JP2008247926A - 低毒性のヒトインターフェロン−αアナログ - Google Patents
低毒性のヒトインターフェロン−αアナログ Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008247926A JP2008247926A JP2008161051A JP2008161051A JP2008247926A JP 2008247926 A JP2008247926 A JP 2008247926A JP 2008161051 A JP2008161051 A JP 2008161051A JP 2008161051 A JP2008161051 A JP 2008161051A JP 2008247926 A JP2008247926 A JP 2008247926A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ifnα
- amino acid
- seq
- analog
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【課題】インターフェロンαの細胞毒性を減少する方法および細胞毒性を減少したインターフェロンαを提供することを本発明の課題とする。さらに、低細胞毒性を有するヒトインターフェロンαアナログ、およびこの低毒性のインターフェロンαアナログの治療適用を提供することも、本発明の課題とする。
【解決手段】上記課題は、ポリペプチド配列のN末端部位における規定されたアミノ酸置換を作製し、インターフェロンαの細胞毒性を減少することにより解決された。また、低細胞毒性を有するヒトインターフェロンαアナログ、およびこの低毒性のインターフェロンαアナログの治療適用を提供することによって、本発明のさらなる課題が解決された。
【選択図】なし
【解決手段】上記課題は、ポリペプチド配列のN末端部位における規定されたアミノ酸置換を作製し、インターフェロンαの細胞毒性を減少することにより解決された。また、低細胞毒性を有するヒトインターフェロンαアナログ、およびこの低毒性のインターフェロンαアナログの治療適用を提供することによって、本発明のさらなる課題が解決された。
【選択図】なし
Description
(発明の分野)
本発明はヒトインターフェロンαの毒性を減少する方法、低毒性のヒトインターフェロンαアナログ、およびこれらアナログの治療的使用に関するものである。
本発明はヒトインターフェロンαの毒性を減少する方法、低毒性のヒトインターフェロンαアナログ、およびこれらアナログの治療的使用に関するものである。
(参考文献)
(発明の背景)
インターフェロン(IFN)は2つの異なる群に分類されており:I型インターフェロンとしては、IFNα、IFNβ、およびIFNω(IFNαIIとしても公知である)が挙げられ、II型インターフェロンは、IFNγ(DeMaeyerらによる総説、1988)に代表されている。ヒトでは、少なくとも17個のIFNαの非対立遺伝子、少なくとも2個のIFNβの非対立遺伝子、および1個のIFNγ遺伝子があると推定されている。
インターフェロン(IFN)は2つの異なる群に分類されており:I型インターフェロンとしては、IFNα、IFNβ、およびIFNω(IFNαIIとしても公知である)が挙げられ、II型インターフェロンは、IFNγ(DeMaeyerらによる総説、1988)に代表されている。ヒトでは、少なくとも17個のIFNαの非対立遺伝子、少なくとも2個のIFNβの非対立遺伝子、および1個のIFNγ遺伝子があると推定されている。
IFNαは様々な型の細胞増殖を阻害することが示された。IFNαは、ヘアリーセル白血病のような血液学的な悪性疾患に対して特に有効である(Quesadaら、1984)。さらに、これらのタンパクは多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、軽度リンパ腫、カポージ肉腫、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、膀胱腫瘍、および卵巣癌に対しても活性が示された(Bonnemら、1984、Oldham、1985)。特定の自己免疫および炎症性疾患の病因におけるインターフェロンとインターフェロンレセプターの役割も研究されてきた(Benoitら、1993)。
IFNαはまた、様々なタイプのウィルス感染に対して有用である(Finterら、1991)。αインターフェロンはヒト乳頭腫ウイルス感染、B型肝炎およびC型肝炎の感染に対しても活性を示した(Finterら、1991;Kashimaら、1988;Dusheikoら、1986;Davisら、1989)。
しかし、意味深いことに、IFNαの有用性はそれらの毒性によって制限されてきた。癌、およびウイルス疾患の治療におけるインターフェロンの使用は結果的に発熱、悪寒、食欲不振、体重減少、および疲労のような深刻な副作用をもたらしている(Pontzerら、1991;Oldham、1985)。このような副作用はしばしば(i)インターフェロン投薬量を処置の効果を制限するレベルに減少する、または(ii)患者の治療からの解放を必要とする。そのような毒性は、消耗性のヒトおよび動物の疾患の治療において、これらの強力な抗ウィルスおよび抗増殖性タンパクの有効性を減少させてきた。
(発明の要旨)
本発明は、以下を提供する。
(項目1) ヒトIFNαの毒性を減少させるための方法であって、成熟ヒトIFNα配列の、19番目、20番目、22番目、24番目、および27番目のアミノ酸のうち1以上のアミノ酸を、培養物中の単核細胞内のIFNαの特異的な毒性を実質的に減少させるために効果的なアミノ酸での置換する工程であって、ここで、1〜27番目のアミノ酸の大部分は天然ヒトIFNαアミノ酸である工程、を包含する方法。
(項目2) 項目1に記載の方法であって、ここで、前記置換する工程は、前記の成熟ヒトIFNα配列の19番目、20番目、22番目、および27番目のアミノ酸のうち、1以上のアミノ酸を非保存的アミノ酸で置換する工程を包含する、方法。
(項目3) 項目1に記載の方法であって、ここで、前記置換する工程が、以下の置換工程、
(a)19番目のアミノ酸をクラスIIIのアミノ酸で置換する工程;
(b)20番目のアミノ酸をクラスIVのアミノ酸で置換する工程;
(c)22番目のアミノ酸をクラスIIIのアミノ酸で置換する工程;
(d)24番目のアミノ酸をクラスVのアミノ酸で置換する工程;および、
(e)27番目のアミノ酸をクラスIVのアミノ酸で置換する工程、
のうちの1つ以上を包含する、方法。
(項目4) 項目1に記載の方法であって、ここで前記置換する工程が、以下の置換工程、
(a)19番目のアミノ酸をAspで置換する工程;
(b)20番目のアミノ酸をArgで置換する工程;
(c)22番目のアミノ酸をAsnで置換する工程;
(d)24番目のアミノ酸をLeuで置換する工程;および、
(e)27番目のアミノ酸をHisで置換する工程、
のうちの1つ以上を包含する、方法。
(項目5) 項目1に記載の方法であって、ここで、前記置換する工程が、以下の置換工程、
(a)成熟ヒトIFNα配列の19〜27番目の位置を、配列番号2に規定される9マーにより置換する工程;
(b)成熟ヒトIFNα配列の11〜27番目の位置を、配列番号4に規定される17マーにより置換する工程;
(c)成熟ヒトIFNα配列の6〜27番目の位置を、配列番号6に規定される22マーにより置換する工程;
からなる群から選択される置換工程により達成される、方法。
(項目6) 項目1に記載の方法であって、ここで、成熟ヒトIFNα配列の28〜166番目の位置は実質的に不変である、方法。
(項目7) ヒト治療で使用される低毒性のヒトIFNαアナログであって、項目1に記載の方法に従って前記アミノ酸を置換する工程により調製された、1以上の置換されたアミノ酸を有する成熟ヒトIFNαを包含する、低毒性のヒトIFNαアナログ。
(項目8) 項目7に記載のアナログであって、ここで、前記置換されたアミノ酸が19番目、20番目、22番目および、27番目の1以上の位置において非保存的アミノ酸である、アナログ。
(項目9) 項目7に記載のアナログであって、ここで、前記置換する工程が、以下の置換工程、
(a)19番目のアミノ酸をクラスIIIのアミノ酸で置換する工程;
(b)20番目のアミノ酸をクラスIVのアミノ酸で置換する工程;
(c)22番目のアミノ酸をクラスIIIのアミノ酸で置換する工程;
(d)24番目のアミノ酸をクラスVのアミノ酸で置換する工程;および、
(e)27番目のアミノ酸をクラスIVのアミノ酸で置換する工程、
のうちの1つ以上を包含する、アナログ。
(項目10) 項目7に記載のアナログであって、ここで、前記置換する工程が、以下の置換工程、
(a)19番目のアミノ酸をAspで置換する工程;
(b)20番目のアミノ酸をArgで置換する工程;
(c)22番目のアミノ酸をAsnで置換する工程;
(d)24番目のアミノ酸をLeuで置換する工程;および、
(e)27番目のアミノ酸をHisで置換する工程、
のうちの1つ以上を包含する、アナログ。
(項目11) 項目7に記載のアナログであって、ここで、前記置換する工程が、以下の置換工程、
(a)成熟ヒトIFNα配列の19〜27番目の位置を、配列番号2に規定される9マーにより置換する工程;
(b)成熟ヒトIFNα配列の11〜27番目の位置を、配列番号4に規定される17マーにより置換する工程;
(c)成熟ヒトIFNα配列の6〜27番目の位置を、配列番号6に規定される22マーによるりする工程;
からなる群から選択される置換工程により達成される、アナログ。
(項目12) 項目7に記載のアナログであって、ここで、成熟ヒトIFNα配列の28〜166番目の位置が実質的に不変である、アナログ。
(項目13) ウィルスの複製を阻害する方法であって、ウィルスに感染した細胞に、該細胞内におけるウィルスの複製を阻害する有効濃度の項目7に記載の低毒性のヒトIFNαアナログを接触させる工程を包含する、方法。
(項目14) 腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、腫瘍細胞に、該腫瘍細胞の増殖を阻害する有効濃度の項目7に記載の低毒性のヒトIFNαアナログを接触させる工程を包含する、方法。
(項目15) 自己免疫疾患の治療が必要な被験体における自己免疫疾患の処置の方法であって、該被験体に、項目7に記載の低毒性のヒトIFNαアナログの有効量を投与する工程を含有する、方法。
(項目16) 慢性炎症の治療が必要な被験体における慢性炎症の処置の方法であって、該被験体に、項目7に記載の低毒性のヒトIFNαアナログの有効量を投与する工程を含有する、方法。
(項目17) IFNαの静脈投与に応答する疾患状態の処置の方法であって、経口投与による、項目7に記載の低毒性のヒトIFNαアナログの有効量を投与する工程を含有する、方法。
1つの局面において、本発明はヒトIFNα(HuIFNα)の毒性を減少するための方法を包含する。この方法は、成熟HuIFNαの19、20、22、24、および27番目のアミノ酸の1つ以上を、培養物中のヒト単核細胞に曝した場合にそのポリペプチドペプチドの特異的な毒性を実質的に減少するのに効果的なアミノ酸と置換することを包含する。成熟HuIFNαの1〜27番目のアミノ酸残基の大部分は不変のままである。
本発明は、以下を提供する。
(項目1) ヒトIFNαの毒性を減少させるための方法であって、成熟ヒトIFNα配列の、19番目、20番目、22番目、24番目、および27番目のアミノ酸のうち1以上のアミノ酸を、培養物中の単核細胞内のIFNαの特異的な毒性を実質的に減少させるために効果的なアミノ酸での置換する工程であって、ここで、1〜27番目のアミノ酸の大部分は天然ヒトIFNαアミノ酸である工程、を包含する方法。
(項目2) 項目1に記載の方法であって、ここで、前記置換する工程は、前記の成熟ヒトIFNα配列の19番目、20番目、22番目、および27番目のアミノ酸のうち、1以上のアミノ酸を非保存的アミノ酸で置換する工程を包含する、方法。
(項目3) 項目1に記載の方法であって、ここで、前記置換する工程が、以下の置換工程、
(a)19番目のアミノ酸をクラスIIIのアミノ酸で置換する工程;
(b)20番目のアミノ酸をクラスIVのアミノ酸で置換する工程;
(c)22番目のアミノ酸をクラスIIIのアミノ酸で置換する工程;
(d)24番目のアミノ酸をクラスVのアミノ酸で置換する工程;および、
(e)27番目のアミノ酸をクラスIVのアミノ酸で置換する工程、
のうちの1つ以上を包含する、方法。
(項目4) 項目1に記載の方法であって、ここで前記置換する工程が、以下の置換工程、
(a)19番目のアミノ酸をAspで置換する工程;
(b)20番目のアミノ酸をArgで置換する工程;
(c)22番目のアミノ酸をAsnで置換する工程;
(d)24番目のアミノ酸をLeuで置換する工程;および、
(e)27番目のアミノ酸をHisで置換する工程、
のうちの1つ以上を包含する、方法。
(項目5) 項目1に記載の方法であって、ここで、前記置換する工程が、以下の置換工程、
(a)成熟ヒトIFNα配列の19〜27番目の位置を、配列番号2に規定される9マーにより置換する工程;
(b)成熟ヒトIFNα配列の11〜27番目の位置を、配列番号4に規定される17マーにより置換する工程;
(c)成熟ヒトIFNα配列の6〜27番目の位置を、配列番号6に規定される22マーにより置換する工程;
からなる群から選択される置換工程により達成される、方法。
(項目6) 項目1に記載の方法であって、ここで、成熟ヒトIFNα配列の28〜166番目の位置は実質的に不変である、方法。
(項目7) ヒト治療で使用される低毒性のヒトIFNαアナログであって、項目1に記載の方法に従って前記アミノ酸を置換する工程により調製された、1以上の置換されたアミノ酸を有する成熟ヒトIFNαを包含する、低毒性のヒトIFNαアナログ。
(項目8) 項目7に記載のアナログであって、ここで、前記置換されたアミノ酸が19番目、20番目、22番目および、27番目の1以上の位置において非保存的アミノ酸である、アナログ。
(項目9) 項目7に記載のアナログであって、ここで、前記置換する工程が、以下の置換工程、
(a)19番目のアミノ酸をクラスIIIのアミノ酸で置換する工程;
(b)20番目のアミノ酸をクラスIVのアミノ酸で置換する工程;
(c)22番目のアミノ酸をクラスIIIのアミノ酸で置換する工程;
(d)24番目のアミノ酸をクラスVのアミノ酸で置換する工程;および、
(e)27番目のアミノ酸をクラスIVのアミノ酸で置換する工程、
のうちの1つ以上を包含する、アナログ。
(項目10) 項目7に記載のアナログであって、ここで、前記置換する工程が、以下の置換工程、
(a)19番目のアミノ酸をAspで置換する工程;
(b)20番目のアミノ酸をArgで置換する工程;
(c)22番目のアミノ酸をAsnで置換する工程;
(d)24番目のアミノ酸をLeuで置換する工程;および、
(e)27番目のアミノ酸をHisで置換する工程、
のうちの1つ以上を包含する、アナログ。
(項目11) 項目7に記載のアナログであって、ここで、前記置換する工程が、以下の置換工程、
(a)成熟ヒトIFNα配列の19〜27番目の位置を、配列番号2に規定される9マーにより置換する工程;
(b)成熟ヒトIFNα配列の11〜27番目の位置を、配列番号4に規定される17マーにより置換する工程;
(c)成熟ヒトIFNα配列の6〜27番目の位置を、配列番号6に規定される22マーによるりする工程;
からなる群から選択される置換工程により達成される、アナログ。
(項目12) 項目7に記載のアナログであって、ここで、成熟ヒトIFNα配列の28〜166番目の位置が実質的に不変である、アナログ。
(項目13) ウィルスの複製を阻害する方法であって、ウィルスに感染した細胞に、該細胞内におけるウィルスの複製を阻害する有効濃度の項目7に記載の低毒性のヒトIFNαアナログを接触させる工程を包含する、方法。
(項目14) 腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、腫瘍細胞に、該腫瘍細胞の増殖を阻害する有効濃度の項目7に記載の低毒性のヒトIFNαアナログを接触させる工程を包含する、方法。
(項目15) 自己免疫疾患の治療が必要な被験体における自己免疫疾患の処置の方法であって、該被験体に、項目7に記載の低毒性のヒトIFNαアナログの有効量を投与する工程を含有する、方法。
(項目16) 慢性炎症の治療が必要な被験体における慢性炎症の処置の方法であって、該被験体に、項目7に記載の低毒性のヒトIFNαアナログの有効量を投与する工程を含有する、方法。
(項目17) IFNαの静脈投与に応答する疾患状態の処置の方法であって、経口投与による、項目7に記載の低毒性のヒトIFNαアナログの有効量を投与する工程を含有する、方法。
1つの局面において、本発明はヒトIFNα(HuIFNα)の毒性を減少するための方法を包含する。この方法は、成熟HuIFNαの19、20、22、24、および27番目のアミノ酸の1つ以上を、培養物中のヒト単核細胞に曝した場合にそのポリペプチドペプチドの特異的な毒性を実質的に減少するのに効果的なアミノ酸と置換することを包含する。成熟HuIFNαの1〜27番目のアミノ酸残基の大部分は不変のままである。
ある実施態様において、この方法は、19、20、22、および27番目のアミノ酸の1つ以上を非保存的アミノ酸と置換することを包含する。様々な実施態様において、この置換には、19番目のアミノ酸の、クラスIIIアミノ酸(特にAsp)での置換;20番目のアミノ酸の、クラスIVアミノ酸(特にArg)での置換;22番目のアミノ酸の、クラスIIIアミノ酸(特にAsn)での置換;および27番目のアミノ酸の、クラスIVアミノ酸(特にHis)での置換が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施態様において、この置換としては、24番目のアミノ酸の、クラスVアミノ酸(特にLeu)での置換が挙げられる。
別の実施態様において、この方法は、成熟HuIFNαの19〜27番目の残基間の配列を、配列番号2に規定される9マーで置換することを包含する。特に、成熟HuIFNαの19〜27番目の残基間の配列は配列番号1である。9マーの配列番号2は、成熟ヒツジインターフェロン−τ(OvIFNτ)の19〜27番目の残基に対応し、そして成熟HuIFNαとは19、20、22、24、および27番目の位置で、同一でない残基を含む。別の実施態様において、この方法は、HuIFNαの11〜27番目の残基間の配列を、配列番号4に規定される17マーで置換することを包含する。特に、成熟HuLFNαの11〜27番目の残基間の配列は配列番号3である。17マーの配列番号4は成熟OvIFNτの11〜27番目の残基に対応し、そしてHuIFNαとは11、13、14、16、19,20,22,24、および27番目の位置で、同一でない残基を含む。別の実施態様において、この方法は、HuIFNαの6〜27番目の残基間の配列を、配列番号6に規定される22マーと置換することを包含する。特に、成熟HuIFNαの6〜27番目の残基間の配列は配列番号5である。22マーの配列番号6は成熟OvIFNτの6〜27番目の残基に対応し、そしてHuIFNαとは6,7,8、11、13、14、16、19,20,22,24、および27番目の位置で、同一でない残基を含む。
関連した局面において、本発明はHuIFNαの毒性を減少させるための方法を包含する。この方法は成熟HuIFNαの19、20、22、24、および27番目のアミノ酸の1つ以上を、培養物中の単核細胞内のポリペプチドの特異的な毒性を実質的に減少するのに効果的なアミノ酸で置換することを包含し、ここで、成熟HuIFNαの28〜166番目の残基間の配列は実質的に不変である。ある実施様態において、この置換はHuIFNαの1〜27番目の残基間の配列を、配列番号8で規定される27マーで置換することにより達成される。特に、成熟HuIFNαの1〜27番目の残基間の配列は配列番号7である。27マーの配列番号8は成熟OvIFNτの1〜27番目の残基に対応し、そして、成熟HuIFNαとは、2、4、5、6、7、8、11、13、14、16、19、20、22、24、および27番目の位置で、同一でない残基を含む。
別の局面において、本発明はヒト治療における使用のための低毒性のヒトIFNαアナログを包含する。このアナログは成熟HuIFNαタンパクを包含し、このタンパクは、アミノ酸19、20、22、24、および27番目の1以上の位置での、置換されたアミノ酸を有しており、そしてこのアナログにおける1〜27番目のアミノ酸残基の大部分は天然HuIFNα残基である。このアナログは、培養物中における単核細胞の増加された生存能力によって証明されたように、天然ヒトIFNαと比較して、実質的に減少された比毒性を有しているとして特徴づけられる。
ある実施態様において、このアナログは19、20、22、および27番目の1以上の位置での、非保存的アミノ酸置換を含む。様々な実施態様において、この置換されたアミノ酸には、19番目のアミノ酸に対する、クラスIIIアミノ酸(特にAsp);20番目のアミノ酸に対する、クラスIVアミノ酸(特にArg);22番目のアミノ酸に対する、クラスIIIアミノ酸(特にAsn);および27番目のアミノ酸に対する、クラスIVアミノ酸(特にHis)が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施態様において、この置換されたアミノ酸としては、24番目のアミノ酸に対する、クラスVアミノ酸(特にLeu)が挙げられる。
別の実施態様において、このアナログは、19〜27番目の残基間を配列番号2の9マーで置換された、成熟ヒトIFNαを包含する。別の実施態様では、このアナログは、11〜27番目の残基間を配列番号4の17マーで置換された、成熟ヒトIFNαを包含する。別の実施態様では、このアナログは、6〜27番目の残基間を配列番号6の22マーで置換された成熟ヒトIFNαを包含する。
関連した局面において、本発明はヒト治療における使用のための低毒性のヒトIFNαアナログを包含し、このアナログは、アミノ酸19、20、22、24、および27番目での1以上の位置で、置換されたアミノ酸を有する成熟ヒトIFNαタンパクであって、その成熟ヒトIFNα配列の28〜166番目の残基間は実質的に不変である、成熟ヒトIFNαタンパクを包含する。このアナログは、培養物中における単核細胞の増加された生存能力によって証明されるような、天然成熟ヒトIFNαと比較して、実質的に減少された比毒性により特徴づけられる。ある実施態様では、このアナログは、1〜27番目の残基間を配列番号8の27マーで置換された成熟ヒトIFNαを包含する。
本発明はさらに、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を包含する。この方法において、腫瘍細胞に、腫瘍細胞の増殖を阻害する有効濃度の、上記タイプの低毒性のIFNαアナログを接触させる。その低毒性のIFNαアナログは任意の受容可能な薬学的処方物の一部であり得る。低毒性のIFNαアナログによりその増殖が阻害され得る腫瘍細胞としては、癌細胞、造血癌性細胞、白血病性細胞、リンパ腫細胞および黒色腫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施態様において、腫瘍細胞としては、ステロイド感受性腫瘍細胞(例えば、乳腫瘍細胞)が挙げられる。
本発明のさらに別の局面において、上記タイプの低毒性のIFNαアナログは、ウイルスの複製の阻害の方法において使用される。この方法において、ウイルス感染した細胞に、その細胞内でのウイルスの複製を阻害する有効濃度の、低毒性のIFNαアナログを接触させる。その低毒性のIFNαは任意の受容可能な薬学的処方物の一部であり得る。RNAウイルスおよびDNAウイルスの両方の複製は、低毒性のヒトIFNαにより阻害され得る。例示的なRNAウイルスとしては、ネコ白血病ウイルス、メンヨウの進行性肺炎ウイルス、ヒツジレンチウイルス、ウマ伝染病貧血ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ビスナ−マエディウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、あるいはC型肝炎ウイルス(HCV)が挙げられる。例示的なDNAウイルスとはB型肝炎ウイルス(HBV)である。
さらに別の局面において、本発明は、自己免疫疾患の処置が必要とされる被験体における、その処置の方法を包含する。ある実施態様においては、自己免疫疾患は多発性硬化症である。その方法は、薬学的有効量の上記タイプの低毒性のヒトIFNαアナログを、被験体に投与する工程を包含する。
別の局面において、本発明は、慢性炎症の処置が必要とされる被験体における、その処置の方法を包含する。ある実施態様においては、慢性炎症は潰瘍性大腸炎から生じる。その方法は、薬学的有効量の上記タイプの低毒性のヒトIFNαアナログを、被験体に投与する工程を包含する。
さらに別の局面において、本発明は上記タイプの低毒性のヒトIFNαアナログの経口投与による、静脈投与されるIFNαに応答性の任意の疾患状態の処置の方法を包含する。経口投与されるアナログは、好ましくは被験体により経口摂取される。
本発明のこれらの、および他の目的ならびに特徴は、以下の本発明の詳細な記述が、添付される図と共に読まれる場合にさらに十分に評価される。
(配列の簡単な説明)
配列番号1は、成熟ヒトIFNα(mHuIFNα)の19〜27番目の残基間のアミノ酸配列である。
配列番号1は、成熟ヒトIFNα(mHuIFNα)の19〜27番目の残基間のアミノ酸配列である。
配列番号2は、成熟ヒツジインターフェロン−τの(mOvIFNτ)19〜27番目の残基間のアミノ酸配列である。
配列番号3は、mHuIFNαの11〜27番目の残基間のアミノ酸配列である。
配列番号4は、mOvIFNτの11〜27番目の残基間のアミノ酸配列である。
配列番号5は、mHuIFNαの6〜27番目の残基間のアミノ酸配列である。
配列番号6は、mOvIFNτの6〜27番目の残基間のアミノ酸配列である。
配列番号7は、mHuIFNαの1〜27番目の残基間のアミノ酸配列である。
配列番号8は、mOvIFNτの1〜27番目の残基間のアミノ酸配列である。
配列番号9は、成熟HuIFNα(IFNα−d;GenBank受託番号J00210,PID g386796)のアミノ酸配列である。
配列番号10は、成熟IFNαアナログIFNα−N0のアミノ酸配列である。
配列番号11は、成熟IFNαアナログIFNα−N1のアミノ酸配列である。
配列番号12は、成熟IFNαアナログIFNα−N2のアミノ酸配列である。
配列番号13は、成熟IFNαアナログIFNα−N3のアミノ酸配列である。
配列番号14は、成熟IFNαアナログIFNα−N4のアミノ酸配列である。
配列番号15は、成熟IFNαアナログIFNα−N5のアミノ酸配列である。
配列番号16は、成熟IFNαアナログIFNα−N6のアミノ酸配列である。
配列番号17は、成熟IFNαアナログIFNα−N7のアミノ酸配列である。
配列番号18は、成熟OvIFNτ(oTP−1;GenBank受託番号Y00287,PID g1358)のアミノ酸配列である。
配列番号19は、IFNα−N0をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号20は、リンカー1に対するヌクレオチド配列である。
配列番号21は、リンカー2に対するヌクレオチド配列である。
配列番号22は、断片N1,正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
配列番号23は、断片N1,逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
配列番号24は、断片N2,正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
配列番号25は、断片N2,逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
配列番号26は、断片N3,正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
配列番号27は、断片N3,逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
配列番号28は、断片N4,正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
配列番号29は、断片N4,逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
配列番号30は、断片N5,正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
配列番号31は、断片N5,逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
配列番号32は、断片N6,正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
配列番号33は、断片N6,逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
配列番号34は、断片N7,正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
配列番号35は、断片N7,逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。
(発明の詳細な説明)
(I 定義)
インターフェロン−α(IFNα)とは、配列番号9で表される成熟IFNαタンパク質配列と70%を超える、もしくは、好ましくは約80%を超える、あるいは、さらに好ましくは約90%を超えるアミノ酸の同一性を有する、インターフェロンタンパクのファミリーの任意の1つをいう。アミノ酸配列の同一性は、例えば、デフォルトパラメーターをもちいてLALIGNプログラムを使用して決定され得る。このプログラムは配列比較プログラムのFASTA version 1.7 suite(Pearson and Lipman 1988;Pearson,1990;William R.Pearson,Department of Biological Chemistry,Box440,Jordan Hall,Charlottesville,VAから利用可能なプログラム)の中に見られる。代表的に、IFNαは以下の特徴の群からの少なくとも1つの特徴を有している;(a)抗ウイルス特性、(b)抗細胞増殖特性、および(c)核酸によるか、またはウイルスによる誘導性。好ましいIFNαはヒト由来である。
(I 定義)
インターフェロン−α(IFNα)とは、配列番号9で表される成熟IFNαタンパク質配列と70%を超える、もしくは、好ましくは約80%を超える、あるいは、さらに好ましくは約90%を超えるアミノ酸の同一性を有する、インターフェロンタンパクのファミリーの任意の1つをいう。アミノ酸配列の同一性は、例えば、デフォルトパラメーターをもちいてLALIGNプログラムを使用して決定され得る。このプログラムは配列比較プログラムのFASTA version 1.7 suite(Pearson and Lipman 1988;Pearson,1990;William R.Pearson,Department of Biological Chemistry,Box440,Jordan Hall,Charlottesville,VAから利用可能なプログラム)の中に見られる。代表的に、IFNαは以下の特徴の群からの少なくとも1つの特徴を有している;(a)抗ウイルス特性、(b)抗細胞増殖特性、および(c)核酸によるか、またはウイルスによる誘導性。好ましいIFNαはヒト由来である。
インターフェロン−τ(IFNτ)とは、配列番号18で表される成熟IFNτ配列と70%を超える、または、好ましくは約80%を超える、または、より好ましくは約90%を超えるアミノ酸の同一性を有するインターフェロンタンパクのファミリーの任意の1つをいう。代表的に、IFNτは以下の特徴の群からの少なくとも1つの特徴を有している;(a)胚/胎児期間の栄養外胚葉/胎盤による発現、(b)抗黄体消退化特性、(c)抗ウイルス特性、および(d)抗細胞増殖特性。好ましいIFNτは、ヒツジおよびウシIFNτである。
「成熟タンパク」とは、リーダー配列の除去後のIFNタンパクをいう。成熟IFNタンパク配列は、成熟タンパク配列のCys1に対応する、完全IFNアミノ酸配列のCys24残基より始まる。
あるポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド断片は、それが由来する配列または断片中に存在しているものと同じヌクレオチドの配列を、そのポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド断片が含む場合に、それは別のポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド断片に「由来する」。例えば、細菌のプラスミドは、そのインサート中のポリヌクレオチド配列が、ある選択されたヒト遺伝子中のポリヌクレオチド配列と同じである場合は、その選択されたヒト遺伝子に「由来する」インサートを保持する。
同様に、あるポリペプチド配列またはポリペプチド断片は、それが由来する配列または断片中に存在する配列と同じアミノ酸の配列を、そのポリペプチド配列またはポリペプチド断片が保持している場合に、それは別のポリペプチド配列またはポリペプチド断片に「由来する」。
2つのアミノ酸配列に関して、同一パーセント(%)とは、それら配列が最適に整列化され「ギャップ」に対してペナルティーを割り当てない場合での、その2つの配列における同一残基のパーセント(%)をいう。つまり、第一配列を第二配列と共に最適に整列化するために、ギャップを第一配列中に挿入する必要がある場合は、同一パーセント(%)は対応するアミノ酸残基とペアとなる残基のみを用いて計算される(すなわち、その計算は、第一配列の「ギャップ」中に存在する、第二配列中の残基を考慮しない)。最適整列化は、最も高い同一パーセント(%)のスコアーを与える整列化として定義される。そのような整列化は、「GENEWORKS」プログラムを用いて実行され得る。あるいは、整列化は1のktup、デフォルトパラメーター、およびデフォルトPAMを有するローカルアライメントプログラムLALIGNを用いて実行され得る。
「保存的置換」とは、あるクラスのアミノ酸の、同クラスのアミノ酸での置換をいい、ここで、クラスとは、共通の物理化学的なアミノ酸側鎖の特性、および(標準Dayhoff交換頻度マトリックスにより決定されるような)天然に見られる相同タンパクにおける高い置換頻度によって規定される。上記のように分類された、アミノ酸側鎖の6つ一般的のクラスとしては、クラスI(Cys);クラスII(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly);クラスIII(Asn、Asp、Gln、Glu);クラスIV(His、Arg、Lys);クラスV(Ile、Leu、Val、Met);およびクラスVI(Phe、Tyr、Trp)が挙げられる。例えば、Aspの、Asn、Gln、あるいはGluのようなクラスIIIの別の残基での置換は、保存的置換である。
「非保存的置換」とは、あるクラスのアミノ酸の、別のクラス由来のアミノ酸での置換をいう(例えば、クラスII残基であるAlaの、Asp、Asn、Glu、またはGlnのようなクラスIII残基での置換)。
疾患の「処置」とは、疾患の症状および/または疾患の重篤度を減少するのに効果的な治療物質を投与することをいう。
(II.低毒性のヒトIFNαアナログ)
本発明は、成熟HuIFNαにおける19、20、22、24、および27番目のアミノ酸位置の1以上にアミノ酸置換を導入するより、HuIFNαの細胞毒性を有意的に減少させ得ることの知見に基づいている。
本発明は、成熟HuIFNαにおける19、20、22、24、および27番目のアミノ酸位置の1以上にアミノ酸置換を導入するより、HuIFNαの細胞毒性を有意的に減少させ得ることの知見に基づいている。
図1は、成熟HuIFNαの最初の27N末端アミノ酸残基(配列番号9)、および成熟OvIFNτの最初の27N末端アミノ酸残基(配列番号18)を示しており、ここで、非同一残基は太字で示されている。OvIFNτ置換のサブセットを含むHuIFNαアナログは、実施例1において記載されているように調製された。各HuIFNαアナログの1〜27番目の位置は、図1に示され、その置換は太字で示されている。各アナログの28〜166番目のアミノ酸は、HuIFNα残基のままである(例えば、配列番号9の28〜166番目の残基)。
IFNα−N0〜IFNα−N7(配列番号10〜配列番号17)と称するHuIFNαアナログに対して、実施例2および実施例3に記載される細胞毒性のアッセイを行った。HuIFNαと共にインキュベートされた肝細胞は、生存度において有意的な低下が示された(表1、実施例2)。対照的に、IFNαアナログIFNα−N0と共にインキュベートした細胞は、親出願に報告されたように、本質的に生存度の減少を示さなかった。
IFNα−N1からIFNα−N7までのアナログに対して、実施例3に記載される細胞毒性のアッセイを行った。様々な量のOvIFNτ、または様々な量のIFNα−N0と共にインキュベートした末梢血単核細胞(PBMC)は、7日間のインキュベート後、本質的に生存度の減少は示さなかった。アナログ−N1あるいはアナログ−N3と共にインキュベートしたPBMCは、HuIFNαに対して観察されたのと同様のレベルで、生存度の有意的な低下を示した。従って、アナログ−N1およびアナログ−N3における、2、4、5、6、7、8、11、13、および14番目の位置での置換は、HuIFNαの細胞毒性の減少には、比較的、効果がないものである。IFNα−N4と共にインキュベートした細胞は、HuIFNαと共にインキュベートした細胞の生存度およびOvIFNτと共にインキュベートした細胞の生存度との間のレベルでの生存度を保持していた。従って、16、19、および20番目の位置での、さらなる置換は、HuIFNαの毒性の減少に部分的に効果的である。
IFNαアナログIFNα−N5、IFNα−N6、およびIFNα−N7とインキュベートしたPBMCは、7日間のインキュベート後、本質的に生存度の低下を示さなかった(表2)。これら3アナログはOvIFNαの低い細胞毒性を保持し、そしてさらに、HuIFNα細胞毒性の減少の原因となる位置を規定する。最も際立ったことに、アナログIFNα−N7は、19、20、22、24、および27番目の位置での、5つのみの置換を有している。他の低細胞毒性を示したアナログ、−N0、−N5および−N6は、これらの位置および、さらなる位置においての置換を有している(図1)。アナログIFNα−4は、本試験において中程度の細胞毒性のレベルを示すが、位置22、24、および27での置換を欠いている。本発明に従って、本データは、19、20、22、24、および27番目の残基が、これらのタンパクの細胞毒性において顕著な役割を果たしていることを実証している。
より具体的には、本発明は、19、20、22、24、および27番目の位置での1以上のアミノ酸置換を含有しているHuIFNαアナログで、その残りのアミノ酸の大部分が天然HuIFNα残基である、HuIFNαアナログを意図している。このアナログは、天然ヒトIFNαと関連する治療特性とともに、本明細書に記載されている細胞毒性アッセイによって測定されたような減少された毒性を有している。
好ましい置換としては、以下の1つ以上が挙げられる:成熟HuIFNαの19番アミノ酸は、成熟OvIFNτのAsp19、あるいは同クラスの残基であるAsn、Gln、またはGluで置換され得る;成熟HuIFNαの20番アミノ酸は、成熟OvIFNτのArg20、あるいは同クラスの残基であるHisまたはLysと置換され得る;成熟HuIFNαの22番アミノ酸は、成熟OvIFNτのAsn22、あるいは同クラスの残基であるAsp、Gln、またはGluと置換され得る;成熟HuIFNαの24番アミノ酸は、成熟OvIFNτのLeu24、あるいは同クラスの残基であるValまたはMetと置換され得る;および、成熟HuIFNαの27番アミノ酸は、OvIFNτのHis27、あるいは同クラスの残基であるArgまたはLysと置換され得る。このような置換は、HuIFNαの毒性を減少するのに効果的であるが、望ましいHuIFNαの治療特性を有意には変えない。
いくつかの低毒性のHuIFNαアナログの変化された位置を包囲する、他の例示的配列としては、配列番号2、配列番号4、および配列番号6として本明細書に記載される配列が挙げられる。最も好ましい実施態様は、OvIFNτにおいて非同一である位置における、19〜27番目の領域において置換されたHuIFNαアナログである。例えば、成熟ヒトIFNαの19〜27番目のアミノ酸(配列番号1)が、成熟OvIFNτの19〜27番目のアミノ酸(配列番号2)で置換される構築物は、結果として、成熟ヒトIFNαの19、20、22、24、および27番目の位置での変化を生じるが、残りの成熟ヒトIFNα配列は、不変のままである。この例はアナログIFNα−N7(配列番号17)と対応する。
記載された低毒性のヒトIFNαアナログは「成熟」タンパクである、すなわち、それらは(成熟タンパクのCys1に対応する)完全なインターフェロン配列のCys24残基から始まるが、本発明はまたリーダー配列を含むIFNαアナログ(すなわち、開始メチオニンから始まる)を包含することは、理解され得る。そのようなヒトIFNαにおけるリーダー配列はヒトIFNα、ヒツジIFNτ、または別のI型インターフェロンに由来し得る。
先に指摘されたように、本発明のHuIFNαアナログに対して意図される重要な利点とは、天然ヒトIFNαと比較した、アナログの減少された毒性である。このHuIFNαアナログは天然ヒトIFNαと同じ生物学的活性を有し得る。
(III 組換え操作および合成操作)
HuIFNαアナログIFNα−N0をコードする合成遺伝子の構築は、実施例1Aに記載されている。手短には、最初の27N末端の位置における15全てのOvIFNτでの置換を含んでいる成熟HuIFNαのアミノ酸配列(配列番号10)は、Pichia pastorisに対して最適化されたコドン使用頻度で、復帰(back)翻訳された。そのヌクレオチド配列は、その構築物の全長にわたり、間隔を置いて配置された5つの制限部位を含むよう編集された。その合成遺伝子配列は4つのヌクレオチド断片に分けられた。個々の断片は(各、長さ約150塩基対)は、オリゴヌクレオチドの連続的ライゲーションにより構築された。その断片は細菌のベクターの中に連続的にクローン化され、IFNα−N0(配列番号19)をコードする遺伝子を生じた。合成遺伝子は次にPichia pastorisにおける発現のためのpPICZ−αベクターの中にクローン化された。アナログIFNα−N1からIFNα−N7をコードする合成遺伝子はまた、実施例1Aにおいて記載されるようなオリゴヌクレオチドの連続的ライゲーションによって構築された。
HuIFNαアナログIFNα−N0をコードする合成遺伝子の構築は、実施例1Aに記載されている。手短には、最初の27N末端の位置における15全てのOvIFNτでの置換を含んでいる成熟HuIFNαのアミノ酸配列(配列番号10)は、Pichia pastorisに対して最適化されたコドン使用頻度で、復帰(back)翻訳された。そのヌクレオチド配列は、その構築物の全長にわたり、間隔を置いて配置された5つの制限部位を含むよう編集された。その合成遺伝子配列は4つのヌクレオチド断片に分けられた。個々の断片は(各、長さ約150塩基対)は、オリゴヌクレオチドの連続的ライゲーションにより構築された。その断片は細菌のベクターの中に連続的にクローン化され、IFNα−N0(配列番号19)をコードする遺伝子を生じた。合成遺伝子は次にPichia pastorisにおける発現のためのpPICZ−αベクターの中にクローン化された。アナログIFNα−N1からIFNα−N7をコードする合成遺伝子はまた、実施例1Aにおいて記載されるようなオリゴヌクレオチドの連続的ライゲーションによって構築された。
Pichiaにおける合成遺伝子の発現(実施例1B)は、組換えHuIFNαアナログの大量発現をもたらした。組換えHuIFNαアナログは、同じPichia pastoris系を用いて発現された、組換えOvIFNτの抗ウイルス活性と類似の抗ウイルス活性(実施例1C)を示した。
(IV.有用性)
(A.抗ウイルス特性)
I型インターフェロンは強力な抗ウイルス特性を示す。IFNαと比較して、IFNτの減少された毒性は、成熟タンパクの最初の27N末端残基内に存在する非保存的アミノ酸に起因すると思われる。これらのアミノ酸残基での、IFNαのN末端部分のその対応する残基についての置換は、結果として生じたHuIFNαアナログの細胞毒性を減少するようであるが、I型インターフェロンの抗ウイルス活性を保持するようである。従って、本発明の低毒性のHuIFNαアナログを含有する処方物は、ウイルスの複製を阻害するために使用され得る。
(A.抗ウイルス特性)
I型インターフェロンは強力な抗ウイルス特性を示す。IFNαと比較して、IFNτの減少された毒性は、成熟タンパクの最初の27N末端残基内に存在する非保存的アミノ酸に起因すると思われる。これらのアミノ酸残基での、IFNαのN末端部分のその対応する残基についての置換は、結果として生じたHuIFNαアナログの細胞毒性を減少するようであるが、I型インターフェロンの抗ウイルス活性を保持するようである。従って、本発明の低毒性のHuIFNαアナログを含有する処方物は、ウイルスの複製を阻害するために使用され得る。
本発明の低毒性のHuIFNαアナログは、胎児と母体間の免疫関係に影響を及ぼす方法において(例えば、母方のウイルス(例えば、HIV)の成長中の胎児への伝染を防ぐことにおいて、)必要とされ得る。同種のタンパク質を用いると強力な抗原の応答は、あまりないようなので、これらのヒトインターフェロンアナログは、特にヒト治療のために有効である。
(B.抗細胞増殖特性)
I型インターフェロンは強力な抗細胞増殖活性を示す。本明細書に記載されるような低毒性のヒトIFNαアナログはまた、近年公知である、他のインターフェロンと関連するネガティブな副作用なしで、細胞増殖を阻害するために使用され得る。本発明の低毒性のIFNαアナログを包含する処方物は、腫瘍増殖を阻害するか、防ぐか、あるいは遅らせるために使用され得る。
I型インターフェロンは強力な抗細胞増殖活性を示す。本明細書に記載されるような低毒性のヒトIFNαアナログはまた、近年公知である、他のインターフェロンと関連するネガティブな副作用なしで、細胞増殖を阻害するために使用され得る。本発明の低毒性のIFNαアナログを包含する処方物は、腫瘍増殖を阻害するか、防ぐか、あるいは遅らせるために使用され得る。
(C.免疫系障害)
本発明の方法を使用して処置され得る疾患としては、自己免疫性、炎症性、増殖性、および過剰の増殖性疾患、ならびに免疫学的に媒介された疾患の皮膚での発症が挙げられる。特に、本発明の方法は、免疫系の過敏症に関係する状態を処置するために有利である。免疫系の過敏症には4つの型がある。I型、あるいは即時型の/アナフィラキシー性の過敏症は、アレルゲン(例えば、花粉)に対する応答におけるマスト細胞の脱顆粒によるものであり、そして、そのような過敏症としては、喘息、アレルギー性鼻炎(枯草熱)、じんま疹(発疹)、アナフィラキシーショック、および他のアレルギー性の疾患が挙げられる。II型、あるいは自己免疫性の過敏症は、身体自身の細胞上で認識された「抗原」に対して向けられた抗体に起因するものである。III型過敏症は、様々な組織中に留まり、そしてさらなる免疫応答を活性化する抗原/抗体免疫複合体の形成に起因するものであり、そして、III型過敏症は、血清病、アレルギー性肺胞炎、およびブースターワクチン接種後に時折形成される大きい腫脹のような状態の原因となる。IV型過敏症は、炎症反応を生じる感作T細胞からのリンフォカインの放出に起因するものである。例としては、接触皮膚炎、はしかの発疹、および特定の薬物に対する「アレルギー」反応が挙げられる。
本発明の方法を使用して処置され得る疾患としては、自己免疫性、炎症性、増殖性、および過剰の増殖性疾患、ならびに免疫学的に媒介された疾患の皮膚での発症が挙げられる。特に、本発明の方法は、免疫系の過敏症に関係する状態を処置するために有利である。免疫系の過敏症には4つの型がある。I型、あるいは即時型の/アナフィラキシー性の過敏症は、アレルゲン(例えば、花粉)に対する応答におけるマスト細胞の脱顆粒によるものであり、そして、そのような過敏症としては、喘息、アレルギー性鼻炎(枯草熱)、じんま疹(発疹)、アナフィラキシーショック、および他のアレルギー性の疾患が挙げられる。II型、あるいは自己免疫性の過敏症は、身体自身の細胞上で認識された「抗原」に対して向けられた抗体に起因するものである。III型過敏症は、様々な組織中に留まり、そしてさらなる免疫応答を活性化する抗原/抗体免疫複合体の形成に起因するものであり、そして、III型過敏症は、血清病、アレルギー性肺胞炎、およびブースターワクチン接種後に時折形成される大きい腫脹のような状態の原因となる。IV型過敏症は、炎症反応を生じる感作T細胞からのリンフォカインの放出に起因するものである。例としては、接触皮膚炎、はしかの発疹、および特定の薬物に対する「アレルギー」反応が挙げられる。
いくらかの個体において、特定の状態から結果として過敏症になり得る機構は、一般的にはよく理解されていないが、遺伝的および外因性要因の両方を含み得る。例えば、細菌、ウイルス、あるいは薬物は、すでに自己免疫障害に対する遺伝的素因を有している個体における、自己免疫応答を誘発する役割を果たし得る。いくつかの型の過敏症の発生数は、他の過敏症と相関し得ると示唆されてきた。例えば、特定の通常のアレルギーを有する個体は、自己免疫疾患に対してより感受性であることが提唱されている。
自己免疫障害は、特定の器官あるいは特定の組織に主に制限されるもの、および体全体が罹患するものとに大まかに分類され得る。器官特異的障害の例(罹患する器官と共に)としては、多発性硬化症(神経突起上のミエリンコーティング)、I型糖尿病(膵臓)、橋本甲状腺炎(甲状腺)、悪性貧血(胃)、アジソン病(副腎)、重症筋無力症(神経筋接合部のアセチルコリンレセプター)、慢性関節リウマチ(関節内層(joint lining))、ブドウ膜炎(眼)、乾癬(皮膚)、ギヤン−バレー症候群(神経細胞)、およびグレーブス病(甲状腺)が挙げられる。全身性自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデスおよび皮膚筋炎が挙げられる。
過敏症障害の他の例としては、喘息、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、他の湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、鼻炎、扁平苔癬、天疱瘡(pemplugus)、水疱性類天疱瘡、表皮水疱症、ウルティカリス(uritcaris)、血管性水腫、脈管炎(vasculitides)、紅斑、皮膚性好酸球増加症、円形脱毛症、アテローム性動脈硬化症、原発性胆汁性肝硬変、およびネフローゼ症候群が挙げられる。関連する疾患としては、セリアック病(ceriac
disease)、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、炎症性腸疾患、クローン病、および潰瘍性大腸炎のような腸炎ならびに食物関連のアレルギーが挙げられる。
disease)、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、炎症性腸疾患、クローン病、および潰瘍性大腸炎のような腸炎ならびに食物関連のアレルギーが挙げられる。
本発明の方法を使用する処置を特に受け入れられる自己免疫疾患としては、多発性硬化症、I型(インシュリン依存性の)糖尿病、エリテマトーデス、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、慢性間接リウマチ、口内炎、喘息、ブドウ膜炎、アレルギー、および乾癬が挙げられる。
本発明の低毒性のHuIFNαアナログを含有する医薬は、治療的処置に使用され得、そしてそれによって、先に議論されたような自己免疫障害の症状を緩和し得る。
(D.薬学的組成物)
本発明の低毒性のヒトIFNαアナログは、薬学的に有用な組成物を調製するための、公知の方法に従って処方され得る。インターフェロンおよびインターフェロン様化合物を含有する処方物は、以前に記載されている(例えば、Martin、1976)。一般に、本発明の組成物は、有効量のインターフェロンアナログが、組成物の効果的な投与を容易にするために適切なキャリア−と組み合わせ得るよう処方される。
本発明の低毒性のヒトIFNαアナログは、薬学的に有用な組成物を調製するための、公知の方法に従って処方され得る。インターフェロンおよびインターフェロン様化合物を含有する処方物は、以前に記載されている(例えば、Martin、1976)。一般に、本発明の組成物は、有効量のインターフェロンアナログが、組成物の効果的な投与を容易にするために適切なキャリア−と組み合わせ得るよう処方される。
これらの治療において使用される組成物もまた、様々な形態で存在し得る。これらには、例えば、錠剤、丸剤、粉末、溶液あるいは懸濁液、リポソーム、坐剤、注射剤、および不融性溶液のような、固体の、半固体の、および液体の投薬形態が挙げられる。好ましい形態は、投与、および治療的適用の意図される形態に依存する。その組成物はまた、好ましくは当業者に公知である、従来の薬学的に受容可能なキャリアーおよびアジュバンドを含有する。好ましくは、その本発明の組成物は1ユニットの投与量の形態で存在しており、そして通常一日あたり一回以上、患者に投与される。
低毒性のヒトIFNαアナログ、または関連したポリペプチドは、経口摂取、吸入、鼻腔内噴霧、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、病変内注射、あるいは皮下注射を含む、任意の薬学的に受容可能な投薬形態で、患者に投与され得る。特に、他のインターフェロン化合物に対して使用される組成物および方法は、これらアナログの送達に使用され得る。
しかし、本発明のIFNαアナログの一つの重要の利点は、それらの極度に低い細胞毒性である。この低毒性のために、他のインターフェロン(例えば、天然ヒトIFNα)化合物について一般に利用され得る濃度よりさらに高い濃度で、そのインターフェロンアナログを投与することが可能である。従って、本発明の低毒性のHuIFNαアナログは約5×104ユニット/日から20×106ユニット/日までから、約500×106ユニット/日以上の速度で投与され得ることが意図される。好ましい実施態様では、その投与量は約20×106ユニット/日である。高い投与量は全身投与にとって好ましい。もちろん、この発明の組成物および方法は、他の治療との併用においても使用され得ることは理解されるべきである。
一旦、患者の状態が改善されると、必要な場合に維持量が投与される。その後、症状の関数としての、投与量または投与頻度、あるいは両者は、改善された状態が保持されるレベルまで減少され得る。症状が望ましいレベルに緩和された場合は、処置は終止するべきである。しかし、患者は、任意の疾患症状の再発に際して長期的な体制の、間欠性の処置を必要とし得る。
本発明のIFNαアナログは、他のインターフェロンが以前に活性を示した疾患を含む、様々な癌およびウイルス性疾患を処置するために、標準手順によって投与され得る(例えば、Finterら、1991;Dianzani、1992;Francisら、1992、および米国特許第4,885,166号および米国特許第4,975,276号を参照のこと)。しかし、先に議論されたように、本発明のIFNαアナログは、毒性なしでこれらの状態を処置するそれらの能力を含めた、独特の特徴および利点を有している。
(E.皮膚障害の処置)
皮膚の障害は、病変内局的に本発明の低毒性のインターフェロンアナログを用いて処置され得、ここで、処方物および投与量は、投与方法、ならびに処置されるべき病変のサイズおよび重篤度に依存する。好ましい方法としては、皮内および皮下注射が挙げられる。大きい病変内への複数の注射は可能とされ得、そして一人の患者のいくつかの皮膚上の病変は、一度に処置され得る。投与のスケジュールは、当業者により決定され得る。持続的に放出されるようデザインされた処方物は投与頻度を減少させ得る。
皮膚の障害は、病変内局的に本発明の低毒性のインターフェロンアナログを用いて処置され得、ここで、処方物および投与量は、投与方法、ならびに処置されるべき病変のサイズおよび重篤度に依存する。好ましい方法としては、皮内および皮下注射が挙げられる。大きい病変内への複数の注射は可能とされ得、そして一人の患者のいくつかの皮膚上の病変は、一度に処置され得る。投与のスケジュールは、当業者により決定され得る。持続的に放出されるようデザインされた処方物は投与頻度を減少させ得る。
(F.全身処置)
全身処置は、実質的に全ての適用と等価である。複数の静脈内、皮下、および/または筋肉内投与は可能であり、そして処置のための移植可能な方法の場合、持続的に放出されるようデザインされた処方物は、特に有用である。患者はまた、移植可能な皮下の入口、リザーバー、またはポンプを用いて処置され得る。
全身処置は、実質的に全ての適用と等価である。複数の静脈内、皮下、および/または筋肉内投与は可能であり、そして処置のための移植可能な方法の場合、持続的に放出されるようデザインされた処方物は、特に有用である。患者はまた、移植可能な皮下の入口、リザーバー、またはポンプを用いて処置され得る。
(G.局所的処置)
本発明の低毒性のIFNαアナログを用いた局所的処置は、特定の器官における癌の処置に有用である。処置は動脈内注入により達成され得る。カテーテルは罹患した器官を直接的処置するために外科的に、あるいは血管造影的に移植され得る。カテーテルを連結された皮下の入口は、慢性的な処置に使用され得るか、あるいは移植可能な、補充可能なポンプもまた使用され得る。
本発明の低毒性のIFNαアナログを用いた局所的処置は、特定の器官における癌の処置に有用である。処置は動脈内注入により達成され得る。カテーテルは罹患した器官を直接的処置するために外科的に、あるいは血管造影的に移植され得る。カテーテルを連結された皮下の入口は、慢性的な処置に使用され得るか、あるいは移植可能な、補充可能なポンプもまた使用され得る。
以下の実施例は本発明を説明するが、決して本発明の制限を意図するものではない。
(材料および方法)
制限エンドヌクレアーゼ、T4DNAリガーゼ、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、および仔ウシ腸フォスファターゼはNew England Biolabs(Beverly、MA)またはPromega Biotech(Madison、WI)より購入した:これらの試薬は製品説明書に従って使用した。シークエンシング反応のために、「SEQUENASE DNA II」シークエンシングキットを使用した(United States Biochemical Corporation、Cleveland OH)。免疫ブロット試薬および他の試薬は、Sigma Chemical Co.(St.Louis、MO)またはFisher Scientific(Needham、MA)より購入した。ニトロセルロースフィルターはSchleicher and Schuell(Keene、NH)より入手した。
制限エンドヌクレアーゼ、T4DNAリガーゼ、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、および仔ウシ腸フォスファターゼはNew England Biolabs(Beverly、MA)またはPromega Biotech(Madison、WI)より購入した:これらの試薬は製品説明書に従って使用した。シークエンシング反応のために、「SEQUENASE DNA II」シークエンシングキットを使用した(United States Biochemical Corporation、Cleveland OH)。免疫ブロット試薬および他の試薬は、Sigma Chemical Co.(St.Louis、MO)またはFisher Scientific(Needham、MA)より購入した。ニトロセルロースフィルターはSchleicher and Schuell(Keene、NH)より入手した。
合成オリゴヌクレオチドリンカーおよびプライマーは、市販の自動オリゴヌクレオチドシンセサイザー(例えば、ABI model 380B−02 DNA synthesizer(Applied Biosystems、Foster City、CA))を使用して調製した。あるいは、カスタム設計された合成オリゴヌクレオチドは、例えば、Synthetic Genetics(San Diego、CA)より購入され得る。CDNA合成キットおよびランダムプライミングラベリングキットは、Boehringer−Mannheim Biochemical(BMB、Indianapolis、IN)より入手した。
ポリペプチドをコードしているオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド合成の標準的な方法によって直接的に合成され得るか、あるいはコードする配列が大きい場合には、コード配列に対応する、複数のオリゴヌクレオチド断片の直列の並びを含む一連のクローニング工程により合成され得るか(Yoshioら、1989;Eatonら、1988)のいずれか一方で合成され得る。オリゴヌクレオチドのコード配列は、標準的な組換え手順により発現され得る(Maniatisら、1982;Ausubelら、1988)。あるいは、ペプチドは標準的なin vitro技術(Applied Biosystems、Foster City CA)より直接的に合成され得る。
組換えヒトIFNαAは、Biosource International(Camarillo、CA)より入手した。他に示されない限り、タンパク濃度はビシンコニニン(bicinchoninic)酸アッセイキット(Pierce、Rockford IL)を製品説明書に従って用い、決定した。
本研究で使用した、全ての組織培養培地、血清、およびIFNは内毒素に対して陰性であり、その内毒素は0.07ng/mlの感度レベルでのリムルスアメーバ様細胞ライセート(Cape Cod、Woods Hole、MAの共同研究者)を用いたアッセイにより決定した。
(実施例1)
(HuIFNαアナログのクローニングおよび発現)
(A.HuIFNαアナログをコードする合成遺伝子の構築)
最初の27N末端の位置に15全てのOvIFNτ置換を含むHuIFNαのアミノ酸配列(配列番号10)を、Pichia pastorisに最適化されたコドン使用頻度で復帰(back)翻訳された。そのヌクレオチド配列は、その構築物の全長にわたり間隔を置いて配置された、5つの制限部位を含むように編集された。その合成遺伝子配列は4つのヌクレオチド断片に分けられた。個々の断片は(各、長さ約150塩基対)は、オリゴヌクレオチドの連続的ライゲーションにより構築された。それら断片はG2細菌ベクターの中に連続的にクローン化され、IFNα−N0(配列番号19)コードする遺伝子を生じた。さらに合成遺伝子は細菌ベクターから切り出され、Pichia pastorisにおける発現用のpPICZ−αベクター(Invitrogen、San Diego CA)のXhoI/NotI部位中にライゲーションした。
(HuIFNαアナログのクローニングおよび発現)
(A.HuIFNαアナログをコードする合成遺伝子の構築)
最初の27N末端の位置に15全てのOvIFNτ置換を含むHuIFNαのアミノ酸配列(配列番号10)を、Pichia pastorisに最適化されたコドン使用頻度で復帰(back)翻訳された。そのヌクレオチド配列は、その構築物の全長にわたり間隔を置いて配置された、5つの制限部位を含むように編集された。その合成遺伝子配列は4つのヌクレオチド断片に分けられた。個々の断片は(各、長さ約150塩基対)は、オリゴヌクレオチドの連続的ライゲーションにより構築された。それら断片はG2細菌ベクターの中に連続的にクローン化され、IFNα−N0(配列番号19)コードする遺伝子を生じた。さらに合成遺伝子は細菌ベクターから切り出され、Pichia pastorisにおける発現用のpPICZ−αベクター(Invitrogen、San Diego CA)のXhoI/NotI部位中にライゲーションした。
IFNα−N1からIFNα−N7のアナログをコードしている合成遺伝子もまた、オリゴヌクレオチドの連続的ライゲーションにより構築した。上記のpPICZ−α/IFNα−N0構築物をXbaIおよびBstEIIを用いて消化し、そしてアニールされたオリゴヌクレオチドリンカー1(配列番号20)およびリンカー2(配列番号21)を、これらの部位中にライゲーションし、中間体ベクター構築物を作成した。この工程で、IFNα−N0のN末端部分に対応するヌクレオチド配列を除去し、以下に列挙されるヌクレオチド断片により置換した。中間体ベクター構築部をXhoIおよびEcoRIを用いて消化した。連続的ライゲーションによって調製した、以下に示すヌクレオチド断片は、次にその中間体構築物のXhoI/EcoRI部位中にライゲーションし、pPICZ−αベクター中にIFNα−N1からIFNα−N7までの各アナログを作成した。
IFNα−N1 断片N1正方向 配列番号22
断片N1逆方向 配列番号23
IFNα−N2 断片N2正方向 配列番号24
断片N2逆方向 配列番号25
IFNα−N3 断片N3正方向 配列番号26
断片N3逆方向 配列番号27
IFNα−N4 断片N4正方向 配列番号28
断片N4逆方向 配列番号29
IFNα−N5 断片N5正方向 配列番号30
断片N5逆方向 配列番号31
IFNα−N6 断片N6正方向 配列番号32
断片N6逆方向 配列番号33
IFNα−N7 断片N7正方向 配列番号34
断片N7逆方向 配列番号35
(B.PichiaにおけるHuIFNαアナログの発現)
組換えインターフェロンアナログの発現のために、各遺伝子のコード配列を、pPICZ−α発現ベクター(Invitrogen、San Diego、CA)のXhoIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼ部位を使用してそのベクター内に挿入した。pPICZ−α発現ベクターは組換えインターフェロンの発現および精製を容易にする様々な要素を提供する。例えば、そのベクターは、メタノール調節性アルコールオキシダーゼ(AOX)プロモーターを含有する発現カセットを含んでいる。メタノールで増殖させた酵母細胞内において、およそ5%のpolyA+ RNAはAOX1遺伝子由来である。さらに、そのベクターはまた、培養培地中へのタンパクの分泌を指示する、Saccharomyces cerevisiaeのαファクターのプレプロペプチド由来の分泌シグナル配列を含有する。また、そのベクターによって、Sh ble遺伝子(Streptoalloteichus hindustanus ble遺伝子)によりコードされるゼオシン(Zeocin)抗生物質を用いて、組換え細菌細胞および組換え酵母細胞の選択を提供する。
断片N1逆方向 配列番号23
IFNα−N2 断片N2正方向 配列番号24
断片N2逆方向 配列番号25
IFNα−N3 断片N3正方向 配列番号26
断片N3逆方向 配列番号27
IFNα−N4 断片N4正方向 配列番号28
断片N4逆方向 配列番号29
IFNα−N5 断片N5正方向 配列番号30
断片N5逆方向 配列番号31
IFNα−N6 断片N6正方向 配列番号32
断片N6逆方向 配列番号33
IFNα−N7 断片N7正方向 配列番号34
断片N7逆方向 配列番号35
(B.PichiaにおけるHuIFNαアナログの発現)
組換えインターフェロンアナログの発現のために、各遺伝子のコード配列を、pPICZ−α発現ベクター(Invitrogen、San Diego、CA)のXhoIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼ部位を使用してそのベクター内に挿入した。pPICZ−α発現ベクターは組換えインターフェロンの発現および精製を容易にする様々な要素を提供する。例えば、そのベクターは、メタノール調節性アルコールオキシダーゼ(AOX)プロモーターを含有する発現カセットを含んでいる。メタノールで増殖させた酵母細胞内において、およそ5%のpolyA+ RNAはAOX1遺伝子由来である。さらに、そのベクターはまた、培養培地中へのタンパクの分泌を指示する、Saccharomyces cerevisiaeのαファクターのプレプロペプチド由来の分泌シグナル配列を含有する。また、そのベクターによって、Sh ble遺伝子(Streptoalloteichus hindustanus ble遺伝子)によりコードされるゼオシン(Zeocin)抗生物質を用いて、組換え細菌細胞および組換え酵母細胞の選択を提供する。
HuIFNαアナログをコードしている組換えプラスミドを、大量増殖用のPichia pastoris野生株X−33にエレクトロポレーションした。組換え酵母のコロニーを、Invitrogenにより提供されたプロトコールに従って、増殖および誘導した。上清を回収し、そして0.8/0.2mmポアサイズのアクロディスクフィルター(acrodisc filter)(Gelman Sciences、Ann Arbor、MI)を使用して濾過し、そしてセントリプラス−10コンセントレータ(Amicon,Inc.,Beverly,MA)を使用して、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でバッファー交換した。この方法によって得られた組換えHuIFNαアナログは、同じPichia pastoris系を使用して発現された、組換えOvIFNτの抗ウイルス活性と同様の抗ウイルス活性を示した。
(C.定量的抗ウイルスアッセイ)
比色アッセイを使用して、インターフェロンタンパクの抗ウイルス活性を定量化した。Madin Darbyウシ腎臓(MDBK)細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質を補充したイーグルMEMを使用して、96ウェルの平底プレート中でコンフルエントになるまで増殖した。培地を除去し、そして細胞を滅菌PBSで一度洗浄した。希釈培地として2%FBSおよび抗生物質を補充したイーグルMEMを使用して連続的な10倍および2倍希釈を使用し、サンプルを、100μl/ウェルになるよう、三連で添加した。インターフェロンサンプルを添加して、そして細胞を37℃で、18時間インキュベートした。標準なインターフェロンのコントロールとしては、組換えHuIFN−αA(Biosource Intl.)使用した。100μlの水疱性口内炎ウイルス(VSV)をテストウェルに添加して、37℃で、そしてさらに48時間インキュベートした。100μlの培地を各ウェルから除去して、そして100μlの0.2%ニュートラルレッド溶液(Gibco−BRL)と交換し、そして37℃で、1時間インキュベートした。全ての培地を除去し、そして細胞を100μgの酸アルコール(50%エタノール、1%酢酸)の添加前にPBSで2回穏やかに洗浄した。可溶化された色素のA550を、Bio−Kinetics Reader(Bio−Tek Instruments,Winooski VT)により読取った。保護率は次の式を用いて計算された。
比色アッセイを使用して、インターフェロンタンパクの抗ウイルス活性を定量化した。Madin Darbyウシ腎臓(MDBK)細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質を補充したイーグルMEMを使用して、96ウェルの平底プレート中でコンフルエントになるまで増殖した。培地を除去し、そして細胞を滅菌PBSで一度洗浄した。希釈培地として2%FBSおよび抗生物質を補充したイーグルMEMを使用して連続的な10倍および2倍希釈を使用し、サンプルを、100μl/ウェルになるよう、三連で添加した。インターフェロンサンプルを添加して、そして細胞を37℃で、18時間インキュベートした。標準なインターフェロンのコントロールとしては、組換えHuIFN−αA(Biosource Intl.)使用した。100μlの水疱性口内炎ウイルス(VSV)をテストウェルに添加して、37℃で、そしてさらに48時間インキュベートした。100μlの培地を各ウェルから除去して、そして100μlの0.2%ニュートラルレッド溶液(Gibco−BRL)と交換し、そして37℃で、1時間インキュベートした。全ての培地を除去し、そして細胞を100μgの酸アルコール(50%エタノール、1%酢酸)の添加前にPBSで2回穏やかに洗浄した。可溶化された色素のA550を、Bio−Kinetics Reader(Bio−Tek Instruments,Winooski VT)により読取った。保護率は次の式を用いて計算された。
(実施例2)
(肝細胞におけるIFNαアナログのインビトロ毒性)
HuIFNαおよびIFNαアナログIFNα−N0(配列番号10;図1)のインビトロの毒性を、正常のヒト肝細胞を用いて比較した。肝細胞を、Clonetics Corporation(San Diego,CA)から、マトリゲル被覆の96ウェルプレート中の細胞のコンフルエントな層として受け取った。次の日、ウェル中の培地を、0.1μMのインシュリン、0.1μMのデキサメサゾン、50μg/mlのゲンタマイシン、および50ng/mlのアンホテリシンBを補充した、100μlの改変ウィリアムE培地(Clonetics Corp.)と交換した。細胞を引き続き、2,000U/ml〜128,000U/mlのHuIFNα、またはIFNα−N0で処置した。インキュベートの4、6、または7日後に、10μlのテトラゾリウム塩WST−1(4−3−(4−ヨードフェニル)−2−(4−ニトロフェニル)−2H−5−テトラゾリオール−1−3−ベンゼンジスルホネート)(Boehringer Mannheim,Indianapolis IN)を各ウェルに添加した。WST−1は、ミトコンドリアの呼吸鎖に存在し、そして生存可能な細胞内でのみ活性である、コハク酸テトラゾリウムレダクターゼ系により切断され、ホルマザンを生じる。生存可能な細胞のパーセントは、450nmの吸収により測定され、そしてインターフェロン非処理の細胞のパーセントとして表された。
(肝細胞におけるIFNαアナログのインビトロ毒性)
HuIFNαおよびIFNαアナログIFNα−N0(配列番号10;図1)のインビトロの毒性を、正常のヒト肝細胞を用いて比較した。肝細胞を、Clonetics Corporation(San Diego,CA)から、マトリゲル被覆の96ウェルプレート中の細胞のコンフルエントな層として受け取った。次の日、ウェル中の培地を、0.1μMのインシュリン、0.1μMのデキサメサゾン、50μg/mlのゲンタマイシン、および50ng/mlのアンホテリシンBを補充した、100μlの改変ウィリアムE培地(Clonetics Corp.)と交換した。細胞を引き続き、2,000U/ml〜128,000U/mlのHuIFNα、またはIFNα−N0で処置した。インキュベートの4、6、または7日後に、10μlのテトラゾリウム塩WST−1(4−3−(4−ヨードフェニル)−2−(4−ニトロフェニル)−2H−5−テトラゾリオール−1−3−ベンゼンジスルホネート)(Boehringer Mannheim,Indianapolis IN)を各ウェルに添加した。WST−1は、ミトコンドリアの呼吸鎖に存在し、そして生存可能な細胞内でのみ活性である、コハク酸テトラゾリウムレダクターゼ系により切断され、ホルマザンを生じる。生存可能な細胞のパーセントは、450nmの吸収により測定され、そしてインターフェロン非処理の細胞のパーセントとして表された。
その結果を表1に示す。値は、培地のみで処理された細胞の生存能力と等しいものを100%とした生存可能な細胞の代謝活性のパーセントとして示される。
HuIFNαと共にインキュベートした肝細胞は、生存能力において有意的な低下を示した。対照的に、IFNαアナログIFNα−N0と共にインキュベートした細胞は、非処理の細胞と比較して、本質的に生存能力の減少は示さなかった。
(実施例3)
(単核細胞におけるIFNαアナログのインビトロ毒性)
HuIFNα、OvIFNτ、およびIFNα−N0からIFNα−N7(配列番号10から配列番号17;図1)までのヒトIFNαアナログのインビトロでの毒性を、末梢血単核細胞(PBMC)を用いて比較した。全血液のバフィコート画分をPBSで1:4に希釈し、そしてNycoprep 1.077(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)上にオーバーレイした。600×gで、20℃、20分間遠心分離後、界面にバンドを形成しているPBCMをピペットを用いて取り除いた。細胞をPBSで一度洗浄し、そして96ウェルプレートに2×105細胞/ウェルの濃度でプレートした。次の日、細胞を2,000U/mlから128,000U/mlのIFNα、IFNτまたはIFNαアナログで処置した。7日間のインキュベート後、テトラゾリウム塩WST−1(Boehringer Mannheim)を各ウェルに添加した。生存可能な細胞の割合を、450nmの吸収により測定し、インターフェロン非処理の細胞の割合として表した。
(単核細胞におけるIFNαアナログのインビトロ毒性)
HuIFNα、OvIFNτ、およびIFNα−N0からIFNα−N7(配列番号10から配列番号17;図1)までのヒトIFNαアナログのインビトロでの毒性を、末梢血単核細胞(PBMC)を用いて比較した。全血液のバフィコート画分をPBSで1:4に希釈し、そしてNycoprep 1.077(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)上にオーバーレイした。600×gで、20℃、20分間遠心分離後、界面にバンドを形成しているPBCMをピペットを用いて取り除いた。細胞をPBSで一度洗浄し、そして96ウェルプレートに2×105細胞/ウェルの濃度でプレートした。次の日、細胞を2,000U/mlから128,000U/mlのIFNα、IFNτまたはIFNαアナログで処置した。7日間のインキュベート後、テトラゾリウム塩WST−1(Boehringer Mannheim)を各ウェルに添加した。生存可能な細胞の割合を、450nmの吸収により測定し、インターフェロン非処理の細胞の割合として表した。
その結果を、表2に示した。値は、培地のみで処理された細胞の生存能力と等しいものを100%とした生存可能な細胞の代謝活性のパーセントとして示される。
HuIFNαと共にインキュベートしたPBMCは、生存能力において有意的な低下を示した。対照的に、OvIFNτと共に、またはヒトIFNαアナログであるIFNα−N0、IFNα−N5、IFNα−N6、およびIFNα−N7と共にインキュベートした細胞は、7日間のインキュベート後、本質的に生存能力の減少を示さなかった。HuIFNαに対して観察されたものと同様の生存能力の低下は、IFNαアナログであるIFNα−N1およびIFNα−N3と共にインキュベートされた細胞において観察された。IFNαアナログであるIFNα−N4と共にインキュベートされた細胞は、HuIFNαと共にインキュベートされた細胞より、生存能力においてわずかな増加を示した。
本発明は、特定の方法および実施態様を参照して共に記述されたが、本発明から逸脱することなく、様々な修正および変更がされ得ることが理解される。
Claims (1)
- ヒトIFNαの毒性を減少させるための方法であって、成熟ヒトIFNα配列の22番目のアミノ酸ならびに、19番目、20番目、24番目、および27番目のアミノ酸のうち1以上のアミノ酸を、培養物中の単核細胞内のIFNαの特異的な毒性を実質的に減少させるために効果的なアミノ酸での置換する工程であって、ここで、1〜27番目のアミノ酸の大部分は天然ヒトIFNαアミノ酸である工程、を包含する方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/954,395 US6204022B1 (en) | 1996-04-12 | 1997-10-20 | Low-toxicity human interferon-alpha analogs |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000516991A Division JP2001520238A (ja) | 1997-10-20 | 1998-10-20 | 低毒性のヒトインターフェロン−αアナログ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008247926A true JP2008247926A (ja) | 2008-10-16 |
Family
ID=25495373
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000516991A Pending JP2001520238A (ja) | 1997-10-20 | 1998-10-20 | 低毒性のヒトインターフェロン−αアナログ |
JP2008161051A Pending JP2008247926A (ja) | 1997-10-20 | 2008-06-19 | 低毒性のヒトインターフェロン−αアナログ |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000516991A Pending JP2001520238A (ja) | 1997-10-20 | 1998-10-20 | 低毒性のヒトインターフェロン−αアナログ |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6204022B1 (ja) |
EP (1) | EP1025124B1 (ja) |
JP (2) | JP2001520238A (ja) |
KR (2) | KR100861007B1 (ja) |
CN (1) | CN1240717C (ja) |
AT (1) | ATE402957T1 (ja) |
AU (1) | AU744774B2 (ja) |
CA (1) | CA2308116C (ja) |
DE (1) | DE69839812D1 (ja) |
DK (1) | DK1025124T3 (ja) |
ES (1) | ES2310931T3 (ja) |
TW (1) | TW593336B (ja) |
WO (1) | WO1999020653A1 (ja) |
Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6833256B1 (en) * | 1999-06-22 | 2004-12-21 | University Of Maryland | Interferon tau mutants and methods for making them |
AU781377B2 (en) * | 1999-08-27 | 2005-05-19 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Materials and methods for inhibition of IgE production |
EP1276756A4 (en) * | 2000-04-12 | 2004-06-09 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
AU2587002A (en) * | 2000-11-03 | 2002-05-15 | Biomedicines Inc | Method for short-term and long-term drug dosimetry |
JP2005500247A (ja) * | 2000-12-07 | 2005-01-06 | ボード オブ リージェンツ, ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム | ヒトmda−7に関わる処置方法 |
CA2454860A1 (en) | 2001-08-12 | 2003-02-27 | Pepgen Corporation | Hybrid interferon/interferon tau proteins, compositions and methods of use |
EP1536839B1 (en) * | 2001-11-09 | 2010-09-15 | Intarcia Therapeutics, Inc | Combination therapy comprising omega-interferon for treating infection with hepatitis c virus or yellow fever virus |
US20040009939A1 (en) * | 2002-03-05 | 2004-01-15 | Board Of Regent, The University Of Texas System | Methods of enhancing immune induction involving MDA-7 |
DE60332358D1 (de) * | 2002-09-09 | 2010-06-10 | Hanall Pharmaceutical Co Ltd | Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide |
US20040126360A1 (en) * | 2002-10-09 | 2004-07-01 | Manning Mark C. | Oral formulations for proteins and polypeptides |
US7731947B2 (en) | 2003-11-17 | 2010-06-08 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Composition and dosage form comprising an interferon particle formulation and suspending vehicle |
CN1759122B (zh) * | 2003-03-03 | 2012-06-13 | 得克萨斯州大学***董事会 | 包含mda-7的组合物和方法 |
US20050003533A1 (en) | 2003-05-08 | 2005-01-06 | Pawel Kalinski | Mature type-1 polarized dendritic cells with enhanced IL-12 production and methods of serum-free production and use |
CA2548220A1 (en) * | 2003-12-01 | 2005-09-09 | Introgen Therapeutics, Inc. | Use of mda-7 to inhibit infection by pathogenic organisms |
NZ548256A (en) | 2004-02-02 | 2010-02-26 | Ambrx Inc | Modified human four helical bundle polypeptides and their uses |
US20070281041A1 (en) * | 2004-03-02 | 2007-12-06 | Introgen Therapeutics, Inc. | Compositions and Methods Involving MDA-7 for the Treatment of Cancer |
US11246913B2 (en) | 2005-02-03 | 2022-02-15 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide |
WO2006083761A2 (en) | 2005-02-03 | 2006-08-10 | Alza Corporation | Solvent/polymer solutions as suspension vehicles |
WO2006086798A2 (en) * | 2005-02-08 | 2006-08-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods involving mda-7 for the treatment of cancer |
US7695710B2 (en) * | 2005-06-20 | 2010-04-13 | Pepgen Corporation | Antitumor and antiviral combination therapies using low-toxicity, long-circulating human interferon-alpha analogs |
EP1901777A2 (en) * | 2005-06-20 | 2008-03-26 | Pepgen Corporation | Low-toxicity, long-circulating chimeras of human interferon-alpha analogs and interferon tau |
WO2007098106A2 (en) * | 2006-02-17 | 2007-08-30 | Pepgen Coporation | Respiratory tract delivery of interferon-tau |
AU2007266475B2 (en) | 2006-05-30 | 2009-12-03 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Two-piece, internal-channel osmotic delivery system flow modulator |
DK2049081T3 (da) | 2006-08-09 | 2013-02-25 | Intarcia Therapeutics Inc | Osmotiske leveringssystemer og stempelarrangementer |
WO2008121461A2 (en) * | 2007-02-26 | 2008-10-09 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Vaccine for activating helper function of cd8+ tcells |
US20080260820A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Gilles Borrelly | Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides |
PT2157967E (pt) | 2007-04-23 | 2013-04-03 | Intarcia Therapeutics Inc | Formulações de suspensões de péptidos insulinotrópicos e suas utilizações |
CN103694337B (zh) | 2008-02-08 | 2016-03-02 | Ambrx公司 | 经修饰瘦素多肽和其用途 |
DK2240155T3 (da) | 2008-02-13 | 2012-09-17 | Intarcia Therapeutics Inc | Indretninger, formuleringer og fremgangsmåder til levering af flere gavnlige midler |
BRPI1012951A2 (pt) | 2009-06-09 | 2016-07-26 | Defyrus Inc | "administração de interferon para profilaxia ou tratamento de infecção por patôgeno" |
KR102148624B1 (ko) | 2009-09-28 | 2020-08-26 | 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 | 실질 항정상태 약물 전달의 신속 확립 및/또는 종결 |
US20120208755A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-16 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers |
WO2012177892A2 (en) * | 2011-06-21 | 2012-12-27 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Type i interferon mimetics as therapeutics for cancer, viral infections, and multiple sclerosis |
US9889085B1 (en) | 2014-09-30 | 2018-02-13 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c |
KR20240042548A (ko) | 2015-06-03 | 2024-04-02 | 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 | 임플란트 배치 및 제거 시스템들 |
CN109310743A (zh) | 2016-05-16 | 2019-02-05 | 因塔西亚制药公司 | 胰高血糖素受体选择性多肽及其使用方法 |
USD860451S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-09-17 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant removal tool |
USD840030S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-02-05 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant placement guide |
KR20190104039A (ko) | 2017-01-03 | 2019-09-05 | 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 | Glp-1 수용체 효능제의 연속적인 투여 및 약물의 동시-투여를 포함하는 방법 |
CN112043685A (zh) * | 2020-09-18 | 2020-12-08 | 深圳科兴药业有限公司 | 重组人干扰素α1b突变体吸入溶液及其制备方法 |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2016015B (en) | 1978-01-22 | 1982-05-06 | Hayashibara Co | Method of preparing interferon and preparations containing interferon |
US4460574A (en) | 1980-06-16 | 1984-07-17 | Yabrov Alexander A | Prophylaxis or treatment of interferon-sensitive diseases |
US4414150A (en) | 1980-11-10 | 1983-11-08 | Genentech, Inc. | Hybrid human leukocyte interferons |
US4456748A (en) | 1981-02-23 | 1984-06-26 | Genentech, Inc. | Hybrid human leukocyte interferons |
US4507281A (en) | 1981-10-13 | 1985-03-26 | Exovir, Inc. | Interferon-containing compositions |
WO1983002461A1 (en) | 1982-01-19 | 1983-07-21 | Cetus Corp | Multiclass hybrid interferons |
US6936694B1 (en) | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
EP0146903A3 (en) | 1983-12-19 | 1987-07-22 | Schering Corporation | Production of a vector encoding a novel hybrid interferon species |
US4892743A (en) | 1983-12-21 | 1990-01-09 | Schering Corporation | Novel hybrid interferon species |
US4636383A (en) | 1984-08-29 | 1987-01-13 | Schering Corporation | Interferon-cyclaradine combination |
US4724232A (en) | 1985-03-16 | 1988-02-09 | Burroughs Wellcome Co. | Treatment of human viral infections |
DE3607835A1 (de) | 1986-03-10 | 1987-09-24 | Boehringer Ingelheim Int | Hybridinterferone, deren verwendung als arzneimittel und als zwischenprodukte zur herstellung von antikoerpern und deren verwendung sowie verfahren zu ihrer herstellung |
US4846782A (en) | 1986-03-14 | 1989-07-11 | Schering Corporation | Treatment of cancer with interferon and radiotherapy |
EP0240224A3 (en) | 1986-03-31 | 1989-02-01 | Interferon Sciences, Inc. | An alpha interferon analogue |
ZA878295B (en) | 1986-11-06 | 1988-05-03 | Amarillo Cell Culture Co. Inc. | Treatment of immuno-resistant disease |
US5705363A (en) | 1989-03-02 | 1998-01-06 | The Women's Research Institute | Recombinant production of human interferon τ polypeptides and nucleic acids |
CN1090510A (zh) | 1992-10-30 | 1994-08-10 | 佛罗里达大学 | 干扰素-τ组成物及其用途 |
US5939286A (en) * | 1995-05-10 | 1999-08-17 | University Of Florida | Hybrid interferon tau/alpha polypeptides, their recombinant production, and methods using them |
-
1997
- 1997-10-20 US US08/954,395 patent/US6204022B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-10-20 KR KR1020067002021A patent/KR100861007B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-10-20 DK DK98952350T patent/DK1025124T3/da active
- 1998-10-20 AT AT98952350T patent/ATE402957T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-10-20 AU AU98072/98A patent/AU744774B2/en not_active Ceased
- 1998-10-20 ES ES98952350T patent/ES2310931T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-20 EP EP98952350A patent/EP1025124B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-20 DE DE69839812T patent/DE69839812D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-20 CN CNB988103680A patent/CN1240717C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-10-20 JP JP2000516991A patent/JP2001520238A/ja active Pending
- 1998-10-20 KR KR1020007004158A patent/KR100586625B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-10-20 CA CA2308116A patent/CA2308116C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-10-20 WO PCT/US1998/021936 patent/WO1999020653A1/en active IP Right Grant
- 1998-12-29 TW TW087117293A patent/TW593336B/zh not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-06-19 JP JP2008161051A patent/JP2008247926A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1276797A (zh) | 2000-12-13 |
KR20010031206A (ko) | 2001-04-16 |
CA2308116A1 (en) | 1999-04-29 |
AU9807298A (en) | 1999-05-10 |
ATE402957T1 (de) | 2008-08-15 |
AU744774B2 (en) | 2002-03-07 |
ES2310931T3 (es) | 2009-01-16 |
US6204022B1 (en) | 2001-03-20 |
EP1025124A1 (en) | 2000-08-09 |
KR100586625B1 (ko) | 2006-06-07 |
KR20060015701A (ko) | 2006-02-17 |
WO1999020653A1 (en) | 1999-04-29 |
TW593336B (en) | 2004-06-21 |
JP2001520238A (ja) | 2001-10-30 |
DK1025124T3 (da) | 2008-10-06 |
EP1025124B1 (en) | 2008-07-30 |
DE69839812D1 (de) | 2008-09-11 |
KR100861007B1 (ko) | 2008-09-30 |
CA2308116C (en) | 2010-12-14 |
CN1240717C (zh) | 2006-02-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2008247926A (ja) | 低毒性のヒトインターフェロン−αアナログ | |
Foster et al. | Are all type I human interferons equivalent? | |
De Maeyer et al. | Type I interferons | |
Dianzani et al. | The biological basis for clinical use of interferon | |
TW391983B (en) | Human interferon TAU, processes thereof and pharmaceutical uses thereof | |
JPH07503851A (ja) | 改良インターフェロン及びヒトの末梢血液白血球からのその製造方法 | |
CN1094642A (zh) | 治疗组合物 | |
JP2005029561A (ja) | コンセンサスヒト白血球インターフェロンを含有する抗腫瘍剤 | |
JP2002542202A (ja) | 抗酸化剤を伴ったリバビリンを含有するhcv組み合わせ治療薬 | |
JP2001520238A5 (ja) | ||
CZ20033109A3 (en) | Use of osteopontin for the treatment and/or prevention of neurologic diseases | |
TW200900504A (en) | Recombinant human interferon-like proteins | |
EP2739301B1 (en) | Hcv immunotherapy | |
CA2181566C (en) | Compositions and methods using unbound mpl receptor for stimulating platelet production | |
JP2003531822A (ja) | 自己免疫疾患を治療するためのth−1免疫反応誘導サイトカインの拮抗薬 | |
JPH11501283A (ja) | I型インターフェロンに対する中和活性を有する、インターフェロンレセプターに対するモノクローナル抗体を含んでなる医薬組成物 | |
TW200407159A (en) | Treatment of hepatitis C in the asian population | |
Oritani et al. | Interferon-ζ/limitin: novel type I interferon that displays a narrow range of biological activity | |
CN101244263A (zh) | 包含混合干扰素-α亚型的混合物 | |
Smalley et al. | Interferons: current status and future directions of this prototypic biological | |
JP2009504706A (ja) | HBV処置のためのPEG−IFNαおよびリバビリン | |
KR100464531B1 (ko) | 잡종인터페론조성물및그것을사용하는방법 | |
WO2021195883A1 (zh) | TFF2蛋白和IFN-κ蛋白联用在治疗新型冠状病毒感染中的应用 | |
Finter | Cytokines in the treatment of virus infections | |
Aul et al. | Interferons: Biological Activities and Clinical Efficacy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090304 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090728 |