JP2008241244A - Quantitative analyzing method of anionic compound due to ce/ms - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、キャピラリー電気泳動と質量分析とを組み合わせたキャピラリー電気泳動/質量分析装置(CE/MS)およびこの装置を用いる陰イオン性化合物の分離分析方法に関する。 The present invention relates to a capillary electrophoresis / mass spectrometer (CE / MS) combining capillary electrophoresis and mass spectrometry, and a method for separating and analyzing anionic compounds using this apparatus.
近年、キャピラリー電気泳動と質量分析とを組み合わせた、高感度かつ高選択性を有するキャピラリー電気泳動/質量分析装置(CE/MS)を用いたイオン性化合物の分析法が開発されている。この手法の優位性は、キャピラリー電気泳動(CE)については迅速な分析を可能にし、非常に高い分離能を有する点、および質量分析(MS)については非常に高い選択性と感度を有する点が挙げられる。この優れた分析手法により、カルボン酸、フェノール性化合物、アミノ酸などの分析例が報告されている。そして近年、CE/MSを用いたアニオン分析系が確立され、解糖系、ペントースリン酸回路、TCA回路、およびカルビン・ベンソン回路中間体の分離・検出が可能となった(非特許文献1)。 In recent years, an analysis method for ionic compounds using a capillary electrophoresis / mass spectrometer (CE / MS) having high sensitivity and high selectivity, which combines capillary electrophoresis and mass spectrometry, has been developed. The advantage of this method is that it allows rapid analysis for capillary electrophoresis (CE) and has a very high resolution and very high selectivity and sensitivity for mass spectrometry (MS). Can be mentioned. Examples of analysis of carboxylic acids, phenolic compounds, amino acids, etc. have been reported by this excellent analytical technique. In recent years, an anion analysis system using CE / MS has been established, and glycolysis, pentose phosphate circuit, TCA circuit, and Calvin Benson circuit intermediates can be separated and detected (Non-patent Document 1).
図1Aに示すように、通常のフューズドシリカキャピラリーを用いた電気泳動では、キャピラリー内表面がシラノール基の解離によって負電荷を帯びている。したがって、キャピラリー中の泳動液に含まれている電解質はキャピラリーとの界面が正電荷を帯び、電気浸透流(EOF)は陽極(アノード)から陰極(カソード)に向かう。さらに、CE/MSにおいては、質量分析装置(MS)に接続した側のキャピラリーの先端を、電解質を含む泳動液に浸すことができない。これらの理由により、泳動液を入れたバイアル側を陰極およびMS側を陽極とした場合には、EOFがバイアル側に向かうため、MS側のキャピラリー先端に空洞が生じる。そのため、CEの電流が流れなくなり、泳動が中断される(図1A参照)。 As shown in FIG. 1A, in electrophoresis using a normal fused silica capillary, the inner surface of the capillary is negatively charged due to the dissociation of silanol groups. Therefore, the electrolyte contained in the electrophoresis solution in the capillary is positively charged at the interface with the capillary, and the electroosmotic flow (EOF) is directed from the anode (anode) to the cathode (cathode). Furthermore, in CE / MS, the tip of the capillary connected to the mass spectrometer (MS) cannot be immersed in an electrophoretic solution containing an electrolyte. For these reasons, when the side of the vial containing the electrophoresis solution is used as the cathode and the side of the MS is used as the anode, the EOF is directed toward the vial, and a cavity is created at the capillary tip on the MS side. Therefore, the CE current stops flowing and the migration is interrupted (see FIG. 1A).
CEの電流が流れなくなる現象を防ぐために、SMILEキャピラリーを使用して、EOFを反転させる方法が開発されている(特許文献1)。SMILEキャピラリーは、キャピラリー内表面が陽イオン性化合物によってコーティングされているので、キャピラリー内壁が正に荷電し、EOFを陰極から陽極へと反転させることが可能である(図1B参照)。これにより、解糖系、TCA回路、およびペントースリン酸回路の中間体などの種々の陰イオン性化合物を連続的かつ安定に一斉分析することが可能となった。 In order to prevent the phenomenon that the current of CE does not flow, a method of reversing the EOF using a SMILE capillary has been developed (Patent Document 1). In the SMILE capillary, the inner surface of the capillary is coated with a cationic compound, so that the inner wall of the capillary is positively charged and the EOF can be inverted from the cathode to the anode (see FIG. 1B). As a result, various anionic compounds such as glycolysis, TCA cycle, and pentose phosphate cycle intermediates can be analyzed continuously and stably.
しかし、このSMILEキャピラリーは高価である上、非常に耐久性が低く、ルーチンワークに適さない。また、リブロース5−リン酸とリボース5−リン酸、あるいはグルコース1−リン酸、グルコース6−リン酸、フルクトース6−リン酸などの異性体の分離が不完全であり、定量分析が困難である。さらに、SMILEキャピラリーを用いた分析系では、一部のヌクレオチドやCoA類などの多価陰イオンは、SMILEキャピラリー内表面に吸着するため、検出することができない。 However, this SMILE capillary is expensive and has very low durability and is not suitable for routine work. In addition, separation of isomers such as ribulose 5-phosphate and ribose 5-phosphate, or glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, fructose 6-phosphate is incomplete, and quantitative analysis is difficult. . Furthermore, in an analysis system using a SMILE capillary, polyvalent anions such as some nucleotides and CoAs are adsorbed on the inner surface of the SMILE capillary and cannot be detected.
そこで、中性ポリマー(ポリ(ジメチルシロキサン))で内表面をコーティングしたキャピラリー(DB−1)を用い、さらにキャピラリーの入口をエアーポンプで加圧することにより、一定流量の液体を質量分析計側に送り込む方法も開発されている(非特許文献2)。この方法によれば、ヌクレオチド類、ニコチンアミド補酵素類、CoA類などの一斉分析が可能である。しかし、この方法では、糖リン酸の異性体を分離することができず、ヌクレオチド類の分離も充分とはいえない。したがって、同一移動時間に多数の化合物が同時溶出し、イオン化サプレッションによるMSの定量性の低下が懸念される。
本発明は、糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、CoA化合物などの幅広い陰イオン性化合物の一斉分析を、より安価かつ安定して行うことが可能な分析系を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide an analysis system that can perform simultaneous analysis of a wide range of anionic compounds such as sugar phosphates, organic acids, nucleotides, and CoA compounds more inexpensively and stably.
CE/MSにおいて、分析対象イオンのみかけの移動度は、EOF移動度と電気泳動移動度とのベクトル和で表すことができる。一般的に、これらの値は、陽極から陰極に向かう方向を正とする。陽イオン性化合物を対象としたCE/MS分析系、すなわち、泳動液を入れたバイアル側を陽極およびMS側を陰極とした系では、EOF移動度と電気泳動移動度とはいずれも正であるため、分析の途中で電流が流れなくなるという現象はほとんど見られず、安定して分析を行うことができる。そこで、本発明者らは、このような極性で陰イオン性化合物を分析できるか否かの検討を行ったところ、EOF移動度の絶対値を電気泳動移動度の絶対値よりも大きくして、分析対象イオンのみかけの移動度を正にすることにより、安定な陰イオン性化合物の分析系を確立した。 In CE / MS, the apparent mobility of ions to be analyzed can be expressed as a vector sum of EOF mobility and electrophoretic mobility. Generally, these values are positive in the direction from the anode to the cathode. In the CE / MS analysis system for cationic compounds, that is, the system in which the vial side containing the electrophoresis solution is the anode and the MS side is the cathode, both the EOF mobility and the electrophoretic mobility are positive. Therefore, the phenomenon that current does not flow during the analysis is hardly observed, and the analysis can be performed stably. Therefore, the present inventors have examined whether or not an anionic compound can be analyzed with such a polarity. As a result, the absolute value of the EOF mobility is made larger than the absolute value of the electrophoretic mobility, By making the apparent mobility of analyte ions positive, a stable anionic compound analysis system was established.
すなわち、本発明は、キャピラリー電気泳動と質量分析とを組み合わせて陰イオン性化合物を分離分析する方法を提供し、該方法は、
泳動液で満たされたキャピラリーの泳動液の入口側を陽極および出口側を陰極となるように設定し、該キャピラリーに電圧を印加して陰イオン性化合物を含む試料を電気泳動する工程であって、該電圧の印加により発生する電気浸透流の移動度の絶対値が、該試料中の少なくとも1種の陰イオン性化合物の電気泳動移動度の絶対値を上回るような条件で該電気泳動を行う、工程;および
該キャピラリーの出口まで泳動された該試料中の陰イオン性化合物を質量分析する工程;
を含む。
That is, the present invention provides a method for separating and analyzing an anionic compound by combining capillary electrophoresis and mass spectrometry,
A step of electrophoresis of a sample containing an anionic compound by setting the inlet side of the electrophoresis solution of the capillary filled with the electrophoresis solution to be an anode and the cathode side being a cathode, and applying a voltage to the capillary. The electrophoresis is performed under the condition that the absolute value of the mobility of the electroosmotic flow generated by the application of the voltage exceeds the absolute value of the electrophoretic mobility of at least one anionic compound in the sample. And mass analyzing the anionic compound in the sample migrated to the outlet of the capillary;
including.
1つの実施態様では、上記キャピラリーは、内表面が予め不活性処理されているフューズドシリカキャピラリーである。 In one embodiment, the capillary is a fused silica capillary whose inner surface has been previously subjected to an inert treatment.
1つの実施態様では、上記泳動液のpHは8から11である。 In one embodiment, the pH of the electrophoresis solution is 8-11.
1つの実施態様では、上記泳動液は、酢酸アンモニウム、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、および炭酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも1種を含む。 In one embodiment, the electrophoresis solution contains at least one selected from the group consisting of ammonium acetate, trimethylamine, triethylamine, ethanolamine, and ammonium carbonate.
1つの実施態様では、上記方法は、上記電気泳動して質量分析する工程中または該工程後に、該電圧の印加を中止して、該キャピラリー内の該泳動液を該出口側へ加圧送液し、該キャピラリーの出口まで移動した試料を質量分析する工程、をさらに含む。 In one embodiment, in the method, during or after the step of performing electrophoresis and mass spectrometry, the application of the voltage is stopped and the electrophoretic solution in the capillary is pressurized and fed to the outlet side. And a step of mass-analyzing the sample moved to the outlet of the capillary.
本発明はまた、キャピラリーの出口側が陰極になるように設定されたキャピラリー電気泳動装置;
該キャピラリー電気泳動装置で分離された試料をイオン化するためのイオン化装置;および
該イオン化された試料を分析するための質量分析装置;
を備えた、陰イオン性化合物の分離分析装置を提供する。
The present invention also provides a capillary electrophoresis apparatus set so that the outlet side of the capillary is a cathode;
An ionizer for ionizing a sample separated by the capillary electrophoresis apparatus; and a mass spectrometer for analyzing the ionized sample;
An anionic compound separation and analysis apparatus comprising:
1つの実施態様では、上記キャピラリーは、内表面が予め不活性処理されているフューズドシリカキャピラリーである。 In one embodiment, the capillary is a fused silica capillary whose inner surface has been previously subjected to an inert treatment.
1つの実施態様では、上記分離分析装置は、さらに、上記キャピラリー内の泳動液を該出口側に加圧送液するための手段を備える。 In one embodiment, the separation / analysis apparatus further includes means for feeding the electrophoresis solution in the capillary under pressure to the outlet side.
本発明はさらに、泳動液で満たされたキャピラリーにおいて、該泳動液の入口側を陽極および出口側を陰極となるように設定された、陰イオン性化合物の分離装置を提供する。 The present invention further provides an anionic compound separation device in a capillary filled with an electrophoretic solution, wherein the electrophoretic solution has an inlet side as an anode and an outlet side as a cathode.
本発明によれば、陰イオン性化合物の分析に用いられる通常のCEの系とは電極の極性を逆転させているため、分析途中でCEの電流が流れなくなる現象がなく、安定して分析を行うことができる。さらに、特殊なキャピラリーではなく、一般的なフューズドシリカキャピラリーを用いることができるため、安価に分析することができる。さらに、本発明によれば、CEとCE後の加圧送液とを組み合わせることにより、今まで同時に分析を行うことが困難だった糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、CoA化合物などの陰イオン性化合物を、一斉分析することが可能となる。 According to the present invention, since the polarity of the electrode is reversed from that of a normal CE system used for the analysis of anionic compounds, there is no phenomenon that the CE current does not flow during the analysis, and the analysis can be performed stably. It can be carried out. Furthermore, since a general fused silica capillary can be used instead of a special capillary, analysis can be performed at low cost. Furthermore, according to the present invention, anionic compounds such as sugar phosphates, organic acids, nucleotides, and CoA compounds that have been difficult to analyze simultaneously by combining CE and the pressurized liquid after CE are combined. Can be simultaneously analyzed.
本発明は、以下の原理に基づく。 The present invention is based on the following principle.
上述のように、CE/MSにおいて、分析対象イオンのみかけの移動度は、EOF移動度と電気泳動移動度とのベクトル和で表すことができる。一般的に、これらの値は、陽極から陰極に向かう方向を正とする。特許文献1に記載の陰イオン性化合物の分析系の場合(図1B参照)、バイアル側を陰極およびMS側を陽極としており、分析対象が陰イオン性化合物であるため、電気泳動移動度は負となる。また、SMILEキャピラリーを用いてEOFを負に反転させている。その結果、分析対象イオンのみかけの移動速度は負となり、分析対象はMS側に泳動されてMSで検出される。 As described above, in CE / MS, the apparent mobility of analysis target ions can be represented by a vector sum of EOF mobility and electrophoretic mobility. Generally, these values are positive in the direction from the anode to the cathode. In the case of the anionic compound analysis system described in Patent Document 1 (see FIG. 1B), since the vial side is a cathode and the MS side is an anode, and the analysis target is an anionic compound, the electrophoretic mobility is negative. It becomes. Further, the EOF is inverted negatively using a SMILE capillary. As a result, the apparent movement speed of the analysis target ions becomes negative, and the analysis target migrates to the MS side and is detected by the MS.
分析対象の電気泳動移動度の正負を変えることはできない。しかし、泳動液を入れたバイアル側を陽極およびMS側を陰極とすれば、分析対象である陰イオン性化合物の電気泳動移動度は負であるが、通常のフューズドシリカキャピラリーにおけるEOFは正になる。ここで、EOFの絶対値を電気泳動移動度の絶対値よりも大きくすれば、分析対象のみかけの移動度を正にすることができ、陰イオン性化合物をMS側に泳動させることができると考えられる。そこで、本発明は、この原理に基づいて、通常のフューズドシリカキャピラリーを用いて、EOF移動度の絶対値を電気泳動移動度の絶対値よりも大きくすることによって、安定な陰イオン性化合物分析系を確立した。 The electrophoretic mobility of the analysis target cannot be changed. However, if the side of the vial containing the electrophoresis solution is the anode and the side of the MS is the cathode, the electrophoretic mobility of the anionic compound to be analyzed is negative, but the EOF in a normal fused silica capillary is positive. Become. Here, if the absolute value of EOF is made larger than the absolute value of electrophoretic mobility, the apparent mobility can be made positive, and an anionic compound can be migrated to the MS side. Conceivable. Therefore, the present invention is based on this principle, and by using a normal fused silica capillary, the absolute value of EOF mobility is made larger than the absolute value of electrophoretic mobility, so that stable anionic compound analysis can be performed. A system was established.
上記の原理に基づいて構築した、本発明の陰イオン性化合物を分離分析する方法を、図2に示すシステムを例に挙げて、詳細に説明する。 The method for separating and analyzing the anionic compound of the present invention constructed based on the above principle will be described in detail by taking the system shown in FIG. 2 as an example.
本発明の方法に用いられる陰イオン性化合物の分離分析装置は、キャピラリーの出口側が陰極になるように設定されたキャピラリー電気泳動装置(CE);該CEで分離された試料をイオン化するためのイオン化装置;および該イオン化された試料を分析するための質量分析装置(MS)から構成される。 An anionic compound separation and analysis apparatus used in the method of the present invention includes a capillary electrophoresis apparatus (CE) set so that the outlet side of the capillary becomes a cathode; ionization for ionizing a sample separated by the CE An apparatus; and a mass spectrometer (MS) for analyzing the ionized sample.
CEは、フューズドシリカキャピラリー;このキャピラリーに導入され、試料を分離するための泳動液を貯留するバイアル;該泳動液に先端が浸漬された電極;および、該電極に電圧を印加するための電源を含む。フューズドシリカキャピラリーの一端は、バイアル中の泳動液に浸漬され、そして他端はイオン化装置に接続されている。 The CE is a fused silica capillary; a vial that is introduced into the capillary and stores an electrophoresis solution for separating a sample; an electrode whose tip is immersed in the electrophoresis solution; and a power source for applying a voltage to the electrode including. One end of the fused silica capillary is immersed in the electrophoresis solution in the vial, and the other end is connected to an ionizer.
本発明で用いられるフューズドシリカキャピラリーは、当該技術分野で通常用いられるキャピラリーであれば特に限定されず、市販のものを使用することができる。EOF移動度を適切にする目的で、およびキャピラリーの耐久性を考慮して、フューズドシリカキャピラリーの内表面の遊離シラノール基をジメチルシロキサン処理した(すなわち、不活性処理した)キャピラリーが好適に用いられる。このようなキャピラリーは、タンパク質やペプチドをキャピラリーHPLC、nano−HPLCなどで分離する際によく用いられ、不活性処理キャピラリーとして市販されている。一般に用いられている不活性処理キャピラリーは、遊離シラノール基がすべて完全にジメチルシロキシル化されているわけではなく、部分的に遊離シラノール基が残存していると思われる。そのため、本発明においては、キャピラリーの内表面に帯電したわずかな負電荷によって、適切なEOF移動度を得ることができる。 The fused silica capillary used in the present invention is not particularly limited as long as it is a capillary usually used in the technical field, and a commercially available one can be used. For the purpose of appropriate EOF mobility and considering the durability of the capillary, a capillary in which free silanol groups on the inner surface of the fused silica capillary are treated with dimethylsiloxane (that is, inactive) is preferably used. . Such capillaries are often used for separating proteins and peptides by capillary HPLC, nano-HPLC or the like, and are commercially available as inactive capillaries. Inactive treatment capillaries that are generally used, all free silanol groups are not completely dimethylsiloxylated, and some free silanol groups remain. Therefore, in the present invention, an appropriate EOF mobility can be obtained by a slight negative charge charged on the inner surface of the capillary.
本発明で用いられる泳動液は、通常の陰イオン性化合物の分離に用いられる泳動液が用いられ得、これは電解質を含む緩衝液であり得る。MSに導入する際のイオン化を考慮して、揮発性の高い泳動緩衝液を用いることが好ましい。また、泳動緩衝液は、分析対象である陰イオン性化合物のpKaおよびpIを考慮して、中性〜アルカリ性であることが好ましい。このような揮発性かつ中性〜アルカリ性の泳動緩衝液には、代表的には、酢酸アンモニウム、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、炭酸アンモニウムなどが含まれ得る。泳動液に含まれるこのような電解質および濃度は、分析対象の陰イオン性化合物の種類に応じて、および泳動液のpHを考慮して、適宜決定され得る。通常、陰イオン性化合物の分離の場合、泳動液のpHは、pHが高い方がほとんどの陰イオン性化合物の一斉分析が可能であると考えられている(特許文献1)。しかし、本発明においては、泳動液のpHは、好適には7〜11であり、より好適には8〜11であり、さらに好適には8〜9.5である。 As the electrophoretic solution used in the present invention, an electrophoretic solution used for separation of a normal anionic compound may be used, which may be a buffer solution containing an electrolyte. In consideration of ionization when introduced into MS, it is preferable to use a highly volatile electrophoresis buffer. In addition, the electrophoresis buffer is preferably neutral to alkaline in consideration of the pKa and pI of the anionic compound to be analyzed. Such a volatile and neutral to alkaline running buffer may typically include ammonium acetate, trimethylamine, triethylamine, ethanolamine, ammonium carbonate, and the like. Such an electrolyte and concentration contained in the electrophoresis solution can be appropriately determined according to the type of the anionic compound to be analyzed and in consideration of the pH of the electrophoresis solution. In general, in the case of separation of anionic compounds, it is considered that the pH of the electrophoretic solution is higher, so that simultaneous analysis of most anionic compounds is possible (Patent Document 1). However, in the present invention, the pH of the electrophoresis solution is preferably 7 to 11, more preferably 8 to 11, and further preferably 8 to 9.5.
前述のように、CE/MSにおいては、MSに接続した側のキャピラリーの先端を、電解質を含む泳動液に浸すことができない。したがって、陰イオン性物質をCE/MSにより分析することを目的として、泳動液を入れたバイアル側を陰極およびMS側を陽極とした場合には、EOFがバイアル側に向かうため、MS側のキャピラリー先端に空洞が生じる。そのため、CEの電流が流れなくなり、泳動が中断される(図1A参照)。本発明においては、キャピラリーの出口側(MS側)が陰極および入口側(バイアル側)が陽極になるように設定される。そのため、電圧をかけた場合に、キャピラリーにおけるEOFは正方向(キャピラリーの入口側から出口側へ)となる(図2参照)。 As described above, in CE / MS, the tip of the capillary on the side connected to the MS cannot be immersed in an electrophoretic solution containing an electrolyte. Therefore, for the purpose of analyzing anionic substances by CE / MS, when the vial side containing the electrophoresis solution is used as the cathode and the MS side as the anode, the EOF is directed to the vial side. A cavity is created at the tip. Therefore, the CE current stops flowing and the migration is interrupted (see FIG. 1A). In the present invention, the capillary is set so that the outlet side (MS side) is the cathode and the inlet side (vial side) is the anode. Therefore, when a voltage is applied, the EOF in the capillary is in the positive direction (from the capillary inlet side to the outlet side) (see FIG. 2).
CEを行う際、上記電極には通常当該技術分野で行われる程度の高電圧(例えば、−30kV〜+30kV)が印加される。電圧の印加によって電気泳動が開始され、キャピラリー中の陰イオン性化合物は、負方向の泳動移動度で(陽極(入口側))に泳動する。しかし、本発明においては、EOF移動度の絶対値が陰イオン性化合物の泳動移動度の絶対値を上回る条件でCEが行われるので、陰イオン性化合物のみかけの移動度は正になる。そのため、陰イオン性化合物はキャピラリーの出口へと泳動される。 When performing CE, a high voltage (for example, −30 kV to +30 kV) that is normally performed in the technical field is applied to the electrode. Electrophoresis is started by the application of voltage, and the anionic compound in the capillary migrates to (anode (inlet side)) with negative migration mobility. However, in the present invention, CE is performed under the condition that the absolute value of the EOF mobility exceeds the absolute value of the electrophoretic mobility of the anionic compound, so the apparent mobility of the anionic compound becomes positive. Therefore, the anionic compound is migrated to the outlet of the capillary.
EOF移動度(EOFの流速)は、泳動液のpHと電圧とに依存して変動する。EOF移動度は、中性マーカー(例えば、グルコース)を分析対象としてCE/MS分析を行うことにより測定可能である。具体的には、所定の長さのキャピラリーおよび所定の電圧下において、中性マーカーの検出時間を測定することによって、EOF移動度(cm2V−1・s−1)を算出することができる。一方、陰イオン性化合物の泳動移動度は、各化合物のpKaおよびpIと、泳動液のpHと、電圧とに依存して変動し、これは、既知のEOF移動度となる条件下でCEを行うことによって求めることができる。 The EOF mobility (the flow rate of EOF) varies depending on the pH and voltage of the electrophoresis solution. The EOF mobility can be measured by performing CE / MS analysis using a neutral marker (for example, glucose) as an analysis target. Specifically, the EOF mobility (cm 2 V −1 · s −1 ) can be calculated by measuring the neutral marker detection time under a predetermined length of capillary and a predetermined voltage. . On the other hand, the electrophoretic mobility of anionic compounds varies depending on the pKa and pI of each compound, the pH of the electrophoretic solution, and the voltage. This is because CE is measured under conditions that result in a known EOF mobility. It can be determined by doing.
上記のようにして算出されるEOF移動度および電気泳動移動度をもとに、泳動液のpHを適宜変えることによって、分析対象試料中の少なくとも1種の陰イオン性化合物のみかけの移動度が正になるように、EOF移動度の絶対値が陰イオン性化合物の泳動移動度の絶対値を上回る条件が決定される。なお、通常のフューズドシリカキャピラリーを用いる場合、EOFは常に正であり、その流速はpHが高くなるに従って大きくなることが知られている(非特許文献3)。また、上述のように、本発明においては、泳動液のpHは、好適には7〜11である。したがって、当該技術分野で通常用いられる泳動液中の電解質濃度および印加電圧において、泳動液のpHを7〜11の範囲で最適化することによって、本発明のCE/MSに適切な条件を決定することができる。本発明においては、好適には、例えば、−30kV〜+30kVの電圧をかける場合、約50mMの電解質を含むpH8〜9.5の泳動液を用いることにより、上記条件を達成し得る。 Based on the EOF mobility and electrophoretic mobility calculated as described above, the apparent mobility of at least one anionic compound in the sample to be analyzed can be changed by appropriately changing the pH of the electrophoresis solution. The condition that the absolute value of the EOF mobility exceeds the absolute value of the electrophoretic mobility of the anionic compound is determined so as to be positive. In addition, when using a normal fused silica capillary, EOF is always positive, and the flow rate is known to increase as the pH increases (Non-patent Document 3). Further, as described above, in the present invention, the pH of the electrophoresis solution is preferably 7 to 11. Therefore, the conditions suitable for the CE / MS of the present invention are determined by optimizing the pH of the electrophoresis solution in the range of 7 to 11 at the electrolyte concentration and applied voltage in the electrophoresis solution usually used in the art. be able to. In the present invention, for example, when a voltage of −30 kV to +30 kV is applied, the above condition can be achieved by using an electrophoresis solution having a pH of 8 to 9.5 containing about 50 mM of electrolyte.
分析すべき試料中に、電気泳動移動度の絶対値がEOF移動度の絶対値と同等であるかまたは大きい陰イオン性化合物が含まれている場合は、この化合物は、電気泳動によってキャピラリーの出口まで移動することができず、キャピラリー内に滞留する。そこで、電気泳動の途中の適切な時点で電圧の印加を中止して、キャピラリー内の泳動液を入口側から加圧して出口側へ送液することによって、滞留している化合物を出口へ移動させることができる。あるいは、電圧を変化させることによって、あるいは電圧を下げかつ加圧を上げることによって、化合物を出口へ移動させてもよい。 If the sample to be analyzed contains an anionic compound with an absolute value of electrophoretic mobility that is equal to or greater than the absolute value of EOF mobility, this compound is removed from the capillary outlet by electrophoresis. Cannot move up to and stays in the capillary. Therefore, by stopping the application of voltage at an appropriate time during electrophoresis, pressurizing the electrophoresis solution in the capillary from the inlet side and feeding it to the outlet side, thereby moving the remaining compound to the outlet. be able to. Alternatively, the compound may be moved to the outlet by changing the voltage or by decreasing the voltage and increasing the pressure.
したがって、本発明に用いられる陰イオン性化合物の分離分析装置は、このような泳動液を加圧送液するための手段を備えていることが好ましい。加圧送液手段としては、例えば、エアーポンプが挙げられる。 Therefore, it is preferable that the anionic compound separation / analysis apparatus used in the present invention includes means for feeding such an electrophoretic solution under pressure. An example of the pressure liquid feeding means is an air pump.
CEで分離されてキャピラリーの出口に移動した試料は、キャピラリー出口に接続されたイオン化装置でイオン化される。 The sample separated by CE and moved to the capillary outlet is ionized by an ionizer connected to the capillary outlet.
イオン化の方法は、通常MSにおいて行われる方法であれば特に限定されない。例えば、エレクトロスプレー法(ESI)、大気圧化学イオン化法(APCI)、高速原子衝突法(FAB)が採用され得る。 The ionization method is not particularly limited as long as it is a method usually performed in MS. For example, electrospray method (ESI), atmospheric pressure chemical ionization method (APCI), and fast atom bombardment method (FAB) can be employed.
例えば、ESIの場合、イオン化装置には、シース液がエレクトロスプレーに適した流量で供給され、同時に、細かい液滴を生成してイオン化を促進するためのネブライザガス(例えば、窒素ガス)が供給される。 For example, in the case of ESI, the ionizer is supplied with sheath fluid at a flow rate suitable for electrospray, and at the same time is supplied with a nebulizer gas (eg, nitrogen gas) to generate fine droplets and promote ionization. The
イオン化された試料は、質量分析装置(MS)で分析される。MSは、通常用いられる質量分析装置が用いられ、例えば、シングルステージの四重極型、磁場型、飛行時間、イオントラップなどの種々の形式の質量分析装置、あるいはタンデム型の質量分析装置であってもよい。 The ionized sample is analyzed with a mass spectrometer (MS). For the MS, a commonly used mass spectrometer is used, for example, a single stage quadrupole type, a magnetic field type, a time of flight, an ion trap, or other types of mass analyzers, or a tandem type mass analyzer. May be.
本発明の方法によって分析され得る陰イオン性化合物としては、糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、CoA化合物などが挙げられる。これらの化合物は、異性体の分離分析も可能である。 Anionic compounds that can be analyzed by the method of the present invention include sugar phosphates, organic acids, nucleotides, CoA compounds and the like. These compounds can be separated and analyzed for isomers.
以下の実施例におけるすべてのCE/ESI−MS実験は、P/ACE MDQ (Beckman Coulter, Fullerton, CA)、Esquire 3000 plus ion trap mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA)、syringe pump IC3100 (Cole parmer, Illinois, USA)、およびCE ESI sprayer (Aglient Technologies, California, USA)を用いて行った。CEの制御は、32 Karat software (Beckman Coulter)を用い、MSの制御およびデータ取得は、Esquire Control 5.1 (Bruker Daltonics)を用い、そしてデータ解析は、Data Analysis 3.1 (Bruker Daltonics)を用いて行った。 All CE / ESI-MS experiments in the following examples are P / ACE MDQ (Beckman Coulter, Fullerton, CA), Esquire 3000 plus ion trap mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA), syringe pump IC3100 ( Cole parmer, Illinois, USA), and CE ESI sprayer (Aglient Technologies, California, USA). CE control was performed using 32 Karat software (Beckman Coulter), MS control and data acquisition was performed using Esquire Control 5.1 (Bruker Daltonics), and data analysis was performed using Data Analysis 3.1 (Bruker Daltonics). .
以下の実施例を行うにあたって、分析に初めて使用するキャピラリーは、泳動液を30psi(2.1bar)、60分の条件で送液することにより洗浄した。各分析において、キャピラリーに試料を注入する前には、キャピラリーに泳動液を30psi(2.1bar)、10分の条件で送液し、平衡化を行った。試料の注入は、2.0psi(0.14bar)の圧力で5秒間行った(約6nL)。 In carrying out the following examples, the capillaries used for the first time in the analysis were washed by feeding the electrophoresis solution under the conditions of 30 psi (2.1 bar) and 60 minutes. In each analysis, before injecting the sample into the capillary, the electrophoresis solution was fed into the capillary under conditions of 30 psi (2.1 bar) for 10 minutes for equilibration. Sample injection was performed at a pressure of 2.0 psi (0.14 bar) for 5 seconds (approximately 6 nL).
電気泳動は、バイアル側を陽極およびMS側を陰極に設定し、キャピラリーの両端に30kVの電圧を掛けた。電圧印加開始から設定した電圧値に達するまでに要する時間(ランプ時間)は0.30分とした。電気泳動時に、キャピラリーには22.5〜23.0μAの電流が流れ、電力は0.68Wであった。キャピラリーの温度は20℃に保った。シース液として、5mM酢酸アンモニウムを含む50%(v/v)メタノール水溶液を用い、シリンジポンプにより5μL/分の流速でイオン化室に送液した。 For electrophoresis, the vial side was set as the anode and the MS side as the cathode, and a voltage of 30 kV was applied to both ends of the capillary. The time (ramp time) required to reach the set voltage value from the start of voltage application was 0.30 minutes. During electrophoresis, a current of 22.5 to 23.0 μA flowed through the capillary, and the power was 0.68 W. The capillary temperature was kept at 20 ° C. A 50% (v / v) aqueous methanol solution containing 5 mM ammonium acetate was used as the sheath liquid, and the solution was sent to the ionization chamber by a syringe pump at a flow rate of 5 μL / min.
ESI−MSはネガティブイオンモードで検出を行った。MSのパラメーターは以下の通りである:ターゲットマス、m/z 150;スキャン範囲、m/z=50〜1000;スキャン速度、13,000m/z/sの標準スキャン分解能;ネブライザガス、6.0psi、ドライガス流速、4.0L/分;ドライガス温度、300℃;キャピラリー電圧、4.0kV。 ESI-MS was detected in negative ion mode. MS parameters are as follows: target mass, m / z 150; scan range, m / z = 50-1000; scan speed, standard scan resolution of 13,000 m / z / s; nebulizer gas, 6.0 psi Dry gas flow rate, 4.0 L / min; Dry gas temperature, 300 ° C .; Capillary voltage, 4.0 kV.
以下の実施例において分析に供した試料としての陰イオン性化合物は、以下のとおりである:グリオキシル酸;ピルビン酸;乳酸;グリセリン酸;フマル酸;コハク酸;ニコチン酸;リンゴ酸;2−オキソグルタル酸;リビトール;β−グリセロリン酸;シキミ酸;3−ホスホグリセリン酸;クエン酸;イソクエン酸;エリトロース4−リン酸;リボース5−リン酸;リブロース5−リン酸;グルコース6−リン酸;フルクトース6−リン酸;グルコース1−リン酸;セドヘプツロース7−リン酸;1,4−ピペラジンジエタンスルホン酸(PIPES);リブロース1,5−ビスリン酸;チアミン一リン酸(TMP);シチジル酸(CMP);ウリジル酸(UMP);フルクトース1,6−ビスリン酸;フルクトース2,6−ビスリン酸;AMP;GMP;セドヘプツロース1,7−ビスリン酸;CDP;UDP;ADP;パントテン酸;GDP;FMN;CTP;UTP;ATP;GTP;ADP−リボース;UDP−グルコース;ADP−グルコース;NAD;NADH;NADP;NADPH;FAD;およびアセチルCoA。 The anionic compounds as samples subjected to analysis in the following examples are as follows: glyoxylic acid; pyruvic acid; lactic acid; glyceric acid; fumaric acid; succinic acid; nicotinic acid; Acid; ribitol; β-glycerophosphoric acid; shikimic acid; 3-phosphoglyceric acid; citric acid; isocitrate; erythrose 4-phosphate; ribose 5-phosphate; ribulose 5-phosphate; glucose 6-phosphate; -Phosphate; Glucose 1-Phosphate; Cedoheptulose 7-Phosphate; 1,4-Piperazine Diethanesulfonic acid (PIPES); Ribulose 1,5-bisphosphate; Thiamine monophosphate (TMP); Cytidylic acid (CMP) Uridylic acid (UMP); fructose 1,6-bisphosphate; fructose 2,6-bisphosphate; MP; GMP; sedheptulose 1,7-bisphosphate; CDP; UDP; ADP; pantothenic acid; GDP; FMN; CTP; UTP; ATP; GTP; ADP-ribose; UDP-glucose; ADP-glucose; NADPH; FAD; and acetyl CoA.
各化合物のストック溶液は純水を用いて、100mMの濃度に調製した。分析用試料は、これらのストック溶液を適宜混合し、純水で希釈して用いた。 A stock solution of each compound was prepared to a concentration of 100 mM using pure water. The sample for analysis was used by appropriately mixing these stock solutions and diluting with pure water.
(実施例1)
50μmφ×100cmの通常のフューズドシリカキャピラリー(GL sciences製)を用いた。バイアル側を陽極およびMS側を陰極に設定した。泳動液は、特許文献1に記載の方法に従って50mM酢酸アンモニウム(pH9.0)を用いた。
Example 1
A normal fused silica capillary (manufactured by GL sciences) having a diameter of 50 μmφ × 100 cm was used. The vial side was set as the anode and the MS side as the cathode. As the electrophoresis solution, 50 mM ammonium acetate (pH 9.0) was used according to the method described in Patent Document 1.
種々の陰イオン性化合物について、上記の条件下でCE/ESI−MSを行った結果、EOFはMS側に流れることにより、電気泳動が成立し、ほとんどの陰イオン性化合物が検出できた。キャピラリーの内表面に特殊なコーティングを施す必要がないため、キャピラリーの品質にばらつきが少なく、安定した結果を得ることができた。 As a result of performing CE / ESI-MS on various anionic compounds under the above-mentioned conditions, EOF flowed to the MS side, electrophoresis was established, and most anionic compounds could be detected. Since there was no need to apply a special coating to the inner surface of the capillary, there was little variation in the quality of the capillary and stable results could be obtained.
しかし、共溶出する化合物が存在し、一部イオン化サプレッションにより検出が困難になる場合もあった。また、グルコース1−リン酸、グルコース6−リン酸、フルクトース6−リン酸などの異性体の分離は不十分であり、これらを区別することが困難であった。さらに、クエン酸、イソクエン酸などの多価有機酸を検出することができなかった。このように、検出が良好でない原因としては、EOFが早すぎるため、十分に分離しないうちにMSに分析対象化合物が到達すること、異性体間の電気泳動移動度の差が小さすぎることなどが考えられる。 However, co-eluting compounds exist and some ionization suppression may make detection difficult. Further, separation of isomers such as glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, and fructose 6-phosphate is insufficient, and it is difficult to distinguish them. Furthermore, polyvalent organic acids such as citric acid and isocitric acid could not be detected. As described above, the reason why the detection is not good is that the EOF is too early, so that the analysis target compound reaches the MS before it is sufficiently separated, and the difference in electrophoretic mobility between isomers is too small. Conceivable.
(実施例2)
通常のフューズドシリカキャピラリーの代わりに、フューズドシリカキャピラリーの内表面をジメチルシロキサン処理したキャピラリー(50μmφ×100cm、GL sciences製)を用いたこと以外は、上記実施例1と同様にCE/ESI−MSを行った。ジメチルシロキサン処理したキャピラリーでは、その内表面の極性が低くなり、ゼータ電位(電気二重層における滑り面と液体内部の電位との差)が小さくなり、EOFをある程度遅くすることができると予想される。
(Example 2)
CE / ESI− was performed in the same manner as in Example 1 except that a capillary (50 μmφ × 100 cm, manufactured by GL sciences) in which the inner surface of the fused silica capillary was treated with dimethylsiloxane was used instead of the normal fused silica capillary. MS was performed. In the dimethylsiloxane-treated capillary, the polarity of the inner surface is lowered, the zeta potential (the difference between the sliding surface in the electric double layer and the potential inside the liquid) is reduced, and it is expected that the EOF can be delayed to some extent. .
分析時間は長くなったが、各陰イオン性化合物の分離が大きく向上した。実施例1では共溶出したグルコース1−リン酸、グルコース6−リン酸、フルクトース6−リン酸などが分離し、異性体の分離も可能になった。また、電流値が落ちるということはなく、上記実施例1で用いた通常のフューズドシリカキャピラリーと同様に、安定して結果が得られた。 Although the analysis time was longer, the separation of each anionic compound was greatly improved. In Example 1, co-eluted glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, fructose 6-phosphate and the like were separated, and isomers could be separated. Further, the current value did not drop, and the result was obtained stably as in the case of the normal fused silica capillary used in Example 1 above.
(実施例3)
通常のフューズドシリカキャピラリーの代わりに、フューズドシリカキャピラリーの内表面をジメチルシロキサン処理したキャピラリー(50μmφ×100cm、GL sciences製)を用い、そして泳動液として酢酸アンモニウム(pH9.0)の代わりに50mM酢酸+92mMトリメチルアミン(pH9.4)を用いたこと以外は、上記実施例1と同様にCE/ESI−MSを行った。
(Example 3)
Instead of a normal fused silica capillary, a capillary (50 μmφ × 100 cm, manufactured by GL sciences) whose inner surface was fused with dimethylsiloxane was used, and 50 mM instead of ammonium acetate (pH 9.0) was used as an electrophoresis solution. CE / ESI-MS was performed in the same manner as in Example 1 except that acetic acid + 92 mM trimethylamine (pH 9.4) was used.
その結果、陰イオン性化合物の分離が全体的に向上し、特に、リブロース5−リン酸とリボース5−リン酸、あるいはグルコース1−リン酸、グルコース6−リン酸、フルクトース6−リン酸などの異性体の分離が向上した。これは、アンモニウムイオンよりもかさ高いトリメチルアミンがこれらの陰イオン性化合物を取り囲むため、異性体の構造の相違が強調され、異性体間の電気泳動移動度の差が大きくなったためと考えられる。 As a result, the separation of anionic compounds is improved overall, and in particular, ribulose 5-phosphate and ribose 5-phosphate, or glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, fructose 6-phosphate, etc. The separation of isomers was improved. This is thought to be because trimethylamine, which is bulkier than ammonium ions, surrounds these anionic compounds, thereby highlighting the difference in isomer structure and increasing the difference in electrophoretic mobility between isomers.
一方、フルクトース1,6−ビスリン酸、フルクトース2,6−ビスリン酸、クエン酸、イソクエン酸などの分子量が小さくかつ極性の非常に高い化合物は検出ができなかった。これは、EOF移動度よりも電気泳動移動度の絶対値のほうが大きいため、MS側ではなく、バイアル側に移動してしまったためと考えられる。 On the other hand, compounds with low molecular weight and very high polarity such as fructose 1,6-bisphosphoric acid, fructose 2,6-bisphosphoric acid, citric acid and isocitric acid could not be detected. This is considered to be because the absolute value of the electrophoretic mobility is larger than the EOF mobility, so that it has moved not to the MS side but to the vial side.
(実施例4)
次に、電気泳動を行うと同時に、エアーポンプでキャピラリーの入口側に0.5psi(34mbar)の圧力を掛けて補助的に送液を行う条件で、上記実施例3と同様にCE/ESI−MSを行った。
Example 4
Next, CE / ESI− was performed in the same manner as in Example 3 above, under the condition that at the same time as electrophoresis was performed, a pressure of 0.5 psi (34 mbar) was applied to the inlet side of the capillary with an air pump, and the liquid was supplementarily fed. MS was performed.
その結果、リブロース5−リン酸とリボース5−リン酸、あるいはグルコース1−リン酸、グルコース6−リン酸、フルクトース6−リン酸などの異性体は分離可能であり、そしてフルクトース1,6−ビスリン酸、フルクトース2,6−ビスリン酸、クエン酸、イソクエン酸などの検出も可能であった。しかし、後者の化合物の検出時間は遅く、それまでに拡散が起こってピークが非常にブロードになった。 As a result, isomers such as ribulose 5-phosphate and ribose 5-phosphate, or glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, and fructose 6-phosphate can be separated, and fructose 1,6-bislin Detection of acids, fructose 2,6-bisphosphate, citric acid, isocitric acid and the like was also possible. However, the detection time of the latter compound was slow, and diffusion occurred so far and the peak became very broad.
(実施例5)
次に、電気泳動の途中で電圧を落とし、それ以降は、単にエアーポンプで送液する手法で、CE/ESI−MSを行った。上記実施例4と同様に、ジメチルシロキサン処理したフューズドシリカキャピラリー(50μmφ×100cm)および泳動液として50mM酢酸、92mMトリメチルアミン(pH9.4)を用い0.5psiで補助的に送液しながら30分間電気泳動を行い、その後電圧を落としてエアーポンプのみで1.5psi(0.10bar)にて20分間送液した。結果を図3に示す。なお、CE/MSに供した各化合物の濃度は100μMである。
(Example 5)
Next, the voltage was dropped in the middle of electrophoresis, and thereafter, CE / ESI-MS was performed by a method of simply sending liquid with an air pump. As in Example 4 above, a fused silica capillary (50 μmφ × 100 cm) treated with dimethylsiloxane and 50 mM acetic acid and 92 mM trimethylamine (pH 9.4) as the electrophoresis solution were used for 30 minutes while being supplementarily fed at 0.5 psi. Electrophoresis was performed, and then the voltage was reduced and the solution was fed for 20 minutes at 1.5 psi (0.10 bar) only with an air pump. The results are shown in FIG. The concentration of each compound subjected to CE / MS is 100 μM.
図3からわかるように、種々の陰イオン性化合物が非常に良好に分離され、糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、CoAなどの51種の陰イオン性化合物の一斉分析が可能となった。このようなエアーポンプを補助的に用いる方法は、エアーポンプの圧力の調整を自由に行うことができるので、分離・検出時間の微妙な調整を容易に行うことが可能である。 As can be seen from FIG. 3, various anionic compounds were separated very well, and simultaneous analysis of 51 types of anionic compounds such as sugar phosphates, organic acids, nucleotides, and CoA became possible. Such a method of using the air pump as an auxiliary means that the pressure of the air pump can be freely adjusted, so that it is possible to easily perform fine adjustment of the separation / detection time.
本発明によれば、陰イオン性化合物の分析に用いられる通常のCEの系とは電極の極性を逆転させているため、分析途中でCEの電流が流れなくなる減少がなく、安定して分析を行うことができる。さらに、特殊なキャピラリーではなく、一般的なフューズドシリカキャピラリーを用いることができるため、安価に分析することができる。さらに、本発明によれば、CEとCE後の加圧送液とを組み合わせることにより、今まで同時に分析を行うことが困難だった糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、CoA化合物などの陰イオン性化合物を、一斉分析することが可能となる。したがって、本発明の方法は、メタボローム解析の新たな必須技術となり得る。 According to the present invention, since the polarity of the electrode is reversed from that of a normal CE system used for the analysis of anionic compounds, there is no decrease that the CE current does not flow during the analysis, and the analysis can be performed stably. It can be carried out. Furthermore, since a general fused silica capillary can be used instead of a special capillary, analysis can be performed at low cost. Furthermore, according to the present invention, anionic compounds such as sugar phosphates, organic acids, nucleotides, and CoA compounds that have been difficult to analyze simultaneously by combining CE and the pressurized liquid after CE are combined. Can be simultaneously analyzed. Therefore, the method of the present invention can be a new essential technique for metabolomic analysis.
Claims (9)
泳動液で満たされたキャピラリーの泳動液の入口側を陽極および出口側を陰極となるように設定し、該キャピラリーに電圧を印加して陰イオン性化合物を含む試料を電気泳動する工程であって、該電圧の印加により発生する電気浸透流の移動度の絶対値が、該試料中の少なくとも1種の陰イオン性化合物の電気泳動移動度の絶対値を上回るような条件で該電気泳動を行う、工程;および
該キャピラリーの出口まで泳動された該試料中の陰イオン性化合物を質量分析する工程;
を含む、方法。 A method for separating and analyzing anionic compounds by combining capillary electrophoresis and mass spectrometry,
A step of electrophoresis of a sample containing an anionic compound by setting the inlet side of the electrophoresis solution of the capillary filled with the electrophoresis solution to be an anode and the cathode side being a cathode, and applying a voltage to the capillary. The electrophoresis is performed under the condition that the absolute value of the mobility of the electroosmotic flow generated by the application of the voltage exceeds the absolute value of the electrophoretic mobility of at least one anionic compound in the sample. And mass analyzing the anionic compound in the sample migrated to the outlet of the capillary;
Including a method.
該キャピラリー電気泳動装置で分離された試料をイオン化するためのイオン化装置;および
該イオン化された試料を分析するための質量分析装置;
を備えた、陰イオン性化合物の分離分析装置。 Capillary electrophoresis apparatus set so that the outlet side of the capillary becomes the cathode;
An ionizer for ionizing a sample separated by the capillary electrophoresis apparatus; and a mass spectrometer for analyzing the ionized sample;
An anionic compound separation and analysis apparatus comprising:
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