JP2008263964A - Cell line derived from bat - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、コウモリ由来の細胞であって、長期継代が可能な細胞株に関する。本発明はさらに、該キクガシラコウモリおよびオオコウモリ由来細胞株を用いたウイルスの複製法、ウイルス感染症の診断のためのウイルス力価測定方法、ウイルス抗体の定量法、新種ウイルスの検出・同定法、および抗ウイルス剤のスクリーニング法に関する。 The present invention relates to a cell line derived from bats and capable of long-term passage. The present invention further relates to a method for replicating a virus using the cell strain derived from the damselfly bat and the fruit bat, a method for measuring a virus titer for diagnosing a virus infection, a method for quantifying a virus antibody, and a method for detecting and identifying a new virus. And an antiviral agent screening method.
２００５年にＳＡＲＳ（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ： 重症急性呼吸器症候群）ウイルスが中国キクガシラコウモリ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ ｂａｔ：学名Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ））から分離された。ＳＡＲＳは、２００２年に中華人民共和国広東省に発生し、２００３年７月に新型肺炎制圧宣言がだされるまでの間に、８，０６９人が感染し、７７５人が死亡したとされる、重篤なウイルス感染症である。
オオコウモリに関しては、アフリカにおいてエボラ出血熱（Ｅｂｏｒａ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｆｅｖｅｒ）ウイルスが３種のオオコウモリ（Ｈｙｓｐｉｇｎａｔｈｕｓ ｍｏｎｓｔｒｏｓｕｓ，Ｅｐｏｍｏｐｓ ｆｒａｎｑｕｅｔｔｉ，Ｍｙｏｎｙｃｔｅｒｉｓ ｔｏｒｑｕａｔａ）から分離され、東南アジアのニパウイルス病（Ｎｉｐａｈ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）が、ライルオオコウモリ（Ｐｔｅｒｏｐｕｓ Ｌｙｌｅｉ）から分離された。特に前者は毎年８０％以上の致死率をもって出現し、例年数十人から数百人の犠牲者を出している。後者は、マレーシアにおける最近の出現が深刻であり、ヒトに感染すると７０％以上の致死率を示し、オオコウモリからブタを介してヒトに感染することから、１９９８年の発生では約１００万頭のブタが殺処分となった。
わが国には、１種のオオコウモリが存在し、その１亜種であるヤエヤマオオコウモリから琉球ウイルスが分離された（非特許文献、本メールに添付）。
In 2005, SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) virus was isolated from Chinese horseshoe bat (scientific name Rhinolophus ferrumumequinum). SARS occurred in Guangdong Province of the People's Republic of China in 2002, and by the time the new pneumonia control declaration was issued in July 2003, 8,069 people were infected and 775 people died. It is a serious viral infection.
As for the bats, Ebola Hemorrhagic Fever virus was isolated from three species of bats (Hyspignathus montrosus, Epomops franqueti, Ni pteritus) and eastern disease. Lylei). In particular, the former appears with a mortality rate of 80% or more every year, causing several tens to hundreds of casualties each year. The latter has a serious recent appearance in Malaysia, and when it infects humans, it exhibits a mortality rate of more than 70%, and humans are infected from pigs through swine. The pig was killed.
In Japan, there is one kind of fruit bat, and the Ryukyu virus was isolated from its subspecies Yaeyama bat (non-patent literature, attached to this mail).
重篤なウイルス感染症に対する防御あるいは治療の試みは世界中で広く行われているが、ウイルスは、感染した細胞内で細胞自体の代謝経路を使って複製するため、宿主細胞に悪影響を与えずウイルスだけを攻撃できる代謝機能は限られ、現在使用されている抗ウイルス薬は体内でのウイルス感染・増殖の経路を遮断する効果をもつものが多くを占めている。しかしながら、近年、エマージングウイルスと呼ばれる致死的な作用を持つ新興ウイルスは、現代社会の発展と共に広範囲に拡散し、感染の脅威を強めている。 Attempts to protect or treat severe viral infections are widespread throughout the world, but the virus replicates within the infected cell using its own metabolic pathway, so it does not adversely affect host cells. The metabolic functions that can attack only viruses are limited, and many of the antiviral drugs currently used have the effect of blocking the path of viral infection and growth in the body. However, recently, an emerging virus with a lethal action called an emerging virus has spread widely with the development of modern society, and has strengthened the threat of infection.
エマージングウイルスのヒトへの感染は、野生動物から直接起きる場合と、野生動物から家畜が感染し、家畜からヒトが感染する場合がある。マレーシアで発生したニパウイルスは、自然宿主のオオコウモリから、オオコウモリの生息地まで広げられた養豚場のブタに感染し、ブタからヒトに感染したケースである。狂犬病ウイルス、エボラ出血熱ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、脳炎ウイルスなど人間に重篤な病気を引き起こす様々なウイルスは、コウモリが自然宿主であることが明らかにされている（非特許文献１）。 Infection of humans with emerging viruses may occur directly from wild animals, or live animals from wild animals and humans from live animals. The Nipah virus that originated in Malaysia is a case of swine farms that spread from the natural host bat to the bat habitat, and from pig to human. It has been clarified that bats are natural hosts for various viruses that cause serious diseases in humans such as rabies virus, Ebola hemorrhagic fever virus, SARS virus, and encephalitis virus (Non-patent Document 1).
これまで、日本脳炎不活化ワクチンの製造にはマウス、インフルエンザワクチンの製造には発育鶏卵が用いられてきた。また、ウイルスの分離・増殖には、アフリカミドリザル腎由来細胞Ｖｅｒｏ細胞などの培養細胞が用いられている。しかし、動物の使用、製造コストの面から、あるいは変異を極力防ぐためにも、コウモリ由来の培養細胞で、かつ、ウイルスの大量の増殖を支持する培養細胞を用いることが理想的となっている。コウモリ由来の培養細胞は、コウモリを捕獲し、臓器を摘出し、その臓器より培養してえられるが、この初代培養細胞からは多くても１０代前後しか継代することが出来ず、持続して用いることが不可能である。持続して継代できる、いわゆる不死化の細胞を用いた研究は、抗ウイルス医薬品の開発に重要であるが、特許文献１には、不死化ニワトリ線維芽細胞を用いてワクチン生産のために、大量にウイルスを複製する方法が開示されている。
人間に重篤な病気を引き起こすウイルスの感染の仕組みの解明や、これらのウイルスに対する医薬品は充分とは言えない現状である。本発明は、ウイルスと同じ宿主由来のコウモリ由来の長期継代が可能な細胞を提供し、ウイルスの感染の仕組みの解明、あるいはワクチン製造のためのウイルスの複製方法や、ウイルス感染症の診断のためのウイルス力価・抗体の測定法、新種ウイルスの検出・同定法、および抗ウイルス剤のスクリーニング法を提供することをその主な課題とする。 Elucidation of the mechanism of virus infection that causes serious illness in humans, and pharmaceuticals against these viruses are not sufficient. The present invention provides a cell capable of long-term passage derived from a bat derived from the same host as the virus, elucidation of the mechanism of virus infection, virus replication method for vaccine production, and diagnosis of virus infection. The main subjects are to provide a virus titer / antibody measurement method, a new virus detection / identification method, and an antiviral screening method.
本発明者等は、日本のキクガシラコウモリ或いはヤエヤマオオコウモリを捕獲し、腎臓より細胞を抽出し、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕａ ４０）のラージＴ抗原を該細胞に形質導入することにより、本発明を完成するに至った。 The inventors of the present invention completed the present invention by capturing Japanese horseshoe bats or Japanese flying bats, extracting cells from the kidney, and transducing the cells with large T antigen of SV40 (Simian virus 40). It came to do.
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１）コウモリに由来する細胞であって、ＳＶ４０，（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）ラージＴ抗原遺伝子を導入した細胞であることを特徴とする、長期継代可能な細胞株。
（２）（１）に記載した長期継代可能な細胞株において、ウイルスが複製された場合に細胞変性効果を生じる、該長期継代可能な細胞株に由来する新規な細胞株。
（３）前記ウイルスが、コウモリ由来のウイルスである（２）に記載の新規な細胞株。
（４）前記コウモリがキクガシラコウモリまたは大コウモリである（３）記載の長期継代可能な細胞株。
（５）受託番号ＮＩＴＥ ＡＰ−３４７として寄託された（４）に記載の長期継代可能な細胞株。
（６）ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子を導入した細胞がコウモリ腎臓に由来する細胞である（１）〜（５）のいずれかに記載の長期継代可能な細胞株。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞株に、ウイルスを感染させ、細胞を培養し、細胞変性効果が全面に広がった段階で、培養上清および感染細胞からウイルスを回収してなるウイルスの複製方法。
（８）（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞株と、ウイルスを共培養し、細胞変性効果を指標に行うことを特徴とするウイルス力価の測定方法。
（９）（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞株と、ウイルス含有血清とを共培養し、細胞変性効果を指標に行うことを特徴とする、ウイルスに対する抗体価を定量する方法。
（１０）（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞株を、ウイルスの含有が疑われる試料と接触させ、共培養して、細胞変性効果が観察された細胞を単離してウイルス核酸を回収し、ウイルスを共通に検出するＤＮＡポリメラーゼ領域のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、塩基配列を決定することからなる、新種のウイルスを検出する方法。
（１１）（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞株にウイルスを感染させ、該ウイルスの増殖阻害を評価することを特徴とする、抗ウイルス剤のスクリーニング方法。
That is, the present invention provides the following (1) to (11).
(1) A cell line capable of being passaged for a long period of time, which is a cell derived from a bat, wherein the cell is transfected with SV40, (Similar virus 40) large T antigen gene.
(2) A novel cell line derived from the long-passable cell line that produces a cytopathic effect when the virus is replicated in the long-passable cell line described in (1).
(3) The novel cell line according to (2), wherein the virus is a bat-derived virus.
(4) The cell line capable of long-term passage according to (3), wherein the bat is a black bat or a large bat.
(5) The cell line capable of long-term passage as described in (4) deposited under accession number NITE AP-347.
(6) The cell line capable of long-term passage according to any one of (1) to (5), wherein the cell into which the SV40 large T antigen gene is introduced is a cell derived from a bat kidney.
(7) The cell line according to any one of (1) to (6) is infected with the virus, the cell is cultured, and the cytopathic effect is spread to the entire surface. A method of replicating the virus that is recovered.
(8) A method for measuring a virus titer, comprising coculturing a virus with the cell line according to any one of (1) to (6) and using a cytopathic effect as an index.
(9) A method for quantifying an antibody titer against a virus, comprising co-culturing the cell line according to any one of (1) to (6) and a virus-containing serum and using a cytopathic effect as an index. .
(10) The cell line according to any one of (1) to (6) is brought into contact with a sample suspected of containing virus, co-cultured, and a cell in which a cytopathic effect is observed is isolated to obtain a viral nucleic acid. A method for detecting a new type of virus, which comprises performing PCR using a primer pair of a DNA polymerase region that commonly detects a virus and determining a base sequence.
(11) A method for screening an antiviral agent, comprising infecting the cell line according to any one of (1) to (6) with a virus and evaluating growth inhibition of the virus.
本発明のコウモリ由来ウイルスの増殖に適した本細胞は、コウモリ由来ウイルスの研究のみならず、コウモリ由来ウイルスのワクチンの製造や、ウイルス感染症の診断にも役立つことが期待される。 The present cell suitable for the growth of the bat-derived virus of the present invention is expected to be useful not only for the study of bat-derived viruses but also for the production of bat-derived virus vaccines and the diagnosis of viral infections.
ウイルスと宿主は長い歴史の中で、共存関係を成立させた。ウイルスは特定の動物にしか感染しないことが多い。そのためウイルスの分離・増殖には、同じ宿主由来の培養細胞を用いる必要がある。例え、異宿主由来の細胞株で増殖できたとしても、増殖が遅いなどの問題があるほか、ウイルスは急速に異宿主での増殖に適するよう変異を起こしてしまうことが多い。本発明は、社会的に問題となっているコウモリ由来ウイルスについて、その分離・増殖に適した細胞株を提供するものである。 Viruses and hosts have established a coexistence relationship over a long history. Viruses often infect only certain animals. Therefore, it is necessary to use cultured cells derived from the same host for virus isolation and propagation. For example, even if it can be grown in a cell line derived from a different host, there are problems such as slow growth, and the virus often rapidly mutates to be suitable for growth in a different host. The present invention provides a cell line suitable for the separation and propagation of bat-derived viruses that have become a social problem.
本発明の長期継代可能な細胞株は、コウモリの組織から得られる。
本発明においては、翼手目に属する所謂コウモリであればよく、大翼手亜目、小翼手亜目のいずれであってもよい。たとえばオオコウモリ科、オオコウモリ属（Ｐｔｅｒｏｐｕｓ）のヤエヤマオオコウモリなど、キクガシラコウモリ属（Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ）のキクガシラコウモリ、ホオヒゲコウモリ属（Ｍｙｏｔｉｓ）のモモジロコウモリ、アブラコウモリ属（Ｐｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕ）のイエコウモリ、ヒナコウモリ属（Ｖｅｓｐｅｒｔｉｌｉｏ）のヒナコウモリ、ユビナガコウモリ属（Ｍｉｎｉｏｐｔｅｒｕｓ）のユビナガコウモリ、その他のコウモリが挙げられる。しかしながら、コウモリはヒトに致死的なウイルスを保有している可能性も高く、また種の絶滅の危機を避けるため、環境省または都道府県の許可を得なければならない。そのため、大量に生存して、捕獲が容易かつ捕獲許可の受けやすいヤエヤマオオコウモリやキクガシラコウモリを使用することが望ましい。
また、長期継代可能な細胞株は、コウモリの組織から得ることができるが、一般には内臓の組織が便利であり、好ましくは腎臓である。
The long-passable cell line of the present invention is obtained from bat tissue.
In the present invention, a so-called bat belonging to the winged eye may be used, and either a large winged or small winged hand. For example, the bat family, the Pteropus spider bat, and the like Examples include Vespertilian chick bats, Minopterus humming bats, and other bats. However, bats are likely to carry a lethal virus in humans and must be approved by the Ministry of the Environment or a prefecture to avoid the danger of species extinction. For this reason, it is desirable to use a long-tailed bat or a black-winged bat that survives in large quantities and is easy to capture and easy to receive.
A cell line capable of being passaged for a long time can be obtained from bat tissue, but generally a visceral tissue is convenient, and preferably a kidney.
本発明の長期継代可能な細胞株は、コウモリ由来の長期継代可能な細胞株である。したがって、該長期継代可能な細胞株は、例えば、以下のような手順で樹立することが出来る。捕獲されたコウモリより、無菌的に組織、例えば腎臓を摘出し、腎臓の被膜を除去した後、これを細かく切断し、尿細管上皮細胞と間質細胞とを分離するための酵素処理を行う。ここで使用する酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、カテプシン、パパイン、カスパーゼなどタンパク質分解酵素があげられ、トリプシンの使用が望ましい。得られた細胞は、培養液でよく洗浄した後、血清を含む培養液中で培養を行う。培養液は、例えば、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含んだＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）がある。更にこの培養液には、細菌の混入を防ぐために抗生剤を加えておくことが好ましい。抗生剤としては、ペニシリン、ストレプトマイシンやアンピシリンがあげられ、１種または２種を加えることができる。培養は３０〜４０℃、好ましくは３７℃で行う。また、培養液中に３〜１０％、好ましくは５％のＣＯ２を混合した洗浄空気を供給しながら行うことが望ましい。通常この培養は１〜２週間行う。ここで得られた細胞を初代培養細胞と呼称する。 The cell line capable of long-term passage of the present invention is a cell line capable of long-term passage derived from bats. Therefore, the cell line capable of being passaged for a long time can be established, for example, by the following procedure. A tissue such as the kidney is aseptically removed from the captured bat, and after removing the kidney capsule, it is cut into pieces and subjected to an enzyme treatment for separating tubular epithelial cells and stromal cells. Examples of the enzyme used here include proteolytic enzymes such as trypsin, chymotrypsin, cathepsin, papain, caspase, and the use of trypsin is desirable. The obtained cells are thoroughly washed with a culture solution, and then cultured in a culture solution containing serum. An example of the culture solution is RPMI 1640 (GIBCO) containing 10% fetal calf serum (FCS). Furthermore, it is preferable to add an antibiotic to the culture solution in order to prevent bacterial contamination. Antibiotics include penicillin, streptomycin and ampicillin, and one or two of them can be added. Culturing is performed at 30 to 40 ° C, preferably 37 ° C. Further, it is desirable to carry out while supplying cleaning air in which 3 to 10%, preferably 5% CO2 is mixed in the culture solution. This culture is usually carried out for 1 to 2 weeks. The cells obtained here are referred to as primary cultured cells.
次いで、該初代培養細胞へ、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする遺伝子、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子配列を含む複製開始点欠失ＳＶ４０ＤＮＡ、および抗生剤耐性遺伝子、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンやアンピシリンに耐性を有する遺伝子を導入するが、遺伝子の導入は常法に従って行うことができる。具体的にはエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、レトロウイルスベクターの使用等があげられる。導入した発現ベクター内に存在する抗生剤耐性遺伝子により、形質導入された細胞のみを選択的に増やすために、抗生剤を含んだ培養液、例えば前記１０％ＦＣＳを含んだＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）や１０％ＦＣＳを含んだＲＰＭＩ(免疫生物研究所)で、５〜１０日間、好ましくは６〜８日間培養する。この状態で、抗生剤耐性遺伝子が導入されていない細胞は死滅する。生き残った細胞を、３〜４日間隔で継代を行うことにより、長期継代可能な細胞株を作製することができる。 The primary cultured cells are then made resistant to genes encoding SV40 large T antigen, for example, SV40 DNA containing a replication origin deletion SV40 large T antigen gene sequence, and antibiotic resistance genes such as penicillin, streptomycin and ampicillin. The introduced gene can be introduced according to a conventional method. Specifically, electroporation method, microinjection method, use of retrovirus vector and the like can be mentioned. In order to selectively increase only the transduced cells by the antibiotic resistance gene present in the introduced expression vector, a culture solution containing an antibiotic such as RPMI 1640 (GIBCO) or 10% containing 10% FCS is used. The cells are cultured for 5 to 10 days, preferably 6 to 8 days in RPMI (Immuno-Biological Laboratories) containing% FCS. In this state, cells into which the antibiotic resistance gene has not been introduced die. By surviving the surviving cells at intervals of 3 to 4 days, a cell line capable of long-term passage can be produced.
以上に記述した方法により作製し、選択した長期継代可能な細胞株は、独立行政法人・製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センターに、平成１９年３月２７日、受託番号ＮＩＴＥ ＡＰ−３４７として寄託されている。 A cell line that can be produced by the method described above and selected for long-term passage can be obtained from an independent administrative agency, the National Institute for Product Evaluation and the Patent Microorganisms Deposit Center on March 27, 2007, under the accession number NITE AP-347. Has been deposited.
また、本発明の長期継代可能な細胞株を利用して、細胞変異効果（ＣＰＥ）を有するコウモリ由来のウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、エボラ出血熱ウイルス、ニパウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ピコナウイルス、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、レオウイス、トガウイルスなどを複製することにより生じる細胞も本発明に含まれる。 In addition, bat-derived viruses having a cell mutation effect (CPE), for example, rabies virus, Ebola hemorrhagic fever virus, Nipah virus, SARS virus, piconavirus, herpes virus, paramyxos, using the cell line capable of long-term passage of the present invention. A cell produced by replicating a virus, Leouis, togavirus or the like is also included in the present invention.
また、本発明の長期継代可能な細胞株は、ウイルスを大量に複製することができるものである。すなわち、該細胞にウイルスを感染させて、感染細胞を培養し、細胞変性効果が全面に広がった段階で、培養上清および感染細胞からウイルスを回収することにより、ウイルスを大量に複製することができる。 The cell line capable of being passaged for a long time of the present invention is capable of replicating a large amount of virus. That is, the virus can be replicated in large quantities by infecting the cells with the virus, culturing the infected cells, and recovering the virus from the culture supernatant and the infected cells at the stage where the cytopathic effect has spread to the entire surface. it can.
上記ウイルスをワクチンとして使用する場合、感染細胞の培養は、抗原性を示す血清中のリポタンパク質、血清アルブミンおよび血清グロブリンなど有害な血清成分を低減したウシ血清を使用することが望ましく、５〜１０％濃度の該ウシ血清を含有する培地で培養することにより、その培養上清中に、ヒトを含む動物に対し、副反応を起こしにくい、安全性を高めたワクチンの原材料としてのウイルスを大量に調製することができる。 When the above virus is used as a vaccine, it is desirable to use bovine serum in which harmful serum components such as lipoprotein, serum albumin and serum globulin in antigenic serum are reduced for culturing infected cells. By culturing in a medium containing the bovine serum at a concentration of 5%, a large amount of virus as a raw material for a vaccine that is less likely to cause a side reaction to animals including humans and has improved safety is cultured in the culture supernatant. Can be prepared.
ワクチンの製造方法としては、例えば、感染細胞を培養して、上清中に放出されたウイルスを回収するか、あるいは細胞中に存在しているウイルスを、細胞を破壊することにより回収するとともに、ウイルスをホルマリン処理などにより不活化し、不活化したウイルスにアジュバントを添加することによりワクチンを調製することができる。ワクチン中のウイルスの量は、ワクチンを接種するヒトを含む動物に、目的のウイルスの感染を阻止できる免疫を付与するに十分な量であり、一般に、例えば、１×１０３．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜１×１０５．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上のウイルス量である。また、使用できるアジュバントとしては、ワクチンを接種するヒトを含む動物に、全身性感染防御免疫や局所性感染防御免疫を付与できるアジュバントがあげられる。 As a method for producing a vaccine, for example, by culturing infected cells and recovering the virus released in the supernatant, or recovering the virus present in the cell by destroying the cell, A vaccine can be prepared by inactivating a virus by formalin treatment or the like and adding an adjuvant to the inactivated virus. The amount of virus in the vaccine is an amount sufficient to confer immunity to animals, including humans to be vaccinated, to prevent infection with the virus of interest, and is generally, for example, 1 × 10 3.5 TCID 50 / The amount of virus is from ml to 1 × 10 5.0 TCID 50 / ml or more. Examples of adjuvants that can be used include adjuvants that can impart systemic protective immunity and local protective immunity to animals including humans to be vaccinated.
また、本発明の長期継代可能な細胞株は、目的のウイルスと共培養することにより、ウイルスの力価を測定することができる。ウイルスの力価の測定は、例えば、以下のように行うことができる。組織培養用プレートの各ウェルに本発明の細胞を分注し、１〜３日間培養して単層を形成させる。次いで、培養上清を除き、検査するウイルスを適切な培地で１：１０１〜１：１０８まで階段希釈して各ウェルに添加し、ウイルスを細胞に吸着感染させた後、ＦＣＳを含有する培地を加えて３〜７日間培養する。また、ウイルス力価の測定は、ウイルスによる細胞変性効果が認められたウェルを陽性とみなし、ベーレンス・ケルバー法を用いてＴＣＩＤ５０／ｍｌを算出して得られる。 In addition, the cell strain capable of being passaged for a long time of the present invention can measure the titer of the virus by co-culture with the target virus. The virus titer can be measured, for example, as follows. Cells of the present invention are dispensed into each well of a tissue culture plate and cultured for 1-3 days to form a monolayer. Next, the culture supernatant is removed, and the virus to be tested is serially diluted from 1:10 1 to 1:10 8 with an appropriate medium, added to each well, and the virus is adsorbed to the cells, and then contains FCS. Add medium and incubate for 3-7 days. The virus titer is obtained by calculating TCID 50 / ml using the Behrens Kerber method, assuming that the well in which the cytopathic effect by the virus is recognized as positive.
さらに、本発明の長期継代可能な細胞株は、細胞変性効果を指標にウイルスに対する抗体価を定量することができる。すなわち、抗体価を測定するための抗原は、上記のようにして得られるワクチン用の不活化ウイルスを抗原とする場合や、本発明の細胞株と共培養したウイルスから単離した抗原の場合もある。抗体価の測定は、例えば以下のように行うことができる。得られた抗原を免疫測定用のＥＬＩＳＡプレートや、ニトロセルロース膜などの支持体に固定することにより調製し、ウイルスに感染した人を含む動物の血清中に存在する抗体と結合させた後、公知の免疫測定法例えば、免疫沈降法、酵素免疫測定法 （ＥＩＡ； ｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、蛍光抗体法（ＦＩＡ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、免疫細胞染色等の免疫学的測定法で測定し、抗体価を求めることができる。上記測定法においては、抗体を検出可能な物質で標識するが、例えば、酵素標識の西洋ワサビパーオキシダーゼやアルカリ性フォスファターゼなどを結合させた二次抗体との反応およびそれに続く呈色反応などにより抗体価を測定することができる。この結果から、ウイルス感染の有無あるいは重症度を判定することも可能である。 Furthermore, the cell line capable of being passaged for a long time of the present invention can quantify the antibody titer against the virus using the cytopathic effect as an index. That is, the antigen for measuring the antibody titer may be an antigen isolated from a virus co-cultured with the cell line of the present invention or an inactivated virus for vaccine obtained as described above. is there. The antibody titer can be measured, for example, as follows. Prepared by immobilizing the obtained antigen on an ELISA plate for immunoassay or a support such as a nitrocellulose membrane, and after binding it to the antibody present in the serum of animals including those infected with viruses, For example, immunoprecipitation, enzyme immunoassay (EIA; enzyme-linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), fluorescent antibody assay (FIA); The antibody titer can be determined by immunoassay such as fluorescent immunoassay (fluorescent immunoassay). In the above measurement method, the antibody is labeled with a detectable substance. For example, the antibody titer is determined by a reaction with a secondary antibody bound with an enzyme-labeled horseradish peroxidase or alkaline phosphatase and the subsequent color reaction. Can be measured. From this result, it is also possible to determine the presence or severity of virus infection.
また、さらに、本発明の長期継代可能な細胞株を用いて、コウモリ由来の新種のウイルスを検出・同定することができる。すなわち、本発明の長期継代可能な細胞株に、ウイルスの含有が疑われる試料と接触させて感染させた該細胞株を、例えば、１０％ＦＣＳを含んだＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）で、３０〜４０℃、好ましくは３７℃で、１〜２週間培養し、細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）が観察された細胞を顕微鏡で確認する。これは、この新種コウモリウイルスが本発明の長期継代可能な細胞株で増殖できたことを証明する。さらに、詳細に新種のウイルスを同定する場合には、培養上清からウイルス核酸を回収し、ウイルスを共通に検出するプライマー対を用いてＰＣＲを行い、塩基配列を決定することができる。 Furthermore, bat-derived new viruses can be detected and identified using the cell line capable of long-term passage of the present invention. That is, the cell line of the present invention which has been infected with a sample suspected of containing virus is contacted with a sample suspected of containing virus, for example, with RPMI 1640 (GIBCO) containing 10% FCS for 30-40. The cells are cultured at 1 ° C., preferably 37 ° C. for 1 to 2 weeks, and the cells in which cytopathic effect is observed are confirmed with a microscope. This proves that this new species of bat virus could be propagated in the cell line of the present invention capable of long-term passage. Furthermore, when a new kind of virus is identified in detail, a viral nucleic acid can be recovered from the culture supernatant, and PCR can be performed using a primer pair that commonly detects the virus to determine the base sequence.
本発明の長期継代可能な細胞株は、ウイルス感染症の予防あるいは治療用医薬品のスクリーニングに用いることができるばかりでなく、ウイルス感染のメカニズムの解明にも使用することができる。ウイルス感染症の予防あるいは治療用医薬品である、抗ウイルス剤は、本発明の細胞に、目的とするウイルスを感染させ、該ウイルスの増殖抑制あるいは死滅効果を評価することにより得ることができる。 The cell line capable of long-term passage of the present invention can be used not only for screening for pharmaceuticals for preventing or treating viral infections, but also for elucidating the mechanism of viral infection. The antiviral agent, which is a pharmaceutical agent for preventing or treating viral infections, can be obtained by infecting the cells of the present invention with the target virus and evaluating the growth inhibition or killing effect of the virus.
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。 Hereinafter, examples will be given to describe the present invention in more detail, but the present invention is not limited thereto.
＜細胞株の作製＞
日本に常在する翼手目小翼手亜目のキクガシラコウモリ（学名Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｆｅｒｒｕｍｅｑｕｉｎｕｍ：英語名ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ ｂａｔ）のオスを山口県知事の許可の下、捕獲した。捕獲されたキクガシラコウモリより、無菌的に腎臓を摘出した。腎臓の被膜を除去した後ハサミで細かな断片にし、トリプシンで処理することにより、個々の細胞に分離した。トリプシン処理した細胞を、培養液でよく洗浄した後、フラスコに接種した。培養液には１０％の牛胎児血清（ＦＣＳ）を含んだＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）を用いた。この培養液には、更に細菌の混入を防ぐために１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン（ＧＩＢＣＯ）と１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を加えた。培養は３７℃、５％ＣＯ２存在下で行った。
<Production of cell lines>
We captured a male of the winged winged small winged winged bat (scientific name Rhinolophus ferrumequinum: English name horseshoe bat) with the permission of the governor of Yamaguchi Prefecture. The kidney was aseptically removed from the captured black bat. After removing the kidney capsule, it was cut into small pieces with scissors and separated into individual cells by treatment with trypsin. The trypsinized cells were thoroughly washed with a culture solution and then inoculated into a flask. RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal calf serum (FCS) was used as the culture solution. To this culture solution, 100 mg / ml penicillin (GIBCO) and 100 U / ml streptomycin (GIBCO) were further added to prevent bacterial contamination. The culture was performed at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2.
初代培養細胞を株化するために、３５ｍｍディッシュに初代培養細胞をほぼ全面に細胞が増えたところで、ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子配列を含む複製開始点欠失ＳＶ４０ＤＮＡをコードするＴ抗原発現プラスミド（ｐＳＶ４０Ｔｏｒｉ−ＤＮＡ）をトランスフェクション法によって細胞へ導入した。導入の２時間前に無血清培地であるＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）２ｍｌに培養液を交換し、導入の３０分前より、１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と４μｇのｐＳＶ４０Ｔｏｒｉ−ＤＮＡを計５００μｌになるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭで調整し、２０分間室温で静置後、初代培養細胞に導入した。導入後４時間で培養液を１０％の牛胎児血清（ＦＣＳ）を含んだＲＰＭＩ１６４０に置換し、更に２０時間培養した。 In order to establish a primary culture cell line, when the number of primary culture cells increased almost entirely on a 35 mm dish, a T antigen expression plasmid (pSV40Tori-) encoding a replication origin deletion SV40 DNA containing the SV40 large T antigen gene sequence was obtained. DNA) was introduced into the cells by the transfection method. Two hours before the introduction, the culture medium was replaced with 2 ml of OPTI-MEM (GIBCO), which is a serum-free medium, and 10 μl of Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and 4 μg of pSV40Tori-DNA totaled 500 μl from 30 minutes before the introduction. As described above, the mixture was adjusted with OPTI-MEM and allowed to stand at room temperature for 20 minutes, and then introduced into primary cultured cells. Four hours after the introduction, the culture solution was replaced with RPMI 1640 containing 10% fetal calf serum (FCS), and further cultured for 20 hours.
形質導入された細胞のみを選択的に増やすために、形質導入２４時間後に、７５ｃｍ２フラスコに細胞を継代し、培養液の１０％ＦＣＳを含んだＲＰＭＩ１６４０に、最終濃度２００μｇ／ｍｌとなるようにＧ４１８（ＳＩＧＭＡ）を加えた。プラスミドにはネオマイシンに耐性の遺伝子を導入しているため、プラスミドが導入された細胞はＧ４１８に耐性になるが、プラスミドが導入されていない細胞はＧ４１８により死滅する。 In order to selectively increase only the transduced cells, 24 hours after transduction, the cells were passaged into a 75 cm 2 flask, and RPMI1640 containing 10% FCS of the culture solution was adjusted to a final concentration of 200 μg / ml. G418 (SIGMA) was added. Since a gene resistant to neomycin has been introduced into the plasmid, cells into which the plasmid has been introduced become resistant to G418, but cells into which the plasmid has not been introduced are killed by G418.
約一週間後、プラスミドが導入されていない細胞はほぼすべて死滅し、生き残った細胞のコロニーは、急速に細胞を増やし始め、３〜４日間隔で１：３希釈の継代が可能となり、４０継代の細胞が得られた。この細胞をＢａｔ ｋｉｄｎｅｙ Ｔ１細胞（ＢＫＴ１）細胞と名付けた。 After about one week, almost all cells without the plasmid are killed, and surviving colonies of cells begin to grow rapidly and can be passaged at a 1: 3 dilution every 3-4 days. Passage cells were obtained. This cell was named Batkidney T1 cell (BKT1) cell.
＜コウモリ由来新規ヘルペスウイルスの同定＞
継代で細胞死が認められたキクガシラコウモリ脾臓から得られた未知のウイルス（ＢＶ１）をＢＫＴ１細胞に感染し、１０％ＦＣＳを含んだＲＰＭＩ１６４０培地で共培養した結果、細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）が観察された。これは、この新種コウモリヘルペスウイルスがＢＫＴ１細胞で増殖できたことを証明している。さらにこの感染細胞を電子顕微鏡で観察した結果、細胞内にヘルペスウイルス様粒子が観察された（図１）。
<Identification of a new herpesvirus derived from bat>
As a result of infecting BKT1 cells with an unknown virus (BV1) obtained from the spleen of the horseshoe bat spleen that was found to have passed through the passage, the cells were co-cultured in RPMI1640 medium containing 10% FCS, resulting in cytopathic effect. ) Was observed. This demonstrates that this new bat herpesvirus was able to grow on BKT1 cells. Furthermore, as a result of observing the infected cells with an electron microscope, herpesvirus-like particles were observed in the cells (FIG. 1).
ＢＶ１感染細胞の培養上清からウイルスＤＮＡを回収し、ＶａｎＤＥＶＡＮＴＥＲ ＤＲらの方法（ＶａｎＤＥＶＡＮＴＥＲ ＤＲ，ＷＡＲＲＥＮＴＥＲ Ｐ，ＢＥＮＮＥＴＴ Ｌ，ＳＣＨＵＬＴＺ ＥＲ，ＣＯＵＬＴＥＲ Ｓ，ＧＡＲＢＥＲ ＲＬ，ＲＯＳＥ ＴＭ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３４：１６６６−１６７１，１９９６年）に準じて、ヘルペスウイルスを共通に検出する配列番号２および配列番号３に示すプライマー対（ＤＮＡポリメラーゼ領域）を用いてＰＣＲを行い、塩基配列（配列番号１）を決定した結果、このコウモリ由来ヘルペスウイルスはウマヘルペスウイルス２型に最も近縁であることが示された（図２）。遺伝子レベルでは、ヘルペスウイルス科、ガンマヘルペスウイルス亜科、ラディノウイルス属に属するこれまで報告のないヘルペスウイルスであることが分かった。ＢＶ１ウイルスは、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ：国立遺伝子研究所）に、アクセッションＮｏ．ＡＢ２１９８５５８として登録した。 Viral DNA was collected from the culture supernatant of BV1-infected cells, and the method of VanDEVANTER DR, et al. , 1996), PCR was performed using the primer pair (DNA polymerase region) shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 that commonly detect herpesviruses, and the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) was determined. This bat-derived herpesvirus was shown to be most closely related to equine herpesvirus type 2 (FIG. 2). At the gene level, it was found that the herpes virus belongs to the genus Herpesviridae, Gammaherpesviridae and Radinovirus. The BV1 virus can be obtained from DDBJ (DNA Data Bank of Japan: Accession No.). Registered as AB2198558.
＜細胞株の作製＞
日本に常在する翼手目大翼手亜目のヤエヤマオオコウモリ（学名Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ｄａｓｙｍａｌｌｕｓ ｙａｙｅｙａｍａｅ：英語名Ｒｙｕｋｙｕ ｆｌｙｉｎｇ ｆｏｘ）のオスを沖縄県知事の許可の下、捕獲した。捕獲されたヤエヤマオオコウモリより、無菌的に腎臓を摘出した。腎臓の被膜を除去した後ハサミで細かな断片にし、トリプシンで処理することにより、個々の細胞に分離した。トリプシン処理した細胞を、培養液でよく洗浄した後、フラスコに接種した。培養液には１０％の牛胎児血清（ＦＣＳ）を含んだＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）を用いた。この培養液には、更に細菌の混入を防ぐために１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン（ＧＩＢＣＯ）と１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を加えた。培養は３７℃、５％ＣＯ２存在下で行った。
<Production of cell lines>
We captured a male male bat (scientific name: Pterops dasymallays jayyamae) in Japan with the permission of the governor of Okinawa Prefecture. The kidneys were aseptically removed from the captured foxes. After removing the kidney capsule, it was cut into small pieces with scissors and separated into individual cells by treatment with trypsin. The trypsinized cells were thoroughly washed with a culture solution and then inoculated into a flask. RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal calf serum (FCS) was used as the culture solution. To this culture solution, 100 mg / ml penicillin (GIBCO) and 100 U / ml streptomycin (GIBCO) were further added to prevent bacterial contamination. The culture was performed at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
初代培養細胞を株化するために、３５ｍｍディッシュに初代培養細胞をほぼ全面に細胞が増えたところで、ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子配列を含む複製開始点欠失ＳＶ４０ＤＮＡをコードするＴ抗原発現プラスミド（ｐＳＶ４０Ｔｏｒｉ−ＤＮＡ）をトランスフェクション法によって細胞へ導入した。導入の２時間前に無血清培地であるＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）２ｍｌに培養液を交換し、導入の３０分前より、１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と４μｇのｐＳＶ４０Ｔｏｒｉ−ＤＮＡを計５００μｌになるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭで調整し、２０分間室温で静置後、初代培養細胞に導入した。導入後４時間で培養液を１０％の牛胎児血清（ＦＣＳ）を含んだＲＰＭＩ１６４０に置換し、更に２０時間培養した。 In order to establish a primary culture cell line, when the number of primary culture cells increased almost entirely on a 35 mm dish, a T antigen expression plasmid (pSV40Tori-) encoding a replication origin deletion SV40 DNA containing the SV40 large T antigen gene sequence was obtained. DNA) was introduced into the cells by the transfection method. Two hours before the introduction, the culture medium was replaced with 2 ml of OPTI-MEM (GIBCO), which is a serum-free medium, and 10 μl of Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and 4 μg of pSV40Tori-DNA totaled 500 μl from 30 minutes before the introduction. As described above, the mixture was adjusted with OPTI-MEM and allowed to stand at room temperature for 20 minutes, and then introduced into primary cultured cells. Four hours after the introduction, the culture solution was replaced with RPMI 1640 containing 10% fetal calf serum (FCS), and further cultured for 20 hours.
形質導入された細胞のみを選択的に増やすために、形質導入２４時間後に、７５ｃｍ３フラスコに細胞を継代し、培養液の１０％ＦＣＳを含んだＲＰＭＩ１６４０に、最終濃度２００μｇ／ｍｌとなるようにＧ４１８（ＳＩＧＭＡ）を加えた。プラスミドにはネオマイシンに耐性の遺伝子を導入しているため、プラスミドが導入された細胞はＧ４１８に耐性になるが、プラスミドが導入されていない細胞はＧ４１８により死滅する。 In order to selectively increase only the transduced cells, 24 hours after transduction, the cells were passaged into a 75 cm 3 flask, and RPMI1640 containing 10% FCS of the culture solution was adjusted to a final concentration of 200 μg / ml. G418 (SIGMA) was added. Since a gene resistant to neomycin has been introduced into the plasmid, cells into which the plasmid has been introduced become resistant to G418, but cells into which the plasmid has not been introduced are killed by G418.
約一週間後、プラスミドが導入されていない細胞はほぼすべて死滅し、生き残った細胞のコロニーは、急速に細胞を増やし始め、３〜４日間隔で１：３希釈の継代が可能となり、４０継代の細胞が得られた。この細胞をＦｒｕｉｔ Ｂａｔ ｋｉｄｎｅｙ Ｔ１細胞（ＦＢＫＴ１）細胞と名付けた。 After about a week, almost all cells without the plasmid have been killed and the surviving colonies of cells began to grow rapidly and can be passaged at a 1: 3 dilution every 3-4 days. Passage cells were obtained. This cell was named Fruit Bat kidney T1 cell (FBKT1) cell.
＜コウモリ由来新規アデノウイルスの同定＞
継代で細胞死が認められたヤエヤマオオコウモリ脾臓から得られた未知のウイルス（Ｒｙｕｋｙｕ ｖｉｒｕｓ １：ＲＶ１）をFＢＫＴ１細胞に感染し、１０％ＦＣＳを含んだＲＰＭＩ１６４０培地で共培養した結果、細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）が観察された。これは、この新種アデノウイルスがFＢＫＴ１細胞で増殖できたことを証明している。さらにこの感染細胞を電子顕微鏡で観察した結果、核内にアデノウイルス様粒子が観察された（図３）。
<Identification of a new bat-derived adenovirus>
As a result of infecting FBKT1 cells with an unknown virus (Ryukyu virus 1: RV1) obtained from the spleen of the flying fox bat that had been found to be cell dead at the passage, cell degeneration was performed as a result of co-culture in RPMI1640 medium containing 10% FCS. A cytopathic effect was observed. This demonstrates that this new adenovirus was able to grow on FBKT1 cells. Furthermore, as a result of observing this infected cell with an electron microscope, adenovirus-like particles were observed in the nucleus (FIG. 3).
ＲＶ１感染細胞の培養上清からウイルスＤＮＡを回収し、ＶａｎＤＥＶＡＮＴＥＲ ＤＲらの方法（ＷＥＬＬＥＨＡＮ ＪＦ，ＪＯＨＮＳＯＮ ＡＪ，ＨＡＲＲＡＣＨ Ｂ，ＢＥＮＫＩ Ｍ，ＰＥＳＳＩＥＲ ＡＰ，ＪＯＨＮＳＯＮ ＣＭ，ＧＡＲＮＥＲ ＭＭ，ＣＨＩＬＤＥＳＳ Ａ，ＪＡＣＯＢＳＯＮ ＥＲ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：１３３６６−１３３６９，２００４年）に準じて、アデノウイルスを共通に検出する配列番号５および配列番号６に示すプライマー対（ＤＮＡポリメラーゼ領域）を用いてＰＣＲを行い、塩基配列（配列番号４）を決定した結果、このコウモリ由来アデノウイルスはツパイアデノウイルス（Ｔｒｅｅ ｓｈｒｅｗ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）に最も近縁であることが示された（図４）。遺伝子レベルでは、アデノウイルス科、マストアデノウイルス属に属するこれまで報告のないアデノウイルスであることが分かった。ＲＶ１ウイルスは、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ：国立遺伝子研究所）に、アクセッションＮｏ．ＡＢ３０３３０１として登録した。 Viral DNA was collected from the culture supernatant of RV1-infected cells, and the method of VanDEVANTER DR, et al. 78: 13366-13369, 2004), PCR was performed using the primer pair (DNA polymerase region) shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 that commonly detects adenovirus, and the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4) As a result, it was shown that this bat-derived adenovirus is most closely related to the tree shrew adenovirus (FIG. 4). At the gene level, it was found that the adenovirus belongs to the family Adenoviridae and the genus of mast adenovirus and has not been reported so far. RV1 virus can be obtained from DDBJ (DNA Data Bank of Japan: Accession No.). Registered as AB303301.
本発明の細胞は、長期にわたり継代培養を行うことが可能であり、コウモリ由来のウイルスの分離や増殖に優れていることが期待され、感染ウイルスの診断やワクチンの作出に有用であると考えられる。 The cells of the present invention can be subcultured over a long period of time, and are expected to be excellent in separation and propagation of bat-derived viruses, and are considered useful for diagnosis of infectious viruses and production of vaccines. It is done.
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