BSA were immobilized on a nitrocellulose membrane and searched with a FITC-labeled peptide. All peptides could bind directly to the matrix proteins gelatin, collagen I and fibronectin, but not to the other proteins tested (data not shown). A solid phase binding assay was then used to determine their binding affinity to fibronectin and collagen I. Peptide LRR5 and all three short peptides had slightly higher binding affinity for collagen I than fibronectin, but generally this binding affinity is very low, and their Kd is in the μM or even low mM range ( Table 2).

ＥＣＭへのＥＣ接着および付着は、血管新生の進行にとって重要である。遊走および管腔形成は双方とも接着によって開始されるが、本ペプチドが抗接着因子として役割を果たすならば、その後の細胞遊走と管腔形成は双方とも阻害することができるだろう。ＬＲＲ５およびその関連ペプチドはすべてフィブロネクチンおよびコラーゲンＩに結合するので、それらは、ＥＣＭへのＥＣ接着を抑制し、それにより血管新生を阻害することができるだろう。実際、細胞をペプチドと３０分間プレインキュベーションした後、フィブロネクチンをコーティングした９６ウェル上に播種したところ、接着した細胞の数は有意に減少した（図１０）。この有意な阻害は、精製デコリンのものと比較可能であった１０ｎＭの低濃度においても、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｎで認められた。一方、ペプチドＬＲＲ５ＭおよびＬＲＲ５Ｃはこの機能にそれほど効果的ではなく、μＭの濃度でわずかに明白な阻害作用があった。同様に、これらのペプチドはコラーゲンＩへのＥＣ接着も用量依存的に阻害した（データは示さず）。これらの結果によれば、ＬＲＲ５Ｎは、フィブロネクチンへのＥＣ接着阻害においてＬＲＲ５と同程度に効果的であるが、ＬＲＲ５Ｎが管腔形成または遊走の阻害に効果的ではないので、ＬＲＲ５がＥＣ管腔形成および遊走を阻害する能力は、それがフィブロネクチンへのＥＣ接着を抑制することによるものではないことが明らかである。 EC adhesion and attachment to the ECM is important for the progression of angiogenesis. Both migration and lumen formation are initiated by adhesion, but if the peptide serves as an anti-adhesion factor, both subsequent cell migration and lumen formation could be inhibited. Since LRR5 and its related peptides all bind to fibronectin and collagen I, they will be able to suppress EC adhesion to ECM and thereby inhibit angiogenesis. In fact, when cells were preincubated with peptides for 30 minutes and seeded on 96 wells coated with fibronectin, the number of adherent cells was significantly reduced (FIG. 10). This significant inhibition was observed with LRR5 and LRR5N even at a low concentration of 10 nM that was comparable to that of purified decorin. On the other hand, the peptides LRR5M and LRR5C were not very effective for this function and had a slightly obvious inhibitory effect at a concentration of μM. Similarly, these peptides also inhibited EC adhesion to collagen I in a dose-dependent manner (data not shown). These results indicate that LRR5N is as effective as LRR5 in inhibiting EC adhesion to fibronectin, but LRR5N is not as effective in inhibiting lumen formation or migration, so LRR5 is in EC lumen formation. It is clear that the ability to inhibit and migration is not due to suppressing EC adhesion to fibronectin.

ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍは、ＶＥＧＦ刺激によるＦＡＫリン酸化、局所接着へのパキシリンの局在化、ならびにアクチンストレスファイバーの形成を阻害する
ＬＲＲ５ＭペプチドおよびＬＲＲ５Ｃペプチドの異なる機能を理解するため、ＦＡＫに関連するさらなるメカニズム試験を行った。ＦＡＫは、細胞外マトリックスに細胞を付着する、局所接着複合体の重要な成分であって、細胞遊走、付着、生存および細胞周期制御にとって不可欠である（３０）。これは非受容体型チロシンキナーゼであり、増殖因子及びインテグリンシグナルを統合し、細胞遊走を促進する。適切な細胞の遊走は、アクチンフィラメント動態と付着複合体リモデリングの双方に依存する。ＶＥＧＦ刺激によるＥＣ遊走の機序の１つは、ＦＡＫリン酸化を刺激することによるものであり、これはＦＡＫを活性化し、局所接着の構築と再配列を開始することが報告されている（３１）。次いで、活性化されたＦＡＫはパキシリンをはじめとする他の局所接着関連タンパク質をリン酸化及び活性化し、これは直ちに局所接着複合体へ補充される。これが終了した後、局所接着関連パキシリンと相互作用する新しいアクチン重合に伴って、アクチンストレスファイバーが蓄積される（３２）。次いで、ＦＡＫは脱リン酸化により不活性化され、細胞プロテアーゼによって切断され、局所接着ならびにアクチンフィラメントの解体が生じる。アポトーシス中、ＦＡＫはカスパーゼにより切断され、ＦＡＫ機能を阻害するＦＡＫのＣ末端断片であるＦＲＮＫが生じる（３３）。 LRR5 and LRR5M inhibit VEGF-stimulated FAK phosphorylation, localization of paxillin to local adhesion, and formation of actin stress fibers. To understand the different functions of LRR5M and LRR5C peptides, additional mechanisms related to FAK A test was conducted. FAK is an important component of the local adhesion complex that attaches cells to the extracellular matrix and is essential for cell migration, attachment, survival and cell cycle control (30). It is a non-receptor tyrosine kinase that integrates growth factors and integrin signals and promotes cell migration. Proper cell migration depends on both actin filament dynamics and attachment complex remodeling. One mechanism of VEGF-stimulated EC migration is by stimulating FAK phosphorylation, which has been reported to activate FAK and initiate local adhesion assembly and rearrangement (31 ). The activated FAK then phosphorylates and activates other local adhesion-related proteins, including paxillin, which are immediately recruited to the local adhesion complex. After this is done, actin stress fibers accumulate with new actin polymerization that interacts with local adhesion-related paxillin (32). FAK is then inactivated by dephosphorylation and cleaved by cellular proteases, resulting in local adhesion as well as actin filament disassembly. During apoptosis, FAK is cleaved by caspases, resulting in FRNK, a C-terminal fragment of FAK that inhibits FAK function (33).

図１１から明らかなように、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍは共に、ＶＥＧＦ刺激によるＦＡＫリン酸化を抑制した。ＬＲＲ５Ｍは、ＦＡＫリン酸化の阻害においてＬＲＲ５よりもより効果的であったが、これは、ＥＣ管腔形成とアポトーシス誘導の阻害においてそれがより強力な活性を有することと一致している。一方、ＥＣ遊走阻害に非常に効果的であるが、管腔形成とアポトーシス誘導の阻害に活性がないＬＲＲ５Ｃは、ＦＡＫリン酸化に対していかなる阻害作用も示さなかった。むしろ、このペプチドによりＦＡＫリン酸化が穏やかに刺激される。 As is clear from FIG. 11, both LRR5 and LRR5M suppressed FAK phosphorylation by VEGF stimulation. LRR5M was more effective than LRR5 in inhibiting FAK phosphorylation, consistent with its more potent activity in inhibiting EC lumen formation and apoptosis induction. On the other hand, LRR5C, which is very effective in inhibiting EC migration but not active in inhibiting tube formation and inducing apoptosis, did not show any inhibitory effect on FAK phosphorylation. Rather, this peptide gently stimulates FAK phosphorylation.

また、局所接着の形成と再編成の指標である、ＶＥＧＦ誘導性パキシリンの局所接着への補充は、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍの双方によって効果的に遮断された。図１２から明らかなように、多数のＶＥＧＦ誘導によるパッチ化パキシリン染色（矢印によって示した）が、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍで処理した場合にほぼ完全になくなり、その場合、ＬＲＲ５Ｍがより効果的であった。また、精製デコリンも１００ｎＭで局所接着形成を阻害した。ペプチドＬＲＲ５Ｎは局所接着の形成を多少低減したが、ＬＲＲ５ＣおよびＬＲＲ５Ｓは不活性であった（図１２）。 Also, VEGF-induced paxillin recruitment to local adhesion, an indicator of local adhesion formation and reorganization, was effectively blocked by both LRR5 and LRR5M. As is apparent from FIG. 12, numerous VEGF-induced patched paxillin staining (indicated by arrows) was almost completely eliminated when treated with LRR5 and LRR5M, in which case LRR5M was more effective. Purified decorin also inhibited local adhesion formation at 100 nM. Peptide LRR5N somewhat reduced the formation of local adhesion, while LRR5C and LRR5S were inactive (FIG. 12).

ＴＲＩＴＣ結合ファロイジンによるアクチンフィラメントの免疫蛍光染色によって明らかなように、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍは、一貫してＶＥＧＦ誘導性アクチンストレスファイバー形成を強く抑制した（図１３）。ＬＲＲ５Ｎはそれほど効果的ではなかったが、ＬＲＲ５Ｃはこの機能に関し本質的には効果がなかった。 LRR5 and LRR5M consistently strongly inhibited VEGF-induced actin stress fiber formation as evidenced by immunofluorescent staining of actin filaments with TRITC-conjugated phalloidin (FIG. 13). LRR5N was not very effective, but LRR5C was essentially ineffective for this function.

上記３つの実験を互いに十分に相関させたところ、ペプチドＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍによるマトリゲル上のＥＣ管腔形成およびＥＣアポトーシス誘導の阻害が、ＶＥＧＦ誘導性ＦＡＫリン酸化、局所接着へのパキシリン再配置、およびアクチンストレスファイバー形成を抑制するそれらの能力に連動していることが明らかであった。また、ＥＣ管腔形成およびＥＣアポトーシス誘導の阻害において効力の高いＬＲＲ５Ｍは、Ｙ３９７でのＦＡＫリン酸化の抑制においても効力が高い。 When the above three experiments were fully correlated with each other, inhibition of EC lumen formation and EC apoptosis induction on Matrigel by peptides LRR5 and LRR5M was found to be VEGF-induced FAK phosphorylation, paxillin relocation to local adhesion, and actin It was clear that they were linked to their ability to suppress stress fiber formation. LRR5M, which is highly effective in inhibiting EC tube formation and EC apoptosis induction, is also highly effective in suppressing FAK phosphorylation at Y397.

ＣＤスペクトル研究により、溶液中のＬＲＲ５に関する安定構造が明らかになった
ペプチド機能の構造的基盤を検討するため、ペプチドのＣＤ分析を行った。１ｍＭ濃度のペプチドＬＲＲ５のＣＤスペクトルは負の極大約２１２ｎｍと負のショルダー約２２２ｎｍを示したが、これは３_１０ヘリックス構造の可能性を示唆している（図１４）。トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を５〜８０パーセントの各種比率のＴＦＥ／水で添加したところ、ＬＲＲ５のＣＤスペクトルではいかなる差異も現れず、ＬＲＲ５ペプチドが安定したヘリックス構造を持っていることが示唆された（３４）。さらに、２０８付近の弱い曲がりと、２１２および２２２ｎｍの２つの負の極小は、このペプチドがｐＨ７．０で３_１０とβ−シート構造の相互変換を経ていることを示している可能性がある。同様の吸収パターンがペプチドＬＲＲ５Ｎで観察され、２０９〜２４０ｎｍの広範な負の極小範囲と２０９ｎｍの鋭いシャープな極小を持っており、このペプチドがヘリックスとβ−シート構造またはβ−ターン構造の相互変換を経ていることが推測される。しかし、ＴＦＥを添加すると、β−シートの除去により螺旋形形状が改善されるので、ＬＲＲ５Ｎの構造は不安定である（データは示さず）。スクランブル化ペプチドＬＲＲ５Ｓは、２１０ｎｍ付近に強い負の吸収と２２２〜２２５ｎｍ付近に弱い負の吸収を示したが、これは３_１０ヘリックス構造を示唆している。ＬＲＲ５ＣおよびＬＲＲ５Ｍの両ＣＤスペクトルは、２０２〜２０５ｎｍで負の吸収を示したが、これはＩ型β−ターンを示唆している。 CD spectral studies have revealed a stable structure for LRR5 in solution. To investigate the structural basis of peptide function, peptide CD analysis was performed. While CD spectra of the peptide LRR5 of 1mM concentration was negatively maxima about 212nm and negative shoulder about 222 nm, suggesting the possibility of _{3 10} helical structure (Fig. 14). When trifluoroethanol (TFE) was added at various ratios of 5 to 80 percent TFE / water, there was no difference in the CD spectrum of LRR5, suggesting that the LRR5 peptide has a stable helix structure. (34). Furthermore, a weak bend and at around 208, two negative minima 212 and 222nm, the peptide may be indicative that through the interconversion of _{3 10} and β- sheet structure pH 7.0. A similar absorption pattern is observed with peptide LRR5N, which has a wide negative minimum range of 209-240 nm and a sharp sharp minimum of 209 nm, which is an interconversion of helix and β-sheet or β-turn structure. It is speculated that it has gone through. However, when TFE is added, the structure of LRR5N is unstable (data not shown) as the helical shape is improved by removal of the β-sheet. It scrambled peptide LRR5S showed weak negative absorption around strong negative absorption and 222~225nm around 210 nm, suggesting a _{3 10} helix structure. Both LRR5C and LRR5M CD spectra showed a negative absorption between 202 and 205 nm, suggesting a type I β-turn.

考察
デコリンが特定の状況下で抗血管新生活性を有することが報告されているが、本発明者らは、精製デコリンがマトリゲル上でのＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよび血清誘導性ＨＵＶＥＣ管腔形成を阻害し得ることを初めて本明細書で示した。精製ウシ関節デコリンは、昆虫細胞で発現される組換えヒトデコリンよりもＥＣ管腔形成を強く阻害した（図１）。さらに、コアタンパク質のＬＲＲ５ドメインを表すペプチド（２６残基）は、マトリゲル上のＥＣ管腔形成、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ刺激による遊走、フィブロネクチンへの接着、ならびにＥＣアポトーシスの誘導をはじめとする、血管新生の複数の局面を阻害することによって、有効な血管新生阻害剤として機能する。さらに本発明者らは、ＬＲＲ５の異なるサブ領域が血管新生の異なる局面を阻害することを証明した。中央領域（ＬＲＲ５Ｍ）はＥＣ管腔形成を阻害することに関与する。Ｃ末端領域（ＬＲＲ５Ｃ）は、ＶＥＧＦが関与する走化性ＥＣ遊走を特異的に阻害するが、しかし、ｂＦＧＦ誘導性ＥＣ遊走には作用しなかった。Ｎ末端および中央領域はともに、ＥＣアポトーシスの誘導に関与する。一方、Ｎ末端領域（ＬＲＲ５Ｎ）は、フィブロネクチンへのＥＣ接着の阻害においてより効果がある。また本発明者らは、ＶＥＧＦ誘導性ＥＣ管腔形成を阻害するＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍの能力が、ＶＥＧＦ誘導性ＦＡＫ活性化、局所接着の構築ならびにアクチンストレスファイバー形成のそれらの抑制と連動しているが、マトリックスタンパク質へのＥＣ付着の抑制によるものではないことを明らかにした。表３にＬＲＲ５ペプチドの概要を示す。 Discussion Although decorin has been reported to have anti-angiogenic activity under certain circumstances, the inventors have shown that purified decorin inhibits VEGF, bFGF and serum-induced HUVEC lumen formation on Matrigel. This is the first time that it has been obtained. Purified bovine joint decorin inhibited EC tube formation more strongly than recombinant human decorin expressed in insect cells (FIG. 1). In addition, the peptide representing the LRR5 domain of the core protein (26 residues) is responsible for angiogenesis, including EC tube formation on Matrigel, migration by VEGF or bFGF stimulation, adhesion to fibronectin, and induction of EC apoptosis. It functions as an effective angiogenesis inhibitor by inhibiting multiple aspects. Furthermore, the inventors have demonstrated that different subregions of LRR5 inhibit different aspects of angiogenesis. The central region (LRR5M) is involved in inhibiting EC lumen formation. The C-terminal region (LRR5C) specifically inhibits chemotactic EC migration involving VEGF, but did not affect bFGF-induced EC migration. Both the N-terminal and central regions are involved in the induction of EC apoptosis. On the other hand, the N-terminal region (LRR5N) is more effective in inhibiting EC adhesion to fibronectin. We also note that the ability of LRR5 and LRR5M to inhibit VEGF-induced EC lumen formation is linked to their suppression of VEGF-induced FAK activation, local adhesion construction and actin stress fiber formation. It was clarified that it was not due to suppression of EC adhesion to the matrix protein. Table 3 outlines the LRR5 peptide.

ＶＥＧＦは、ＥＣ増殖、遊走、局所接着複合体形成および再編成、アクチン細胞骨格のストレスファイバーへのリモデリングならびに管腔形成、血管新生応答のすべての必要な成分を誘導する、最も重要な血管新生因子である。増殖を除き、ＬＲＲ５はＶＥＧＦ誘導性血管新生のすべての局面を阻害した。ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍの強力な抗管腔形成活性と、ＶＥＧＦ誘導性ＦＡＫ活性化、局所接着へのパキシリンの補充およびアクチンストレスファイバー形成を阻害するそれらの能力との相関関係は、ＦＡＫシグナル伝達経路がマトリゲル上のＶＥＧＦ誘導性ＥＣ管腔形成に重要な役割を果たすことを強く示唆している。強力なＬＲＲ５Ｍの抗管腔形成活性は、その強力なＦＡＫ活性化阻害と相関していた。 VEGF is the most important angiogenesis that induces all necessary components of EC proliferation, migration, local adhesion complex formation and reorganization, remodeling of the actin cytoskeleton into stress fibers and lumen formation, angiogenic response Is a factor. Except for proliferation, LRR5 inhibited all aspects of VEGF-induced angiogenesis. The correlation between the potent anti-lumenogenic activity of LRR5 and LRR5M and their ability to inhibit VEGF-induced FAK activation, recruitment of paxillin to local adhesion and actin stress fiber formation indicates that the FAK signaling pathway is matrigel The above strongly suggests an important role in VEGF-induced EC lumen formation. The potent anti-luminogenic activity of LRR5M correlated with its potent inhibition of FAK activation.

またＦＡＫシグナル伝達経路もＶＥＧＦ誘導性ＥＣ遊走に関与するが、ＥＣ遊走を阻害したＬＲＲ５ＣがＦＡＫ活性化を抑制しなかったので、ＬＲＲ５はＦＡＫ非依存性シグナル伝達経路によりＥＣ遊走を阻害した可能性が高いと考えられる。最近、インテグリンの細胞質ドメインと相互作用するシグナル伝達タンパク質であるインテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）もまた、ＶＥＧＦにより誘導されるＨＵＶＥＣ血管形態形成に重要な役割を果たしており、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ走化性遊走がＩＬＫの阻害により抑制されることが報告されている（３５）。またＩＬＫも、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／Ｒａｃｌシグナル伝達を介してアクチンフィラメント再編成および細胞遊走および浸潤を仲介する（３６）。ＬＲＲ５Ｃもまた、ＩＬＫシグナル伝達経路の阻害によりＶＥＧＦ刺激によるＨＵＶＥＣ走化性遊走を阻害するか否かについては、今後の研究が待たれる。 The FAK signaling pathway is also involved in VEGF-induced EC migration, but LRR5C that inhibited EC migration did not suppress FAK activation, so LRR5 may inhibit EC migration through a FAK-independent signaling pathway Is considered high. Recently, integrin-linked kinase (ILK), a signaling protein that interacts with the cytoplasmic domain of integrin, has also played an important role in VEGF-induced HUVEC blood vessel morphogenesis, and VEGF-induced HUVEC chemotaxis migration It has been reported that it is suppressed by inhibition of ILK (35). ILK also mediates actin filament rearrangement and cell migration and invasion via PI3K / Akt / Racl signaling (36). Future studies are awaiting whether LRR5C also inhibits VEGF-stimulated HUVEC chemotaxis migration by inhibiting the ILK signaling pathway.

細胞遊走は、局所接着とアクチンフィラメントの両方の動的構築と分解に関与する。ＬＲＲ５ＣはＶＥＧＦ誘導性の局所接着構築およびアクチンストレスファイバー形成を阻害しなかったが、ＬＲＲ５Ｃが、それらの分解または動的変化を妨げるか否かについては今後さらに調査を行う必要がある。さらに、ＦＡＫリン酸化および脱リン酸化の動的サイクルは、局所接着の動的変化に不可欠なものである。ＬＲＲ５ＣはわずかにＦＡＫリン酸化を刺激したので、このペプチドがＦＡＫリン酸化／脱リン酸化の動的変化に影響を及ぼすのか否かについては、さらに検討する必要がある。 Cell migration is involved in the dynamic assembly and degradation of both local adhesion and actin filaments. Although LRR5C did not inhibit VEGF-induced local adhesion assembly and actin stress fiber formation, further investigation is needed to determine whether LRR5C prevents their degradation or dynamic changes. Furthermore, the dynamic cycle of FAK phosphorylation and dephosphorylation is essential for the dynamic change of local adhesion. Since LRR5C slightly stimulated FAK phosphorylation, further investigation is needed as to whether this peptide affects FAK phosphorylation / dephosphorylation dynamic changes.

細胞遊走は、マトリックス媒介性インテグリンクラスター形成およびＦＡＫ活性化を介してだけでなく、増殖因子／受容体が活性化した多数の細胞内シグナル伝達経路を介して誘発され得る。ＦＡＫ経路の他に、例えば、ＰＩ３キナーゼ活性化、ｐ３８−ＭＡＰＫ活性化、Ａｋｔ活性化、ＮＯ放出の誘導などの他の多数の経路もまたＶＥＧＦ誘導性ＥＣ遊走と連動していた（３２）。ＬＲＲ５Ｃが、これらの経路の１つを阻害することにより、ＶＥＧＦ誘導性ＥＣ遊走を阻害した可能性がある。 Cell migration can be triggered not only through matrix-mediated integrin cluster formation and FAK activation, but also through a number of intracellular signaling pathways activated by growth factors / receptors. In addition to the FAK pathway, many other pathways, such as PI3 kinase activation, p38-MAPK activation, Akt activation, induction of NO release, were also linked to VEGF-induced EC migration (32). LRR5C may have inhibited VEGF-induced EC migration by inhibiting one of these pathways.

ＥＣ管腔形成の媒介に関与しているシグナル伝達経路は完全には理解されていない。管腔形成には、細胞遊走の他に、細胞間接着、細胞マトリックス接着、細胞融合、アポトーシス、ならびにＥＣ分化をはじめとする多数の過程が必要であるので、ＦＡＫ活性化の阻害はこれらの１つまたは複数の過程に影響を及ぼし、それが管腔形成の阻害をもたらす可能性が高いと考えられる。我々のデータは、ＥＣにおけるＶＥＧＦ誘導性ＦＡＫシグナル伝達経路の阻害が、ＬＲＲ５ペプチドおよびＬＲＲ５Ｍペプチドのマトリゲル上での管腔形成阻害能力と連動していることを明らかに示唆している。ペプチドＬＲＲ５ＣおよびＬＲＲ５Ｎは、（ＦＡＫ活性化、局所接着複合体へのパキシリン再配置ならびにアクチンストレスファイバー形成から明らかなように）ＶＥＧＦ誘導性ＦＡＫシグナル伝達経路を阻害することができないか、弱く阻害するが、管腔形成に効果的な阻害はなかった。 The signaling pathways involved in mediating EC lumen formation are not fully understood. In addition to cell migration, tube formation requires many processes including cell-cell adhesion, cell matrix adhesion, cell fusion, apoptosis, and EC differentiation. One or more processes may be affected, which is likely to result in inhibition of lumen formation. Our data clearly suggests that inhibition of the VEGF-induced FAK signaling pathway in EC is linked to the ability of the LRR5 and LRR5M peptides to inhibit tube formation on Matrigel. Peptides LRR5C and LRR5N cannot or weakly inhibit the VEGF-induced FAK signaling pathway (as evidenced by FAK activation, paxillin rearrangement to the local adhesion complex and actin stress fiber formation) There was no effective inhibition of lumen formation.

ＦＡＫシグナル伝達は、増殖因子とインテグリン媒介性細胞遊走に関与するだけでなく、細胞増殖、アポトーシスならびに細胞接着および伸展にも関与することは周知である（３７）。我々の結果は、ペプチドＬＲＲ５およびＬＲＲ５ＭによるＦＡＫＹ３９７のリン酸化の阻害が、カスパーゼ依存性経路を介して、管腔形成ならびにＥＣアポトーシス誘導をそれらが阻害する能力に連動していることを明らかに示唆している。マトリックスへの細胞付着および接着は、血管新生における重要な工程である。フィブロネクチンおよびＴＳＰ１基質上での細胞接着および伸展がデコリンにより阻害されることは周知である（１３、１５）。ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｎは、フィブロネクチンへのＨＵＶＥＣ接着を低濃度で効果的に妨げたが、マトリックスへのＥＣ接着阻害は、ＬＲＲ５がＥＣ管腔形成を阻害したことの重要な機序でないと考えられる。それは、ＬＲＲ５Ｍが、フィブロネクチンへのＨＵＶＥＣ接着の阻害にほとんど効果のない濃度で、ＥＣ管腔形成を強く阻害したからである（図６および図１０）。 It is well known that FAK signaling is involved not only in growth factors and integrin-mediated cell migration, but also in cell proliferation, apoptosis and cell adhesion and spreading (37). Our results clearly suggest that inhibition of phosphorylation of FAK Y397 by peptides LRR5 and LRR5M is linked to their ability to inhibit lumen formation and EC apoptosis induction via a caspase-dependent pathway is doing. Cell attachment and adhesion to the matrix is an important step in angiogenesis. It is well known that decorin inhibits cell adhesion and spreading on fibronectin and TSP1 substrates (13, 15). Although LRR5 and LRR5N effectively prevented HUVEC adhesion to fibronectin at low concentrations, inhibition of EC adhesion to the matrix appears not to be an important mechanism by which LRR5 inhibited EC lumen formation. This is because LRR5M strongly inhibited EC tube formation at a concentration that had little effect on inhibiting HUVEC adhesion to fibronectin (FIGS. 6 and 10).

コラーゲンＩおよびフィブロネクチンへの本ペプチドの結合親和力は低く、低ｍＭ〜μＭの範囲である。ＦＩＴＣ標識ペプチドを用いたところ、本発明者らは、ＬＲＲ５およびその関連ペプチドは、細胞に入らないか、細胞表面には結合しないことを観察したが（データは示さず）、これは、ＬＲＲ５およびその関連ペプチドが細胞外マトリックス中で機能していると考えられることを示唆している。デコリンコアタンパク質のＬＲＲ３〜ＬＲＲ５領域は、血管新生に関与する増殖因子であるＴＧＦβに結合することが報告されているが、本研究で記載した結合条件で試験した場合には、ＬＲＲ５はこの増殖因子に結合しなかった（データは示さず）。恐らく、ＬＲＲ５の抗血管新生活性は、デコリンがＴＧＦβに結合する能力とは無関係であろう。 The binding affinity of the peptide to collagen I and fibronectin is low, ranging from low mM to μM. Using FITC-labeled peptides, we observed that LRR5 and its related peptides do not enter the cell or bind to the cell surface (data not shown), which indicates that LRR5 and This suggests that the related peptide is thought to function in the extracellular matrix. Although the LRR3 to LRR5 regions of decorin core protein have been reported to bind to TGFβ, a growth factor involved in angiogenesis, LRR5 is a growth factor when tested under the binding conditions described in this study. (Data not shown). Presumably, the anti-angiogenic activity of LRR5 is independent of the ability of decorin to bind to TGFβ.

ペプチド治療は、臨床用途にますます利用されてきている。ペプチドの利点は、そのサイズが小さいこと、合成が簡単であること、宿主系に毒性および免疫反応がないこと、化学的な修飾が可能であることである（２）。ＭＭＰ−２のＰｅｘドメイン、ＶＥＧＦＲ１のＩｇドメイン、ＴＳＰ１のＴＳＲドメインならびにエンドスタチンをはじめとする内因性タンパク質の様々なドメインから、いくつかの抗血管新生ペプチドが得られている（５、２８、３８、３９）。本研究は、ＬＲＲドメイン由来の抗血管新生ペプチドの初めての報告である。 Peptide therapy is increasingly being used in clinical applications. The advantages of peptides are that they are small in size, easy to synthesize, have no toxicity and immune response in the host system, and can be chemically modified (2). Several anti-angiogenic peptides have been derived from various domains of endogenous proteins including MMP-2 Pex domain, VEGFR1 Ig domain, TSP1 TSR domain and endostatin (5, 28, 38). 39). This study is the first report of an anti-angiogenic peptide derived from an LRR domain.

最近、抗血管新生ペプチドは、高頻度の疎水性残基を有し、逆平行β−シートとして折り重なる傾向があること報告されている（４０）。強力な血管新生阻害剤である３３アミノ酸Ａｎｇｉｎｅｘペプチドは、生理活性構造であるβ−シートを含有するよう設計されたものである（４１、４２）。ＣＤスペクトルによって示した通り、２６残基のＬＲＲ５ペプチドもまた、溶液中で安定した３_１０ヘリックス構造を有するのに加えて、β−シートも有している（図１４）。この原稿の準備をしている間、デコリンの二量体タンパク質コアの結晶構造が報告されたが（２７）、これは、ウシデコリンのＬＲＲＶＩ（本発明におけるヒトＬＲＲ５に等しい）が３_１０ヘリックスとβ−シートを含んでいることを示しており、これは本発明者らのＣＤの結果と一致している。ＬＲＲ５は、外面に暴露している３_１０ヘリックスと二量体界面部のβ−シートを有するバナナ形のデコリンモノマー分子の中心にある。デコリンコアタンパク質のすべてのＬＲＲの中で、ＬＲＲ５だけが３_１０ヘリックス構造を持っている（２７）。さらに、多数の生理活性ペプチドにおいて、βターンの存在はその機能にとって重要である（４３）。また、本明細書に記載したすべてのペプチドもまた、それらの生物活性にとって重要であり得るβターン構造を持っている。 Recently, it has been reported that anti-angiogenic peptides have a high frequency of hydrophobic residues and tend to fold as antiparallel β-sheets (40). The 33 amino acid Anginex peptide, a potent angiogenesis inhibitor, was designed to contain a β-sheet that is a bioactive structure (41, 42). As indicated by CD spectrum, also LRR5 peptide 26 residues, in addition to having a stable _{3 10} helical structure in solution, beta-sheet also has (Fig. 14). While preparing this document, the crystal structure of the dimeric protein core of decorin have been reported (27), which is (equal to human LRR5 in the present invention) LRR VI of Ushidekorin and 3 ₁₀ helix It shows that it contains a β-sheet, which is consistent with our CD results. LRR5 is at the center of decorin monomer molecules banana-shaped having a β- sheet 3 ₁₀ helix and dimer interface unit that exposed to the outer surface. Among all of the LRR of decorin core protein, only LRR5 has a _{3 10} helix structure (27). Furthermore, in many bioactive peptides, the presence of a β-turn is important for its function (43). Also, all peptides described herein also have a β-turn structure that can be important for their biological activity.

要約すると、デコリンコアタンパク質のＬＲＲ５ドメインは、ＥＣ管腔形成、遊走、マトリックスへの接着ならびにＥＣアポトーシスの誘導を阻害することにより、強い抗血管新生作用を示す。さらに、ＬＲＲ５の異なるサブ領域は、血管新生の異なる局面に影響を及ぼす。すなわち、ＬＲＲ５Ｍは管腔形成を阻害し、ＬＲＲ５Ｃは遊走を阻害し、ＬＲＲ５ＮはマトリックスへのＥＣ接着の阻害に非常に効果がある。ＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５Ｍはともに、ＥＣアポトーシスの誘導に関与する。さらに本発明者らは、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍの抗管腔形成活性が、ＶＥＧＦ刺激によるＦＡＫＹ３９７のリン酸化、ならびに局所接着およびアクチンストレスファイバー形成を抑制する能力と連動していることを明らかにした。ＬＲＲ５Ｍは、ＬＲＲ５およびその親分子デコリンに比べ、管腔形成の阻害においてはるかに強力である。 In summary, the LRR5 domain of the decorin core protein exhibits a strong anti-angiogenic effect by inhibiting EC tube formation, migration, adhesion to the matrix and induction of EC apoptosis. Furthermore, different subregions of LRR5 affect different aspects of angiogenesis. That is, LRR5M inhibits tube formation, LRR5C inhibits migration, and LRR5N is very effective in inhibiting EC adhesion to the matrix. Both LRR5N and LRR5M are involved in the induction of EC apoptosis. Furthermore, the present inventors have clarified that the antiluminal activity of LRR5 and LRR5M is linked to the ability to suppress VEGF-stimulated FAK Y397 phosphorylation and local adhesion and actin stress fiber formation. LRR5M is much more potent at inhibiting tube formation than LRR5 and its parent molecule decorin.

実施例１のための参考文献
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実施例２：デコリンペプチドは血管新生を阻害する
ペプチド合成
本ペプチドはペプチド合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、型番４７３Ａ）を用いて合成し、次いで、０．１％のトリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いて、ＨＰＬＣＣ１８逆相カラムにより精製した。 Example 2: Decorin Peptide Inhibits Angiogenesis Peptide Synthesis The peptide is synthesized using a peptide synthesizer (Applied Biosystems, Inc., model 473A) and then acetonitrile gradient in 0.1% trifluoroacetic acid And purified by HPLC C18 reverse phase column.

１．ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（ｈｄＬＲＲ５）（２６−ｍｅｒ）（配列番号２）
２．ＴＡＬＱＬＫＳＩＧＫＭＭＳＧＩＧＶＮＰＩＦＧＥＥＮＱ（スクランブルｄｈＬＲＲ５）（２６−ｍｅｒ）（配列番号３）
３．ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫ（Ｎ−ｈｄＬＲＲ５）（１３−ｍｅｒ）（配列番号４）
４．ＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（Ｃ−ｈｄＬＲＲ５）（１３−ｍｅｒ）（配列番号５）
５．ＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥ（Ｍ−ｈｄＬＲＲ５）（１２−ｍｅｒ）（配列番号６）
６．ＫＬＥＲＬＹＬＳＫＮＱＬＫＥＬＰＥＫＭＰＫ（ｈｄＬＲＲ３）（２３−ｍｅｒ）（配列番号７）
７．ＴＬＱＥＬＲＡＨＥＮＥＩＴＫＶＲＫＶＴＦＮＧＬＮ（ｈｄＬＲＲ４）（２６−ｍｅｒ）（配列番号８）。 1. QMIVIELGTNPLKSSGIENGAFQGMK (hdLRR5) (26-mer) (SEQ ID NO: 2)
2. TALQLKSIGKMMSGIGVNPIFGEENQ (scrambled dhLRR5) (26-mer) (SEQ ID NO: 3)
3. QMIVIELGTNPLK (N-hdLRR5) (13-mer) (SEQ ID NO: 4)
4). SSGIENGAFQGMK (C-hdLRR5) (13-mer) (SEQ ID NO: 5)
5. LGTNPLKSSSIE (M-hdLRR5) (12-mer) (SEQ ID NO: 6)
6). KLERLYLSKNQLKELPEKMPK (hdLRR3) (23-mer) (SEQ ID NO: 7)
7). TLQELRAHENEITKVRKVTFNGLN (hdLRR4) (26-mer) (SEQ ID NO: 8).

血管新生アッセイ
ＨＵＶＥＣ遊走アッセイ
細胞遊走アッセイは、２４ウェルのフォーマット中で８Ｔｍ細胞培養インサート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いて実施した。ＨＵＶＥＣは、実験前に３〜５時間、２％血清を加えた培地中で予め飢餓させた。細胞培養インサートは、０．２％ゼラチンまたはフィブロネクチン（５０ｕｇ／ｍｌ）で両サイドをプレコーティングし、乾燥させた。次いで、飢餓させたＨＵＶＥＣを、種々のすべてのペプチドと個別に、３７℃、５％のＣＯ_２インキュベーターで３０分間インキュベートした。 Angiogenesis assay
HUVEC migration assay The cell migration assay was performed using an 8Tm cell culture insert (Falcon) in a 24-well format. HUVEC were pre-starved in medium supplemented with 2% serum for 3-5 hours prior to the experiment. Cell culture inserts were precoated on both sides with 0.2% gelatin or fibronectin (50 ug / ml) and dried. The starved HUVECs were then incubated with all the various peptides separately for 30 minutes in a 37 ° C., 5% CO ₂ incubator.

次いで、細胞（３．０×１０^４細胞／インサート）を、２４ウェル培養プレート中の細胞培養インサートの上部表面上にプレーティングした。走化因子（ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ）含有培地を底部に十分に加え、細胞を６〜１４時間インキュベートした。インサートの上部表面の細胞を綿棒で優しく取り除いた。インサートの底部横の細胞を７０％エタノールで１０〜１５分間固定し、次いで、インサートを乾燥させた。顕微鏡下で分析するために、細胞を０．０４％のギムザ液で１０分間染色した。ＮＩＨ画像ソフトウェアを用いて遊走細胞をカウントした。 Cells (3.0 × 10 ⁴ cells / insert) were then plated on the upper surface of the cell culture insert in a 24-well culture plate. Chemotactic factor (VEGF or bFGF) containing media was added well to the bottom and the cells were incubated for 6-14 hours. Cells on the top surface of the insert were gently removed with a cotton swab. Cells next to the bottom of the insert were fixed with 70% ethanol for 10-15 minutes and then the insert was allowed to dry. Cells were stained with 0.04% Giemsa solution for 10 minutes for analysis under a microscope. Migrated cells were counted using NIH imaging software.

マトリゲル管腔形成アッセイ
マトリゲル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製またはＢＤ製）を、９６ウェルプレートのウェル表面にプレコーティングした。ＨＵＶＥＣ（１．５〜２×１０^４／ウェル、継代＜６）を回収し、１％ウシ胎児血清を含む培地（増殖因子を含まないＭ１９９培地またはＣＳＣ培地）に再懸濁した。次いで、細胞を、３０分間３７℃の細胞培養インキュベーターで種々のすべてのペプチドと様々な濃度で個別にインキュベートし、その後、９６ウェル上にプレーティングし、１２〜１６時間インキュベートした。管腔形成は、細胞プレーティング後７〜８時間から観察した。血管新生は、５ヶ所の任意の領域を取って測定し、ＮＩＨイメージャー（ＮＩＨＩｍａｇｅｒ）ソフトウェアを用いて管腔長および面積を測定した。 Matrigel tube formation assay Matrigel (Chemicon or BD) was precoated on the well surface of a 96 well plate. HUVEC (1.5-2 × 10 ⁴ / well, passage <6) were collected and resuspended in medium containing 1% fetal calf serum (M199 medium or CSC medium without growth factors). The cells were then individually incubated with various different peptides at various concentrations in a cell culture incubator at 37 ° C. for 30 minutes, then plated on 96 wells and incubated for 12-16 hours. Lumen formation was observed from 7-8 hours after cell plating. Angiogenesis was measured by taking 5 arbitrary regions and measuring lumen length and area using NIH Imager software.

ＴＵＮＥＬアポトーシスアッセイは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製のＡｐｏＡｌｅｒｔキットを用いて行った。簡単に説明すると、ＨＵＶＥＣを４ウェルのチャンバースライドに本ペプチドと一緒に播種し、２４時間本ペプチドで処理した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、細胞をＦＩＴＣ標識ＵＴＰおよびＴｄＴを含有するヌクレオチド混合物とともにインキュベートした。細胞はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で対比染色した。 The TUNEL apoptosis assay was performed using the ApoAlert kit from Clontech. Briefly, HUVECs were seeded with the peptide on 4-well chamber slides and treated with the peptide for 24 hours. After fixing the cells with 4% paraformaldehyde, the cells were incubated with a nucleotide mixture containing FITC-labeled UTP and TdT. Cells were counterstained with propidium iodide (PI).

あるいは、アポトーシスは、様々な濃度で本ペプチドとともにインキュベートし、アセトン：メタノール（１：１）で細胞を１０分間固定した後、ＤＮＡをＨｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８（５００ｎｇ／ｍｌ）で直接染色することにより分析した。アポトーシスを起こした細胞は、顕微鏡下、任意の領域でカウントした（倍率６３０×、１試料当たり５領域）。 Alternatively, apoptosis was analyzed by incubating with the peptide at various concentrations, fixing cells with acetone: methanol (1: 1) for 10 minutes, and then directly staining the DNA with Hoechst dye 33258 (500 ng / ml). . Apoptotic cells were counted in an arbitrary area under a microscope (magnification 630 × 5 areas per sample).

結果
図１５〜１７にそれらの結果を示す。図１５は、ペプチドｈｄＬＲＲ５（配列番号２）がＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ遊走を阻害することを示す。図１６は、ペプチドｈｄＬＲＲ５（配列番号２）がマトリゲルで管腔形成を阻害することを示す。図１７は、ＴＵＮＥＬ標識により測定した場合、デコリンペプチドｈｄＬＲＲ５が、ＥＣアポトーシスを誘導することを示す。 Results FIGS. 15 to 17 show the results. FIG. 15 shows that the peptide hdLRR5 (SEQ ID NO: 2) inhibits VEGF-induced HUVEC migration. FIG. 16 shows that the peptide hdLRR5 (SEQ ID NO: 2) inhibits tube formation in Matrigel. FIG. 17 shows that the decorin peptide hdLRR5 induces EC apoptosis as measured by TUNEL labeling.

ヒトデコリンのＬＲＲ５に対応する２６アミノ酸のペプチド（すなわちｈｄＬＲＲ５；配列番号２）は、インビトロでのマトリゲル血管新生アッセイにおいて管腔形成を阻害し、ＶＥＧＦによる内皮細胞遊走（ＨＵＶＥＣ）を阻害し得る。ＬＲＲ５は、余剰アミノ酸を含む長鎖配列のデコリン中の他のすべてのＬＲＲに比べた場合のその特有のＬ（ロイシン）構成、コラーゲンおよびＴＧＦβに結合する高い能力により選別される。 A 26 amino acid peptide corresponding to human decorin LRR5 (ie, hdLRR5; SEQ ID NO: 2) can inhibit lumen formation and inhibit endothelial cell migration (HUVEC) by VEGF in an in vitro Matrigel angiogenesis assay. LRR5 is screened by its unique L (leucine) organization, high ability to bind to collagen and TGFβ when compared to all other LRRs in decorin of long sequences containing excess amino acids.

試験したデコリンペプチドは、内皮細胞にとって細胞傷害性ではない。内皮細胞の代謝状態に対するその効果について、１０ｐＭ〜１ｍＭの間の濃度範囲で試験した。１ｍＭの濃度であっても、培養した内皮細胞に細胞毒性は認められなかった。その細胞毒性レベルは、アンギオスタチンおよびエンドスタチンなどの他の周知の血管新生阻害剤と同水準である。 The decorin peptides tested are not cytotoxic to endothelial cells. Its effect on the metabolic state of the endothelial cells was tested in a concentration range between 10 pM and 1 mM. Cytotoxicity was not observed in cultured endothelial cells even at a concentration of 1 mM. Its cytotoxic level is comparable to other well-known angiogenesis inhibitors such as angiostatin and endostatin.

また本発明者らは、ｈｄＬＲＲ５（配列番号２）がニトロセルロース結合コラーゲンに結合することも明らかにした（データは示さず）。 The present inventors also revealed that hdLRR5 (SEQ ID NO: 2) binds to nitrocellulose-binding collagen (data not shown).

実施例３：追加のペプチド
追加のＬＲＲ５の修飾バージョン：
ＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号９）
ＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１０）
ＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１１）
ＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１２）
ＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１３）
ＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１４）
ＧＩＥＮＴＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１５）
ＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１６） Example 3: Additional peptides Modified versions of additional LRR5:
IVIELGTNPLKSSGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 9)
IELGTNPLKSSSGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 10)
LGTNPLKSSSGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 11)
TNPLKSSSGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 12)
PLKSGSGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 13)
LKSSGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 14)
GIENTGAFQGMK (SEQ ID NO: 15)
ENGAFQGMK (SEQ ID NO: 16)

追加のペプチドのアラニンスキャン突然変異：
Ｍ−ＬＲＲ５をベースとしたもの：
ＡＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号１７）
ＬＡＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号１８）
ＬＧＡＮＰＬＫＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号１９）
ＬＧＴＡＰＬＫＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２０）
ＬＧＴＮＡＬＫＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２１）
ＬＧＴＮＰＡＫＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２２）
ＬＧＴＮＰＬＡＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２３）
ＬＧＴＮＰＬＫＡＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２４）
ＬＧＴＮＰＬＫＳＡＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２５）
ＬＧＴＮＰＬＫＳＳＡＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２６）
ＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＡＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２７）
ＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＡ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２８） Additional peptide alanine scan mutations:
Based on M-LRR5:
AGTNPLKSSSIE (12-mer) (SEQ ID NO: 17)
LATNPLKSSSIE (12-mer) (SEQ ID NO: 18)
LGAMPLKKSSGIE (12-mer) (SEQ ID NO: 19)
LGTAPLKSSGIE (12-mer) (SEQ ID NO: 20)
LGTNALKSSSIE (12-mer) (SEQ ID NO: 21)
LGTNPAKSSGIE (12-mer) (SEQ ID NO: 22)
LGTNPLASSGIE (12-mer) (SEQ ID NO: 23)
LGTNPLKASGIE (12-mer) (SEQ ID NO: 24)
LGTNPLKSGAIE (12-mer) (SEQ ID NO: 25)
LGTNPLKSSIE (12-mer) (SEQ ID NO: 26)
LGTNPLKSSSGAE (12-mer) (SEQ ID NO: 27)
LGTNPLKSSSIA (12-mer) (SEQ ID NO: 28)

Ｃ−ＬＲＲＳをベースとしたもの：
ＡＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（１３−ｍｅｒ）（配列番号２９）
ＳＡＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号３０）
ＳＳＡＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号３１）
ＳＳＧＡＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号３２）
ＳＳＧＩＡＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号３３）
ＳＳＧＩＥＡＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号３４）
ＳＳＧＩＥＮＡＡＦＱＧＭＫ（配列番号３５）
ＳＳＧＩＥＮＧＡＡＱＧＭＫ（配列番号３６）
ＳＳＧＩＥＮＧＡＦＡＧＭＫ（配列番号３７）
ＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＡＭＫ（配列番号３８）
ＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＡＫ（配列番号３９）
ＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＡ（配列番号４０） Based on C-LRRS:
ASGIENGAFQGMK (13-mer) (SEQ ID NO: 29)
SAGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 30)
SSAIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 31)
SSGAENGAFQGMK (SEQ ID NO: 32)
SSGIANGAFQGMK (SEQ ID NO: 33)
SSGIEAGAFQGMK (SEQ ID NO: 34)
SSGIENAAFQGMK (SEQ ID NO: 35)
SSGIENGAAQGMK (SEQ ID NO: 36)
SSGIENGAFAGMK (SEQ ID NO: 37)
SSGIENGAFQAMK (SEQ ID NO: 38)
SSGIENGAFQGAK (SEQ ID NO: 39)
SSGIENGAFQGMA (SEQ ID NO: 40)

他の脊椎動物種の類似配列：
ＱＭＩＶＶＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌＬＲＲ５）（配列番号４１）
ＮＶＬＶＩＥＬＧＧＮＰＬＫＮＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＬＫ（マウスＬＲＲ５）（配列番号４２）
ＲＭＩＶＩＥＬＧＧＮＰＬＫＮＳＧＩＥＮＧＡＬＱＧＭＫ（ラットＬＲＲＳ）（配列番号４３）
ＱＶＩＶＬＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（ニワトリＬＲＲＳ）（配列番号４４）
ＮＶＩＶＭＥＬＧＳＮＰＬＳＳＳＧＶＤＮＧＡＦＡＤＬＫ（ゼブラフィッシュＬＲＲ５）（配列番号４５） Similar sequences from other vertebrate species:
QMIVVELGTNPLKSSGIENGAFQGMK (horse, sheep, cow, pig, dog LRR5) (SEQ ID NO: 41)
NVLVIELGGNPLKNSGIENGAFQGLK (mouse LRR5) (SEQ ID NO: 42)
RMIELELGNGPLKNSGIENGALQGMK (rat LRRS) (SEQ ID NO: 43)
QVIVLELGTNPLKSSGIENGAFQGMK (chicken LRRS) (SEQ ID NO: 44)
NVIVMELGSNPLSSSGVDNGAFADLK (Zebrafish LRR5) (SEQ ID NO: 45)

実施例４：癌の治療
癌に罹患している患者に、ペプチドＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号２）を静脈内投与する。 Example 4: Cancer Treatment Peptide QMIVIELGTNPLKSSGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 2) is administered intravenously to patients suffering from cancer.

図１は、ペプチドｈｄＬＲＲ５（配列番号２；ＬＲＲ５ともいう）がＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ遊走を阻害することを示す図である。１．増殖因子なしコントロール；２．１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ；３〜８：１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ＋１００μＭ、１０μＭ；１μＭ；１００ｎＭ；１０ｎＭ；１ｎＭの濃度のデコリンｈｄＬＲＲ５ペプチド。FIG. 1 shows that the peptide hdLRR5 (SEQ ID NO: 2; also referred to as LRR5) inhibits VEGF-induced HUVEC migration. 1. No growth factor Control; 2.10 ng / ml VEGF; 3-8: 10 ng / ml VEGF + 100 μM, 10 μM; 1 μM; 100 nM; 10 nM; 1 nM concentrations of decorin hdLRR5 peptide. 図１Ａは、デコリンはマトリゲル上のＥＣ管腔形成を阻害することを示す図である。２種類のデコリンの阻害作用を示す代表的な写真である。１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、１５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦまたは１０％ＦＢＳ存在下のＥＣ管腔形成アッセイにおけるウシ軟骨（ＤＣＮ）由来の天然プロテオグリカンと組換えヒトデコリン（ｒｈＤＣＮ）。このアッセイは、増殖因子を減らしたマトリゲルを用いて行った。FIG. 1A shows that decorin inhibits EC lumen formation on Matrigel. It is a typical photograph showing the inhibitory action of two types of decorin. Natural proteoglycan and recombinant human decorin (rhDCN) from bovine cartilage (DCN) in an EC tube formation assay in the presence of 15 ng / ml VEGF, 15 ng / ml bFGF or 10% FBS. This assay was performed using Matrigel with reduced growth factors. 図１Ｂは、デコリンはマトリゲル上のＥＣ管腔形成を阻害することを示す図である。阻害作用の数量化を示す棒グラフの図面である。FIG. 1B shows that decorin inhibits EC lumen formation on Matrigel. It is drawing of the bar graph which shows quantification of an inhibitory effect. 図２は、デコリンコアタンパク質中のＬＲＲ５ドメインが、マトリゲル上のＥＣ管腔形成を強く阻害することを示す図である。FIG. 2 shows that the LRR5 domain in decorin core protein strongly inhibits EC tube formation on Matrigel. 図２Ａは、図２Ｂの試験で用いたペプチドのリストである。FIG. 2A is a list of peptides used in the test of FIG. 2B. 図２Ｂは、デコリンコアタンパク質中のＬＲＲ５ドメインが、マトリゲル上のＥＣ管腔形成を強く阻害することを示す図である。増殖因子を経らしたマトリゲルを用いた管腔形成アッセイの代表的な写真である。各試料は、１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下、０．５％ＦＢＳと１００μＭのペプチドを含有している培地中でインキュベートした。FIG. 2B shows that the LRR5 domain in decorin core protein strongly inhibits EC lumen formation on Matrigel. It is a typical photograph of the tube formation assay using the matrigel which passed through the growth factor. Each sample was incubated in medium containing 0.5% FBS and 100 μM peptide in the presence of 15 ng / ml VEGF. 図２Ｃは、デコリンコアタンパク質中のＬＲＲ５ドメインが、マトリゲル上のＥＣ管腔形成を強く阻害することを示す図である。ＬＲＲペプチドによる管腔形成阻害の定量を示すグラフである。ＬＲＲ５は、ＶＥＧＦ誘導性管腔形成を用量依存的に阻害した。FIG. 2C shows that the LRR5 domain in decorin core protein strongly inhibits EC lumen formation on Matrigel. It is a graph which shows quantification of tube formation inhibition by LRR peptide. LRR5 inhibited VEGF-induced lumen formation in a dose-dependent manner. 図３は、デコリンペプチドｈｄＬＲＲ５は、ＴＵＮＥＬ標識により測定した場合、ＥＣアポトーシスを誘導することを示す図である。緑色蛍光（これは白黒写真では見ることができない）はアポトーシスを起こした細胞を示す。FIG. 3 shows that decorin peptide hdLRR5 induces EC apoptosis as measured by TUNEL labeling. Green fluorescence (which cannot be seen in black and white photography) indicates cells that have undergone apoptosis. 図３Ａは、ＬＲＲ５が、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ遊走を阻害したことを示す図である。ＬＲＲ５は投与依存的にＥＣ遊走を阻害する。ＶＥＧＦ_１６５（１０ｎｇ／ｍｌ）を走化剤として用いた。Ｙ軸の遊走（％）は、３組の実験から得た平均値である。FIG. 3A shows that LRR5 inhibited VEGF-induced HUVEC migration. LRR5 inhibits EC migration in a dose-dependent manner. VEGF ₁₆₅ (10 ng / ml) was used as a chemotactic agent. Y-axis migration (%) is an average value obtained from three sets of experiments. 図３Ｂは、ＬＲＲ５が、ｂＦＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ遊走を阻害したことを示す図である。ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を化学遊走物質として用いた。Ｙ軸の遊走（％）は、３組の実験から得た平均値である。FIG. 3B shows that LRR5 inhibited bFGF-induced HUVEC migration. bFGF (10 ng / ml) was used as a chemoattractant. Y-axis migration (%) is an average value obtained from three sets of experiments. 図４は、ヒトデコリンタンパク質の配列（配列番号１）および注解を示す図である。シグナルペプチド（残基１〜１６）にはアンダーラインを引いている。プロペプチド（残基１７〜３０）はイタリック体で示す。成熟デコリンは残基３１〜３５９である。ＬＲＲは、位置８２で始まる交互の大文字および小文字で示している。ＬＲＲ５は、太字でアンダーラインを引いている（残基１７５〜２００）。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合部位は、太字でアンダーラインを引いて示したＳ３４にある。残基Ｎ２１１、Ｎ２６２およびＮ３０３は、少糖類炭水化物に結合するための（Ｎ結合グリコシル化）３つの部位であり、アンダーラインを引いている。非依存性Ｎ末端コラーゲンＩ結合ドメインは、残基４８〜７２にある。ＬＲＲ６はＥＧＦＲを結合する。ＬＲＲ３はフィブロネクチンおよびトロンボスポンジンを結合する。またＣ末端ドメイン（残基３０９〜３５９）もフィブロネクチンを結合する。またＮ末端ドメインは、Ｚｎ^＋＋の存在下でフィブリノーゲンを結合する。FIG. 4 is a diagram showing the sequence of human decorin protein (SEQ ID NO: 1) and comments. The signal peptide (residues 1-16) is underlined. Propeptides (residues 17-30) are shown in italics. Mature decorin is residues 31-359. LRRs are shown in alternating upper and lower case letters starting at position 82. LRR5 is bold and underlined (residues 175-200). The glycosaminoglycan (GAG) binding site is in S34, shown in bold and underlined. Residues N211, N262, and N303 are three sites for binding to oligosaccharide carbohydrates (N-linked glycosylation) and are underlined. An independent N-terminal collagen I binding domain is at residues 48-72. LRR6 binds EGFR. LRR3 binds fibronectin and thrombospondin. The C-terminal domain (residues 309-359) also binds fibronectin. The N-terminal domain also binds fibrinogen in the presence of Zn ⁺⁺ . 図４Ａは、ＬＲＲ５がＥＣ増殖を阻害しないことを示す図である。ＥＣ増殖が１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦによって誘導された。ＬＲＲ５は１０μＭ濃度以下では増殖を阻害しないが、１００μＭでは穏やかに阻害した。FIG. 4A shows that LRR5 does not inhibit EC proliferation. EC proliferation was induced by 10 ng / ml VEGF. LRR5 did not inhibit growth below 10 μM concentration, but gently inhibited at 100 μM. 図４Ｂは、ＬＲＲ５がＥＣ増殖を阻害しないことを示す図である。ＥＣ増殖が１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦによって誘導された。ＬＲＲ５は、ｂＦＧＦ刺激によるＥＣ増殖にいかなる作用も持たなかった。FIG. 4B shows that LRR5 does not inhibit EC proliferation. EC proliferation was induced by 10 ng / ml bFGF. LRR5 had no effect on bFGF-stimulated EC proliferation. 図５は、ｈｄＬＲＲ５（配列番号２）が高濃度（１００μＭ）で内皮細胞アポトーシスを誘導することを示す図である。矢印はアポトーシスを起こした細胞を示す。FIG. 5 shows that hdLRR5 (SEQ ID NO: 2) induces endothelial cell apoptosis at a high concentration (100 μM). Arrows indicate apoptotic cells. 図５Ａは、ＬＲＲ５がＨＵＶＥＣアポトーシスを誘導することを示す図である。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８でＤＮＡを染色することによる顕微鏡下の断片化染色体の観察結果を示す。白色の矢印は、断片化染色体を有するアポトーシス細胞を示す。FIG. 5A shows that LRR5 induces HUVEC apoptosis. The observation result of the fragmented chromosome under a microscope by dyeing DNA with Hoechst dye 33258 is shown. White arrows indicate apoptotic cells with fragmented chromosomes. 図５Ｂは、ＬＲＲ５がカスパーゼ依存的経路を介してＨＵＶＥＣアポトーシスを誘導することを示す図である。細胞死ＥＬＩＳＡアッセイを用いたアポトーシスの定量結果を示す。実験は、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび／または１０μＭのｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（汎用カスパーゼ阻害剤）の存在または不在下で行う。ＬＲＲ５は、ＶＥＧＦの存在下であってもアポトーシスを誘導したが、この作用はｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによってほぼ完全に阻害される。FIG. 5B shows that LRR5 induces HUVEC apoptosis via a caspase-dependent pathway. The quantification result of apoptosis using a cell death ELISA assay is shown. Experiments are performed in the presence or absence of 10 ng / ml VEGF and / or 10 μM z-VAD-fmk (a universal caspase inhibitor). LRR5 induced apoptosis even in the presence of VEGF, but this effect is almost completely inhibited by z-VAD-fmk. 図６は、管腔形成アッセイの結果を示す図である。デコリンペプチドは、マトリゲルでの管腔形成を阻害した。ｄＬＲＲ５は配列番号２であり；ｓｄＬＲＲ５は配列番号３であり；ｄＬＲＲ５Ｍは配列番号６であり；ｄＬＲＲ５Ｎは配列番号４であり；ｄＬＲＲ５Ｃは配列番号５であり；デコリンは配列番号２である。FIG. 6 is a diagram showing the results of a tube formation assay. Decorin peptide inhibited lumen formation in Matrigel. dLRR5 is SEQ ID NO: 2; sdLRR5 is SEQ ID NO: 3; dLRR5M is SEQ ID NO: 6; dLRR5N is SEQ ID NO: 4; dLRR5C is SEQ ID NO: 5; decorin is SEQ ID NO: 2. 図６Ａは、ＬＲＲ５の中央領域が、ＥＣ管腔形成を強く阻害することを示す図である。ＬＲＲ５Ｎ、ＬＲＲ５ＭおよびＬＲＲ５Ｃの抗管腔形成活性の代表的な写真である。ペプチドＬＲＲ５Ｍは、増殖因子を減らしたマトリゲル上のＶＥＧＦ刺激によるＥＣ管腔形成を投与依存的に強く阻害する。FIG. 6A shows that the central region of LRR5 strongly inhibits EC lumen formation. It is a representative photograph of the anti-lumenogenic activity of LRR5N, LRR5M and LRR5C. The peptide LRR5M strongly inhibits VEGF-stimulated EC lumen formation on Matrigel with reduced growth factors in a dose-dependent manner. 図６Ｂは、ＬＲＲ５の中央領域が、ＥＣ管腔形成を強く阻害することを示す図である。１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下で形成された管腔の定量結果を示す。これらの値は、２回の繰り返し実験から得られた管腔の平均の長さである。FIG. 6B shows that the central region of LRR5 strongly inhibits EC lumen formation. The quantification result of the lumen formed in the presence of 15 ng / ml VEGF is shown. These values are the average lumen length obtained from two repeated experiments. 図６Ｃは、ＬＲＲ５の中央領域が、ＥＣ管腔形成を強く阻害することを示す図である。１５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの存在下で形成された管腔の定量結果を示す。これらの値は、２回の繰り返し実験から得られた管腔の平均の長さである。FIG. 6C shows that the central region of LRR5 strongly inhibits EC lumen formation. The quantification result of the lumen formed in the presence of 15 ng / ml bFGF is shown. These values are the average lumen length obtained from two repeated experiments. 図７は、ＨＵＶＥＣ遊走に対するデコリンペプチドの効果の結果を示す図である。１．増殖因子なし（−）；２．１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（＋）；３．３Ｔｇ／ｍｌのデコリン（＋）；４．１ＴＭのＬＲＲ３（＋）；５．１ＴＭのＬＲＲ４（＋）；６．１ＴＭのＬＲＲ５（＋）；７．１ＴＭのスクランブルＬＲＲ５（＋）。FIG. 7 shows the results of decorin peptide effects on HUVEC migration. 1. No growth factor (-); 2.10 ng / ml VEGF (+); 3.3 Tg / ml decorin (+); 4.1 TM LRR3 (+); 5.1 TM LRR4 (+); 6.1 TM LRR5 (+); 7.1 scrambled LRR5 (+). 図７Ａは、ＨＵＶＥＣ遊走に対するＬＲＲ５短鎖ペプチドの効果を示す図である。１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦで刺激した場合のＬＲＲ５Ｎ、ＬＲＲ５ＭおよびＬＲＲ５Ｃペプチドの抗遊走効果を示す。ＬＲＲ５Ｃは、用量依存的にＶＥＧＦ刺激によるＥＣ遊走を阻害する。これらの結果は、３つの異なる実験から得た平均値である。FIG. 7A shows the effect of LRR5 short peptide on HUVEC migration. The anti-migration effect of LRR5N, LRR5M and LRR5C peptides when stimulated with 10 ng / ml VEGF is shown. LRR5C inhibits VEGF-stimulated EC migration in a dose-dependent manner. These results are average values from three different experiments. 図７Ｂは、ＨＵＶＥＣ遊走に対するＬＲＲ５短鎖ペプチドの効果を示す図である。１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで刺激した場合のＬＲＲ５Ｎ、ＬＲＲ５ＭおよびＬＲＲ５Ｃペプチドの抗遊走効果を示す。ＬＲＲ５ＣはｂＦＧＦ刺激によるＥＣ遊走を阻害しないが、ペプチドＬＲＲ５Ｍは効果がある。これらの結果は、３つの異なる実験から得た平均値である。FIG. 7B shows the effect of LRR5 short peptide on HUVEC migration. The anti-migration effect of LRR5N, LRR5M and LRR5C peptides when stimulated with 10 ng / ml bFGF is shown. LRR5C does not inhibit bFGF-stimulated EC migration, but peptide LRR5M is effective. These results are average values from three different experiments. 図８Ａは、ＬＲＲ５短鎖ペプチドがＥＣ増殖を阻害しないことを示す図である。１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦにより刺激したＥＣ増殖。濃度が１０Ｍ以上のペプチドＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５Ｃは、ＶＥＧＦ刺激によるＥＣ増殖を穏やかに阻害する。これらの結果は、３回の実験から得た平均値である。FIG. 8A shows that the LRR5 short peptide does not inhibit EC proliferation. EC proliferation stimulated by 10 ng / ml VEGF. Peptides LRR5N and LRR5C at concentrations of 10M and above gently inhibit VEGF-stimulated EC proliferation. These results are average values obtained from three experiments. 図８Ｂは、ＬＲＲ５短鎖ペプチドがＥＣ増殖を阻害しないことを示す図である。１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦにより刺激したＥＣ増殖。いずれのペプチドも、ｂＦＧＦ刺激によるＥＣ増殖に対して有意な効果はなかった。これらの結果は、３回の実験から得た平均値である。FIG. 8B shows that the LRR5 short chain peptide does not inhibit EC growth. EC proliferation stimulated by 10 ng / ml bFGF. None of the peptides had a significant effect on bFGF-stimulated EC proliferation. These results are average values obtained from three experiments. 図９Ａは、ＥＣアポトーシスの誘導におけるＬＲＲ５サブ領域の異なる活性を示す図である。ＴＵＮＥＬ染色後のアポトーシス細胞の代表的な写真。ここで示した写真は、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下におけるペプチドの効果である。ＬＲＲ５、ＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５Ｍは効果があるが、ＬＲＲ５Ｃにはあまり効果はない。FIG. 9A shows different activities of the LRR5 subregion in inducing EC apoptosis. Representative photograph of apoptotic cells after TUNEL staining. The photograph shown here is the effect of the peptide in the presence of 10 ng / ml VEGF. LRR5, LRR5N and LRR5M are effective, but LRR5C is less effective. 図９Ｂは、ＥＣアポトーシスの誘導におけるＬＲＲ５サブ領域の異なる活性を示す図である。断片化ＤＮＡを測定する細胞死ＥＬＩＳＡアッセイを用いたアポトーシスの定量。実験は、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび／または１０μＭのｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（汎用カスパーゼ阻害剤）の存在下または不在下で行う。ＬＲＲ５、ＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５ＭはＶＥＧＦの存在下であってもアポトーシスを誘導するが、この作用は、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによりほぼ完全に阻害される。FIG. 9B shows the different activities of the LRR5 subregion in the induction of EC apoptosis. Quantification of apoptosis using a cell death ELISA assay that measures fragmented DNA. Experiments are performed in the presence or absence of 10 ng / ml VEGF and / or 10 μM z-VAD-fmk (a universal caspase inhibitor). LRR5, LRR5N and LRR5M induce apoptosis even in the presence of VEGF, but this effect is almost completely inhibited by z-VAD-fmk. 図１０は、フィブロネクチンへのＥＣ結合の阻害におけるＬＲＲ５およびその関連ペプチドの効果を示す図である。フィブロネクチンへのＥＣ結合は、ＤＣＮ、ＬＲＲ５および３種類の短鎖ペプチド全部によって阻害される。ＬＲＲ５ＭおよびＬＲＲ５Ｃと比較した場合、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｎは高い効果を示す。ここで示した値は、３回の繰り返し実験の平均値である。FIG. 10 shows the effect of LRR5 and its related peptides in inhibiting EC binding to fibronectin. EC binding to fibronectin is inhibited by DCN, LRR5 and all three short peptides. LRR5 and LRR5N are highly effective when compared to LRR5M and LRR5C. The value shown here is an average value of three repeated experiments. 図１１は、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍは、ＨＵＶＥＣ内のＶＥＧＦ刺激によるＦＡＫＹ３９７リン酸化を効果的に阻害したことを示す図である。ＩＰ：免疫沈降；Ｗｂ：ウェスタンブロット。FIG. 11 shows that LRR5 and LRR5M effectively inhibited VEGF-stimulated FAK Y397 phosphorylation in HUVEC. IP: immunoprecipitation; Wb: Western blot. 図１２は、ペプチドＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍは、局所接着へのＶＥＧＦ誘導によるパキシリン再配置を効果的に阻害したことを示す図である。ＨＵＶＥＣを固定し、透過処理し、パキシリンに対し染色した。ペプチドの濃度は１００μＭであり、組換えＤＣＮは１００ｎＭであった。ペプチド処理した試料は、すべて１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下にあった。実験は３回繰り返した。代表的な写真を示す。白色の矢印は局所接着を示す。画像は、オリンパス１×７０共焦点顕微鏡を用いて得た。FIG. 12 shows that peptides LRR5 and LRR5M effectively inhibited VEGF-induced paxillin rearrangement to local adhesion. HUVECs were fixed, permeabilized and stained for paxillin. The peptide concentration was 100 μM and the recombinant DCN was 100 nM. All peptide-treated samples were in the presence of 10 ng / ml VEGF. The experiment was repeated three times. A representative photograph is shown. White arrows indicate local adhesion. Images were obtained using an Olympus 1 × 70 confocal microscope. 図１３は、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍは、ＶＥＧＦ誘導性アクチンストレスファイバー形成を効果的に阻害したことを示す図である。ＨＵＶＥＣ細胞を固定し、線状アクチンをファロイジンＴＲＩＴＣコンジュゲートで染色した。ペプチド処理試料は、すべて１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下であった。実験は３回繰り返した。写真は、各試料の異なる２０ヶ所の顕微鏡検査位置の代表的写真である。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８による青色カウンター染色である。白色の矢印はアクチンストレスファイバーを示す。画像は、倍率６３０×のＺｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を用いて得た。FIG. 13 shows that LRR5 and LRR5M effectively inhibited VEGF-induced actin stress fiber formation. HUVEC cells were fixed and linear actin was stained with phalloidin TRITC conjugate. All peptide treated samples were in the presence of 10 ng / ml VEGF. The experiment was repeated three times. The photographs are representative photographs of 20 different microscopic inspection positions of each sample. Nuclei are blue counterstained with Hoechst dye 33258. White arrows indicate actin stress fibers. Images were obtained using a Zeiss fluorescence microscope with a magnification of 630 ×. 図１４は、ＬＲＲ５、そのスクランブル誘導体および３種類の短鎖誘導体のＣＤスペクトルを示す図である。ペプチドの濃度は１ｍＭであった。FIG. 14 is a diagram showing CD spectra of LRR5, its scrambled derivatives, and three types of short chain derivatives. The concentration of peptide was 1 mM. 図１５は、ペプチドｈｄＬＲＲ５（配列番号２；ＬＲＲ５ともいう）がＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ遊走を阻害することを示す図である。１．増殖因子なしコントロール；２．１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ；３〜８：１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ＋１００μＭ、１０μＭ；１μＭ；１００ｎＭ；１０ｎＭ；１ｎＭの濃度のデコリンｈｄＬＲＲ５ペプチド。FIG. 15 shows that the peptide hdLRR5 (SEQ ID NO: 2; also referred to as LRR5) inhibits VEGF-induced HUVEC migration. 1. No growth factor Control; 2.10 ng / ml VEGF; 3-8: 10 ng / ml VEGF + 100 μM, 10 μM; 1 μM; 100 nM; 10 nM; 1 nM concentrations of decorin hdLRR5 peptide. 図１６は、ペプチドｈｄＬＲＲ５がマトリゲルでの管腔形成を阻害することを示す図である。FIG. 16 shows that the peptide hdLRR5 inhibits tube formation in Matrigel. 図１７は、デコリンペプチドｄＬＲＲ５が、ＴＵＮＥＬ標識で測定した場合にＥＣアポトーシスを誘導することを示す図である。緑色蛍光（これは白黒写真では見ることができない）は、アポトーシスを起こした細胞を示す。FIG. 17 shows that the decorin peptide dLRR5 induces EC apoptosis when measured with TUNEL labeling. Green fluorescence (which cannot be seen in black and white photography) indicates cells that have undergone apoptosis. 図１８は、ヒトデコリンタンパク質の配列（配列番号１）および注解を示す図である。シグナルペプチド（残基１〜１６）にはアンダーラインを引いている。プロペプチド（残基１７〜３０）はイタリック体で示す。成熟デコリンは残基３１〜３５９である。ＬＲＲは、位置８２で始まる交互の大文字および小文字で示している。ＬＲＲ５は、太字でアンダーラインを引いている（残基１７５〜２００）。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合部位は、太字でアンダーラインを引いて示したＳ３４にある。残基Ｎ２１１、Ｎ２６２およびＮ３０３は、少糖類炭水化物に結合するための（Ｎ結合グリコシル化）３つの部位であり、アンダーラインを引いている。非依存性Ｎ末端コラーゲンＩ結合ドメインは、残基４８〜７２にある。ＬＲＲ６はＥＧＦＲを結合する。ＬＲＲ３はフィブロネクチンおよびトロンボスポンジンを結合する。またＣ末端ドメイン（残基３０９〜３５９）もフィブロネクチンを結合する。またＮ末端ドメインは、Ｚｎ^＋＋の存在下でフィブリノーゲンを結合する。FIG. 18 is a diagram showing the sequence of human decorin protein (SEQ ID NO: 1) and annotations. The signal peptide (residues 1-16) is underlined. Propeptides (residues 17-30) are shown in italics. Mature decorin is residues 31-359. LRRs are shown in alternating upper and lower case letters starting at position 82. LRR5 is bold and underlined (residues 175-200). The glycosaminoglycan (GAG) binding site is in S34, shown in bold and underlined. Residues N211, N262, and N303 are three sites for binding to oligosaccharide carbohydrates (N-linked glycosylation) and are underlined. An independent N-terminal collagen I binding domain is at residues 48-72. LRR6 binds EGFR. LRR3 binds fibronectin and thrombospondin. The C-terminal domain (residues 309-359) also binds fibronectin. The N-terminal domain also binds fibrinogen in the presence of Zn ⁺⁺ . 図１９は、ｈｄＬＲＲ５（配列番号２）が高濃度（１００μＭ）で内皮細胞アポトーシスを誘導することを示す図である。矢印はアポトーシスを起こした細胞を示す。FIG. 19 is a diagram showing that hdLRR5 (SEQ ID NO: 2) induces endothelial cell apoptosis at a high concentration (100 μM). Arrows indicate apoptotic cells. 図２０は、管腔形成アッセイの結果を示す図である。デコリンペプチドは、マトリゲルでの管腔形成を阻害した。ｄＬＲＲ５は配列番号２であり；ｓｄＬＲＲ５は配列番号３であり；ｄＬＲＲ５Ｍは配列番号６であり；ｄＬＲＲ５Ｎは配列番号４であり；ｄＬＲＲ５Ｃは配列番号５であり；デコリンは配列番号２である。FIG. 20 shows the results of the tube formation assay. Decorin peptide inhibited lumen formation in Matrigel. dLRR5 is SEQ ID NO: 2; sdLRR5 is SEQ ID NO: 3; dLRR5M is SEQ ID NO: 6; dLRR5N is SEQ ID NO: 4; dLRR5C is SEQ ID NO: 5; decorin is SEQ ID NO: 2. 図２１は、ＨＵＶＥＣ遊走に対するデコリンペプチドの効果の結果を示す図である。１．増殖因子なし（−）；２．１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（＋）；３．３Ｔｇ／ｍｌのデコリン（＋）；４．１ＴＭのＬＲＲ３（＋）；５．１ＴＭのＬＲＲ４（＋）；６．１ＴＭのＬＲＲ５（＋）；７．１ＴＭのスクランブルＬＲＲ５（＋）。FIG. 21 shows the results of decorin peptide effects on HUVEC migration. 1. No growth factor (-); 2.10 ng / ml VEGF (+); 3.3 Tg / ml decorin (+); 4.1 TM LRR3 (+); 5.1 TM LRR4 (+); 6.1 TM LRR5 (+); 7.1 scrambled LRR5 (+).

Claims

ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含有するデコリンの一部由来の５〜４０個のアミノ酸からなるペプチド、または前記ペプチドの変異体。 A peptide consisting of 5 to 40 amino acids derived from a part of decorin containing leucine rich repeat (LRR), or a variant of said peptide.

ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含有するデコリンの一部由来の５〜３０個のアミノ酸からなる請求項１に記載のペプチド、または前記ペプチドの変異体。 The peptide of Claim 1 which consists of 5-30 amino acids derived from a part of decorin containing a leucine rich repeat (LRR), or the variant of the said peptide.

ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含有するデコリンの一部由来の５〜２６個のアミノ酸からなる請求項１に記載のペプチド、または前記ペプチドの変異体。 The peptide of Claim 1 which consists of 5 to 26 amino acids derived from a part of decorin containing a leucine rich repeat (LRR), or the variant of the said peptide.

デコリンのＬＲＲ５由来の５〜２６個のアミノ酸からなる請求項３に記載のペプチド、またはかかるペプチドの変異体。 4. The peptide according to claim 3, comprising 5 to 26 amino acids derived from LRR5 of decorin, or a variant of such a peptide.

アミノ酸配列ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号２）；ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫ（配列番号４）；もしくはＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号５）；ＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥ（配列番号６）を有する、請求項４に記載のペプチド、または前記ペプチドの変異体。 5. The peptide of claim 4, or a variant of said peptide, having the amino acid sequence QMIVIELGTNPLSGSGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 2); QMIVIELGTNPLK (SEQ ID NO: 4); or SSGIENGAFQGMK (SEQ ID NO: 5);

デコリンのＬＲＲ４由来の５〜２４個のアミノ酸からなる請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、または前記ペプチドの変異体。 The peptide according to any one of claims 1 to 3, or a variant of the peptide, comprising 5 to 24 amino acids derived from decorin LRR4.

アミノ酸配列ＴＬＱＥＬＲＡＨＥＮＥＩＴＫＶＲＫＶＴＦＮＧＬＮ（配列番号８）を有する、請求項６に記載のペプチド、またはその変異体。 7. The peptide of claim 6, or a variant thereof, having the amino acid sequence TLQELRAHENEITKVRKVTFNGLN (SEQ ID NO: 8).

デコリンのＬＲＲ３由来の５〜２１個のアミノ酸からなる請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、またはその変異体。 The peptide according to any one of claims 1 to 3, or a variant thereof, comprising 5 to 21 amino acids derived from decorin LRR3.

アミノ酸配列ＫＬＥＲＬＹＬＳＫＮＱＬＫＥＬＰＥＫＭＰＫ（配列番号７）を有する、請求項８に記載のペプチド、またはその変異体。 The peptide of Claim 8 which has an amino acid sequence KLERLYLSKNQLKELPEKMPK (sequence number 7), or its variant.

請求項１〜９のいずれか一項に定義した２種以上のペプチド、または請求項１〜９のいずれか一項に定義した１種のペプチドおよびデコリン由来でない追加のペプチド配列を含む、２５０個以下のアミノ酸残基からなるペプチド、あるいは２５０個以下のアミノ酸残基の前記ペプチドの変異体。 250, comprising two or more peptides as defined in any one of claims 1 to 9, or one peptide as defined in any one of claims 1 to 9 and an additional peptide sequence not derived from decorin A peptide comprising the following amino acid residues, or a variant of the peptide having 250 or fewer amino acid residues.

１００個以下のアミノ酸残基からなる請求項１０に記載のペプチド、またはその変異体。 The peptide of Claim 10 which consists of 100 or less amino acid residues, or its variant.

変異体において、デコリン配列由来の１個または２個または３個または４個のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、請求項１〜１１のいずれか一項に定義したペプチドの変異体。 12. A variant of a peptide as defined in any one of claims 1 to 11, wherein in the variant one, two, three or four amino acids from the decorin sequence are replaced with another amino acid.

置換アミノ酸の１種または複数が非天然アミノ酸である、請求項１２に記載の変異体。 13. A variant according to claim 12, wherein one or more of the substituted amino acids is an unnatural amino acid.

変異体が、ペプチド結合の代わりに１種または複数の非ペプチド結合を含有する、請求項１〜１１のいずれか一項に定義したペプチドの変異体。 12. A variant of a peptide as defined in any one of claims 1 to 11, wherein the variant contains one or more non-peptide bonds instead of peptide bonds.

環状ペプチドである、請求項１〜１１のいずれか一項に定義したペプチド。 The peptide as defined in any one of claims 1 to 11, which is a cyclic peptide.

請求項１〜１１のいずれか一項に定義したペプチドをコードするポリヌクレオチド。 A polynucleotide encoding a peptide as defined in any one of claims 1-11.

請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクター。 An expression vector comprising the polynucleotide according to claim 16.

請求項１６に記載のポリヌクレオチド、または請求項１７に記載の発現ベクターを含んでいる宿主細胞。 A host cell comprising the polynucleotide of claim 16 or the expression vector of claim 17.

請求項１〜１５のいずれか一項に記載したペプチドまたはその変異体の製造方法であって、前記ペプチドまたは変異体を化学的に合成することを含む方法。 A method for producing the peptide or variant thereof according to any one of claims 1 to 15, comprising chemically synthesizing the peptide or variant.

請求項１〜１１のいずれか一項に定義したペプチドの製造方法であって、請求項１６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１７に記載の発現ベクターから、あるいは請求項１８に記載の宿主細胞中で前記ペプチドを発現することを含む方法。 A method for producing a peptide as defined in any one of claims 1 to 11, comprising the polynucleotide of claim 16 or the expression vector of claim 17 or in the host cell of claim 18. Expressing the peptide in

請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体と、薬剤として許容される担体とを含む医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising the peptide according to any one of claims 1 to 15 or a variant thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.

薬剤として使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体。 The peptide according to any one of claims 1 to 15 or a variant thereof for use as a medicine.

患者の血管新生を阻害する方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドもしくはその変異体、または請求項１６に記載のポリヌクレオチド、または請求項１７に記載の発現ベクターを投与することを含む方法。 A method for inhibiting angiogenesis in a patient, the peptide according to any one of claims 1 to 15 or a variant thereof, or the polynucleotide according to claim 16, or the expression vector according to claim 17. Administering.

患者が有害な血管新生がある疾患に罹患しているか、その疾患に罹患しやすい、請求項２３に記載の方法。 24. The method of claim 23, wherein the patient is suffering from or susceptible to a disease with deleterious angiogenesis.

癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、潰瘍、子宮内膜症および乾癬のいずれかに罹患しているか、または罹患しやすい患者を治療する方法であって、患者に、有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドもしくはその変異体、または請求項１６に記載のポリヌクレオチド、または請求項１７に記載の発現ベクターを投与することを含む方法。 A method of treating a patient suffering from or susceptible to any of cancer, diabetic retinopathy, macular degeneration, rheumatoid arthritis, ulcer, endometriosis and psoriasis, the patient claiming an effective amount 18. A method comprising administering the peptide according to any one of claims 1 to 15 or a variant thereof, or the polynucleotide according to claim 16, or the expression vector according to claim 17.

患者の有害な血管新生を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドもしくはその変異体、請求項１６に記載のポリヌクレオチド、または請求項１７に記載の発現ベクターの使用。 18. A peptide according to any one of claims 1 to 15 or a variant thereof, a polynucleotide according to claim 16, or a polynucleotide according to claim 17 in the manufacture of a medicament for treating adverse angiogenesis in a patient. Use of the expression vector.

癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、潰瘍、子宮内膜症および乾癬のいずれかに罹患しているか、または罹患しやすい患者を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドもしくはその変異体、請求項１６に記載のポリヌクレオチド、または請求項１７に記載の発現ベクターの使用。 In the manufacture of a medicament for treating a patient suffering from or susceptible to any of cancer, diabetic retinopathy, macular degeneration, rheumatoid arthritis, ulcer, endometriosis and psoriasis. Use of the peptide according to any one of the above or a variant thereof, the polynucleotide according to claim 16, or the expression vector according to claim 17.