JP2008301792A - 改変ポリヘドリンプロモーター、バクミド変異体及び目的タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】バキュロウイルス発現系における目的タンパク質の高発現が可能な改変ポリヘドリンプロモーター、該改変ポリヘドリンプロモーターを含むバクミド変異体、及び、該バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法を提供する。
【解決手段】バースト配列を2以上8以下含む改変ポリヘドリンプロモーターである。また、前記改変ポリヘドリンプロモーターと、バキュロウイルスDNAと、miniFレプリコンと、トランスポゾンの付着部位と、を含むバクミド変異体である。
更に、バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法であって、大腸菌中で、前記バクミド変異体と、目的タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、トランスポゼースとにより、目的タンパク質発現バクミドを得る工程と、前記目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入する工程と、を含む目的タンパク質の製造方法である。
【選択図】なし
【解決手段】バースト配列を2以上8以下含む改変ポリヘドリンプロモーターである。また、前記改変ポリヘドリンプロモーターと、バキュロウイルスDNAと、miniFレプリコンと、トランスポゾンの付着部位と、を含むバクミド変異体である。
更に、バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法であって、大腸菌中で、前記バクミド変異体と、目的タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、トランスポゼースとにより、目的タンパク質発現バクミドを得る工程と、前記目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入する工程と、を含む目的タンパク質の製造方法である。
【選択図】なし
Description
本発明は、改変ポリヘドリンプロモーター、バクミド変異体及び目的タンパク質の製造方法に関する。
バキュロウイルス遺伝子発現系は、真核生物である昆虫由来の細胞中で組換えタンパク質を生産するため、糖鎖付加、リン酸化などの翻訳後修飾が行われるため、活性を有する組換えタンパク質の大量生産に適している。
組換えタンパク質の高発現のためには高いプロモーター活性を有する発現用プロモーターが必要である。バキュロウイルス遺伝子発現系においては、バキュロウイルス由来の強力なポリヘドリンプロモーターが発現用プロモーターとして広く利用されており、その機能と構造についてはいくつかの報告がなされている(例えば、非特許文献1〜2参照)。
組換えタンパク質の高発現のためには高いプロモーター活性を有する発現用プロモーターが必要である。バキュロウイルス遺伝子発現系においては、バキュロウイルス由来の強力なポリヘドリンプロモーターが発現用プロモーターとして広く利用されており、その機能と構造についてはいくつかの報告がなされている(例えば、非特許文献1〜2参照)。
一方、さらに効率よく組換え遺伝子の発現を行うために、カイコ発現系に利用されるカイコガ核多角体病ウイルス(BmNPV)をBAC(Bacterial Artificial Choromosome)クローン化できるBmNPVシャトルベクター(バクミド)が開発され、大腸菌体内でのクローニングや組換えウイルスの構築を迅速に行うことができるようになった(例えば、特許文献1参照)。
特開2004−173507号公報
J. Virol., 1994, Vol.68, p7746−7756.
J. Virol., 1999, Vol.73, p3404−3409.
しかしながら、バキュロウイルス遺伝子発現系においても、目的タンパク質の発現効率が十分であるとは言い難かった。
本発明は、バキュロウイルス遺伝子発現系における目的タンパク質の高発現が可能な改変ポリヘドリンプロモーター、該改変ポリヘドリンプロモーターを含むバクミド変異体、及び、該バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、バキュロウイルス遺伝子発現系における目的タンパク質の高発現が可能な改変ポリヘドリンプロモーター、該改変ポリヘドリンプロモーターを含むバクミド変異体、及び、該バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
本発明の第1の態様は、バースト配列を2以上8以下含むバキュロウイルス遺伝子発現系用のバクミド発現系用の改変ポリヘドリンプロモーターである。前記バースト配列は配列番号1のポリヌクレオチドであることが好ましい。
本発明の第2の態様は、前記改変ポリヘドリンプロモーターと、バキュロウイルスDNAと、miniFレプリコンと、トランスポゾンの付着部位と、を含むバクミド変異体である。前記バキュロウイルスDNAは、BmNPV DNA又はAcMNPV DNAであることが好ましい。
また、本発明の第3の態様は、バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法であって、大腸菌中で、前記バクミド変異体と、目的タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、トランスポゼースとにより、目的タンパク質発現バクミドを得る工程と、前記目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入する工程と、を含む目的タンパク質の製造方法である。
本発明によれば、バキュロウイルス遺伝子発現系における目的タンパク質の高発現が可能な改変ポリヘドリンプロモーター、該改変ポリヘドリンプロモーターを含むバクミド変異体、及び、該バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法を提供することができる。
本発明の改変ポリヘドリンプロモーターは、バースト配列を2以上8以下含んでおり、バキュロウイルス遺伝子発現系用であることを特徴とする。天然型のポリヘドリンプロモーターは当初より1つのバースト配列を含むが、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターはバースト配列を2以上8以下含むので、バキュロウイルス遺伝子発現系に用いた場合に良好なプロモーター活性を達成することができる。
本発明におけるポリヘドリンプロモーターとは、バキュロウイルス、特に、核多角体ウイルス(NPV:Nucleopolyhedrovirus)が、感染細胞の核内に生成するタンパク質であるポリヘドリンの遺伝子発現を調節しているプロモーターを意味する。
本発明におけるポリヘドリンプロモーターとは、バキュロウイルス、特に、核多角体ウイルス(NPV:Nucleopolyhedrovirus)が、感染細胞の核内に生成するタンパク質であるポリヘドリンの遺伝子発現を調節しているプロモーターを意味する。
ポリヘドリンプロモーターの塩基配列のうち、転写開始点から翻訳開始点までの約50bpの領域内は一般にバースト配列と呼ばれ、バキュロウイルス由来の転写活性化因子である最後期転写因子1(VLF1)と相互作用するシス・エレメントとしてポリヘドリンプロモーターの活性化に必須である(例えば、Virology, 1998, Vol. 248, p131−138.参照)。
本発明におけるバースト配列は、VLF1と相互作用しうるポリヌクレオチドであればよいが、VLF1との相互作用と転写活性化の観点から、ポリヘドリンプロモーターの塩基配列のうち、転写開始点から翻訳開始点までの約50bpの領域内に含まれるポリヌクレオチドであることが好ましく、下記表1に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド(配列番号1)であることがより好ましい。
本発明におけるバースト配列は、VLF1と相互作用しうるポリヌクレオチドであればよいが、VLF1との相互作用と転写活性化の観点から、ポリヘドリンプロモーターの塩基配列のうち、転写開始点から翻訳開始点までの約50bpの領域内に含まれるポリヌクレオチドであることが好ましく、下記表1に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド(配列番号1)であることがより好ましい。
本発明の改変ポリヘドリンプロモーターが含むバースト配列の数は2以上8以下であるが、プロモーター活性向上の点から、より好適なバースト配列の数は、バキュロウイルス遺伝子発現系に応じて適宜選択することができる。例えば、AcMNPV DNAを含むバクミド変異体を用いる場合、含まれるバースト配列の数としては、2以上5以下であることが好ましく、2以上3以下であることがより好ましい。また、BmNPV DNAを含むバクミド変異体を用いる場合、含まれるバースト配列の数としては、2以上5以下であることが好ましい。
本発明の改変ポリヘドリンプロモーターは、転写活性化の観点から、バースト配列を転写開始点の下流かつ翻訳開始点の上流に含むものであることが好ましい。
また、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターは、転写活性化の観点から、バースト配列をタンデムリピートで含むことが好ましい。バースト配列をタンデムリピートで含むとは、2つ以上のバースト配列を連続して含むことを意味するが、バースト配列間にはスペーサーとなる塩基配列を含むことができる。バースト配列間に含まれる塩基数としては、転写活性化の観点から、6残基以下であることが好ましい。
また、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターは、転写活性化の観点から、バースト配列をタンデムリピートで含むことが好ましい。バースト配列をタンデムリピートで含むとは、2つ以上のバースト配列を連続して含むことを意味するが、バースト配列間にはスペーサーとなる塩基配列を含むことができる。バースト配列間に含まれる塩基数としては、転写活性化の観点から、6残基以下であることが好ましい。
本発明においては、バースト配列を転写開始点の下流かつ翻訳開始点の上流にタンデムリピートで含むことにより、より効率的にプロモーター活性を上昇させることができ、より好ましい。
本発明の改変ポリヘドリンプロモーターは、バースト配列を1つ含む天然型のポリヘドリンプロモーターを鋳型とした一般的なPCRによって作製することができる。
特にバースト配列を3つ以上含む改変ポリヘドリンプロモーターの場合は、相同な粘着末端を形成する異なる2つの制限酵素を利用する方法を好ましく用いることができる。この方法では2つの異なるコンパチブルな制限酵素の認識部位を、バースト配列の上流と下流とにそれぞれ配置し、これらの制限酵素による酵素処理とライゲーションを繰り返すことにより、より効率的に多数のバースト配列を含む改変ポリヘドリンプロモーターを作製することができる。これら2つの異なるコンパチブルな制限酵素としては、例えば、XbaIとSpeIの組合せを挙げることができる。
特にバースト配列を3つ以上含む改変ポリヘドリンプロモーターの場合は、相同な粘着末端を形成する異なる2つの制限酵素を利用する方法を好ましく用いることができる。この方法では2つの異なるコンパチブルな制限酵素の認識部位を、バースト配列の上流と下流とにそれぞれ配置し、これらの制限酵素による酵素処理とライゲーションを繰り返すことにより、より効率的に多数のバースト配列を含む改変ポリヘドリンプロモーターを作製することができる。これら2つの異なるコンパチブルな制限酵素としては、例えば、XbaIとSpeIの組合せを挙げることができる。
本発明のバクミド変異体は、前記改変ポリヘドリンプロモーターと、バキュロウイルスDNAと、miniFレプリコンと、トランスポゾンの付着部位とを含むことを特徴とする。前記改変ポリヘドリンプロモーターを含むことで、本発明のバクミド変異体を用いた目的タンパク質発現系における発現効率を向上させることができる。
バキュロウイルスDNAとしては、BmNPV DNA又はAcMNPV DNAであることが好ましい。BmNPV DNAとAcMNPV DNAは本発明のバクミド変異体の使用目的によって適宜選択可能である。
ここでBmNPVは、蚕の幼虫、蚕の蛹および蚕の培養細胞に感染して、感染細胞の核内に多角体をつくるカイコガ核多角体病ウイルス(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus)を意味し、BmNPV DNAは、BmNPVのDNA配列を意味する。
またAcMNPVは、オートグラファ・カルフォルニカ多角体病ウイルス(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus)を意味し、AcMNPV DNAは、AcMNPVのDNA配列を意味する。
ここでBmNPVは、蚕の幼虫、蚕の蛹および蚕の培養細胞に感染して、感染細胞の核内に多角体をつくるカイコガ核多角体病ウイルス(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus)を意味し、BmNPV DNAは、BmNPVのDNA配列を意味する。
またAcMNPVは、オートグラファ・カルフォルニカ多角体病ウイルス(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus)を意味し、AcMNPV DNAは、AcMNPVのDNA配列を意味する。
miniFレプリコンは、大腸菌DH5αF’IQより分離したプラスミド由来の配列であって複製に必要な領域を意味する。このminiFレプリコンは、例えばF’レプリコンから得ることができる。このminiFレプリコンの構造は、例えば特開2004−173507号公報に開示されている。
トランスポゾン(Tn)の付着部位とは、ドナープラスミド(デスティネーションベクター)内のトランスポゼース認識配列に挟まれた外来遺伝子(発現目的遺伝子)を、転位酵素トランスポゼースによりバクミド内の標的部位に挿入させるための配列である。トランスポゾンの付着部位としては、Tn7の付着部位mini−attTn7、Tn3の付着部位およびTn4の付着部位などが挙げられる。このトランスポゾン(Tn)の付着部位は、例えば、lacZ遺伝子(例えば、lacZα遺伝子)に含まれている。
この他、ベクターの構造の確認及び選別のために、種々のマーカー配列及び選択用配列等の補助配列を含んでもよい。外来遺伝子がバクミド上に挿入されたことを確認するために利用されるマーカー配列としては、例えば、LacZ遺伝子、GFP遺伝子、薬剤耐性遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を挙げることができる。目的とする構造のベクターを選択するための選択用配列としては、薬剤耐性遺伝子、例えば、カナマイシン耐性遺伝子やアンピシリン耐性遺伝子などを挙げることができる。これらの補助配列は、当業者により適宜選択することができる。
改変ポリヘドリンプロモーター、miniFレプリコン、バキュロウイルスDNA及びトランスポゾンの付着部位から構成されたバクミド変異体の基本骨格は、公知の方法で作製することができ、例えば特開2004−173507号公報や、Biochemical and Biophysica Research Communications 326 (2005) 564-569などに記載されている。
本発明のバクミド変異体は、目的タンパク質を製造する際の製造効率をより向上させるため、ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも1つを欠損していてもよい。
ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも1つを欠損させる方法としては、相同組換え系を利用した方法であり、例えば、国際公開第2007/029360号明細書に記載の方法及びそれを適宜変更した方法を挙げることができる。
ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも1つを欠損させる方法としては、相同組換え系を利用した方法であり、例えば、国際公開第2007/029360号明細書に記載の方法及びそれを適宜変更した方法を挙げることができる。
本発明の目的タンパク質の製造方法は、大腸菌中で前記バクミド変異体と、目的タンパク質をコードする配列(以下、「発現目的遺伝子」ということがある)を含むポリヌクレオチドと、トランスポゼースとにより、目的タンパク質を発現するバクミドを得る工程を含む。
発現目的遺伝子を含むポリヌクレオチドは、トランスポゼース認識部位に挟まれた発現目的遺伝子を含むドナープラスミドであることが好ましい。これによりλリコンビネーション系を用いた相同組換え系(例えば、J. Bacteriology, 1998, p.2063-2071参照)により、前記バクミド変異体に発現目的遺伝子を効率よく組換えることができる。
発現目的遺伝子を含むポリヌクレオチドは、トランスポゼース認識部位に挟まれた発現目的遺伝子を含むドナープラスミドであることが好ましい。これによりλリコンビネーション系を用いた相同組換え系(例えば、J. Bacteriology, 1998, p.2063-2071参照)により、前記バクミド変異体に発現目的遺伝子を効率よく組換えることができる。
本発明における発現目的遺伝子は、昆虫由来の分泌シグナル配列を更に含んでいてもよい。これにより目的タンパク質を昆虫細胞外に分泌させることができる。
昆虫由来の分泌シグナル配列としては、公知の分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができるが、分泌効率の観点から、カイコ脳神経ペプチドホルモンBombyxin由来の分泌シグナル配列bx、またはフェノール酸化酵素由来の分泌シグナル配列ppaeのいずれかであることが好ましい。
昆虫由来の分泌シグナル配列としては、公知の分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができるが、分泌効率の観点から、カイコ脳神経ペプチドホルモンBombyxin由来の分泌シグナル配列bx、またはフェノール酸化酵素由来の分泌シグナル配列ppaeのいずれかであることが好ましい。
本発明においては、上記で得られた目的タンパク質発現バクミドを、昆虫由来の細胞に導入する工程を含む。
上記目的タンパク質発現バクミドを導入(感染)する昆虫由来の細胞としては、昆虫個体の細胞であっても、確立した細胞株であってもよく、目的等に応じて適宜選択することができる。
上記目的タンパク質発現バクミドを導入(感染)する昆虫由来の細胞としては、昆虫個体の細胞であっても、確立した細胞株であってもよく、目的等に応じて適宜選択することができる。
昆虫の種類としては、本発明のバクミド変異体が感染しうる昆虫であれば特に制限はない。具体的には、例えば、本発明のバクミド変異体がAcMNPV DNAを含む場合、スポドプテラ・フルギペルタ(Spodoptera frugiperda)及びイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)を挙げることができる。また、本発明のバクミド変異体がBmNPV DNAを含む場合、カイコガ(Bombyx mori)を挙げることができる。
また、確立された細胞株としては、例えば、カイコガに由来するBm5細胞及びBmN4細胞、スポドプテラ・フルギペルタに由来するSf細胞、並びに、イラクサギンウワバに由来するTn細胞等を挙げることができる。
目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入する方法としては、公知の方法を適用することができる。
例えば、確立された細胞株に導入する場合には、細胞を培養している培地に直接添加することで、目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入することができる。また、カイコガ個体の細胞に導入する場合には、カイコガの幼虫個体又はカイコガの蛹に目的タンパク質発現バクミドを含む溶液を直接接種することで導入することができる。
例えば、確立された細胞株に導入する場合には、細胞を培養している培地に直接添加することで、目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入することができる。また、カイコガ個体の細胞に導入する場合には、カイコガの幼虫個体又はカイコガの蛹に目的タンパク質発現バクミドを含む溶液を直接接種することで導入することができる。
本発明においては、昆虫由来の細胞によって生成された目的タンパク質を回収する回収工程を更に設けることが好ましい。
目的タンパク質の回収としては、特に制限なく公知の方法を適用することができる。このような回収工程には、例えば、Hisタグ及びFlagタグのようなタグや、発現した目的タンパク質に対する抗体などを用いる方法や、イオン交換カラム及びアフィニティカラムなどによる精製方法など、公知の手段を用いることができる。
目的タンパク質の回収としては、特に制限なく公知の方法を適用することができる。このような回収工程には、例えば、Hisタグ及びFlagタグのようなタグや、発現した目的タンパク質に対する抗体などを用いる方法や、イオン交換カラム及びアフィニティカラムなどによる精製方法など、公知の手段を用いることができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、実施例中の%は特記しない限り、質量基準である。尚、市販のキットを使用した場合には、特記しない限り添付の取り扱い説明書にしたがって操作を行った。
(実施例1)
pDEST8(インビトロジェン社製)を鋳型とし、下記表2に示したPCRプライマーセット(polh−F:配列番号2及びpolh−R:配列番号3)と、KOD plus DNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製)を用いて、95℃ 2分の後、95℃ 30秒、55℃ 40秒、68℃ 1分30秒を30サイクル、の条件でPCRを行い、2つのバースト配列をタンデムリピートで有する改変ポリヘドリンプロモーターを含むポリヌクレオチドを得た。
また、pDEST8(インビトロジェン社製)を鋳型とし、下記表2に示したPCRプライマーセット(配列番号4及び5)と、LA Taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いて、95℃ 2分の後、95℃ 30秒、55℃ 40秒、72℃ 8分を32サイクル、の条件でPCRを行い、pDEST8のデスティネーションベクター部分を増幅した。
上記で得られたポリヌクレオチドとpDEST8のデスティネーションベクター部分とを、制限酵素XhoI及びHindIIIでそれぞれ処理し、DNA Ligation Kit(タカラバイオ社製)を用いてライゲーション処理を行い、バースト配列を2つ含む改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターpDB2を得た。
pDEST8(インビトロジェン社製)を鋳型とし、下記表2に示したPCRプライマーセット(polh−F:配列番号2及びpolh−R:配列番号3)と、KOD plus DNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製)を用いて、95℃ 2分の後、95℃ 30秒、55℃ 40秒、68℃ 1分30秒を30サイクル、の条件でPCRを行い、2つのバースト配列をタンデムリピートで有する改変ポリヘドリンプロモーターを含むポリヌクレオチドを得た。
また、pDEST8(インビトロジェン社製)を鋳型とし、下記表2に示したPCRプライマーセット(配列番号4及び5)と、LA Taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いて、95℃ 2分の後、95℃ 30秒、55℃ 40秒、72℃ 8分を32サイクル、の条件でPCRを行い、pDEST8のデスティネーションベクター部分を増幅した。
上記で得られたポリヌクレオチドとpDEST8のデスティネーションベクター部分とを、制限酵素XhoI及びHindIIIでそれぞれ処理し、DNA Ligation Kit(タカラバイオ社製)を用いてライゲーション処理を行い、バースト配列を2つ含む改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターpDB2を得た。
(実施例2)
実施例1で得られたpDB2を鋳型とし、上記表2に示したPCRプライマーセット(polh−F:配列番号2及びpolh−R:配列番号3)と、KOD plus DNAポリメラーゼを用いて、95℃ 2分の後、95℃ 30秒、55℃ 40秒、68℃ 1分30秒を30サイクル、の条件でPCRを行い、2つのバースト配列をタンデムリピートで有する改変ポリヘドリンプロモーターを含むポリヌクレオチドを得た。
得られたポリヌクレオチドを制限酵素SpeIとHindIIIとで処理したものと、pDB2を制限酵素XbaIとHindIIIとで処理したものを、DNA Ligation Kit(タカラバイオ社製)を用いてライゲーション処理を行い、バースト配列を3つタンデムリピートで有する改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターpDB3を得た。
実施例1で得られたpDB2を鋳型とし、上記表2に示したPCRプライマーセット(polh−F:配列番号2及びpolh−R:配列番号3)と、KOD plus DNAポリメラーゼを用いて、95℃ 2分の後、95℃ 30秒、55℃ 40秒、68℃ 1分30秒を30サイクル、の条件でPCRを行い、2つのバースト配列をタンデムリピートで有する改変ポリヘドリンプロモーターを含むポリヌクレオチドを得た。
得られたポリヌクレオチドを制限酵素SpeIとHindIIIとで処理したものと、pDB2を制限酵素XbaIとHindIIIとで処理したものを、DNA Ligation Kit(タカラバイオ社製)を用いてライゲーション処理を行い、バースト配列を3つタンデムリピートで有する改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターpDB3を得た。
(実施例3)
実施例2において、pDB2の代わりにpDB3を用いた以外は実施例2と同様にして、バースト配列を5つ含む改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターpDB5を得た。
実施例2において、pDB2の代わりにpDB3を用いた以外は実施例2と同様にして、バースト配列を5つ含む改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターpDB5を得た。
(比較例1)
実施例2において、pDB2の代わりにpDB5を用いた以外は実施例2と同様にして、バースト配列を9つ含む改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターpDB9を得た。
実施例2において、pDB2の代わりにpDB5を用いた以外は実施例2と同様にして、バースト配列を9つ含む改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターpDB9を得た。
(比較例2)
実施例2において、pDB2の代わりにpDB9を用いた以外は実施例2と同様にして、バースト配列を17含む改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターpDB17を得た。
実施例2において、pDB2の代わりにpDB9を用いた以外は実施例2と同様にして、バースト配列を17含む改変ポリヘドリンプロモーターを含むデスティネーションベクターpDB17を得た。
(実施例4)
<発現目的遺伝子のデスティネーションベクターへの組換え>
得られたpDB2、pDB3及びpDB5を用いて、シロイロナズナ由来β―グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子(インビトロジェン社、品番:11791-020)を常法に従いゲートウェイ・クローニング(登録商標、インビトロジェン社)により組換えた。
<発現目的遺伝子のデスティネーションベクターへの組換え>
得られたpDB2、pDB3及びpDB5を用いて、シロイロナズナ由来β―グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子(インビトロジェン社、品番:11791-020)を常法に従いゲートウェイ・クローニング(登録商標、インビトロジェン社)により組換えた。
<発現目的遺伝子のバクミド変異体への組換え>
上記によりGUS酵素遺伝子を組換えたpDB2、pDB3及びpDB5をBac−to−Bacシステム(登録商標、インビトロジェン社)を用いてAcMNPVバクミド(インビトロジェン社)に挿入して、改変ポリヘドリンプロモーターを有し、目的タンパク質としてGUS酵素を発現するバクミド変異体をそれぞれ構築した。
上記によりGUS酵素遺伝子を組換えたpDB2、pDB3及びpDB5をBac−to−Bacシステム(登録商標、インビトロジェン社)を用いてAcMNPVバクミド(インビトロジェン社)に挿入して、改変ポリヘドリンプロモーターを有し、目的タンパク質としてGUS酵素を発現するバクミド変異体をそれぞれ構築した。
<発現目的遺伝子の発現>
上記により得られたGUS酵素遺伝子を組換えたバクミド変異体を、それぞれTn細胞に感染させて、96時間培養した。細胞を超音波処理により破砕後、発現させたGUS酵素を遠心分離により精製した。
次いで発現させたGUS酵素の活性を、p−ニトロフェニル−β−グルクロニドを基質として37℃で反応させ、1分間に1μmolのp−ニトロフェノールを遊離する活性を1ユニットとして測定した。タンパク質濃度はブラッドフォード法を基礎とするプロテインアッセイキット(バイオラッド社製)を用いて、ウシ血清アルブミンを標準として測定した。
Tn細胞にバクミド変異体を感染させて、発現させたGUS酵素の活性を測定した結果を図1に示した。
上記により得られたGUS酵素遺伝子を組換えたバクミド変異体を、それぞれTn細胞に感染させて、96時間培養した。細胞を超音波処理により破砕後、発現させたGUS酵素を遠心分離により精製した。
次いで発現させたGUS酵素の活性を、p−ニトロフェニル−β−グルクロニドを基質として37℃で反応させ、1分間に1μmolのp−ニトロフェノールを遊離する活性を1ユニットとして測定した。タンパク質濃度はブラッドフォード法を基礎とするプロテインアッセイキット(バイオラッド社製)を用いて、ウシ血清アルブミンを標準として測定した。
Tn細胞にバクミド変異体を感染させて、発現させたGUS酵素の活性を測定した結果を図1に示した。
また、上記により得られたGUS酵素遺伝子を組換えたバクミド変異体を、それぞれSf細胞に感染させて、12時間、36時間、72時間、120時間培養した。発現したGUS酵素の活性を、上記と同様にして測定した結果を表3に示した。
(比較例3)
実施例4において、pDB2、pDB3及びpDB5の代わりに、上記で得られたpDB9及びpDB17を用いた以外は実施例4と同様にしてGUS酵素遺伝子を発現するバクミド変異体をそれぞれ作製した。得られたバクミド変異体を用いて実施例4と同様にして、GUS酵素を発現させ、発現させたGUS酵素の活性を測定した。
結果を図1及び表3に示した。
実施例4において、pDB2、pDB3及びpDB5の代わりに、上記で得られたpDB9及びpDB17を用いた以外は実施例4と同様にしてGUS酵素遺伝子を発現するバクミド変異体をそれぞれ作製した。得られたバクミド変異体を用いて実施例4と同様にして、GUS酵素を発現させ、発現させたGUS酵素の活性を測定した。
結果を図1及び表3に示した。
(比較例4)
pDB2、pDB3及びpDB5の代わりに、GUS酵素遺伝子を組換えたpDEST8を用いた以外は実施例4と同様にしてGUS酵素遺伝子を発現するバクミド変異体を作製した。得られたバクミド変異体を用いて実施例4と同様にして、GUS酵素を発現させ、発現させたGUS酵素の活性を測定した。尚、pDEST8はバースト配列を一つだけ有している。
結果を図1及び表3に示した。
pDB2、pDB3及びpDB5の代わりに、GUS酵素遺伝子を組換えたpDEST8を用いた以外は実施例4と同様にしてGUS酵素遺伝子を発現するバクミド変異体を作製した。得られたバクミド変異体を用いて実施例4と同様にして、GUS酵素を発現させ、発現させたGUS酵素の活性を測定した。尚、pDEST8はバースト配列を一つだけ有している。
結果を図1及び表3に示した。
図1から、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターを含む目的タンパク質発現バクミドを用いることで、効率よく目的タンパク質を製造できることが分かる。
また表3より、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターを含む目的タンパク質発現バクミドを用いることで、効率よく目的タンパク質を製造できることに加え、生産速度も向上することが分かる。また、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターを用いることで、目的タンパク質発現の立ち上がりが早くなることが分かる。尚、コントロールには野生型バクミドを感染させたSf細胞を用いた。
また表3より、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターを含む目的タンパク質発現バクミドを用いることで、効率よく目的タンパク質を製造できることに加え、生産速度も向上することが分かる。また、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターを用いることで、目的タンパク質発現の立ち上がりが早くなることが分かる。尚、コントロールには野生型バクミドを感染させたSf細胞を用いた。
(実施例5)
ヒト胃由来cDNAライブラリー(タカラバイオ社製)を鋳型とし、下記表4に示したPCRプライマーセット(配列番号6及び配列番号7)と、Takara ExTaq(タカラバイオ社製)を用いて、94℃ 3分の後、94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 1分30秒を35サイクル、72℃ 5分、の条件でPCRを行い、ヒト−α1,4−N−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼ(α4GnT)遺伝子を含むポリヌクレオチドを得た。
上記で得られたポリヌクレオチドとpBlueBacHis2-GFPuv(Biotechnol. Prog., 1999, Vol.15, p283-286)とを、制限酵素KpnIとEcoRIでそれぞれ処理し、DNA Ligation Kitを用いてライゲーション処理を行い、GFPuv−α4GnT融合遺伝子を含むプラスミドを得た。
ヒト胃由来cDNAライブラリー(タカラバイオ社製)を鋳型とし、下記表4に示したPCRプライマーセット(配列番号6及び配列番号7)と、Takara ExTaq(タカラバイオ社製)を用いて、94℃ 3分の後、94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 1分30秒を35サイクル、72℃ 5分、の条件でPCRを行い、ヒト−α1,4−N−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼ(α4GnT)遺伝子を含むポリヌクレオチドを得た。
上記で得られたポリヌクレオチドとpBlueBacHis2-GFPuv(Biotechnol. Prog., 1999, Vol.15, p283-286)とを、制限酵素KpnIとEcoRIでそれぞれ処理し、DNA Ligation Kitを用いてライゲーション処理を行い、GFPuv−α4GnT融合遺伝子を含むプラスミドを得た。
得られたプラスミドを鋳型とし、下記表4に示したPCRプライマーセット(配列番号8及び配列番号7)と、Takara ExTaqを用いて、94℃ 3分の後、94℃ 30秒、62℃ 40秒、72℃ 1分30秒を30サイクル、72℃ 5分、の条件でPCRを行い、bx−GFPuv−α4GnT融合遺伝子を含むポリヌクレオチドを得た。このポリヌクレオチドをTOPOクローニングによりpENTR/D−TOPOベクター(インビトロジェン社製)に挿入した。
そして、上記プラスミドに含まれるbx−GFPuv−α4GnT融合遺伝子を常法に従ってゲートウェイ・クローニングによりpDB5に組換えた。得られたpDB5を特開2004−173507号公報に記載の方法によって調製したBmNPVバクミドにBac−to−Bacシステムを用いて組み込むことにより、bx−GFPuv−α4GnT融合遺伝子を発現するバクミド変異体を作製した。
得られたバクミド1μgをカイコガの幼虫(四齢)へ注射器で導入した。7日後、常法によりカイコガの幼虫の体液から発現したタンパク質を回収し、遠心分離にて不溶物を除去した。このタンパク質溶液をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、常法に従いタンパク質を分離した。このゲルに紫外線を照射することによりbx−GFPuv−α4GnT融合タンパク質に含まれるGFPuvタンパク質を励起し、蛍光を測定した。
結果を図2に示した。
結果を図2に示した。
(比較例5)
pDB5の代わりにpDEST8を用いた以外は実施例5と同様にしてbx−GFPuv−α4GnT融合遺伝子を発現するバクミド変異体を作製した。このバクミド変異体を用いた以外は実施例5と同様にして、bx−GFPuv−α4GnT融合タンパク質を発現させ、発現したbx−GFPuv−α4GnT融合タンパク質を蛍光により検出した。
結果を図2に示した。
pDB5の代わりにpDEST8を用いた以外は実施例5と同様にしてbx−GFPuv−α4GnT融合遺伝子を発現するバクミド変異体を作製した。このバクミド変異体を用いた以外は実施例5と同様にして、bx−GFPuv−α4GnT融合タンパク質を発現させ、発現したbx−GFPuv−α4GnT融合タンパク質を蛍光により検出した。
結果を図2に示した。
図2から、本発明の改変ポリヘドリンプロモーターを含む目的タンパク質発現バクミドを用いることで、効率よく目的タンパク質を製造できることが分かる。
また、pDB5の代わりにpDB17を用いた以外は実施例5と同様にしてbx−GFPuv−α4GnT融合遺伝子を発現するバクミド変異体を作製した。このバクミド変異体を用いた以外は実施例5と同様にして、bx−GFPuv−α4GnT融合タンパク質を発現させたところ、融合タンパク質に由来する蛍光はほとんど検出できなかった。
Claims (5)
- バースト配列を2以上8以下含むバキュロウイルス遺伝子発現系用の改変ポリヘドリンプロモーター。
- 前記バースト配列が配列番号1のポリヌクレオチドである請求項1に記載の改変ポリヘドリンプロモーター。
- 請求項1又は請求項2に記載の改変ポリヘドリンプロモーターと、バキュロウイルスDNAと、miniFレプリコンと、トランスポゾンの付着部位と、を含むバクミド変異体。
- 前記バキュロウイルスDNAは、BmNPV DNA又はAcMNPV DNAである請求項3に記載のバクミド変異体。
- バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法であって、
大腸菌中で、請求項3又は請求項4に記載のバクミド変異体と、目的タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、トランスポゼースとにより、目的タンパク質発現バクミドを得る工程と、
前記目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入する工程と、
を含む目的タンパク質の製造方法。
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JP2015533841A (ja) * | 2012-10-28 | 2015-11-26 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | 強靭なt細胞用のpr13.5プロモータ及び抗体応答 |
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-
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- 2007-06-11 JP JP2007154456A patent/JP2008301792A/ja active Pending
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