JP2008309539A - ２次元電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 自動化が容易な２次元電気泳動装置を提供する。
【解決手段】 １本の１次元目分離用流路と、これに交差・連通する複数本の２次元目分離用流路からなる２次元電気泳動用流路に、両性電解質を使用する広領域緩衝液と、水溶性直鎖ポリマー若しくは分岐構造を含む水溶性直鎖ポリマーのいずれか一以上と、試料とを混合した泳動液を導入して電気泳動を行う２次元電気泳動装置を提供する。
本発明の２次元電気泳動装置を用いることにより、１次元目の電気泳動終了後直ちに２次元目の電気泳動に移行することができる。従来必要であった１次元目の電気泳動後試料を含む支持体を２次元目の電気泳動用支持体上へ移し替える操作が不要であるので、電気泳動装置の自動化が容易になる。
また、電気泳動槽をマイクロチップ化することにより、さらに電気泳動の高速化が可能となる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、たんぱく質の分離分析を行う２次元電気泳動装置及びこれを用いた電気泳動方法に関する。

ポリアクリルアミドゲルを電気泳動用支持体として用いるゲル電気泳動法は生命科学、医療、環境、食品の分野でたんぱく質、ペプチド、神経伝達物質、ホルモン、核酸などの分離分析手段として広く用いられている。特に、たんぱく質を等電点と分子量という二つの異なる分離モードで分離するポリアクリルアミドゲル２次元電気泳動法は、分離能の優れた分析法として知られている。

上記の従来方法の一例を説明すれば、チューブゲルを用いた１次元目の等電点分離電気泳動と、スラブ（平板）ゲルを用いた２次元目の分子量分離電気泳動を組み合わせた２次元電気泳動においては、１次元目の分離が終了したのちにゲルをチューブから取り出して、これを２次元目分離用のスラブゲルの上に密着させてから、２次元目の電気泳動を行う必要があった。
O’Farrell, J.Biol. Chem., 250, 4007-4021, 1975

ポリアクリルアミドゲル２次元電気泳動法は、泳動用支持体であるポリアクリルアミドゲルの調製が煩雑で、品質の規格化が難しい。近年、ゲルのサイズは小さくなり泳動時間の短縮もはかられてきてはいるが、さらに簡便で実用的な電気泳動法および電気泳動装置が望まれている。

本発明が解決しようとする主要な課題は、２次元電気泳動の高速化と分離性能に優れる２次元電気泳動装置を提供することにある。さらには周辺機器も含めた全システムの小型化、自動化を図ることである。

本発明による解決手段を以下に述べる。
請求項１、２に示す発明は本願発明の基本をなし、２次元電気泳動に際し、試料のみの導入流路を持たない１本の１次元目用分離流路と、これと交差して複数本並列する２次元目用分離流路を設けて２次元電気泳動を行うことにある。さらに上記流路内の全域に水溶性直鎖ポリマー若しくは分岐構造を含む水溶性直鎖ポリマーのいずれか一以上と両性電解質を用いた広領域緩衝液を混合した泳動液、又はこれにさらに試料を混合した泳動液を導入して２次元電気泳動を行うものである。

以下、図１を用いて上記発明を詳細に説明する。図１（Ａ）は２次元電気泳動槽１００の斜視図、図１（Ｂ）は図１（Ａ）のＰ−Ｐ位置の部分断面図である。複数本の流路１２１，１２２で構成される２次元目の電気泳動分離用流路１２０が１次元目の電気泳動分離用流路１１０と交差して一体化している。上記交差部においては、各流路１１０、１２１、１２２は連通しており、各流路間を流体が自由に往来することができる。図示のように、１次元目分離用流路と２次元目分離用流路の全域に泳動液１３０が導入されている。この泳動液は、先に述べたように、水溶性直鎖ポリマー若しくは分岐構造を含む水溶性直鎖ポリマーのいずれか一以上と両性電解質を用いた広領域緩衝液を混合したもの、又はこれにさらに試料を混合したものである。

２次元目電気泳動分離用の複数本の流路は、１次元目電気泳動分離用の流路との交差部分以外においては互いに物理的に独立している。このため、然るべき電極と電極液とにより１次元目電気泳動分離用流路の両端に電圧を加えて１次元目の電気泳動を行った場合にも、交差して一体化接続している２次元目電気泳動分離用複数本流路の存在の影響は受けにくい。

１次元目電気泳動の電圧印加には、例えば、図５（Ａ）に示す１次元目電気泳動用電極システム５１０を一対で用いればよい。１次元目電気泳動用電極システム５１０では、キャピラリー５１３の中に電極液５１１が充填されており、毛細管作用により一定量が保持されている。電極液中に事前に試料（たんぱく質など）を混合しておくことも可能である。電極液中には電極線５１２が設けられている。今、一対の１次元目電気泳動用電極システムの電極液面５１５の各々を１次元目電気泳動分離用流路の両端に接触させれば、電極液と１次元目分離用泳動液とが接触するので、電極線に所定の電圧を加えることにより、１次元目の電気泳動を行うことが出来る。この時に、１次元目電気泳動分離用流路に交差して一体化接続している２次元目電気泳動分離用複数本の流路は、1次元目電気泳動に影響を与えにくくするために両端が開放されている。

また、２次元目電気泳動分離用流路１２０に電圧を加えるには、例えば、図５（Ｂ）に示す２次元目電気泳動用電極システム５２０を一対で用いればよい。２次元目電気泳動用電極システムの構成は１次元目用と類似しており、電極液容器５２３の中に電極液５２１が充填されており、毛細管作用により一定量が保持されている。電極液中には電極線５２２が設けられている。

本発明によれば、１次元目の電気泳動終了後直ちに２次元目の電気泳動を開始することが出来る。従来の方法で必要とされた１次元目電気泳動終了後、試料を含む泳動用支持体を2次元目電気泳動用支持体上に移す煩雑な操作が不要になり、電気泳動時間が短縮されると同時に工程が簡素化されるため、装置の自動化が容易になる。泳動液に混合した水溶性直鎖ポリマー（若しくは分岐構造を含む水溶性直鎖ポリマー）は分離スポットの拡散を抑え、若しくは分子篩効果により分離能を向上させる。

請求項２に示す発明のポイントは、請求項１に示した泳動液中に試料をさらに混合したことにある。これにより、１次元目の電気泳動開始にあたって試料を導入する必要が無くなり、電気泳動操作と工程の簡素化が図れる。

また、請求項３に示す発明のポイントは、上記の流路をキャピラリーで構成することにある。さらに、請求項４に示す発明では、請求項３に示した１次元目電気泳動分離用のキャピラリーの両端に電極槽を設け、また、２次元目電気泳動用の複数本のキャピラリーの両端にも各キャピラリーに共通の電極槽を設け、さらに、上記の２次元目電気泳動用電極槽の内面に撥水処理を施している。上記の撥水処理を施すことにより、１次元目・２次元目電気泳動用キャピラリー全域に泳動液を導入したときに、２次元目電気泳動分離用の各キャピラリー端部から電極槽の内面を濡らしながら泳動液が漏れ出すのを防止することが出来る。

さらに、請求項５に示す発明のポイントは、１次元目および２次元目電気泳動分離用流路を基板上に設けた溝状の流路で構成することにある。さらには、請求項６に示す発明では、請求項４の発明と同様に、上記の溝状流路の両端に電極槽を設けることにある。２次元目電気泳動分離用の複数本の溝状流路の両端には、各溝状流路に対して共通の電極槽を設け、さらに、上記の２次元目電気泳動用の電極槽の内面に撥水処理を施すことにある。

本発明によれば、プロセスの簡素化に基づいて、2次元電気泳動所要時間が短縮され、また、装置の小型化・自動化が容易となる。さらに、両性電解質を用いた広領域緩衝液と水溶性直鎖ポリマー（若しくは分岐構造を含む水溶性直鎖ポリマー）とを混合した泳動液を用いることで、分離能の優れた泳動分離像が得られる。

図面を用いて、以下に本発明を実施するための最良の形態について説明する。図２は、１次元目及び２次元目電気泳動分離用流路をキャピラリーで構成し、１次元目及び２次元目電気泳動分離用キャピラリーの両端には、電極槽２５１、２５２を設けた２次元電気泳動装置２００を示す。各キャピラリーには、下記に示すＡ、Ｂ、のいずれかの仕様の泳動液を導入する。
Ａ仕様泳動液：両性電解質を使用する広領域緩衝液と、水溶性直鎖ポリマー若しくは分岐構造を含む水溶性直鎖ポリマーのいずれか一以上を混合した泳動液
Ｂ仕様泳動液：上記Ａ仕様泳動液に、試料を予め混合した泳動液

上記の水溶性直鎖ポリマー若しくは分岐構造を含む水溶性直鎖ポリマーとは、例えば、直鎖状ポリアクリルアミド、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、デキストラン、ポリエチレングリコールなどである。

図６は、１次元目電気泳動用泳動液と２次元目電気泳動用泳動液に電圧を加えるための電極システムを示す。図６（Ａ）は１次元目電気泳動用の電極システム６１０であり、キャピラリー状容器中に電極液と電極線がセットされている。また、図６（Ｂ）は２次元目電気泳動用の電極システム６２０であり、電極液容器中に電極液と電極線がセットされている。

図３は、電気泳動用流路を溝状流路で形成した、マイクロチップの例である。図４は、上記のマイクロチップに設けられた１次元目及び２次元目電気泳動用溝状流路の端部に各々電極槽を設けた例である。図３及び図４に示す流路に導入した泳動液に電圧を印加するに際しても、先の図６に示した電極システムを適用することができる。

図２に、本発明の第１の実施例である２次元電気泳動装置を示す。図２（Ａ）は本実施例の２次元電気泳動装置２００の斜視図であり、１次元目・２次元目電気泳動分離用流路をキャピラリーで構成したことを特徴としている。図２（Ｂ）は図２（Ａ）におけるＳ−Ｓ箇所の部分断面図である。１次元目電気泳動分離用キャピラリー２１０と、複数本の２次元目電気泳動分離用キャピラリー２２１・２２２とは交差して一体化している。また、図２（Ｂ）に示すように交差部分において１次元目電気泳動分離用キャピラリーと２次元目電気泳動分離用キャピラリーは連通している。さらに、１次元目電気泳動分離用キャピラリーの両端には１次元目電気泳動用電極槽２５１を設けている。

さらには、複数本の２次元目電気泳動分離用キャピラリーの両端にも２次元目電気泳動用電極槽２５２を設けている。また、２次元目電気泳動用電極槽２５２の内面には図示のように撥水処理コート層２５５が設けられており、１次元目・２次元目電気泳動用キャピラリー全域に泳動液２３０を導入したときに、２次元目電気泳動分離用の各キャピラリー端部から電極槽の内面を濡らしながら泳動液が漏れ出すのを防止している。

上記の２次元電気泳動装置を用いてたんぱく質を分離する場合の一例を以下に説明する。まず、１次元目電気泳動用電極槽から泳動液２３０を１次元目・２次元目電気泳動分離用キャピラリーの全域に導入する。このとき、２次元目電気泳動用電極槽の中に泳動液が流れ込まないように、導入液量を調整する。泳動液には前述したA仕様泳動液を用いた。本実施例ではＡ仕様泳動液を、市販の両性電解質（両性電解質を使用した広領域緩衝液、pH3.5〜pH10：pH3.5〜pH5.0＝1：1）0.1％、直鎖ポリアクリルアミド溶液（３％Ｔ、０％Ｃ）に調製した水溶液とした。

次に、１次元目の電気泳動について説明する。１次元目電気泳動分離用キャピラリー中の泳動液に電圧を印加するには、図６（Ａ）に示す１次元目電気泳動用電極システム６１０を用いる。キャピラリー６１３の中には電極液６１１と電極線６１２が設けられている。キャピラリーは毛細管作用により別容器から所定電極液の所定量を吸い上げて保持できる構造となっている。本例では、電極液として0.01Ｍのリン酸溶液（陽極用）と0.04Ｍの水酸化ナトリウム溶液（陰極用）を用い、さらに上記陽極液中には予め試料（たんぱく質）を混合させている。上記の一対の電極システム６１０を１次元目電気泳動用電極槽２５１中の泳動液２３０に接触させた後、電圧を印加して１次元目の等電点電気泳動を行う。

上記の１次元目電気泳動終了後、直ちに２次元目の電気泳動に移行する。これには、図６（Ｂ）に示す２次元目電気泳動用電極システム６２０を用いて２次元目分離用泳動液に電圧を印加する。２次元目電気泳動用電極システムも、大略１次元目と同様の構造であり、電極液容器６２３の中に電極液６２１と電極線６２２が設けられている。電極液容器は毛細管作用により別容器から所定電極液の所定量を吸い上げて保持できる構造となっている。本例では、陽極用／陰極用電極液として、0.05Ｍトリス（Tris（hydroxy）aminomethane）−0.38Ｍグリシン緩衝液を用いた。

上記の一対の２次元目電気泳動用電極システムを２次元目電気泳動用電極槽の上部にセットした後、２次元目電気泳動用泳動液と電極液との液絡をはかり、電圧を印加して２次元目電気泳動（ゾーンまたは分子量電気泳動）を行う。微量分析試料は蛍光標識など高感度検出を可能にする前処理を施して用い、泳動用流路に励起光を照射して発する蛍光をCCDカメラでコンピュータに取り込めば、電気泳動分離の経過および結果の観察が可能となり、画像解析、デイスプレイもできる。励起用光源は、用いる蛍光体の種類により選択する。

本発明の第２の実施例を図３に示す。図３は、１次元目・２次元目分離用流路を微細な溝状流路（以下ではマイクロ流路と呼ぶ。）で構成した２次元電気泳動用マイクロチップ３００である。図３（Ａ）は、上記マイクロチップの斜視図、図３（Ｂ）は図３（Ａ）におけるＴ−Ｔ箇所の部分断面図である。１次元目分離用マイクロ流路３１０と、複数本の２次元目分離用マイクロ流路３２１・３２２とは交差して一体化している。また、図３（Ａ）、（Ｂ）に示すように交差部分において１次元目電気泳動分離用マイクロ流路と２次元目電気泳動分離用マイクロ流路は連通している。

上記のマイクロチップは、半導体微細加工技術を応用して基板３４０上にマイクロ流路を形成している。基板材料は、シリコンである。上記マイクロ流路のサイズは、流路幅100μm、深さ100μm, 長さ２０ｍｍである。複数本の２次元目電気泳動用マイクロ流路は隣り合う流路の間隔（並列流路の仕切り壁の厚み）を約２０μｍに保ち、１００本のマイクロ流路で構成している。１次元目・２次元目用マイクロ流路内部表面には厚さ約1μmの酸化膜（ＳｉＯ₂膜）が形成されている。

マイクロ流路内には、全域に亘って泳動液３３０が導入されている。泳動液には前述したＢ仕様泳動液を用いた。本実施例ではＢ仕様泳動液を、市販の両性電解質（両性電解質を使用した広領域緩衝液、pH3.5〜pH10：pH3.5〜pH5.0＝1：1）0.1％、直鎖ポリアクリルアミド溶液（３％Ｔ、０％Ｃ）、試料として海苔由来の蛍光たんぱく質phycoerythrinなど２種を各0.7μg/μlになる様に調製した水溶液とした。

マイクロ流路内の泳動液３３０に電圧を印加するには、前述した図６に示す電極システムを用いる。使用する電極液については、実施例１に示したと同様であるが、試料については泳動液中に事前に混合させているため、あらためて試料を電極液中に混合することはない。

まず、１次元目分離に際しては一対の１次元目電気泳動用電極システム６１０をマイクロチップ上の１次元目電気泳動用電極液接触ゾーン３５１の領域に接触させて、電極液と泳動液との液絡をはかった後、電圧を印加して１次元目の電気泳動（等電点電気泳動）を行う。

上記により、１次元目の電気泳動が終了したら、直ちに２次元目の電気泳動に移行する。一対の２次元目電気泳動用電極システム６２０をマイクロチップ上の２次元目電気泳動用電極液接触ゾーン３５２に接触させて、泳動液と電極液の液絡をはかった後、直ちに電圧を印加して２次元目の電気泳動（ゾーンまたは分子量電気泳動）を行う。２次元電気泳動経過および終了時の電気泳動像の観察手法などは、実施例１と同様であるので記述を省略する。

本発明の第３の実施例を図４に示す。図４は、１次元目・２次元目電気泳動の分離用流路を実施例２と同様にマイクロ流路で構成し、また、１次元目・２次元目電気泳動用マイクロ流路の両端に電極槽を設けたことを特徴とする２次元電気泳動用マイクロチップ４００である。図４（Ａ）は、上記マイクロチップの平面図、図４（Ｂ）は図４（Ａ）におけるＹ−Ｙ箇所の断面図である。

１次元目・２次元目電気泳動用マイクロ流路の両端に、１次元目電気泳動用電極槽４５１、２次元目電気泳動用電極槽４５２を設けたことを除けば、その構造は大略、実施例２と同様であるので詳細な記述を省略する。実施例１で述べたのと同様の目的で、図示のように、２次元目電気泳動用電極槽４５２の内面全体には撥水処理コート層４５５を設けている。ここで、図４（Ａ）に示す平面図においては、２次元目電気泳動用電極槽４５２の底面に施された撥水処理コート層の描画を省略している。また、本実施例で用いる泳動液や電気泳動方法は前述の実施例１、２で説明した内容に極めて類似しているので、詳細な説明を省略する。

なお、実施例２、３に示したマイクロチップでは、マイクロ流路上にカバーを設置していないが、必要に応じてカバープレートを設けてもよい。このときのカバープレートは、電気泳動像の観察のための照明光や蛍光標識体を発光させるための励起光に対して透明であることが必要であり、ガラスや合成樹脂製の板状カバーが好適である。さらには、マイクロチップの基板材質は、絶縁性の基板、あるいは流路が基板と電気的に絶縁できる構造を採れるものであれば、特にシリコンに限定されるものではない。ガラスや合成樹脂で作製されたものは、照明光や励起光を基板の裏面からも照射が出来るので、マイクロチップの基板材質として好適である。上記基板材料は照射光によって蛍光を発しないものでなくてはならない。

本発明の活用例としては、医療、食品、環境分析、又はその品質管理など広い分野に適用可能である。

本発明による２次元電気泳動槽の斜視図及び部分断面図 実施例1に示す2次元電気泳動装置の斜視図及び部分断面図 実施例２に示す2次元電気泳動用マイクロチップの斜視図及び断面図 実施例３に示す2次元電気泳動用マイクロチップの斜視図及び断面図 本発明の説明に用いた電気泳動用電極システムの斜視図 各実施例で用いた電気泳動用電極システムの斜視図

符号の説明

100――２次元電気泳動槽
110――１次元目電気泳動の分離用流路
120――２次元目電気泳動の分離用流路
121、122――２次元目電気泳動の分離用単独流路
130、230、330、430――泳動液
200――２次元電気泳動装置
210――１次元目電気泳動の分離用キャピラリー
221、222――２次元目電気泳動の分離用キャピラリー
251、451――１次元目電気泳動用電極槽
252、452――２次元目電気泳動用電極槽
255、455――撥水処理コート層
300、400――２次元電気泳動用マイクロチップ
310、410――１次元目電気泳動の分離用マイクロ流路
320、420――２次元目電気泳動の分離用マイクロ流路
321、322、421、422――２次元目電気泳動の分離用単独マイクロ流路
340、440――基板
351――１次元目電気泳動用電極液接触ゾーン
352――２次元目電気泳動用電極液接触ゾーン
510、610――１次元目電気泳動用電極システム
511、521、611、621――電極液
512、522、612、622――電極線
513、613――キャピラリー
520、620――２次元目電気泳動用電極システム
523、623――電極液容器
515、525――電極液面

Claims (8)

1. １次元目電気泳動の分離用流路に２次元目電気泳動の分離用流路たる複数本の流路が交差して一体化しており、前記交差部分では前記１次元目電気泳動・２次元目電気泳動用の流路が互に連通しており、かつ、前記２次元目電気泳動の分離用の複数本の流路は前記交差部分以外を除いては互いに独立していて電気的にも互いに絶縁されて構成されている２次元電気泳動用の泳動槽において、
   前記１次元目電気泳動の分離用流路及び２次元目電気泳動の分離用流路に、両性電解質を使用する広領域緩衝液と、水溶性直鎖ポリマー若しくは分岐構造を含む水溶性直鎖ポリマーのいずれか一以上を混合した泳動液を導入したことを特徴とする２次元電気泳動装置。
2. 請求項１に記載の泳動液に、
   さらに試料を混合して泳動液としたことを特徴とする請求項１に記載の２次元電気泳動装置。
3. １次元目電気泳動の分離用流路および２次元目電気泳動の分離用流路を、キャピラリーで構成したことを特徴とする請求項１ないし２のいずれか１項に記載の２次元電気泳動装置。
4. １次元目電気泳動の分離用キャピラリーの両端に電極槽を設け、また、複数本の２次元目電気泳動の分離用キャピラリーの両端には各キャピラリーに対して共通の電極槽を設け、前記２次元目電気泳動用電極槽の内面に撥水処理を施したことを特徴とする請求項３に記載の２次元電気泳動装置。
5. １次元目電気泳動の分離用流路および２次元目電気泳動の分離用流路を、基板上に設けた溝状流路で構成したことを特徴とする請求項１ないし２のいずれか１項に記載の２次元電気泳動装置。
6. 基板上に設けた１次元目電気泳動の分離用溝状流路の両端に電極槽を設け、
   また、複数本の２次元目電気泳動の分離用溝状流路の両端には、前記複数本の２次元目電気泳動の分離用溝状流路の各溝に対して共通の電極槽を設け、前記の各溝に対して共通の電極槽の内面に撥水処理を施したことを特徴とする請求項５に記載の２次元電気泳動装置。
7. 請求項１ないし６のいずれか１項に記載の２次元電気泳動装置を用いることを特徴とする２次元電気泳動方法。
8. 1次元目の電気泳動が等電点分離、2次元目の電気泳動がゾーン若しくは分子量分離であることを特徴とする請求項７に記載の２次元電気泳動方法。

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