JP2008266282A - 制癌剤の有効成分としての環状デプシペプチドおよび当該環状デプシペプチドを有効成分として含有する制癌剤。 - Google Patents
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Abstract
Description
nMという強い細胞毒性を示すことを発見した。さらに、この天然由来のkulokekahilide-2について高分解能質量分析および一次元および二次元NMRスペクトル(COSY、HMQC、HMBC、NOESY)の解析に基づいて構造解析を行った結果、当該ペプチドがC44H67N5O10の組成式を有し、alanine(Ala)、Isoleucine
(Ile)、N-methylglycine (NMeGly)、N-methylphenylalanine (NMePhe)、および alanine の5つのアミノ酸、ならびに、2-
hydroxyisocaproic acid (leucic acid, Hica) および
5,7-dihydroxy-2,6,8-trimethyl-2,8-decadienoic acid (5S,6S,7S-Dtda) の2つのヒドロキシ脂肪酸から構成されている新規な環状デプシペプチドであることを導出し、また、その構成アミノ酸の立体配置についても推定した。さらに、この化合物のNMRスペクトルを詳細に検討したところ、NMeGlyとNMePheのアミド結合部分においてcis-体と
trans-体の2つの配座異性体が含まれていることが分かった( Y. Nakao, W. Y. Yoshida, Y. Takada, J. Kimura,
L. Yang, S. L .Mooberry, and P. J. Scheuer, J.Nat.Prod., 2004, 67 1332-1340 )。本発明者らは、上述した構造解析の結果、下記構造式(I)で表される環状デプシペプチドの合成を試みて、これに成功した。合成したkulokekahilide-2の構造式を下記式(I)に示す。なお、下記式(I)は原子省略法によって記載されている。したがって下記式(I)において省略された末端は全てメチル基である。
一般式(1)
一般式(2)
一般式(3)
形態に限定されるものではない。本発明の環状デプシペプチドについて以下説明する。なお、これ以降、本明細書中においては、混乱を避けるため、誤った構造解析結果に基づいて合成された細胞毒性を示さない合成物については、kulokekahilide-2(誤)と標記し、本発明に係る、天然由来の構造を合成により明らかにし、強い細胞毒性をもつ正しい構造の化合物をkulokekahilide-2(正)と標記して区別するものとする。
(L-Ala)とし、L-methylphenylalanine (L-NMePhe)をD-methylphenylalanine (D-NMePhe)として構成した立体異性体である。同じく、本実施形態のkulokekahilide-2Bも、合成したkulokekahilide-2(誤)におけるアミノ酸の立体配置を一部変更したものであり、D-AlaをL-Alaとし、L-AlaをD-Alaとして構成した立体異性体である。本実施形態のkulokekahilide-2(正)も、合成したkulokekahilide-2(誤)におけるアミノ酸の立体配置を一部変更したものであり、D-AlaをL-Ala、L-AlaをD-Ala、そしてL-NMePheをD-NMePheとして構成した立体異性体である。本実施形態のkulokekahilide-2Aおよびkulokekahilide-2Bは、いずれも、P388マウス白血病細胞、およびヒト子宮がん由来HeLa細胞に対して強い細胞毒性を示し、特に、kulokekahilide-2Aは、上記2細胞に対して抗癌作用を示す抗生物質として知られるアドリアマイシンよりも強い細胞毒性を示す。さらに、本実施形態のkulokekahilide-2(正)に至っては、予期したようにヒト子宮がん由来HeLa細胞に対してkulokekahilide-2Aよりも強い細胞毒性を示す。
(Tce) で保護したL-イソロイシン(L-Ile-OTce)とアミノ基をt-ブチルオキシカルボニル基(Boc)で保護したN-メチルグリシン(Boc-N-MeGly)を、縮合剤としてN-エチル-N’-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩(EDCI・HCl)を用い、ジぺプチドを合成する。次いで、得られたジペプチドのN-末端側の保護基を除去したジペプチドをBoc-D-N-メチルフェニルアラニン
(Boc-D-NMePhe)と反応させ、トリペプチドを得る。同様な保護基操作により、L-アラニン(L-Ala)、D-2-ヒドロキシイソカプロン酸
(D-Hica)、5,7-ジヒドロキシ-2,6,8-トリメチル-2,8-デカジエン酸 (5S,6S,7S-Dtda)、 そして、最後にL-アラニン
(L-Ala)を縮合し、環化させることによってkulokekahilide-2Aを得ることができる。
る。
(Tce) で保護したL-イソロイシン(L-Ile-OTce)とアミノ基をt-ブチルオキシカルボニル基(Boc)で保護したN-メチルグリシン(Boc-N-MeGly)
を、縮合剤としてN-エチル-N’-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩(EDCI・HCl)を用い、ジぺプチドを合成する。次いで、得られたジペプチドのN-末端側の保護基を除去したジペプチドをBoc-L-N-メチルフェニルアラニン
(Boc-L-NMePhe) と反応させ、トリペプチドを得る。同様な保護基操作により、L-アラニン(L-Ala)、D-2-ヒドロキシイソカプロン酸
(D-Hica)、5,7-ジヒドロキシ-2,6,8-トリメチル-2,8-デカジエン酸 (5S, 6S, 7S-Dtda)、 そして、最後にD-アラニン
(D-Ala)を縮合し、環化させることによってkulokekahilide-2Bを得ることができる。
1, 3, 3-テトラメチルウロニウム(TBTU)を用いることができ、添加剤として、ジメチルアミノピリジン(DMAP)、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、そして1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)を用いることができる。また、アミノ酸でないD-Hica
および 5S,6S,7S-Dtdaの合成方法については、kulokekahilide-2Aの製造方法について上述したのと同様である。
(Tce) で保護したL-イソロイシン(L-Ile-OTce)とアミノ基をt-ブチルオキシカルボニル基(Boc)で保護したN-メチルグリシン(Boc-N-MeGly)
を、縮合剤としてN-エチル-N’-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩(EDCI・HCl)を用い、ジぺプチドを合成する。次いで、得られたジペプチドのN-末端側の保護基を除去したジペプチドをBoc-D-N-メチルフェニルアラニン
(Boc-D-NMePhe) と反応させ、トリペプチドを得る。同様な保護基操作により、L-アラニン(L-Ala)、D-2-ヒドロキシイソカプロン酸
(D-Hica)、5,7-ジヒドロキシ-2,6,8-トリメチル-2,8-デカジエン酸 (5S, 6S, 7S-Dtda)を縮合させる。この操作までkulokekahilide-2A
と同様である。そして、最後にD-アラニン (D-Ala)を縮合し、環化させることによってkulokekahilide-2(正)を得ることができる。
および 5S,6S,7S-Dtdaの合成方法については、kulokekahilide-2Aの製造方法について上述したのと同様である。
(1−1)ジペプチド(Boc-NMeGly-L-Ile-OTce)
Boc-L-Ile (2.32 g, 10.0 mmol) のCH2Cl2 (20
mL) に溶液に、トリクロロエタノール (TceOH, 1.1 mL, 10.0 mmol)、DMAP (122 mg, 1.0 mmol)、縮合剤にEDCI・HCl
(2.30 g, 12.0 mmol) を加え、Boc-L-Ile-OTceを得た。これに4 M塩酸ジオキサン溶液 (20 mL) で処理し、L-Ile-OTce・HClとした。この塩酸塩をCH2Cl2-ジメチルホルムアミド
(DMF) (1:1) (20 mL) に溶解し、トリエチルアミン (Et3N, 1.4 mL, 10.0 mmol)、Boc-NMeGly
(2.1 g, 11.0 mmol)、HOBt (1.49 g, 10.0 mmol)、そしてEDC・HCl (4.22 g, 22.0 mmol) を加え、縮合し、Boc-ジペプチド
(3.71 g, 8.56 mmol, 86%) を得た。
Boc-ジペプチド (3.71 g, 8.60 mmol) を、4 M塩酸-ジオキサン溶液 (20 mL)で処理し、ジペプチド塩酸塩を得た。この塩酸塩
(644 mg, 1.74 mmol) のCH2Cl2-DMF (1:1, 6 mL) 溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(iPr2NEt,
935 μL, 5.2 mmol)、Boc-D-NMePhe (486 mg, 1.74 mmol) を加え、HBTU(792 mg, 2.09 mmol) を用いて縮合し、Boc-トリペプチド
(882 mg, 1.48 mmol, 85%)を得た。
(1−3)テトラペプチド (Boc-L-Ala-D-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce)
Boc-トリペプチド (2.62 g, 4.41 mmol)を、4 M塩酸-ジオキサン溶液 (10 mL)で処理し、この塩酸塩
(2.26 g, 4.25 mmol)のCH2Cl2-DMF (1:1, 14 mL) 溶液に、iPr2NEt
(2.3 mL, 12.8 mmol)、Boc-L-Ala (885 mg, 4.68 mmol)、HBTU (1.93 g, 5.1 mmol) を加え縮合し、Boc-テトラペプチド
(2.14 g , 3.21 mmol, 76%) を得た。
Boc-テトラペプチド (2.14 g, 3.21 mmol) を、4 M塩酸-ジオキサン溶液 (10 mL) で処理し、その塩酸塩を得た。この塩酸塩
(1.93 g, 3.2 mmol) のDMF (6.4 mL) 溶液に、Et3N (449 μL, 3.2 mmol)、D-Hica(465
mg, 3.52 mmol)、HOBt (865 mg, 6.4 mmol)、EDCI・HCl (920 mg, 4.8 mmol)を加え縮合し、ペンタペプチド
(1.64 g, 2.41 mmol, 75%) を得た。
7S-5-O-MTM-7-O-TBS-Dtda-D-Hica- L-Ala-D-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce)
ペンタペプチド (340 mg,
0.5 mmol) のCH2Cl2 (2.0 mL) 溶液に、5位をメチルチオメチル基 (MTM)、7位をt-ブチルジメチルシリル基(TBS)で保護したジヒドロキシ酸
(5S, 6S, 7S-5-O-MTM- 7-O-TBS-Dtda , 208.4 mg, 0.5 mmol)、DMAP (61 mg, 0.5 mmol)、EDCI・HCl
(192 mg, 1.0 mmol)を加え、縮合し、デプシヘキサペプチド (449 mg, 0.42 mmol, 83%) を得た。
6S, 7S)-5-O-MTM-Dtda-D-Hica- L-Ala-D-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce)
デプシヘキサペプチド (486.7
mg, 0.45 mmol) をフッ化水素-ピリジン塩 (1 g) のピリジン-テトラヒドロフラン (THF) (1:4, 5 mL) 溶液 (10 mL) に溶かし、40
oCで反応させ、7位のTBS基を除去した (383.3 mg, 0.40 mmol, 88%)。このアルコール (368.1 mg,
0.38 mmol) のCH2Cl2 (1.5 mL) 溶液に、Fmoc-L-アラニン(175.6 mg,
0.56 mmol)、DMAP (45.9 mg, 0.38 mmol)、EDCI・HCl (144.2 mg, 0.75 mmol)を加え、縮合し、デプシヘプタペプチド
(449.5 mg, 0.36 mmol, 95%)を得た。
6S, 7S)-5-O-MTM-Dtda-D-Hica-L-Ala- D-NMePhe-
NMeGly-L-Ile-COOH)
デプシヘプタペプチド (434.1
mg, 0.35 mmol)のTHF (15 mL) 溶液に、1 M酢酸アンモニウム(3.0 mL)、および亜鉛粉末 (1.58 g, 24.2 mmol) を加え、C-末端側のTce基を脱離し、遊離カルボン酸
(320.0 mg, 0.28 mmol, 82%) を得た。このカルボン酸 (297.2 mg, 0.26 mmol) のアセトニトリル (15 mL) 溶液に、ジエチルアミン
(1.5 mL) を加え、N-末端側のFmoc基を除去し、セコ酸 (233.6 mg, 0.26 mmol, 98%) を得た。
セコ酸 (218.1 mg, 0.24 mmol) のCH2Cl2 (220 mL)、DMF
(22 mL) 混合溶液に、HOAt (328.0 mg, 2.41 mmol)、EDCI・HCl (462.0 mg, 2.41 mmol) を加え、マクロラクタム化させ、環状化合物
(137.7 mg, 0.156 mmol, 65%) を得た。この環状化合物 (120.4 mg, 0.136 mmol)のTHF (3.2 mL)、水
(0.8 mL) 混合溶液に、2, 6-ルチジン (320 μL) および硝酸銀 (924.3 mg, 5.44 mmol) を加えて65oCでジヒドロキシ酸のMTM保護基を除き、kulokekahilide-2A
(109.9 mg, 0.133 mmol) を定量的に得た。上述した手順で合成したkulokekahilide-2Aの物理化学的性質を下記の表に示す。なお、kulokekahilide-2AのNMRスペクトルによる詳細な立体構造解析の結果、kulokekahilide-2(正)の構造と同様、NMeGlyとD-NMePheのアミド結合部でcis-
体とtrans−体の配座異性体が確認され、その割合はおよそ1:1.2であった。また、後述するkulokekahilide-2Bにおいては、NMeGlyとL-NMePheのアミド結合のほかに、L-NMePheとL-Alaのアミド結合部にも配座異性体が存在し、計4つの異性体が含まれていると考えられた。しかしながら、kulokekahilide-2A,
-2Bのスペクトルについては、kulokekahilide-2(正)のように cis- 体とtrans−体が明らかでないので、下記表1および後述する下記表2においてはスペクトルを一緒に記載してある。
(2−1)ジペプチド(Boc-
NMeGly-L-Ile-OTce)
Boc-L-Ile (2.32 g, 10.0 mmol) のCH2Cl2 (20
mL) に溶液に、トリクロロエタノール (TceOH, 1.1 mL, 10.0
mmol)、DMAP (122 mg, 1.0 mmol)、縮合剤にEDCI・HCl (2.30 g, 12.0 mmol) を加え、Boc-L-Ile-OTceを得た。これに4 M塩酸ジオキサン溶液 (20 mL) で処理し、L-Ile-OTce・HClとした。この塩酸塩をCH2Cl2-ジメチルホルムアミド
(DMF) (1:1) (20 mL) に溶解し、トリエチルアミン (Et3N, 1.4 mL, 10.0 mmol)、Boc-NMeGly
(2.1 g, 11.0 mmol)、HOBt (1.49 g, 10.0 mmol)、そしてEDCI・HCl (4.22 g, 22.0 mmol) を加え、縮合し、Boc-ジペプチド
(3.71 g, 8.56 mmol, 85.6%) を得た。
(Boc-L-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce)
Boc-ジペプチド (3.49 g, 8.04 mmol) を、4 M塩酸-ジオキサン溶液 (20 mL)で処理し、ジペプチド塩酸塩を得た。この塩酸塩
(1.85 g, 5.0 mmol) のCH2Cl2-DMF (1:1, 16 mL) 溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(iPr2NEt,
2.7 mL, 15.0 mmol)、Boc-L-NMePhe (1.40 g, 5.0 mmol)、HOBt(810 mg, 6 mmol)を加え、TBTU(1.93
g, 6.0 mmol) を用いて縮合し、Boc-トリペプチド (2.37 mg, 3.98 mmol, 80%)を得た。
(Boc-L-Ala-L-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce)
Boc-トリペプチド (2.37 g, 3.98 mmol)を、4 M塩酸-ジオキサン溶液 (10 mL)で処理し、この塩酸塩 (1.05 g, 1.98 mmol)のCH2Cl2-DMF
(1:1,
6 mL) 溶液に、iPr2NEt (1.2
mL, 5.94 mmol)、Boc-L-Ala (412 mg, 2.78
mmol)、PyBOP (1.24 g, 2.38
mmol) を加え縮合し、Boc-テトラペプチド (844 g, 1.27 mmol, 64%) を得た。
Boc-テトラペプチド (824 mg, 1.24 mmol) を、4 M塩酸-ジオキサン溶液 (10 mL) で処理し、その塩酸塩を得た。この塩酸塩
(751.5 mg, 1.25 mmol) のDMF (2.5 mL) 溶液に、Et3N (175 μL, 1.25 mmol)、D-Hica(182
mg, 1.38 mmol)、HOBt (338 mg, 2.5 mmol)、EDCI・HCl (359 mg, 1.88 mmol)を加え縮合し、ペンタペプチド
(582 mg, 0.86 mmol, 68%) を得た。
(5S,
6S, 7S-5-O-MTM-7-O-TBS-Dtda-D-Hica-L-Ala-L-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce)
ペンタペプチド (340 mg, 0.5 mmol) のCH2Cl2 (2.0
mL) 溶液に、5位をメチルチオメチル基 (MTM)、7位をt-ブチルジメチルシリル基(TBS)で保護したジヒドロキシ酸 (5S, 6S,
7S-5-O-MTM-7-O-TBS-Dtda , 208.4 mg, 0.5 mmol)、DMAP (61 mg, 0.5 mmol)、EDCI・HCl (192 mg, 1.0 mmol)を加え、縮合し、デプシヘキサペプチド (430 mg, 0.4 mmol, 80%) を得た。
6S, 7S)-5-O-MTM-Dtda-D-Hica- L-Ala-L-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce)
デプシヘキサペプチド (385.2
mg, 0.36 mmol) をフッ化水素-ピリジン塩 (1 g) のピリジン-テトラヒドロフラン (THF) (1:4, 5 mL) 溶液 (8 mL) に溶かし、40
oCで反応させ、7位のTBS基を除去した (304.1 mg, 0.32 mmol, 88%)。このアルコール (289.4 mg,
0.30 mmol) のCH2Cl2 (1.2 mL) 溶液に、Fmoc-D-アラニン(137.8 mg,
0.44 mmol)、DMAP (36.0 mg, 0.30 mmol)、EDCI・HCl (113.1 mg, 0.59 mmol)を加え、縮合し、デプシヘプタペプチド
(361.4 mg, 0.29 mmol)を定量的に得た。
デプシヘプタペプチド (347.6 mg, 0.28 mmol)のTHF (12 mL) 溶液に、1 M酢酸アンモニウム(2.4 mL)、および亜鉛粉末
(1.27 g, 19.3 mmol) を加え、C-末端側のTce基を脱離し、遊離カルボン酸 (254.0 mg, 0.23 mmol, 82%) を得た。このカルボン酸
(234.2 mg, 0.21 mmol) のアセトニトリル (12 mL) 溶液に、ジエチルアミン (1.2 mL) を加え、N-末端側のFmoc基を除去し、セコ酸
(179.7 mg, 0.20 mmol, 96%) を得た。
セコ酸 (167.2 mg, 0.19 mmol) のCH2Cl2 (170 mL)、DMF
(17 mL) 混合溶液に、HOAt (251.8 mg, 1.85 mmol)、EDCI・HCl (354.6 mg, 1.85 mmol) を加え、マクロラクタム化させ、環状化合物
(115.0 mg, 0.13 mmol, 70%) を得た。この環状化合物 (99.6 mg, 0.112 mmol)のTHF (2.4 mL)、水
(0.6 mL) 混合溶液に、2, 6-ルチジン (260 μL) および硝酸銀 (761.2 mg, 4.48 mmol) を加えて65oCでジヒドロキシ酸のMTM保護基を除き、kulokekahilide-2B
(92.5 mg, 0.112 mmol) を定量的に得た。上述した手順で合成したkulokekahilide-2Bの物理化学的性質を下記の表に示す。この化合物のNMRスペクトルは、天然由来のkulokekahilide-2(正)と同様に、cis-体とtrans-体と考えられる配座異性体の他に、L-NMePheとL-Alaのアミド結合部においても配座異性体の存在を示した。
(3−1)ジペプチド(Boc-NMeGly-L-Ile-OTce)
Boc-L-Ile (2.32 g, 10.0 mmol) のCH2Cl2 (20
mL) に溶液に、トリクロロエタノール (TceOH, 1.1 mL, 10.0 mmol)、DMAP (122 mg, 1.0 mmol)、縮合剤にEDCI・HCl
(2.30 g, 12.0 mmol) を加え、Boc-L-Ile-OTceを得た。これに4 M塩酸ジオキサン溶液 (20 mL) で処理し、L-Ile-OTce・HClとした。この塩酸塩をCH2Cl2-ジメチルホルムアミド
(DMF) (1:1) (20 mL) に溶解し、トリエチルアミン (Et3N, 1.4 mL, 10.0 mmol)、Boc-NMeGly
(2.1 g, 11.0 mmol)、HOBt (1.49 g, 10.0 mmol)、そしてEDCI・HCl (4.22 g, 22.0 mmol) を加え、縮合し、Boc-ジペプチド
(3.71 g, 8.56 mmol, 86%) を得た。
Boc-ジペプチド (3.71 g, 8.60 mmol) を、4 M塩酸-ジオキサン溶液 (20 mL)で処理し、ジペプチド塩酸塩を得た。この塩酸塩
(644 mg, 1.74 mmol) のCH2Cl2-DMF (1:1, 6 mL) 溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(iPr2NEt,
935 μL, 5.2 mmol)、Boc-D-NMePhe (486 mg, 1.74 mmol) を加え、HBTU(792 mg, 2.09 mmol) を用いて縮合し、Boc-トリペプチド
(882 mg, 1.48 mmol, 85%)を得た。
Boc-トリペプチド (2.62 g, 4.41 mmol)を、4 M塩酸-ジオキサン溶液 (10 mL)で処理し、この塩酸塩
(2.26 g, 4.25 mmol)のCH2Cl2-DMF (1:1, 14 mL) 溶液に、iPr2NEt
(2.3 mL, 12.8 mmol)、Boc-L-Ala (885 mg, 4.68 mmol)、HBTU (1.93 g, 5.1 mmol) を加え縮合し、Boc-テトラペプチド
(2.14 g , 3.21 mmol, 76%) を得た。
Boc-テトラペプチド (2.14 g, 3.21 mmol) を、4 M塩酸-ジオキサン溶液 (10 mL) で処理し、その塩酸塩を得た。この塩酸塩
(1.93 g, 3.2 mmol) のDMF (6.4 mL) 溶液に、Et3N (449 μL, 3.2 mmol)、D-Hica(465
mg, 3.52 mmol)、HOBt (865 mg, 6.4 mmol)、EDCI・HCl (920 mg, 4.8 mmol)を加え縮合し、ペンタペプチド
(1.64 g, 2.41 mmol, 75%) を得た。
7S-5-O-MTM-7-O-TBS-Dtda-D-Hica- L-Ala-D-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce)
ペンタペプチド (340 mg,
0.5 mmol) のCH2Cl2 (2.0 mL) 溶液に、5位をメチルチオメチル基 (MTM)、7位をt-ブチルジメチルシリル基(TBS)で保護したジヒドロキシ酸
(5S, 6S, 7S-5-O-MTM- 7-O-TBS-Dtda , 208.4 mg, 0.5 mmol)、DMAP (61 mg, 0.5 mmol)、EDCI・HCl
(192 mg, 1.0 mmol)を加え、縮合し、デプシヘキサペプチド (449 mg, 0.42 mmol, 83%) を得た。
[Fmoc-D-Ala-(5S,6S,7S)-5-O-MTM-Dtda-D-Hica- L-Ala-D-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce]
デプシヘキサペプチド (486.7 mg, 0.45 mmol) をフッ化水素-ピリジン塩 (1 g) のピリジン-テトラヒドロフラン (THF) (1:4,
5 mL) 溶液 (10 mL) に溶かし、40 oCで反応させ、7位のTBS基を除去した (383.3 mg, 0.40 mmol,
88%)。このアルコール (202 mg, 0.21 mmol) のCH2Cl2
(8.4 mL) 溶液に、Fmoc-D-Ala (98.1 mg, 0.315 mmol)、DMAP (26 mg, 0.21 mmol) およびEDCI・HCl
(80.5 mg, 0.42 mmol) を加え、縮合し、デプシヘプタペプチド (223 mg, 0.18 mmol, 86%) を得た。
[H2N-D-Ala-(5S,6S,7S)-5-O-MTM-Dtda-D-Hica-L-Ala-D-NMePhe-NMeGly-L-Ile-COOH]
デプシヘプタペプチド (210 mg, 0.17 mmol)
のTHF (7.0 mL) 溶液に、1 M酢酸アンモニウム (1.4 mL)、および亜鉛粉末 (763 mg, 11.7 mmol) を加え、C-末端側のTce基を脱離し、遊離カルボン酸とし、このカルボン酸のアセトニトリル
(7.0 mL) 溶液に、ジエチルアミン (0.70 mL) を加え、N-末端側のFmoc基を除去し、セコ酸 (124 mg, 0.14 mmol, 82%)
を得た。
セコ酸
(111 mg, 0.12 mmol) のCH2Cl2-DMF
(10:1, 122 mL) 混合溶液に、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール (HOAt, 166.0 mg, 1.22 mmol)、EDCI・HCl
(233.9 mg, 1.22 mmol) を加え、マクロラクタム化させ、環状化合物 (83 mg, 0.094 mmol, 77%) を得た。この環状化合物
(69.5 mg, 0.078 mmol) のTHF-水 (4:1, 3.5 mL) 混合溶液に、2, 6-ルチジン (0.195 mL, 1.68
mmol) および硝酸銀 (571 mg, 3.36 mmol) を加え、65℃で反応させ、ジヒドロキシ酸のMTM保護基を除去し、kulokekahilide-2(正)(29 mg,
0.035 mmol, 45%) を得た。上述した手順で合成したkulokekahilide-2(正)の物理化学的性質を下記の表に示す。この合成物のNMRスペクトルは、天然由来の化合物と同様にcis-体とtrans-体の混合物を示したが、その各々の異性体の帰属を行うことが出来た。
(4−1)ジペプチド(Boc-NMeGly-L-Ile-OTce)
Boc-L-Ile (2.32 g, 10.0 mmol) のCH2Cl2 (20
mL) に溶液に、トリクロロエタノール (TceOH, 1.1 mL, 10.0
mmol)、DMAP (122 mg, 1.0 mmol)、縮合剤にEDCI・HCl (2.30 g, 12.0 mmol) を加え、Boc-L-Ile-OTceを得た。これに4 M塩酸ジオキサン溶液 (20 mL) で処理し、L-Ile-OTce・HClとした。この塩酸塩をCH2Cl2-ジメチルホルムアミド
(DMF) (1:1) (20 mL) に溶解し、トリエチルアミン (Et3N, 1.4 mL, 10.0 mmol)、Boc-NMeGly
(2.1 g, 11.0 mmol)、HOBt (1.49 g, 10.0 mmol)、そしてEDCI・HCl (4.22 g, 22.0 mmol) を加え、縮合し、Boc-ジペプチド
(3.71 g, 8.56 mmol, 86%) を得た。
(Boc-L-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce)
Boc-ジペプチド (1.8 g, 4.16 mmol) を、4 M塩酸-ジオキサン溶液 (8.3 mL)で処理し、ジペプチド塩酸塩を得た。この塩酸塩
(1.22 g, 3.3 mmol) のCH2Cl2-DMF (1:1, 3 mL) 溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(iPr2NEt,
1.77 mL, 9.9 mmol)、Boc-L-NMePhe (1.11 g, 3.69 mmol) を加え、PyBOP (2.58 g, 4.95
mmol) を用いて縮合し、Boc-トリペプチド (1.73 g, 2.99 mmol, 91%)を得た。
(Boc-D-Ala-L-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce)
Boc-トリペプチド (2.03 g, 3.50 mmol)を、4 M塩酸-ジオキサン溶液 (7.0 mL)で処理し、この塩酸塩
(1.68 g, 3.25 mmol)のCH2Cl2-DMF (1:1, 12 mL) 溶液に、iPr2NEt
(1.75 mL, 9.75 mmol)、Boc-D-Ala (615 mg, 3.25 mmol)、PyBOP (2.03 g, 3.90 mmol) を加え縮合し、Boc-テトラペプチド
(1.47 g , 2.26 mmol, 69%) を得た。
(D-Hica-D-Ala-L-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce)
Boc-テトラペプチド (1.20 g, 1.84 mmol) を、4 M塩酸-ジオキサン溶液 (3.7 mL) で処理し、その塩酸塩を得た。この塩酸塩
(880 mg, 1.5 mmol) のDMF (2.8 mL) 溶液に、Et3N (109 μL, 1.5 mmol)、D-Hica(218
mg, 1.65 mmol)、HOBt (405 mg, 3.0 mmol)、EDCI・HCl (860 mg, 4.5 mmol)を加え縮合し、ペンタペプチド
(909 mg, 1.36 mmol, 91%) を得た。
7S-5-O-MTM-7-O-TBS-Dtda-D-Hica- D-Ala-L-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce)
ペンタペプチド (909 mg, 1.36 mmol) のCH2Cl2 (3.1 mL) 溶液に、5位をメチルチオメチル基
(MTM)、7位をt-ブチルジメチルシリル基(TBS)で保護したジヒドロキシ酸 (5S, 6S, 7S-5-O-MTM- 7-O-TBS-Dtda, 568
mg, 1.5 mmol)、DMAP (83 mg, 0.68 mmol)、EDCI・HCl (520 mg, 2.72 mmol)を加え、縮合し、デプシヘキサペプチド
(1.12 g, 1.04 mmol, 77%) を得た。
7S)-5-O-MTM-Dtda-D-Hica- D-Ala-L-NMePhe-NMeGly-L-Ile-OTce)
デプシヘキサペプチド (1.11
g, 1.04 mmol) をフッ化水素-ピリジン塩 (1 g) のピリジン-テトラヒドロフラン (THF) (1:4, 5 mL) 溶液 (27mL) に溶かし、40
oCで反応させ、7位のTBS基を除去した (767 mg, 0.80 mmol, 78%)。このアルコール (760 mg, 0.80
mmol) のCH2Cl2 (2.7 mL) 溶液に、Fmoc-L-アラニン(374 mg, 1.2 mmol)、DMAP
(48.8 mg, 0.4 mmol)、EDCI・HCl (521 mg, 2.4 mmol)を加え、縮合し、デプシヘプタペプチド (670 mg, 0.53
mmol, 67%)を得た。
6S, 7S)-5-O-MTM-Dtda-D-Hica-D-Ala-L-NMePhe- NMeGly-L-Ile-COOH)
デプシヘプタペプチド (650 mg, 0.5 mmol)のTHF (25 mL) 溶液に、1 M酢酸アンモニウム(5.0 mL)、および亜鉛粉末 (2.3
g, 35 mmol) を加え、C-末端側のTce基を脱離し、遊離カルボン酸 (473 mg, 0.42 mmol, 84%) を得た。このカルボン酸
(183 mg, 0.16 mmol) のアセトニトリル (9 mL) 溶液に、ジエチルアミン (0.9 mL) を加え、N-末端側のFmoc基を除去し、セコ酸
(114 mg, 0.12 mmol, 77%) を得た。
セコ酸 (145 mg, 0.16 mmol) のCH2Cl2 (150 mL)、DMF (15
mL) 混合溶液に、HOAt (217 mg, 1.6 mmol)、EDCI・HCl (306 mg, 1.6 mmol) を加え、マクロラクタム化させ、環状化合物
(100 mg, 0.078 mmol, 70%) を得た。この環状化合物 (27.4 mg, 0.030 mmol)のTHF (0.6 mL)、水
(0.15 mL) 混合溶液に、2, 6-ルチジン (70.0 μL) および硝酸銀 (219 mg, 1.29 mmol) を加えて65oCでジヒドロキシ酸のMTM保護基を除き、kulokekahilide-2(誤)(20
mg, 0.023 mmol, 81%) を得た。上述した手順で合成したkulokekahilide-2(誤)の物理化学的性質を下記の表に示す。この化合物についても配座異性体が存在しており、その混合物のスペクトルを示す。
上述した手順で合成したkulokekahilide-2A、kulokekahilide-2B、およびkulokekahilide-2(正)について下記に示す条件の下、生理活性測定を行った。あわせて、比較例として、抗癌作用を示す抗生物質として既知のアドリアマイシン(ADM)についても同様の条件下で生理活性測定を行った。
ヒト子宮がん由来HeLa細胞は、2μg/mLのゲンタマイシン、10%ウシ胎児血清、10μg/mLの抗生物質を添加し、1M HClでpH7.0-7.4に調節したMEM培地(GibcoBRL)中で、37度、5%の二酸化炭素存在下で培養を行った。96穴マクロプレートの各ウェルに細胞を含む200μL(1000細胞/mL)の培地を加えて24時間培養を行った後に、各濃度のサンプル溶液2μlを添加して96時間培養を行った。50μLの3-(4,5-dimethyl-
2-thiazoyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide (MTT) 生理食塩水溶液(1mg/mL)を各ウェルに加え3時間培養を続けた。上清を除去後、生じた沈殿にDMSOを加えて溶解し510
nmの吸収を測定した。
P388マウス白血病細胞(JCRB17)は、100μg/mLのカナマイシン、10%ウシ胎児血清、10μMの2-ヒドロキシエチルジスルフィドを添加したRPMI
1640培地(ニッスイ)中で、37度、5%の二酸化炭素存在下で培養を行った。96穴マクロプレートの各ウェルに100μLの細胞懸濁液(1x104細胞/mL)と100μLのサンプルを含む培地を加え、96時間培養を行った。50μLの3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyl-2H
tetrazolium bromide (MTT) 生理食塩水溶液(1 mg/mL)を各ウェルに加え3時間培養を続けた。上清を除去後、生じた沈殿にDMSOを加えて溶解し510
nmの吸収を測定した。
Claims (4)
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物、又はその薬理上許容される塩若しくはエステル誘導体を有効成分として含有する制癌剤。
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