JP2008272297A - Porous body containing apatite/collagen composite fiber and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は人工骨材、細胞の足場材等に好適なアパタイト／コラーゲン複合体繊維を含む多孔体（以下、単に「アパタイト／コラーゲン多孔体」という）であって、概略板状の気孔を有するもの及びその製造方法に関する。 The present invention is a porous body (hereinafter simply referred to as “apatite / collagen porous body”) containing apatite / collagen composite fibers suitable for artificial bones, cell scaffolds, etc., and has substantially plate-like pores. And a manufacturing method thereof.
アパタイトからなる人工骨は自家骨に対する親和性を有し、自家骨に直接結合することができるため、その有用性が評価されており、整形外科、脳神経外科、形成外科、口腔外科等で臨床応用されている。アパタイトとコラーゲンからなる多孔体の機械的強度と生体親和性はほぼ反比例の関係にあり、機械的強度を大きくするほど生体親和性は小さくなるという傾向がある。このため、用途に応じたバランスでこれらの特性を有するように多孔体を設計したいという要望がある。アパタイトとコラーゲンからなる多孔体の特性は気孔率にある程度依存し、多孔体の気孔率は、原料中の液体（水、リン酸水溶液等）の割合等により制御可能である。しかし人工骨の用途は多岐に渡ってきており、望ましい特性の違いも大きくなっているため、気孔率の制御のみでは十分とは言えない。 Artificial bone made of apatite has affinity for autologous bone and can be directly bonded to autologous bone, so its usefulness has been evaluated, and clinical application in orthopedics, neurosurgery, plastic surgery, oral surgery, etc. Has been. The mechanical strength and biocompatibility of a porous body made of apatite and collagen are in an inversely proportional relationship, and the biocompatibility tends to decrease as the mechanical strength increases. For this reason, there is a demand to design a porous body so as to have these characteristics in a balance according to the application. The characteristics of the porous body made of apatite and collagen depend to some extent on the porosity, and the porosity of the porous body can be controlled by the ratio of the liquid (water, aqueous phosphoric acid solution, etc.) in the raw material. However, artificial bones have been used for a wide variety of purposes, and the difference in desirable characteristics has increased. Therefore, it cannot be said that controlling the porosity alone is sufficient.
機械的強度や生体親和性は、アパタイトとコラーゲンからなる多孔体の気孔率のみならず、平均気孔径にも依存することが知られている。例えば多孔体の平均気孔径が大きいほど、生体に埋入したときに気孔内に体液、組織等が入り込み易いので、多孔体は大きな生体親和性を有すると言える。平均気孔径はアパタイトとコラーゲンからなる多孔体の特性に大きな影響を与える因子であり、多孔体が所望の大きさの平均気孔径を有するようにしたいという要望は、近年一層高まってきている。 It is known that mechanical strength and biocompatibility depend not only on the porosity of a porous body made of apatite and collagen, but also on the average pore diameter. For example, it can be said that the larger the average pore diameter of the porous body, the easier the body fluid, tissue, etc. enter into the pores when it is embedded in the living body. The average pore diameter is a factor that greatly affects the properties of a porous body made of apatite and collagen. In recent years, there is a growing demand for the porous body to have a desired average pore diameter.
本発明者らは、以前、アパタイト／コラーゲン複合体繊維と、コラーゲンと、水とを含む分散物をゲル化し、ゲル体を凍結及び乾燥した後、多孔質体中のコラーゲンを架橋するアパタイト／コラーゲン多孔体の製造方法において、ゲル体の凝固時間により、前記アパタイト／コラーゲン多孔体の平均気孔径を制御する方法を開示した（特許文献１）。この方法によると、ゲル体の凍結環境温度を調整するだけで、得られるアパタイト／コラーゲン多孔体の平均気孔径を制御可能であるので、所望の機械的強度及び生体親和性を有するアパタイト／コラーゲン多孔体を簡便に得ることができる。 In the past, the present inventors have gelled a dispersion containing apatite / collagen composite fiber, collagen, and water, and after freezing and drying the gel body, apatite / collagen that crosslinks the collagen in the porous body. In the method for producing a porous body, a method for controlling the average pore diameter of the apatite / collagen porous body by the coagulation time of the gel body has been disclosed (Patent Document 1). According to this method, it is possible to control the average pore diameter of the obtained apatite / collagen porous body simply by adjusting the freezing environment temperature of the gel body, so that the apatite / collagen porous material having the desired mechanical strength and biocompatibility is obtained. The body can be easily obtained.
しかし、最近ではアパタイト／コラーゲン多孔体の気孔率や平均気孔径に加えて、気孔の形状も骨形成に影響することが分かってきた。つまり、骨形成材料が入り込み易い形状の気孔を有するアパタイト／コラーゲン多孔体を人工骨材として用いれば、骨形成は一層促進されると考えられる。ところが、骨形成に寄与する因子には組織や血管等、細長い形状のものもあるのに対し、特許文献１をはじめ、従来の方法によると、いずれも球状の気孔が形成される。球状でない気孔を有するアパタイト／コラーゲン多孔体の製造方法は、未だ知られていない。 Recently, however, it has been found that the shape of pores affects bone formation in addition to the porosity and average pore diameter of apatite / collagen porous bodies. That is, if an apatite / collagen porous body having pores in a shape in which a bone forming material can easily enter is used as an artificial bone material, it is considered that bone formation is further promoted. However, while factors that contribute to bone formation include elongated shapes such as tissues and blood vessels, according to conventional methods including Patent Document 1, spherical pores are all formed. A method for producing an apatite / collagen porous body having non-spherical pores is not yet known.
従って本発明の目的は、概略板状の気孔を有するアパタイト／コラーゲン多孔体及びその製造方法を提供することである。 Accordingly, an object of the present invention is to provide an apatite / collagen porous body having substantially plate-like pores and a method for producing the same.
上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者らは、予め水蒸気を付着させたアパタイト／コラーゲン複合体繊維及びコラーゲンを含むゲル体を凍結及び乾燥し、得られた多孔質体を架橋すると、概略板状の気孔を有するアパタイト／コラーゲン多孔体が得られることを発見し、本発明に想到した。 As a result of diligent research in view of the above-mentioned object, the inventors of the present invention have roughly described that when a gel body containing apatite / collagen composite fiber and collagen preliminarily attached with water vapor is frozen and dried, and the resulting porous body is crosslinked. The inventors have discovered that an apatite / collagen porous body having plate-like pores can be obtained, and have arrived at the present invention.
すなわちアパタイト／コラーゲン複合体繊維を含む多孔体を製造する本発明の方法は、アパタイト／コラーゲン複合体繊維と、コラーゲンと、水とを含む分散物をゲル化する工程と、得られたゲル体を凍結及び乾燥することにより多孔質体とする工程と、前記多孔質体中のコラーゲンを架橋する工程とを有し、前記ゲル化する工程に先立って、前記アパタイト／コラーゲン複合体繊維に水蒸気を付着させる工程を有することを特徴とする。 That is, the method of the present invention for producing a porous body containing an apatite / collagen composite fiber includes a step of gelling a dispersion containing an apatite / collagen composite fiber, collagen and water, and the obtained gel body. It has a step of freezing and drying to form a porous body and a step of cross-linking collagen in the porous body. Prior to the gelling step, water vapor is attached to the apatite / collagen composite fiber. It has the process to make it feature.
50〜95％RHの湿度でコラーゲンの変性温度未満の温度の雰囲気中に前記アパタイト／コラーゲン複合体繊維を12時間以上保持することによって、前記アパタイト／コラーゲン複合体繊維に水蒸気を付着させるのが好ましい。 It is preferable to attach water vapor to the apatite / collagen composite fiber by holding the apatite / collagen composite fiber for 12 hours or more in an atmosphere having a humidity of 50 to 95% RH and a temperature lower than the denaturation temperature of collagen. .
前記水蒸気を付着させたアパタイト／コラーゲン複合体繊維の含水量は５〜11質量％とするのが好ましい。 The water content of the apatite / collagen composite fiber to which the water vapor is attached is preferably 5 to 11% by mass.
本発明のアパタイト／コラーゲン複合体繊維を含む多孔体は、アパタイト／コラーゲン複合体繊維が集合してなる複数の繊維層からなり、前記繊維層の間に概略板状の気孔が形成されていることを特徴とする。 The porous body containing the apatite / collagen composite fiber of the present invention is composed of a plurality of fiber layers formed by aggregating apatite / collagen composite fibers, and substantially plate-like pores are formed between the fiber layers. It is characterized by.
本発明の製造方法により、概略板状の気孔を有するアパタイト／コラーゲン多孔体を得ることができる。このようなアパタイト／コラーゲン多孔体は、人工骨材、細胞の足場材等に好適である。 By the production method of the present invention, an apatite / collagen porous body having substantially plate-like pores can be obtained. Such porous apatite / collagen is suitable for artificial bones, cell scaffolds, and the like.
[1] アパタイト／コラーゲン複合体繊維を含む多孔体の製造方法
(1) アパタイト／コラーゲン複合体繊維
(a) 原料
アパタイト／コラーゲン複合体繊維は、コラーゲン、リン酸又はその塩、カルシウム塩を原料とする。コラーゲンとしては特に限定されず、動物等から抽出したものを使用できる。なお由来する動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されない。一般的には哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ウサギ及びネズミ）や鳥類（例えばニワトリ）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンが使用できる。また魚類（例えばタラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ及びサメ）の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を使用してもよい。なおコラーゲンの抽出方法も特に限定されず、一般的な抽出方法によることができる。また動物組織から抽出したものではなく、遺伝子組み替え技術によって得られたコラーゲンを使用してもよい。
[1] Method for producing porous body including apatite / collagen composite fiber
(1) Apatite / collagen composite fiber
(a) Raw material The apatite / collagen composite fiber is made from collagen, phosphoric acid or a salt thereof, and calcium salt as a raw material. It does not specifically limit as collagen, What was extracted from the animal etc. can be used. The species, tissue site, age, etc. of the derived animal are not particularly limited. Generally, collagen obtained from the skin, bone, cartilage, tendon, organ, etc. of mammals (eg, cows, pigs, horses, rabbits and mice) and birds (eg, chickens) can be used. Collagen-like proteins obtained from the skin, bones, cartilage, fins, scales, organs, etc. of fish (eg, cod, flounder, flounder, salmon, trout, tuna, mackerel, Thailand, sardine and shark) may also be used. The method for extracting collagen is not particularly limited, and can be based on a general extraction method. In addition, collagen obtained by gene recombination techniques may be used instead of those extracted from animal tissues.
リン酸又はその塩（以下単に「リン酸（塩）」という）の例としてはリン酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム及びリン酸二水素カリウムが挙げられる。またカルシウム塩の例としては炭酸カルシウム、酢酸カルシウム及び水酸化カルシウムが挙げられる。リン酸塩及びカルシウム塩はそれぞれ均一な水溶液又は懸濁液の状態で添加するのが好ましい。 Examples of phosphoric acid or a salt thereof (hereinafter simply referred to as “phosphoric acid (salt)”) include phosphoric acid, disodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and potassium dihydrogen phosphate. . Examples of calcium salts include calcium carbonate, calcium acetate and calcium hydroxide. The phosphate and calcium salt are preferably added in the form of a uniform aqueous solution or suspension, respectively.
使用するアパタイト原料［リン酸（塩）及びカルシウム塩］とコラーゲンとの質量比により、生成物中のアパタイト／コラーゲンの質量比を制御できる。このため使用するアパタイト原料とコラーゲンとの質量比は、目的とするアパタイト／コラーゲン複合体繊維の組成比により適宜決定する。アパタイト／コラーゲン複合体繊維中のアパタイト／コラーゲンの比率は９／１〜６／４（質量比）とするのが好ましく、例えば８／２とする。 The mass ratio of apatite / collagen in the product can be controlled by the mass ratio of the apatite raw material [phosphoric acid (salt) and calcium salt] to be used and collagen. For this reason, the mass ratio of the apatite raw material to be used and collagen is appropriately determined depending on the composition ratio of the target apatite / collagen composite fiber. The ratio of apatite / collagen in the apatite / collagen composite fiber is preferably 9/1 to 6/4 (mass ratio), for example, 8/2.
(b) 溶液の調製
リン酸（塩）水溶液及びカルシウム塩水溶液を調製する。リン酸（塩）水溶液及びカルシウム塩水溶液の濃度は、リン酸（塩）とカルシウム塩とが所望の配合比にあれば特に限定されないが、後述する滴下操作の都合上、リン酸（塩）水溶液の濃度を50〜250 ｍM程度とし、カルシウム塩水溶液の濃度を200〜600 mM程度とするのが好ましい。コラーゲンは一般的にはリン酸水溶液の状態で、前述のリン酸（塩）水溶液に加える。コラーゲンのリン酸水溶液としては、コラーゲンの濃度が約0.5〜１質量％、リン酸の濃度が10〜30 mM程度のものを使用する。実用的にはコラーゲンの濃度が0.8〜0.9質量％（例えば0.85質量％）、リン酸の濃度が15〜25 mM（例えば20 mM）程度である。
(b) Preparation of solution Prepare phosphoric acid (salt) aqueous solution and calcium salt aqueous solution. The concentration of the phosphoric acid (salt) aqueous solution and the calcium salt aqueous solution is not particularly limited as long as the phosphoric acid (salt) and the calcium salt are in a desired blending ratio, but for the convenience of the dropping operation described later, the phosphoric acid (salt) aqueous solution. Preferably, the concentration of the solution is about 50 to 250 mM, and the concentration of the calcium salt aqueous solution is about 200 to 600 mM. Collagen is generally added to the aforementioned phosphoric acid (salt) aqueous solution in the form of an aqueous phosphoric acid solution. As the phosphoric acid aqueous solution of collagen, one having a collagen concentration of about 0.5 to 1% by mass and a phosphoric acid concentration of about 10 to 30 mM is used. Practically, the collagen concentration is about 0.8 to 0.9 mass% (for example, 0.85 mass%), and the phosphoric acid concentration is about 15 to 25 mM (for example, 20 mM).
(c) アパタイト／コラーゲン複合体繊維の製造
添加すべきカルシウム塩水溶液の量に近い量（好ましくは添加すべきカルシウム塩水溶液の0.5〜２倍、より好ましくは0.8〜1.2倍）の水を予め反応容器に入れ、40℃程度に加熱しておく。そこに、コラーゲンを含有するリン酸（塩）水溶液とカルシウム塩水溶液を同時に滴下する。これらの滴下条件によって、合成するアパタイト／コラーゲン複合体繊維の長さを制御できる。滴下速度は10〜50 ml/min程度とするのが好ましく、反応溶液を50〜300 rpm程度で撹拌するのが好ましい。滴下中、反応溶液中のカルシウムイオン濃度を3.75 mM以下、かつリン酸イオン濃度を2.25 mM以下に維持するのが好ましい。これにより、反応溶液のpHは8.9〜9.1に保たれる。カルシウムイオン及び／又はリン酸イオンの濃度が上記範囲を超えると、複合体の自己組織化が妨げられる。本明細書中「自己組織化」とは、コラーゲン繊維に沿って、ハイドロキシアパタイト（アパタイト構造を有するリン酸カルシウム）が生体骨特有の配向をしていること、すなわちハイドロキシアパタイトのC軸がコラーゲン繊維に沿うように配向していることを意味する。以上の滴下条件により、アパタイト／コラーゲン複合体繊維の長さは、多孔体の原料として好適な１mm以下となる。またアパタイト／コラーゲン複合体繊維は、自己組織化したものとなる。
(c) Production of apatite / collagen composite fiber An amount of water close to the amount of calcium salt aqueous solution to be added (preferably 0.5 to 2 times, more preferably 0.8 to 1.2 times that of the calcium salt aqueous solution to be added) is reacted in advance. Place in a container and heat to about 40 ° C. Thereto, a phosphoric acid (salt) aqueous solution containing collagen and a calcium salt aqueous solution are dropped simultaneously. The length of the apatite / collagen composite fiber to be synthesized can be controlled by these dropping conditions. The dropping speed is preferably about 10 to 50 ml / min, and the reaction solution is preferably stirred at about 50 to 300 rpm. During the dropping, it is preferable to maintain the calcium ion concentration in the reaction solution at 3.75 mM or less and the phosphate ion concentration at 2.25 mM or less. Thereby, the pH of the reaction solution is maintained at 8.9 to 9.1. When the concentration of calcium ions and / or phosphate ions exceeds the above range, self-assembly of the complex is prevented. In this specification, “self-organization” means that hydroxyapatite (calcium phosphate having an apatite structure) is oriented along the collagen fiber, that is, the C axis of hydroxyapatite is along the collagen fiber. It means that it is oriented. By the above dripping conditions, the length of the apatite / collagen composite fiber becomes 1 mm or less suitable as a raw material for the porous body. The apatite / collagen composite fiber is self-organized.
滴下終了後、スラリー状になった水とアパタイト／コラーゲン複合体繊維との混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥は、−10℃以下に凍結した状態で真空引きし、急速に乾燥させることにより行うことができる。 After completion of the dropwise addition, the slurry-like mixture of water and apatite / collagen composite fiber is freeze-dried. Freeze-drying can be performed by evacuating in a state of being frozen at −10 ° C. or lower and drying rapidly.
(2) アパタイト／コラーゲン複合体繊維への水蒸気の付着
水蒸気を含む雰囲気中にアパタイト／コラーゲン複合体繊維を保持することによって、アパタイト／コラーゲン複合体繊維に水蒸気を付着させる。液体の水ではなく、水蒸気をアパタイト／コラーゲン複合体繊維に付着させることによって、表面に過剰な水を付着させることなく、アパタイト／コラーゲン複合体繊維が均一に水を含有するようにすることができる。アパタイト／コラーゲン複合体繊維に付着した水蒸気は、後述するゲル体の凍結の工程において氷となるが、この氷の核成長が、得られるアパタイト／コラーゲン多孔体の気孔形状に関係すると考えられる。アパタイト／コラーゲン複合体繊維に付着した水が偏在していると、凍結の工程において、氷の核成長によってゲル体の組織が破壊されてしまうため、得られるアパタイト／コラーゲン多孔体の強度が低くなってしまう。
(2) Adhesion of water vapor to apatite / collagen composite fiber Water vapor is attached to the apatite / collagen composite fiber by holding the apatite / collagen composite fiber in an atmosphere containing water vapor. By attaching water vapor to the apatite / collagen composite fiber instead of liquid water, the apatite / collagen composite fiber can uniformly contain water without attaching excessive water to the surface. . The water vapor adhering to the apatite / collagen composite fiber becomes ice in the step of freezing the gel, which will be described later, and this ice nucleus growth is considered to be related to the pore shape of the resulting apatite / collagen porous body. If the water adhering to the apatite / collagen composite fiber is unevenly distributed, the structure of the gel body will be destroyed by ice nucleation in the freezing process, so the strength of the resulting apatite / collagen porous body will be low. End up.
アパタイト／コラーゲン複合体繊維を一定の温度と湿度に保つには、例えば恒温恒湿装置を用いるのが好ましい。保持する雰囲気が高温であるほど、効率よく繊維に水蒸気を付着させることができるが、アパタイト／コラーゲン複合体繊維に含まれるコラーゲンの変性を防ぐ観点から、コラーゲンの変性温度未満の温度に保持するのが好ましく、変性温度より5〜15℃低い温度に保持するのがより好ましい。例えばアパタイト／コラーゲン複合体繊維に含まれるコラーゲンの変性温度が36〜37℃の場合、温度を21〜32℃にした恒温恒湿度装置内に保持するのが好ましい。保持する温度にもよるが、効率よく水蒸気を付着させるためには、恒温恒湿装置内の湿度を50〜99％にするのが好ましく、50〜95％にするのがさらに好ましい。 In order to keep the apatite / collagen composite fiber at a constant temperature and humidity, it is preferable to use, for example, a constant temperature and humidity device. The higher the atmosphere is, the more efficiently water vapor can be attached to the fiber. However, from the viewpoint of preventing the denaturation of collagen contained in the apatite / collagen composite fiber, the temperature is kept below the denaturation temperature of collagen. It is more preferable to keep the temperature 5 to 15 ° C. lower than the denaturation temperature. For example, when the denaturation temperature of the collagen contained in the apatite / collagen composite fiber is 36 to 37 ° C., it is preferably kept in a constant temperature and humidity apparatus at a temperature of 21 to 32 ° C. Although depending on the temperature to be maintained, in order to efficiently attach water vapor, the humidity in the thermostatic chamber is preferably 50 to 99%, and more preferably 50 to 95%.
温度や湿度にもよるが、水蒸気を含む雰囲気中にアパタイト／コラーゲン複合体繊維を保持する時間は12時間〜15日間とするのが好ましく、１日〜10日とするのがより好ましい。保持時間を12時間未満とすると、十分な量の水蒸気をアパタイト／コラーゲン複合体繊維に付着させにくい。保持時間を15日間超としても、水蒸気の付着量はほとんど変化しない。 Although depending on the temperature and humidity, the time for holding the apatite / collagen composite fiber in the atmosphere containing water vapor is preferably 12 hours to 15 days, more preferably 1 day to 10 days. When the holding time is less than 12 hours, it is difficult to attach a sufficient amount of water vapor to the apatite / collagen composite fiber. Even when the holding time is longer than 15 days, the amount of water vapor hardly changes.
水蒸気を付着させたアパタイト／コラーゲン複合体繊維の含水量は、アパタイト／コラーゲン複合体繊維の乾燥重量の５〜11質量％とするのが好ましい。含水量がアパタイト／コラーゲン複合体繊維の乾燥重量の５％未満であると、得られるアパタイト／コラーゲン多孔体の気孔が概略板状になり難い。含水量を11質量％超とするのは、実質的に困難である。アパタイト／コラーゲン複合体繊維は、水蒸気の付着前から、コラーゲンの結晶水に由来する３質量％程度の水を含有している。このためアパタイト／コラーゲン複合体繊維の含水量を５〜11質量％とするためには、２〜８質量％の水蒸気を付着させればよい。含水量は、示差熱熱重量同時測定装置（TG-DTA）中でアパタイト／コラーゲン複合体繊維を加熱乾燥し蒸発する水分量を測定することにより求めることができる。 The water content of the apatite / collagen composite fiber to which water vapor is attached is preferably 5 to 11% by mass of the dry weight of the apatite / collagen composite fiber. When the water content is less than 5% of the dry weight of the apatite / collagen composite fiber, the pores of the obtained apatite / collagen porous body are hardly formed into a plate shape. It is substantially difficult to make the water content more than 11% by mass. The apatite / collagen composite fiber contains about 3% by mass of water derived from collagen crystallization water before the adhesion of water vapor. For this reason, in order to set the water content of the apatite / collagen composite fiber to 5 to 11% by mass, 2 to 8% by mass of water vapor may be attached. The water content can be determined by measuring the amount of water that evaporates and heats the apatite / collagen composite fiber in a differential thermothermal gravimetric simultaneous measurement device (TG-DTA).
(3) アパタイト／コラーゲン複合体繊維を含む分散物の調製
水蒸気を付着させたアパタイト／コラーゲン複合体繊維に水、リン酸水溶液等の液体を加えて撹拌し、ペースト状の分散物を調製する。この分散物が含有する液体の量は、80〜99体積％とするのが好ましく、90〜97体積％とするのがより好ましい。換言すると、複合体繊維の量は、1〜20体積％とするのが好ましく、3〜10体積％とするのがより好ましい。アパタイト／コラーゲン複合体繊維には予め水蒸気を付着させてあるので、分散物が含有する液体の量を所望の値にするには、アパタイト／コラーゲン複合体繊維に付着させた水蒸気の量を差し引いて、加える液体の量を決める必要がある。
(3) Preparation of Dispersion Containing Apatite / Collagen Composite Fiber A liquid such as water or phosphoric acid aqueous solution is added to the apatite / collagen composite fiber to which water vapor is adhered and stirred to prepare a paste-like dispersion. The amount of the liquid contained in the dispersion is preferably 80 to 99% by volume, and more preferably 90 to 97% by volume. In other words, the amount of the composite fiber is preferably 1 to 20% by volume, and more preferably 3 to 10% by volume. Since water vapor is preliminarily attached to the apatite / collagen composite fiber, in order to obtain the desired amount of liquid contained in the dispersion, the amount of water vapor attached to the apatite / collagen composite fiber is subtracted. It is necessary to determine the amount of liquid to be added.
製造する多孔体の気孔率P（％）は分散物中のアパタイト／コラーゲン複合体繊維と液体との体積比に依存し、下記式(1)：
P = Y / (X+Y)×100 ・・・ (1)
［ただし、Xは分散物中のアパタイト／コラーゲン複合体繊維の体積、Yは分散物中の液体（アパタイト／コラーゲン複合体繊維に付着した水蒸気が液化したものを含む）の体積を示す。］により表される。このため加える液体の量によって、多孔体の気孔率Pを制御することができる。液体を加えた後で分散物を撹拌することにより、アパタイト／コラーゲン複合体繊維が切断され繊維長の分布幅が大きくなるため、製造する多孔体の強度が向上する。
The porosity P (%) of the porous material to be produced depends on the volume ratio of the apatite / collagen composite fiber and the liquid in the dispersion, and the following formula (1):
P = Y / (X + Y) × 100 (1)
[Wherein X represents the volume of the apatite / collagen composite fiber in the dispersion, and Y represents the volume of the liquid in the dispersion (including the liquid liquefied water vapor attached to the apatite / collagen composite fiber). ]. Therefore, the porosity P of the porous body can be controlled by the amount of liquid added. By stirring the dispersion after adding the liquid, the apatite / collagen composite fiber is cut and the fiber length distribution width is increased, so that the strength of the porous body to be produced is improved.
複合体の分散物にバインダーとなるコラーゲンを加え、さらに撹拌する。コラーゲンの添加量は、アパタイト／コラーゲン複合体繊維100質量％に対して、１〜10質量％とするのが好ましく、３〜６質量％とするのがより好ましい。複合体の場合と同様に、コラーゲンはリン酸水溶液の状態で加えるのが好ましい。コラーゲンのリン酸水溶液の濃度等は特に限定されないが、実用的にはコラーゲンの濃度が0.8〜0.9質量％（例えば0.85質量％）、リン酸の濃度が15〜25 mM（例えば20 mM）である。 Collagen as a binder is added to the dispersion of the composite and further stirred. The added amount of collagen is preferably 1 to 10% by mass, more preferably 3 to 6% by mass with respect to 100% by mass of the apatite / collagen composite fiber. As in the case of the complex, the collagen is preferably added in the form of an aqueous phosphoric acid solution. The concentration of the phosphoric acid aqueous solution of collagen is not particularly limited, but practically the collagen concentration is 0.8 to 0.9 mass% (for example, 0.85 mass%), and the phosphoric acid concentration is 15 to 25 mM (for example, 20 mM). .
(4) 分散物のゲル化
コラーゲンのリン酸（塩）水溶液の添加により分散物は酸性となっているので、これにpHが７程度となるまで水酸化ナトリウム溶液を加える。分散物のpHを6.8〜7.6とするのが好ましく、7.0〜7.4とするのがより好ましい。分散物のpHを6.8〜7.6とすることにより、バインダーとして加えたコラーゲンの繊維化を促進することができる。
(4) Gelation of the dispersion The dispersion becomes acidic due to the addition of an aqueous solution of phosphoric acid (salt) of collagen. To this, a sodium hydroxide solution is added until the pH reaches about 7. The pH of the dispersion is preferably 6.8 to 7.6, more preferably 7.0 to 7.4. By setting the pH of the dispersion to 6.8 to 7.6, the fiberization of collagen added as a binder can be promoted.
分散物にリン酸緩衝溶液（PBS）の2.5〜10倍程度の濃縮液を加えて撹拌し、イオン強度を0.2〜0.8に調整する。より好ましいイオン強度は、PBSと同程度のイオン強度（0.2〜0.8程度）である。分散物のイオン強度を大きくすることにより、バインダーとして加えたコラーゲンの繊維化を促進することができる。 A concentrated solution of about 2.5 to 10 times the phosphate buffer solution (PBS) is added to the dispersion and stirred to adjust the ionic strength to 0.2 to 0.8. A more preferable ionic strength is the same ionic strength as PBS (about 0.2 to 0.8). By increasing the ionic strength of the dispersion, it is possible to promote the fiberization of collagen added as a binder.
分散物を成形型に入れた後、35〜43℃の温度に保持することにより分散物をゲル化させる。保持温度は35〜40℃とするのが好ましい。分散物を十分にゲル化させるため、保持する時間は0.5〜3.5時間とするのが好ましく、１〜３時間とするのがより好ましい。分散物の温度を35〜43℃に保持することにより、バインダーとして加えたコラーゲンが繊維化し、分散物がゲル状となる。分散物がゲル化することにより、アパタイト／コラーゲン複合体繊維が分散物中で沈降するのを防ぐことができるため、均一な多孔質体を製造することが可能となる。ゲル化処理を施した分散物はゼリー状になる。 After putting the dispersion in a mold, the dispersion is gelled by maintaining the temperature at 35 to 43 ° C. The holding temperature is preferably 35 to 40 ° C. In order to sufficiently gel the dispersion, the holding time is preferably 0.5 to 3.5 hours, and more preferably 1 to 3 hours. By maintaining the temperature of the dispersion at 35 to 43 ° C., collagen added as a binder is fibrillated, and the dispersion becomes a gel. Since the dispersion is gelled, it is possible to prevent the apatite / collagen composite fibers from being settled in the dispersion, so that a uniform porous body can be produced. The dispersion subjected to the gelation treatment becomes a jelly.
(5) ゲル体の凍結及び乾燥
アパタイト／コラーゲン複合体繊維を含むゲル体を凍結器に入れる等して凍結させる。目的とするアパタイト／コラーゲン多孔体の平均気孔径は、ゲル体の凍結に要する時間に依存する。凍結器内の温度は−100〜０℃とするのが好ましく、−100〜−10℃とするのがより好ましく、−80〜−20℃とするのが特に好ましい。−100℃未満とすると、得られるアパタイト／コラーゲン多孔体の平均気孔径が小さ過ぎる。０℃超とすると、凍結しないか凍結に長時間を要する上、多孔体の平均気孔径が大き過ぎる。ゲル体の凍結の工程において、アパタイト／コラーゲン複合体繊維に付着させた水蒸気からなる氷が生成し、この氷の核成長によって、得られるアパタイト／コラーゲン多孔体の気孔は概略板状になると考えられる。
(5) Freezing and drying of the gel body The gel body containing the apatite / collagen composite fiber is frozen by placing it in a freezer. The average pore size of the target apatite / collagen porous body depends on the time required for freezing the gel body. The temperature in the freezer is preferably -100 to 0 ° C, more preferably -100 to -10 ° C, and particularly preferably -80 to -20 ° C. When the temperature is lower than −100 ° C., the average pore diameter of the obtained apatite / collagen porous body is too small. If it exceeds 0 ° C., it will not freeze or it will take a long time to freeze, and the average pore size of the porous body will be too large. In the freezing process of the gel body, ice composed of water vapor adhered to the apatite / collagen composite fiber is generated, and the pores of the resulting apatite / collagen porous body are considered to be approximately plate-like by the ice nucleus growth. .
凝固したゲル体を乾燥し、多孔質体とする。ゲル体の乾燥は、凍結乾燥によるのが好ましい。つまり、アパタイト／コラーゲン複合体繊維の場合と同様に、−10℃以下に凍結した状態で真空引きし、急速に乾燥させることにより行う。凍結乾燥は分散物が十分に乾燥するまで行えばよく時間は特に制限されないが、一般的には24〜72時間程度である。 The solidified gel body is dried to make a porous body. The gel body is preferably dried by freeze-drying. That is, as in the case of the apatite / collagen composite fiber, it is carried out by evacuating and rapidly drying it in a frozen state at −10 ° C. or lower. Freeze-drying may be performed until the dispersion is sufficiently dried, and the time is not particularly limited, but is generally about 24 to 72 hours.
(6) コラーゲンの架橋
コラーゲンの架橋は物理的架橋（γ線、紫外線、熱脱水、電子線等を用いる方法）、化学的架橋（架橋剤や縮合剤を用いる方法）のいずれを用いてもよい。化学的架橋の場合、架橋剤の溶液に多孔質体を浸すことにより、多孔質体中のコラーゲンを架橋する。架橋剤としては、アルデヒド系架橋剤（例えばグルタールアルデヒド及びホルムアルデヒド）、イソシアネート系架橋剤（ヘキサメチレンジイソシアネート等）、カルポジド系架橋剤（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩等）、ポリエポキシ系架橋剤（エチレングリコールジエチルエーテル等）、トランスグルタミナーゼ等が挙げられる。これらの架橋剤のうち、架橋度の制御し易さや、得られる多孔体の生体適合性の面からグルタールアルデヒドが特に好ましい。
(6) Collagen cross-linking Collagen cross-linking may be either physical cross-linking (method using γ rays, ultraviolet rays, thermal dehydration, electron beam, etc.) or chemical cross-linking (method using cross-linking agent or condensing agent). . In the case of chemical crosslinking, collagen in the porous body is crosslinked by immersing the porous body in a solution of a crosslinking agent. Examples of the crosslinking agent include aldehyde-based crosslinking agents (eg, glutaraldehyde and formaldehyde), isocyanate-based crosslinking agents (such as hexamethylene diisocyanate), and carbodide-based crosslinking agents (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride). Etc.), polyepoxy crosslinking agents (ethylene glycol diethyl ether, etc.), transglutaminase and the like. Of these crosslinking agents, glutaraldehyde is particularly preferable from the viewpoint of easy control of the degree of crosslinking and the biocompatibility of the resulting porous body.
架橋剤をグルタールアルデヒドとする場合、グルタールアルデヒド溶液の濃度は、0.005〜0.015質量％とするのが好ましく、0.005〜0.01質量％とするのがより好ましい。多孔体は脱水する必要があるが、ここでグルタールアルデヒド溶液の溶媒としてエタノール等のアルコールを使用すると、多孔体の脱水をコラーゲンの架橋と同時に行うことができる。脱水を架橋と同時に行うことにより、アパタイト／コラーゲン複合体繊維が収縮した状態で架橋反応を起こさせ、生成する多孔体の弾性を向上させることができる。 When the crosslinking agent is glutaraldehyde, the concentration of the glutaraldehyde solution is preferably 0.005 to 0.015% by mass, and more preferably 0.005 to 0.01% by mass. The porous body needs to be dehydrated. Here, when an alcohol such as ethanol is used as the solvent of the glutaraldehyde solution, the porous body can be dehydrated simultaneously with the crosslinking of collagen. By performing dehydration at the same time as crosslinking, a crosslinking reaction can be caused in a contracted state of the apatite / collagen composite fiber, and the elasticity of the resulting porous body can be improved.
架橋処理後、未反応のグルタールアルデヒドを除去するため２質量％程度のグリシン水溶液に多孔体を浸漬し、次いで水洗する。さらにエタノールに浸漬することにより多孔体を脱水した後、室温で乾燥させる。 After the crosslinking treatment, the porous body is immersed in an aqueous solution of about 2% by mass of glycine to remove unreacted glutaraldehyde, and then washed with water. Further, the porous body is dehydrated by dipping in ethanol and then dried at room temperature.
熱脱水架橋の場合、凍結乾燥後の多孔質体を100〜160℃、０〜100 hPaの真空オーブン中に10〜12時間保持すればよい。 In the case of thermal dehydration crosslinking, the lyophilized porous material may be kept in a vacuum oven at 100 to 160 ° C. and 0 to 100 hPa for 10 to 12 hours.
[2] アパタイト／コラーゲン複合体繊維を含む多孔体
本発明のアパタイト／コラーゲン多孔体は、アパタイト／コラーゲン複合体繊維が集合してなる複数の繊維層からなる。繊維層は10〜500μm程度の厚さを有する板状であり、ランダムな向きで、ランダムな層数で重なっている。繊維層の間には、アパタイト／コラーゲン複合体繊維が集合してなる柱が散在する。微視的に見ると、繊維層の重なり方向は散在する柱によって支持されているだけであるので、この方向にはアパタイト／コラーゲン多孔体は比較的脆いと考えられる一方、層方向には強度を有すると考えられる。しかし、上述のように、繊維層の重なりはランダムであるので、巨視的に見ると、繊維層の重なり方向は平均化されており、向きによる強度の比はさほど大きくない。
[2] Porous body containing apatite / collagen composite fiber The apatite / collagen porous body of the present invention comprises a plurality of fiber layers formed by aggregating apatite / collagen composite fibers. The fiber layer is a plate having a thickness of about 10 to 500 μm, and is overlapped in a random direction and with a random number of layers. Between the fiber layers, columns formed by aggregating apatite / collagen composite fibers are scattered. When viewed microscopically, the overlapping direction of the fiber layers is only supported by scattered columns, and in this direction the apatite / collagen porous material is considered to be relatively brittle, while the strength in the layer direction is increased. It is thought to have. However, as described above, since the overlapping of the fiber layers is random, when viewed macroscopically, the overlapping directions of the fiber layers are averaged, and the ratio of the strength depending on the direction is not so large.
繊維層の間に柱が散在することによって形成された気孔は概略板状である。概略板状の気孔の厚さは、繊維層の0.5〜10倍程度である。概略板状の気孔には、血管、比較的大きなタンパク質等も入り込み易いので、このアパタイト／コラーゲン多孔体を生体内に埋入すると、骨形成が促進されると考えられる。 The pores formed by the interspersed pillars between the fiber layers are generally plate-shaped. The thickness of the substantially plate-like pores is about 0.5 to 10 times that of the fiber layer. Since blood vessels, relatively large proteins, etc. are likely to enter into the roughly plate-shaped pores, it is considered that bone formation is promoted when this apatite / collagen porous body is embedded in the living body.
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例１
(1) アパタイト／コラーゲン複合体繊維の作製
120 mMリン酸水溶液400 mlに、コラーゲンのリン酸水溶液（濃度0.97 wt%、20 mMリン酸）を412 g加えて撹拌することにより溶液Iを得た。他方、400 mM水酸化カルシウム溶液（溶液II）を400 ml調製した。反応容器に200 mlの純水を入れた後、溶液I及びIIを同時に滴下し、得られた反応溶液を撹拌した。滴下中の反応溶液のpHは8.9〜9.1に保持した。生成したアパタイト／コラーゲン複合体繊維の長さは、概ね１〜２mmであった。アパタイト／コラーゲン複合体繊維を含むスラリーは、凍結及び凍結乾燥した。アパタイト／コラーゲン複合体繊維中のアパタイト／コラーゲンの配合比は、質量基準で８／２であった。
Example 1
(1) Fabrication of apatite / collagen composite fiber
Solution I was obtained by adding 412 g of a phosphoric acid aqueous solution of collagen (concentration 0.97 wt%, 20 mM phosphoric acid) to 400 ml of 120 mM phosphoric acid aqueous solution and stirring. On the other hand, 400 ml of 400 mM calcium hydroxide solution (solution II) was prepared. After adding 200 ml of pure water to the reaction vessel, the solutions I and II were simultaneously added dropwise, and the resulting reaction solution was stirred. The pH of the reaction solution during the dropping was kept at 8.9 to 9.1. The length of the produced apatite / collagen composite fiber was approximately 1 to 2 mm. The slurry containing the apatite / collagen composite fiber was frozen and lyophilized. The blending ratio of apatite / collagen in the apatite / collagen composite fiber was 8/2 on a mass basis.
(2) 水蒸気の付着
凍結乾燥したアパタイト／コラーゲン複合体繊維を恒温恒湿度装置に入れ、装置内を温度21℃、湿度60〜70％にして、７日間保持することにより、アパタイト／コラーゲン複合体繊維に水蒸気を付着させた。TG-DTAを用いて、水蒸気を付着させる前後のアパタイト／コラーゲン複合体繊維の含水量をn=3で測定した。結果を表１及び図１に示す。水蒸気を付着させる前の含水量は、アパタイト／コラーゲン複合体繊維にもともと含まれている結晶水の量であると考えられる。表１及び図１から分かるように、水蒸気の付着によって、含水量は約2.3倍になった。
(2) Adhesion of water vapor The apatite / collagen complex is obtained by placing the freeze-dried apatite / collagen composite fiber in a constant temperature and humidity device and keeping the temperature inside the device at 21 ° C. and humidity 60 to 70% for 7 days. Water vapor was allowed to adhere to the fiber. Using TG-DTA, the water content of the apatite / collagen composite fiber before and after adhering water vapor was measured at n = 3. The results are shown in Table 1 and FIG. It is considered that the water content before adhering water vapor is the amount of crystal water originally contained in the apatite / collagen composite fiber. As can be seen from Table 1 and FIG. 1, the water content increased about 2.3 times due to the adhesion of water vapor.
(3) アパタイト／コラーゲン複合体繊維を含む多孔体の作製
実施例１(2) で得た水蒸気を付着させたアパタイト／コラーゲン複合体繊維1.074g（複合体繊維乾燥質量として１g）に、5.94gの生理食塩水 及び0.061mLの1N NaOHを混合した後、2.04gのコラーゲン水溶液［コラーゲン濃度：0.51質量％（20mMリン酸水溶液中）］を混合し、分散物を得た。分散物の液体含有量は、95体積％（アパタイト／コラーゲン複合体繊維中の水を含む。）であった。分散物を成形型に入れ、37.5℃で２時間保持して分散物をゲル化させ、−60℃で凍結させた後、凍結乾燥し、アパタイト／コラーゲン多孔体を得た。アパタイト／コラーゲン多孔体の光学顕微鏡写真及び走査電子顕微鏡写真をそれぞれ図2(a)及び図3(a)に示す。これらの写真から、このアパタイト／コラーゲン多孔体の気孔が概略板状であることが分かった。実施例１のアパタイト／コラーゲン多孔体の気孔率は、95％であった。
(3) Production of porous body containing apatite / collagen composite fiber To 1.74 g of apatite / collagen composite fiber (1 g as the dry weight of the composite fiber) to which water vapor was adhered obtained in Example 1 (2), 5.94 g Was mixed with 0.061 mL of 1N NaOH, and then 2.04 g of collagen aqueous solution [collagen concentration: 0.51% by mass (in 20 mM phosphoric acid aqueous solution)] was mixed to obtain a dispersion. The liquid content of the dispersion was 95% by volume (including water in the apatite / collagen composite fiber). The dispersion was put into a mold and kept at 37.5 ° C. for 2 hours to gel the dispersion, frozen at −60 ° C. and then lyophilized to obtain an apatite / collagen porous body. An optical micrograph and a scanning electron micrograph of the apatite / collagen porous material are shown in FIGS. 2 (a) and 3 (a), respectively. From these photographs, it was found that the pores of this apatite / collagen porous body were approximately plate-shaped. The porosity of the apatite / collagen porous material of Example 1 was 95%.
比較例１
実施例１(1) で得た水蒸気を付着させる前のアパタイト／コラーゲン複合体繊維を1.032g（複合体繊維乾燥質量として１g）を用いて、生理食塩水の配合量を6.05g、１N NaOHの添加量を0.059ml、及びコラーゲン水溶液の添加量を1.96gとした以外実施例１と同様にしてアパタイト／コラーゲン多孔体を作製した。得られたアパタイト／コラーゲン多孔体の光学顕微鏡写真及び走査電子顕微鏡写真を図2(b)及び図3(b)に示す。これらの写真から、このアパタイト／コラーゲン多孔体の気孔は概略球状であることが分かった。このアパタイト／コラーゲン多孔体の気孔率は、95％であった。
Comparative Example 1
Using 1.032 g of the apatite / collagen composite fiber before adhering water vapor obtained in Example 1 (1) (1 g as the dry weight of the composite fiber), the amount of physiological saline was 6.05 g, and 1N NaOH. An apatite / collagen porous material was produced in the same manner as in Example 1 except that the addition amount was 0.059 ml and the addition amount of the collagen aqueous solution was 1.96 g. An optical micrograph and a scanning electron micrograph of the obtained apatite / collagen porous body are shown in FIGS. 2 (b) and 3 (b). From these photographs, it was found that the pores of this apatite / collagen porous body were approximately spherical. The porosity of this apatite / collagen porous body was 95%.
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