JP2008237064A - 細胞観察装置および細胞観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】小型で通常のインキュベータ内に入れられ、培地の大部分を同時に観察できる細胞観察装置および細胞観察方法を提供する。
【解決手段】インキュベータ１０内に設置された細胞培養用の容器４０の下には細胞観察装置の画像観察部２０が置かれている。画像観察部２０は、複数のマイクロレンズが配列されたマイクロレンズアレイにより受光素子上に複数の物体縮小像を結像する複眼画像入力部を有しており、容器４０の下面の５０％以上の画像を複眼画像入力部が取り込んでいる。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞観察装置および細胞観察方法に関し、特にインキュベータ内での細胞観察装置および細胞観察方法に関するものである。

近年、ヒト細胞をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養し、培養した組織を患者に適用する技術が数多く報告されている。特に、ヒト皮膚組織については、欧米において商品化レベルにまで達している。また、幹細胞を増殖させて様々な医療用途に用いることに関しても、これらの培養組織は利用されている。このような細胞の多くは、接着依存性細胞であって、培養容器の底面等に貼り付いて二次元的に増殖していくが、三次元的な増殖は困難であるため、所定量増殖したら底面積がより広い培養容器に変更してさらに増殖させる必要がある。

上記のように培養容器を変更する前提として、細胞の増殖の程度を定期的に観察する必要がある。これまで、生細胞を観察するために様々な試みがなされてきた。光学顕微鏡を用いた細胞の観察は、古くから用いられて来た簡便な観察手法であり、現在最も広く普及している。この場合、培養装置（インキュベータ）を併せて使用し、観察時以外は培養装置内に細胞を保存することで、環境が細胞に与えるダメージを最小限に抑えるようにする。けれども、光学顕微鏡と培養装置とを組み合わせた一般的な観察系では、培養装置への出し入れの際、環境変動により細胞に大きなダメージを与えることが知られている。また、対象を観察の度に顕微鏡に着脱するため、複数回の観察に渡って正確な観察位置を再現することは困難である。すなわち、観察した細胞を次回の観察時には見失ってしまい、観察対象の同一性を保つのが困難であった。観察毎に対象とする細胞が異なる可能性が高く、得られるのは統計的な情報のみである。

このような問題を解決するため、特許文献１に開示されている装置は、培養装置への出し入れの手間を省き、環境変動による細胞へのダメージを回避するための構成を開示している。この構成では、細胞を培養しながら育成状態をチェックし、必要に応じて培養装置内で観察できるようになっている。

また、特許文献２には、細胞を培養する培養手段と、赤外光線によって細胞を撮像する赤外光撮像手段を少なくとも含み前記培養手段に収容されている細胞を撮像する撮像手段と、該撮像手段で撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、異なる時点で撮像された画像の前記細胞画像データから認識された異なる時点の細胞同士の同一性を前記細胞パラメータに基づいて判別する細胞追跡手段と、を備えている細胞観察装置が開示されている。
特表２００１−５００７４４号公報 特開２００６−２３８８０２号公報 特開２００１−６１１０９号公報

しかしながら、上記２つの特許文献に開示されている装置は特殊な装置であって、通常の市販のインキュベータに入れることはできず、特殊なインキュベータを利用しなければならないという問題があった。特に、従来の撮像手段は透過光により観察する位相差顕微鏡が用いられており、この撮像手段が大型であると共に一度に観察できる範囲が狭く、大型培養容器の全体を同時に観察することができず、細胞培養には不向きの観察装置であった。

本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、小型で通常のインキュベータ内に入れられ、培地の大部分を同時に観察できる細胞観察装置および細胞観察方法を提供することにある。

上記の課題を解決するため、本発明の細胞観察装置は、インキュベータ中に一部が設置され、細胞が培養され透明な下面を有する容器の下に設置される画像観察部と、照明部とをインキュベータ中に備え、前記画像観察部は、複数のマイクロレンズが配列されたマイクロレンズアレイにより、受光素子上に複数の物体縮小像が結像される複眼画像入力部を有しており、前記複数の物体縮小像の全体は、前記容器の下面の５０％以上の画像を含んでいる構成とした。ここでマイクロレンズとは、直径が２ｍｍ以下のレンズのことである。また、複数の物体縮小像の全体が容器の下面の５０％以上の画像を含んでいるというのは、個々の物体縮小像を組み合わせて容器の下面の画像を再構成したときに下面の５０％以上が全て画像として現れることである。

このような構成により、画像観察部の厚みを薄くでき、焦点距離も小さくできるので、市販の容量の小さいインキュベータの中に入れられると共に培地の大部分を同時に観察することができる細胞観察装置となる。

前記複眼画像入力部は複数存しており、前記容器の下面の５０％以上の画像は分割されて、各分割画像は各前記複眼画像入力部にそれぞれ結像している構成であってもよい。

前記照明部は、前記容器の側方から容器に光を照射する構成であってもよい。

前記容器の上面を構成する上面部材の内側の面には、反射防止処理が施されていてもよい。

本発明の細胞観察方法は、インキュベータ中に設置された細胞が培養され透明な下面を有する容器中での細胞の状況を観察する細胞観察方法であって、上記の細胞観察装置をインキュベータ内の容器の下方に設置する工程と、細胞の培養状況を前記細胞観察装置により前記インキュベータ内で観察する工程とを含む。

本発明では、複数のマイクロレンズが配列された複眼画像入力部を有しているので、画像観察部の厚みを小さくできると共に焦点距離も小さくでき、さらに容器の下面の５０％以上を同時に観察できる。

以下、本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。以下の図面においては、説明の簡潔化のため、実質的に同一の機能を有する構成要素を同一の参照符号で示す。

（実施形態１）
図１は、インキュベータ（培養装置）１０内に設置された実施形態１の細胞観察装置を模式的に示した図である。図は内部を示しており、実際には扉が存していて、細胞の培養中は密閉されている。インキュベータ１０内には細胞を培養する容器４０が置かれる棚１２があり、その下に細胞観察装置の画像観察部２０が置かれている。

ヒトの組織の細胞や幹細胞などを培養する場合は、人体内部と同じ環境にする必要があり、インキュベータ１０内は温度が３７℃、湿度９５ＲＨ％以上、二酸化炭素濃度５％に保たれる。二酸化炭素濃度を５％に保つために、二酸化炭素の入ったガスボンベ７０がインキュベータ１０の外に置かれ、インキュベータ１０内に管７１を通して二酸化炭素を供給している。細胞を培養する容器４０は図２に示すように、将棋の駒のような五角形の形状を有しており、内部の培養状態が観察できるように下面４２と側面は透明である。一方上面４１を構成する上面部材の内側面には反射防止のための黒のつや消し塗料が塗布されている。容器４０はスクリューキャップ４３で封じられているが、培養液や種細胞を入れるとき、あるいは内容物を取り出すときには、スクリューキャップ４３は開けられる。

棚１２は細胞の観察を邪魔しないように透明であるか、あるいは枠のみで容器４０を支える形態であることが好ましい。

画像観察部２０は接続線６１によってインキュベータ１０の外に置かれた画像処理部６０に繋がれている。画像処理部６０は画像観察部２０から受け取った画像データを処理し、分析する。

また、インキュベータ１０内には照明部５０，５０が容器４０の側方に設置されている。照明部５０，５０は白色ＬＥＤを光源として用いている。詳しくは、容器４０の側面に沿って複数の白色ＬＥＤチップを並べて光源としている。照明部５０，５０を容器４０の側方に置くことにより、容器４０の下面からの画像観察部２０への反射光は無くなり、細胞の観察を行いやすい。また、容器４０の上面の内側面は反射防止が施されているので、上面からの画像観察部２０への反射光も無くなり、細胞の観察をより行いやすい。

本実施形態の細胞観察装置は、画像観察部２０、照明部５０，５０、画像処理部６０を備えており、照明部５０，５０が発した光が容器４０の下面に付着している細胞コロニーに当たって乱反射され、その反射光を画像観察部２０の受光素子によって観察する。従来の細胞観察装置は透過光を利用して位相差顕微鏡によって細胞を観察していたが、本実施形態では位相差法式を用いず、反射光をそのまま観察している。

本実施形態の画像観察部２０は、図３に示すように、複数のマイクロレンズ１ａが配列されたマイクロレンズアレイ１と、このマイクロレンズアレイ１の下に設けられた隔壁層２と、隔壁層２の下に設けられた受光素子３を備えた複眼画像入力部３０を有している。この複眼画像入力部３０の構造は特許文献３に示されている構造と同じである。なお、図ではマイクロレンズアレイ１と隔壁層２と受光素子３とを離間させて描いているが、これは説明しやすいようにするためであり、実際にはこれらは重ねられて配置されている。隔壁層２は格子状の複数の隔壁２ａの集合体であり、受光素子３は複数の受光セル３ａの集合体である。

一つのマイクロレンズ１ａは一つの隔壁２ａに対応しており、それらに対して複数の受光セル３ａが対応している。これらが信号処理単位Ｕを構成している。図では破線による角柱で信号処理単位Ｕを示している。隔壁２ａは対応するマイクロレンズ１ａの隣のマイクロレンズからの光を遮るはたらきをしており、光信号の混信を防いでいる。そして、受光素子３の上に画像観察部２０の上にある物体の複数の縮小像が結像する。

本実施形態ではマイクロレンズ１ａを用いているため、複眼画像入力部３０自体の厚みを通常の撮像装置よりも小さくすることができる。また、焦点距離も小さくできるため対象物体との距離を通常の撮像装置よりも小さくすることができる。このため、インキュベータ内の狭い空間に画像観察部２０を設置することができる。また、構造が簡単であって、従来よりも高精細の画像データを取り出すことができる。そして、面積の大きい対象物を、複眼画像入力部３０を移動させることなく対象物の５０％以上を同時に観察することができる。

市販のインキュベータ１０は容量が数十Ｌのものが多く、内部の空間の高さも５０〜６０ｃｍ程度であって、既に述べたとおり市販の位相差顕微鏡は内部に入れられない。しかしながら、本実施形態の画像観察部２０は数ｍｍ〜数ｃｍの高さで焦点距離も数ｍｍ〜数十ｃｍとすることができるので、容器４０をインキュベータ１０内に入れたまま細胞の観察が行える。これにより、容器４０をインキュベータ１０外に出すことによる細胞培養への悪影響を避けることができる。なお、実際の装置の例としては、高さは５ｍｍ（ケースを含めて約１ｃｍ）、焦点距離は５ｃｍである。

次に細胞の培養状況を観察する方法について説明する。

まず細胞観察装置の画像観察部２０をインキュベータ１０の内部の底面に設置する。そして接続線６１により画像処理部６０と接続する。

それから、画像観察部２０の上方３〜４ｃｍのところに棚１２を置き、その上に培養液と種細胞を入れた容器４０を置く。また、容器４０の両側方のインキュベータ内壁に照明部５０，５０を設置する。

次に、インキュベータ１０の扉を閉めて密閉し、温度、湿度、二酸化炭素濃度を培養用の条件に設定し、細胞の培養を開始する。

それから所定の時間毎に、照明部５０，５０に電流を供給して容器４０内を照らし、画像観察部２０によって容器４０の下面４２に接着して増殖しながら拡がっていく細胞コロニーの画像データを採取し、画像処理部６０に送る。各受光セル３ａから得られる画像データは演算により、例えば図６に示すような容器４０の下面４２における画像となり、細胞コロニー４５，４５，４５の数と大きさとから細胞の増殖速度およびより大きな培養容器への移し替え予定日を画像処理部６０が演算により算出する。

本実施形態では、隣り合う信号処理単位Ｕに結像する縮小画像に重なりがあれば、三次元画像を演算して取り出すこともできる。

（実施形態２）
実施形態２は、実施形態１とは複眼画像入力部が異なっており、他の点は実施形態１と同じであるので、複眼画像入力部について説明する。

図４に示すように、本実施形態の複眼画像入力部３１は、基板３２の上に九個の分割複眼画像入力部３３，３３，…を有している構成となっている。各分割複眼画像入力部３３，３３，…は、それぞれ９つの信号処理単位Ｕを有している。そして、分割複眼画像入力部３３，３３，…は、容器４０の下面４２の形状に沿うように配置されて、下面４２の５０％以上の画像を観察できるようにしている。本実施形態では９０％以上の画像を観察できる。なお、各分割複眼画像入力部３３，３３，…は、容器４０の下面４２の分割された画像をそれぞれ受光素子上に結像させている。

分割複眼画像入力部３３の構成は、図５に示すようにイメージセンサ（受光素子）３８の上に隔壁層３７が載せられ、その上にマイクロレンズアレイ３６が載せられ、その上には絞り３５が載せられている。そして絞り３５の上にスペーサ３４が載せられ、重ねられたこれらは枠により固定されている。なお、絞り３５は板に開けられたマイクロレンズよりも小径の穴であり、スペーサ３４は細胞観察の妨げにならないように中央部に大きな開口を有している。

本実施形態では、小型の受光素子を複数使用して複数の分割複眼画像入力部３３を構成させているので、安価に作製することができる。また、解像度も上がる。その他、実施形態１と同様の効果を奏する。

（その他の実施形態）
上記の実施形態は例示に過ぎず、本発明はこれらの例に限定されない。例えば実施形態２において分割複眼画像入力部３３の数は９より多くても良いし少なくてもよい。また、一つの分割複眼画像入力部３３を構成する信号処理単位Ｕの数も９よりも多くてもよいし、少なくても良い。

容器の形状や大きさも特に限定されない。また、複眼画像入力部、分割複眼画像入力部にはフィルターを付けてもよい。容器上面の反射防止処理はサンドブラスト加工や素材そのものを無反射のものに換えてもよい。

以上説明したように、本発明に係る細胞観察装置は、画像観察部が薄くインキュベータの中に設置できるので、幹細胞の培養観察用の装置等として有用である。

インキュベータ内に設置された実施形態１に係る細胞観察装置の模式図 細胞を培養する容器の斜視図 複眼画像入力部の模式的な分解斜視図 実施形態２に係る複眼画像入力部の平面図 分割複眼画像入力部の分解斜視図 培養された細胞のコロニーを示す図

符号の説明

１ マイクロレンズアレイ
１ａ マイクロレンズ
１０ インキュベータ
２０ 画像観察部
３０，３１ 複眼画像入力部
４０ 容器
４１ 容器上面
４２ 容器下面
５０ 照明部
６０ 画像処理部
６１ 接続線

Claims (5)

1. インキュベータ中に一部が設置される細胞観察装置であって、
   細胞が培養され透明な下面を有する容器の下に設置される画像観察部と、照明部とをインキュベータ中に備え、
   前記画像観察部は、複数のマイクロレンズが配列されたマイクロレンズアレイにより、受光素子上に複数の物体縮小像が結像される複眼画像入力部を有しており、
   前記複数の物体縮小像の全体は、前記容器の下面の５０％以上の画像を含んでいる、細胞観察装置。
2. 前記複眼画像入力部は複数存しており、
   前記容器の下面の５０％以上の画像は分割されて、各分割画像は各前記複眼画像入力部にそれぞれ結像している、請求項１に記載されている細胞観察装置。
3. 前記照明部は、前記容器の側方から容器に光を照射する、請求項１または２に記載されている細胞観察装置。
4. 前記容器の上面を構成する上面部材の内側の面には、反射防止処理が施されている、請求項１から３のいずれか一つに記載されている細胞観察装置。
5. インキュベータ中に設置された細胞が培養され透明な下面を有する容器中での細胞の状況を観察する細胞観察方法であって、
   請求項１から４のいずれか一つに記載されている細胞観察装置をインキュベータ内の容器の下方に設置する工程と、
   細胞の培養状況を前記細胞観察装置により前記インキュベータ内で観察する工程と
   を含む、細胞観察方法。

Images