JP2008500004A - ＣＤ４４ｖＲＡに対する抗体およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑膜細胞に由来するＣＤ４４変異体タンパク質に対して特異的な抗体、および前記ＲＡ特異的ＣＤ４４変異体に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を放出する新規の細胞ハイブリドーマ、およびそれによって発現されるｍＡｂに関する。前記抗体は特異的なＣＤ４４変異体を同定、単離または標的化する方法において有用である。
【選択図】 図３

Description

本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑膜細胞に由来するＣＤ４４変異体タンパク質に対して特異的な抗体、ならびに、このタンパク質に関する種々の生物工学的方法および使用に関する。

先行技術の列挙
以下は、本発明の分野における最新技術を記述するために適切であると考えられる先行技術の列挙である。本明細書中におけるこれらの参考文献の表示は、著者名および発行年を括弧内に示すことによってなされる。

ＣＤ４４と呼ばれる細胞表面接着分子は、細胞と細胞との相互作用および細胞とマトリックスとの相互作用、ならびに、細胞輸送、細胞の経内皮移動に関係していることが示されている。

ＣＤ４４は、保存されたアミノ末端の細胞外ドメイン、保存されていない膜近位領域、変異体エキソンの様々な組合せを発現する可変領域、保存された膜貫通領域ドメイン、および、保存された細胞質尾部を含む単鎖分子である。ＣＤ４４のゲノム配列は５’末端における５個の定常エキソンおよび３’末端における５個の定常エキソンを含む。マウスのＣＤ４４遺伝子はまた、Ｖ_１〜Ｖ_１０と呼ばれる１０個の変異体エキソンを分子の中央部に含み、これにより、合計で２０個のエキソンがもたらされる。ヒトのＣＤ４４遺伝子は、これら１０個の変異体エキソンのうちの９個のみ（Ｖ_２〜Ｖ_１０）を含み、従って、合計で１９個のエキソンを含む（Ｓｃｒｅａｔｏｎ，Ｇ．Ｒ．他、１９９２）。Ｖ_２〜Ｖ_１０の差のある選択的スプライシングにより、膜近位ドメインに挿入され、分子の可変領域を構成する変異体エキソン（これらはエキソンＶｘ（ｘ＝１〜１０）と呼ばれる）の様々な組合せを発現するＣＤ４４の多くのイソ型が生じている。これらの分子はＣＤ４４変異体（ＣＤ４４ｖ）と呼ばれる。今日までに、ＣＤ４４の数十個のイソ型が知られている。

標準のＣＤ４４（ＣＤ４４ｓ、配列番号５）において、第５定常エキソンは直接スプライシングされて第１６定常エキソンになり、従って、この分子は完全な可変領域を有さない。生じたタンパク質生成物は主に造血細胞表面で発現し、従って、この生成物はまた、造血ＣＤ４４（ＣＤ４４Ｈ）または標準ＣＤ４４生成物（ＣＤ４４ｓ生成物、配列番号６）として知られている。角化細胞のＣＤ４４（これまでに確認された最も長いＣＤ４４）では、エキソンＶ３〜エキソンＶ１０が分子の２つの定常領域の間に縦列で挿入されている。

ＣＤ４４のＮ末端には、分子のリガンド結合部位が含まれる。ヒアルロン酸（ＨＡ）がＣＤ４４の主たるリガンドであるが、他の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（例えば、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンおよびコンドロイチン硫酸）、ならびに、ＥＣＭ非構成成分（粘膜血管アドレッシン、セルグリシン、オステオポンチンおよびクラスＩＩインバリアント鎖）もまた、ＣＤ４４受容体と相互作用することができる。ＣＤ４４およびときにはヒアルロン酸の顕著な蓄積が、創傷治癒、組織再構成、炎症（自己炎症を含む）、形態形成および発ガンにおけるような、集中した細胞遊走および細胞増殖の領域において検出される。

自己免疫疾患におけるＣＤ４４タンパク質およびその様々な変異体の関与が知られている。例えば、様々な抗ＣＤ４４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により、マウスにおける実験的に誘導された自己免疫関節炎の重篤度が改善され得ることが示されている（Ｖｅｒｄｒｅｎｇｈ，Ｍ．他、１９９５）。しかしながら、これらのｍＡｂはＣＤ４４の定常領域に対して向けられている（従って、これらは、すべてのＣＤ４４イソ型によって共有される抗汎ＣＤ４４ｍＡｂと呼ばれる）。従って、そのようなｍＡｂはまた、微生物の撲滅に関わる免疫細胞および炎症細胞の遊走活性のために要求される、正常な細胞の表面に発現するＣＤ４４を阻止することができる。

ＣＤ４４の様々な変異体領域に対して向けられたモノクローナルＡｂはまた、自己免疫疾患を処置するための潜在的な薬剤として提案されている。Ｈｅｒｒｌｉｃｈ他は、ラット膵臓腺ガンのＣＤ４４ｖ表面タンパク質の転移特異的な変異体に対して向けられたｍＡｂを記載する（Ｈｅｒｒｌｉｃｈ他、１９９１）。Ｔ細胞の増殖を阻害する抗ＣＤ４４モノクローナル抗体もまた、様々な自己免疫疾患を処置するために提供されていた（Ａｕｎｅ，Ｔ．Ｍ．他、１９９２）。エキソンｖ６を含有するＣＤ４４の様々な形態に対して特異的なモノクローナル抗体もまた、炎症性疾患を診断するために有用であるとして報告されていた（Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｓ．他、１９９４）。加えて、ある種のＣＤ４４タンパク質、ペプチドまたは誘導体が、様々な自己免疫疾患を処置するために使用することができることが報告されている（Ｈａｌｅ，Ｌ．Ｐ．，１９９２）。

実験的関節炎のマウスモデル（コラーゲン誘導関節炎）において、イソタイプが一致したコントロールｍＡｂの注射ではなく、３つの異なる抗ＣＤ４４ｍＡｂのうちの１つを疾患発症時に注射することにより、足蹠腫脹の増大が防止され、また、そのような注射は、臨床スコアを非常に低いレベルで維持することに役立っていた（Ｎｅｄｖｅｔｚｋｉ他、１９９９）。これら３つの異なるタイプの抗ＣＤ４４ｍＡｂのそれぞれがＣＤ４４受容体の異なった定常エピトープを認識した。３つの抗体のすべてが、類似する関節炎防止効果を示した。

悪性プロセスにおけるＣＤ４４の関与もまた記載されている（Ｎａｏｒ，Ｄ．、１９９７）。マウスに注射された抗ＣＤ４４ｍＡｂは、様々なリンパ腫細胞およびガン腫細胞がそれらの標的器官に浸潤することを阻害または防止することが示された。加えて、非転移性のラット膵臓腺ガン細胞への変異体ＣＤ４４イソ型のトランスフェクションは転移能力をこれらの細胞にもたらした。

（用語集）
下記は、説明および請求項を通して使用され、かつ、下記のように意味することが本発明に従って理解されなければならない用語である。

「関節リウマチ−ＣＤ４４（ＣＤ４４−ＲＡ）変異体核酸をコードする配列」（これはまた、「ＣＤ４４ｖＲＡコード配列」または「ＣＤ４４−ＲＡ変異体」と交換可能に示される）−これは、配列番号１に示される配列を有する核酸分子を示す。この配列に対する少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列（下記参照）、および、少なくとも２０ヌクレオチドの長さを有する上記分子のフラグメント（下記参照）も同様に、配列番号１を有する変異体と同じ用途の多くについて好適である。これらの分子は、天然で既知のＣＤ４４転写物の新規な天然に存在する選択的スプライシング変異体をコードする配列を含む。変異体は、一次ｍＲＮＡ転写物の選択的スプライシングから生じる天然に存在する成熟ｍＲＮＡ配列であり、既知の配列の単なる短縮化された形態、変異した形態またはフラグメント化形態でないことを強調しなければならない。

このＣＤ４４ｖＲＡ配列は、ＣＤ４４遺伝子の定常部のエキソン１〜５、エキソン１５〜１７およびエキソン１９、ならびに遺伝子の可変領域のエキソン７〜１４（ｖ３〜ｖ１０）を含む（Ｓｃｒｅａｔｏｎ他、１９９２、上掲）。この変異体コード配列の特徴的な特徴は、下記において説明されるように、その配列が、野生型（ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０）のコード配列と最適にアラインメントされたとき、３つのさらなる塩基（ＣＡＧ）をエキソンｖ５の５末端（特に、配列番号１の９０８位〜９１０位）に含むことである。

「ＣＤ４４ｖＲＡ生成物」は、「変異体生成物」、「ＣＤ４４ｖＲＡタンパク質」、「変異体タンパク質」、「ＣＤ４４ｖＲＡペプチド」または「変異体ペプチド」としてもまた示されることがあるが、ＣＤ４４ｖＲＡコード配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。「ポリペプチド」によって、ペプチドまたはタンパク質、ならびに、化学修飾されたアミノ酸（下記参照）を有するペプチドまたはタンパク質（例えば、糖ペプチドまたは糖タンパク質）が意図される。ＣＤ４４ｖＲＡ生成物の特徴的な特徴は、野生型タンパク質配列（ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０）と最適にアラインメントされたときに野生型タンパク質配列（ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０）と比較して、配列番号２の３０３位における新しいＡｌａ残基の挿入に関する。後者は本発明による好ましいＣＤ４４ｖＲＡ生成物である。このＣＤ４４ｖＲＡタンパク質は、ＲＡ患者のヒト滑膜細胞から単離されるような天然のグリコシル化形態を含む。

「核酸分子」または「核酸」は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチドまたは両タイプの組合せから構成される一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを示し、また、天然型ヌクレオチド、化学修飾されたヌクレオチド、および合成ヌクレオチドを含むことができる。

「アミノ酸配列」、２０個の天然に出現するアミノ酸、合成アミノ酸、および化学修飾されているアミノ酸（下記参照）のいずれか１つから構成される配列。

「抗体」−これは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥの抗体クラスのいずれかの抗体を示す。この定義には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が含まれる。この用語は、完全な抗体、または、由来した完全な抗体の抗原結合特性を実質的に保持する、抗変異体生成物抗体の抗原結合ドメインを含む抗体のフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｃ部分を有さない他の抗体、単鎖抗体、二重特異的抗体、二重特異性抗体、本質的には抗体の可変部の抗原結合ドメインのみからなる他のフラグメントなど）を示す。

用語「完全な抗体の抗原結合特性を実質的に保持する」は、抗体フラグメント、誘導体または組換え抗体分子がＣＤ４４ｖＲＡ生成物と特異的に結合し、かつ、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物に対する親和性が、例えば、（下記に記載されるような）スキャッチャード分析によって測定されたとき、（フラグメント、誘導体または組換え抗体分子が由来した）完全な抗体の結合親和性の少なくとも３０％であるようでなければならないことを意味することを理解しなければならない。好ましい実施形態において、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物についての、抗体フラグメント、誘導体または組換え抗体分子の結合親和性は、完全な抗体の結合親和性の少なくとも５０％であり、より好ましくは、完全な抗体の結合親和性の少なくとも７５％である。

「抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体」または「抗ＣＤ４４−ＲＡ変異体抗体」は、ＣＤ４４ｖＲＡタンパク質に特異的に結合する抗体を示す。この抗体には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、そして、抗体フラグメント、抗体誘導体および相同体、ならびに組換え抗体分子（すべてがモノクローナル抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体またはポリクローナル抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体に由来する）が含まれる。抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体には特に、本明細書中に記載される特定のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（これは「Ｆ８：３３ｍＡｂ」および「Ｆ８：３３−６−８−１０ｍＡｂ」の用語によって本明細書中では示される）、ならびに、ＣＤ４４ｖＲＡタンパク質に特異的に結合する他の抗体（これは抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂとして示される）が含まれる。好ましくは、抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体は、このさらなるＡｌａ残基を含有するエピトープに対して特異的に結合する。

「組換え抗体分子」−これは、標準的な遺伝子工学技術による、典型的には核酸レベル（すなわち、遺伝子、ｍＲＮＡなど）におけるモノクローナル抗体の操作から生じる抗体分子を示す。組換え抗体分子は、モノクローナル抗体「に由来する」として示される。組換え抗体分子には、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、単鎖抗体および融合タンパク質が含まれる。組換え抗体分子は、その組換え抗体分子が由来したモノクローナル抗体の抗原結合特性を実質的に保持する。

「抗体フラグメント」−これには、抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体の少なくとも６アミノ酸のフラグメント、または、このポリペプチドの誘導体もしくは相同体の少なくとも６アミノ酸のフラグメントが含まれる。フラグメントは、好ましくは、この抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体またはこの誘導体もしくは相同体の少なくとも１０個のアミノ酸（より好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸）を含む。

「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の誘導体」−これには、元のｍＡｂに由来する（上記で定義されるような）組換え抗体分子、ならびに、化学修飾されている（上記で定義されるような）ｍＡｂが含まれ、また、放射性薬剤、蛍光性成分、トキシン、抗生物質などにより標識されたｍＡｂもまた含まれる。

「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の相同体」−これには、元のｍＡｂの配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質、または、元のｍＡｂを形成する少なくとも６個のアミノ酸のフラグメントに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。相同体と、元のｍＡｂまたはそのフラグメントとの間でのアミノ酸配列における変化は、元の配列の１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、置換または化学的修飾から生じる。相同体が置換を含有する場合、その置換は好ましくは保存的置換である。

「保存的置換」−これは、１つのクラスにおけるアミノ酸が同じクラスのアミノ酸によって置換される（されている）ことを示す（この場合、クラスは、アミノ酸側鎖の共通する物理化学的性質、および、例えば、標準的なＤａｙｈｏｆｆ頻度交換行列またはＢＬＯＳＵＭ行列によって決定されるような自然界に見出される相同的タンパク質における大きい置換頻度によって定義される）。アミノ酸側鎖の６つの一般的なクラスが類別化されており、これらには、クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；およびクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）が含まれる。例えば、Ａｓｐを別のクラスＩＩＩ残基（例えば、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＧｌｕ）に置換することは保存的置換である。

「非保存的置換」−これは、あるクラスのアミノ酸が別のクラスからのアミノ酸で置換される（されている）ことを示す（例えば、Ａｌａ（クラスＩＩ残基）のクラスＩＩＩ残基（例えば、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＧｌｕなど）による置換）。

「化学修飾された」−これは、本発明の生成物を示すとき、そのアミノ酸残基の少なくとも１つが、天然のプロセス（プロセシングまたは他の翻訳後修飾など）、または、この分野で広く知られている化学的修飾技術のいずれかによって修飾されている生成物（タンパク質、ポリペプチド、抗体）を意味する。数多くの既知の修飾の中で、典型的ではあるが、非限定的な例には、アセチル化、アシル化、アミド化、ＡＤＰ−リボシル化、グリコシル化、グリコサミノグリカン化、ＧＰＩアンカー形成、脂質または脂質誘導体の共有結合による結合、メチル化、ミリスチル化、ペグ化、プレニル化、リン酸化、ユビキチン化、または任意の類似するプロセスが含まれる。

「最適なアラインメント」−これは、最大のパーセント同一性スコアを与えるアラインメントとして定義される。そのようなアラインメントは、様々な市販の配列分析プログラムを使用して、例えば、１のカットアップ、初期値パラメーターおよび初期値ＰＡＭを使用する局所的アラインメントプログラムＬＡＬＩＧＮなどを使用して行うことができる。

「少なくとも９０％の同一性を有する」−これは、２組のアミノ酸配列または核酸配列に関して、配列が最適にアラインメントされているときに２つの配列において同一である残基の百分率を示す。従って、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性は、２つ以上の最適にアラインメントされたポリペプチド配列におけるアミノ酸の少なくとも９０％が同一であることを意味する。しかしながら、この定義は明らかに、元のｍＡｂ配列に関して１００％同一である配列を含まない。

「発現ベクター」−これは、ＤＮＡフラグメントを取り込み、かつ、細胞内で発現する能力を有するベクターを示す。多くの原核生物発現ベクターおよび真核生物発現ベクターが知られており、かつ／または市販されている。適切な発現ベクターの選択は当業者の知識の範囲内である。

「欠失」−これは、天然に存在する配列と比較したとき、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基がそれぞれ存在しない、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のいずれかにおける変化である。

「挿入」または「付加」−これは、天然に存在する配列と比較したとき、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加をそれぞれもたらしている、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列におけるそのような変化である。

「置換」−１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸が、天然に存在する配列と比較したとき、異なるヌクレオチドまたはアミノ酸によってそれぞれ置換される（されている）こと。アミノ酸配列に関して、置換は保存的または非保存的であり得る。

「生物学的サンプル」−本発明の方法において使用される生物学的サンプルは、任意の適切な身体由来の体液サンプル（これには、全血、末梢血単球、リンパ球などが含まれる）が可能であり、好ましくは、生物学的サンプルは滑膜細胞または滑液あるいはその細胞抽出物を含む。

「疾患を処置する」−これは、疾患、障害または病理学的状態に関連する症状（特に、関節リウマチ（ＲＡ）に関連する症状）を改善するために、重篤度を軽減するか、または疾患を治療するために、あるいは、疾患を発症させないために、あるいは、疾患に関連する症状の発現を、症状が現れる前に防止するために、疾患の進行、または疾患に関連する症状の悪化を低下させるために、寛解期間の開始を高めるために、疾患の進行的慢性期段階で引き起こされる不可逆的損傷を遅くするために、この進行期段階の開始を遅らせるために、生存率またはより迅速な回復を改善するために、あるいは、上記の２つ以上の組合せのために効果的な治療物質を投与することを示す。

処置療法は、処置される疾患のタイプに依存するものであり、医学の分野における当業者（例えば、医師）に既知の様々な検討事項によって決定することができる。

「検出」−これは、本発明のいくつかの態様では、疾患、障害、病理学的状態または正常な状態を検出する方法を示し、具体的には、関節リウマチおよび乾癬性関節炎におけるそれらの検出方法を示す。この用語は、疾患、障害または病理学的状態に対する素因の検出、ならびに、疾患の重篤度を決定することによって患者の予後を明らかにするための検出を示す場合がある。抗体−抗原複合体の検出を、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年）に記載される様々な技術（これらに限定されない）を含めて、この分野で広く知られている数多くの技術のいずれかによって行うことができる。

本発明は、ハイブリドーマの開発、および、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物またはこのＣＤ４４ｖＲＡ生成物のフラグメント（ただし、フラグメントは、ＣＤ４４ｖＲＡコード配列（配列番号１）のエキソンｖ４からエキソンｖ５にまでまたがる領域から翻訳されるアミノ酸配列、または、この領域の一部から翻訳されるアミノ酸配列（約３０アミノ酸）を含み、かつ、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物およびＣＤ４４ｖ３−ｖ１０生成物（配列番号４）が最適にアラインメントされたとき、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０の対応するフラグメントには存在しないＡｌａ残基を含む）と特異的に反応する、このハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体に基づいている。

本発明はまた、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物（配列番号２）に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株（本明細書中ではＦ８：３３ハイブリドーマおよびＦ８：３３−６−８−１ハイブリドーマと呼ばれる）を提供する。これらのハイブリドーマは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ Ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）（パスツール研究所、パリ、フランス）に２００３年４月１６日に寄託された：寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−３０１５（ハイブリドーマＦ８：３３について）および同ＣＮＣＭ Ｉ−３０１６（ハイブリドーマＦ８：３３−６−８−１０について）。

本発明はさらに、Ｆ８：３３ハイブリドーマまたはＦ８：３３−６−８−１０ハイブリドーマのいずれかによって産生されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を提供する。

本発明のｍＡｂの抗原結合特異性を実質的に保持する、上記ｍＡｂのフラグメント、誘導体または相同体もまた本発明の一部を形成する。

加えて、本発明は、上記で定義されるような本発明の抗体を含む医薬組成物を提供する。

別の態様によって、本発明は、この抗体を製造する方法を提供する。この場合、この方法は、（ｉ）モノクローナル抗体を産生するＦ８：３３ハイブリドーマまたはＦ８：３３−６−８−１０ハイブリドーマの細胞を提供すること、および（ｉｉ）この抗体の産生を可能にする条件のもとでこの細胞を培養することを含む。

さらに別の態様によって、本発明は、Ｆ８：３３ハイブリドーマまたはＦ８：３３−６−８−１０ハイブリドーマによって産生される抗体を単離する方法を提供する。この方法は、上記に記載されるように抗体を産生させること、および、産生された抗体を単離することを含む。

さらに、本発明は、この抗体によって認識されるポリペプチドを生物学的サンプルから精製する方法を提供する。この場合、この方法は、
（ｉ）固体担体に結合したこの抗体を含むアフィニティーマトリックスを提供すること；
（ｉｉ）この生物学的サンプルをアフィニティーマトリックスと接触させて、抗体−ポリペプチド複合体および結合していない生物学的サンプルを生じさせること；
（ｉｉｉ）結合していない生物学的サンプルを除くこと；および
（ｉｖ）アフィニティーマトリックスに結合した抗体からポリペプチドを放出させること
を含む。

さらに、さらなる態様によって、本発明は、本発明の抗体によって認識されるエピトープを有する抗原を発現する細胞を伴う疾患、障害または病理学的状態を有する可能性が高い被検査個体を同定するための方法を提供する。この場合、この方法は、
（ｉ）生物学的サンプルをこの被検査個体から得ること；
（ｉｉ）生物学的サンプルを、検出可能な抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件のもとでこの抗体と接触させること；および
（ｉｉｉ）この抗体−抗原複合体を検出すること
を含み、この抗体−抗原複合体の存在により、被検査個体がこの疾患または障害を有する可能性が高いことが示される。

本発明による代わりの同定方法において、検出工程（ｉｉｉ）は、この抗体−抗原複合体を検出すること、および、この複合体のレベルを、健康な個体から得られたサンプルにおいて検出された抗体−抗原複合体のレベルと比較することを含み、このレベルのずれにより、被検査個体がこの疾患または障害を有する可能性が高いことが示される。

最後の態様において、本発明は、治療効果を個体において達成するための方法を提供する。この方法は、治療効果的な量の本発明の抗体をこの個体に投与すること、および、治療効果をこの個体において得ることを含み、この場合、治療効果は、この抗体によって認識されるエピトープを含む抗原の発現に関連する症状を防止または改善することである。

図面の簡単な記述
本発明を理解するために、また、本発明が実際にどのように行われ得るかを理解するために、いくつかの非限定的な実施例が次に、添付された図面を参照して記載される。
図１はＣＤ４４のゲノム構造（図１Ａ）、ＣＤ４４の定常コード領域を表すプライマーのアガロースゲル電気泳動（図１Ｂ）、そして、ＲＡ−ＣＤ４４およびＣＤ４４ｖ３−ｖ１０の部分核酸配列（エキソン４およびエキソン５）、ならびに対応するアミノ酸配列（配列番号：１５〜３０）（この場合、配列は最適にアラインメントされている）（図１Ｃ）を示す。
図２は抗汎ＣＤ４４または抗ＣＤ４４ｖ６とインキュベーションされた（示されるような）種々のＮａｍａｌｗａ細胞トランスフェクタントの蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析のヒストグラムを示す（図２Ａ）；４μｇ／ｍｌ（図２Ｂ）、２μｇ／ｍｌ（図２Ｃ）、０．４μｇ／ｍｌ（図２Ｄ）および０．２μｇ／ｍｌ（図２Ｅ）で種々のＮａｍａｌｗａトランスフェクタントに結合する、Ｆ８：３３によって産生されたｍＡｂの能力もまた評価された。この場合、フルオレセインにカップリングされた二次抗体（ＩＩＡｂ）の結合がコントロールとして使用された。図２Ａ〜図２Ｅは、ＣＤ４４ＦＩＴＣの平均蛍光強度に対する細胞カウント数を示す。
図３は可溶性のＣＤ４４ｖＲＡ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｓ（それぞれＣＤ４４ｖＲＡ−Ｆｃ（四角）、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ（菱形）、ＣＤ４４ｓ−Ｆｃ（三角））により被覆されたマイクロウエルに対する、Ｆ８：３３由来の抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂの結合のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）分析の結果を示す（図３Ａ〜図３Ｃ）。一方、ＢＳＡによるマイクロウエル（丸）がコントロールとして使用された（図３Ａ）。Ｆ８：３３由来の抗ＣＤ４４ｍＡｂの結合を抗汎ＣＤ４４ｍＡｂの結合と比較した（図３Ｂ）；図３Ｃは種々のＣＤ４４生成物のウエスタンブロット分析を示す（ＣＤ４４ｓ（レーンＩ）、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０（レーンＩＩ）およびＣＤ４４ｖＲＡ（レーンＩＩＩ）。
図４はＲＡ患者の関節から得られた滑膜細胞（図４Ａ）、ならびに、ドナーＭおよびドナーＬと呼ばれる２名の個体から提供された初代ヒト角化細胞（それぞれ、図４Ｂおよび図４Ｃ）に対する、市販の抗汎ＣＤ４４ｍＡｂおよび抗変異体ｍＡｂ（抗ＣＤ４４ｖ６ｍＡｂまたは抗ＣＤ４４ｖ９ｍＡｂ）の結合のＦＡＣＳ分析、ならびに、同じ２名の個体から得られた初代角化細胞、ならびに、滑膜細胞に対する、Ｆ８：３３由来の抗ＣＤ４４ｖＲＡの、２つの濃度（４μｇ／ｍｌ（図４Ｄ）および２μｇ／ｍｌ（図４Ｅ））における選択的結合のフローサイトメトリー分析を示す。図４Ａ〜図４Ｅは、ＣＤ４４ＦＩＴＣの平均蛍光強度に対する細胞カウント数を示す。
図５はＦ８：３３抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂの存在下もしくは非存在下（図５Ａ）、または、抗汎ＣＤ４４ｍＡｂの存在下もしくは非存在下で行われた細胞遊走アッセイのグラフを示し、それに従って、Ｎａｍａｌｗａトランスフェクタント（Ｎａｍａｌｗａ−ｐｃＤＮＡ３．１（菱形）、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｓ（四角）、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０（三角）およびＮａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡ（丸））が、トランスウエル遊走アッセイにおいてＨＡ被覆フィルターを横断するそれらの能力について、Ｆ８：３３抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂの存在下もしくは非存在下（図５Ａ）、または抗汎ＣＤ４４ｍＡｂの存在下もしくは非存在下（図５Ｂ）で分析され、細胞遊走百分率が、抗体の存在下でメンブランを横断した細胞数を、その非存在下でメンブランを横断した細胞数により除算し、１００を乗じることによって計算された。
図６はＲＡ患者の関節から得られた滑膜細胞（三角）、または初代角化細胞（四角）を使用して、Ｆ８：３３由来の抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂの存在下もしくは非存在下（図６Ａ）、または抗汎ＣＤ４４ｍＡｂの存在下もしくは非存在下（図６Ｂ）で行われ、トランスウエル遊走アッセイにおいてＨＡ被覆フィルターを横断するそれらの能力が評価される細胞遊走アッセイのグラフを示す。（細胞遊走百分率が図５Ｂにおけるように計算された）。
図７はＮａｍａｌｗａ−ｐｃＤＮＡ３．１細胞、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｓ細胞、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０細胞、またはＮａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡ細胞に対する、Ｆ８：３３−６−８−１０由来の抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂの結合のＦＡＣＳ分析を示す（ＣＤ４４ＦＩＴＣの平均蛍光強度に対する細胞カウント数）（図７Ａ〜図７Ｅ）。抗体は下記の濃度で存在した：１．２ｍｇ／ｍｌ（図７Ａ）、１２０μｇ／ｍｌ（図７Ｂ）、１２μｇ／ｍｌ（図７Ｃ）、１．２μｇ／ｍｌ（図７Ｄ）、および１２０ｎｇ／ｍｌ（図７Ｅ）。
図８はマウスにおけるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）に対するＦ８：３３（四角）の影響を示す。関節炎の発達を、足の腫脹を測定することによって１０日間モニターした。値は平均±ＳＥＭである。抗汎ｈＣＤ４４をコントロール（三角）として使用した。
図９はマウスにおけるＣＩＡに対するＫＭ８１（抗汎マウスＣＤ４４、四角）および４Ｄ２（イソタイプが一致するコントロール抗体、三角）の影響を示す。値は平均±ＳＥＭである。

本発明に従って、今回、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する２つのハイブリドーマ細胞株が単離されている。これらのｍＡｂは、関節リウマチ（ＲＡ）を有する個体の滑膜細胞に存在するが、非ＲＡ個体の滑膜細胞には存在しないＣＤ４４ｖＲＡ生成物（ＣＤ４４ｖＲＡ）に特異的に結合することが見出された。これらのｍＡｂは、ＣＤ４４の元の野生型タンパク質配列（ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０）または他のイソ型に優先してＣＤ４４ｖＲＡ生成物に対して特異的であるので、これらのモノクローナル抗体は、とりわけ、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物の同定、単離または標的化を必要とする様々な方法において有用である。

従って、本発明は、その態様の第１によれば、ハイブリドーマ、および、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物またはこのＣＤ４４ｖＲＡ生成物のフラグメント（ただし、フラグメントは、ＣＤ４４ｖＲＡコード配列のエキソンｖ４からエキソンｖ５にまでまたがる領域から翻訳されるアミノ酸配列、または、この領域の一部から翻訳されるアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＤ４４ｖＲＡおよびＣＤ４４ｖ３−ｖ１０が最適にアラインメントされているとき、野生型変異体ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０の対応するフラグメントに存在しないＡｌａ残基を少なくとも含む）に対する特異性を伴って反応する、このハイブリドーマによって発現されるモノクローナル抗体に関する。このＡｌａ残基は、配列番号２にその配列が示される変異体生成物ＣＤ４４ｖＲＡの３０３位におけるＡｌａ残基に対応する。

本発明はまた、寄託アクセション番号ＣＮＣＭ Ｉ−３０１５（ハイブリドーマＦ８：３３について）および同ＣＮＣＭ Ｉ−３０１６（ハイブリドーマＦ８：３３−６−８−１０について）を有するマウスハイブリドーマ細胞株（これらは本明細書中ではＦ８：３３ハイブリドーマ細胞株およびＦ８：３３−６−８−１０ハイブリドーマ細胞株と呼ばれる）（これらはＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ Ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）（パスツール研究所、パリ、フランス）に２００３年４月１６日に寄託された）、ならびに、この細胞株、クローンおよびサブクローンによって産生されるｍＡｂに関する。本発明のハイブリドーマは、この分野で知られている方法のいずれか［例えば、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．によって、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７（１９７５）に記載されるような方法］によって作製することができる。ハイブリドーマ細胞の上清が、典型的には、この分野で既知の方法のいずれか１つによって、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）などによって抗体結合活性についてスクリーニングされる。上清は、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物のいずれか（そのフラグメント、誘導体または相同体を含む）に結合することができるｍＡｂの産生について、または、この生成物を発現する細胞に結合することができるｍＡｂの産生についてスクリーニングすることができる。

モノクローナル抗体は、典型的には、モノクローナル抗体を産生させるために好適な条件のもとでハイブリドーマ細胞を培養し、広く知られている技術によってｍＡｂを細胞培養物から単離することによって製造される。そのような条件および技術はこの分野では広く知られており、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂｕｔｌｅｒ，Ｍ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）に記載される。本発明の抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体はまた、当業者に広く知られている組換え遺伝子方法によって、例えば、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（第３章）（Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、および、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ他［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６９（１９９２）］に記載されるような方法によって製造することができる。

本明細書中こので示されたように、組換え抗体分子には、例えば、キメラ抗体［Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１２０２（１９８５）によって記載されるようなキメラ抗体］、ヒト化抗体［例えば、Ｓｈｉｎ Ｓ．Ｕ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１７８：４５９〜４７６（１９８９）；Ｇｕｓｓｏｗ Ｄ．およびＳｅｅｍａｎｎ Ｇ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０３：９９〜１２１（１９９１）によって記載されるようなヒト化抗体］、二重特異性抗体［例えば、Ｗｅｉｎｅｒ Ｌ．Ｍ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２８７７〜２８８６（１９９３）；Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｄ．Ａ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ａｐｐｌ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．、１６：６４５〜６５１（１９８９）によって記載されるような二重特異性抗体］、単鎖抗体（ｓｃＦｖ、例えば、Ｇｒｉｔｚａｐｉｓ Ａ．Ｄ．他、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８８：１２９２〜１３００（２００３）によって記載されるような単鎖抗体）、完全な免疫グロブリンまたはフラグメント状の免疫グロブリン［例えば、Ｃｏｌｏｍａ Ｍ．Ｊ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５２：８９〜１０４（１９９２）；Ｎｅｓｂｉｔ Ｍ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５１：２０１〜２０８（１９９２）；Ｂａｒｂａｓ Ｃ．Ｆ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０１６４〜１０１６８（１９９２）によって記載されるような免疫グロブリン］、または、鎖シャッフリングによって作製される抗体［例えば、Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３〜４５５（１９９４）によって記載されるような抗体］が含まれる。ヒト化抗体を、例えば、ＣＤＲグラフト化（例えば、欧州特許出願公開第０２３９４００号に記載されるようなＣＤＲグラフト化）によって製造することができる。フレームワーク領域もまた、（例えば、欧州特許出願第０５１９５９６号に記載されるように）改変することができる。抗体をヒト化するために、ＰＣＲ（例えば、欧州特許出願第０３６８６８４号、同第０４３８３１０号、または国際特許出願公開ＷＯ９２／０７０７５に記載されるようなＰＣＲ）、またはコンピューターモデル化（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９２／２２６５３に記載されるようなコンピューターモデル化）などの方法を使用することができる。融合タンパク質、例えば、単鎖抗体／トキシンの融合タンパク質［例えば、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ Ｖ．Ｋ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：９４９１〜９４０４（１９９０）；Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｐ．Ｎ．他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５３：３３４〜３３９（１９９３）によって記載されるような融合タンパク質］もまた製造することができ、従って、これもまた本発明の一部を形成する。

本発明のハイブリドーマ細胞株は、モノクローナル抗体をコードする核酸を含み、従って、そのような核酸もまた本発明の範囲内である。抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体をコードする核酸を、この分野で広く知られている技術によってハイブリドーマ細胞株から単離することができ、そのような技術には、Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）に記載される様々な技術が含まれる。そのような核酸は、抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体を発現するさらなる細胞株または遺伝子組換え動物を調製するために有用であり、あるいは、組換え抗体分子の調製において使用することができる。

本発明の抗ＣＤ４４ｖＲＡ Ａｂには、それらがどのように産生されるとしても、本発明のハイブリドーマ細胞株によって発現されるモノクローナル抗体が含まれる：それらはハイブリドーマ細胞において実際に産生されるか、または、この分野では広く知られているような他の技術によって産生され、例えば、ハイブリドーマ細胞からの適切な遺伝物質の移入によって他の細胞タイプにおいて産生される（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｚｏｌａ，Ｈ．編、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、第４章〜第９章を参照のこと）。従って、上記で定義されるようなモノクローナル抗体、すなわち、Ｆ８：３３またはＦ８：３３−６−８−１０に由来するｍＡｂと同様に、ＣＤ４４ｖＲＡまたはこのＣＤ４４ｖＲＡのフラグメント（ただし、ＣＤ４４ｖＲＡフラグメントは、ＣＤ４４ｖＲＡコード配列のエキソンｖ４〜エキソンｖ５に接する領域から翻訳されるアミノ酸配列、または、この領域の一部から翻訳されるアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＤ４４ｖＲＡおよびＣＤ４４ｖ３−ｖ１０が最適にアラインメントされているとき、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０の対応するフラグメントには存在しないＡｌａ残基（これは配列番号２における３０３位でのＡｌａ残基に対応する）を含む）に対する特異性を伴って反応するモノクローナル抗体もまた提供される。

ＣＤ４４ｖＲＡのｍＲＮＡ転写物は、［Ｓｃｒｅａｔｏｎ他（１９９２）（同上）によって記載されるように］、定常エキソン１〜５、定常エキソン１５〜１７および定常エキソン１９と、変異体エキソン７〜１４（ｖ３〜ｖ１０）、そしてまた、配列番号１の９０８位〜９１０位における３つのさらなるヌクレオチド（これらは配列番号２の３０３位における新しいＡｌａ残基の挿入をもたらしている）を含有する。さらなるＣＡＧがＲＡ患者の滑膜細胞のＣＤ４４転写物において生じていることが図１Ｃに示される。ＣＡＧがＣＤ４４のｍＲＮＡに含まれることは、翻訳された細胞表面ＣＤ４４糖タンパク質へのＡｌａ残基の挿入を可能にする。この変化は、ＲＡ患者の滑膜細胞表面に発現するＣＤ４４ｖＲＡを認識するＦ８：３３ｍＡｂまたはＦ８：３３−６−８−１０ｍＡｂの産生を可能にするために十分である。

ＣＤ４４ｖＲＡの、イントロンＣＡＧに隣接するエキソンｖ５の非正統的な転写は、おそらくは、この分子におけるスプライシング装置の誤調節の結果である。未知の遺伝的因子または環境的要因または両者の組合せにより、相対的な存在量、組織分布、または、セリン−アルギニン（ＳＲ）の活性、もしくは、示差的なスプライシングを拮抗的に制御するヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）スプライシング因子の活性が変化し得る［Ｃａｃｅｒｅｓ，Ｊ．Ｒ．およびＫｏｒｎｂｌｉｈｔ，Ａ．Ｒ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１８：１８６〜１９３（２００２）］。ＣＡＧ含有スプライス接合部はそのような変化を特に受けやすく、これにより、ＲＡ患者のＣＤ４４のｍＲＮＡ配列におけるＣＡＧ含有が生じることがある。類似する機構により、ＣＤ４４スプライシング装置が他の自己免疫疾患において影響を受けることがある。これに関連して、非コード領域に存在する変異（例えば、５’スプライス部位および３’スプライス部位、分岐部位またはポリアデニル化シグナルに影響を及ぼす変異など）は高頻度（約１５％）で遺伝的疾患の原因であることを述べておかなければならない［Ｋｒａｗｃｚａｋ，Ｍ．、Ｒｅｉｓｓ，Ｊ．およびＣｏｏｐｅｒ，Ｄ．Ｎ．、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、９０：４１〜５４（１９９２）］。

ＣＤ４４ｖＲＡ生成物が、健康な個体に由来する滑膜細胞から得られたＣＤ４４には現れない特有のさらなる領域を含有するという事実を考慮して、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物に対して特異的に向けられた抗体は、従って、ＣＤ４４分子を発現する細胞が関与する様々な疾患の診断、予後、防止および治療のために使用することができる。

ＣＤ４４ｖＲＡ生成物「に対して特異的に向けられた」、または、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物に「特異的に結合する」によって、抗体が、他の既知のＣＤ４４タンパク質よりも優先的にＣＤ４４ｖＲＡ生成物を認識し、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物に結合することが意味される。特に、抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体は、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０と呼ばれる元の野生型タンパク質配列よりも優先的にＣＤ４４ｖＲＡ生成物を認識し、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物に結合する。一般に、抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体の親和性は、ＣＤ４４ｖＲＡに対する結合について、元の野生型タンパク質配列または他のＣＤ４４イソ型に対する結合の場合よりも少なくとも２倍大きい。好ましい実施形態において、抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体の結合親和性は、ＣＤ４４ｖＲＡに対する結合について、元の野生型ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０タンパク質配列または他のＣＤ４４イソ型に対する結合の場合よりも少なくとも１０倍大きい。結合親和性は、細胞表面に存在する抗原に対するスキャッチャード分析（これは、この分野で広く知られている方法である）（例えば、Ｈｕｌｍｅｓ，Ｅ．Ｃ．、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ［第４章、ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ］を参照のこと）によって決定することができる。

特異的な結合はまた、細胞遊走に対する抗体の影響、治療効果、細胞凝集を誘導する能力、免疫蛍光研究および結合競合アッセイなどの生物学的アッセイから推測することができる。そのようなアッセイにおいて、抗体は、この抗体を実験設定において使用する結果がコントロール設定の結果と統計学的に有意な様式で異なるならば、ＣＤ４４ｖＲＡ特異的であるとして定義される。

ＣＤ４４ｖＲＡ生成物における３０３位での１つだけのＡｌａアミノ酸の付加は、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物における抗原的に異なるエピトープの形成をもたらしていた。従って、本発明はまた、定義されたような抗体の相同体、フラグメントおよび誘導体（例えば、化学修飾された誘導体、放射能標識された誘導体、トキシンまたは抗生物質分子にカップリングされた誘導体など）にも関する（ただし、これらはすべて、（そのようなさらなるＡｌａを含む）抗原的に異なるエピトープを認識し、従って、モノクローナル抗体の抗原結合特異性を実質的に保持する）。

また、Ｆ８：３３およびＦ８：３３−６−８−１０のハイブリドーマ細胞株、同様に、抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂを産生するさらなるハイブリドーマ、ならびに、それらのクローンおよびサブクローンによって産生されるモノクローナル抗体に由来し、かつ、モノクローナル抗体の抗原結合特性を実質的に保持する組換え抗体分子は明らかに本発明に含まれる。本発明の抗体の相同体、フラグメントおよび誘導体を調製すること、あるいは、抗体の配列分析から出発して、かつ／または、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の使用によって、同じイディオタイプを有する組換え抗体分子（すなわち、Ｆ８：３３およびＦ８：３３−６−８−１０のハイブリドーマ細胞株、または、ＣＤ４４ｖＲＡを認識するｍＡｂを産生する他のハイブリドーマ、ならびにそれらのクローンおよびサブクローンから得られる抗体と同じアミノ酸配列を抗原結合部位の領域（相補性決定領域、ＣＤＲ）において有する抗体分子）を調製することは当業者の技術の範囲内である。

本発明の範囲に含まれる抗体のフラグメントは、例えば、完全な抗体の抗原結合特性を実質的に保持する、モノクローナル抗体分子のＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ＦｖフラグメントもしくはｓｃＦｖフラグメント、または任意の他のフラグメントであり得る。フラグメントは、完全な抗体の化学的切断または酵素切断によって、あるいは、この分野で広く知られている方法のいずれかによって製造することができる。フラグメントはまた、この分野で広く知られている組換え法によって、例えば、抗体遺伝子の一部（重鎖または軽鎖または両方）を異種の宿主において発現させることによって製造することができる。

上記で示されたように、本発明の抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体は、元の野生型タンパク質配列（ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０）には存在しない、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物のエピトープを認識する。本発明の抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体は好ましくは、配列番号２の３０３位にＡｌａを含むエピトープを認識する。あるいは、または加えて、本発明の抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体は、３０３位におけるＡｌａ残基の挿入の結果としてのＣＤ４４タンパク質の全体的な三次構造における変化によって生じるネオエピトープを認識する。そのようなネオエピトープは、立体配座的エピトープ、非線状エピトープ、炭水化物エピトープ、または、示差的なグリコシル化によって露出するエピトープであり得る。エピトープは、ｖ５エキソンの開始部にペプチド配列の変異体領域を含むことができ、または、エピトープは、変異体ポリペプチドのＡｌａ残基の挿入によってその三次構造が変化している分子の異なる部分に存在し得る。

様々な宿主を、ハイブリドーマ技術によって抗体を産生させるために使用することができ、これらには、ラット、マウスなどが含まれる。動物は、宿主にＣＤ４４ｖＲＡ生成物（このフラグメント、誘導体または相同体を含む）を注射することによって免疫化することができる。様々なアジュバントを、抗体に対する免疫学的応答を増大させるために使用することができる（例えば、フロイントのアジュバント、鉱物ゲル、水酸化アルミウムなど）。動物宿主はまた、本明細書中に記載されるように、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物（そのフラグメント、誘導体または相同体を含む）をコードする遺伝物質を運ぶベクターによりトランスフェクションされている細胞（例えば、ヒトＮａｍａｌｗａ細胞）を用いて免疫化することができる。

上記のハイブリドーマ技術に加えて、このようなハイブリドーマのクローンおよびサブクローン、ならびに、さらなる技術によって得られる、抗体を産生する連続した細胞株もまた使用することができる：例えば、ＥＢＶハイブリドーマ技術［Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、６２：１０９（１９８４）］など。

治療的態様によれば、本発明は、医薬的に許容され得るキャリアと、有効成分として、所定量の本発明のモノクローナル抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体（その相同体、フラグメントまたは誘導体、および、本発明のモノクローナル抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体に由来する組換え抗体分子を含む；これらはすべて、元のモノクローナル抗体の抗原結合特異性を実質的に保持する）とを含む医薬組成物を提供する。この場合、この量は、下記においてさらに議論されるように、治療効果（例えば、そのような処置を必要としている対象の免疫系に対する治療効果）を達成するために効果的なものである。

本発明のｍＡｂは、患者個々の臨床的状態、投与部位および投与方法、投与スケジュール、患者の年齢、性別、体重、および、医師に既知の他の要因を考慮に入れて、適正な医療行為に従って投与および投薬される。

本発明における様々な目的のための「量」は、この分野で既知のような検討事項によって決定される。そのような量は、上記で記載されたような所望する治療効果（例えば、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物の中和、または、例えば、抗体の中和作用によって、その標的へのその結合を阻止することなど）を達成するために効果的でなければならない。そのような量は、とりわけ、処置される疾患のタイプおよび重篤度、ならびに処置療法に依存する。そのような量は典型的には、適切に設計された臨床試験（用量範囲研究）において決定され、当業者は、効果的な量を決定するためにそのような試験を適性に行う方法を理解している。一般に知られているように、効果的な量は、細胞表面のＣＤ４４ｖＲＡ糖タンパク質に対する抗体の親和性、その体内分布プロフィル、様々な薬理学的パラメーター（例えば、体内半減期など）、存在する場合には望ましくない副作用、処置されている個体の年齢および性別などの要因などを含む様々な要因に依存する。

用語「医薬的に許容され得るキャリア」によって、本発明のｍＡｂと反応しない任意の不活性な非毒性物質が意味される。従って、キャリアは、従来的に使用されているキャリアのいずれもが可能であり、化学物理的な検討事項（例えば、溶解性、および、化合物との反応性がないことなど）によって、また、投与経路によって制限されるだけである。
キャリアはまた、特定の形態で与えられるときに、例えば、注射に好適な形態で、ピル形態で、単純なシロップとして、芳香性粉末などとして与えられるときに一定の形態または粘稠度を医薬組成物に与えるために医薬組成物に添加される物質を示すことがある。キャリアはまた、組成物に安定性を提供するための物質（例えば、保存剤）、または、配合物に食用風味を提供するための物質であり得る。

キャリアの選択は、部分的には、特定のｍＡｂによって、ならびに、組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。従って、本発明の医薬組成物の広範囲の様々な好適な配合物が存在する。好ましい配合物は、非経口投与（例えば、全身的または局所的のいずれかであっても、皮下投与、静脈内投与、腹腔内投与または筋肉内投与）のために好適な配合物である。注射用組成物のための効果的な医薬用キャリアのための要件は当業者には十分に知られている。例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ、ＢａｎｋｅｒおよびＣｈａｌｍｅｒｓ編、２３８頁〜２５０頁（１９８２））、および、ＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ（Ｔｏｉｓｓｅｌ、第４版、６６２頁〜６３０頁（１９８６））を参照のこと。本発明の医薬組成物はまた静脈内注入によって投与することができる。

一例として、非経口投与（例えば、点滴静注または静脈内注入による静脈内投与）のために好適な医薬組成物の調製物について、投薬量は体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲にある（低濃度ほど好ましい）。しかしながら、本発明の方法における処置のための医薬組成物はこれらの投薬量に限定されず、他の適切な投薬量も十分に、選択する当業者の能力の範囲内である。

本発明の組成物の注射可能な配合物のために好適なキャリアには、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）が含まれ得るが、これらに限定されない。静脈内注射の場合、治療薬剤の水溶性形態を点滴法によって投与することができ、それによって、抗体および医薬的に許容され得るキャリアを含有する医薬配合物が注入される。具体的な医薬的に許容され得るキャリアには、例えば、５％デキストロース、０．９％生理的食塩水、リンゲル溶液または他の好適な賦形剤が含まれ得る。筋肉内投与用調製物（例えば、抗体の好適な可溶性塩形態の無菌配合物）を、注射用水、０．９％生理的食塩水または５％グルコース溶液などの医薬用賦形剤に溶解し、投与することができる。抗体の好適な不溶性形態を、水性基剤または医薬的に許容され得るオイル基剤（例えば、長鎖脂肪酸のエステル（例えば、オレイン酸エチル）など）における懸濁物として調製し、投与することができる。理解しなければならないように、医薬組成物は、少なくとも１つのタイプの医療用のキャリアまたは希釈剤と一緒になった医療用の配合物キットの形態にすることができる。抗体は、放射性薬剤、酵素薬剤、抗生物性薬剤またはトキシン薬剤にコンジュゲート化することができる。

本発明の医薬組成物は、治療的に有益な効果が、ＣＤ４４ｖＲＡタンパク質を中和することによって、または、その標的に対するその結合を、例えば、抗体の作用を中和することにより阻止することによって達成され得る疾患、障害または病理学的状態の防止または処置のために好適である。そのような疾患、障害または病理学的状態は、例えば、ＣＤ４４ｖＲＡを含む細胞、またはＣＤ４４ｖＲＡタンパク質を発現する細胞が関与する炎症性疾患、または感染性疾患の炎症性合併症、自己免疫疾患、悪性疾患、または任意の他の疾患もしくは障害であり得る。自己免疫疾患には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症および炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）が含まれる。加えて、そのような医薬組成物は、特有のＡｌａ含有エピトープを含むＣＤ４４タンパク質の他の形態を発現する細胞を伴う疾患の処置のために使用することができる。

好ましい実施形態によれば、この抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体を含む医薬組成物は、自己免疫疾患を処置するために使用される。

本発明の予備的態様によれば、上記で定義されるような抗体を作製する方法が提供される。この場合、この方法は、
（ｉ）Ｆ８：３３ハイブリドーマもしくはＦ８：３３−６−８−１０ハイブリドーマの細胞、または、抗Ｃｄ４４ｖＲＡｍＡｂを産生する他のハイブリドーマの細胞、または、それらのクローンもしくはサブクローンの細胞を提供すること；
（ｉｉ）この細胞を、抗体の産生を可能にする条件のもとで培養すること
を含む。

本発明の具体的な実施形態では、ハイブリドーマ細胞を、１０％のウシ胎児血清（カタログ番号ＣＨ３０１６０．０３、Ｐｅｒｂｉｏ、ベルギー）および１％のｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ抗生物質（カタログ番号０３−０３１−１Ｂ、Ｂｅｔ−Ｈａｅｍｅｋ ｌｔｄ．、イスラエル）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（カタログ番号Ｒ−８７５８、Ｓｉｇｍａ ｌｔｄ．、イスラエル）において成長させた。７０％〜８０％の培養コンフルエンスの成長の後、細胞を、１週間、低タンパク質培地（ＬＰＭ、カタログ番号０５−０４０−１Ａ、Ｂｅｔ−Ｈａｅｍｅｋ ｌｔｄ．、イスラエル）に移した。

本発明の予備的方法はまた、それによって産生された抗体を単離する工程を含むことができる。本発明の具体的な実施形態によれば、抗体の調製が、ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム（カタログ番号１７−０４０５−０１、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン）を製造説明書に従って使用して行われた。

さらに、この態様では、本発明の抗体によって認識されるエピトープを含有するポリペプチドまたはタンパク質を生物学的サンプルから精製する方法が提供される。この場合、この方法は、
（ｉ）固体担体に結合したこの抗体を含むアフィニティーマトリックスを提供すること；
（ｉｉ）この生物学的サンプルをアフィニティーマトリックスと接触させて、抗体−ポリペプチド複合体および結合していない生物学的サンプルを生じさせること；
（ｉｉｉ）結合していない生物学的サンプルを除くこと；および
（ｉｖ）アフィニティーマトリックスに結合した抗体からポリペプチドを放出させること
を含む。

ポリペプチドは好ましくはＣＤ４４ｖＲＡ生成物である。

複合体は、非常に多数の標準的な技術によって、例えば、複合体をサンプルから物理的に除くことによって、または、複合体を洗浄することによって、サンプルの残り部分から分離することができる。結合したＣＤ４４ｖＲＡ生成物を、その後、複合体から放出させて、実質的に精製されているＣＤ４４ｖＲＡ生成物を得ることができる。この方法のために好適な固体担体がこの分野では広く知られている（例えば、アガロース、ポリアクリルアミドまたはポリアクリル酸のビーズ（磁性ビーズおよびプロテインＡ結合ビーズを含む））。

本発明の診断態様によれば、ＲＡ−ＣＤ４４変異体タンパク質を発現する細胞を伴う疾患、障害または病理学的状態を有する可能性が高い個体を同定するための方法もまた考えられる。

ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物をアッセイするために有用な様々なプロトコルがこの分野では既知である。例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）が含まれる。直接的または競合的な結合アッセイもまた使用することができる。これらの診断アッセイでは、抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体および標識が、ヒト体液中のＣＤ４４ｖＲＡ生成物、あるいは細胞または組織の抽出物におけるＣＤ４４ｖＲＡ生成物を検出するために利用される。本発明の抗体は、修飾を伴って、または修飾されることなく使用することができる。多くの場合、抗体は、抗体を共有結合または非共有結合のいずれかによってレポーター分子と連結することによって標識される。そのようなレポーター分子は、例えば、放射性薬剤、蛍光性薬剤（例えば、ＦＩＴＣ）、酵素などであり得る。

本発明による診断方法は、
（ｉ）生物学的サンプルを被検査個体から得ること；
（ｉｉ）この生物学的サンプルを、検出可能な抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件のもとで、本明細書中で定義されるような抗体と接触させること；および
（ｉｉｉ）この抗体−抗原複合体を検出すること
を含み、この抗体−抗原複合体の存在により、ＣＤ４４ｖＲＡタンパク質を発現する細胞を伴う疾患または障害を被検査個体が有する可能性が高いことが示される。

あるいは、本発明による診断方法は、
（ｉ）生物学的サンプルを被検査個体から得ること；
（ｉｉ）この生物学的サンプルを、検出可能な抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件のもとで、本明細書中で定義されるような抗体と接触させること；および
（ｉｉｉ）この抗体−抗原複合体を検出し、この複合体のレベルを、健康な個体から得られたサンプルにおいて検出される抗体−抗原複合体のレベルと比較すること
を含むことができ、この場合、このレベルからのずれにより、被検査個体がこの疾患または障害を有する可能性が高いことが示される。

１つの特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体、そのフラグメントおよび誘導体は、関節リウマチ（ＲＡ）を有する可能性が高い個体を同定するための方法において有用である。

上記診断方法では、個体が有する疾患の種類または程度を示し得るサンプル中のタンパク質のレベルまたは量（この特定の場合には、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物のレベル）を決定するためにこの分野で既知の方法で定量化することができる。上記方法は、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物が、健康な個体におけるその発現と比較して異常なレベルで発現される障害、疾患または病理学的状態を診断するために使用することができる。ＣＤ４４ｖＲＡ生成物が異常な状態でのみ発現され、正常な状態では発現されない場合、その存在の検出は、その異常な状態を診断するために十分である。変異体生成物が、健康な個体でもまた、ある程度に発現される場合、その変異体タンパク質に対する正常な標準的発現値を、体液サンプルを多数の健康な個体から得て、これらのサンプルのプールにおける変異体生成物の発現レベルを明らかにすることによって決定することができる。被検査個体における変異体生成物の測定された変動する発現を、その後、以前に決定された標準的レベルに対して比較することができる。

本発明の抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体はまた、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物の発現を伴う障害、疾患または病理学的状態を処置するための治療剤として使用することができる。本発明の抗体の個体への投与は、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物の活性の阻止または低下、および、有益な効果がそのような低下によって達成され得るそのような障害および疾患の処置をもたらす。

本発明の抗体は典型的には、有効成分として、１つまたは複数の本発明の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を、医薬的に許容され得るキャリアと一緒に含む医薬組成物で投与される。抗体は、様々な活性な薬剤（例えば、放射性分子、酵素、抗生物質またはトキシン薬剤など）にコンジュゲート化することができ、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物を含んでそのような薬剤を標的細胞内に持ち込むためのキャリアとして使用することができる。

本発明の上記実施形態は、好ましくは、関節リウマチ（ＲＡ）の同定、診断および処置のために使用される。

材料および方法
ヒトＣＤ４４ｖＲＡ、ＣＤ４４ｖ３−１０およびＣＤ４４ｓのクローニングおよびトランスフェクション
ヒトＣＤ４４ｖＲＡのｃＤＮＡをクローン化するために、関節吸引を受けているＲＡ患者の総滑膜細胞集団を単離した。ＲＮＡを、市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて分離し、ＣＤ４４ｖＲＡのｃＤＮＡを、ＣＤ４４の定常コード領域（図１Ａ）を表す下記のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲ（ＰＴＣ−１００（商標）プログラム可能なサーマルコントローラー、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）によって調製した：

ＰＣＲ生成物のサイズをアガロースゲル電気泳動および配列決定（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）およびＰｓｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）消化（ＣＤ４４ｖＲＡにおけるヌクレオチド挿入により、ＰｓｔＩ消化部位が導入される）によって確認した。

ＰＣＲ生成物をゲルから切り出し、精製し、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローン化した。陽性クローンを白／青スクリーニングによって選択した。プラスミドを、市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩの二重消化に供し、遺伝子産物が発現されるｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）にクローン化した。プラスミドを、記載のように［Ｚｈａｎｇ Ｚ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：４１９２１〜４２９２９（２００１）］、ＣＤ４４陰性のＮａｍａｌｗａバーキットリンパ腫細胞株（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１４３２）にトランスフェクションした。ヒトＣＤ４４ｖ３−１０のクローンニングについては、上記プロトコルを使用して、ＲＮＡをヒト角化細胞から単離し（Ｈａｄａｓｓａｈ大学病院、エルサレム）、ヒトＣＤ４４ｓのクローンニングについては、上記プロトコルを使用して、ＲＮＡをＨｅＬａ子宮頸ガン細胞株（ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＣＬ−２）から得られる）から単離した。

ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０のｃＤＮＡおよびＣＤ４４ｓのｃＤＮＡならびにｐｃＤＮＡ３．１ベクター（「空ベクター」）のトランスフェクションを上記のように行った。それにより、トランスフェクションされたＮａｍａｌｗａ細胞は、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡ、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｓ、およびＮａｍａｌｗａ−Ｎｅｏ（空）とそれぞれ称された。

可溶性のｈＣＤ４４ｖ３−１０、ｈＣＤ４４ｖＲＡおよびｈＣＤ４４ｓのプラスミドの調製
可溶性ＣＤ４４ｖ３−１０のｃＤＮＡを、発表されているＣＤ４４配列から特定される２つのプライマーを使用して、初代ヒト角化細胞の総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ増幅によってクローン化した：

両プライマーには、ＸｂａＩの認識部位が含まれた。ＰＣＲ生成物をＸｂａＩ酵素で消化し、ｐＣＸＦｃゼオベクター（ｚｅｏｖｅｃｔｏｒ）をＮｈｅＩで消化した。消化後、ＰＣＲ生成物をｐＣＸＦｃゼオベクターに連結して、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−免疫グロブリン（Ｉｇ）−Ｆｃ組換え体を作製した。同じプロトコルを使用して、可溶性ＣＤ４４ｖＲＡのｃＤＮＡおよび可溶性ＣＤ４４ｓのｃＤＮＡを関節リウマチ患者の滑膜細胞からクローン化した。可溶性ＣＤ４４フラグメントを、ＣＤ４４の発表されている配列（１〜１８２４塩基）［Ｓｃｒｅａｔｏｎ，Ｇ．Ｒ．他（１９９２）、同上］から特定した。

２９３Ｔ細胞への可溶性ＣＤ４４プラスミドの一過性トランスフェクション
上記で示されたＦｃ含有プラスミドのそれぞれ１つの３μｇ量を１２μｌのＦｕＧｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）と２０分間インキュベーションした。混合物を、７０％コンフルエンシーの２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を含有する１５ｃｍの細胞プレートに加えた。上清を４８時間後および７２時間後に集めた。ＣＤ４４−Ｉｇ Ｆｃのフラグメント化されたプロテオグリカンをプロテインＧカラムで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および、抗汎ＣＤ４４ｍＡｂ（Ｈｅｒｍｅｓ−３、ＡＴＣＣ Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＢ−９４８０）を用いた免疫ブロティングによって正しさについて分析した。

逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＮＡを、ＲＮＡ−ＢＥＥ試薬（ＲＮＡ単離溶媒、Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ Ｉｎｃ．、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸ）を製造者の説明書に従って使用して、ＲＡ患者の滑膜細胞、初代ヒト角化細胞またはＮａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡ細胞から抽出した。逆転写を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣＬ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）および２０ユニットのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍｅｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含有する２０μｌの反応体積において５ユニットのＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍｅｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、５００ｎｇのＲＮＡおよび１００ｎｇのオリゴｄ（Ｔ）１８プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍｅｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して行った。反応液サンプルを４１℃で１時間インキュベーションし、その後、逆転写酵素を、混合物を６５℃で１０分間加熱することによって不活性化した。増幅を、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、２５０μＭの各ｄＮＴＰおよび２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍｅｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含有する５０μｌの最終体積において０．５μｌの逆転写酵素反応生成物（ｃＤＮＡ）を使用して、マイクロプロセッサー制御インキュベーター（ＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒ（商標）、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）において行った。下記のプライマー（図１Ａ）を反応混合物に加えた（これらはまた、図１Ａにも示される）：

ＣＤ４４の増幅を、９４℃で１分間の変性、５０℃で１分間のアニーリング、および７２℃で２分間の伸長を有する３０サイクルについて行い、その後、７２℃で１０分間の最後の伸長を行った。増幅生成物を１．５％アガロースゲルで分離した。細胞のＣＤ４４イソ型転写物の決定は、マーカーラダーに対するバンドの位置、および、異なるＣＤ４４変異体の予想されるｂｐサイズに基づいた。

モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの作製
Ｃｏｒｉｘａ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から得られた３０量体ＣＤ４４ｖＲＡペプチド：ＳＮＰＥＶＬＬＱＴＴ ＴＲＭＴＡＤＶＤＲＮＧＴＴＡＹＥＧＮＷＮ（配列番号１４）、および／または、上記のように製造された１００μｇ／ｍｌの可溶性ＣＤ４４ｖＲＡ（ともに完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）に乳化して）を使用して、８週齢のメスＣ７５ＢＬ／６マウスを皮下または筋肉内に免疫化した。免疫化を１４日目および２８日目に繰り返し、２週間後にマウスから採血して、その血清を、ＣＤ４４を発現するＮａｍａｌｗａ細胞に結合するその能力についてフローサイトメトリーによって調べた。最大のポリクローナル抗ＣＤ４４抗体力価を有する動物を選択し、１０^８個のＮａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡ細胞により腹腔内（ｉ．ｐ．）に追加免疫した。７２時間後、マウスからの脾臓細胞を集め、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ［Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７（１９７５）］に従って骨髄腫細胞株のＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合した。

Ｌ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、ピルビン酸ナトリウムおよびＭＥＭイーグル非必須アミノ酸（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、イスラエル）および２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）を含有する富化ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）において１日間インキュベーションした後、ハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）−ＨＹハイブリドーマ選択培地（培地Ｄ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）において成長させた。１０日目〜１４日目の間で、単離されたハイブリドーマコロニーを半固体寒天から集め、ＨＡＴ培地補充物（Ｓｉｇｍａ）および２０％のＦＢＳを含有する富化ＲＰＭＩ１６４０培地において９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）で成長させた。置床後７日目に、単離されたハイブリドーマクローンからの上清を、Ｎａｍａｌｗａ−Ｎｅｏ細胞、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖ３−１０細胞またはＮａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡ細胞に結合するその能力についてフローサイトメトリーによってスクリーニングした。上清がＮａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡに対して選択的または優先的に結合したハイブリドーマを限界希釈によってクローン化し、その後、さらに３サイクルにわたって再クローン化した。単離されたハイブリドーマは、ＨＡＴ培地補充物および２０％のＦＢＳを含有する富化ＲＰＭＩ１６４０において維持された。ＣＤ４４ｖＲＡ陽性ハイブリドーマの上清のイソタイプを、Ｃｌｏｎｏｔｙｐｅ Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用するＥＬＩＳＡによって決定した。

蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析
１０^６個の量の細胞を、３Ｇ５抗汎ＣＤ４４ｓ（Ｈｅｒｍｅｓ３、ＩｇＧ）、Ｆ−１０−４４−２抗汎ＣＤ４４ｍＡｂ（ＩｇＧ２ｂ、Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、これはまた抗ＣＤ４４ｓ ｍＡｂとして知られている）またはＶＦＦ７抗ＣＤ４４ｖ６ ｍＡｂ（ＩｇＧ１、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍ、Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア）と氷上で４５分間インキュベーションした。徹底的な洗浄の後、細胞をフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化二次抗Ｉｇ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と氷上で３０分間インキュベーションした。その後、細胞を洗浄し、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて分析した。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
９６ウエルのポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ）を、精製されたＣＤ４４ｖＲＡ−ＩｇＦｃ可溶性タンパク質、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−ＩｇＦｃ可溶性タンパク質、ＣＤ４４ｓ−ＩｇＦｃ可溶性タンパク質、またはＢＳＡにより被覆した（１００μｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に希釈されて、ウエルあたり１００μｇ／ｍｌ）。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ／Ｔ）により３回洗浄した。ＰＢＳにおける１０％ミルクによる３７℃で２時間のブロッキングの後、異なる濃度のＦ８：３３抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂまたは抗汎ＣＤ４４（Ｈｅｒｍｅｓ３）ｍＡｂをウエルに加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベーションし、洗浄し、二次のヤギ抗マウス多価ペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をさらに１時間加えた。酵素反応を、リン酸塩−クエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）における０．０４％のＨ_２Ｏ_２および０．０４％のＯ−フェニレンジアミンを用いて発色させた。光学濃度をマイクロプレートリーダーＭＲＸ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で４０５ｎｍにおいて測定し、０．１００を超える値を陽性と見なした。

ウエスタンブロット分析
細胞をＮＰ−４０緩衝液において溶解し、１００μｇのタンパク質を変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ＰＶＤＦメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移した。ブロットを、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）における１％のＢＳＡによりブロッキング処理し、１μｇ／ｍｌのＨｅｒｍｅｓ−３抗汎ＣＤ４４ｍＡｂ（これはＡＴＣＣハイブリドーマ（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＢ−９４８０）の上清から得られ、プロテインＧカラムで精製された）と１時間インキュベーションした。ブロットをＰＢＳ−Ｔで再び洗浄し、適切なＨＲＰコンジュゲート化抗Ｉｇ二次抗体（１：１００００希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と４５分間インキュベーションし、ＰＢＳ−Ｔで再び洗浄して、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）を用いて発色させた。

トランスウエル遊走アッセイ
遊走アッセイを、直径が６．５ｍｍのトランスウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）において行った。トランスウエルの上部区画および下部区画を、ＰＢＳにおける０．５ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸（ＨＡ；Ｈ１８７６、Ｓｉｇｍａ）により４℃で一晩被覆され、次いでＲＰＭＩ１６４０により３回洗浄された５μＭ細孔のポリカーボネートフィルターによって分離した。ＲＰＭＩ１６４０に懸濁された５ｘ１０^５個の量のトランスフェクションされたＮａｍａｌｗａ細胞またはヒト初代角化細胞を上部区画に加え、ＲＰＭＩに希釈された２９３Ｔ細胞上清、または間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）（ＲＰＭＩに希釈された４００ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を下部区画に加えた。抗体の遊走防止能を評価するために、Ｆ８：３３抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂまたは抗汎ＣＤ４４（Ｆ１０−４４−２）ｍＡｂをトランスウエルプレートに種々の濃度で加え、その後、プレートを５％ＣＯ_２とともに３７℃で４時間インキュベーションした。下部区画に遊走した細胞を、インキュベーション期間が終了したとき蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって１分間の高速度で計数し、細胞数／分の値を記録した。

マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎の阻害
下記のｍＡｂを使用した：ハイブリドーマＫＭ８１（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−２４１；２２から得られるラット抗マウスＣＤ４４定常領域（ラット、ＩｇＧ２）；ハイブリドーマ４Ｄ２（Ｊ．Ｈａｉｍｏｖｉｃｈ（Ｔｅｌ−Ａｖｉｖ大学）によって提供された；Ｍａｌｏｎｅｙ他、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、４：１９１〜２０９、１９８５）から得られたラット抗マウス細胞表面免疫グロブリンイディオタイプ（ラット、ＩｇＧ２ｂ）（これは、ＫＭ８１ｍＡｂに対する関連性のないイソタイプコントロールとして使用された）；ハイブリドーマＦ８：３３（本発明者らが開発したハイブリドーマ）から得られたマウス抗ヒトＣＤ４４ｖＲＡ（マウス、ＩｇＧ２ａ）；ハイブリドーマＦ１０−４４−２から得られたマウス抗ヒトＣＤ４４定常領域（マウス、ＩｇＧ２ａ）（Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｃｏｍｐａｎｙから購入）（これは、Ｆ８：３３ｍＡｂに対する非生物機能性イソタイプコントロールとして使用された）。

関節炎をマウスにおいて誘導するために、オスのＤＢＡ／１マウス（８週齢〜１２週齢）に、Ｗｉｌｌｉａｍｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９７８４〜９７８８、１９９２に記載されるように、ウシの関節軟骨から精製され、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、米国）に乳化された２００μｇのＩＩ型コラーゲンを尾の基部に皮内注射した。マウスは、最初の投薬の後３週間目に、ＣＦＡに乳化された２００μｇのＩＩ型コラーゲンの追加免疫注射を受けた。マウスを毎日調べ、１つ以上の足に紅斑および／または腫脹を有する各動物を、ＫＭ８１抗マウスＣＤ４４ｍＡｂ、４Ｄ２イソタイプ一致コントロールｍＡｂ、Ｆ８：３３抗ヒトＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂまたはＦ１０−４４−２非生物機能性イソタイプコントロール抗ヒトＣＤ４４ｍＡｂの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受ける４つ群の１つに無作為に割り当てた。各マウスは、疾患発症日（０日目）、および、その後、１０日間にわたって１日毎に、２００μｇの抗体が１００μｌのＰＢＳにおいて注射された。関節炎を、足の腫脹を測定することによって１０日間の処置期間中モニターした。

足の腫脹を測定するために、それぞれの冒された後ろ足の厚さを、マイクロカリパスを用いて測定した。結果が足幅の直接的な測定値（ミリメートル単位）として表される。

統計学的分析
データは、１元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、対になっていない値に対するスチューデントｔ検定のためのマイクロコンピュータープログラムを使用して分析された。Ｐ＜０．０５を有意であると見なした。結果は平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表される。それぞれの実験は少なくとも３回繰り返され、すべてが類似する結果を示した。

結果
関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑膜細胞において発現するＣＤ４４のｍＲＮＡはイントロン由来のさらなるトリヌクレオチドを含有する
ＲＡ患者由来の滑膜細胞を関節吸引後に単離した。その総ＲＮＡを逆転写し、ＣＤ４４の定常コード領域を表すプライマーを使用してＰＣＲに供した。

図１Ｂは、代表的なＲＡ患者の関節に由来する滑膜細胞のＲＴ−ＰＣＲを示す。２つの主要なシグナルが検出された：速く移動するバンド（５７１ｂｐ）はＣＤ４４ｓに対応し、遅く移動するバンド（１７１４ｂｐ）はＣＤ４４ｖ３−ｖ１０に対応する（これはまた角化細胞においても発現している）。これらの知見は直接的な配列決定によって確認された（データは示されず）。

ＣＤ４４変異体が、５５名のＲＡ患者のうちの５２名に由来する滑膜細胞において、また、１４名の乾癬性関節炎（ＰＳＡ）患者のうちの１２名に由来する滑膜細胞において検出された。変形性関節炎（ＯＡ）患者の滑膜細胞に由来する１２個のサンプルのうちの５個でもまた、このＣＤ４４変異体を示した。

５５名のＲＡ患者のうちの５２名および１４名のＰＳＡ患者のうちの８名に由来するＣＤ４４変異体のＲＴ−ＰＣＲ生成物を配列決定した。さらなるトリヌクレオチド（ＣＡＧ）が、野生型変異体ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０に対するコンピューターによるアラインメント（図１Ｃ）の後で、２３名（２９名中）のＲＡ患者および７名（８名中）のＰＳＡ患者においてエキソンｖ４とエキソンｖ５との間で検出された（図１Ｃ）。このＣＡＧトリヌクレオチドは、エキソンｖ４からエキソンｖ５にまでまたがるイントロンの最末端から、正確にはスプライシング接合部において転写された。このトリヌクレオチドは、ＣＤ４４転写物の読み枠全体を妨害することなく、アラニン（Ａｌａ）の翻訳を可能にしている。さらなるＣＡＧを有する関節リウマチ由来のＣＤ４４変異体はＣＤ４４ｖＲＡと称された。

抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂの製造
ＣＤ４４ｖＲＡにおけるさらなるＡｌａの発現は、ＲＡ変異体と、野生型イソ型のＣＤ４４ｖ３−ｖ１０（または標準的なイソ型のＣＤ４４ｓ）とを識別することができるｍＡｂの生成を可能にする立体配置変化を誘導することが考えられた。ＣＤ４４ｖＲＡ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０（ヒト角化細胞に由来する）およびＣＤ４４ｓ（ＨｅＬａ細胞に由来する）のｃＤＮＡをＣＤ４４陰性のＮａｍａｌｗａバーキットリンパ腫細胞株にトランスフェクションした。高レベルのＣＤ４４ｓを発現するＣＤ４４トランスフェクタント、ならびに、等しいレベルのｖ６含有ＣＤ４４変異体を発現するＣＤ４４ｖ３−ｖ１０トランスフェクタントおよびＣＤ４４ｖＲＡトランスフェクタントを選択した（図２Ａ）。これらのトランスフェクタントは、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｓ、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、およびＮａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡとそれぞれ称された。空ベクターによりトランスフェクションされたＮａｍａｌｗａ細胞はＮａｍａｌｗａ−Ｎｅｏと称された。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、材料および方法で記載されたように、ＣＦＡに取り込まれた可溶性ＣＤ４４ｖＲＡで免疫化し、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡ細胞により抗原投与した。ポリクローナル抗ＣＤ４４ｖＲＡ抗体をその血清において示すマウスからの脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合した。ハイブリドーマ細胞クローンを、フローサイトメトリーによって示されるように、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｓまたはＮａｍａｌｗａ−Ｎｅｏには実質的に結合せず、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡに対して結合するその上清の能力に従ってスクリーニングした。クローンおよびサブクローンを陽性のハイブリドーマ細胞コロニーから確立した。それらは８ヶ月間以上にわたって培養状態で安定であった。Ｆ８：３３と称される陽性ハイブリドーマの上清からの抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂをＧ−プロテインカラムで精製した。フローサイトメトリーにより、０．４μｇ／ｍｌの濃度で、Ｆ８：３３の抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂは、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡと相互作用したが、野生型ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０を含めて、それ以外のトランスフェクタントとは相互作用しなかったことがさらに明らかにされた（図２Ｂ〜図２Ｅ）。２μｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度（表１）では、Ｆ８：３３は、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０と交差反応し（図２Ｂ〜図２Ｅ）、さらにより高い濃度では（＞１００μｇ／ｍｌ）、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｓ細胞およびＮａｍａｌｗａ−Ｎｅｏ細胞と同様に交差反応した（示されず）。

上記知見は、Ｆ８：３３ｍＡｂが、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０被覆マイクロウエルまたはＣＤ４４ｓ被覆マイクロウエルに対するよりも高い割合でＣＤ４４ｖＲＡ被覆マイクロウエルに対して用量依存的様式で結合したことを示すＥＬＩＳＡによって確認された（図３Ａ）。対照的に、抗汎ＣＤ４４ｍＡｂは、ＣＤ４４ｖＲＡおよびＣＤ４４ｖ３−ｖ１０に対して類似した程度に結合し（図３Ｂ）、一方、ＣＤ４４ｓに対しては、おそらくは、関連するエピトープを認識することができないために、結合しなかった。可溶性ＣＤ４４タンパク質の正体がウエスタンブロットによって確認された（図３Ｃ）。

これらの抗体は、マイクロウエルに被覆されたＣＤ４４ｖＲＡに対して、または、Ｎａｍａｌｗａ細胞において発現するＣＤ４４ｖＲＡに対して、対応する野生型分子（ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０）またはＣＤ４４ｓに対するよりも高い割合で結合した。特筆すべきことに、ＣＤ４４ｖＲＡおよびＣＤ４４ｖ３−ｖ１０はＮａｍａｌｗａ細胞において類似する程度に発現しており、一方、ＣＤ４４ｓは、さらに高いレベルでこれらの細胞において発現している。このことは、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡに対するＦ８：３３の優先的な結合が定性的には要求されないことを示している。Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡに対するＦ８：３３抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂの選択的な結合が０．４μｇ／ｍｌ以下の濃度で検出された。増大する濃度では、Ｆ８：３３は、まずＮａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０と交差反応し、次いでＮａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｓと交差反応する。このことは示差的な結合親和性を意味する（最も大きくは、細胞表面のＣＤ４４ｖＲＡに対してであり、最も低くは、細胞表面のＣＤ４４ｓに対してである）。

Ｆ８：３３抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂによるＲＡ滑膜細胞の選択的標的化
Ｎａｍａｌｗａトランスフェクタントは、実際には、抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂの結合能力および生物活性を評価するための人為的なモデルである。より現実的な評価を得るために、Ｆ８：３３と、初代ＲＡ滑膜細胞および初代角化細胞との相互作用を調べた。角化細胞はＣＤ４４ｖ３−ｖ１０（ＣＤ４４ｖＲＡの野生型）の既知の発現細胞であるので、角化細胞を参照群として選んだ。フローサイトメトリー分析では、ＲＡ患者の滑膜細胞におけるＣＤ４４ｓの発現が、２名の提供者から得られた角化細胞におけるＣＤ４４ｓの発現よりもわずかに大きいことが、ｖ６含有ＣＤ４４の発現における変動を伴って明らかにされた。角化細胞は、ＲＡ滑膜細胞よりもはるかに高いレベルで、様々なｖ９含有ＣＤ４４分子（これにはＣＤ４４ｖ３−ｖ１０が含まれる）を発現することもまた認められた（図４Ａ〜図４Ｃ）。たとえそうであっても、２μｇ／ｍｌおよび４μｇ／ｍｌの濃度において、Ｆ８：３３抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂは、フローサイトメトリーによって示されるように、滑膜細胞と相互作用したが、角化細胞とは相互反応しなかった（図４Ｄ〜図４Ｅ）。１００μｇ／ｍｌもの高い濃度でさえ、Ｆ８：３３はＲＡ滑膜細胞に選択的に結合し、その一方で、２００μｇ／ｍｌの濃度では、Ｆ８：３３は角化細胞と交差反応した（表１）。滑膜細胞は、そのｃＤＮＡのＰｓｔＩ消化によってＣＤ４４ｖＲＡ陽性細胞として同定された。角化細胞はＣＤ４４ｖ３−ｖ１０を構成的に発現している。

トランスウエル細胞遊走のＣＤ４４ｖＲＡ依存性
Ｆ８：３３抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂとＲＡ滑膜細胞との間での相互作用が生物活性を示すかどうかという疑問を調べた。このために、ＮａｍａｌｗａトランスフェクタントならびにＲＡ滑膜細胞および角化細胞の遊走をトランスウエル遊走アッセイにおいて阻害するＦ８：３３抗ＣＤ４４ｖＲＡの能力を測定した。

Ｆ８：３３抗ＣＤ４４ｖＲＡは、ＨＡ被覆メンブランを横断するＮａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡ細胞の能力を、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０の能力よりも効果的に、用量依存的様式で低下させた（図５Ａ）。この抗体は、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｓ細胞およびＮａｍａｌｗａ−Ｎｅｏ細胞の遊走に対する阻害作用を何ら示すことができなかった（１μｇ／ｍｌの濃度で、Ｆ８：３３はＮａｍａｌｗａ−Ｎｅｏ細胞の遊走を高めた）。イソタイプが一致する抗汎ＣＤ４４ｍＡｂ（これはすべてのＣＤ４４イソ型における定常エピトープを認識する）は、最大濃度でのみ、すべてのＣＤ４４トランスフェクタントの遊走に対してわずかに影響しただけであった（図５Ｂ）。このことは、Ｆ８：３３の選択的な抗遊走作用を意味する。

Ｆ８：３３抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂはまた、トランスウエル遊走アッセイによって示されるように、ＨＡ被覆メンブランを横断する、角化細胞ではなく、ＣＤ４４ｖＲＡ陽性のＲＡ滑膜細胞の能力を用量依存的様式で低下させた（図６Ａ）。対照的に、抗汎ＣＤ４４ｍＡｂは両方の細胞タイプの細胞遊走を妨害しなかった（図６Ｂ）。

Ｆ８：３３−６−１０−８もまた、ＣＤ４４ｖＲＡ生成物に対して非常に特異的である（図７Ａ〜図７Ｅ）。Ｆ８：３３−６−１０−８ハイブリドーマに由来する抗体を、空ベクターを発現するＮａｍａｌｗａ細胞（Ｎａｍａｌｗａ−ｐｃＤＮＡ３．１）、標準的ＣＤ４４を発現するＮａｍａｌｗａ細胞（Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｓｔｄ）、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０生成物を発現するＮａｍａｌｗａ細胞（Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０）、またはＣＤ４４ｖＲＡ生成物を発現するＮａｍａｌｗａ細胞（Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡ）のいずれかとインキュベーションした。既に１．２μｇ／ｍｌで（図７Ｄ）、Ｆ８：３３−６−１０−８抗体はＣＤ４４ｖＲＡ発現細胞と特異的に反応し、これに対して、それ以外の細胞には全く結合していない。１．２ｍｇ／ｍｌでさえ（図７Ａ）、Ｆ８：３３−６−１０−８抗体は、それ以外の細胞に対するよりも大きい親和性でＣＤ４４ｖＲＡ発現細胞に結合している。

マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎の阻害
Ｆ８：３３ｍＡｂはまた、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）のインビボアッセイを使用して調べられた。コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）は、関節リウマチ（ＲＡ）（滑膜炎と、軟骨および骨の侵食とを伴う関節内の慢性的な炎症によって特徴づけられる再発性疾患）の動物での類似疾患である。

図８において認めることができるように、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）が、足の腫脹（ＰＡＷ、ｍｍ）の減少によって示されるように、抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂのＦ８：３３を用いた処置によって阻害される。対照的に、コントロール抗体の抗汎ヒトＣＤ４４モノクローナル抗体Ｆ１０−４４−２は関節炎活性を低下させることができなかった。

陽性コントロールとして、抗汎マウスＣＤ４４抗体のＫＭ８１を使用し、その一方で、イソタイプが一致する関連性のないマウスｍＡｂの４Ｄ２モノクローナル抗体を陰性コントロールとして使用した（図９）。図９に示されるように、ＫＭ８１もまた、４Ｄ２モノクローナル抗体とは対照的に、マウスにおけるＣＩＡによって引き起こされる足の腫脹を低下させることができた。

まとめると、Ｆ８：３３は、マウスにおける関節炎活性を低下することによって示されるように、インビボでの生物学的機能が可能である。

ＣＤ４４のゲノム構造（図１Ａ）、ＣＤ４４の定常コード領域を表すプライマーのアガロースゲル電気泳動（図１Ｂ）、そして、ＲＡ−ＣＤ４４およびＣＤ４４ｖ３−ｖ１０の部分核酸配列（エキソン４およびエキソン５）、ならびに対応するアミノ酸配列（配列番号：１５〜３０）（この場合、配列は最適にアラインメントされている）（図１Ｃ）を示す。 ＣＤ４４ＦＩＴＣの平均蛍光強度に対する細胞カウント数を示す。 ＣＤ４４ＦＩＴＣの平均蛍光強度に対する細胞カウント数を示す。 可溶性のＣＤ４４ｖＲＡ、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０、ＣＤ４４ｓ（それぞれＣＤ４４ｖＲＡ−Ｆｃ（四角）、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０−Ｆｃ（菱形）、ＣＤ４４ｓ−Ｆｃ（三角））により被覆されたマイクロウエルに対する、Ｆ８：３３由来の抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂの結合のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）分析の結果を示す（図３Ａ〜図３Ｃ）。 ＣＤ４４ＦＩＴＣの平均蛍光強度に対する細胞カウント数を示す。 ＣＤ４４ＦＩＴＣの平均蛍光強度に対する細胞カウント数を示す。 Ｆ８：３３抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂの存在下もしくは非存在下（図５Ａ）、または、抗汎ＣＤ４４ｍＡｂの存在下もしくは非存在下で行われた細胞遊走アッセイのグラフを示し、それに従って、Ｎａｍａｌｗａトランスフェクタント（Ｎａｍａｌｗａ−ｐｃＤＮＡ３．１（菱形）、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｓ（四角）、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０（三角）およびＮａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡ（丸））が、トランスウエル遊走アッセイにおいてＨＡ被覆フィルターを横断するそれらの能力について、Ｆ８：３３抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂの存在下もしくは非存在下（図５Ａ）、または抗汎ＣＤ４４ｍＡｂの存在下もしくは非存在下（図５Ｂ）で分析され、細胞遊走百分率が、抗体の存在下でメンブランを横断した細胞数を、その非存在下でメンブランを横断した細胞数により除算し、１００を乗じることによって計算された。 ＲＡ患者の関節から得られた滑膜細胞（三角）、または初代角化細胞（四角）を使用して、Ｆ８：３３由来の抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂの存在下もしくは非存在下（図６Ａ）、または抗汎ＣＤ４４ｍＡｂの存在下もしくは非存在下（図６Ｂ）で行われ、トランスウエル遊走アッセイにおいてＨＡ被覆フィルターを横断するそれらの能力が評価される細胞遊走アッセイのグラフを示す。（細胞遊走百分率が図５Ｂにおけるように計算された）。 Ｎａｍａｌｗａ−ｐｃＤＮＡ３．１細胞、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｓ細胞、Ｎａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０細胞、またはＮａｍａｌｗａ−ＣＤ４４ｖＲＡ細胞に対する、Ｆ８：３３−６−８−１０由来の抗ＣＤ４４ｖＲＡｍＡｂの結合のＦＡＣＳ分析を示す（ＣＤ４４ＦＩＴＣの平均蛍光強度に対する細胞カウント数）（図７Ａ〜図７Ｅ）。 マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）に対するＦ８：３３（四角）の影響を示す。 マウスにおけるＣＩＡに対するＫＭ８１（抗汎マウスＣＤ４４、四角）および４Ｄ２（イソタイプが一致するコントロール抗体、三角）の影響を示す。

配列番号７〜１３は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号１４は合成ペプチドの配列である。

Claims (23)

1. 関節リウマチ患者のＣＤ４４変異体（ＣＤ４４ｖＲＡ）または前記ＣＤ４４ｖＲＡのフラグメントであって、ＣＤ４４ｖＲＡコード配列のエキソンｖ４からエキソンｖ５にまでまたがる領域から翻訳されるアミノ酸配列、または前記領域の一部から翻訳されるアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＤ４４ｖＲＡおよびＣＤ４４ｖ３−ｖ１０が最適にアラインメントされたとき、ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０の対応するフラグメントには存在しないＡｌａ残基を含むフラグメントと特異的に反応する抗体。
2. 前記Ａｌａ残基は、配列番号２の３０３位におけるＡｌａ残基に対応する請求項１に記載の抗体。
3. 前記抗体は、モノクローナル抗体である請求項１または２に記載の抗体。
4. 寄託アクセション番号ＣＮＣＭ Ｉ−３０１５（Ｆ８：３３ハイブリドーマ）または寄託アクセション番号ＣＮＣＭ Ｉ−３０１６（Ｆ８：３３−６−８−１０ハイブリドーマ）を有する細胞ハイブリドーマ。
5. 寄託アクセション番号ＣＮＣＭ Ｉ−３０１５（Ｆ８：３３ハイブリドーマ）または寄託アクセション番号ＣＮＣＭ Ｉ−３０１６（Ｆ８：３３−６−８−１０ハイブリドーマ）を有する細胞ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）。
6. 請求項３または５に記載のモノクローナル抗体に由来する抗体分子であって、前記抗体分子は前記モノクローナル抗体のフラグメント、前記モノクローナル抗体の誘導体、またはその相同体であり、前記フラグメント、誘導体または相同体は請求項３または５に記載のｍＡｂの抗原結合特異性を実質的に保持する抗体分子。
7. 請求項３または５に記載のｍＡｂのＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）_２フラグメントである抗体分子。
8. 請求項３または５に記載のｍＡｂのイディオタイプまたは結合部位を有する組換え抗体分子であって、請求項３または５に記載のｍＡｂの抗原結合特異性を実質的に保持する組換え抗体分子。
9. キメラ抗体分子、ヒト化抗体分子または単鎖抗体分子であるか、または鎖シャッフリングによって作製される抗体である請求項８に記載の組換え抗体分子であって、前記組換え抗体分子は請求項３または５に記載のｍＡｂの抗原結合特異性を実質的に保持する組換え抗体分子。
10. 請求項３または５に記載のｍＡｂと同じエピトープに結合する抗体分子。
11. 請求項１〜３および５〜１０のいずれか一項に記載の抗体、および医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物。
12. 関節リウマチ（ＲＡ）の処置のための請求項１１の医薬組成物。
13. 請求項１〜３および５〜１０のいずれか一項に記載の抗体によって認識されるエピトープを含むポリペプチドまたはタンパク質を生物学的サンプルから精製する方法であって：
    （ｉ）固体担体に結合した前記抗体を含むアフィニティーマトリックスを提供すること；
    （ｉｉ）前記生物学的サンプルを前記アフィニティーマトリックスと接触させて、抗体−ポリペプチド複合体および結合していない生物学的サンプルを生じさせること；
    （ｉｉｉ）結合していない生物学的サンプルを除くこと；および
    （ｉｖ）アフィニティーマトリックスに結合した抗体からポリペプチドを放出させること
    を含む方法。
14. 前記ペプチドは、ＣＤ４４ｖＲＡポリペプチドである請求項１３に記載の方法。
15. 抗原の存在についてサンプルを分析する方法であって：
    （ｉ）サンプルを、抗体と抗原の検出可能な複合体の形成を可能にする条件のもとで、請求項１〜３および５〜１０のいずれか一項に記載の抗体と接触させること；および
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られたデータを分析して前記抗体−抗原複合体が形成されたかどうか確認すること
    を含み、前記抗体−抗原複合体の形成は、前記抗体によって認識されるエピトープを有する抗原がサンプル中に存在することを示す方法。
16. 請求項１および５〜１０のいずれか一項に記載の抗体によって認識されるエピトープを含む抗原を発現する細胞を伴う疾患または障害を有する可能性が高い被検査個体を同定するための方法であって：
    （ｉ）生物学的サンプルを前記被検査個体から得ること；
    （ｉｉ）前記生物学的サンプルを、検出可能な抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件のもとで前記抗体と接触させること；および
    （ｉｉｉ）前記抗体−抗原複合体を検出すること
    を含み、前記抗体−抗原複合体の存在は、被検査個体がＣＤ４４ｖＲＡタンパク質を発現する細胞を伴う疾患または障害を有する可能性が高いことを示す方法。
17. 請求項１〜３および５〜１０のいずれか一項に記載の抗体によって認識されるエピトープを含む抗原を発現する細胞を伴う疾患または障害を有する可能性が高い被検査個体を同定するための方法であって：
    （ｉ）生物学的サンプルを前記被検査個体から得ること；
    （ｉｉ）前記生物学的サンプルを、検出可能な抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件のもとで前記抗体と接触させること；および
    （ｉｉｉ）前記抗体−抗原複合体を検出すること、および前記複合体のレベルを、健康な個体から得られたサンプルにおいて検出される抗体−抗原複合体のレベルと比較すること
    を含み、前記レベルからのずれは、被検査個体が前記疾患または障害を有する可能性が高いことを示す方法。
18. 前記疾患または障害は、ＣＤ４４ｖＲＡを発現する細胞を伴う請求項１６または１７に記載の方法。
19. 前記疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）である請求項１６または１７に記載の方法。
20. 治療効果を個体において達成するための方法であって：
    （ｉ）治療効果的な量の本発明の請求項１〜３および５〜１０のいずれか一項に記載の抗体を前記個体に投与すること；および、
    （ｉｉ）治療効果を前記個体において得ること
    を含み、前記治療効果は、前記抗体によって認識されるエピトープを含む抗原の発現に関連する症状を防止または改善することである方法。
21. 前記ポリペプチドは、ＣＤ４４ｖＲＡまたは請求項１〜３および５〜１０のいずれか一項に記載の抗体によって認識される前記エピトープを含むその誘導体、フラグメントまたは相同体である請求項２０に記載の方法。
22. 前記疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）である請求項２１に記載の方法。
23. 請求項１〜３および５〜１０のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸分子。

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