JP2008230977A - Anticancer agent containing nitidine as component, and sensitivity enhancer of the anticancer agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ニチジンを成分とするABCA1発現低下癌細胞に対する抗癌剤、および該抗癌剤の感受性増強剤に関する。 The present invention relates to an anticancer agent against ABCA1 expression-reduced cancer cells containing nitidine as a component, and a sensitivity enhancer of the anticancer agent.
がんは日本人の死因の第一位である。そのうち肺がんは男性では一位、女性では三位となるなど、致死率が高く難治性のがんとして新たな治療法・治療薬が求められている。 Cancer is the leading cause of death among Japanese. Among them, lung cancer ranks first in men and third in women, and there is a need for new treatments and drugs as refractory cancers with a high fatality rate.
ニチジンにおいては、現在臨床で用いられているイリノテカンなどと同様のトポイソメラーゼI阻害活性が報告されている。しかしその活性は非常に小さく、抗癌剤への応用に関する報告は認められていない。一方で、代表的なトポI阻害剤であるCPTとジヒドロニチジンの抗腫瘍活性を細胞レベルで比較した結果、トポI阻害活性の強さだけでは説明できない細胞毒性（抗腫瘍活性）様式の存在が示されている（特許文献１参照）。 Nitidine has reported topoisomerase I inhibitory activity similar to irinotecan and the like currently used in clinical practice. However, its activity is very small, and no report on application to anticancer agents has been found. On the other hand, as a result of comparing the anti-tumor activity of CPT and dihydronitidine, which are typical topo I inhibitors, at the cellular level, there is a cytotoxicity (anti-tumor activity) mode that cannot be explained only by the strength of topo I inhibitory activity. Is shown (see Patent Document 1).
ABC(ATP-Binding Cassette)タンパク質は、200アミノ酸に渡って配列がよく保存されたATP結合ドメインを1機能分子あたり2つもつ膜タンパク質ファミリーであり、バクテリアからヒトまで生物界に幅広く存在する。それぞれの生物で重要な生理機能を果たしている。ヒトの染色体には49のABCタンパク質遺伝子がコードされており、それらの異常によってさまざまな疾病が引き起こされることから、ABCタンパク質が生理的に重要であることがわかる。また、バクテリアからヒトまであらゆる生物において、それぞれ数十から100以上のABCタンパク質が働いている。遺伝子ファミリーとして最も大きなもののひとつであり、生物界全体にとって重要な役割を果たしている。ABCタンパク質のひとつであるABCA1は高密度リポタンパク質(HDL)の形成に必須であり、その異常はタンジール病を引き起こす。 ABC (ATP-Binding Cassette) proteins are a family of membrane proteins that have two ATP-binding domains per functional molecule that have well-conserved sequences over 200 amino acids, and exist widely in the biological world from bacteria to humans. It plays important physiological functions in each organism. 49 ABC protein genes are encoded in human chromosomes, and these abnormalities cause various diseases, indicating that ABC proteins are physiologically important. In addition, dozens to 100 or more ABC proteins work in all living things from bacteria to humans. It is one of the largest gene families and plays an important role in the entire biological world. ABCA1, an ABC protein, is essential for the formation of high-density lipoprotein (HDL), and its abnormality causes Tangier disease.
ABCA1タンパク質に関しては、以下の文献に記載された種々の知見が知られている（非特許文献１〜１０参照）。
しかしながら、ABCA1とニチジンとの関連性については、これまでのところ知られていない。
However, the relationship between ABCA1 and nitidine has not been known so far.
これまでのところ、ニチジンの抗癌活性の詳細なメカニズムや、その対象となる癌細胞の有する特徴に関して不明な点が多い。本発明は、ニチジンの抗癌活性の対象となる癌細胞の特徴を新たに見出し、得られた知見に基いて、ニチジンを成分とする細胞選択的な抗癌剤の提供を課題とする。並びに、該抗癌剤の感受性を増強させる薬剤の提供、加えて、該抗癌剤の感受性の検査方法の提供を課題とする。 So far, there are many unclear points regarding the detailed mechanism of anticancer activity of nitidine and the characteristics of the target cancer cells. An object of the present invention is to newly find the characteristics of cancer cells that are the target of anticancer activity of nitidine, and to provide a cell-selective anticancer agent containing nitidine as a component based on the obtained knowledge. Another object of the present invention is to provide a drug that enhances the sensitivity of the anticancer drug, and in addition, to provide a method for testing the sensitivity of the anticancer drug.
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。本発明者は、各種癌細胞株を用いて、ニチジンによる細胞毒性評価試験を行った。その結果、ABCA1低発現細胞株において顕著な細胞障害活性が見られた。即ち、ニチジンの細胞障害活性とABCA1発現量との間で相関があることが初めて見出された。
また、リアルタイムPCRの結果から、ニチジンに対する感受性の低い細胞は、ABCA1遺伝子の発現量が増大していることが明らかとなった。
さらに、ニチジンに対して感受性の低い細胞を、ABCA1遺伝子の発現阻害剤によって処理することにより、発現阻害剤の濃度上昇に従ってニチジンに対する感受性（細胞毒性）が増加することがわかった。
The present inventor has intensively studied to solve the above problems. The present inventor conducted a cytotoxicity evaluation test with nitidine using various cancer cell lines. As a result, significant cytotoxic activity was observed in the ABCA1 low-expressing cell line. That is, it was found for the first time that there is a correlation between the cytotoxic activity of nitidine and the expression level of ABCA1.
From the results of real-time PCR, it was found that the expression level of ABCA1 gene was increased in cells with low sensitivity to nitidine.
Furthermore, it was found that the sensitivity (cytotoxicity) to nitidine increases as the concentration of the expression inhibitor is increased by treating cells with low sensitivity to nitidine with the expression inhibitor of ABCA1 gene.
本発明者が行った実験により、ニチジンがABCA1発現低下細胞に対して選択的な抗癌活性を示すことが明らかとなった。従って、ニチジンを有効成分とする薬剤は、ABCA1発現低下細胞選択的な抗癌剤として有用であることが示された。さらに、ABCA1発現阻害剤は、前記抗癌剤の感受性を増強させる薬剤として有用であり、例えば、前記抗癌剤と組み合わせて組成物とすることにより、新規な抗癌剤として用いることができる。
また、本発明者によって見出された新たな知見に基いて、ニチジンを成分とする抗癌剤に対して感受性か否かの検査を行うことができる。即ち、被検者由来の試料について、ABCA1の発現状態を測定することにより、ニチジンを成分とする抗癌剤が有効か否かについて遺伝子診断を行うことが可能である。
Experiments conducted by the inventor have revealed that nitidine exhibits selective anticancer activity against ABCA1-expressing cells. Therefore, it has been shown that a drug containing nitidine as an active ingredient is useful as an anti-cancer agent selective for cells with reduced ABCA1 expression. Furthermore, the ABCA1 expression inhibitor is useful as a drug that enhances the sensitivity of the anticancer agent. For example, the ABCA1 expression inhibitor can be used as a novel anticancer agent by combining it with the anticancer agent.
Moreover, based on the new knowledge discovered by this inventor, it can test | inspect whether it is sensitive with respect to the anticancer agent which uses nitidine as a component. That is, by measuring the expression state of ABCA1 in a sample derived from a subject, it is possible to perform genetic diagnosis as to whether or not an anticancer agent containing nitidine as a component is effective.
本発明は、ニチジンを有効成分とするABCA1発現低下細胞に対する抗癌剤、および、該抗癌剤の感受性を増強させる薬剤、並びに、該抗癌剤の感受性の検査方法に関し、より具体的には、
〔１〕 以下の一般式(I)もしくは(II)で表される化合物、またはその塩を有効成分とする、ABCA1発現低下癌細胞に対する抗癌剤、
〔３〕 以下の一般式(I)もしくは(II)で表される化合物またはその塩、およびABCA1遺伝子発現阻害物質を組み合わせて成る組成物、
〔５〕 以下の一般式(I)もしくは(II)で表される化合物またはその塩、およびABCA1遺伝子発現阻害物質を構成成分として含む、癌治療用キット、
〔７〕 前記抗癌剤が、以下の一般式(I)もしくは(II)で表される化合物またはその塩である、〔６〕に記載の抗癌剤感受性増強剤、
（ａ）被検者由来の試料について、ABCA1遺伝子の発現量を測定する工程
（ｂ）対照と比較して、前記発現量が低下している場合に、被検者は抗癌剤に感受性であるものと判定する工程
〔９〕 以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、抗癌剤感受性癌細胞の検査方法、
（ａ）被検癌細胞について、ABCA1遺伝子の発現量を測定する工程
（ｂ）対照と比較して、前記発現量が低下している場合に、被検癌細胞は抗癌剤感受性癌細胞であるものと判定する工程
〔１０〕 前記抗癌剤が、以下の一般式(I)もしくは(II)で表される化合物またはその塩である、〔８〕または〔９〕に記載の方法、
〔１２〕 以下の一般式(I)または(II)で表される化合物またはその塩と、ABCA1遺伝子発現阻害物質とを混合する工程を含む、抗癌剤の製造方法、
[1] An anticancer agent against ABCA1 expression-reduced cancer cells, comprising as an active ingredient a compound represented by the following general formula (I) or (II), or a salt thereof:
[3] A composition comprising a combination of a compound represented by the following general formula (I) or (II) or a salt thereof, and an ABCA1 gene expression inhibitor,
[5] A cancer treatment kit comprising as a constituent component a compound represented by the following general formula (I) or (II) or a salt thereof, and an ABCA1 gene expression inhibitor:
[7] The anticancer agent sensitivity enhancer according to [6], wherein the anticancer agent is a compound represented by the following general formula (I) or (II) or a salt thereof:
(A) A step of measuring the expression level of ABCA1 gene for a sample derived from a subject (b) When the expression level is reduced compared to a control, the subject is sensitive to an anticancer agent [9] The method for examining anticancer drug-sensitive cancer cells, comprising the following steps (a) and (b):
(A) Step of measuring the expression level of ABCA1 gene for the test cancer cell (b) When the expression level is lower than that of the control, the test cancer cell is an anticancer drug-sensitive cancer cell [10] The method according to [8] or [9], wherein the anticancer agent is a compound represented by the following general formula (I) or (II) or a salt thereof:
[12] A method for producing an anticancer agent, comprising a step of mixing a compound represented by the following general formula (I) or (II) or a salt thereof and an ABCA1 gene expression inhibitor,
ニチジンの細胞障害性発現と膜上のABCA1タンパク質との関連性を評価した結果、ABCA1発現量の低い細胞ほどニチジンに対する感受性が高く、両者に負の相関が認められた。
本発明によりニチジン輸送への関与が示唆されたABCA1は、これまでのところ、脂質輸送に関連した報告しかみられず、薬剤耐性に関する知見は、本発明者によって初めて見出されたものである。
また、ABCA1の発現量が高く、ニチジンに対する感受性が低い癌細胞は、ABCA1発現阻害剤で処理することにより、ニチジンに対する感受性が増強することが分った。
As a result of evaluating the relationship between the cytotoxic expression of nitidine and the ABCA1 protein on the membrane, cells with lower ABCA1 expression were more sensitive to nitidine and a negative correlation was observed between the two.
ABCA1, which has been suggested to be involved in nitidine transport according to the present invention, has so far only been reported in relation to lipid transport, and the knowledge regarding drug resistance was first discovered by the present inventors.
It was also found that cancer cells with high ABCA1 expression and low sensitivity to nitidine are enhanced in sensitivity to nitidine by treatment with an ABCA1 expression inhibitor.
本発明により、ABCA1発現抑制剤を成分とする、ニチジン抗癌剤に対する感受性増強剤が提供された。該薬剤を抗癌剤と併用することにより、従来抗癌剤の効果が見られない、あるいは効果が弱い癌細胞に対しても、十分な抗癌作用を発揮させることが可能である。 ADVANTAGE OF THE INVENTION By this invention, the sensitivity enhancement agent with respect to the nitidine anticancer agent which uses ABCA1 expression inhibitor as a component was provided. By using this drug in combination with an anticancer agent, it is possible to exert a sufficient anticancer action even against cancer cells that have not been effective or have a weak effect.
また本発明によって、ABCA1遺伝子の発現を指標とするニチジン抗癌剤に対する感受性の検査方法が提供された。該方法により、ニチジンを成分とする抗癌剤の投与対象者を選定することができる。また、被検癌細胞についてABCA1遺伝子の発現を指標とすることにより、ニチジンにより治療効果が期待できるか否かについて検査を行うことができる。即ち、ABCA1の発現量を評価することにより、適切な処方を施すテーラーメード医療を実施することができる。 The present invention also provides a method for testing sensitivity to a nitidine anticancer agent using the expression of ABCA1 gene as an index. By this method, the administration subject of the anticancer agent containing nitidine as a component can be selected. Moreover, it can test | inspect whether a therapeutic effect is expectable by a nitidine by using the expression of ABCA1 gene as a parameter | index about a test cancer cell. In other words, by evaluating the expression level of ABCA1, tailor-made medicine for applying an appropriate prescription can be performed.
本発明は、ニチジンまたはその塩を有効成分とするABCA1発現低下癌細胞に対する抗癌剤に関する。本発明において「ニチジン」は、具体的には、ニチジン(Nitidine; NTD)、またはジヒドロニチジン(Dihydronitidine; DHN)をいう（本明細書においては、これらの化合物をまとめて「ニチジン」と記載する場合あり）。 The present invention relates to an anticancer agent against ABCA1 expression-reduced cancer cells containing nitidine or a salt thereof as an active ingredient. In the present invention, “nitidine” specifically refers to nitidine (Nitidine; NTD) or dihydronitidine (DHN) (in the present specification, these compounds are collectively referred to as “nitidine”). In some cases).
本発明のニチジン(NTD)、またはジヒドロニチジン(DHN)は、それぞれ以下の一般式（I）または(II)で表される化合物である。
ニチジン: (1,3)Benzodioxolo(5,6-c)phenanthridinium, 2,3-dimethoxy-12-methyl-
また、上記ジヒドロニチジン(DHN)の正式名称は以下の通りである。
ジヒドロニチジン: (1,3)Benzodioxolo(5,6-c)phenanthridine, 12,13-dihydro-2,3-
dimethoxy-12-methyl-
The nitidine (NTD) or dihydronitidine (DHN) of the present invention is a compound represented by the following general formula (I) or (II), respectively.
Nitidine: (1,3) Benzodioxolo (5,6-c) phenanthridinium, 2,3-dimethoxy-12-methyl-
The official names of the dihydronitidine (DHN) are as follows.
Dihydronitidine: (1,3) Benzodioxolo (5,6-c) phenanthridine, 12,13-dihydro-2,3-
dimethoxy-12-methyl-
本発明は、上記一般式(I)もしくは(II)で表される化合物、またはその塩を有効成分とするABCA1発現低下癌細胞に対する抗癌剤を提供する。
本発明においてニチジン(NTDまたはDHN)は、植物等の天然物から抽出することができ、また、化学的に合成することも可能である。
植物からのニチジンの抽出は、一般的な手法により実施することが可能である。例えば、植物中に含まれる他の成分と、ニチジンとの有機溶媒に対する親和性の差を利用する方法、溶解度の差を利用する方法、各種樹脂に対する吸着親和力の差を利用する方法等を、単独で、または組み合わせて、あるいは反復して用いることができる。具体的には、イオン交換クロマトグラフィー、非イオン性吸着樹脂を用いたクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、アルミナ、シリカゲル等の吸着剤によるクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の各種液体クロマトグラフィー、あるいは、結晶化、減圧濃縮、凍結乾燥等の手段を、それぞれ単独で、または適宜組み合わせて、もしくは反復して用いることができる。また、植物は抽出効率の観点から、抽出前に予め凍結乾燥したのち粉砕しておくことが好ましい。
The present invention provides an anticancer agent against ABCA1 expression-reduced cancer cells comprising the compound represented by the above general formula (I) or (II) or a salt thereof as an active ingredient.
In the present invention, nitidine (NTD or DHN) can be extracted from natural products such as plants, or can be chemically synthesized.
Extraction of nitidine from plants can be carried out by a general method. For example, a method that uses the difference in affinity for organic solvents with other components contained in the plant and nitidine, a method that uses the difference in solubility, a method that uses the difference in adsorption affinity for various resins, etc. Or in combination or repeatedly. Specifically, ion exchange chromatography, chromatography using a nonionic adsorption resin, gel filtration chromatography, chromatography with an adsorbent such as activated carbon, alumina, silica gel, various liquid chromatography such as high performance liquid chromatography, Alternatively, means such as crystallization, concentration under reduced pressure, and lyophilization can be used alone, in appropriate combination, or repeatedly. From the viewpoint of extraction efficiency, the plant is preferably lyophilized and then pulverized before extraction.
また、ニチジンは、サルカケミカンに特に多く含まれるが、広く他の植物においても存在するアルカロイドであると考えられる。従って、本発明で使用されるニチジンは、ニチジンを含む植物から抽出および精製して得ることができる。抽出に利用される植物としては、特に限定されるものではないが、例えばミカン科の植物を挙げることができ、具体的には、サルカケミカン、温州ミカン、夏ミカン、ハッサク、イヨカン、ダイダイ、スダチ、カボス、ユズ、レモン、ライム、オレンジ、キンカン、カラタチ、ミヤマシキミ、ヘンルーダ、サンショウ等を挙げることができる。 In addition, nitidine is an alkaloid which is contained in a large amount in salka kemicans, but is also widely present in other plants. Therefore, the nitidine used in the present invention can be obtained by extraction and purification from a plant containing nitidine. Although it does not specifically limit as a plant utilized for extraction, For example, a plant of the citrus family can be mentioned, and specifically, it is a salmon mandarin orange, Wenzhou mandarin orange, summer mandarin orange, Hassaku, Iyokan, Daidai, Sudachi, Examples include Kabosu, Yuzu, Lemon, Lime, Orange, Kumquat, Karatachi, Miyakimiki, Hen Ruda, and Salamander.
本発明において「塩」とは、本発明の化合物（一般式（I）もしくは（II）の化合物）と塩を形成し、かつ薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩などがあげられる。通常、本発明において「塩」とは、通常、薬学的に許容される塩を言う。 In the present invention, the “salt” is not particularly limited as long as it forms a salt with the compound of the present invention (compound of general formula (I) or (II)) and is pharmacologically acceptable. Inorganic acid salts, organic acid salts, inorganic base salts, organic base salts, acidic or basic amino acid salts, and the like. In the present invention, “salt” usually refers to a pharmaceutically acceptable salt.
無機酸塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などがあげられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などがあげられる。 Preferable examples of inorganic acid salts include hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate and the like, and preferable examples of organic acid salts include, for example, acetate, succinate and fumarate. Acid salt, maleate salt, tartrate salt, citrate salt, lactate salt, stearate salt, benzoate salt, methanesulfonate salt, p-toluenesulfonate salt and the like.
無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられ、有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン塩などがあげられる。 Preferable examples of the inorganic base salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, aluminum salt and ammonium salt. Preferred examples of organic base salts Examples thereof include diethylamine salt, diethanolamine salt, meglumine salt, N, N′-dibenzylethylenediamine salt and the like.
酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられ、塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などがあげられる。
本発明に係る化合物の単離・精製は、抽出、濃縮、留去、結晶化、ろ過、再結晶、各種クロマトグラフィーなどの通常の化学操作を適用して行うことができる。
Preferable examples of the acidic amino acid salt include aspartate and glutamate, and preferable examples of the basic amino acid salt include arginine salt, lysine salt and ornithine salt.
Isolation and purification of the compound according to the present invention can be performed by applying ordinary chemical operations such as extraction, concentration, distillation, crystallization, filtration, recrystallization, and various chromatography.
本発明においては、化合物の構造式が便宜上一定の異性体を表すことがあるが、本発明には化合物の構造上生ずるすべての幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体等の異性体および異性体混合物を含み、便宜上の式の記載に限定されるものではなく、いずれか一方の異性体でも混合物でもよい。従って、本発明の化合物には、分子内に不斉炭素原子を有し光学活性体およびラセミ体が存在することがありうるが、本発明においては限定されず、いずれもが含まれる。 In the present invention, the structural formula of a compound may represent a certain isomer for convenience, but in the present invention, all geometric isomers resulting from the structure of the compound, optical isomers based on asymmetric carbon, stereoisomers, It includes isomers such as tautomers and isomer mixtures, and is not limited to the description of formulas for convenience, and may be either isomer or a mixture. Therefore, the compound of the present invention may have an asymmetric carbon atom in the molecule, and an optically active substance and a racemate may exist. However, the present invention is not limited and includes both.
また、本発明に係る化合物について得られる種々の異性体（例えば幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、回転異性体、立体異性体、互変異性体等）は、通常の分離手段、例えば再結晶、ジアステレオマー塩法、酵素分割法、種々のクロマトグラフィー（例えば薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、等）を用いることにより精製し、単離することができる。 In addition, various isomers (for example, geometric isomers, optical isomers based on asymmetric carbon, rotational isomers, stereoisomers, tautomers, etc.) obtained for the compounds according to the present invention can be obtained by conventional separation means, For example, it can be purified and isolated by using recrystallization, diastereomeric salt method, enzyme resolution method, and various chromatography (for example, thin layer chromatography, column chromatography, gas chromatography, etc.).
また本明細書において記載された遺伝子名（もしくはタンパク質名）は、広く一般的に知られる名称であることから、当業者であれば該遺伝子の塩基配列（もしくはタンパク質のアミノ酸配列）についての情報をもとに、公共の文献データベースあるいは遺伝子データベース（例えばGenBank等）から適宜取得することができる。
本発明のABCA1遺伝子の塩基配列を配列番号：１に、該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に記載する。また、該遺伝子の配列情報等が取得可能なNCBIのアクセッション番号はNM_005502である。
Moreover, since the gene name (or protein name) described in the present specification is a widely known name, those skilled in the art can obtain information on the base sequence (or protein amino acid sequence) of the gene. Basically, it can be appropriately obtained from public literature databases or gene databases (eg, GenBank).
The base sequence of the ABCA1 gene of the present invention is described in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is described in SEQ ID NO: 2. The NCBI accession number from which the sequence information of the gene can be obtained is NM_005502.
なお、ABCA1遺伝子は、塩基配列中の多型の有無等により、同一の遺伝子であっても複数のアクセッション番号が付与されている場合がある。この「多型」とは、一塩基の置換、欠失、挿入変異からなる一塩基多型（SNPs）に限定されず、連続する数塩基の置換、欠失、挿入変異も含まれる。従って、ABCA1遺伝子の塩基配列としては、必ずしも前記アクセッション番号によって取得される配列あるいは配列番号：１に記載された配列に限定されない。同様に、ABCA1遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列も、配列番号：２に記載されたアミノ酸配列に特に限定されない。 Note that ABCA1 gene may be given the same accession number even if it is the same gene depending on the presence or absence of polymorphism in the base sequence. This “polymorphism” is not limited to single nucleotide polymorphisms (SNPs) consisting of single nucleotide substitutions, deletions and insertion mutations, but also includes substitutions, deletions and insertion mutations of several consecutive bases. Therefore, the base sequence of ABCA1 gene is not necessarily limited to the sequence obtained by the accession number or the sequence described in SEQ ID NO: 1. Similarly, the amino acid sequence of the protein encoded by the ABCA1 gene is not particularly limited to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.
本発明の上記タンパク質は、配列番号：２に記載されたアミノ酸配列に限定されず、該アミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列を含むABCA1遺伝子によってコードされるタンパク質の変異タンパク質もしくはホモログタンパク質であって、ABCA1遺伝子によってコードされるタンパク質（配列番号：２に記載されたタンパク質）と機能的に同等なタンパク質も含まれる。ここで「機能的に同等なタンパク質」とは、ABCA1遺伝子によってコードされるタンパク質における機能（例えば、細胞膜上トランスポーター機能など）と同様の機能を備えたタンパク質である。 The protein of the present invention is not limited to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, and ABCA1 containing an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are added, deleted, substituted, or inserted in the amino acid sequence A protein that is a mutant protein or a homologous protein of a protein encoded by a gene and that is functionally equivalent to a protein encoded by the ABCA1 gene (protein described in SEQ ID NO: 2) is also included. Here, the “functionally equivalent protein” is a protein having a function similar to a function (for example, a transporter function on a cell membrane) in a protein encoded by the ABCA1 gene.
あるいはABCA1遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して、例えば９０%以上、望ましくは９５%以上、更に望ましくは９９%以上の相同性を有するタンパク質を、ABCA1遺伝子によってコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質として示すことができる。
また、本発明のABCA1遺伝子は特に制限されるものではないが、通常、動物由来であり、より好ましくは哺乳動物由来であり、最も好ましくはヒト由来である。
Alternatively, a protein having a homology of, for example, 90% or more, desirably 95% or more, more desirably 99% or more with respect to the amino acid sequence of the protein encoded by the ABCA1 gene is functionally related to the protein encoded by the ABCA1 gene. It can be shown as an equivalent protein.
The ABCA1 gene of the present invention is not particularly limited, but is usually derived from an animal, more preferably derived from a mammal, and most preferably derived from a human.
本発明の抗癌剤は、癌細胞に対して選択的（特異的）に作用し、正常細胞には作用しないことを特徴とする。また、本発明の抗癌剤は、ABCA1の発現が低下した癌細胞（本明細書においては、「ABCA1発現低下癌細胞」と記載する）に対して、効果的に抗癌活性を発揮する特徴を有する。 The anticancer agent of the present invention is characterized in that it acts selectively (specifically) on cancer cells and does not act on normal cells. In addition, the anticancer agent of the present invention has a characteristic of effectively exerting anticancer activity against cancer cells in which the expression of ABCA1 is reduced (in the present specification, described as “ABCA1 expression-reduced cancer cells”). .
本発明において、ABCA1発現低下癌細胞とは、ABCA1遺伝子の発現が通常の細胞（正常細胞もしくは通常の癌細胞など）と比較して低下もしくは抑制された癌細胞、またはABCA1タンパク質の機能が低下もしくは抑制された癌細胞等を指す。本発明のABCA1発現低下癌細胞には、自然に生じた癌細胞に限らず、人工的にABCA1の発現が抑制された癌細胞が含まれる。 In the present invention, ABCA1 expression-reduced cancer cells refer to cancer cells in which the expression of ABCA1 gene is reduced or suppressed compared to normal cells (such as normal cells or normal cancer cells), or the function of ABCA1 protein is reduced or It refers to suppressed cancer cells and the like. The ABCA1 expression-reduced cancer cells of the present invention are not limited to naturally occurring cancer cells, but include cancer cells in which ABCA1 expression is artificially suppressed.
本発明の抗癌剤の対象（標的）となる癌細胞は、ABCA1の発現が低下した癌細胞であれば特に制限されない。ABCA1発現低下癌細胞としては、例えば、肺胞上皮癌細胞（肺腺癌）等を例示することができる。
なお、任意の癌細胞について、本発明の抗癌剤の標的となり得る癌細胞であるか否かは、例えば、ABCA1遺伝子の発現を測定することによって、簡便に評価することができる。
The cancer cells that are targets (targets) of the anticancer agent of the present invention are not particularly limited as long as ABCA1 expression is reduced. Examples of ABCA1-reduced cancer cells include alveolar epithelial cancer cells (lung adenocarcinoma).
Whether any cancer cell is a cancer cell that can be a target of the anticancer agent of the present invention can be easily evaluated, for example, by measuring expression of ABCA1 gene.
また、本発明の抗癌剤は、正常細胞に対しては作用せず、上述の癌細胞に対して選択的に作用する特徴を有する。また、後述するように、ABCA1発現阻害物質と組み合わせることにより、従来、ニチジン抗癌剤が有効でない癌細胞に対しても、抗癌作用を発揮させることが可能である。
本発明における「抗癌剤」は、「抗腫瘍剤」、「抗腫瘍薬剤」、「抗腫瘍医薬組成物」、「癌細胞増殖抑制剤」、「腫瘍増殖抑制剤」、「癌治療剤」、あるいは「制癌剤」等と表現することも可能である。また、本発明の薬剤は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。
Further, the anticancer agent of the present invention has a feature that it does not act on normal cells but acts selectively on the above-mentioned cancer cells. In addition, as described later, by combining with an ABCA1 expression inhibitor, it is possible to exert an anticancer effect even against cancer cells for which a nitidine anticancer agent has not been effective.
The “anticancer agent” in the present invention is “antitumor agent”, “antitumor agent”, “antitumor pharmaceutical composition”, “cancer cell growth inhibitor”, “tumor growth inhibitor”, “cancer therapeutic agent”, or It can also be expressed as “cancer drug”. The drug of the present invention can also be expressed as “medicine”, “pharmaceutical composition”, “therapeutic drug”, and the like.
なお、本発明における「治療」には、癌の発生や進行を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。また、癌細胞（組織）に対して、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果もしくは改善効果を有する場合であってもよい。
本発明の抗癌剤の対象となる「癌」は、通常、悪性腫瘍とも呼ばれ、また、癌病変だけでなく、前癌病変も含まれる。また、腫瘍、ポリープ（例えば、大腸ポリープ）等も本発明の抗癌剤の対象となり得る。
The “treatment” in the present invention includes a preventive effect that can suppress the occurrence and progression of cancer in advance. Moreover, it is not necessarily limited to having a complete therapeutic effect on cancer cells (tissues), and may have a partial effect or an improving effect.
The “cancer” that is the subject of the anticancer agent of the present invention is usually called a malignant tumor, and includes not only cancer lesions but also precancerous lesions. Tumors, polyps (for example, large intestine polyps) and the like can also be targets of the anticancer agent of the present invention.
また本発明は、上記一般式（I）もしくは（II）で表される化合物またはその塩、およびABCA1遺伝子発現阻害物質を組み合わせて成る組成物（以下、単に「組成物」と記載する場合あり）を提供する。
本発明の組成物は、少なくとも、上記一般式（I）もしくは（II）で表される化合物またはその塩、およびABCA1遺伝子発現阻害物質が含まれていればよく、これら以外の物質が含まれていてもよい。本発明の組成物において、上記の化合物の組成割合（組成率）等は特に制限されず、上記のそれぞれの化合物が有効な程度に含有されていればよい。
The present invention also relates to a composition comprising a combination of the compound represented by the above general formula (I) or (II) or a salt thereof, and an ABCA1 gene expression inhibitor (hereinafter sometimes simply referred to as “composition”). I will provide a.
The composition of the present invention only needs to contain at least the compound represented by the above general formula (I) or (II) or a salt thereof, and an ABCA1 gene expression inhibitor, and contains other substances. May be. In the composition of the present invention, the composition ratio (composition ratio) and the like of the above compound are not particularly limited as long as each of the above compounds is contained in an effective degree.
本発明の組成物は、抗癌剤として有用である。本発明は、本発明の組成物を含有する抗癌剤に関する。該抗癌剤は、特に、従来、ニチジンの抗癌作用が見られない癌細胞（例えば、ABCA1の発現が正常な細胞）に対しても、効果的な抗癌作用が期待できる。
また本発明は、上記一般式（I）もしくは（II）で表される化合物またはその塩、およびABCA1遺伝子発現阻害物質が、それぞれ別々の構成要素として成るキットを提供する。本発明の好ましい態様としては、少なくとも、一般式（I）もしくは（II）で表される化合物またはその塩、およびABCA1遺伝子発現阻害物質を構成成分として含む、癌治療用キットである。
The composition of the present invention is useful as an anticancer agent. The present invention relates to an anticancer agent containing the composition of the present invention. In particular, the anticancer agent can be expected to have an effective anticancer effect particularly on cancer cells in which the anticancer effect of nitidine has not been observed (for example, cells in which ABCA1 expression is normal).
The present invention also provides a kit comprising a compound represented by the above general formula (I) or (II) or a salt thereof, and an ABCA1 gene expression inhibitor as separate components. A preferred embodiment of the present invention is a kit for treating cancer comprising at least a compound represented by the general formula (I) or (II) or a salt thereof and an ABCA1 gene expression inhibitor as constituents.
また、本発明の抗癌剤において、ABCA1発現阻害物質は、ABCA1遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能（活性）を阻害する物質であれば特に制限されない。一例を示せば、
（ａ）ABCA1遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）ABCA1遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）ABCA1遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
（ｄ）ABCA1遺伝子によってコードされるタンパク質と結合する抗体
からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
また、ABCA1を形質膜上で不活性化させる物質（例えば、HDLを低下させる薬剤プロブコール等）は、本発明のABCA1発現阻害物質に含まれる。
In the anticancer agent of the present invention, the ABCA1 expression inhibitor is not particularly limited as long as it inhibits the expression of ABCA1 gene or the function (activity) of the protein encoded by the gene. For example,
(A) an antisense nucleic acid for the transcription product of ABCA1 gene or a part thereof (b) a nucleic acid having ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product of ABCA1 gene (c) the action of inhibiting the expression of ABCA1 gene by RNAi effect A nucleic acid having (d) a compound selected from the group consisting of antibodies that bind to a protein encoded by the ABCA1 gene.
In addition, a substance that inactivates ABCA1 on the plasma membrane (for example, a drug probucol that reduces HDL) is included in the ABCA1 expression inhibitor of the present invention.
本発明における「核酸」とは、通常、RNAまたはDNAを意味する。特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。 The “nucleic acid” in the present invention usually means RNA or DNA. As a method for inhibiting the expression of a specific endogenous gene, a method using an antisense technique is well known to those skilled in the art. There are several factors as described below for the action of the antisense nucleic acid to inhibit the expression of the target gene. Inhibition of transcription initiation by triplex formation, inhibition of transcription by hybridization with a site where an open loop structure was locally created by RNA polymerase, inhibition of transcription by hybridization with RNA undergoing synthesis, intron and exon Splicing inhibition by hybridization at splice point, splicing inhibition by hybridization with spliceosome formation site, inhibition of translocation from nucleus to cytoplasm by hybridization with mRNA, hybridization with capping site and poly (A) addition site Inhibition of splicing, translation initiation inhibition by hybridization with the translation initiation factor binding site, translation inhibition by hybridization with the ribosome binding site in the vicinity of the initiation codon, peptation by hybridization with the mRNA translation region and polysome binding site Elongation inhibition of de chain, and gene expression inhibition by hybrid formation at sites of interaction between nucleic acids and proteins, and the like. In this way, antisense nucleic acids inhibit the expression of target genes by inhibiting various processes such as transcription, splicing or translation (Hirashima and Inoue, Shinsei Kagaku Kenkyu 2 Lecture and Expression of Nucleic Acid IV Gene, Japan Biochemical) (Academic Society, Tokyo Chemical Doujin, 1993, 319-347).
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用によりABCA1遺伝子の発現を阻害してもよい。一つの態様としては、ABCA1遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、ABCA1遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の生物もしくは細胞へ導入することができる。アンチセンス核酸の配列は、導入される生物もしくは細胞が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。 The antisense nucleic acid used in the present invention may inhibit ABCA1 gene expression by any of the actions described above. As one embodiment, if an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the ABCA1 gene mRNA is designed, it is considered effective for inhibiting the translation of the gene. In addition, a sequence complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used. Thus, the nucleic acid containing the antisense sequence of the sequence of the untranslated region as well as the translated region of the ABCA1 gene is also included in the antisense nucleic acid used in the present invention. The antisense nucleic acid used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side. The nucleic acid thus prepared can be introduced into a desired organism or cell by using a known method. The sequence of the antisense nucleic acid is preferably a sequence complementary to the endogenous gene or a part thereof possessed by the organism or cell to be introduced, but it is completely complementary as long as the gene expression can be effectively suppressed. It does not have to be. The transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, most preferably 95% or more, to the transcript of the target gene. In order to effectively suppress the expression of a target gene using an antisense nucleic acid, the length of the antisense nucleic acid is at least 15 bases, preferably 100 bases or more, more preferably 500 bases or more.
また、ABCA1遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。 Inhibition of ABCA1 gene expression can also be performed using ribozymes or ribozyme-encoding DNA. A ribozyme refers to an RNA molecule having catalytic activity. Some ribozymes have a variety of activities, but research focusing on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes that cleave RNA in a site-specific manner. Some ribozymes have a size of 400 nucleotides or more, such as group I intron type and M1 RNA contained in RNase P, but some have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type. (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzymes, 1990, 35, 2191.)
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.）。 For example, the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme cleaves 3 ′ of C15 in the sequence G13U14C15, but base pairing between U14 and A9 is important for its activity, and instead of C15, A15 or U15 However, it has been shown that it can be cleaved (Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.). By designing a ribozyme whose substrate binding site is complementary to the RNA sequence in the vicinity of the target site, it is possible to create a restriction RNA-cleaving ribozyme that recognizes the sequence UC, UU or UA in the target RNA (Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285., Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzymes, 1990, 35, 2191., Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059 .).
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように、リボザイム活性を有する核酸を用いて本発明におけるABCA1遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。 Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention. This ribozyme is found, for example, in the minus strand of tobacco ring spot virus satellite RNA (Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.). It has been shown that hairpin ribozymes can also produce target-specific RNA-cleaving ribozymes (Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751., Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology, 1992, 30, 112.). Thus, the expression of the gene can be inhibited by specifically cleaving the transcript of the ABCA1 gene in the present invention using a nucleic acid having ribozyme activity.
本発明のABCA1遺伝子の発現を阻害する物質の一態様としては、本発明のABCA1遺伝子に対してRNAi（RNA interference；RNA干渉）効果を有する二本鎖RNA（siRNA）を挙げることができる。
一般的にRNAiとは、標的遺伝子のmRNA配列と相同な配列からなるセンスRNAおよびこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる二本鎖RNAを細胞内に導入することにより、標的遺伝子mRNAの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現が阻害される現象を言う。
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素（RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このsiRNAも含まれる。
なお、上記RNA分子において一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA(shRNA)も本発明に含まれる。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る分子もまた本発明に含まれる。
上記siRNAの態様としては、ABCA1遺伝子の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA(siRNA)を例示することができる。
An example of a substance that inhibits the expression of the ABCA1 gene of the present invention includes double-stranded RNA (siRNA) having an RNAi (RNA interference) effect on the ABCA1 gene of the present invention.
In general, RNAi refers to a target gene by introducing into a cell a double-stranded RNA consisting of a sense RNA consisting of a sequence homologous to the mRNA sequence of the target gene and an antisense RNA consisting of a sequence complementary thereto. A phenomenon that induces the destruction of mRNA and inhibits the expression of target genes.
The details of the RNAi mechanism are still unknown, but an enzyme called DICER (a member of the RNase III nuclease family) contacts double-stranded RNA, and the double-stranded RNA is called a small interfering RNA or siRNA. It is thought to be broken down into pieces. This siRNA is also included in the double-stranded RNA having RNAi effect in the present invention.
In addition, a molecule having one end closed in the above RNA molecule, for example, a siRNA (shRNA) having a hairpin structure is also included in the present invention. That is, a molecule capable of forming a double-stranded RNA structure within the molecule is also included in the present invention.
Examples of the siRNA include RNA (siRNA) that can suppress the expression of ABCA1 gene by the RNAi effect.
また、二本鎖RNAの末端において、例えば、１もしくは複数のRNAが付加もしくは欠失された構造の二本鎖RNAもまた、本発明に含まれる。その場合、二本鎖を形成するRNAは、ABCA1遺伝子の部分配列と完全に同一（相同）である必要はないが、相同性を有することが好ましい。また、本発明のRNAi効果を有する二本鎖RNAは、通常、本発明のABCA1遺伝子のmRNAにおける連続する任意のRNA領域と相同な配列からなるセンスRNA、および該センスRNAに相補的な配列のアンチセンスRNAからなる二本鎖RNAである。 In addition, a double-stranded RNA having a structure in which one or more RNAs are added or deleted at the end of the double-stranded RNA is also included in the present invention. In that case, the RNA that forms the double strand does not need to be completely identical (homologous) to the partial sequence of the ABCA1 gene, but preferably has homology. The double-stranded RNA having the RNAi effect of the present invention is usually a sense RNA comprising a sequence homologous to any continuous RNA region in the mRNA of the ABCA1 gene of the present invention, and a sequence complementary to the sense RNA. It is a double-stranded RNA consisting of antisense RNA.
本発明のsiRNAにおいて二本鎖を形成する領域のRNAの長さは、好ましくは15〜30bp程度の長さであり、より好ましくは19〜21bpの長さであり、最も好ましくは19 bpの長さであるが、必ずしもこれらの長さに限定されない。
また、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。また、本発明のABCA1遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させる。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子(siRNA)が含まれることが期待されるため、その分解産物を利用することが可能である。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待されるmRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、RNAi効果を有する本発明の遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。
In the siRNA of the present invention, the length of the RNA in the region forming a double strand is preferably about 15 to 30 bp, more preferably 19 to 21 bp, and most preferably 19 bp. However, it is not necessarily limited to these lengths.
In addition, even long-chain RNA that does not have an RNAi effect as it is in its length is expected to be degraded into siRNA having an RNAi effect in the cell. The length is not particularly limited. In addition, long double-stranded RNA corresponding to the full length or almost full length region of the ABCA1 gene mRNA of the present invention is preliminarily degraded with DICER, for example. Since this degradation product is expected to contain a double-stranded RNA molecule (siRNA) having an RNAi effect, the degradation product can be used. According to this method, a region on mRNA that is expected to have an RNAi effect need not be selected. That is, the region on the mRNA of the gene of the present invention having the RNAi effect does not necessarily have to be accurately defined.
また、通常、末端に数塩基のオーバーハングを有する二本鎖RNAは、RNAi効果が高いことから、本発明の二本鎖RNAは、末端に数塩基のオーバーハングを有していてもよい。オーバーハングを形成する塩基の長さ、および配列は特に制限されず、このオーバーハングは、DNAおよびRNAのいずれであってもよい。例えば2塩基のオーバーハングを例示することができる。TT（チミンが2個）、UU（ウラシルが2個）、その他の塩基のオーバーハングを有する二本鎖RNAも用いることができる。二本鎖RNAには、このようにオーバーハングを形成する塩基がDNAであるような分子や、標的mRNA配列と相同な配列も含まれる。 In addition, since double-stranded RNA having an overhang of several bases at the end usually has a high RNAi effect, the double-stranded RNA of the present invention may have an overhang of several bases at the end. The length and sequence of the base forming the overhang are not particularly limited, and this overhang may be either DNA or RNA. For example, an overhang of 2 bases can be exemplified. Double-stranded RNAs having TT (2 thymines), UU (2 uracils), and other base overhangs can also be used. Double-stranded RNA includes molecules in which the base that forms an overhang is DNA, and sequences that are homologous to the target mRNA sequence.
上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖RNA」は、当業者であれば、該二本鎖RNAの標的となる本発明によって開示されたABCA1遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。ABCA1遺伝子の塩基配列、即ち、配列番号：１に記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者であれば容易に行い得る。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択することも、当業者であれば適宜実施することができる。また、siRNAは市販の核酸合成機を用いて適宜作製することも可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することが可能である。 The above-mentioned “double-stranded RNA that can be suppressed by the RNAi effect” can be appropriately prepared by those skilled in the art based on the base sequence of the ABCA1 gene disclosed by the present invention that is the target of the double-stranded RNA. it can. Based on the base sequence of ABCA1 gene, that is, the base sequence described in SEQ ID NO: 1, any continuous RNA region of mRNA that is a transcription product of the sequence is selected, and double-stranded RNA corresponding to this region A person skilled in the art can easily produce the above. Moreover, those skilled in the art can also appropriately select an siRNA sequence having a stronger RNAi effect from an mRNA sequence that is a transcription product of the sequence. Moreover, siRNA can also be suitably produced using a commercially available nucleic acid synthesizer. In addition, for synthesis of a desired RNA, it is possible to use a general commissioned synthesis service.
また本発明においてsiRNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド(RNA)でなくともよい。即ち、本発明においてsiRNAを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことを言う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜１０個程度、より好ましくは２〜５個程度の少数を指す。
また本発明は、ABCA1遺伝子によってコードされるタンパク質（以下ABCA1タンパク質と記載する場合がある）に結合する抗体を有効成分として含有する抗癌剤を提供する。上記抗体は、ABCA1タンパク質と結合することにより、該タンパク質の機能を阻害することが期待される。
In the present invention, siRNA does not necessarily require that all nucleotides be ribonucleotides (RNA). That is, in the present invention, the one or more ribonucleotides constituting the siRNA may be corresponding deoxyribonucleotides. This “corresponding” refers to the same base species (adenine, guanine, cytosine, thymine (uracil)) although the structures of the sugar moieties are different. For example, deoxyribonucleotide corresponding to ribonucleotide having adenine refers to deoxyribonucleotide having adenine. The “plurality” is not particularly limited, but preferably refers to a small number of about 2 to 10, more preferably about 2 to 5.
The present invention also provides an anticancer agent comprising as an active ingredient an antibody that binds to a protein encoded by the ABCA1 gene (hereinafter sometimes referred to as ABCA1 protein). The antibody is expected to inhibit the function of the protein by binding to ABCA1 protein.
ABCA1タンパク質は、細胞膜上トランスポーターとしての機能を有している。従って本発明の好ましい態様において「タンパク質の機能を阻害する」とは、具体的には、本発明のタンパク質が有する細胞膜上トランスポーターの機能を阻害すること等を指す。ただし、前記機能は、本発明のタンパク質が有する機能の一例であり、例示した以外の機能を阻害する物質であっても、ABCA1発現を阻害する作用を有すると考えられる。 ABCA1 protein has a function as a transporter on the cell membrane. Therefore, in the preferred embodiment of the present invention, “inhibiting the function of a protein” specifically refers to inhibiting the function of a transporter on a cell membrane possessed by the protein of the present invention. However, the function is an example of the function of the protein of the present invention, and even a substance that inhibits functions other than those exemplified is considered to have an action of inhibiting ABCA1 expression.
ABCA1遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体（抗ABCA1抗体）は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然のABCA1タンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントABCA1タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、ABCA1タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、ABCA1タンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、ABCA1タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、ABCA1タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。 An antibody that binds to a protein encoded by the ABCA1 gene (anti-ABCA1 antibody) can be prepared by methods known to those skilled in the art. If it is a polyclonal antibody, it can obtain as follows, for example. Serum is obtained by immunizing a small animal such as a rabbit with a recombinant ABCA1 protein expressed in a microorganism such as Escherichia coli or a partial peptide thereof as a fusion protein with natural ABCA1 protein or GST. This is prepared by, for example, purification using ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, affinity column coupled with ABCA1 protein or synthetic peptide, or the like. In the case of a monoclonal antibody, for example, ABCA1 protein or a partial peptide thereof is immunized to a small animal such as a mouse, the spleen is excised from the mouse, and this is ground to separate the cells, the cells and mouse myeloma cells. Are fused using a reagent such as polyethylene glycol, and a clone that produces an antibody that binds to ABCA1 protein is selected from the fused cells (hybridoma) thus produced. Subsequently, the obtained hybridoma is transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites is collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody is obtained by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, ABCA1 protein, It can be prepared by purification with an affinity column coupled with a synthetic peptide.
本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、本発明のABCA1タンパク質に結合する限り、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のABCA1タンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, so long as it binds to the ABCA1 protein of the present invention, in addition to the polyclonal antibody and the monoclonal antibody, a human antibody, a humanized antibody by genetic recombination, an antibody fragment thereof, Antibody modifications are also included.
The ABCA1 protein of the present invention used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal such as a mouse or a human, and particularly preferably a protein derived from a human. Human-derived proteins can be obtained using the gene sequences or amino acid sequences disclosed herein.
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。 In the present invention, the protein used as the sensitizing antigen may be a complete protein or a partial peptide of the protein. Examples of the partial peptide of protein include an amino group (N) terminal fragment and a carboxy (C) terminal fragment of protein. As used herein, “antibody” means an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein.
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久***能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。 In addition to immunizing non-human animals with antigens to obtain the above hybridomas, human lymphocytes such as human lymphocytes infected with EB virus are sensitized with proteins, protein-expressing cells or lysates thereof in vitro. Lymphocytes can be fused with human-derived myeloma cells having permanent mitotic activity, such as U266, to obtain hybridomas that produce desired human antibodies having binding activity to proteins. When the obtained antibody is used for the purpose of administering it to the human body (antibody treatment), a human antibody or a human-type antibody is preferable in order to reduce immunogenicity.
ニチジンはABCA1発現低下細胞において強い蓄積が起こり蛍光を発することから、本発明の抗癌剤は、臨床検査薬もしくは臨床診断薬として有用である。
例えば、ニチジンの有する自家蛍光を利用して、生検で患者から取り出した腫瘍に作用させた後、その蛍光を観察することで、抗癌剤としての投与が有効かどうか決定することが可能である。即ち、ABCA1 mRNAまたはタンパク質発現量に関わらず、検査で蛍光が観察されたかどうかを指標とすることで、抗癌剤としての有効性を判定することができる。
Since nitidine accumulates strongly in ABCA1 expression-reduced cells and emits fluorescence, the anticancer agent of the present invention is useful as a clinical test agent or clinical diagnostic agent.
For example, it is possible to determine whether or not administration as an anticancer agent is effective by using autofluorescence possessed by nitidine and observing the fluorescence after acting on a tumor extracted from a patient by biopsy. That is, regardless of ABCA1 mRNA or protein expression level, the effectiveness as an anticancer agent can be determined by using as an index whether fluorescence was observed in the test.
本発明においてABCA1発現阻害物質としては、上述の核酸や抗体以外にも、ABCA1遺伝子の発現を阻害することが知られている種々の化合物を挙げることができる。一例を示せば、高脂血症治療薬として知られるProbucolが挙げられる。ProbucolはABCA1の阻害活性を有することが報告されている(Cheng-Ai Wu et al., The Journal of Biological Chemistry, vol. 279, 30168-30174, 2004)。本発明者は、後述の実施例で示すように、ABCA1の発現量が高く、ニチジンに対して感受性が低い癌細胞(HepG2)が、Probucolで処理することによりニチジンに対する感受性が増強されることが分った。
従って、ABCA1の発現を阻害する作用を有する物質は、本発明の抗癌剤感受性増強剤として有用である。
In the present invention, the ABCA1 expression inhibitor may include various compounds known to inhibit the expression of ABCA1 gene in addition to the above-described nucleic acids and antibodies. One example is Probucol, which is known as a therapeutic drug for hyperlipidemia. Probucol has been reported to have ABCA1 inhibitory activity (Cheng-Ai Wu et al., The Journal of Biological Chemistry, vol. 279, 30168-30174, 2004). The present inventor, as shown in the Examples described later, cancer cells (HepG2) with high ABCA1 expression level and low sensitivity to nitidine may be enhanced in sensitivity to nitidine by treatment with Probucol. I understand.
Therefore, a substance having an action of inhibiting ABCA1 expression is useful as an anticancer agent sensitivity enhancer of the present invention.
本発明者は、ABCA1発現阻害物質がニチジン抗癌剤に対する感受性を増強させるための薬剤として有用であることを新たに見出した。即ち、本発明は、ABCA1発現阻害物質を有効成分とする、抗癌剤感受性増強剤を提供する。
本発明の抗癌剤感受性増強剤は、好ましくは、上記一般式(I)または(II)で表される化合物、またはその塩の有する抗癌作用を増強させる機能を持つ。
上記発明においてABCA1発現阻害物質は、特に制限されないが、例えば以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される化合物である。
（ａ）ABCA1遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）ABCA1遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）ABCA1遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
（ｄ）ABCA1遺伝子によってコードされるタンパク質と結合する抗体
The inventor of the present invention has newly found that ABCA1 expression inhibitor is useful as a drug for enhancing sensitivity to a nitidine anticancer agent. That is, the present invention provides an anticancer agent sensitivity enhancer comprising an ABCA1 expression inhibitor as an active ingredient.
The anticancer agent sensitivity enhancer of the present invention preferably has a function of enhancing the anticancer activity of the compound represented by the above general formula (I) or (II) or a salt thereof.
In the above invention, the ABCA1 expression inhibitor is not particularly limited, and is, for example, a compound selected from the group consisting of the following (a) to (d).
(A) an antisense nucleic acid for the transcription product of ABCA1 gene or a part thereof (b) a nucleic acid having ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product of ABCA1 gene (c) the action of inhibiting the expression of ABCA1 gene by RNAi effect Nucleic acid (d) an antibody that binds to a protein encoded by ABCA1 gene
本発明における「抗癌剤感受性増強剤」を、例えば、抗癌剤併用剤、抗癌剤作用増強剤等と表記することも可能である。
また本発明は、被検者または被検癌細胞について、ABCA1遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、抗癌剤に対して感受性か否かを検査する方法を提供する。
被検者について検査する場合には、例えば以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法が挙げられる。
（ａ）被検者由来の試料について、ABCA1遺伝子の発現量を測定する工程
（ｂ）対照と比較して、前記発現量が低下している場合に、被検者は抗癌剤に感受性であるものと判定する工程
被検癌細胞について検査する場合には、例えば、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法を挙げることができる。
（ａ）被検癌細胞について、ABCA1遺伝子の発現量を測定する工程
（ｂ）対照と比較して、前記発現量が低下している場合に、被検癌細胞は抗癌剤感受性癌細胞であるものと判定する工程
The “anticancer agent sensitivity enhancer” in the present invention can also be expressed as, for example, an anticancer agent combination agent, an anticancer agent action enhancer, or the like.
The present invention also provides a method for examining whether or not a subject or a test cancer cell is sensitive to an anticancer agent, which comprises measuring the expression level of ABCA1 gene.
When inspecting a subject, for example, a method including the following steps (a) and (b) may be mentioned.
(A) A step of measuring the expression level of ABCA1 gene for a sample derived from a subject (b) When the expression level is reduced compared to a control, the subject is sensitive to an anticancer agent In the case of examining the test cancer cell, for example, a method including the following steps (a) and (b) can be mentioned.
(A) Step of measuring the expression level of ABCA1 gene for the test cancer cell (b) When the expression level is lower than that of the control, the test cancer cell is an anticancer drug-sensitive cancer cell Process
本発明において「抗癌剤に対して感受性か否かの検査」とは、被検者または被検癌細胞について抗癌剤が効く可能性が高いか低いかを判定するための検査が含まれる。本発明の方法においては、ABCA1遺伝子の発現量が対照と比較して低下している場合に、被検者または被検癌細胞は抗癌剤に対して感受性である、あるいは感受性の素因を有すると判定される。または、抗癌剤に対して抵抗性ではない、あるいは抵抗性の素因を有さないと判定される。
一方、ABCA1遺伝子の発現量が対照と比較して低下していない場合に、被検者または被検癌細胞は抗癌剤に対して抵抗性である、あるいは抵抗性の素因を有すると判定される。または、抗癌剤に対して感受性ではない、あるいは感受性の素因を有さないと判定される。
In the present invention, “examination of whether or not the anticancer drug is sensitive” includes a test for determining whether or not the anticancer drug is highly effective for the subject or the test cancer cell. In the method of the present invention, when the expression level of ABCA1 gene is lower than that of the control, it is determined that the subject or the test cancer cell is sensitive to or has a predisposition to sensitivity. Is done. Alternatively, it is determined that the drug is not resistant to the anticancer agent or does not have a predisposing factor for resistance.
On the other hand, when the expression level of the ABCA1 gene is not decreased as compared with the control, it is determined that the subject or the test cancer cell is resistant to or has a predisposition to resistance. Alternatively, it is determined that it is not sensitive to an anticancer agent or does not have a predisposition to sensitivity.
本発明の方法により、癌を発症していない被検者であっても、抗癌剤が効く可能性が高いか低いかを判定することができる。また既に癌を発症した被検者の場合にも、抗癌剤が効く可能性が高いか低いかを判定することができ、治療方針の決定等に利用する事ができる。また、癌細胞についても、抗癌剤が効く可能性が高いか低いかを判定することができ、治療方針の決定等に利用することができる。
なお、本明細書で用いられる「治療」とは、通常、薬理学的なおよび／または生理学的な効果を得ることを意味する。
また本発明における被検者は、特に制限されないが、癌患者であることが好ましい。また本発明において用いられる癌細胞としては、治療の対象とする癌組織に含まれる細胞であることが好ましい。被検癌細胞の由来としては、ヒト等の哺乳動物細胞などに由来する細胞が挙げられる。
According to the method of the present invention, even a subject who has not developed cancer can determine whether an anticancer agent is highly effective or low. Further, even in the case of a subject who has already developed cancer, it can be determined whether the anticancer agent has a high or low possibility of being effective, and can be used for determination of a treatment policy or the like. In addition, regarding cancer cells, it is possible to determine whether an anticancer agent has a high or low possibility of being effective, and it can be used to determine a treatment policy.
As used herein, “treatment” generally means obtaining pharmacological and / or physiological effects.
The subject in the present invention is not particularly limited, but is preferably a cancer patient. In addition, the cancer cell used in the present invention is preferably a cell contained in a cancer tissue to be treated. Examples of the origin of the test cancer cell include cells derived from mammalian cells such as humans.
本発明の上記方法において、「ABCA1遺伝子の発現量の測定」には、ABCA1遺伝子によってコードされるタンパク質の発現量を測定することが含まれる。遺伝子もしくはタンパク質の発現量の測定は、一般的な遺伝子工学技術を用いて、簡便に測定することができる。具体的には、後述する手法によって行うことができる。
また前記本発明の検査方法によって感受性か否かの検査の対象となる抗癌剤は、例えば一般式（I）もしくは（II）で表される化合物またはその塩が挙げられる。
また本発明は、抗癌剤感受性増強剤のスクリーニング方法を提供する。
その一つの態様は、ABCA1遺伝子の発現量を指標とする方法である。ABCA1遺伝子の発現量を低下させる化合物、またはABCA1タンパク質の機能を阻害する化合物は、抗癌剤感受性増強剤の候補化合物となることが期待される。
In the above method of the present invention, “measurement of the expression level of ABCA1 gene” includes measuring the expression level of the protein encoded by ABCA1 gene. The expression level of a gene or protein can be easily measured using a general genetic engineering technique. Specifically, it can be performed by a method described later.
Examples of the anticancer agent to be tested for sensitivity by the test method of the present invention include compounds represented by the general formula (I) or (II) or salts thereof.
The present invention also provides a screening method for an anticancer drug sensitivity enhancer.
One embodiment thereof is a method using the expression level of ABCA1 gene as an index. A compound that decreases the expression level of the ABCA1 gene or a compound that inhibits the function of the ABCA1 protein is expected to be a candidate compound for an anticancer drug sensitivity enhancer.
本発明は、ABCA1遺伝子の発現量、もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、抗癌剤感受性増強剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法である。
（ａ）ABCA1遺伝子を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
The present invention provides a screening method for an anticancer drug sensitivity enhancer, which comprises selecting a compound that decreases the expression level of ABCA1 gene or the activity of a protein encoded by the gene.
A preferred embodiment of the screening method of the present invention is a method including the following steps (a) to (c), for example.
(A) a step of contacting a test compound with a cell or cell extract expressing the ABCA1 gene (b) a step of measuring the expression level of the gene (c) comparison with a case where measurement is performed in the absence of the test compound And selecting a compound that reduces the expression level
また、別の態様としては、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法が挙げられる。
（ａ）ABCA1遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
Moreover, as another aspect, the method containing the process of the following (a)-(c) is mentioned.
(A) a step of bringing a test compound into contact with a cell or cell extract containing DNA having a structure in which a transcriptional regulatory region of ABCA1 gene and a reporter gene are functionally linked, and (b) measuring the expression level of the reporter gene (C) a step of selecting a compound that reduces the expression level as compared with the case of measuring in the absence of the test compound
上記方法に用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。 There is no restriction | limiting in particular as a test compound used for the said method. For example, natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides and other single compounds, as well as compound libraries, gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts Products, plant extracts and the like, but are not limited thereto.
ABCA1遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、ABCA1遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。 The “contact” of the test compound to the cell expressing the ABCA1 gene is usually performed by adding the test compound to the culture medium of the cell expressing the ABCA1 gene, but is not limited to this method. When the test compound is a protein or the like, “contact” can be performed by introducing a DNA vector expressing the protein into the cell.
上記方法においては、次いで、該ABCA1遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、ABCA1遺伝子を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはRT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また、ABCA1遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、ABCA1タンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに、ABCA1タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。ABCA1タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。 Next, in the above method, the expression level of the ABCA1 gene is measured. Here, “gene expression” includes both transcription and translation. The gene expression level can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, the amount of transcription of the gene can be measured by extracting mRNA from cells expressing the ABCA1 gene according to a standard method and performing Northern hybridization or RT-PCR using this mRNA as a template. Alternatively, the amount of translation of the gene can be measured by recovering the protein fraction from cells expressing the ABCA1 gene and detecting the expression of ABCA1 protein by electrophoresis such as SDS-PAGE. Furthermore, the amount of translation of a gene can be measured by detecting the expression of the protein by performing Western blotting using an antibody against ABCA1 protein. The antibody used for detection of ABCA1 protein is not particularly limited as long as it is a detectable antibody. For example, both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該発現量を低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、抗癌剤感受性増強剤の候補化合物となる。
さらに別の態様としては、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法が挙げられる。
（ａ）ABCA1遺伝子によってコードされるタンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活性を低下させる化合物を選択する工程
In this method, a compound that decreases the expression level is then selected as compared to the case where the test compound is not contacted (control). The compound thus selected becomes a candidate compound for an anticancer agent sensitivity enhancer.
Yet another embodiment includes a method including the following steps (a) to (c).
(A) a step of contacting a test compound with a protein encoded by ABCA1 gene, or a cell or cell extract expressing the protein, (b) a step of measuring the activity of the protein (c) non-test compound A step of selecting a compound that reduces the activity of the protein as compared to when measured in the presence
上記方法においては、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、ABCA1の機能（活性）を低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、抗癌剤感受性増強剤の候補化合物となる。
また、ニチジンの蓄積が見られる細胞は、ニチジンに対して感受性であることから、ニチジンの細胞内蓄積量を指標として、抗癌剤感受性増強剤の候補化合物をスクリーニングすることも可能である。一般式（I）または（II）で表される化合物またはその塩の細胞内蓄積量を増加させるような化合物は、抗癌剤感受性増強剤となることが期待される。
In the above method, a compound that reduces the function (activity) of ABCA1 is selected as compared with the case where the test compound is not contacted (control). The compound thus selected becomes a candidate compound for an anticancer agent sensitivity enhancer.
In addition, since cells in which accumulation of nitidine is observed are sensitive to nitidine, it is also possible to screen a candidate compound for an anticancer drug sensitivity enhancer using the amount of nitidine accumulated in the cell as an index. A compound that increases the intracellular accumulation of the compound represented by the general formula (I) or (II) or a salt thereof is expected to be an anticancer drug sensitivity enhancer.
また本発明は、本発明の各種方法に用いられる試薬を提供する。その一つの態様は、ABCA1遺伝子の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするプローブであって、少なくとも15塩基長のポリヌクレオチドを含む試薬である。
該ポリヌクレオチドは、好ましくはABCA1遺伝子の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするものである。ここで「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら, Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。
The present invention also provides reagents used in the various methods of the present invention. One embodiment thereof is a probe that hybridizes with the base sequence of ABCA1 gene under stringent conditions, and is a reagent containing a polynucleotide having a length of at least 15 bases.
The polynucleotide preferably hybridizes with the base sequence of ABCA1 gene under stringent conditions. Here, “hybridizes under stringent conditions” refers to those described under stringent hybridization conditions (for example, as described in Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2nd edition 1989). In the condition), it means that cross-hybridization does not occur significantly with DNA encoding other proteins.
該ポリヌクレオチドは、上記本発明の方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。
上記ポリヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ABCA1遺伝子の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成ポリヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15塩基長以上の鎖長を有する。
The polynucleotide can be used as a probe or primer in the method of the present invention.
When the polynucleotide is used as a probe, the probe is not particularly limited as long as it hybridizes with the base sequence of ABCA1 gene under stringent conditions. The probe may be a synthetic polynucleotide and usually has a chain length of at least 15 bases or more.
本発明のポリヌクレオチドは、例えば市販のポリヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。
本発明のポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、ポリヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
The polynucleotide of the present invention can be produced by, for example, a commercially available polynucleotide synthesizer. The probe can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
When the polynucleotide of the present invention is used as a probe, it is preferably used after being appropriately labeled. As a labeling method, a method of labeling by phosphorylating the 5 ′ end of a polynucleotide with 32 P using T4 polynucleotide kinase, and a random hexamer oligonucleotide or the like using a DNA polymerase such as Klenow enzyme are used. Examples thereof include a method (such as a random prime method) in which a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin is incorporated as a primer.
該ポリヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、通常少なくとも15塩基長以上の鎖長を有する。プライマーは、ABCA1遺伝子を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
本発明の試薬の他の一つの態様として、ABCA1遺伝子によってコードされるタンパク質と結合する抗体を含む試薬を挙げることができる。抗体は、検査等に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が挙げられる。抗体は必要に応じて標識される。これら抗体は上述の方法によって作製することができる。
When the polynucleotide is used as a primer, it usually has a chain length of at least 15 bases or more. The primer is not particularly limited as long as it can amplify ABCA1 gene.
Another embodiment of the reagent of the present invention includes a reagent containing an antibody that binds to a protein encoded by ABCA1 gene. The antibody is not particularly limited as long as it can be used for testing and the like, and examples thereof include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. The antibody is labeled as necessary. These antibodies can be produced by the method described above.
本発明の試薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（BSAやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
また本発明は、本発明の抗癌剤の製造方法を提供する。該製造方法においては、一般式（I）または（II）で表される化合物またはその塩と、ABCA1遺伝子発現阻害物質とを混合する工程を含む方法である。
In the reagent of the present invention, in addition to the active ingredient oligonucleotide and antibody, for example, sterilized water, physiological saline, vegetable oil, surfactant, lipid, solubilizer, buffer, protein stabilizer (BSA, gelatin etc. ), Preservatives and the like may be mixed as necessary.
The present invention also provides a method for producing the anticancer agent of the present invention. The production method includes a step of mixing the compound represented by the general formula (I) or (II) or a salt thereof and an ABCA1 gene expression inhibitor.
本発明の抗癌剤は、慣用されている方法により錠剤、丸剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、粉剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤、液剤、乳剤、懸濁剤、注射剤等として製剤化することができる。
製剤化には通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要に応じて安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調製剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化される。
The anticancer agent of the present invention is prepared by a conventional method using tablets, pills, powders, fine granules, granules, powders, coated tablets, capsules, syrups, troches, inhalants, suppositories, injections, ointments. Preparations, eye ointments, eye drops, nasal drops, ear drops, poultices, lotions, solutions, emulsions, suspensions, injections and the like.
Commonly used excipients, binders, lubricants, colorants, flavoring agents, and stabilizers, emulsifiers, absorption promoters, surfactants, pH adjusters, preservatives as necessary Antioxidants and the like can be used, and they are generally formulated by blending ingredients used as raw materials for pharmaceutical preparations.
例えば経口製剤を製造するには、本発明にかかる化合物またはその薬理学的に許容される塩と賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。これらの成分としては例えば、大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油； 流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィン等の炭化水素； ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油； セトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール； シリコン樹脂； シリコン油； ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤； ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース等の水溶性高分子； エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール； グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトールなどの多価アルコール；グルコース、ショ糖等の糖； 無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウム等の無機粉体、精製水等があげられる。 For example, in order to produce an oral preparation, the compound according to the present invention or a pharmacologically acceptable salt and excipient thereof, and if necessary, a binder, a disintegrant, a lubricant, a coloring agent, and a flavoring agent. After adding, etc., it is made into powders, fine granules, granules, tablets, coated tablets, capsules and the like by conventional methods. Examples of these components include animal and vegetable oils such as soybean oil, beef tallow and synthetic glycerides; hydrocarbons such as liquid paraffin, squalane and solid paraffin; ester oils such as octyldodecyl myristate and isopropyl myristate; cetostearyl alcohol and behenyl alcohol Higher alcohols of: silicone resin; silicone oil; surfactants such as polyoxyethylene fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene polyoxypropylene block copolymer Hydroxyethyl cellulose, polyacrylic acid, carboxyvinyl polymer, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, methyl cellulose, etc. Water-soluble polymers; lower alcohols such as ethanol and isopropanol; polyhydric alcohols such as glycerin, propylene glycol, dipropylene glycol and sorbitol; sugars such as glucose and sucrose; anhydrous silicic acid, magnesium magnesium silicate, aluminum silicate, etc. Inorganic powder, purified water and the like.
賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素、デンプン、果糖、ソルビトール、カオリン、カルメロース、キシリトール、軽質無水ケイ酸、リン酸水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストリン、ポピドン等が、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミン等が、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、デキストラン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が、滑沢剤としては、例えばステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、マクロゴール、含水二酸化ケイ素、ショ糖脂肪酸エステル等が、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末、エリスリトール、キシリトール、クエン酸、マルチトール、ステビア、ソーマチン等が用いられる。これらの錠剤・顆粒剤には糖衣、その他必要に応じて適宜コーティングしてもよい。糖衣剤としては、アラビアゴム末、酸化チタン、ゼラチン、タルク、沈降炭酸カルシウム、白糖等が、コーティング剤としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、メタアクリル酸コポリマー等が用いられる。また、シロップ剤や注射用製剤等の液剤を製造する際には、本発明にかかる化合物またはその薬理学的に許容される塩にpH調整剤、溶解剤、等張化剤などと、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤などを加えて、常法により製剤化する。注射剤を調製する場合、必要に応じて、pH調製剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に収納後、凍結乾燥等によって、固形製剤として、用時調製の製剤としてもよい。また、一投与量を容器に収納してもよく、また、投与量を同一の容器に収納してもよい。 Examples of excipients include lactose, corn starch, sucrose, glucose, mannitol, sorbit, crystalline cellulose, silicon dioxide, starch, fructose, sorbitol, kaolin, carmellose, xylitol, light anhydrous silicic acid, calcium hydrogen phosphate, diphosphate Calcium hydride, hydroxypropyl cellulose, dextrin, popidone and the like are binders such as polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, methylcellulose, ethylcellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polypropylene. Glycol, polyoxyethylene, block polymer, meglumine, etc. are disintegrants such as starch, agar, gelatin powder, Crystalline cellulose, calcium carbonate, sodium hydrogen carbonate, calcium citrate, dextrin, dextran, pectin, carboxymethyl cellulose / calcium, etc. Examples of lubricants include stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica , Hardened vegetable oil, light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, macrogol, hydrous silicon dioxide, sucrose fatty acid ester, etc. as flavoring agents, cocoa powder, mint brain, aroma powder, mint oil, dragon brain, cinnamon powder Erythritol, xylitol, citric acid, maltitol, stevia, thaumatin and the like are used. These tablets and granules may be appropriately coated as needed. Examples of sugar coatings include gum arabic powder, titanium oxide, gelatin, talc, precipitated calcium carbonate, and white sugar. Examples of coating agents include hydroxypropyl methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, and methacrylic acid copolymer. Is used. Further, when producing a liquid preparation such as a syrup or an injectable preparation, the compound according to the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof, a pH adjuster, a solubilizer, an isotonic agent, etc. Add a solubilizing agent, stabilizer, etc. accordingly, and formulate it by a conventional method. When preparing an injection, a pH adjusting agent, a buffer, a stabilizer, a preservative, etc. are added as necessary, and a subcutaneous, intramuscular or intravenous injection is prepared by a conventional method. The injection may be prepared as a solid preparation by lyophilization after storing the solution in a container. One dose may be stored in a container, and the dose may be stored in the same container.
製剤化にあたり使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能である。使用する基剤原料として具体的には、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水等の原料が挙げられ、さらに必要に応じて、pH調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料等を添加することができる。また必要に応じて分化誘導作用を有する成分、血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。 As a base material used for formulation, various raw materials usually used for pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics, and the like can be used. Specific examples of base materials to be used include animal and vegetable oils, mineral oils, ester oils, waxes, higher alcohols, fatty acids, silicone oils, surfactants, phospholipids, alcohols, polyhydric alcohols, Examples include raw materials such as water-soluble polymers, clay minerals, and purified water. If necessary, add pH adjusters, antioxidants, chelating agents, antiseptic / antifungal agents, coloring agents, flavors, etc. Can do. Moreover, components having differentiation-inducing action, blood flow promoters, bactericides, anti-inflammatory agents, cell activators, vitamins, amino acids, humectants, keratolytic agents, and the like can be blended as necessary.
上記薬剤の剤型の種類としては、例えば経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。DNAを生体内に投与する場合、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを利用することができる。また、合成アンチセンス核酸や合成siRNAを生体内に投与する場合、リポソーム、高分子ミセル、カチオン性キャリアなどの非ウイルスベクターを利用することができる。投与方法としては、例えばin vivo法およびex vivo法を挙げることができる。 Examples of the dosage form of the drug include tablets, powders, pills, powders, granules, fine granules, soft / hard capsules, film coating agents, pellets, sublingual agents, pastes, etc. Examples of parenteral preparations include injections, suppositories, transdermal preparations, ointments, plasters, and liquids for external use. Those skilled in the art can select the optimal dosage form according to the route of administration and the administration target. . When DNA is administered in vivo, viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, Sendai viruses, and non-viral vectors such as liposomes can be used. In addition, when a synthetic antisense nucleic acid or a synthetic siRNA is administered in vivo, non-viral vectors such as liposomes, polymer micelles, and cationic carriers can be used. Examples of the administration method include an in vivo method and an ex vivo method.
本発明の薬剤の投与量は、投与対象の年齢、性別、体重、投与形態・塩の種類、疾患（癌）の具体的な種類等に応じて適宜選ぶことができる。例えば、通常成人として1日あたり、約0.01〜1000mg、好ましくは0.1〜500mg、さらに好ましくは0.1〜100mgを1日1〜数回に分けて投与することができるが、特にこれらの値に制限されない。 The dosage of the drug of the present invention can be appropriately selected according to the age, sex, body weight, dosage form / salt type, specific type of disease (cancer), and the like. For example, about 0.01 to 1000 mg, preferably 0.1 to 500 mg, more preferably 0.1 to 100 mg per day as a normal adult can be administered in 1 to several times a day, but is not particularly limited to these values .
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ ニチジンの各種細胞に対する細胞毒性
96well plateに1x103 cells/100μl・wellとなるように各細胞をまき、約2 hr後、well底面に細胞が接着しているのを確認した後、培地で希釈した所定濃度のサンプルを添加した（24 hr、5% CO2、加湿、37℃）。市販のキット（CellTiter 96 AQueous non-radioactive cell proliferation assay,Promega）にしたがって調整した発色試薬を20μl添加した。0、30、60 min後に測定を行った。サンプル無添加を100%として細胞毒性評価を行った。
EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Cytotoxicity of nitidine to various cells
Each cell is seeded in a 96-well plate at 1x10 3 cells / 100 μl / well, and after about 2 hr, after confirming that the cells adhere to the bottom of the well, a sample of a predetermined concentration diluted with a medium is added. (24 hr, 5% CO 2 , humidified, 37 ° C). 20 μl of a coloring reagent prepared according to a commercially available kit (CellTiter 96 AQueous non-radioactive cell proliferation assay, Promega) was added. Measurements were taken after 0, 30, 60 min. Cytotoxicity evaluation was performed with 100% of no sample added.
DHNの各種細胞に対する細胞毒性評価の結果を表１に示す。
NTDの各種細胞に対する細胞毒性評価の結果を表２に示す。
上記実験から、DHNは正常組織由来の細胞に対しては低毒性であり、一方、ほとんどの腫瘍細胞に対しては高い毒性を示すことが判った。例外的にA549（肺線ガン由来）に対しては強く、VMRC-LCP（肺扁平上皮癌）に対しては低毒性を示した。
NTDに関しては最高濃度10μg/mlまでしか調べていないが、この場合の細胞生存率はいずれも80%以上であった。
正常細胞(OUMS-36T-2F、WI-38)および肺悪性中皮腫（ACC-MESO-4）においては、毒性認められず、A549細胞に対しては高い毒性を示した。そのほかの肺腺癌由来の細胞においてはある程度の毒性を示した。
From the above experiments, it was found that DHN is low toxic to cells derived from normal tissues, while it is highly toxic to most tumor cells. Exceptionally strong against A549 (derived from lung cancer) and low toxicity against VMRC-LCP (squamous lung cancer).
For NTD, only a maximum concentration of 10 μg / ml was examined, but in this case, the cell viability was 80% or more.
In normal cells (OUMS-36T-2F, WI-38) and pulmonary malignant mesothelioma (ACC-MESO-4), no toxicity was observed, indicating high toxicity to A549 cells. Other pulmonary adenocarcinoma-derived cells showed some toxicity.
〔実施例２〕フローサイトによる細胞死検出
90 mmシャーレに5x105 cellsのA549、WI-38細胞をまき、直ちに480 ng/mlのDHNを添加した（対照は無添加）。24 hrまたは48 hr、5% CO2、加湿、37℃の条件で行った。0.05%トリプシン処理により細胞を剥離し、PBSで洗浄した。
Annexin V-FITCを添加し（終濃度50 ng/ml）、30 min、室温の後、propidium iodide(PI)を添加し（終濃度5μg/ml、5 min、室温）、フローサイトメータにより分析を行った。
結果を図１に示す。A549細胞には時間とともにアポトーシス初期（図1A右下エリア）、後期（図1B右上エリア）細胞が増加（図1、2）した。WI-38細胞では特に変化が見られなかった。
[Example 2] Detection of cell death by flow site
5 × 10 5 cells of A549 and WI-38 cells were seeded in a 90 mm petri dish, and 480 ng / ml DHN was immediately added (control was not added). The test was performed under conditions of 24 hr or 48 hr, 5% CO 2 , humidification, and 37 ° C. Cells were detached by 0.05% trypsin treatment and washed with PBS.
Annexin V-FITC is added (final concentration 50 ng / ml), 30 min, after room temperature, propidium iodide (PI) is added (final concentration 5 μg / ml, 5 min, room temperature), and analyzed with a flow cytometer. went.
The results are shown in FIG. A549 cells increased with time in early apoptosis (lower right area in FIG. 1A) and late (upper right area in FIG. 1B) (FIGS. 1 and 2). There was no particular change in WI-38 cells.
〔実施例３〕カスパーゼ3活性
96well plateに1x103 cells/100μl・wellとなるようにA549、WI-38細胞をまき、500、250、125、63ng/ml（終濃度）のDHNを添加した。24 hr、5% CO2、加湿、37℃の後、カスパーゼ3測定キット（Caspase 3 Assay kit, Sigma Aldrich）に従い、測定した。
結果を図３に示す。DHNの添加によりA549に細胞死が誘導されるのと同時に、誘導された細胞死の大きさに応じたカスパーゼ3活性の増大が認められた。
[Example 3] Caspase 3 activity
A549 and WI-38 cells were seeded in a 96-well plate at 1 × 10 3 cells / 100 μl / well, and 500, 250, 125, and 63 ng / ml (final concentration) of DHN were added. After 24 hr, 5% CO 2 , humidification and 37 ° C., measurement was performed according to a caspase 3 assay kit (Sigma Aldrich).
The results are shown in FIG. When DHN was added, cell death was induced in A549, and at the same time, an increase in caspase 3 activity corresponding to the size of the induced cell death was observed.
〔実施例４〕形態学的観察
WI-38、OUMS 36T-2F、VMRC-LCP、A549細胞をPBS（blank）、DHN（250 ng/ml）、CPT（250 ng/ml）存在下で24 hr培養した。PBSで洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察（UV励起、蛍光観察領域420 nm以上）した。
結果を図４に示す。DHN処理したA549細胞においてのみ、細胞内に強い蛍光が認められた。蛍光は主に細胞質の小器官に蓄積している様子が観察された。CPTも同様にUV励起による蛍光を発するが、CPTの感受性の高いVMRC-LCP細胞では蛍光は観察されていない。
[Example 4] Morphological observation
WI-38, OUMS 36T-2F, VMRC-LCP, and A549 cells were cultured for 24 hr in the presence of PBS (blank), DHN (250 ng / ml), and CPT (250 ng / ml). After washing with PBS, the sample was observed with a fluorescence microscope (UV excitation, fluorescence observation region of 420 nm or more).
The results are shown in FIG. Only in A549 cells treated with DHN, strong fluorescence was observed in the cells. It was observed that fluorescence accumulated mainly in cytoplasmic organelles. CPT also emits fluorescence by UV excitation, but no fluorescence is observed in VMRC-LCP cells, which are sensitive to CPT.
〔実施例５〕形態学的観察（２）
プラスチックシャーレに細胞をまき、ほぼコンフルエントになった状態で、細胞培地中にNTDを1μg/ml（終濃度）で添加し、0 hr、1 hr、2 hr、4 hr後に観察した。また4 hr作用の後、NTD(-)培地中でさらに培養し1 hr（計5 hr）、4 hr（計8 hr）後に観察した。
細胞毒性の感受性の高い細胞ほど蛍光強度が強い傾向が認められた（図5）。反応開始1 hrという比較的早い時期から蓄積が認められ、4 hr経ってもそのほとんどが細胞内にとどまっていた。
[Example 5] Morphological observation (2)
Cells were seeded in a plastic petri dish, and NTD was added to the cell culture medium at 1 μg / ml (final concentration) in an almost confluent state and observed after 0 hr, 1 hr, 2 hr, and 4 hr. Further, after 4 hr action, the cells were further cultured in NTD (−) medium and observed after 1 hr (total 5 hr) and 4 hr (total 8 hr).
Cells with higher sensitivity to cytotoxicity tended to have higher fluorescence intensity (Fig. 5). Accumulation was observed from a relatively early period of 1 hr after the start of the reaction, and most of it remained in the cell even after 4 hr.
〔実施例６〕遺伝子発現解析
90 mmシャーレにほぼコンフルエントになった細胞からtotal RNAを抽出し、各細胞由来の5μgのtotal RNAを用いて一本鎖cDNAを合成した。
等量の合成cDNAサンプルを用いて、リアルタイムPCR法によるABCA1 mRNA発現解析を行った。使用したプライマーは5'-CCCTTCTTATACCCTAAGATGAAGC-3'（配列番号：３）および5'-AGTGCAAAAATAGATCCCATTACAG-3'（配列番号：４）である。
リアルタイムPCRの結果からNTDに対する感受性の小さい細胞は、ABCA1遺伝子の発現量が増大していることが明らかになった（表３）。
[Example 6] Gene expression analysis
Total RNA was extracted from cells almost confluent in a 90 mm dish, and single-stranded cDNA was synthesized using 5 μg of total RNA derived from each cell.
ABCA1 mRNA expression analysis by real-time PCR was performed using an equal amount of synthetic cDNA sample. The primers used were 5′-CCCTTCTTATACCCTAAGATGAAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 3) and 5′-AGTGCAAAAATAGATCCCATTACAG-3 ′ (SEQ ID NO: 4).
From the results of real-time PCR, it was revealed that the expression level of ABCA1 gene was increased in cells with low sensitivity to NTD (Table 3).
〔実施例７〕ProbucolによるNTD感受性変化試験
96well plateに1x103 cells/100μl・wellとなるようにHepG2細胞をまき、100μMから0.1μMのProbucolで1 hrプレインキュベーションを行った。1μg/ml（終濃度）のNTDまたはPBSを培地中に添加した。24 hr、5% CO2、加湿、37℃の後、市販のキット（CellTiter 96 AQueous non-radioactive cell proliferation assay,Promega）にしたがって調整した発色試薬を20μl添加し、0、30、60 min後に測定した。Probucol無添加を100%として細胞毒性評価を行った。
結果を図６に示す。Probucolのみ存在した場合では、細胞毒性はほとんど認められなかった。一方、1μg/mlのNTD存在下では、Probucol濃度上昇にしたがって細胞毒性の増加が認められた。
[Example 7] NTD sensitivity change test with Probucol
HepG2 cells were seeded in a 96-well plate at 1 × 10 3 cells / 100 μl / well, and pre-incubated with 100 μM to 0.1 μM Probucol for 1 hr. 1 μg / ml (final concentration) of NTD or PBS was added to the medium. After 24 hr, 5% CO 2 , humidification and 37 ° C, add 20 μl of color reagent prepared according to a commercially available kit (CellTiter 96 AQueous non-radioactive cell proliferation assay, Promega), and measure after 0, 30, 60 min did. Cytotoxicity was evaluated with 100% non-addition of Probucol.
The results are shown in FIG. When only Probucol was present, little cytotoxicity was observed. On the other hand, in the presence of 1 μg / ml NTD, cytotoxicity increased with increasing Probucol concentration.
〔実施例８〕in vivo実験（A549細胞）
ヌードマウス（BALB/cAJcl-nu）（n=24）皮内に2x105 cells/50μl PBSのA549細胞を注射した。14日間の飼育の後、腫瘍体積（mm3；長辺(mm)x短辺(mm)x短辺(mm)x0.5）を測定し、腫瘍の確認できたマウスのうち、体積の小さいものから12匹を選び、2群（n=6）を設定した。NTD投与群とPBS投与群を設定し、それぞれNTD（0.1mg/100μl・body・day）、PBS（100μl）を腹腔内に連日投与した。15日間の投与期間を設定し、体重、腫瘍体積を測定した。
結果を図７に示す。15日間の投与期間で腫瘍体積に有意な変化が認められた。未処理群の腫瘍体積に対してNTD投与群の体積は42%に抑制された。
[Example 8] In vivo experiment (A549 cells)
Nude mice (BALB / cAJcl-nu) (n = 24) were injected intradermally with 2 × 10 5 cells / 50 μl PBS of A549 cells. After 14 days of breeding, the tumor volume (mm 3 ; long side (mm) x short side (mm) x short side (mm) x 0.5) was measured, and the volume of the mice whose tumor was confirmed was small Twelve animals were selected from those, and two groups (n = 6) were set. An NTD administration group and a PBS administration group were set, and NTD (0.1 mg / 100 μl · body · day) and PBS (100 μl) were intraperitoneally administered daily. A 15-day administration period was set, and body weight and tumor volume were measured.
The results are shown in FIG. There was a significant change in tumor volume over the 15-day dosing period. The volume of the NTD administration group was suppressed to 42% of the tumor volume of the untreated group.
〔実施例９〕in vivo実験（Lewis Lung Cancer）
マウス（C57BL/6JJcl）（n=24）皮内に2x104 cells/50μl PBSのマウス肺線ガン細胞（LLC：Lewis Lung Cancer）を注射した。7日間の飼育の後、腫瘍体積（mm3；長辺(mm)x短辺(mm)x短辺(mm)x0.5）を測定し、腫瘍の確認できたマウスのうち、体積の小さいものから12匹を選び、2群（n=6）を設定した。NTD投与群とPBS投与群を設定し、それぞれNTD（0.1mg/100μl・body・day）、PBS（100μl）を腹腔内に連日投与した。7日間の投与期間を設定し、体重、腫瘍体積を測定した。
結果を図８に示す。7日間の投与期間で腫瘍体積に有意な変化が認められた。未処理群の腫瘍体積に対してNTD投与群の体積は42%に抑制された。
[Example 9] In vivo experiment (Lewis Lung Cancer)
Mouse (C57BL / 6JJcl) (n = 24) skin was injected with 2 × 10 4 cells / 50 μl PBS of mouse lung line cancer cells (LLC: Lewis Lung Cancer). After 7 days of breeding, the tumor volume (mm 3 ; long side (mm) x short side (mm) x short side (mm) x 0.5) was measured. Twelve animals were selected from those, and two groups (n = 6) were set. An NTD administration group and a PBS administration group were set, and NTD (0.1 mg / 100 μl · body · day) and PBS (100 μl) were intraperitoneally administered daily. A 7-day administration period was set, and body weight and tumor volume were measured.
The results are shown in FIG. Significant changes in tumor volume were observed over the 7 day administration period. The volume of the NTD administration group was suppressed to 42% of the tumor volume of the untreated group.
Claims (12)
（ａ）被検者由来の試料について、ABCA1遺伝子の発現量を測定する工程
（ｂ）対照と比較して、前記発現量が低下している場合に、被検者は抗癌剤に感受性であるものと判定する工程 A test method for determining whether or not it is sensitive to an anticancer agent, comprising the following steps (a) and (b).
(A) A step of measuring the expression level of ABCA1 gene for a sample derived from a subject (b) When the expression level is reduced compared to a control, the subject is sensitive to an anticancer agent Process
（ａ）被検癌細胞について、ABCA1遺伝子の発現量を測定する工程
（ｂ）対照と比較して、前記発現量が低下している場合に、被検癌細胞は抗癌剤感受性癌細胞であるものと判定する工程 A test method for anticancer drug-sensitive cancer cells, comprising the following steps (a) and (b):
(A) Step of measuring the expression level of ABCA1 gene for the test cancer cell (b) When the expression level is lower than that of the control, the test cancer cell is an anticancer drug-sensitive cancer cell Process
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