JP2008237163A - Method for separating/detecting protein or the like - Google Patents

Method for separating/detecting protein or the like Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for separating/detecting a protein or the like, in which a protein tag system having a bond with high specificity is utilized. <P>SOLUTION: The method for separating/detecting the protein or the like includes forming a conjugate from (A) a biotin-immobilizing enzyme derived from archeal Sulfolobustokodaii and (B) a fused protein of a biotin-carrying protein derived from the archaea and biotinylated by catalytic action of the biotin-immobilizing enzyme with a target protein or forming a conjugate from the biotin-immobilizing enzyme (A), the fused protein (B) and (C) a substance having a binding affinity with the target protein and then separating/detecting the target protein or the target protein and the substance (C) having binding affinity with the target protein. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)由来のビオチン固定化酵素によるビオチン化反応を利用した、タンパク等の分離・検出方法に関する。 The present invention relates to a method for separating and detecting proteins and the like using a biotinylation reaction with a biotin-immobilized enzyme derived from Sulfolobus tokodaii.

プロテインタグシステムは、タンパクの精製方法並びに分析方法として、幅広い分野で活用されている。この手法では、タグとばれる比較的低分子量のタンパクやペプチドと、目的のタンパクを融合させて細胞内で発現させ、その後、タグを認識する物質を固定化した固相担体を利用して、目的のタンパクを捕捉し精製する方法である。この際、細胞内で目的のタンパクに結合していたタンパク質も同時に捕捉することが可能であるため、タンパク間相互作用の解析にも活用されている。更に、タグを有する目的タンパクを同様の原理で固相担体に固定化し、その後、その固相担体上で目的タンパクと他の物質(タンパク等)との間の相互作用を解析することも可能である。 Protein tag systems are used in a wide range of fields as protein purification methods and analysis methods. In this method, the target protein is used by fusing a target protein with a relatively low molecular weight protein or peptide called tag and expressed in the cell, and then immobilizing the tag recognition substance. It is a method to capture and purify the protein. At this time, since it is possible to simultaneously capture a protein that has been bound to the target protein in the cell, it is also used for analysis of protein-protein interaction. Furthermore, the target protein having a tag can be immobilized on a solid phase carrier using the same principle, and then the interaction between the target protein and other substances (proteins, etc.) can be analyzed on the solid phase carrier. is there.

このような目的に使用するタグとして、これまでに様々なものが開発されてきたが、代表的なものとしては次の様なものがある。(1)抗体によって認識されるペプチドあるいはタンパク(エピトープ)をタグとして利用し、抗体を固定化した固相担体を利用する系(例えば、非特許文献1参照)、(2)ビオチン化ペプチドあるいはタンパクをタグとして利用し、アビジンあるいはストレプトアビジンを固定化した固相担体を利用する系が挙げられる(例えば、非特許文献2、特許文献1、2参照)。
Brizzard, B., L. et al. Biotechniques (1994) 第16巻 第4号p. 730-735 Rodriguez, P. et al. Methods Mol Biol. (2006) 第338巻 p. 305-323 特表2005−516074号公報 特開2003−153698号公報
Various tags have been developed so far for use for such purposes. Typical examples are as follows. (1) A system using a peptide or protein (epitope) recognized by an antibody as a tag and using a solid support on which the antibody is immobilized (for example, see Non-Patent Document 1), (2) Biotinylated peptide or protein Can be used as a tag, and a system using a solid phase carrier on which avidin or streptavidin is immobilized (for example, see Non-Patent Document 2, Patent Documents 1 and 2).
Brizzard, B., L. et al. Biotechniques (1994) Vol. 16, No. 4, p. 730-735 Rodriguez, P. et al. Methods Mol Biol. (2006) Volume 338 p. 305-323 JP 2005-516074 gazette JP 2003-153698 A

しかし、これらの系には問題点が存在する。それは、まず抗体を利用する系の場合、アミノ酸残基間のみの結合を利用しているため、本質的に交差反応性を示し、目的タンパクではない他のタンパクとの結合が起こり得ることである。また、アビジンを利用する系の場合、アビジンはビオチンのみを認識して結合するため、細胞内に元々存在するビオチン化タンパクもすべて結合することになる。従って、これらの既存の手法には結合特異性という観点から改善の余地がある。また、これらの既存の手法では、目的タンパクを固相担体上に捕捉した後、それを溶出させるのに何らかの添加剤が必要であり、精製や解析に手間がかかっている。更に、抗体やアビジンは大腸菌などの原核生物の発現系を利用して調製することが困難であるため、結果として、価格が非常に高額であることも問題点として挙げられる。 However, there are problems with these systems. First of all, in the case of a system using an antibody, since it uses a bond only between amino acid residues, it essentially shows cross-reactivity and can bind to another protein that is not the target protein. . In the case of a system utilizing avidin, since avidin recognizes and binds only biotin, all biotinylated proteins originally present in the cell also bind. Therefore, these existing methods have room for improvement from the viewpoint of binding specificity. Moreover, in these existing methods, after capturing the target protein on a solid phase carrier, some kind of additive is required to elute it, and it takes time and effort for purification and analysis. Furthermore, since it is difficult to prepare antibodies and avidin using a prokaryotic expression system such as Escherichia coli, as a result, the price is very high.

上記のように既存のプロテインタグシステムでは、目的タンパクではない他のタンパク質による結合が起こり得ることが問題点として挙げられる。そこで、より特異性の高い結合をプロテインタグシステムとして活用することにより、このような問題を克服することが望まれる。また、捕捉した目的タンパクの溶出に関しても、何らかの物質を添加すること無しに溶出することができれば、より迅速な精製や分析が行えることが期待される。更に、大腸菌などの原核生物の発現系で容易に調製可能なタンパクを、タグを認識する物質として利用することにより、精製・分析のコストを下げることが望まれる。本発明の課題は、このような点を全て解決したタンパク等の分離・検出方法を提供することにある。 As described above, the problem with the existing protein tag system is that binding by another protein that is not the target protein can occur. Therefore, it is desired to overcome such problems by utilizing a more specific binding as a protein tag system. In addition, regarding the elution of the captured target protein, it is expected that more rapid purification and analysis can be performed if it can be eluted without adding any substances. Furthermore, it is desired to reduce the cost of purification and analysis by using a protein that can be easily prepared in a prokaryotic expression system such as E. coli as a substance that recognizes the tag. An object of the present invention is to provide a method for separating and detecting proteins and the like that solves all of these points.

上記のような課題を解決するために、本発明では、本発明者が最近見出した、古細菌スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)の特異なビオチン化反応系を利用して、プロティンタグシステムを構築する。ビオチン化反応は、ビオチン固定化酵素(Biotin Protein Ligase、BPL)が、その基質タンパク(Biotin Carboxyl Carrier Protein、BCCP)のある特定のリジン残基にビオチンを付加する反応である。このビオチン化反応は、ビオチンを部位特異的にタンパクに導入でき非常に有用性が高いため、これまで様々な生物種から酵素及びその基質タンパクが単離されてきた。その結果、意外にも、このビオチン化反応は異なる生物種間で交差反応性を示し、生物種が異なっても類似の性質を有していることが示されてきた。 In order to solve the above-described problems, the present invention constructs a protein tag system using a specific biotinylation reaction system of the archaeon Sulfolobus tokodaii recently discovered by the present inventor. . The biotinylation reaction is a reaction in which biotin-immobilized enzyme (Biotin Protein Ligase, BPL) adds biotin to a specific lysine residue of its substrate protein (Biotin Carboxyl Carrier Protein, BCCP). Since this biotinylation reaction is highly useful because it can introduce biotin into a protein in a site-specific manner, enzymes and their substrate proteins have been isolated from various biological species so far. As a result, it has been unexpectedly shown that this biotinylation reaction shows cross-reactivity between different species, and has similar properties even if the species are different.

しかし、最近、本発明者は、古細菌スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)のビオチン化反応系が、これまでの生物種由来のものには見られない、極めて特異な性質を有していることを発見した。その性質とは、まず、この古細菌のビオチン化反応系が、大腸菌の反応系と完全に交差反応性を有していないことと、反応後、酵素であるBPLが、ビオチン化されたBCCPと極めて安定な複合体を形成するという性質である。特に後者の、酵素がその反応生成物と非常に安定な複合体を形成するという性質は、他の酵素反応系おいても例を見ない極めて特異な性質である。本発明は、かかる知見に基づき、更に鋭意研究を重ねた結果、達成されたものである。 However, recently, the present inventor has shown that the biotinylation reaction system of the archaeon Sulfolobus tokodaii has extremely unique properties that have not been found in those derived from conventional biological species. discovered. First of all, this archaeal biotinylation reaction system is not completely cross-reactive with the E. coli reaction system, and after the reaction, the enzyme BPL is biotinylated BCCP. It has the property of forming a very stable complex. In particular, the latter property that the enzyme forms a very stable complex with the reaction product is a very unique property that is unprecedented in other enzyme reaction systems. The present invention has been achieved as a result of further earnest research based on this finding.

本発明の請求項1に記載された発明は、スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)由来のビオチン固定化酵素(A)と、該ビオチン固定化酵素の触媒作用によってビオチン化された、スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)由来のビオチン担持タンパクと目的タンパク質との融合タンパク(B)とから複合体を形成させ、又は、前記ビオチン固定化酵素(A)と、前記融合タンパク(B)と、目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)とから複合体を形成させ、該複合体として、前記目的タンパク、又は、前記目的タンパクと前記目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)を分離・検出することを特徴とするタンパク等の分離・検出方法である。 The invention described in claim 1 of the present invention includes a biotin-immobilized enzyme (A) derived from Sulfolobus tokodaii, and a biotinylated Sulfolobus tokodaii (Sulfolobus tokodaii) -catalyzed action of the biotin-immobilized enzyme. a complex is formed from a fusion protein (B) of a biotin-carrying protein derived from tokodaii) and the target protein, or a binding affinity between the biotin-immobilized enzyme (A), the fusion protein (B), and the target protein. Forming a complex from the substance (C) having a property, and separating and detecting the target protein or the substance (C) having binding affinity for the target protein and the target protein as the complex This is a method for separating and detecting characteristic proteins.

本発明の請求項2に記載された発明は、ビオチン固定化酵素(A)と融合タンパク(B)とからなる複合体を加温して、ビオチン固定化酵素(A)と融合タンパク(B)を解離させ、該融合タンパク(B)として目的タンパクを分離・検出することを特徴とする請求項1項記載のタンパク等の分離・検出方法である。 According to the second aspect of the present invention, the biotin-immobilized enzyme (A) and the fusion protein (B) are heated by heating a complex composed of the biotin-immobilized enzyme (A) and the fusion protein (B). The method for separating and detecting a protein or the like according to claim 1, wherein the target protein is separated and detected as the fusion protein (B).

本発明の請求項3に記載された発明は、ビオチン固定化酵素(A)と融合タンパク(B)と目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)とからなる複合体を加温して、ビオチン固定化酵素(A)から、融合タンパク(B)と目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)を解離させ、該融合タンパク(B)に含まれる目的タンパクと、目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)を分離・検出することを特徴とする請求項1項記載のタンパク等の分離・検出方法である。 The invention described in claim 3 of the present invention comprises heating a complex comprising a biotin-immobilized enzyme (A), a fusion protein (B), and a substance (C) having binding affinity with a target protein, A substance (C) having binding affinity between the fusion protein (B) and the target protein is dissociated from the biotin-immobilized enzyme (A), and the target protein contained in the fusion protein (B) is bound to the target protein. The method for separating / detecting a protein or the like according to claim 1, wherein the substance (C) having a salt is separated / detected.

本発明の請求項4に記載された発明は、目的タンパク質が、ビオチン担持タンパクの活性領域と融合した融合タンパクを形成していることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項記載のタンパク等の分離・検出方法である。 The invention described in claim 4 of the present invention is characterized in that the target protein forms a fusion protein fused with the active region of the biotin-carrying protein. This is a method for separating and detecting proteins and the like.

そして、本発明の請求項5に記載された発明は、ビオチン固定化酵素(A)として、固相担体に固定化されたものを用いることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項記載のタンパク等の分離・検出方法である。 The invention described in claim 5 of the present invention uses the biotin-immobilized enzyme (A) immobilized on a solid phase carrier as the biotin-immobilized enzyme (A). This is a method for separating and detecting proteins and the like described.

本発明によると、古細菌スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)の特異なビオチン化反応系をプロティンタグシステムとして活用し、新規なタンパク等の分離・検出、更には精製系が構築される。具体的には、BCCPをタグとして利用し、目的のタンパクと融合させて細胞内で発現させる。一方で、酵素であるBPLを固相担体に固定化し、タグを認識する物質として利用する。そして、BCCPタグを有する目的タンパクを含む溶液を、BPLを固定化した固相担体と接触させビオチン化反応を行うことにより、固相担体上に目的タンパクを結合させ捕捉する。 According to the present invention, a novel biotinylation reaction system of archaeon Sulfolobus tokodaii is utilized as a protein tag system, and a novel protein separation and detection system and a purification system are constructed. Specifically, BCCP is used as a tag, fused with the target protein, and expressed in cells. On the other hand, BPL, which is an enzyme, is immobilized on a solid phase carrier and used as a substance that recognizes a tag. Then, a solution containing the target protein having a BCCP tag is brought into contact with a solid phase carrier on which BPL is immobilized, and a biotinylation reaction is performed to bind and capture the target protein on the solid phase carrier.

本発明におけるタグシステムでは、BPLとビオチン化されたBCCP間の結合を利用している。この結合は、後の実施例で示すように、ナノモラー(nM)オーダーの極めて高い親和性を有している。また、この結合は、BPLとBCCPのアミノ酸残基間及び、BPLとビオチン間の協同的な相互作用に基づいているため、既存のタグシステムのものよりも、明らかに結合特異性が高いものと考えられる。また、タグを認識する物質であるBPLの分子量が27kDaと、抗体(150kDa)やアビジン(68kDa)の分子量と比較して小さく、その分子表面積が小さいため、目的タンパク以外の非特異的な結合をより抑制することが可能である。 The tag system according to the present invention utilizes a bond between BPL and biotinylated BCCP. This binding has a very high affinity on the order of nanomolar (nM), as shown in later examples. In addition, since this binding is based on a cooperative interaction between the amino acid residues of BPL and BCCP and between BPL and biotin, the binding specificity is clearly higher than that of the existing tag system. Conceivable. In addition, the molecular weight of BPL, a substance that recognizes the tag, is 27 kDa, which is small compared to the molecular weight of antibodies (150 kDa) and avidin (68 kDa), and its molecular surface area is small. It is possible to suppress more.

また、このBPL−BCCP間の結合は、温度上昇により解離するので、温度を上昇させるだけで、固相担体から目的タンパクを溶出させることができる。従って、既存の手法よりも分離・精製や検出・解析を迅速に行えることが期待される。更に、BPLは抗体やアビジンと異なり、大腸菌などの原核生物の発現系で容易に調製することが可能である。 Further, since the bond between BPL and BCCP is dissociated by increasing the temperature, the target protein can be eluted from the solid phase carrier only by increasing the temperature. Therefore, it is expected that separation / purification and detection / analysis can be performed more quickly than existing methods. Further, unlike antibodies and avidin, BPL can be easily prepared in a prokaryotic expression system such as E. coli.

本発明は、スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)由来のビオチン固定化酵素(A)(BPL)と、同じく古細菌由来のビオチン担持タンパク(BCCP)と目的タンパク質との融合タンパク(B)を用い、BPLの触媒作用によってBCCPをビオチン化させ、BPLとビオチン化されたBCCPが複合体を形成するという性質を利用するものである。かくして形成された複合体として、目的タンパクを分離・検出するものである。 The present invention uses a biotin-immobilized enzyme (A) (BPL) derived from Sulfolobus tokodaii and a fusion protein (B) of a biotin-carrying protein (BCCP) derived from archaea and a target protein. This utilizes the property that BCCP is biotinylated by the catalytic action of BPL, and BPL and biotinylated BCCP form a complex. As a complex thus formed, the target protein is separated and detected.

上記と同じ反応は、前記ビオチン固定化酵素(A)と、前記融合タンパク(B)と、目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)にも適用が可能であり、この場合にも、複合体が形成されるので、形成された複合体として、目的タンパクと、目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)を分離・検出することができる。 The same reaction as described above can be applied to the biotin-immobilized enzyme (A), the fusion protein (B), and a substance (C) having binding affinity for the target protein. Since the body is formed, the target protein and the substance (C) having binding affinity for the target protein can be separated and detected as the formed complex.

本発明において用いられるスルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)は、容易に入手可能な古細菌である。スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)(JCM10545)は、理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設に保存されており、第三者の要求により分譲可能である。また、スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)は、その遺伝子が既に解析され知られている(例えば、Suzuki, T. et al., Extremophiles, 2002 Feb;6(1):39-44、Kawarabayashi,Y. et al.,
DNA Res. 8 (4), 123-140 (2001))。そして、そのDNA断片は、独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手が可能である。
Sulfolobus tokodaii used in the present invention is an easily available archaea. Sulfolobus tokodaii (JCM10545) is stored in the microbial strain storage facility of RIKEN Bioinformatics and can be sold at the request of a third party. In addition, Sulfolobus tokodaii has already been analyzed and known (for example, Suzuki, T. et al., Extremophiles, 2002 Feb; 6 (1): 39-44, Kawarabayashi, Y. et al.,
DNA Res. 8 (4), 123-140 (2001)). The DNA fragment can be obtained from the National Institute for Product Evaluation Technology.

ビオチン固定化酵素(BPL)は、ビオチン担持タンパク(BCCP)のある特定のリジン残基に、ビオチンを共有結合で固定化する反応を触媒する酵素である。本発明者の知見によると、スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)由来のBPLが、他の生物種由来のものには見られないいくつかの特徴を有している。その中の一つが、この酵素BPLが反応後、ビオチン化されたBCCP(Holo BCCPともいう)と極めて安定な複合体を形成するという性質である。本発明は、この特異なBPL−Holo BCCP間の結合を利用して、新規なプロティンタグシステムを構築するものである。 Biotin-immobilized enzyme (BPL) is an enzyme that catalyzes a reaction for covalently immobilizing biotin to a specific lysine residue of biotin-carrying protein (BCCP). According to the knowledge of the present inventor, BPL derived from Sulfolobus tokodaii has several characteristics not found in those derived from other species. One of the properties is that the enzyme BPL forms a very stable complex with biotinylated BCCP (also referred to as Holo BCCP) after the reaction. In the present invention, a novel protein tag system is constructed by utilizing this specific binding between BPL and Holo BCCP.

本発明において用いられる古細菌スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)由来のビオチン固定化酵素(BPL)、及び同古細菌由来のビオチン担持タンパク(BCCP)
は公知のものである。このBPLの分子量は27kDaで、BCCPの分子量は17kDaであり、例えば、大腸菌を宿主として大量培養、発現精製を行うことができることが知られている(例えば、Sueda et al、Biochemical and Biophysical Research Communications 344(2006)155-159、Li et al、FEBS Letters
580(2006)1536-1540、末田ら、第6回日本蛋白質科学会年会 京都市 平成18年4月24日〜26日、近藤ら、日本ビタミン学会第58回年会 徳島市 平成18年5月27日〜28日)。
Biotin-immobilized enzyme (BPL) derived from Archaebacterium Sulfolobus tokodaii used in the present invention, and biotin-carrying protein (BCCP) derived from the archaea
Are known. The molecular weight of this BPL is 27 kDa and the molecular weight of BCCP is 17 kDa. For example, it is known that large-scale culture and expression purification can be performed using E. coli as a host (for example, Sueda et al, Biochemical and Biophysical Research Communications 344). (2006) 155-159, Li et al, FEBS Letters
580 (2006) 1536-1540, Sueda et al., 6th Annual Meeting of the Protein Science Society of Kyoto, Kyoto City April 24-26, 2006, Kondo et al., 58th Annual Meeting of the Vitamin Society of Japan, Tokushima City, May 2006 Monday 27th to 28th).

本発明において、目的タンパク質が、ビオチン担持タンパクの活性領域と融合した融合タンパクを形成しているものが好ましい。BCCPの構造は、他の生物由来のものに関する検討から、2つのドメインから構成されており、そのうちビオチン化に必要なのはC末側のドメインだけであることが示されている。また、このC末側のドメインに関しては、いくつかの生物由来のものに関して立体構造が解析されている。 In the present invention, it is preferable that the target protein forms a fusion protein fused with the active region of the biotin-carrying protein. The structure of BCCP is composed of two domains based on studies on those derived from other organisms. Of these, only the C-terminal domain is required for biotinylation. In addition, regarding the domain at the C-terminal side, the three-dimensional structure has been analyzed with respect to those derived from several organisms.

本発明で使用したスルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)のBCCPに関しては、まだ、立体構造は分かっていないが、そのアミノ酸配列の相同性から判断して、他の生物のものとほぼ同様の構造を有しているものと推測できる。実際に、このスルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)のBCCPは、全長が167残基のタンパクであるが、そのN末から順次欠損させた一連のBCCPをGSTとの融合タンパクとして構築し、ビオチン化反応並びにBPLとの結合能を検討した。その結果、C末側のドメインだけに、相当する67残基のBCCPだけでも、ビオチン化反応が起こり、また、BPLに対する強い結合が起こることが確認できた。本発明において、ビオチン担持タンパクの活性領域とは、BCCPのC末側のドメインであって、ビオチン化反応を起こしうる領域を意味する。 Regarding the BCCP of Sulfolobus tokodaii used in the present invention, the three-dimensional structure is not yet known, but judging from the homology of its amino acid sequence, it has almost the same structure as that of other organisms. I can guess that. Actually, the BCCP of Sulfolobus tokodaii is a protein with a total length of 167 residues, but a series of BCCPs that are sequentially deleted from the N-terminus are constructed as a fusion protein with GST, and biotinylated reaction In addition, the binding ability to BPL was examined. As a result, it was confirmed that the biotinylation reaction occurred only in the corresponding 67-residue BCCP only in the C-terminal domain, and that strong binding to BPL occurred. In the present invention, the active region of a biotin-carrying protein means a region on the C-terminal side of BCCP that can cause a biotinylation reaction.

一般にタグの構造としては、タグを認識する物質や固相担体と、目的タンパクとの間の立体障害を避けるために、ある程度の大きさを持ち、目的タンパクと固相担体等との間に一定の距離が保てるような構造を有していることが望ましいと考えられる。しかし、あまりタグが大きいと、目的タンパクへのタグ自身による立体障害が問題となってくる。そのような観点から、このBCCPのC末側ドメインは、7kDa程度の適度なサイズを有していることから、タグとして最適な構造を有していると考えられる。 In general, the tag structure has a certain size to avoid steric hindrance between the target protein and solid phase carrier and the target protein, and is constant between the target protein and the solid phase carrier. It is thought that it is desirable to have a structure that can maintain this distance. However, if the tag is too large, steric hindrance by the tag itself to the target protein becomes a problem. From such a point of view, the C-terminal domain of this BCCP has an appropriate size of about 7 kDa, and thus is considered to have an optimum structure as a tag.

複合体中の目的タンパク、あるいは目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)を分離・検出する方法は、公知のどのような方法・手段を採用しても良い。特に、ビオチン固定化酵素(A)として、固相担体に固定化されたものを用いるのが好ましい。 As a method for separating and detecting the target protein in the complex or the substance (C) having binding affinity with the target protein, any known method / means may be adopted. In particular, it is preferable to use a biotin-immobilized enzyme (A) immobilized on a solid support.

目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)とは、目的タンパクと結合し得る物質、例えば、その他のタンパク、ペプチド、DNA、RNA、糖鎖、脂質が挙げられる。例えば、固相担体上にBPLを介して固定化された目的タンパクに対して、目的タンパクと結合し得る物質(C)を作用させ、これとの相互作用を表面プラズモン共鳴法(SPR法)などを利用して評価する場合には、結合状態だけでなく、解離する過程も評価することも可能であるが、かかる場合も本発明の分離・検出方法に含まれるものである。 Examples of the substance (C) having binding affinity for the target protein include substances that can bind to the target protein, such as other proteins, peptides, DNA, RNA, sugar chains, and lipids. For example, a substance (C) capable of binding to the target protein is allowed to act on the target protein immobilized on the solid phase carrier via BPL, and the interaction with the target protein is determined by the surface plasmon resonance method (SPR method), etc. In the case of evaluating using the method, it is possible to evaluate not only the bound state but also the dissociation process, but such a case is also included in the separation / detection method of the present invention.

本発明はBCCPタグを導入した目的タンパクを、好ましくは、BPLを固定化した固相担体で捕捉し、その後、精製や解析を行うものであるが、具体的な手法に関しては、目的に応じて様々な形態が考えられる。例えば、細胞内で発現させた目的タンパクの分離・精製や、細胞内で目的タンパクと相互作用しているタンパクを同定・検出する、いわゆるプルダウアッセイに応用する場合には、BPLをガラスビーズや磁気ビーズなどの固相担体に共有結合で固定化する。一方で、BCCPタグを有する目的タンパクを、細胞内で発現させる。そして、その細胞の破砕を行った後、細胞破砕溶液にBPL固定化ビーズを作用させビオチン化反応を行い、目的タンパクの捕捉を行う。その後、目的タンパクをビーズから溶出させ分離・回収を行う。目的タンパクに結合しているタンパクを同定・検出する場合には、その後、更に質量分析等を行い、タンパクの分析を行う。 In the present invention, a target protein into which a BCCP tag has been introduced is preferably captured by a solid phase carrier on which BPL is immobilized, and then purified and analyzed. Various forms are possible. For example, when applying to the so-called pull-down assay, in which the target protein expressed in the cell is separated and purified, or the protein that interacts with the target protein in the cell is identified and detected, BPL is used for glass beads or magnetic It is immobilized by a covalent bond to a solid support such as beads. On the other hand, a target protein having a BCCP tag is expressed in cells. After disrupting the cells, BPL-immobilized beads are allowed to act on the cell disruption solution to perform a biotinylation reaction to capture the target protein. Thereafter, the target protein is eluted from the beads and separated and recovered. In the case of identifying / detecting a protein bound to the target protein, mass analysis is then performed to analyze the protein.

一方、BCCPタグを有する目的タンパクを固相担体へ固定化し、その後、その目的タンパクと結合親和性を有する物質(タンパク等)を作用させ、両者の相互作用を解析する場合には、分析手法に応じて、BPLを様々な固相担体(基板やセンサーチップ等)上に固定化する。その代表的な例としては、プロテインチップや表面プラズモン共鳴(SPR)法を利用した、タンパク間相互作用解析等が挙げられる。 On the other hand, in the case of immobilizing a target protein having a BCCP tag on a solid phase carrier, and then allowing a substance having a binding affinity to the target protein (protein etc.) to be analyzed, the analysis method is used. Accordingly, BPL is immobilized on various solid phase carriers (substrate, sensor chip, etc.). Typical examples thereof include protein-protein interaction analysis using a protein chip or surface plasmon resonance (SPR) method.

プロテインチップは、基板上に他種類の目的タンパクを固定化し、その後、それらに分析対象のタンパクを作用させ、相互作用を一度に解析する手法である。本発明をプロテインチップに応用する場合、基板上にBPLを共有結合で固定化し、その後、BCCPタグを有する複数の目的タンパクを、BPLを介して基板上に固定化する。その後、分析対象のタンパクを作用させ解析を行う。 The protein chip is a technique of immobilizing other types of target proteins on a substrate, and then allowing the protein to be analyzed to act on them to analyze the interaction at once. When the present invention is applied to a protein chip, BPL is immobilized on a substrate by a covalent bond, and then a plurality of target proteins having a BCCP tag are immobilized on the substrate via the BPL. Thereafter, the protein to be analyzed is acted on for analysis.

また、SPR法は、センサーチップ上に目的タンパクを固定化し、それと相互作用する物質をフローセル中に流すことにより、両者の相互作用を定量的に評価する方法である。本発明をこのSPR法に応用する場合、センサーチップ上にBPLを共有結合で固定化し、その後、BCCPタグを有する目的タンパクを、BPLを介してセンサーチップ上に固定化する。その後、分析対象の物質との相互作用を解析する。 The SPR method is a method for quantitatively evaluating the interaction between the target protein by immobilizing a target protein on a sensor chip and flowing a substance that interacts with the protein in a flow cell. When the present invention is applied to this SPR method, BPL is immobilized on a sensor chip by covalent bond, and then a target protein having a BCCP tag is immobilized on the sensor chip via BPL. Thereafter, the interaction with the substance to be analyzed is analyzed.

本発明においては、ビオチン固定化酵素(A)と融合タンパク(B)とからなる複合体を加温して、ビオチン固定化酵素(A)と融合タンパク(B)を解離させることができる。そして 解離した融合タンパク(B)として目的タンパクを分離・検出することができる。
加温の温度は50℃以上、好ましく60℃以上である。
In the present invention, the biotin-immobilized enzyme (A) and the fusion protein (B) can be dissociated by heating the complex composed of the biotin-immobilized enzyme (A) and the fusion protein (B). The target protein can be separated and detected as the dissociated fusion protein (B).
The heating temperature is 50 ° C. or higher, preferably 60 ° C. or higher.

また、同じ反応は、ビオチン固定化酵素(A)と融合タンパク(B)と目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)とからなる複合体を加温することによっても起こる。そして、この場合には、ビオチン固定化酵素(A)から、融合タンパク(B)と目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)を解離させ、得られた融合タンパク(B)に含まれる目的タンパクと、目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)を分離・検出することができる。 The same reaction also occurs by heating a complex composed of a biotin-immobilized enzyme (A), a fusion protein (B), and a substance (C) having binding affinity for the target protein. In this case, the substance contained in the fusion protein (B) obtained by dissociating the substance (C) having binding affinity between the fusion protein (B) and the target protein from the biotin-immobilized enzyme (A). A protein and a substance (C) having a binding affinity for a target protein can be separated and detected.

以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例では、本発明の基本となっている、ビオチン化酵素BPLとその基質であるBCCP間の結合を、図1に示すように表面プラズモン共鳴(SPR)法により定量的に評価した。その後、実際の応用例として、目的タンパクとしてグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)を選択し、GSTとBCCPの融合タンパクを構築し、その融合タンパクが、固相担体上のBPLと迅速に反応し、BPLと結合することを同じくSPR法により確認した。また、温度上昇に伴いBPL−BCCP間の結合が解離することを、酵素活性を測定することにより確認した。以下にこれらを具体的に説明する。 Hereinafter, although an example explains the present invention in detail, the present invention is not limited to this. In Examples, the binding between biotinylated enzyme BPL and its substrate BCCP, which is the basis of the present invention, was quantitatively evaluated by the surface plasmon resonance (SPR) method as shown in FIG. Then, as an actual application example, glutathione-S-transferase (GST) is selected as the target protein, a fusion protein of GST and BCCP is constructed, and the fusion protein reacts rapidly with BPL on the solid phase carrier, It was also confirmed by SPR method that it binds to BPL. Further, it was confirmed by measuring the enzyme activity that the bond between BPL and BCCP was dissociated as the temperature increased. These will be specifically described below.

[実施例1]センサーチップ上へのBPLの固定化
SPR法によりBPL−BCCP間の結合を評価するにあたり、センサーチップ上へBPLの固定化を行った。なお、センサーチップはビアコア社製のSenosor Chip CM5を使用し、また、SPR測定は同じくビアコア社製のBiacore Jを使用して行った。固定化はビアコア社製のプロトコールに従い、アミンカップリング法にて行った。具体的には、まずNHS/EDC混合液を利用し、センサーチップ表面のカルボキシル基を活性化した。その後、10mM
酢酸緩衝液(pH 4.5)で、20μg/mlに希釈したBPL溶液を添加し、センサーチップ表面にBPLを固定化した。最後に、エタノールアミン溶液を添加し、残存している活性サイト修飾した。
[Example 1] Immobilization of BPL on sensor chip In evaluating the binding between BPL and BCCP by the SPR method, BPL was immobilized on the sensor chip. In addition, the sensor chip used Senosor Chip CM5 manufactured by Biacore, and SPR measurement was performed using Biacore J manufactured by Biacore. Immobilization was performed by an amine coupling method according to a protocol manufactured by Biacore. Specifically, first, the carboxyl group on the surface of the sensor chip was activated using an NHS / EDC mixed solution. Then 10 mM
A BPL solution diluted to 20 μg / ml with an acetate buffer (pH 4.5) was added to immobilize BPL on the sensor chip surface. Finally, an ethanolamine solution was added to modify the remaining active site.

[実施例2]センサーチップ上に固定化されたBPLとApo型及びHolo型BCCPの相互作用の測定
センサーチップ上に固定化されたBPLに対して、BCCPを作用させ、両者の相互作用を評価した。この際、ビオチンが付加される前のApo型のBCCPと、ビオチンが付加されたHolo型のBCCPに関してそれぞれ評価を行った。具体的には、図1に示すようにフローセルにBCCPを添加し、BPLとの結合に伴う物理量変化(反射光におけるエネルギー消失の見られる反射角度)をモニターすることにより、結合能を評価した。なお、この際ランニング緩衝液としては、HBS buffer(10mM HEPES (pH 7.4),0.15M NaCl)を使用した。
[Example 2] Measurement of interaction between BPL immobilized on sensor chip and Apo-type and Holo-type BCCP BCCP is acted on BPL immobilized on sensor chip, and the interaction between the two is evaluated. did. At this time, the Apo-type BCCP before biotin was added and the Holo-type BCCP to which biotin was added were evaluated. Specifically, the binding ability was evaluated by adding BCCP to the flow cell as shown in FIG. 1 and monitoring the physical quantity change (reflection angle at which energy loss in reflected light is observed) accompanying the binding with BPL. At this time, HBS buffer (10 mM HEPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl) was used as a running buffer.

実際に0.2、0.5、1、2μMのApoBCCP及びHoloBCCPを添加した際に得られた、センサーグラムをそれぞれ図2の(A)と(B)に示した。これより、ビオチンが付加されたHolo-BCCPに関しては、試料添加に伴いレスポンスが大きく増大し、また、試料添加終了後もレスポンスが低下せずに、そのままの強度を維持していることがわかる。このことは、Holo-BCCPはBPLに一旦結合すると、殆ど解離が起こらないことを意味している。これらのセンサーグラムを解析し、解離定数を算出すると、ApoBCCP、Holo BCCPに対して、それぞれ7μM、4nM程度の値が得られた。HoloBCCPに対して算出されたこのナノモーラーオーダーの解離定数は、BPLとの極めて高い結合親和性を表している。 Sensorgrams obtained when 0.2, 0.5, 1, 2 μM of ApoBCCP and HoloBCCP were actually added are shown in FIGS. 2A and 2B, respectively. From this, it can be seen that for Holo-BCCP to which biotin is added, the response greatly increases with the addition of the sample, and the response is not lowered after the addition of the sample, and the strength is maintained as it is. This means that Holo-BCCP hardly dissociates once it binds to BPL. When these sensorgrams were analyzed and the dissociation constants were calculated, values of about 7 μM and 4 nM were obtained for ApoBCCP and Holo BCCP, respectively. This nanomolar order dissociation constant calculated for HoloBCCP represents a very high binding affinity with BPL.

ここでこの解析結果から、BPLは、HoloBCCPだけでなく、ApoBCCPに対しても中程度の結合親和性を有していることがわかる。このことはBPLとHoloBCCP間の極めて高い結合親和性が、BPLとBCCP部位、並びにBPLとビオチン部位との、協同的な結合に基づいていることを意味している。このことは、上述のようにビオチン−アビジン結合を利用したプロテインタグシステムとは、一線を画する点である。アビジンはビオチンのみを認識して結合するため、このアビジンを利用したタグシステムでは、細胞内に元々存在するビオチン化タンパクも全て結合してしまう。その結果として、細胞溶液から目的のビオチンタグを有するタンパクを回収する場合には、必ず余分なタンパクも含んでいることになる。その点本発明のタグシステムでは、BPLのBCCP及びビオチンとの協同的な結合を利用しているため、極めて特異性が高く、原理的に目的タンパクのみを回収できるものと考えられる。 Here, it can be seen from this analysis result that BPL has a moderate binding affinity not only for HoloBCCP but also for ApoBCCP. This means that the very high binding affinity between BPL and HoloBCCP is based on the cooperative binding of BPL and BCCP sites as well as BPL and biotin sites. This is a point different from the protein tag system using the biotin-avidin bond as described above. Since avidin recognizes and binds only biotin, the tag system using this avidin also binds all biotinylated proteins originally present in the cell. As a result, when a protein having a target biotin tag is recovered from a cell solution, an excess protein is always included. In that respect, since the tag system of the present invention utilizes cooperative binding of BPL with BCCP and biotin, it is considered that the tag system is extremely highly specific and in principle only the target protein can be recovered.

[実施例3]センサーチップ上でのビオチン化反応の確認
実際の応用では、固相担体上に固定化されたBPLによって迅速にApoBCCPに対してビオチンの付加反応が起こる必要がある。この点を確認するために、0.1mM
ビオチン、1mM ATP、5mM MgClを含むHBS bufferをランニング緩衝液として使用し、BPL固定化センサーチップに対して、ApoBCCPを添加し、固相担体上でのビオチン化反応について検討した。実際に0.2、0.5、1、2μMのApoBCCPを添加し、ビオチン化反応を行った際に得られたセンサーグラムを図3に示した。これより得られたセンサーグラムは、HoloBCCPを添加した場合(図2の(B))と同様なものとなり、センサーチップ上でも迅速にビオチンの付加反応が起こり、Holo BCCPが生成していることが確認できた。
[Example 3] Confirmation of biotinylation reaction on sensor chip In an actual application, it is necessary to cause a biotin addition reaction to ApoBCCP quickly by BPL immobilized on a solid support. To confirm this point, 0.1 mM
Using HBS buffer containing biotin, 1 mM ATP, and 5 mM MgCl 2 as a running buffer, ApoBCCP was added to a BPL-immobilized sensor chip, and biotinylation reaction on a solid support was examined. FIG. 3 shows sensorgrams obtained when 0.2, 0.5, 1, and 2 μM of ApoBCCP was actually added and biotinylation was performed. The sensorgram obtained from this is the same as when HoloBCCP was added ((B) in FIG. 2), and biotin addition reaction occurred rapidly on the sensor chip, and Holo BCCP was generated. It could be confirmed.

[実施例4]センサーチップ上でのBPLとGST−BCCP融合タンパクの結合
実際の応用例として、目的タンパクとしてグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)を利用し、GSTとBCCPの融合タンパクを調製し、そのBPLとの結合を確認した。GST−BCCP融合タンパクを調製するにあたり、まず大腸菌系での発現プラスミドを構築した。発現プラスミドとしては、GEヘルスケアバイオサイエンス社製のGST発現プラスミド(pGEX-4T-1)を使用し、GSTをコードする遺伝子のC末端側に、BCCPをコードする遺伝子を導入し、GST−BCCP発現プラスミドを構築した。構築した発現プラスミドで、大腸菌を形質転換し培養を行った。その後菌破砕を行い、グルタチオンカラム処理を行うことにより、GST融合タンパクを精製した。なお、BCCPをGSTとの融合タンパクとして構築するに際しては、BCCPのC末側67残基のドメインだけを用い、GSTとの融合タンパクを得た。
[Example 4] Binding of BPL and GST-BCCP fusion protein on sensor chip As an actual application example, using glutathione-S-transferase (GST) as a target protein, a GST-BCCP fusion protein was prepared, The binding with BPL was confirmed. In preparing the GST-BCCP fusion protein, an expression plasmid in E. coli was first constructed. As an expression plasmid, a GST expression plasmid (pGEX-4T-1) manufactured by GE Healthcare Biosciences is used, a gene encoding BCCP is introduced into the C-terminal side of the gene encoding GST, and GST-BCCP is used. An expression plasmid was constructed. Escherichia coli was transformed with the constructed expression plasmid and cultured. Thereafter, the bacteria were disrupted and treated with a glutathione column to purify the GST fusion protein. In constructing BCCP as a fusion protein with GST, only the domain of 67 residues on the C-terminal side of BCCP was used to obtain a fusion protein with GST.

精製したGST融合タンパクに関して、実施例3と同様に、センサーチップ上に固定化したBPLによるビオチン化反応を検討した。その結果、この融合タンパクに関しても、センサーチップ上で迅速にビオチンの付加が起こり、BPLに対する結合が起こることが確認できた。図4に、1μMと2μMのGST融合タンパクを添加し、ビオチン化反応を行った際のセンサーグラムを示した。この図4より、GST−BCCPの添加を終了しても、レスポンスは殆ど低下せずに、GST−BCCPはBPLに結合したままであることがわかる。 With respect to the purified GST fusion protein, the biotinylation reaction with BPL immobilized on the sensor chip was examined in the same manner as in Example 3. As a result, it was confirmed that biotin was rapidly added to the fusion protein on the sensor chip, and binding to BPL occurred. FIG. 4 shows a sensorgram when biotinylation reaction was performed by adding 1 μM and 2 μM GST fusion protein. From FIG. 4, it can be seen that even when the addition of GST-BCCP is completed, the response is hardly lowered and GST-BCCP remains bound to BPL.

[実施例5]BPL−BCCP間の結合の温度依存性
BPL−BCCP間の結合が、温度上昇に伴い解離することを、酵素反応活性を測定することにより確認した。具体的には、様々な温度条件で反応生成物量の経時変化を追跡した。その結果を図5に示した。図5より、低温では、使用した酵素量分だけ反応生成物が生じた後、それ以降は殆ど生成物量は増大しないが、反応温度の上昇に伴い、時間と共に反応生成物量が増大していくのがわかる。このことは、低温では、BPLと生成物であるHolo BCCPが安定な複合体を形成するため、1サイクル目で反応が停止するが、反応温度を上昇させると、複合体が解離し、反応がターンオーバーするようになることを示している。つまり、BPLとHoloBCCP間の結合が、温度上昇により解離することを意味している。
[Example 5] Temperature dependence of binding between BPL and BCCP It was confirmed by measuring enzyme reaction activity that the binding between BPL and BCCP was dissociated as the temperature increased. Specifically, the change over time in the amount of reaction product was followed under various temperature conditions. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 5, at a low temperature, a reaction product is generated by the amount of the enzyme used, and thereafter the product amount hardly increases. However, as the reaction temperature rises, the reaction product amount increases with time. I understand. This means that at low temperatures, BPL and the product Holo BCCP form a stable complex, so the reaction stops in the first cycle, but when the reaction temperature is raised, the complex dissociates and the reaction Indicates that it will turn over. In other words, it means that the bond between BPL and HoloBCCP is dissociated as the temperature rises.

本発明は、タンパク等の分離、精製、同定、検出、並びにタンパク間相互作用の解析などの分野で、広く利用することができる。 The present invention can be widely used in fields such as protein separation, purification, identification, detection, and analysis of protein-protein interactions.

ビオチン化酵素BPLとその基質であるBCCP間の結合を、表面プラズモン共鳴(SPR)法により測定するときの説明図である。It is explanatory drawing when the coupling | bonding between biotinylation enzyme BPL and its substrate BCCP is measured by the surface plasmon resonance (SPR) method. ApoBCCP及びHoloBCCPを添加した際に得られた、センサーグラムを示す図である。It is a figure which shows the sensorgram obtained when ApoBCCP and HoloBCCP were added. ApoBCCPのセンサーチップ上でのビオチン化反応で得られた、センサーグラムを示す図である。It is a figure which shows the sensorgram obtained by the biotinylation reaction on the sensor chip | tip of ApoBCCP. GST−BCCP融合タンパクのセンサーチップ上でのビオチン化反応で得られた、センサーグラムを示す図である。It is a figure which shows the sensorgram obtained by the biotinylation reaction on the sensor chip | tip of GST-BCCP fusion protein. BPL−BCCP間の結合が、温度上昇に伴い解離する様子を示す図である。It is a figure which shows a mode that the coupling | bonding between BPL-BCCP dissociates with a temperature rise.

Claims (5)

スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)由来のビオチン固定化酵素(A)と、該ビオチン固定化酵素の触媒作用によってビオチン化された、スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)由来のビオチン担持タンパクと目的タンパク質との融合タンパク(B)とから複合体を形成させ、又は、前記ビオチン固定化酵素(A)と、前記融合タンパク(B)と、目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)とから複合体を形成させ、該複合体として、前記目的タンパク、又は、前記目的タンパクと前記目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)を分離・検出することを特徴とするタンパク等の分離・検出方法。 Fusion of biotin-immobilized enzyme (A) derived from Sulfolobus tokodaii with biotin-carrying protein derived from Sulfolobus tokodaii and biotinylated by the biotin-immobilized enzyme and the target protein A complex is formed from the protein (B), or a complex is formed from the biotin-immobilized enzyme (A), the fusion protein (B), and a substance (C) having binding affinity for the target protein. And separating and detecting the target protein or the target protein and the substance (C) having binding affinity for the target protein as the complex. ビオチン固定化酵素(A)と融合タンパク(B)とからなる複合体を加温して、ビオチン固定化酵素(A)と融合タンパク(B)を解離させ、該融合タンパク(B)として目的タンパクを分離・検出することを特徴とする請求項1項記載のタンパク等の分離・検出方法。 The complex consisting of biotin-immobilized enzyme (A) and fusion protein (B) is heated to dissociate biotin-immobilized enzyme (A) and fusion protein (B), and the target protein is used as the fusion protein (B). The method for separating / detecting a protein or the like according to claim 1, wherein the protein is separated / detected. ビオチン固定化酵素(A)と融合タンパク(B)と目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)とからなる複合体を加温して、ビオチン固定化酵素(A)から、融合タンパク(B)と目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)を解離させ、該融合タンパク(B)に含まれる目的タンパクと、目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)を分離・検出することを特徴とする請求項1項記載のタンパク等の分離・検出方法。 A complex composed of a biotin-immobilized enzyme (A), a fusion protein (B), and a substance (C) having a binding affinity with the target protein is heated, and the biotin-immobilized enzyme (A) is used to convert the fusion protein (B ) And the substance (C) having binding affinity with the target protein, and separating and detecting the target protein contained in the fusion protein (B) and the substance (C) having binding affinity with the target protein. The method for separating and detecting a protein or the like according to claim 1. 目的タンパク質が、ビオチン担持タンパクの活性領域と融合した融合タンパクを形成していることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項記載のタンパク等の分離・検出方法。 The method for separating and detecting a protein or the like according to any one of claims 1 to 3, wherein the target protein forms a fusion protein fused with an active region of a biotin-carrying protein. ビオチン固定化酵素(A)として、固相担体に固定化されたものを用いることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項記載のタンパク等の分離・検出方法。


The method for separating and detecting a protein or the like according to any one of claims 1 to 4, wherein the biotin-immobilized enzyme (A) is immobilized on a solid phase carrier.


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