JP2008195721A

JP2008195721A - Diabetes-mediating protein and therapeutic use thereof

Info

Publication number: JP2008195721A
Application number: JP2008040600A
Authority: JP
Inventors: Peter Mose Larsen; モーゼラルセンペーテル; Stephen J Fey; ジェイ．フェイスティーブン; Jorn Nerup; ネルプジョーン; Allan E Karlsen; イー．カールセンアラン; Christensen Ulla Bjerre; ブジェリークリステンセンウラ; Flemming Pociot; ポシオトフレミング; Henrik U Andersen; ユー．エイアンダーセンヘンリク
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 2008-02-21
Publication date: 2008-08-28
Also published as: WO1998020124A3; CA2269646A1; EP0934409A2; JP2002504806A; WO1998020124A2; AU5407098A

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide diabetes-mediating proteins and therapeutic uses thereof. <P>SOLUTION: A protective and deleterious diabetes-mediating protein and a polynucleotide encoding the same, a transgenic animal expressing a diabetes-mediating protein, a drug screening method of identifying a test compound altering the expression of a diabetes-mediating protein, and a method of preventing or ameliorating diabetes by administering a compound altering the expression of a diabetes-mediating protein are provided. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

発明の背景
発明の分野
本発明は一般に、糖尿病媒介タンパク質、糖尿病媒介タンパク質を同定する方法、本発明のアッセイにおいて有用なトランスジェニック動物、糖尿病媒介タンパク質の発現に影響を与える薬物のスクリーニングのための方法、および糖尿病の処置および予防のための治療化合物に関する。 BACKGROUND OF THE INVENTION Field of the Invention The present invention generally relates to diabetes-mediating proteins, methods for identifying diabetes-mediating proteins, transgenic animals useful in the assays of the invention, methods for screening for drugs that affect the expression of diabetes-mediating proteins. And therapeutic compounds for the treatment and prevention of diabetes.

関連技術
ヒトおよびヒトの疾患の動物モデルにおけるインシュリン依存性糖尿症（IDDM）の発症は、単核細胞の浸潤、および膵臓島（インシュリン島、insulitis）でのβ細胞の崩壊によって特徴付けられる。β細胞の崩壊の機構は知られていない。蓄積している証拠は、マクロファージおよび単球によって主に産生されるサイトカインインターロイキン-1,6（IL-1β）が、島のβ細胞崩壊の媒介因子であり得ることを示す。 Related Art The development of insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) in humans and animal models of human disease is characterized by mononuclear cell infiltration and β-cell destruction in pancreatic islets (insulitis). The mechanism of β-cell decay is not known. Accumulating evidence indicates that the cytokine interleukin-1,6 (IL-1β) produced mainly by macrophages and monocytes may be a mediator of islet β-cell decay.

ヒト糖尿病の動物モデルとして、糖尿病の傾向があるBB（BB-DP）ラットおよび非肥満糖尿病（NOD）マウスが挙げられる。ラットの島タンパク質の２次元（2D）ゲルマップが構築され、そしてIL-1βへのラットの島細胞のインビトロでの暴露によって生じる、タンパク質合成における定性的および定量的変化を決定するために使用されている（Andersenら、Diabetes44:400-407（1995)）。 Animal models of human diabetes include BB (BB-DP) rats and non-obese diabetic (NOD) mice that are prone to diabetes. A two-dimensional (2D) gel map of rat islet protein has been constructed and used to determine qualitative and quantitative changes in protein synthesis caused by in vitro exposure of rat islet cells to IL-1β. (Andersen et al., Diabetes 44: 400-407 (1995)).

ヒト糖尿病のトランスジェニック動物モデルが知られている。例えば、ヒト糖尿病の1つのモデルは、ラットのインシュリンプロモーターの制御下で膵臓のβ細胞中でウイルスタンパク質を発現するトランスジェニックマウスである（vanHerrathら、J. Clin. Invest．98:1324-1331（1996)）。２％未満のトランスジェニックマウスが、内発的に糖尿病を発症する；しかし、ウイルスでの２ヶ月のチャレンジ後、IDDMは95％以上のマウスで生じる。 Transgenic animal models of human diabetes are known. For example, one model of human diabetes is a transgenic mouse that expresses viral proteins in pancreatic beta cells under the control of the rat insulin promoter (vanHerrath et al., J. Clin. Invest. 98: 1324-1331). 1996)). Less than 2% of transgenic mice develop diabetes spontaneously; however, after 2 months of challenge with virus, IDDM occurs in more than 95% of mice.

発明の要旨
本発明は、一部、糖尿病媒介（DM）タンパク質の発見および同定に基づき、DMタンパク質は、糖尿病の発症、または糖尿病の発症の危険がある被験体における糖尿病の発症の予防に関連するタンパク質である。そして、DMタンパク質は、疾患の発症の存在下と非存在下のと間の異なる発現によって同定される。糖尿病の発症には、臨床的に検出可能な段階に進行する全ての段階が含まれる。 SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is based, in part, on the discovery and identification of diabetes-mediating (DM) proteins, which are related to the development of diabetes or the prevention of the development of diabetes in subjects at risk of developing diabetes. It is a protein. DM proteins are then identified by different expression between the presence and absence of disease onset. The onset of diabetes includes all stages that progress to clinically detectable stages.

従って、本発明の1つの局面において、糖尿病の発症の非存在下での発現と比較して、糖尿病の発症の間の変化した発現を示す、実質的に精製された糖尿病媒介タンパク質が特徴である。本発明の精製された糖尿病媒介タンパク質は、表１および２に列挙されたタンパク質から選択される。新規の糖尿病媒介タンパク質は、分子量、pI、および図６〜40に示されるような質量スペクトルによる特徴によって特徴づけられる。これらのタンパク質は、10％IEFまたはNEPHG ２次元ゲル（図1A-1B）上のそれらの位置を参照して、NEPHGE ７、9、102、123、129、130、174、181、182、211、231、236、253、298、およびIEF665、939、941、950、1196からなる群より選択される。 Accordingly, in one aspect of the invention, a substantially purified diabetes-mediating protein is characterized that exhibits altered expression during the onset of diabetes compared to expression in the absence of the onset of diabetes. . The purified diabetes-mediating protein of the present invention is selected from the proteins listed in Tables 1 and 2. The novel diabetes-mediating protein is characterized by molecular weight, pI, and mass spectral characteristics as shown in FIGS. These proteins refer to NEPHGE 7, 9, 102, 123, 129, 130, 174, 181, 182, 181, 211, referring to their location on 10% IEF or NEPHG 2D gels (FIGS. 1A-1B) 231, 236, 253, 298, and IEF665, 939, 941, 950, 1196.

DMタンパク質はさらに、防御（protective）または有害（deleterious）DMタンパク質として特徴づけられる。防御糖尿病媒介タンパク質（「防御タンパク質」）は、糖尿病の発症を防御し得、そして／または糖尿病の発症の危険性を有する被験体において糖尿病の発症を遅延し得るか、または糖尿病を罹患している被験体において糖尿病の症状を緩和し得るタンパク質として特徴づけられる。防御タンパク質はまた、糖尿病の発症の間には発現が変化しないが、糖尿病の発症を避ける糖尿病の危険性を有する被験体において変化した発現を示すタンパク質であり得る。有害糖尿病媒介タンパク質（「有害タンパク質」）は、糖尿病の発症を増強し得る、被験体の糖尿病を発症する危険性を増大し得る、または糖尿病の発症の危険性を有する被験体において糖尿病の発症に必要とされる時間を短縮し得るタンパク質として特徴づけられる。有害タンパク質はまた、糖尿病の発症の間に発現を変化しないが、糖尿病の発症を避ける、糖尿病の危険性を有する被験体において変化した発現を示すタンパク質であり得る。本発明の糖尿病媒介タンパク質は、ゲル電気泳動、イムノブロッティング、質量スペクトル分析、またはクロマトグラフィーを含む、当該分野で公知の任意の手段によって同定され得、そして糖尿病の発症の非存在下で発現される同じタンパク質と比較して、糖尿病の発症の間の変化したタンパク質発現によって特徴づけられる。米国仮特許出願第60/029,324号は、分子量およびpIによって同定された、膵臓の島細胞中で発現されるタンパク質を同定している（図1Aおよび1B）。本出願は、表１および２ならびに図６〜40に列挙される、糖尿病媒介タンパク質として同定されたこれらのタンパク質の選択を提供する。 DM proteins are further characterized as protective or deleterious DM proteins. A protective diabetes-mediating protein (“protective protein”) can protect against the development of diabetes and / or can delay the onset of diabetes or suffer from diabetes in a subject at risk of developing diabetes Characterized as a protein that can alleviate symptoms of diabetes in a subject. A protective protein may also be a protein that does not change expression during the onset of diabetes but exhibits altered expression in a subject at risk of diabetes that avoids the onset of diabetes. A harmful diabetes-mediating protein ("harmful protein") can enhance the development of diabetes, increase the risk of developing diabetes in a subject, or increase the risk of developing diabetes in a subject at risk of developing diabetes. Characterized as a protein that can reduce the time required. A noxious protein can also be a protein that does not change expression during the onset of diabetes but exhibits altered expression in a subject at risk for diabetes that avoids the onset of diabetes. The diabetes-mediating proteins of the invention can be identified by any means known in the art, including gel electrophoresis, immunoblotting, mass spectral analysis, or chromatography, and are expressed in the absence of the onset of diabetes Characterized by altered protein expression during the onset of diabetes compared to the same protein. US Provisional Patent Application No. 60 / 029,324 identifies proteins expressed in pancreatic islet cells identified by molecular weight and pI (FIGS. 1A and 1B). This application provides a selection of these proteins identified as diabetes-mediating proteins, listed in Tables 1 and 2 and FIGS. 6-40.

本発明の糖尿病媒介タンパク質は、糖尿病の発症を調節し得る化合物を同定するための薬物スクリーニングアッセイに有用であり、糖尿病の処置または予防のための治療薬として有用であり、そして糖尿病媒介タンパク質の発現を調節することによって糖尿病を予防し得るかまたは緩和し得る治療薬の標的として有用である。 The diabetes-mediating proteins of the invention are useful in drug screening assays to identify compounds that can modulate the development of diabetes, are useful as therapeutic agents for the treatment or prevention of diabetes, and expression of diabetes-mediating proteins It is useful as a target for therapeutic agents that can prevent or alleviate diabetes by regulating.

特異的なDMタンパク質の発現における変化は、糖尿病の発症の指標として診断的に有用である。従って、本発明の1つの局面において、表１に列挙された糖尿病媒介タンパク質からなる群から選択される１つ以上のタンパク質におけるタンパク質発現の増大、および表２に列挙された糖尿病媒介タンパク質からなるリストから選択される1つ以上のタンパク質のタンパク質発現における減少を測定することによって、糖尿病の発症を診断する方法が特徴である。タンパク質発現における変化は、糖尿病を発症している疑いがあるか、または糖尿病の発症の危険性を有する試験被験体において測定され、そして正常な非糖尿病のコントロールにおけるタンパク質発現と比較して示される。好ましい実施態様において、表１および２の１つ以上のタンパク質の組み合わせの変更は、糖尿病の発症の指標である。さらに好ましい実施態様において、表１および／または２のタンパク質の５つ以上の組み合わせの変更は、糖尿病の発症の指標である。なおさらに好ましい実施態様において、表１および／または２の10以上のタンパク質の組み合わせの変更が、糖尿病の発症の指標である。 Changes in the expression of specific DM proteins are diagnostically useful as indicators of the onset of diabetes. Thus, in one aspect of the invention, an increase in protein expression in one or more proteins selected from the group consisting of diabetes-mediating proteins listed in Table 1, and a list consisting of diabetes-mediating proteins listed in Table 2 Characterized by a method of diagnosing the development of diabetes by measuring a decrease in protein expression of one or more proteins selected from. Changes in protein expression are measured in test subjects suspected of developing diabetes or at risk of developing diabetes and are shown relative to protein expression in normal non-diabetic controls. In a preferred embodiment, alteration of one or more protein combinations of Tables 1 and 2 is an indicator of the onset of diabetes. In a further preferred embodiment, alteration of a combination of five or more of the proteins in Table 1 and / or 2 is an indicator of the onset of diabetes. In an even more preferred embodiment, a change in the combination of 10 or more proteins of Tables 1 and / or 2 is an indicator of the onset of diabetes.

１つの局面において、本発明は、疾患（例えば、糖尿病）の発症に関連するタンパク質を同定するためのインビボのアッセイ方法を特徴とする。本発明のインビボのアッセイ方法の特異的な実施態様において、インシュリンを分泌するかまたはインシュリン産生細胞に成長し得る細胞は、糖尿病の発症の危険性を有する動物である、免疫学的に適合性の宿主動物に移植される。タンパク質発現は、移植から疾患の発症までの間の時点でレスキューした移植した細胞において分析され、そして糖尿病の発症の非存在下でのそれらの発現と比較して糖尿病の発症の間に変化した発現を示すタンパク質が同定される。特異的な実施態様において、移植された細胞は、糖尿病の発症の危険性を有する動物モデルに移植された新産の島細胞である。１つの特異的な実施態様において、新産の島細胞は新産のBB-DPラットから採取され、そして宿主動物はBB-DPラットである。別の実施態様において、移植細胞の供給源および宿主細胞は、NODマウスである。 In one aspect, the invention features an in vivo assay method for identifying proteins associated with the development of a disease (eg, diabetes). In a specific embodiment of the in vivo assay method of the invention, the cells that secrete insulin or can grow into insulin-producing cells are immunologically compatible animals that are animals at risk of developing diabetes. Transplanted into the host animal. Protein expression was analyzed in transplanted cells rescued at the time between transplantation and disease onset, and expression altered during the onset of diabetes compared to their expression in the absence of the onset of diabetes Are identified. In a specific embodiment, the transplanted cells are new islet cells transplanted into an animal model at risk of developing diabetes. In one specific embodiment, the new islet cells are taken from a new BB-DP rat and the host animal is a BB-DP rat. In another embodiment, the source of transplanted cells and the host cell are NOD mice.

本発明は、防御または有害タンパク質としてさらに特徴づけられ得る、同定した糖尿病媒介タンパク質を提供する。本発明の1つの実施態様において、候補防御タンパク質または有害タンパク質は、候補防御タンパク質または有害タンパク質をコードするポリヌクレオチドで培養細胞をトランスフェクトすることによって、インビトロで同定される。そして、IL-1βでのチャレンジの際のインビトロでの細胞の機能性に対する糖尿病媒介性タンパク質の発現の効果が決定される。ポリヌクレオチドは、誘導性のプロモーターに作動可能に連結され得、その結果、候補の防御タンパク質または有害タンパク質の発現は、外因的な制御下にある。外因的な制御は、薬剤（例えば、インターフェロン）によって発揮され得、このような薬剤は、選択されるプロモーターによって決定される。特異的な実施態様において、細胞の機能性は、一酸化窒素（NO）産生、インシュリンの分泌、細胞の生存性、および／またはIL−1βへの暴露の際の細胞傷害性の測定によって決定される。 The present invention provides identified diabetes-mediating proteins that can be further characterized as protective or harmful proteins. In one embodiment of the invention, a candidate protective protein or harmful protein is identified in vitro by transfecting cultured cells with a polynucleotide encoding the candidate protective protein or harmful protein. The effect of diabetes-mediated protein expression on in vitro cell functionality upon challenge with IL-1β is then determined. The polynucleotide can be operably linked to an inducible promoter so that expression of the candidate defense protein or deleterious protein is under exogenous control. Exogenous control can be exerted by an agent (eg, interferon), such agent being determined by the promoter selected. In a specific embodiment, cell functionality is determined by measuring nitric oxide (NO) production, insulin secretion, cell viability, and / or cytotoxicity upon exposure to IL-1β. The

防御または有害糖尿病媒介タンパク質を同定するためのインビボの方法において、候補タンパク質を発現するトランスジェニック哺乳動物が作成される。ここで、トランスジェニック哺乳動物は、糖尿病を発症する危険性を有しており、そして糖尿病の発症および発症のタイミングに対するトランスジーン発現の効果が決定される。防御タンパク質は、糖尿病の危険性を有する被験体において糖尿病の発症を予防、阻害、または遅延させるタンパク質である。そして有害タンパク質は、糖尿病の発症を生じるか、糖尿病の発症の危険性を増大させるか、または糖尿病の発症の危険性を有する被験体において糖尿病の発症に必要な時間を短縮するタンパク質である。有害タンパク質はまた、防御タンパク質の発現を妨げるかまたは妨害するタンパク質でもある。 In an in vivo method for identifying protective or deleterious diabetes-mediating proteins, transgenic mammals expressing the candidate protein are created. Here, the transgenic mammal is at risk of developing diabetes, and the effect of transgene expression on the onset and timing of onset of diabetes is determined. A protective protein is a protein that prevents, inhibits or delays the onset of diabetes in a subject at risk of diabetes. A harmful protein is a protein that causes the onset of diabetes, increases the risk of developing diabetes, or shortens the time required for the development of diabetes in a subject at risk of developing diabetes. A harmful protein is also a protein that prevents or prevents the expression of protective proteins.

本発明は、実質的に精製された防御または有害糖尿病媒介タンパク質、および本発明の糖尿病媒介タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。１つの限定的でない実施態様において、防御タンパク質は、ガレクチン-3（galectin-3）である（図４および５）（配列番号１〜２）。別の限定的でない実施態様において、有害タンパク質は、モルタリン（mortalin）である（図２〜３）（配列番号３〜４）である。 The invention includes substantially purified protective or deleterious diabetes-mediating proteins and polynucleotide sequences encoding the diabetes-mediating proteins of the invention. In one non-limiting embodiment, the protection protein is galectin-3 (FIGS. 4 and 5) (SEQ ID NOs: 1-2). In another non-limiting embodiment, the harmful protein is mortalin (FIGS. 2-3) (SEQ ID NOs: 3-4).

1つの局面において、本発明は、そのゲノムに挿入された外因性の糖尿病媒介タンパク質遺伝子（単数または複数）を有するトランスジェニック哺乳動物を特徴とする。本発明のトランスジェニック哺乳動物は、糖尿病の発症における糖尿病媒介タンパク質の発現の効果を決定するため、および防御タンパク質または有害タンパク質を同定するためのアッセイ方法において有用である。トランスジーンは、天然の、または部分的にもしくは完全に人工的な糖尿病媒介遺伝子であり得、そして内因性の糖尿病媒介タンパク質遺伝子と異なり得るかまたは同じであり得る。１つの実施態様において、トランスジーンは、誘導性プロモーターの制御下にある。 In one aspect, the invention features a transgenic mammal having an exogenous diabetes-mediating protein gene (s) inserted into its genome. The transgenic mammals of the invention are useful in assay methods to determine the effect of expression of diabetes-mediating proteins in the development of diabetes and to identify protective or harmful proteins. The transgene can be a natural or partially or fully artificial diabetes-mediating gene and can be different from or the same as an endogenous diabetes-mediating protein gene. In one embodiment, the transgene is under the control of an inducible promoter.

関連する局面において、本発明は、外因性の有害遺伝子を有し、そして予想される時間内に増大した自発的な糖尿病の発症の発病率を示す、トランスジェニック哺乳動物を特徴とする。好ましい実施態様において、トランスジェニック哺乳動物は、50％以上の発病率、より好ましくは、60％以上の発病率、なおさらに好ましくは70％以上の発病率、なおさらに好ましくは80％以上の発病率、そして最も好ましくは90以上の糖尿病の発病率を示す。本発明の1つの実施態様において、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、有害糖尿病媒介タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子についてトランスジェニックである。別の実施態様において、トランスジェニック哺乳動物は、さらに、１つ以上の内因性糖尿病媒介タンパク質遺伝子が除去されている。一般に、トランスジェニック哺乳動物は、インシュリン、CMV、インターフェロン、またはMHCプロモーターの制御下にトランスジェニック遺伝子を有する。さらに特異的な実施態様において、トランスジェニック哺乳動物は、増強されたプロモーターによって得られた内因性糖尿病媒介遺伝子を上昇したレベルで発現するか、または高コピー数の内因性の糖尿病媒介遺伝子を発現する。さらに特異的な実施態様において、トランスジェニック哺乳動物は、破壊された糖尿病媒介タンパク質遺伝子を有する。 In a related aspect, the invention features a transgenic mammal having an exogenous deleterious gene and exhibiting an increased incidence of spontaneous diabetes onset in the expected time. In a preferred embodiment, the transgenic mammal has an incidence of 50% or more, more preferably an incidence of 60% or more, even more preferably an incidence of 70% or more, even more preferably an incidence of 80% or more. And most preferably exhibits an incidence of diabetes of 90 or more. In one embodiment of the invention, the transgenic mammal of the invention is transgenic for one or more genes encoding a harmful diabetes-mediating protein. In another embodiment, the transgenic mammal is further deleted of one or more endogenous diabetes-mediating protein genes. Generally, a transgenic mammal has a transgenic gene under the control of insulin, CMV, interferon, or MHC promoter. In a more specific embodiment, the transgenic mammal expresses an endogenous diabetes-mediating gene obtained by an enhanced promoter at an elevated level or expresses a high copy number of an endogenous diabetes-mediating gene. . In a more specific embodiment, the transgenic mammal has a disrupted diabetes-mediating protein gene.

本発明はさらに、内因性の糖尿病媒介タンパク質遺伝子が当該分野で公知の方法によって（例えば、米国特許第5,641,670号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載された遺伝子活性化技術の適用によって）外因的に変化される哺乳動物を含む。 The present invention further relates to gene activation in which endogenous diabetes-mediating protein genes are described by methods known in the art (eg, US Pat. No. 5,641,670, which is incorporated by reference herein in its entirety). Includes mammals that are exogenously altered (by application of technology).

１つの局面において、本発明は、１つ以上の糖尿病媒介タンパク質の発現に影響を与える化合物をスクリーニングするためのアッセイを特徴とする。１つの実施態様において、糖尿病の自発的な発症の危険性を有する動物が、１つ以上の糖尿病媒介タンパク質（単数または複数）の発現に影響を与える化合物の能力を決定するためのアッセイにおいて使用される。好ましい実施態様において、アッセイ動物は、糖尿病の発症の高い危険性を有する本発明のトランスジェニック動物である。用語「糖尿病媒介タンパク質の発現に影響を与える」は、内因性の糖尿病媒介タンパク質の発現を誘導する、増強する、阻害する、または減少させる化合物を意味する。 In one aspect, the invention features an assay for screening for compounds that affect the expression of one or more diabetes-mediating proteins. In one embodiment, an animal at risk for spontaneous development of diabetes is used in an assay to determine the ability of a compound to affect the expression of one or more diabetes-mediating protein (s). The In a preferred embodiment, the assay animal is a transgenic animal of the present invention having a high risk of developing diabetes. The term “influences the expression of a diabetes-mediating protein” means a compound that induces, enhances, inhibits or reduces the expression of an endogenous diabetes-mediating protein.

特異的な実施態様において、本発明は、内因性の防御タンパク質の発現を誘導し得るかまたは増強し得、従って、糖尿病の発症を遅延させ得るかまたは阻害し得る化合物を同定するためのアッセイを提供する。別の特異的な実施態様において、本発明のアッセイ方法は、有害糖尿病媒介タンパク質の発現を抑制し得るかまたは阻害し得、従って、糖尿病の発症を遅延させ得るかまたは阻害し得る化合物の同定に有用である。 In a specific embodiment, the present invention provides an assay for identifying compounds that can induce or enhance the expression of endogenous protective proteins and thus can delay or inhibit the onset of diabetes. provide. In another specific embodiment, the assay method of the present invention is used to identify compounds that can suppress or inhibit the expression of harmful diabetes-mediating proteins and thus can delay or inhibit the onset of diabetes. Useful.

関連する局面において、本発明は、糖尿病媒介タンパク質の活性を調節する化合物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）を同定するためのアッセイ、または糖尿病媒介タンパク質の活性化に必要とされる翻訳後の工程をブロックすることによるアッセイを提供する。特異的なDMタンパク質の発現における変化は、DMタンパク質の発現を調節し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法において有用である。１つ以上の糖尿病媒介タンパク質の発現を調節する化合物は、糖尿病の処置または予防における潜在的な治療薬として有用である。従って、本発明の１つの局面は、１つ以上の糖尿病媒介タンパク質を発現する細胞または組織と試験化合物とを接触させる工程、および１つ以上の糖尿病媒介タンパク質の発現に対する試験化合物の効果を決定する工程を有する、糖尿病媒介タンパク質の発現を調節し得る化合物を同定するための方法アッセイ方法を特徴とする。化合物の効果の決定は、プローブもしくは他のオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション、抗体認識（例えば、免疫拡散（immunodiffusion）、免疫蛍光、ELISA、RIA、ブロッティング、免疫沈降、免疫電気泳動、またはクロマトグラフィー）、および電気泳動を含む、当該分野で公知の種々の方法によって行われ得る。表１および２に列挙される糖尿病媒介タンパク質からなる群より選択される１つ以上のタンパク質の発現を増大し得る化合物、ならびに表１および２に列挙される糖尿病媒介タンパク質からなるリストより選択される１つ以上のタンパク質の発現を減少させ得る化合物が、糖尿病の予防または処置のための候補治療薬である。タンパク質の発現における変化は、試験化合物の非存在下での発現と比較して決定される。 In a related aspect, the present invention blocks assays to identify compounds (eg, agonists, antagonists) that modulate the activity of diabetes-mediating proteins, or post-translational steps required for activation of diabetes-mediating proteins. To provide an assay. Changes in specific DM protein expression are useful in screening methods to identify compounds that can modulate DM protein expression. Compounds that modulate the expression of one or more diabetes-mediating proteins are useful as potential therapeutic agents in the treatment or prevention of diabetes. Accordingly, one aspect of the invention determines the step of contacting a test compound with a cell or tissue that expresses one or more diabetes-mediating proteins and the effect of the test compound on the expression of one or more diabetes-mediating proteins. Features a method assay method for identifying compounds capable of modulating the expression of a diabetes-mediating protein having the steps. Determining the effect of a compound includes hybridization to a probe or other oligonucleotide, antibody recognition (eg, immunodiffusion, immunofluorescence, ELISA, RIA, blotting, immunoprecipitation, immunoelectrophoresis, or chromatography), and It can be performed by various methods known in the art, including electrophoresis. Selected from compounds that can increase the expression of one or more proteins selected from the group consisting of diabetes-mediating proteins listed in Tables 1 and 2, and from the list consisting of diabetes-mediating proteins listed in Tables 1 and 2 Compounds that can reduce the expression of one or more proteins are candidate therapeutics for the prevention or treatment of diabetes. Changes in protein expression are determined relative to expression in the absence of the test compound.

別の局面において、本発明は、糖尿病の危険性を有する被験体において糖尿病を予防するための治療方法、または治療有効量の防御糖尿病媒介タンパク質を投与することによって糖尿病の被験体における糖尿病の症状を緩和する方法を提供する。好ましくは、被験体はヒトである。本発明はまた、防御糖尿病媒介タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供することによる遺伝子治療を含む。本発明はさらに、有害糖尿病媒介タンパク質のインビボでの発現を阻害する、有効量のポリヌクレオチドを投与することによる、糖尿病の予防および／または処置のための治療方法を含む。候補の治療化合物は、表１および２のタンパク質から選択される。 In another aspect, the present invention provides a therapeutic method for preventing diabetes in a subject at risk of diabetes, or the symptoms of diabetes in a diabetic subject by administering a therapeutically effective amount of a protective diabetes-mediating protein. Provide a way to mitigate. Preferably, the subject is a human. The present invention also includes gene therapy by providing a polynucleotide encoding a protective diabetes-mediating protein. The present invention further includes therapeutic methods for the prevention and / or treatment of diabetes by administering an effective amount of a polynucleotide that inhibits the expression of harmful diabetes-mediating proteins in vivo. Candidate therapeutic compounds are selected from the proteins in Tables 1 and 2.

関連する局面において、本発明は、内因性の有害糖尿病媒介タンパク質の発現を抑制し得るかまたは低下させ得る治療有効量の化合物を投与することによる、糖尿病の危険性を有する被験体において糖尿病を予防および／または処置する治療方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、内因性の防御糖尿病媒介タンパク質の発現を誘導し得るかまたは増強し得る治療有効量の化合物を投与することによる、糖尿病の予防および／または処置のための治療方法を提供する。関連する局面において、本発明は、糖尿病媒介タンパク質の活性を調節し得る治療有効量の化合物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）を投与することによるか、または糖尿病媒介タンパク質の活性化を妨げることによる、糖尿病の危険性を有する被験体において糖尿病を予防および／または処置する治療方法を提供する。本発明の治療方法として、必要している被験体に治療薬を提供するための、当該分野で公知のエキソビボの方法が挙げられる。 In a related aspect, the present invention prevents diabetes in a subject at risk of diabetes by administering a therapeutically effective amount of a compound that can suppress or reduce the expression of endogenous harmful diabetes-mediating proteins. And / or therapeutic methods of treatment are provided. In another embodiment, the present invention provides a therapeutic for the prevention and / or treatment of diabetes by administering a therapeutically effective amount of a compound capable of inducing or enhancing expression of an endogenous protective diabetes-mediating protein. Provide a method. In a related aspect, the present invention relates to diabetes by administering a therapeutically effective amount of a compound (eg, agonist, antagonist) that can modulate the activity of a diabetes-mediating protein or by preventing activation of a diabetes-mediating protein. Therapeutic methods for preventing and / or treating diabetes in a subject at risk of: The therapeutic methods of the present invention include ex vivo methods known in the art for providing therapeutic agents to a subject in need.

本発明の１つの目的は、糖尿病の発病を媒介するタンパク質を同定することである。 One object of the present invention is to identify proteins that mediate the pathogenesis of diabetes.

本発明の１つの目的は、糖尿病媒介タンパク質の同定のためのインビボでのアッセイを提供することである。 One object of the present invention is to provide an in vivo assay for the identification of diabetes-mediating proteins.

本発明の別の目的は、被験体における糖尿病を予防、遅延、または緩和し得る試験化合物を同定するためのアッセイにおいて有用な、糖尿病媒介タンパク質を提供することである。 Another object of the present invention is to provide diabetes-mediating proteins that are useful in assays to identify test compounds that can prevent, delay or alleviate diabetes in a subject.

本発明の別の目的は、防御または有害糖尿病媒介タンパク質を同定するためのアッセイにおいて有用なトランスジェニック動物を提供することである。 Another object of the present invention is to provide transgenic animals useful in assays for identifying protective or harmful diabetes-mediating proteins.

本発明の別の目的は、糖尿病媒介タンパク質の発現に影響を与え得る試験化合物を同定するためのアッセイにおいて有用なトランスジェニック動物を提供することである。 Another object of the present invention is to provide transgenic animals useful in assays for identifying test compounds that can affect the expression of diabetes-mediating proteins.

本発明の別の目的は、天然の、または部分的にもしくは完全に人工的な糖尿病媒介遺伝子を含む、マウス、ラット、またはハムスターのようなトランスジェニック宿主哺乳動物（小さく（例えば、完全に成長した場合に１kg未満である）、そして維持が安価である）を提供することである。 Another object of the present invention is that a transgenic host mammal (such as a mouse, rat, or hamster) containing a natural, or partially or fully artificial diabetes-mediating gene (small (eg, fully grown) Is less than 1 kg in some cases) and is inexpensive to maintain.

本発明の１つの利点は、トランスジェニック哺乳動物が、現在利用可能なアッセイ方法よりも実質的により早く、より効果的に、そして安価である様式で、疾患の発症を予防または阻害し得る防御タンパク質を同定するために使用され得ることである。 One advantage of the present invention is that a protective protein that allows a transgenic mammal to prevent or inhibit the onset of disease in a manner that is substantially faster, more effective, and less expensive than currently available assay methods. Can be used to identify.

別の利点は、トランスジェニック哺乳動物が、糖尿病を罹患しているかまたは糖尿病の発症の危険性を有するヒトの処置に有効である、試験薬物に対して試験動物として使用され得ることである。 Another advantage is that the transgenic mammal can be used as a test animal against a test drug that is effective in treating a human suffering from or at risk for developing diabetes.

本発明の別の目的は、糖尿病媒介タンパク質の発現に影響を与え、そしてその疾患の発症の危険を有する被験体における糖尿病の発病を妨げ得る試験化合物を同定するため、または糖尿病の被験体における糖尿病の症状を緩和するためのアッセイを提供することである。 Another object of the present invention is to identify test compounds that affect the expression of diabetes-mediating proteins and can prevent the onset of diabetes in subjects at risk of developing the disease, or diabetes in diabetic subjects. It is to provide an assay to alleviate the symptoms of.

本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、以下および請求の範囲によってさらに完全に記載される、糖尿病媒介遺伝子（単数または複数)およびタンパク質（単数および複数）、アッセイ方法、ならびにトランスジェニックマウスの詳細を読むことによって、当業者に明らかになる。
１．糖尿病媒介性タンパク質を同定するためのインビトロ方法であって、以下の工程：
（ａ）インスリンを分泌するか、またはインスリン分泌細胞へ発達し得る細胞または組織を得る工程；
（ｂ）該細胞または組織を宿主哺乳動物に移植する工程であって、ここで該宿主哺乳動物は、糖尿病を発症する危険性がある、工程；
（ｃ）移植と糖尿病の発症との間の複数の時間で、該移植された細胞または組織を、該宿主哺乳動物から取り出す工程；
（ｄ）該取り出された細胞または組織のタンパク質発現を、分析する工程；
（ｅ）糖尿病発症の存在下のある時間での該タンパク質の発現と、糖尿病発症の不在下の該タンパク質の発現とを比較して、糖尿病の発症の結果として変化された発現を示すタンパク質を同定する工程であって、ここで該タンパク質は、糖尿病媒介性タンパク質である、工程、
を包含する、方法。
２．項目１に記載の方法であって、前記細胞が、膵臓島細胞またはβ細胞である、方法。
３．項目１に記載の方法であって、前記宿主哺乳動物が、移植された細胞と、免疫学的に適合性である、方法。
４．項目１に記載の方法であって、タンパク質発現の前記分析が、ゲル電気泳動、イムノブロッティング、質量分析、またはクロマトグラフィーによってである、方法。
５．項目４に記載の方法であって、前記電気泳動が、二次元ゲル電気泳動である、方法。
６．項目１に記載のプロセスを介して同定される、単離された糖尿病媒介性タンパク質。
７．糖尿病媒介性タンパク質であって、該タンパク質が、糖尿病不在下の同じタンパク質の発現に比べて、糖尿病発症の間に変化された発現を示すとして特徴づけられる、タンパク質。
８．項目７に記載の糖尿病媒介性タンパク質であって、該タンパク質が、表１および２に列挙されるタンパク質からなる群より選択される、タンパク質。
９．項目７に記載の糖尿病媒介性タンパク質であって、該タンパク質が、図６〜48に示されるタンパク質の質量分析の特徴を有するとして特徴づけられるタンパク質の群から選択される、タンパク質。
１０．項目７に記載のタンパク質であって、該タンパク質が、以下；
（ａ）糖尿病を発症する危険性がある被験体において糖尿病の発症に対して防御すること；
（ｂ）糖尿病を発症する危険性がある被験体において糖尿病の発病を遅延すること；または
（ｃ）糖尿病を発症する危険性がある被験体において糖尿病の症状を改善すること、を行い得るタンパク質として特徴づけられる防御的タンパク質である、タンパク質。
１１．項目７に記載のタンパク質であって、該タンパク質が、以下：
（ａ）糖尿病の発症を増強すること；
（ｂ）被験体が糖尿病を発症する危険性を増加すること；
（ｃ）糖尿病を発症する危険性がある被験体において、糖尿病の発症に必要とされる時間を減少すること；または
（ｄ）被験体の症状の重篤度を増加すること、
を行い得るとして特徴づけられる、有害なタンパク質である、タンパク質。
１２．糖尿病の発症を予測するための方法であって、以下の工程：
（ａ）試験被験体から得られたサンプルにおいて、表１に示されるタンパク質のうちの１つ以上の発現を測定する工程；
（ｂ）試験被験体から得られたサンプルにおいて、表２に示されるタンパク質のうちの１つ以上の発現を測定する工程；および
（ｃ）コントロールサンプルにおける発現に比べて、工程（ａ）および（ｂ）のタンパク質の発現を比較する工程を包含し、ここで、表１および表２のタンパク質のうちの１つ以上の変化が、糖尿病の発症の指標である、方法。
１３．項目１２に記載の方法であって、前記サンプルが、表１および表２に列挙される糖尿病媒介性タンパク質のうちの１つ以上を発現する、１つの細胞、複数の細胞、または組織のいずれかである、方法。
１４．防御的なまたは有害な糖尿病媒介性タンパク質を同定するインビトロ方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）糖尿病媒介性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、該ポリヌクレオチドがタンパク質として発現される条件下で、細胞をトランスフェクトする工程；および
（ｂ）該細胞に対する、該発現されたタンパク質の影響を決定する工程を包含し、該影響は、サイトカインの不在下または存在下で、１つ以上の細胞機能の変化として測定され、該細胞機能は、一酸化窒素（NO）生成、インスリン分泌、細胞生存、タンパク質発現、および細胞傷害性のうちの１つ以上である、方法。
１５．防御的なまたは有害な糖尿病媒介性タンパク質を同定するインビボ方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該タンパク質が発現される条件下で、糖尿病媒介性タンパク質を発現するトランスジェニック哺乳動物を作製する工程；および
（ｂ）糖尿病発病の発症およびタイミングに対する、該タンパク質の発現の影響を決定する工程を包含し、防御的なタンパク質は、糖尿病の危険性がある患者において、糖尿病の発症を、防止、阻害、または遅延するタンパク質であり、および有害なタンパク質は、糖尿病を発症する危険性がある患者において、糖尿病の発症を引き起こす、糖尿病発症の危険性を増加する、重篤度を増加する、または糖尿病の発症に必要とされる時間を減少する、タンパク質である、方法。
１６．外因性の糖尿病媒介性タンパク質の導入遺伝子を含有する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
１７．化合物をスクリーニングするためのアッセイ方法であって、該化合物は、糖尿病媒介性タンパク質の発現を達成し得、以下の工程：
（ａ）項目１６に記載のトランスジェニック哺乳動物に、試験化合物を投与する、工程；
（ｂ）糖尿病の発症の発病率およびタイミングに対する、該化合物の効果を測定する工程を包含し、該化合物は、該タンパク質の発現を、阻害、減少、誘導、または増加する、方法。
１８．項目１７に記載のアッセイ方法によって同定される化合物であって、以下：
（ａ）内因性の防御的なタンパク質の発現を、誘導または増強すること；または
（ｂ）有害な糖尿病媒介性タンパク質の発現を、抑制または阻害すること；によって特徴づけられ、ここで該化合物は、糖尿病の発症の危険性がある患者において糖尿病の発症を、遅延または防止し得る、化合物。
１９．糖尿病または糖尿病関連性の異常を処置または防止するための方法であって、糖尿病を発症する危険性がある患者において、糖尿病の発症を防止または遅延し得る化合物、または糖尿病の被験体において糖尿病の症状を改善し得る化合物を投与する工程を包含する、方法。
２０．項目１９に記載の方法であって、前記化合物が、アンチセンス配列である、方法。
２１．項目１９に記載の方法であって、前記化合物が糖尿病媒介性タンパク質抗体に対して抗体特異的である、方法。
２２．項目１９に記載の方法であって、前記化合物が、糖尿病媒介性タンパク質である、方法。
２３．項目２２に記載の方法であって、前記糖尿病媒介性タンパク質が、表１および表２のタンパク質の群から選択される、方法。
２４．項目１９に記載の方法であって、前記化合物が、糖尿病媒介性タンパク質の発現を増強または増加する、方法。
２５．項目１９に記載の方法であって、前記化合物が、糖尿病媒介性タンパク質の発現を阻害または減少する、方法。
２６．項目２５に記載の方法であって、前記化合物が、糖尿病媒介性タンパク質のインビボ発現を阻害する、方法。
２７．糖尿病媒介性タンパク質の活性を調節し得る化合物を同定するための方法であって、糖尿病媒介性タンパク質の活性を調節し得ることが推測される試験化合物で、細胞、組織、または動物を処置する工程、および１つ以上の糖尿病媒介性タンパク質の活性に対する、該化合物の効果を決定する工程を、包含する、方法。 These and other objects, advantages, and features of the present invention are described more fully by the following and claims, diabetes-mediating gene (s) and protein (s), assay methods, and transgenics It will be apparent to one skilled in the art upon reading the details of the mouse.
1. An in vitro method for identifying a diabetes-mediating protein comprising the following steps:
(A) obtaining a cell or tissue that secretes insulin or can develop into insulin secreting cells;
(B) transplanting the cells or tissues into a host mammal, wherein the host mammal is at risk of developing diabetes;
(C) removing the transplanted cells or tissues from the host mammal at multiple times between transplantation and the onset of diabetes;
(D) analyzing the protein expression of the removed cells or tissues;
(E) comparing the expression of the protein at a certain time in the presence of the onset of diabetes with the expression of the protein in the absence of the onset of diabetes to identify a protein that exhibits altered expression as a result of the onset of diabetes Wherein the protein is a diabetes-mediating protein,
Including the method.
2. The method according to item 1, wherein the cell is a pancreatic islet cell or a β cell.
3. The method of item 1, wherein the host mammal is immunologically compatible with the transplanted cells.
4). 2. The method of item 1, wherein the analysis of protein expression is by gel electrophoresis, immunoblotting, mass spectrometry, or chromatography.
5. Item 5. The method according to Item 4, wherein the electrophoresis is two-dimensional gel electrophoresis.
6). An isolated diabetes-mediating protein identified through the process of item 1.
7). A diabetes-mediating protein, wherein the protein is characterized as exhibiting altered expression during the onset of diabetes compared to the expression of the same protein in the absence of diabetes.
8). 8. A diabetes-mediating protein according to item 7, wherein the protein is selected from the group consisting of the proteins listed in Tables 1 and 2.
9. 50. A diabetes-mediating protein according to item 7, wherein the protein is selected from the group of proteins characterized as having the mass spectrometric characteristics of the proteins shown in FIGS.
10. Item 8. The protein according to item 7, wherein the protein is the following:
(A) protecting against the development of diabetes in a subject at risk of developing diabetes;
(B) as a protein that can delay the onset of diabetes in a subject at risk of developing diabetes; or (c) ameliorate the symptoms of diabetes in a subject at risk of developing diabetes. A protein that is a defensive protein that is characterized.
11. Item 8. The protein of item 7, wherein the protein is:
(A) enhancing the onset of diabetes;
(B) increasing the risk that the subject will develop diabetes;
(C) reducing the time required to develop diabetes in a subject at risk of developing diabetes; or (d) increasing the severity of a subject's symptoms;
A protein that is a harmful protein characterized as being able to perform
12 A method for predicting the onset of diabetes, comprising the following steps:
(A) measuring the expression of one or more of the proteins shown in Table 1 in a sample obtained from the test subject;
(B) measuring the expression of one or more of the proteins shown in Table 2 in a sample obtained from the test subject; and (c) comparing the expression in the control sample with steps (a) and ( b) comparing the expression of the protein of b, wherein a change in one or more of the proteins of Tables 1 and 2 is an indicator of the onset of diabetes.
13. 13. The method of item 12, wherein the sample expresses one or more of the diabetes-mediating proteins listed in Table 1 and Table 2, one cell, a plurality of cells, or a tissue Is that way.
14 An in vitro method for identifying a protective or harmful diabetes-mediating protein comprising the following steps:
(A) transfecting a cell with a polynucleotide encoding a diabetes-mediating protein under conditions such that the polynucleotide is expressed as a protein; and (b) of the expressed protein against the cell. Determining the effect, wherein the effect is measured as a change in one or more cellular functions in the absence or presence of cytokines, the cellular function comprising nitric oxide (NO) production, insulin secretion, A method that is one or more of cell survival, protein expression, and cytotoxicity.
15. An in vivo method for identifying a protective or harmful diabetes-mediating protein comprising the following steps:
(A) producing a transgenic mammal that expresses a diabetes-mediating protein under conditions under which the protein is expressed; and (b) determining the effect of expression of the protein on the onset and timing of diabetes development. The process includes a protective protein is a protein that prevents, inhibits or delays the development of diabetes in patients at risk of diabetes, and a harmful protein is at risk of developing diabetes A method that is a protein that causes the onset of diabetes, increases the risk of developing diabetes, increases the severity, or reduces the time required for the development of diabetes in a patient.
16. A transgenic non-human mammal containing a transgene of an exogenous diabetes-mediating protein.
17. An assay method for screening a compound, wherein the compound is capable of achieving diabetes-mediated protein expression and comprises the following steps:
(A) administering the test compound to the transgenic mammal according to item 16;
(B) a method comprising measuring the effect of the compound on the incidence and timing of the onset of diabetes, wherein the compound inhibits, decreases, induces or increases the expression of the protein.
18. A compound identified by the assay method of item 17, comprising:
Characterized by (a) inducing or enhancing the expression of endogenous defensive proteins; or (b) suppressing or inhibiting the expression of deleterious diabetes-mediated proteins, wherein the compound is A compound that can delay or prevent the onset of diabetes in a patient at risk of developing diabetes.
19. A method for treating or preventing diabetes or diabetes-related abnormalities, a compound capable of preventing or delaying the onset of diabetes in a patient at risk of developing diabetes, or symptoms of diabetes in a diabetic subject Administering a compound capable of improving
20. 20. The method according to item 19, wherein the compound is an antisense sequence.
21. 20. A method according to item 19, wherein the compound is antibody specific to a diabetes-mediating protein antibody.
22. 20. The method according to item 19, wherein the compound is a diabetes-mediating protein.
23. 23. The method of item 22, wherein the diabetes-mediating protein is selected from the group of proteins in Table 1 and Table 2.
24. 20. The method according to item 19, wherein the compound enhances or increases the expression of diabetes-mediating protein.
25. 20. The method according to item 19, wherein the compound inhibits or reduces the expression of diabetes-mediating protein.
26. 26. The method of item 25, wherein the compound inhibits in vivo expression of a diabetes-mediated protein.
27. A method for identifying a compound capable of modulating the activity of a diabetes-mediating protein, comprising treating a cell, tissue or animal with a test compound suspected of being able to modulate the activity of a diabetes-mediating protein And determining the effect of the compound on the activity of one or more diabetes-mediating proteins.

好ましい実施態様の詳細な説明
アッセイで使用される本発明の糖尿病媒介タンパク質および遺伝子、アッセイ方法論、およびトランスジェニックが記載される前に、本発明が、記載される特定のアッセイ方法、糖尿病媒介タンパク質および遺伝子、試験化合物、またはトランスジェニック哺乳動物には限定されず、従って、方法、遺伝子、調製物、および動物は、もちろん、変更し得ることが理解されべきである。本明細書中で使用される用語は、特定の実施態様のみを記載する目的のためであり、そして、本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ制限されるので、限定することを意図しないこともまた理解される。 DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Before the diabetes-mediating proteins and genes of the invention used in the assay, assay methodologies, and transgenics are described, the present invention describes the specific assay methods, diabetes-mediating proteins and It is to be understood that the methods, genes, preparations, and animals are of course variable, not limited to genes, test compounds, or transgenic mammals. The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting, as the scope of the invention is limited only by the appended claims. It is also understood.

本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「an」、および「the」は、文脈で他に明らかに指示されない限りは複数の意味を含む。従って、例えば、「糖尿病媒介タンパク質（diabete-mediatingprotein）」または「糖尿病媒介タンパク質（a diabete-mediating protein）」に関しては、このような糖尿病媒介タンパク質の混合物を含み、「処方物（theformulation）」または「方法（the method）」に関しては、１つ以上の処方物、方法、ならびに／あるいは本明細書中で記載される型の工程および／または本開示を読んで、その結果、当業者に明らかである工程を含む。 As used herein and in the appended claims, the singular forms “a”, “an”, and “the” include plural meanings unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “diabete-mediating protein” or “a diabetes-mediating protein” includes mixtures of such diabetes-mediating proteins, including “theformulation” or “ With respect to "the method", one or more formulations, methods, and / or steps of the type described herein and / or the present disclosure will be read and as a result will be apparent to those skilled in the art. Process.

他に規定されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術および科学的な用語は、本発明が属する分野で当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が、ここで記載される。本明細書中で記載される全ての刊行物が、開示を参照して本明細書中に参考として援用され、そして引用される刊行物と組合わせて方法および／または材料を記載する。 Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods and materials are now described. All publications mentioned in this specification are herein incorporated by reference with reference to the disclosure and describe the methods and / or materials in combination with the publications cited.

定義
用語「タンパク質」は、全ての翻訳後の改変体（例えば、プロセシング、短縮、グリコシル化、またはリン酸化）を含む、タンパク質、ポリペプチド、およびアミノ酸の鎖であるペプチドを含み、これはしばしば、タンパク質機能の調節において決定的な役割を果たす。この用語はまた、天然のタンパク質、ならびに合成または組換えタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを含む。 Definitions The term “protein” includes proteins, polypeptides, and peptides that are chains of amino acids, including all post-translational variants (eg, processing, truncation, glycosylation, or phosphorylation), which are often It plays a crucial role in the regulation of protein function. The term also includes natural proteins, as well as synthetic or recombinant proteins, polypeptides, and peptides.

用語「糖尿病」は、インシュリン依存型糖尿症（IDDM）およびＩ型糖尿病を含む。用語「糖尿病関連疾患」は、肥満、循環系の不全、インシュリン耐性、Ｘ症候群、糖尿病網膜症、糖尿病神経障害、ならびに神経障害およびアテローム性動脈硬化症における進行した糖化最終産物（advancedglycation end products、AGE）の併発のような症状を含む。 The term “diabetes” includes insulin-dependent diabetes (IDDM) and type I diabetes. The term “diabetes-related disease” refers to obesity, circulatory failure, insulin resistance, syndrome X, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, and advanced glycation end products (AGE) in neuropathy and atherosclerosis. ) And other symptoms.

用語「糖尿病媒介タンパク質」は、糖尿病の発症に関連するタンパク質を意味する。糖尿病媒介タンパク質は、糖尿病の発症の間に変化した発現を示すタンパク質であり、すなわち、糖尿病が発症していないときの同じタンパク質の発現と比較して、糖尿病の発症の間に、アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされるタンパク質、またはその発現が上方調節または下方調節されるタンパク質である。糖尿病媒介タンパク質はまた、糖尿病または糖尿病関連疾患の発達に付随して改変されるタンパク質も意味する。さらに、インターロイキン1α（IL-1α）は、インシュリンを分泌するランゲルハンス島に対して、インビボおよびインビトロの両方で有害な影響を有し、そして糖尿病の発症において主要な役割を果たすと予想される。島の処置は、それらの発現をアップまたはダウンレギュレートする106個のタンパク質の改変を生じる。本発明の目的のために、用語「糖尿病媒介タンパク質」は、米国仮出願第60/029,324号、（1996年10月25日出願）、同第60/030,186号（1996年11月５日出願）、および同第60/030,088号（1996年11月５日出願）（これらの全ての内容が本明細書中で参考として援用される）にさらに記載されるように、インビトロでラットの島においてIL-αによって調節されることが示されている全てのタンパク質（およびそれらの改変産物の全て）もまた含むと定義される。 The term “diabetes-mediating protein” means a protein associated with the development of diabetes. Diabetes-mediating proteins are proteins that show altered expression during the onset of diabetes, i.e., are up-regulated during the onset of diabetes compared to the expression of the same protein when no diabetes is onset. Or a protein that is down-regulated or whose expression is up- or down-regulated. Diabetes-mediating protein also means a protein that is altered in connection with the development of diabetes or diabetes-related diseases. Furthermore, interleukin 1α (IL-1α) has a deleterious effect both in vivo and in vitro on the islet that secretes insulin and is expected to play a major role in the development of diabetes. Islet treatment results in 106 protein modifications that up or down regulate their expression. For the purposes of the present invention, the term “diabetes-mediating protein” refers to US Provisional Application Nos. 60 / 029,324, (filed Oct. 25, 1996), 60 / 030,186 (filed Nov. 5, 1996). , And 60 / 030,088 (filed Nov. 5, 1996), the contents of all of which are incorporated herein by reference, in vitro in rat islets. All proteins that have been shown to be regulated by -α (and all of their modifications) are also defined to include.

用語「タンパク質改変」は、タンパク質の構造における任意の変化（例えば、定性的変化）を含む。このような改変体は、アミノ酸配列における変化、転写または翻訳のスプライシング変異体、DNAまたはRNA配列に対する翻訳前または翻訳後改変体、DNA、RNA、またはタンパク質に対する巨大分子または低分子（例えば、当該分野で周知のペプチド、イオン、ビタミン、原子、糖含有分子、脂質含有分子、低分子など）の付加を含み得るが、これらに限定されない。 The term “protein modification” includes any change in the structure of a protein (eg, a qualitative change). Such variants include alterations in amino acid sequence, transcriptional or translational splicing variants, pre- or post-translational variants to DNA or RNA sequences, macromolecules or small molecules to DNA, RNA, or proteins (eg, the art (Including but not limited to peptides, ions, vitamins, atoms, sugar-containing molecules, lipid-containing molecules, small molecules, etc.).

本発明のタンパク質改変体の１つの型は、アミノ酸配列の１つ以上の変化（置換、欠失、または挿入）による。このような変化は、１つ以上のアミノ酸での、荷電したアミノ酸から別の荷電したアミノ酸への変化、荷電していないアミノ酸から荷電したアミノ酸への変化、荷電したアミノ酸から荷電していないアミノ酸への変化（例えば、pIまたは可能な分子量における差異を生じさせる）を含み得る。アミノ酸配列における任意の他の変化もまた、本発明に含まれ得る。荷電したアミノ酸配列を有する改変したタンパク質のゲル中での全体的な位置変化はまた、当該分野で公知であるように、タンパク質中に存在する全電荷の数に依存する。ゲルの分解能の変更（例えば、ゲルのpHまたは他の勾配成分における変更）は、主要なまたは主要でないアミノ酸配列の変化の検出を可能にし得る。この型の分析はまた、例えば、配列決定、質量スペクトル、標識抗体の結合を使用して、どのような変化が検出されるかに影響を与え得る。 One type of protein variant of the invention is due to one or more changes (substitutions, deletions or insertions) in the amino acid sequence. Such changes can be from one charged amino acid to another charged amino acid, from an uncharged amino acid to a charged amino acid, from a charged amino acid to an uncharged amino acid at one or more amino acids. Changes (eg, causing differences in pI or possible molecular weight). Any other changes in the amino acid sequence can also be included in the present invention. The overall positional change in a gel of a modified protein having a charged amino acid sequence also depends on the total number of charges present in the protein, as is known in the art. Changes in gel resolution (eg, changes in gel pH or other gradient components) may allow detection of major or minor amino acid sequence changes. This type of analysis can also affect what changes are detected using, for example, sequencing, mass spectra, binding of labeled antibodies.

別の型の改変は、細胞内でオープンリーディングフレームが読まれる方法に影響を与える、タンパク質をコードするDNAまたはRNAの長さ、構造、または方向における変化による。これは、ゲル上のスポットの位置において大きな変化を生じ得、そしてタンパク質型およびゲル中での位置の分析に影響を与え得る。 Another type of modification is due to changes in the length, structure, or orientation of the DNA or RNA encoding the protein that affect how the open reading frame is read in the cell. This can cause a large change in the position of the spot on the gel and can affect the analysis of protein type and position in the gel.

別の型のタンパク質の改変は、細胞内でのタンパク質のプロセスにおける変化による。限定的でない例は、いくつかのタンパク質が「アドレス標識」を有する（ここでは、細胞の内部（または外部）でそれらが使用されるのを特定する）。このような標識またはタグは、タンパク質に付加するかまたはタンパク質から取り出して、タンパク質が細胞内のどこに位置するかを決定する場合、ペプチド、糖、または脂質の形態であり得る。 Another type of protein modification is due to changes in the process of the protein within the cell. A non-limiting example is that some proteins have an “address tag” (which specifies that they are used inside (or outside) the cell). Such a label or tag can be in the form of a peptide, sugar, or lipid when added to or removed from the protein to determine where the protein is located in the cell.

さらなる型のタンパク質の改変は、他の巨大分子のタンパク質への付着による。この群は、このような巨大分子の任意の付加／除去を含み得るが、これらに限定されない。これらの分子は、多くの型であり得、そして永久的または一時的のいずれかであり得る。例として、以下が挙げられる：（ｉ）ポリリボシル化；（ii）DNA／RNA（一本鎖または二本鎖）；（iii）脂質およびリン脂質（例えば、膜付着物）；（iV）糖類／多糖；ならびに（ｖ）グリコシル化（多数の変異体の可能性を増大させるような、多数の種々の型の糖およびシアル酸−種々の一本鎖および分岐構造、の付加）。 Further types of protein modifications are due to the attachment of other macromolecules to the protein. This group may include, but is not limited to, any addition / removal of such macromolecules. These molecules can be of many types and can be either permanent or temporary. Examples include: (i) polyribosylation; (ii) DNA / RNA (single stranded or double stranded); (iii) lipids and phospholipids (eg, membrane deposits); (iV) saccharide / Polysaccharides; and (v) glycosylation (addition of a number of different types of sugars and sialic acids—various single chain and branched structures, such as to increase the likelihood of a number of variants).

別の型のタンパク質の改変は、他の低分子のタンパク質への付着による。例として、以下が挙げられれるが、これらに限定されない：（ｉ）リン酸化；（ii）アセチル化；（iii）ウリジル化；（iv）アデニル化；（ｖ）メチル化、および（vi）キャッピング（分類の理由のために、タンパク質のＮ末端の複雑な改変を区別する）。これらの変化のほとんどはしばしば、タンパク質の活性を調節するために使用される。（ｖ）および（vi）はまた、タンパク質自体の半減期を変更するために使用される。これらのタンパク質の変化は、いくつかの方法（例えば、標識、pIの変化、抗体、または当該分野で公知の分子自体に指向する他の特異的技術）を使用して2Dによって検出され得る。分子量の変化は、2DGEによって検出され得るが、必ずしもそうでなくても良く、MALD（逃避質量分析法のマトリックス補助レーザー放出、matrixassisted laser desorption of flight mass spectrometry）が、これらの改変を検出および特徴づけるために好ましい。 Another type of protein modification is by attachment of other small molecules to the protein. Examples include, but are not limited to: (i) phosphorylation; (ii) acetylation; (iii) uridylation; (iv) adenylation; (v) methylation, and (vi) capping. (For classification reasons, distinguish complex modifications at the N-terminus of proteins). Most of these changes are often used to regulate protein activity. (V) and (vi) are also used to change the half-life of the protein itself. These protein changes can be detected by 2D using a number of methods, such as labels, pi changes, antibodies, or other specific techniques directed to the molecule itself known in the art. Changes in molecular weight can be detected by 2DGE, but this is not always the case, and MALD (matrix assisted laser desorption of flight mass spectrometry) detects and characterizes these modifications Therefore, it is preferable.

用語「発現」は、タンパク質の生理的な発現だけではなく、発現されたタンパク質の活性の測定も含むことを意味する。例えば、タンパク質は、不活性な形態で発現され得、これは、リン酸化によって活性化される。タンパク質の実際の発現は変化しないが、その有効な発現（活性）は改変されている。ゲル上では、活性における変化が、改変された形態のタンパク質の発現の変化として測定され得る。 The term “expression” is meant to include not only physiological expression of a protein, but also measurement of the activity of the expressed protein. For example, the protein can be expressed in an inactive form, which is activated by phosphorylation. Although the actual expression of the protein does not change, its effective expression (activity) has been altered. On the gel, changes in activity can be measured as changes in the expression of the modified form of the protein.

用語「影響を受けたタンパク質」は、発現において改変されたタンパク質または構造的に改変されたタンパク質を意味する。従って、影響を受けたタンパク質は、その発現が、タンパク質が由来する細胞内または細胞外での、１つ以上の化合物での処置、疾患状態もしくは病理学的状態、および／または免疫学的変化によって改変された、タンパク質であり得る。あるいはまたはさらに、影響されたタンパク質はまた、アップレギュレートされたかまたはダウンレギュレートされた変化した発現を示すタンパク質、またはその発現が、このような処置、疾患、もしくは免疫学的変化の非存在下での同じタンパク質（すなわち、「影響を受けていないタンパク質」）の発現と比較して、本発明の方法によっては検出され得ない任意の方法で構造が改変されているタンパク質であり得る。 The term “affected protein” means a protein that is altered in expression or a protein that is structurally altered. Thus, an affected protein is expressed by treatment with one or more compounds, disease state or pathological state, and / or immunological changes in or outside the cell from which the protein is derived. It can be a modified protein. Alternatively or additionally, the affected protein can also be an up-regulated or down-regulated protein exhibiting altered expression, or expression thereof in the absence of such treatment, disease, or immunological changes. As compared to the expression of the same protein in (ie, an “unaffected protein”) can be a protein whose structure has been altered in any way that cannot be detected by the methods of the invention.

用語「糖尿病媒介遺伝子またはポリペプチド」は、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子物質を意味し、これは、完全な糖尿病媒介タンパク質または糖尿病媒介タンパク質のフラグメントをコードする。この用語は、糖尿病媒介タンパク質をコードする任意の種由来の任意の遺伝子を含む。糖尿病媒介遺伝子またはポリヌクレオチドは、天然に存在し得るか、または部分的もしくは全部が合成であり得る。 The term “diabetes-mediating gene or polypeptide” means genetic material that encodes a protein, peptide, or fragment of a protein, which encodes a complete diabetes-mediating protein or a fragment of a diabetes-mediating protein. The term includes any gene from any species that encodes a diabetes-mediating protein. The diabetes-mediating gene or polynucleotide can be naturally occurring or partly or wholly synthetic.

ポリペプチドについて言及する場合、用語「実質的に純粋」は、少なくとも60重量％が、タンパク質および天然に存在する有機分子（天然に付随する）を含まない、ポリペプチドを意味する。実質的に純粋な糖尿病媒介タンパク質は、少なくとも75％重量が、より好ましくは、少なくとも90重量％が、そして最も好ましくは、少なくとも99重量％が、糖尿病媒介タンパク質である。実質的に純粋な糖尿病媒介タンパク質は、天然の供給源から抽出によって；糖尿病媒介タンパク質をコードする組換え核酸の発現によって、またはタンパク質の化学的合成によって得ることができる。純度は、任意の適切な方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析）によって測定され得る。 When referring to a polypeptide, the term “substantially pure” means a polypeptide that is at least 60% by weight free of protein and naturally occurring organic molecules (naturally associated). A substantially pure diabetes-mediating protein is at least 75% by weight, more preferably at least 90% by weight, and most preferably at least 99% by weight is a diabetes-mediating protein. A substantially pure diabetes-mediating protein can be obtained by extraction from a natural source; by expression of a recombinant nucleic acid encoding the diabetes-mediating protein, or by chemical synthesis of the protein. Purity can be measured by any appropriate method (eg, column chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, or HPLC analysis).

本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」は、大きな構築物の別々のフラグメントまたは成分の形態における、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの核酸配列をいう。本発明のポリペプチドの一部または全てをコードするDNAは、組換え転写ユニット中で発現され得る合成遺伝子を提供する、cDNAフラグメントからまたはオリゴヌクレオチドから組み立てられ得る。本発明のポリヌクレオチド配列は、DNA、RNA、およびcDNA配列を含み、そして天然の供給源または当該分野で公知の方法によって合成される合成配列由来であり得る。 As used herein, “polynucleotide” refers to a nucleic acid sequence of deoxyribonucleotides or ribonucleotides in the form of separate fragments or components of a large construct. DNA encoding some or all of the polypeptides of the invention can be assembled from cDNA fragments or from oligonucleotides that provide a synthetic gene that can be expressed in a recombinant transcription unit. The polynucleotide sequences of the present invention include DNA, RNA, and cDNA sequences and can be derived from natural sources or synthetic sequences synthesized by methods known in the art.

本明細書中で使用される「単離された」ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが由来する生物の天然に存在するゲノム中で、そのポリヌクレオチドがすぐに連続する（すなわち、共有結合する）コード配列のいずれとも（すなわち、一方は5'末端で、そして他方は3'末端で）すぐに連続しない、ポリヌクレオチドである。従って、この用語は、例えば、ベクター、自律複製性プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み込まれる組換えポリヌクレオチド、あるいは他の配列とは独立して別々の分子として存在する組換えポリヌクレオチドを含む。これはまた、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である、組換えDNAを含む。 As used herein, an “isolated” polynucleotide is a code in which the polynucleotide is immediately contiguous (ie, covalently linked) in the naturally occurring genome of the organism from which the polynucleotide is derived. A polynucleotide that is not immediately contiguous with either of the sequences (ie, one at the 5 ′ end and the other at the 3 ′ end). Thus, the term exists as a separate molecule independent of, for example, a vector, an autonomously replicating plasmid or virus, or a recombinant polynucleotide that is integrated into prokaryotic or eukaryotic genomic DNA, or other sequences. A recombinant polynucleotide. This also includes recombinant DNA that is part of a hybrid gene encoding additional polypeptide sequences.

本発明の単離されたおよび精製されたポリヌクレオチド配列はまた、本明細書中で特定されたポリヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列間の特異性を保証する、ハイブリダイゼーション条件を意味する。当業者は、非特異的ハイブリダイゼーションの数を減少させ、その結果、高度に相補的な配列のみが同定される、温度および塩濃度を含むハイブリダイゼーション後の洗浄条件を選択し得る（Sambrookら、Molecular Cloning、第２版；Cold Spring Harbor Laboratory Press、ColdSpring Harbor，NY（1989）、本明細書中で参考として特に援用される）。例えば、このような条件は、特殊化された条件下でのハイブリダイゼーション（例えば、5×SSC中での予備浸透、ならびに20％ホルムアミド、5×デンハルト溶液、50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）、および50μgの変性した超音波処理ウシ胸腺DNA溶液中で約40℃にて１時間の予備ハイブリダイゼーション、続く100μMのATPを補充した同じ溶液中で約40℃にて18時間のハイブリダイゼーションを含む）である（Sambrookら、前出（1989)）。本発明の単離および精製されたポリヌクレオチド配列はまた、糖尿病媒介タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的な配列（アンチセンス配列）およびリボザイムを含む。 Isolated and purified polynucleotide sequences of the present invention also include polynucleotide sequences that hybridize under stringent conditions to the polynucleotide sequences identified herein. The term “stringent conditions” refers to hybridization conditions that ensure specificity between hybridizing polynucleotide sequences. One skilled in the art can select post-hybridization wash conditions including temperature and salt concentration that reduce the number of non-specific hybridization so that only highly complementary sequences are identified (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), specifically incorporated herein by reference). For example, such conditions include hybridization under specialized conditions (eg pre-penetration in 5 × SSC, as well as 20% formamide, 5 × Denhardt's solution, 50 mM sodium phosphate, pH 6.8). And prehybridization for 1 hour at about 40 ° C. in 50 μg of denatured sonicated bovine thymus DNA solution, followed by 18 hours of hybridization at about 40 ° C. in the same solution supplemented with 100 μM ATP. (Sambrook et al., Supra (1989)). Isolated and purified polynucleotide sequences of the present invention also include sequences complementary to polynucleotides encoding diabetes-mediating proteins (antisense sequences) and ribozymes.

用語「宿主動物」および「宿主哺乳動物」は、ドナー細胞が移植される動物を記載するために使用される。簡便な宿主動物として、マウス、ハムスター、およびラットが挙げられる。 The terms “host animal” and “host mammal” are used to describe an animal into which donor cells are transplanted. Convenient host animals include mice, hamsters, and rats.

用語「除去された糖尿病媒介タンパク質遺伝子」、「破壊された糖尿病媒介遺伝子」などは、遺伝子を非作動性にするような様式で変更（例えば、ヌクレオチドの付加および／または除去）されている、内因性の糖尿病媒介タンパク質遺伝子を意味するように、本明細書中で互換的に使用される。これはまた、それらもまた遺伝子を非作動性にする、制御配列または調節遺伝子の除去または改変を含むように使用される。 The terms “ablated diabetes-mediating protein gene”, “disrupted diabetes-mediating gene”, etc., are endogenous, altered (eg, addition and / or removal of nucleotides) in a manner that renders the gene inoperable. Is used interchangeably herein to mean the sex diabetes-mediating protein gene. This is also used to include the removal or modification of regulatory sequences or regulatory genes that also render the gene inoperable.

用語「糖尿病の発症の増大した危険性」などは、遺伝的に糖尿病を発症する傾向があり、好ましくは、50％よりも大きい危険性、より好ましくは、60％より大きい危険性、なおさらに好ましくは、70％より大きい危険性、なおさらに好ましくは、80％より大きい危険性、そして最も好ましくは90％より大きい糖尿病の発症の危険性を有する動物を意味する。 The terms "increased risk of developing diabetes" etc. tend to genetically develop diabetes, preferably greater than 50% risk, more preferably greater than 60% risk, even more preferred Means an animal at risk of greater than 70%, even more preferably greater than 80%, and most preferably greater than 90% risk of developing diabetes.

「変化したタンパク質」または「変化したタンパク質発現」は、糖尿病の発症の間にその発現が増大される（「アップレギュレート」）、減少される（「ダウンレギュレート」）、阻害される（すなわち、オフにされる）または誘導される（すなわち、オンにされる）タンパク質を意味する。 An “altered protein” or “altered protein expression” is increased (“upregulated”), decreased (“downregulated”), or inhibited (ie, altered during the onset of diabetes). , Turned off) or induced (ie turned on).

用語「活性を調節する」などは、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、として、その通常の活性を妨げるかまたは増強するようにタンパク質の活性を変化させること、あるいは、タンパク質の活性に必要とされる翻訳後の改変工程をブロックすることによりタンパク質の活性を変化させることを意味する。 The term “modulate activity” or the like, for example, as an agonist, antagonist, alters the activity of a protein to prevent or enhance its normal activity, or post-translation required for protein activity It means that the activity of the protein is changed by blocking the modification step.

用語「有効量」または「治療有効量」は、所望の生理学的効果（例えば、糖尿病の発症の抑制または遅延）を得るために十分な化合物の量を意味する。 The term “effective amount” or “therapeutically effective amount” means an amount of a compound sufficient to obtain a desired physiological effect (eg, suppression or delay of the onset of diabetes).

本明細書中で使用される用語「処置」、「処置する」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般に意味する。この効果は、これらの疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防することに関して予防的であり得、そして／あるいは疾患および／または疾患に寄与する有害な影響を部分的、または完全に治癒することに関して治療的であり得る。本明細書中で使用される「処置」は、哺乳動物（特に、ヒト）における疾患の任意の処置を含み、そして以下を含む：
（ａ）疾患の傾向があり得るがまだ疾患を有するとは診断されていない被験体において、疾患の発病を予防すること；
（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること；または
（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退行を生じること。本発明は、糖尿病、および糖尿病に媒介される関連する状態、インシュリン不全症、またはインシュリン耐性を発症しているかまたはその危険性を有する患者を処置することに関する。より詳細には、「処置」は、糖尿病の危険性を有するかまたは糖尿病を罹患している患者に、治療的に検出可能なそして有用な効果を提供することを意味することが意図される。 The terms “treatment”, “treating” and the like as used herein generally mean obtaining a desired pharmacological and / or physiological effect. This effect may be prophylactic with respect to completely or partially preventing these diseases or their symptoms and / or partially or completely cure the adverse effects contributing to the disease and / or disease. Can be therapeutic in terms of “Treatment” as used herein includes any treatment of disease in mammals, particularly humans, and includes the following:
(A) preventing the onset of the disease in a subject who may be prone to the disease but has not yet been diagnosed as having the disease;
(B) inhibit the disease, ie prevent its onset; or (c) alleviate the disease, ie cause regression of the disease. The present invention relates to treating diabetes and related conditions mediated by diabetes, insulin insufficiency, or resistance to or at risk for insulin resistance. More specifically, “treatment” is intended to mean providing a therapeutically detectable and useful effect to a patient at risk of diabetes or suffering from diabetes.

「処置」は、治療的処置、および予防的（prophylactic）または予防的（preventative）測定の両方をいい、ここで、その目的は、疾患の発症を妨げるかまたは遅延させることである。処置を必要とするものとして、障害をすでに有しているもの、および障害を有する傾向にあるもの、または障害が予防されているものが挙げられる。 “Treatment” refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures, where the purpose is to prevent or delay the onset of the disease. Those in need of treatment include those already having the disorder and those prone to have the disorder or those in whom the disorder has been prevented.

用語「相乗」「相乗効果」などは、１つ以上の治療薬を併用することによって得られる、改善された処置効果を記載するように本明細書中で使用される。いくつかの分野での相乗効果は足し算以上の（例えば、１＋１＝３）効果を意味するが、医療の分野では、足し算（１＋１＝２）または足し算未満の（例えば、１＋１＝1.6）効果が相乗的であり得る。例えば、2つの薬物のそれぞれが、個体に与えられた場合に50％までの糖尿病の発症を阻害する場合、併用された２つの薬物が糖尿病の発症を完全に停止することは期待できない。多くの例において、受容できない副作用のために、２つの薬物は一緒に投与し得ない。他の例において、一緒に投与された場合、薬物は互いに相殺し、50％未満の糖尿病の発症を遅延させる。従って相乗効果は、２つの薬物が50％より多くの糖尿病の発症を遅延させるが、受容できない有害な副作用の増大を伴わない場合に得られると言われる。 The terms “synergistic”, “synergistic effect” and the like are used herein to describe an improved treatment effect obtained by combining one or more therapeutic agents. Synergistic effects in some areas mean more than addition (eg, 1 + 1 = 3) effects, but in the medical field, addition (1 + 1 = 2) or less than addition (eg, 1 + 1 = 1.6) effects are synergistic Can be For example, if each of the two drugs inhibits the development of diabetes by up to 50% when given to an individual, it cannot be expected that the two drugs combined will completely stop the development of diabetes. In many instances, the two drugs cannot be administered together due to unacceptable side effects. In other instances, when administered together, the drugs offset each other and delay the onset of diabetes by less than 50%. Thus, synergistic effects are said to be obtained when the two drugs delay the onset of diabetes by more than 50%, but without an unacceptable increase in adverse side effects.

本明細書中で使用される略語として以下が挙げられる：IDDM＝インシュリン依存性糖尿症；BB-DP＝糖尿病の傾向がある人工交配（Bio-Breeding）ラット；NOD＝非肥満糖尿病マウス。 Abbreviations used herein include the following: IDDM = insulin dependent diabetes; BB-DP = bio-breeding rats prone to diabetes; NOD = non-obese diabetic mice.

発明の一般的な局面
本発明は、以下のいくつかの局面を含む：（１）糖尿病の発症の存在下および非存在下での異なる発現によって同定される、糖尿病媒介タンパク質；（２）糖尿病の発症を予想するため、および所望の様式でDMタンパク質の組み合わせに影響を与え得る化合物を同定するために有用なDMタンパク質のパターンおよび組み合わせ；（３）防御糖尿病媒介タンパク質；（４）有害糖尿病媒介タンパク質；（５）体液中の１つ以上のDMタンパク質、それらの翻訳後改変体、または分解産物の検出に基づく糖尿病の発病または発症の診断のための方法；（６）糖尿病媒介タンパク質を同定するためのインビボの方法；（７)糖尿病媒介タンパク質をコードする外因性遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物；（８）防御または有害糖尿病媒介タンパク質を同定するためのインビボアッセイにおいて有用なトランスジェニック哺乳動物；（９）防御または有害糖尿病媒介タンパク質を同定するために有用な糖尿病媒介タンパク質を発現する形質導入した培養細胞を使用するインビトロアッセイ；（10）防御または有害糖尿病媒介タンパク質を同定するために有用な糖尿病媒介タンパク質を発現する形質導入された島細胞を使用するインビボアッセイ；（11）予想される時間内に糖尿病の高い発症率を示す動物である、ヒト疾患の改良された動物モデル；（12）１つ以上の防御タンパク質の発現を誘導または増強し得る試験化合物を同定するためのインビボのアッセイ方法；（13）有害タンパク質の発現を阻害または減少し得る試験化合物を同定するためのインビボのアッセイ方法；(14）防御糖尿病媒介タンパク質の治療有効量を提供することによって、哺乳動物における糖尿病を処置、および／または糖尿病の発症を予防もしくは遅延させるための方法；（15）防御糖尿病媒介タンパク質の発現を誘導もしくは増強し得るか、または糖尿病媒介タンパク質の活性を調節し得る化合物の治療有効量を提供することによって、哺乳動物における糖尿病を処置、および／または糖尿病の発症を予防もしくは遅延させるための方法；ならびに(16）有害糖尿病媒介タンパク質の発現を阻害もしくは減少し得るか、または糖尿病媒介タンパク質の活性を調節し得る化合物の治療有効量を提供することによって哺乳動物における糖尿病を処置、および／または糖尿病の発症を予防もしくは遅延させるための方法。 General aspects of the invention The present invention includes several aspects: (1) Diabetes mediating proteins identified by different expression in the presence and absence of the onset of diabetes; (2) Diabetes DM protein patterns and combinations useful for predicting onset and identifying compounds that can affect DM protein combinations in a desired manner; (3) protective diabetes mediating proteins; (4) harmful diabetes mediating proteins (5) a method for the diagnosis of the onset or development of diabetes based on the detection of one or more DM proteins, their post-translational variants, or degradation products in body fluids; (6) to identify diabetes-mediating proteins; An in vivo method of: (7) a transgenic mammal comprising an exogenous gene encoding a diabetes-mediating protein; (8) protection or harm Transgenic mammals useful in in vivo assays to identify urinary disease mediating proteins; (9) In vitro using transduced cultured cells that express diabetes mediating proteins useful for identifying protective or harmful diabetes mediating proteins Assays; (10) In vivo assays using transduced islet cells expressing diabetes-mediating proteins useful for identifying protective or harmful diabetes-mediating proteins; (11) High incidence of diabetes within the expected time (12) an in vivo assay method for identifying test compounds capable of inducing or enhancing expression of one or more protective proteins; (13) of harmful proteins; In vivo assay methods to identify test compounds that can inhibit or reduce expression (14) a method for treating diabetes in a mammal and / or preventing or delaying the onset of diabetes by providing a therapeutically effective amount of a protective diabetes-mediating protein; (15) expression of the protective diabetes-mediating protein; A method for treating diabetes in a mammal and / or preventing or delaying the onset of diabetes by providing a therapeutically effective amount of a compound that can be induced or enhanced or that can modulate the activity of a diabetes-mediating protein; And (16) treating diabetes in a mammal by providing a therapeutically effective amount of a compound that can inhibit or reduce the expression of a harmful diabetes-mediating protein or modulate the activity of a diabetes-mediating protein, and / or A method for preventing or delaying onset.

Ｉ．糖尿病媒介タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体。 I. Diabetes mediating proteins, polypeptides, polynucleotides, and antibodies.

本発明は、糖尿病媒介タンパク質、すなわち、糖尿病の発症に関連するかまたは糖尿病の発症の間に影響を受けると同定されたタンパク質を提供する。糖尿病媒介タンパク質は、その発現が、糖尿病の発症の非存在下でのそれらの発現と比較して、糖尿病の発症の間に変化されるタンパク質として特徴づけられる。本発明の開示は、膵臓の島細胞タンパク質の２次元ゲルデータベースにより糖尿病媒介タンパク質を同定する。糖尿病媒介タンパク質には、防御糖尿病媒介タンパク質および有害糖尿病媒介タンパク質を含む。 The present invention provides diabetes-mediating proteins, ie, proteins that have been identified as being associated with or affected during the development of diabetes. Diabetes mediating proteins are characterized as proteins whose expression is altered during the onset of diabetes compared to their expression in the absence of the onset of diabetes. The present disclosure identifies diabetes-mediating proteins by a two-dimensional gel database of pancreatic islet cell proteins. Diabetes mediating proteins include protective diabetes mediating proteins and harmful diabetes mediating proteins.

本発明は、サイトカイン媒介細胞傷害性におけるそれらの有害または防御的役割を確立するために、トランスフェクトされた細胞中のセンスまたはアンチセンス構築物としての、クローニングされたcDNAの発現による機能的評価を含む、糖尿病媒介タンパク質を同定するためのインビトロの方法を提供する。ランゲルハント島のＢ細胞は、サイトカインの毒性効果に特に敏感である。熱ショックタンパク質70（HSP70）でのラットβ細胞のリポフェクション、およびIL-1に暴露された細胞のインビトロの生存性を改善された、ヘミンに対する暴露によるヘムオキシゲナーゼ（HO）の誘導が以前に示されている（Karlsenら、InsulinSecretion and Pancreatic B Cell Research、P.R. FlattおよびS．Lenzen編；Smith-Gordon、USA、499-507頁（1994)）。細胞は、多数の当該分野で公知の方法（例えば、アデノウイルスベクター法）でトランスフェクトされ得る。例えば、Korbuttら、TransplantationProceedings 27:3414（1995）；Cseteら、26:756-757（1994）；Beckerら、J．Biol．Chem．269:21234-21238（1994）を参照のこと。 The present invention includes functional assessment by expression of cloned cDNA as a sense or antisense construct in transfected cells to establish their deleterious or protective role in cytokine-mediated cytotoxicity In vitro methods for identifying diabetes-mediating proteins are provided. Islets of Langerhunt are particularly sensitive to the toxic effects of cytokines. Previously demonstrated induction of heme oxygenase (HO) by exposure to hemin, improved lipofection of rat beta cells with heat shock protein 70 (HSP70), and in vitro viability of cells exposed to IL-1. (Karlsen et al., Insulin Secretion and Pancreatic B Cell Research, edited by PR Flatt and S. Lenzen; Smith-Gordon, USA, 499-507 (1994)). Cells can be transfected by a number of methods known in the art, such as the adenoviral vector method. See, for example, Korbutt et al., Transplantation Proceedings 27: 3414 (1995); Csete et al., 26: 756-757 (1994); Becker et al. Biol. Chem. 269: 21234-21238 (1994).

安定なトランスフェクトされたβ細胞クローンの確立に続いて、糖尿病媒介タンパク質の発現の効果が、サイトカインの非存在下および存在下で培養されたクローンの機能的分析によって決定され得る。機能的分析は、窒素として測定される一酸化窒素の産生（NO）（Greenら、Anal．Biochem．126:131-138（1982））、インシュリンの分泌（Id）、細胞傷害性、および2Dゲル電気泳動を含む。細胞傷害性は、以下を含む当該分野で公知の種々の方法によって測定され得る：（１）乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出に基づく比色アッセイ（CytoTox、Promega）、（２）生細胞のカルセインの取り込みおよび蛍光、ならびに死細胞の核のエチジウムブロマイド染色に基づく生死アッセイ(MolecularProbes）、（３）非放射活性細胞増殖アッセイ（MTT、Promega）、アポトーシス（Nerupら、IDDM，S．BabaおよびT．Kaneko編、ElsevierScience、15-21頁（1994))、および／または遺伝子発現の半定量的複合PCR分析。２次元ゲルは、応答するタンパク質を同定するために、コントロールとサイトカインで刺激した島とを比較するために使用され得、これによって細胞応答において役割を果たすタンパク質を同定する。内部結合分析は、タンパク質の機能的な群を定義し、そしてそれらを調節する（例えば、キナーゼリン酸化または他の翻訳後改変による）ために使用され得る。 Following establishment of stable transfected β-cell clones, the effect of diabetes-mediating protein expression can be determined by functional analysis of clones cultured in the absence and presence of cytokines. Functional analysis includes nitric oxide production (NO) measured as nitrogen (Green et al., Anal. Biochem. 126: 131-138 (1982)), insulin secretion (Id), cytotoxicity, and 2D gels Includes electrophoresis. Cytotoxicity can be measured by various methods known in the art including the following: (1) a colorimetric assay based on the release of lactate dehydrogenase (LDH) (CytoTox, Promega), (2) calcein of living cells Life and death assays based on uptake and fluorescence, and ethidium bromide staining of dead cell nuclei (MolecularProbes), (3) Non-radioactive cell proliferation assays (MTT, Promega), Apoptosis (Nerup et al., IDDM, S. Baba and T. Kaneko Ed., ElsevierScience, 15-21 (1994)), and / or semi-quantitative combined PCR analysis of gene expression. Two-dimensional gels can be used to compare controls and cytokine-stimulated islets to identify responding proteins, thereby identifying proteins that play a role in cellular responses. Internal binding analysis can be used to define functional groups of proteins and regulate them (eg, by kinase phosphorylation or other post-translational modifications).

このようなアッセイにおける使用について好ましい細胞は、インシュリン分泌細胞（例えば、MSLまたはRIN細胞）である。MSL細胞株は、多能性または幹細胞様転移性ラット島細胞腫細胞株である。インビトロおよびインビボでの培養および／または継代条件に依存して、MSL細胞は、ランゲルハンス島の特徴である、全部で４つのホルモン分泌表現系をもたらし得る（Mandrup-Poulsenら、Eur．J．Endocrinology133:660-671（1995）；Eur．J．Endocrinology編、134:21-30（1996))。RIN細胞は、島細胞腫細胞の培養株である（Nielsen、Exp．Clin．Endocrinol．93:277-285（1989)）。 Preferred cells for use in such assays are insulin secreting cells (eg, MSL or RIN cells). The MSL cell line is a pluripotent or stem cell-like metastatic rat islet cell tumor cell line. Depending on in vitro and in vivo culture and / or passage conditions, MSL cells can provide a total of four hormone-secreting phenotypes characteristic of the islets of Langerhans (Mandrup-Poulsen et al., Eur. J. Endocrinology 133). : 660-671 (1995); Eur. J. Endocrinology, 134: 21-30 (1996)). RIN cells are a culture of islet cell tumor cells (Nielsen, Exp. Clin. Endocrinol. 93: 277-285 (1989)).

防御糖尿病媒介タンパク質。本発明は、糖尿病の発症の危険性を有する被験体における糖尿病の発症に対して防御し得るか、または糖尿病を罹患している被験体において糖尿病の症状を緩和し得ると特徴づけられる、実質的に精製された防御糖尿病媒介タンパク質（「防御タンパク質」）を提供する。本発明の防御タンパク質は、糖尿病に対して防御するように直接作用し得るか、あるいは第２の防御タンパク質の合成を誘導もしくは増大するか、または有害タンパク質の合成を減少もしくは阻害することによって間接的に作用し得る。 Protective diabetes mediator protein. The present invention is substantially characterized as being capable of protecting against the development of diabetes in a subject at risk of developing diabetes or alleviating symptoms of diabetes in a subject suffering from diabetes. Provides a purified protective diabetes-mediating protein ("protective protein"). The protective protein of the present invention may act directly to protect against diabetes, or indirectly by inducing or increasing the synthesis of a second protective protein or by reducing or inhibiting the synthesis of harmful proteins. Can act on.

特異的な実施態様において、本発明は、実質的に純粋な防御タンパク質ガレクチン-3を提供する。ラットのガレクチンの配列（配列番号３）を図４に示し、ヒトのガレクチンの配列（配列番号４）を図５に示す。以下に示すように、トランスフェクトした細胞中で発現されるgal-3は、IL-1βでのチャレンジの際に細胞の生存性を増大する。ガレクチンは、胎児および生体の膵臓の島細胞中に存在する、βガラクトシド糖または糖結合体に特異的なレクチンである。本明細書中で使用される用語「実質的に純粋な」は、他のタンパク質、脂質、炭水化物、または天然に付随する他の物質を実質的に含まないgal-3をいう。当業者は、タンパク質精製のための標準的な技術を使用して、gal-3を精製し得る。gal-3ポリペプチドの純度はまた、アミノ末端のアミノ酸配列分析によって決定され得る。gal-3タンパク質は、防御活性を維持している限りは、ポリペプチドの機能的フラグメントを含む。gal-3の生物学的活性を有するより小さいペプチドが、本発明に含まれる。本発明はさらに、配列番号４の全長のアミノ酸配列に対して、少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。相同性または同一性の割合は、例えば、Universityof Wisconsin Genetics Computer Group（UWGCG）から入手可能なGAPコンピュータープログラム（バージョン6.0）を使用して配列情報を比較することによって決定され得る。GAPプログラムは、SmithおよびWaterman、Adv．Appl．Math．2:482（1981）によって改訂された、NeedlemannおよびWunsch、J．Mol．Biol．48:443（1970)のアラインメント法を利用する。簡潔には、GAPプログラムは、２つの配列の短い方の記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の総数で割り算した、類似であるアラインメントした記号の数として類似性を定義する。GAPプログラムのための好ましいデフォルトパラメーター（defaultparameter）として、以下が挙げられる：（１）SchwartzおよびDayhoff編、Atlas of Protein Sequence andStructure、National Biomedical Research Foundation、353-358頁（1979）に記載されるような、一元比較マトリックス（同一性について１、そして非同一性について０の値を有する）ならびにGribsovおよびBurgess、Nucl．AcidsRes．14:6745（1986)の質量測定比較マトリックス；（２）各ギャップについて3.0のペナルティーおよび各ギャップ中の各記号について0.10のペナルティー；ならびに（３）末端のギャップについてはペナルティーなし。 In a specific embodiment, the present invention provides a substantially pure protective protein galectin-3. The rat galectin sequence (SEQ ID NO: 3) is shown in FIG. 4, and the human galectin sequence (SEQ ID NO: 4) is shown in FIG. As shown below, gal-3 expressed in transfected cells increases cell viability upon challenge with IL-1β. Galectins are lectins specific for β-galactoside sugars or sugar conjugates, which are present in fetal and living pancreatic islet cells. As used herein, the term “substantially pure” refers to gal-3 that is substantially free of other proteins, lipids, carbohydrates, or other substances that naturally accompany it. One skilled in the art can purify gal-3 using standard techniques for protein purification. The purity of a gal-3 polypeptide can also be determined by amino-terminal amino acid sequence analysis. The gal-3 protein contains a functional fragment of a polypeptide as long as it maintains protective activity. Smaller peptides with gal-3 biological activity are included in the present invention. The present invention further includes an amino acid sequence having at least 80%, preferably 90%, more preferably 95% identity to the full length amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. The percentage of homology or identity can be determined, for example, by comparing sequence information using the GAP computer program (version 6.0) available from the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). The GAP program is published by Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), Needlemann and Wunsch, J. Am. Mol. Biol. Use the alignment method of 48: 443 (1970). Briefly, the GAP program defines similarity as the number of aligned symbols that are similar divided by the total number of shorter symbols (ie, nucleotides or amino acids) of the two sequences. Preferred default parameters for the GAP program include the following: (1) As described in Schwartz and Dayhoff, edited by Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pages 353-358 (1979). , One-way comparison matrix (having a value of 1 for identity and 0 for non-identity) and Gribsov and Burgess, Nucl. AcidsRes. 14: 6745 (1986) mass measurement comparison matrix; (2) 3.0 penalty for each gap and 0.10 penalty for each symbol in each gap; and (3) No penalty for end gap.

本発明はまた、コンピューターシステムまたは本発明の方法によって同定されるかまたは特徴づけられる、精製されたタンパク質を提供する。ここで、タンパク質は、以下からなる群から選択され得る：
（ａ）表８に示される、対応する分子量およびpIを有する影響を受けていないタンパク質；
（ｂ）表９に示される、対応する分子量およびpIを有する影響を受けたタンパク質；および
（ｃ）表10に示される、対応する分子量およびpIを有するマーカータンパク質、
そしてここで、少なくとも１つの上記のタンパク質が、必要に応じて以下からさらに選択される：
（ｉ）表11に示される、対応する分子量およびpIを有する影響を受けていないタンパク質；
（ii）表12に示される、対応する分子量およびpIを有する影響を受けたタンパク質；および
（iii）表13に示される、対応する分子量およびpIを有するマーカータンパク質。 The invention also provides a purified protein identified or characterized by a computer system or a method of the invention. Here, the protein may be selected from the group consisting of:
(A) Unaffected protein with the corresponding molecular weight and pI shown in Table 8;
(B) an affected protein having a corresponding molecular weight and pI shown in Table 9; and (c) a marker protein having a corresponding molecular weight and pI shown in Table 10;
And here, at least one of the above-mentioned proteins is further selected from:
(I) Unaffected protein with the corresponding molecular weight and pI shown in Table 11;
(Ii) an affected protein having a corresponding molecular weight and pI shown in Table 12; and (iii) a marker protein having a corresponding molecular weight and pI shown in Table 13.

本発明に従って、影響を受けたタンパク質または影響を受けていないペプチドは、影響を受けたペプチドまたは影響を受けていないペプチド（例えば１〜40ドメイン、またはその中の任意の範囲もしくは値）に対応する２つ以上のポリペプチドドメイン（例えば、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、疎水性ドメイン、親水性ドメイン、リガンド結合ドメイン、または孔内層ドメイン）またはそのフラグメントの会合を含む。本発明の影響を受けたペプチドまたは影響を受けていないペプチドのこのようなドメインは、少なくとも74％の相同性（例えば、全体で74〜100％の相同性または同一性）を有し得るか、あるいは本明細書中に記載される、１つ以上の対応する、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドドメインに対して、その中の任意の範囲または値を有し得る。当業者に理解されるように、上記のドメインの立体配置は、本発明の影響を受けたペプチドまたは影響を受けていないペプチドの一部として提供され、その結果、機能的に影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドは、適切な細胞中で発現される場合、島細胞型に影響を与えることが見出される生物学的活性に関連し得る。このような活性は、適切な影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの活性アッセイによって測定される場合、本発明の１つ以上の影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチド活性を確立する。 In accordance with the present invention, an affected protein or an unaffected peptide corresponds to an affected or unaffected peptide (eg, 1-40 domains, or any range or value therein). It includes an association of two or more polypeptide domains (eg, transmembrane domain, cytoplasmic domain, hydrophobic domain, hydrophilic domain, ligand binding domain, or pore domain) or fragments thereof. Such domains of the affected or unaffected peptides of the invention may have at least 74% homology (eg, 74-100% homology or identity overall), Alternatively, one or more corresponding, affected or unaffected protein or peptide domains described herein can have any range or value therein. As will be appreciated by those skilled in the art, the domain configurations described above are provided as part of the affected or unaffected peptides of the present invention, resulting in functionally affected or Unaffected proteins or peptides can be associated with biological activities that are found to affect islet cell types when expressed in appropriate cells. Such activity is determined by one or more affected or unaffected proteins or peptides of the present invention as measured by an activity assay of the appropriately affected or unaffected protein or peptide. Establishing an affected or unaffected protein or peptide activity.

従って、あるいは、本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドは、少なくとも１つの20〜10,000アミノ酸のフラグメントに実質的に対応する影響を受けたかまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドアミノ酸配列の一部を有するペプチド、および／あるいは影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドあるいは影響を受けたがまたは影響を受けていないペプチド群のコンセンサス配列を含む。ここで、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドは、少なくとも74〜99％（例えば、88〜99％（またはその中の任意の範囲もしくは値（例えば、87〜99、88〜99、89〜99、90〜99、91〜99、92〜99、93〜99、94〜99、95〜99、96〜99、97〜99、または98〜99％））の相同性または同一性を、本発明に従って１つ以上のタンパク質の質量スペクトル特徴を有する、表８〜13の１つ以上に示されるかまたは図２〜７に示されるとして特徴付けられる、少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの配列またはコンセンサス配列に対して有する。 Thus, alternatively, an affected or unaffected peptide of the present invention is an affected or unaffected protein or peptide amino acid sequence that substantially corresponds to at least one 20-10,000 amino acid fragment. And / or consensus sequences for affected or unaffected peptides or affected or unaffected peptides. Here, an affected or unaffected protein or peptide is at least 74-99% (eg, 88-99% (or any range or value therein (eg, 87-99, 88-99)). , 89-99, 90-99, 91-99, 92-99, 93-99, 94-99, 95-99, 96-99, 97-99, or 98-99%))) homology or identity At least one of at least one protein having the mass spectral characteristics of one or more proteins according to the invention, as shown in one or more of Tables 8-13 or as shown in FIGS. Has against sequence or consensus sequence.

1つの局面において、このような影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドは、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの生物学的活性を維持し得る。本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドは、天然に存在しないか、または天然に存在するが天然には存在しない形態で精製または単離されることが好ましい。好ましくは、本発明の影響を受けたかまたは影響を受けていないペプチドは、実質的に、本発明に従って１つ以上のタンパク質の質量スペクトル特徴を有する、配列番号を含む表８〜13の１つ以上において特徴付けられる、少なくとも10個の連続するアミノ酸のタンパク質を有する、本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質のドメインの任意のセットに実質的に対応する。 In one aspect, such affected or unaffected peptides can maintain the biological activity of the affected or unaffected protein or peptide. It is preferred that the affected or unaffected peptides of the present invention are either non-naturally occurring or purified or isolated in a naturally occurring but non-naturally occurring form. Preferably, the peptides affected or unaffected by the present invention are substantially one or more of Tables 8-13 comprising SEQ ID NOs having mass spectral characteristics of one or more proteins according to the present invention. Substantially corresponds to any set of domains of affected or unaffected proteins of the invention having a protein of at least 10 consecutive amino acids characterized in

あるいはまたはさらに、本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドは、既知のタンパク質のドメイン（例えば、74〜100％の全体の相同性、またはその中の任意の範囲もしくは値を有する、細胞質ドメイン、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン、または公知の他のドメイン）に対応する少なくとも1つのドメインを含む。別のドメインもまた、本発明に従って１つ以上のタンパク質の質量スペクトル特性を有する、配列番号を含む表８〜13、図２〜７の１つ以上において特徴付けられる、少なくとも10個の連続するアミノ酸のタンパク質をコードするか、またはそれに対して74％の相同性を有するか、または置換されたコドンを有し、それにより、特定のコドンについて同じアミノ酸をコードする、少なくとも30個の連続するヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされる。さらに、リン酸化（例えば、PKAおよびPKC）ドメインはまた、当業者によって認識される場合、本発明に従って影響を受けたかまたは影響を受けていないペプチドまたはコードする核酸配列が提供される場合に考慮される。この限定的でない例は、表12のタンパク質672-674に示され、ここで同じタンパク質が別々にリン酸化される。 Alternatively or additionally, an affected or unaffected peptide of the present invention has a known protein domain (e.g., 74-100% overall homology, or any range or value therein, At least one domain corresponding to a cytoplasmic domain, an intracellular domain, a transmembrane domain, an extracellular domain, or other known domain). Another domain also has at least 10 consecutive amino acids characterized in one or more of Tables 8-13, FIGS. 2-7, including SEQ ID NOs, having mass spectral characteristics of one or more proteins according to the present invention At least 30 contiguous nucleotides that encode or have 74% homology to them, or have codons substituted, thereby encoding the same amino acid for a particular codon. , Encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions. In addition, phosphorylated (eg, PKA and PKC) domains are also considered when recognized by those of skill in the art when an affected or unaffected peptide or encoding nucleic acid sequence is provided according to the present invention. The This non-limiting example is shown in protein 672-674 in Table 12, where the same protein is separately phosphorylated.

本発明はさらに、DNA、cDNA、およびRNA配列を含む、本発明の糖尿病媒介タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。糖尿病媒介タンパク質の全てまたは一部をコードする全てのポリヌクレオチドもまた、それらが糖尿病媒介活性を有するポリペプチドをコードする限りは、本明細書中に含まれる。このようなポリヌクレオチドは、天然に存在する、合成の、および意図的に操作されたポリヌクレオチドを含む。例えば、このようなポリヌクレオチドは、部位特異的変異誘発に供され得る。本発明のポリヌクレオチド配列はまた、アンチセンス配列を含む。アンチセンス配列は、改変されたオリゴヌクレオチドを用いて合成された配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子コードの結果として縮重している配列を含む。これらは、20の天然のアミノ酸であり、これらのほとんどは、１を超える^**コドンによって特定される。従って、全ての縮重ヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列によってコードされる糖尿病媒介ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化していない限りは、本発明に含まれる。 The invention further includes polynucleotide sequences that encode the diabetes-mediating protein of the invention, including DNA, cDNA, and RNA sequences. All polynucleotides encoding all or part of a diabetes-mediating protein are also included herein as long as they encode a polypeptide having diabetes-mediating activity. Such polynucleotides include naturally occurring, synthetic, and intentionally manipulated polynucleotides. For example, such polynucleotides can be subjected to site-directed mutagenesis. The polynucleotide sequences of the present invention also include antisense sequences. Antisense sequences include sequences synthesized using modified oligonucleotides. The polynucleotides of the invention include sequences that are degenerate as a result of the genetic code. These are the 20 natural amino acids, most of which are specified by more than one ^** codon. Accordingly, all degenerate nucleotide sequences are included in the present invention so long as the amino acid sequence of the diabetes-mediating polypeptide encoded by that nucleotide sequence is not functionally altered.

本発明のDNA配列は、いくつかの方法によって得ることができる。例えば、DNAは、当該分野で周知のハイブリダイゼーション技術を使用して単離され得る。これらは以下を含むが、それらに限定されない：１）相同ヌクレオチド配列を検出するための、プローブとのゲノムまたはcDNAライブラリーのハイブリダイゼーション、２）目的のDNA配列にアニーリングし得るプライマーを使用する、ゲノムDNAまたはcDNAについてのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、および３）共有する構造特性を有するクローニングしたDNAフラグメントを検出するために、発現ライブラリーの抗体スクリーニング。 The DNA sequence of the present invention can be obtained by several methods. For example, DNA can be isolated using hybridization techniques well known in the art. These include, but are not limited to: 1) hybridization of genomic or cDNA libraries with probes to detect homologous nucleotide sequences, 2) using primers that can anneal to the DNA sequence of interest, Polymerase chain reaction (PCR) for genomic DNA or cDNA, and 3) antibody screening of expression libraries to detect cloned DNA fragments with shared structural properties.

好ましくは、本発明のDNA配列は、哺乳動物の器官由来であり、そして最も好ましくは、ヒト由来である。適切なプローブが入手可能である限り、核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング手順によって、任意の生物からの任意の遺伝子配列の単離が可能になる。目的のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴペプチドプローブが、化学合成され得る。これは、アミノ酸配列の短いオリゴヌクレオチドストレッチが公知でなければならないことを必要とする。タンパク質をコードするDNA配列は、遺伝子コードから推定され得るが、しかし、コードの縮重を考慮しなければならない。生物のコドン偏向は、最も可能性のあるヌクレオチドのトリプレットを選択するために考慮され得る。配列が縮重する場合、混合した付加反応を行うことが可能である。これは、変性した二本鎖DNAの異種混合物を含む。このようなスクリーニングについて、好ましくは、ハイブリダイゼーションは、一本鎖DNAまたは変性させた二本鎖DNAのいずれかについて行われる。ハイブリダイゼーションは、目的のポリペプチドに関連するmRNA配列が極微量で存在する場合、供給源に由来するcDNAクローンの検出に特に有用である。言い換えれば、非特異的結合を避けるためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用することによって、例えば、その完全な相補物である混合物中の単一のプローブに対する標的DNAのハイブリダイゼーションによって、特異的なcDNAクローンのオートラジオグラフィーによる可視化が可能である（Sambrookら、MolecularCloning、A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、NY（1989)）。 Preferably, the DNA sequences of the present invention are derived from mammalian organs, and most preferably from humans. As long as appropriate probes are available, screening procedures by nucleic acid hybridization allow the isolation of any gene sequence from any organism. An oligopeptide probe corresponding to a portion of the sequence encoding the protein of interest can be chemically synthesized. This requires that a short oligonucleotide stretch of the amino acid sequence must be known. The DNA sequence encoding the protein can be deduced from the genetic code, but the degeneracy of the code must be taken into account. The codon bias of an organism can be considered to select the most likely nucleotide triplet. When the sequence is degenerate, it is possible to perform a mixed addition reaction. This includes a heterogeneous mixture of denatured double-stranded DNA. For such screening, preferably hybridization is performed on either single-stranded DNA or denatured double-stranded DNA. Hybridization is particularly useful for the detection of cDNA clones derived from a source when mRNA sequences associated with the polypeptide of interest are present in trace amounts. In other words, by using stringent hybridization conditions to avoid non-specific binding, for example, by hybridization of the target DNA to a single probe in a mixture that is its full complement. Visualization of cDNA clones by autoradiography is possible (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (1989)).

本発明の糖尿病媒介タンパク質をコードする特異的DNA配列の生成は、以下によっても得ることができる：１）ゲノムDNA由来の二本鎖DNA配列の単離；２）目的のポリペプチドに必要なコドンを提供するための、DNA配列の化学的な操作；および３）真核生物ドナー細胞から単離されたmRNAの逆転写による、二本鎖DNA配列のインビトロ合成。最後の場合、mRNAに相補的な二本鎖DNAが最終的に形成され、これは一般にcDNAと呼ばれる。組換え手順での使用のための特異的DNA配列を産生するための上記の３つの方法のうち、ゲノムDNA単離物の単離は最もまれである。これは特に、哺乳動物ポリペプチドの微生物での発現を得ることが所望される場合に特に正しく、イントロンの存在に起因する。 Generation of a specific DNA sequence encoding the diabetes-mediating protein of the present invention can also be obtained by: 1) isolation of a double-stranded DNA sequence from genomic DNA; 2) codons required for the polypeptide of interest. 3) in vitro synthesis of double-stranded DNA sequences by reverse transcription of mRNA isolated from eukaryotic donor cells. In the last case, double-stranded DNA complementary to the mRNA is finally formed, commonly referred to as cDNA. Of the three methods described above for producing specific DNA sequences for use in recombinant procedures, isolation of genomic DNA isolates is the rarest. This is particularly true when it is desired to obtain microbial expression of a mammalian polypeptide and is due to the presence of introns.

DNA配列の合成はしばしば、所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の完全な配列が既知である場合の方法の選択である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の配列の全体が未知である場合、DNA配列の直接の合成は不可能であり、そして選択される方法は、cDNA配列の合成である。目的のcDNA配列を単離するための標準的な手順は、目的のタンパク質について高レベルの遺伝子発現を有するドナー細胞中に豊富な、mRNAの逆転写に由来するプラスミド保有cDNAまたはファージ保有cDNAライブラリーの形成である。ポリメラーゼ連鎖反応技術が組み合わせて使用される場合、さらにまれな発現産物がクローニングされ得る。ポリペプチドのアミノ酸配列の有意な部分が既知である場合において、標的cDNA中に存在すると推定される配列を二倍にする、標識された一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAプローブ配列の生成は、一本鎖形態に変性されているcDNAのクローニングされたコピーについて行われる、DNA/DNAハイブリダイゼーション手順において使用され得る（Jayら、Nucl．Acid．Res．11:2325（1983)）。 The synthesis of DNA sequences is often a method choice where the complete sequence of amino acid residues of the desired polypeptide product is known. If the entire sequence of amino acid residues of the desired polypeptide is unknown, direct synthesis of the DNA sequence is not possible and the method chosen is synthesis of the cDNA sequence. Standard procedures for isolating the cDNA sequence of interest are plasmid- or phage-carrying cDNA libraries derived from reverse transcription of mRNA, abundant in donor cells with high levels of gene expression for the protein of interest Formation. More rare expression products can be cloned when polymerase chain reaction techniques are used in combination. Generation of a labeled single- or double-stranded DNA or RNA probe sequence that doubles the presumed sequence present in the target cDNA when a significant portion of the amino acid sequence of the polypeptide is known Can be used in DNA / DNA hybridization procedures performed on cloned copies of cDNA that have been denatured into single-stranded form (Jay et al., Nucl. Acid. Res. 11: 2325 (1983)).

cDNA発現ライブラリー（例えば、λgt11）は、糖尿病媒介タンパク質に特異的な抗体を使用して、少なくとも1つのエピトープを有する糖尿病媒介ペプチドについて間接的にスクリーニングし得る。このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかで得られ、そして所望のcDNAの存在の指標である発現産物に由来し、そしてそれを検出するために使用され得る。 A cDNA expression library (eg, λgt11) can be screened indirectly for diabetes-mediating peptides having at least one epitope using antibodies specific for diabetes-mediating proteins. Such antibodies can be obtained either polyclonal or monoclonal and can be derived from and used to detect expression products that are indicative of the presence of the desired cDNA.

糖尿病媒介因子をコードするDNA配列は、適切な宿主細胞中へのDNA移入によってインビトロで発現され得る。「宿主細胞」は、ベクターが増殖され得るかまたはそのDNAが発現される細胞である。この用語はまた、被験体の宿主細胞の任意の子孫を含む。全ての子孫が、親細胞にと同一でなくてもよいことが理解され得る。なぜなら、複製の間に生じる変異が存在し得るからである。しかし、このような子孫は、用語「宿主細胞」が使用される場合、含まれる。安定な導入方法とは、外来DNAが宿主中で連続的に維持されることが当該分野で公知であることを意味する。 A DNA sequence encoding a diabetes mediator can be expressed in vitro by DNA transfer into a suitable host cell. A “host cell” is a cell in which a vector can be propagated or its DNA is expressed. The term also includes any progeny of the subject's host cell. It can be appreciated that all progeny may not be identical to the parent cell. This is because there may be mutations that occur during replication. However, such progeny are included when the term “host cell” is used. A stable introduction method means that the foreign DNA is known in the art to be continuously maintained in the host.

本発明において、糖尿病媒介タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え発現ベクター中に挿入され得る。用語「組換え発現ベクター」は、プラスミド、ウイルス、またはX130遺伝子配列の挿入または取り込みによって操作されている当該分野で公知の他のビヒクルをいう。このような発現ベクターは、宿主の挿入された遺伝子配列の効率的な転写を容易にする、プロモーター配列を含む。発現ベクターは代表的には、複製起点、プロモーター、および形質転換された細胞の表現系の選択を可能にする特異的な遺伝子を含む。本発明での使用に適切なベクターとして、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細菌中での発現のためのT7に基づく発現ベクター（Rosenbergら、Gene56:125（1987)）、哺乳動物細胞中での発現のためのpMSXND発現ベクター（LeeおよびNathans、J．Biol．Chem．263:3521（1988)）、および昆虫細胞中での発現のためのバキュロウイルス由来ベクター。DNAセグメントは、調節エレメント（例えば、プロモーター（例えば、T7、メタロチオネインＩ、またはポリヘドロンプロモーター)）に作動可能に連結されて、ベクター中に存在し得る。 In the present invention, a polynucleotide sequence encoding a diabetes-mediating protein can be inserted into a recombinant expression vector. The term “recombinant expression vector” refers to a plasmid, virus, or other vehicle known in the art that has been manipulated by insertion or incorporation of the X130 gene sequence. Such expression vectors contain a promoter sequence that facilitates efficient transcription of the inserted gene sequence in the host. Expression vectors typically contain an origin of replication, a promoter, and specific genes that allow selection of the transformed cell's phenotype. Suitable vectors for use in the present invention include, but are not limited to: T7-based expression vectors for expression in bacteria (Rosenberg et al., Gene56: 125 (1987)), mammalian cells. PMSXND expression vector for expression in (Lee and Nathans, J. Biol. Chem. 263: 3521 (1988)), and baculovirus-derived vector for expression in insect cells. A DNA segment can be operably linked to a regulatory element, such as a promoter (eg, a T7, metallothionein I, or polyhedron promoter) and present in a vector.

糖尿病媒介タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物のいずれかで発現され得る。宿主は、微生物、酵母、昆虫、および哺乳動物の器官を含み得る。真核生物またはウイルス配列を有するDNA配列を原核細胞中で発現させるための方法は、当該分野で周知である。宿主中で発現および複製し得る生物学的に機能的なウイルス、およびプラスミドDNAベクターが、当該分野で公知である。このようなベクターは、本発明のDNA配列を取り込むために使用される。 A polynucleotide sequence encoding a diabetes-mediating protein can be expressed in either prokaryotes or eukaryotes. Hosts can include microbial, yeast, insect, and mammalian organs. Methods for expressing DNA sequences having eukaryotic or viral sequences in prokaryotic cells are well known in the art. Biologically functional viruses that can be expressed and replicated in a host, and plasmid DNA vectors are known in the art. Such vectors are used to incorporate the DNA sequences of the present invention.

組換えDNAでの宿主細胞の形質転換は、当業者に周知である従来の方法によって行われ得る。宿主が原核生物（例えば、E．coli）である場合、DNAを取り込み得るコンピテント細胞が、当該分野で周知の手順を使用して、対数増殖期後に細胞を回収し、その後CaCl₂法によって処理することによって調製され得る。あるいは、MgCl₂またはRbClが使用され得る。形質転換はまた、所望される場合、宿主細胞のプロトプラストを形成した後に行われ得る。 Transformation of host cells with recombinant DNA can be performed by conventional methods well known to those skilled in the art. If the host is prokaryotic (eg, E. coli), competent cells capable of taking up DNA will be harvested after the logarithmic growth phase using procedures well known in the art and then processed by the CaCl ₂ method. Can be prepared. Alternatively, MgCl ₂ or RbCl can be used. Transformation can also be performed after forming a protoplast of the host cell, if desired.

宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈、従来の機械的手順（例えば、マイクロインジェクション）、エレクトロポレーション、リポソーム中に包埋されたプラスミドの挿入のようなDNAのトランスフェクションまたはウイルスベクターの方法が使用され得る。真核生物細胞はまた、本発明の糖尿病媒介タンパク質をコードするDNA配列、および選択可能な表現系をコードする第２の外来DNA分子（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）で同時形質転換され得る。別の方法は、真核生物ウイルスベクター（例えば、シミアンウイルス40（SV40）、またはウシ乳頭腫ウイルス）を、真核生物細胞を感染、形質転換、または形質導入させ、そしてタンパク質を発現させるために使用することである（例えば、EukaryoticViral Vectors、Cold Spring Harbor Laboratory、Gluzman編、1982を参照のこと）。 If the host is eukaryotic, a calcium phosphate co-precipitation, conventional mechanical procedures (eg, microinjection), electroporation, DNA transfection such as insertion of a plasmid embedded in liposomes or viral vector The method can be used. Eukaryotic cells can also be co-transformed with a DNA sequence encoding the diabetes-mediating protein of the invention and a second foreign DNA molecule encoding a selectable expression system (eg, a herpes simplex thymidine kinase gene). Another method is to use eukaryotic viral vectors (eg, simian virus 40 (SV40), or bovine papilloma virus) to infect, transform, or transduce eukaryotic cells and express proteins. (See, for example, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Gluzman, 1982).

本発明によって提供される、微生物発現されるポリペプチドまたはそのフラグメントの単離および精製は、予備クロマトグラフィーおよび免疫学的分離（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む）を含む、従来の手段によって行われ得る。2DGEは、互いからのタンパク質の改変変異体の精製のための好ましい方法である。 Isolation and purification of the microbially expressed polypeptide or fragment thereof provided by the present invention can be performed by conventional means, including pre-chromatography and immunological separations (including monoclonal or polyclonal antibodies). . 2DGE is a preferred method for the purification of modified variants of proteins from each other.

糖尿病媒介有害タンパク質。糖尿病媒介有害タンパク質（「有害タンパク質」）は、糖尿病の発症を増強するか、または被験体の糖尿病を発症する危険性を増大させると特徴づけられる。本発明は、実質的に精製された防御糖尿病媒介タンパク質、およびこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。好ましい実施態様において、有害タンパク質はモルタリンである。マウスのモルタリンのアミノ酸配列（配列番号１）を図２に示す、そしてヒトのモルタリンのアミノ酸配列（配列番号２）を図３に示す。 Diabetes-mediated harmful protein. Diabetes-mediated harmful proteins (“harmful proteins”) are characterized as enhancing the development of diabetes or increasing the risk of developing diabetes in a subject. The present invention includes substantially purified protective diabetes-mediating proteins and polynucleotide sequences encoding such proteins. In a preferred embodiment, the harmful protein is mortalin. The amino acid sequence of mouse mortalin (SEQ ID NO: 1) is shown in FIG. 2, and the amino acid sequence of human mortalin (SEQ ID NO: 2) is shown in FIG.

糖尿病媒介タンパク質に特異的な抗体。本発明の糖尿病媒介タンパク質はまた、糖尿病媒介タンパク質のエピトープに免疫反応性であるか、または結合する抗体を産生するために使用され得る。抗体は本質的に、種々のエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体、および異なるモノクローナル抗体調製物からなり得る。モノクローナル抗体は、当該分野で周知の方法によってタンパク質のフラグメントを含む抗原から作成される（Kohlerら、Nature 256:495（1975)；Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、1989）。 Antibodies specific for diabetes-mediating proteins. The diabetes-mediating proteins of the invention can also be used to produce antibodies that are immunoreactive or bind to epitopes of diabetes-mediating proteins. Antibodies can consist essentially of pooled monoclonal antibodies with different epitope specificities and different monoclonal antibody preparations. Monoclonal antibodies are made from antigens containing protein fragments by methods well known in the art (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1989).

本明細書中で使用される用語「抗体」は、完全な分子およびそのフラグメント（例えば、Fab、F(ab')2、およびFv）を含み、これらは、エピトープ決定基に結合し得る。これらの抗体フラグメントは、その抗原またはレセプターに選択的に結合するいくつかの能力を維持しており、そして以下のように定義される：
（１）Fab（抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含むフラグメント）は、インタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部を生じるための、酵素であるパパインでの抗体全体の消化によって産生され得る；
（２）Fab'（抗体分子のフラグメント）は、インタクトな軽鎖および重鎖の一部を生じるための、ペプシンでの抗体全体の処理、続く還元によって、得ることができる；１つの抗体分子あたり２つのFab'フラグメントが得られる；
（３）（Fab')2（抗体のフラグメント）は、続く還元を伴わない酵素ペプシンでの抗体全体の処理によって得ることができる；F(ab')2は、２つのジスルフィド結合で互いに結合した２つのFab'フラグメントの二量体である；
（４）Fvは、２つの鎖として発現される、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；そして
（５）単鎖抗体（「SCA」）は、遺伝的に融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子として定義される。 The term “antibody” as used herein includes intact molecules and fragments thereof (eg, Fab, F (ab ′) 2, and Fv), which can bind to epitope determinants. These antibody fragments retain some ability to selectively bind to its antigen or receptor and are defined as follows:
(1) Fab (fragment containing a monovalent antigen-binding fragment of an antibody molecule) is produced by digestion of the whole antibody with the enzyme papain to produce an intact light chain and part of one heavy chain. obtain;
(2) Fab ′ (a fragment of an antibody molecule) can be obtained by treatment of the whole antibody with pepsin to produce intact light chain and part of the heavy chain followed by reduction; Two Fab ′ fragments are obtained;
(3) (Fab ') 2 (antibody fragment) can be obtained by treatment of the whole antibody with the enzyme pepsin without subsequent reduction; F (ab') 2 bound to each other by two disulfide bonds A dimer of two Fab ′ fragments;
(4) Fv is defined as a genetically engineered fragment containing a light chain variable region and a heavy chain variable region expressed as two chains; and (5) a single chain antibody ("SCA") is , Defined as a genetically engineered molecule comprising a light chain variable region and a heavy chain variable region linked by a polypeptide linker suitable as a genetically fused single chain molecule.

これらのフラグメントを作成する方法は、当該分野で公知である。例えば、HarlowおよびLane、Antibodies；ALaboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York（1988)（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。 Methods for making these fragments are known in the art. See, for example, Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988), incorporated herein by reference.

本明細書中で使用される用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する、抗原の任意の抗原性決定基を意味する。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基からなり、そして通常は、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。 The term “epitope” as used herein refers to any antigenic determinant of an antigen to which a paratope of an antibody binds. Epitopic determinants usually consist of chemically active surface groupings of molecules such as amino acids or sugar side chains and usually have specific three dimensional structural characteristics, as well as specific charge characteristics.

本発明の糖尿病媒介ポリペプチドに結合する抗体は、免疫抗原としての目的の小ペプチドを含む完全なポリペプチドまたはフラグメントを使用して調製され得る。動物を免疫するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、翻訳されたcDNA、または所望される場合は、キャリアタンパク質に結合され得る化学合成物由来であり得る。ペプチドに化学結合されるこのように一般的に使用されるキャリアとして、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（BSA）、および破傷風毒素が挙げられる。次いで、結合されたペプチドが、動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫するために使用される。 Antibodies that bind to the diabetes-mediating polypeptides of the invention can be prepared using the complete polypeptide or fragment containing the small peptide of interest as an immunizing antigen. The polypeptide or peptide used to immunize an animal can be derived from a translated cDNA or, if desired, a chemical composition that can be conjugated to a carrier protein. Such commonly used carriers that are chemically conjugated to peptides include keyhole limpet hemocyanin (KLH), thyroglobulin, bovine serum albumin (BSA), and tetanus toxin. The conjugated peptide is then used to immunize the animal (eg, mouse, rat, or rabbit).

所望される場合は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば、抗体が惹起されるポリペプチドまたはペプチドが結合されるマトリックスに結合させるかおよびマトリックスからの溶出によってさらに精製され得る。当業者は、ポリクローナル抗体、およびモノクローナル抗体の精製および／または濃度について免疫学的分野で一般的な種々の技術を知っている。例えば、Coliganら、第９章、Current Protocols in Immunology、Wiley Interscience（1994)（本明細書中で参考として具体的に援用される）を参照のこと。 If desired, polyclonal or monoclonal antibodies can be further purified, for example, by binding to and elution from the matrix to which the polypeptide or peptide against which the antibody is raised is bound. Those skilled in the art are aware of various techniques common in the immunological field for the purification and / or concentration of polyclonal and monoclonal antibodies. See, eg, Coligan et al., Chapter 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience (1994), specifically incorporated herein by reference.

エピトープを模倣するモノクローナル抗体を産生するために、抗イディオタイプ技術を使用することもまた可能である。例えば、第一のモノクローナル抗体を作成するための抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第一のモノクローナル抗体によって結合されるエピトープの「典型（image）」である、超可変領域中の結合ドメインを有する。 It is also possible to use anti-idiotypic techniques to produce monoclonal antibodies that mimic the epitope. For example, an anti-idiotypic monoclonal antibody for making a first monoclonal antibody has a binding domain in the hypervariable region that is the “image” of the epitope bound by the first monoclonal antibody.

本発明の目的のために、糖尿病媒介タンパク質に特異的な抗体または核酸プローブは、生物学的液体または組織中の糖尿病媒介タンパク質を検出するため（抗体を使用して）またはコードするポリヌクレオチドを検出するため（核酸プローブを使用して）に使用され得る。糖尿病媒介タンパク質または核酸プローブと反応性である抗体は、好ましくは、糖尿病媒介タンパク質への結合の検出を可能にする化合物で標識される。検出可能な量の抗原またはポリヌクレオチドを含有する任意の標本が、使用され得る。さらに、特異的タンパク質が、それらのリガンド（例えば、レクチン結合タンパク質へのガレクチン-3の結合）によって選択され得、そして目的のタンパク質の診断および／または精製に有用である。 For purposes of the present invention, an antibody or nucleic acid probe specific for a diabetes-mediating protein detects (using an antibody) or encodes a polynucleotide that encodes the diabetes-mediating protein in a biological fluid or tissue. Can be used (using nucleic acid probes). An antibody that is reactive with a diabetes-mediating protein or nucleic acid probe is preferably labeled with a compound that allows detection of binding to the diabetes-mediating protein. Any specimen containing a detectable amount of antigen or polynucleotide can be used. Furthermore, specific proteins can be selected by their ligands (eg, binding of galectin-3 to lectin binding proteins) and are useful for diagnosis and / or purification of the protein of interest.

細胞成分が核酸である場合、糖尿病媒介タンパク質特異的プローブとの結合の前に核酸を増幅することが必要であり得る。好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が使用されるが、しかし、他の核酸増幅手順（例えば、リガーゼ連鎖反応、連結活性化転写（LAT）、および核酸配列に基づく増幅（NASBA）が使用され得る。 If the cellular component is a nucleic acid, it may be necessary to amplify the nucleic acid prior to binding with a diabetes-mediating protein specific probe. Preferably, polymerase chain reaction (PCR) is used, but other nucleic acid amplification procedures such as ligase chain reaction, ligated activated transcription (LAT), and nucleic acid sequence based amplification (NASBA) can be used. .

II．糖尿病媒介タンパク質の同定のための方法
インビボの動物移植モデル。本発明は、糖尿病の発症に関連するか、または糖尿病の発症の間に特異的に影響されるタンパク質を検出するインビボのアッセイシステムを提供することにより、糖尿病媒介タンパク質を同定するための方法を特徴とする。本明細書中に記載される本発明のインビボの移植アッセイは、関連するまたは影響を受けるタンパク質の同定を可能にする。 II. Methods for identification of diabetes-mediating proteins In vivo animal transplantation model. The present invention features a method for identifying diabetes-mediating proteins by providing an in vivo assay system that detects proteins associated with or specifically affected during the onset of diabetes. And The in vivo transplantation assay of the present invention described herein allows for the identification of related or affected proteins.

本発明の糖尿病媒介タンパク質の同定のための方法において、インシュリン分泌細胞またはインシュリン分泌細胞に成長し得る細胞が、宿主動物に移植される。移植された細胞は、移植と糖尿病の発症との間の時点でレスキューされ、そしてタンパク質発現が決定され、そして移植されていない島細胞および糖尿病を発症していない動物中の相乗移植物とタンパク質発現が比較される。本発明の方法は、糖尿病の発症の間に変化した発現を示すタンパク質を同定することを可能にする。次いで、同定されたタンパク質が単離され、そして防御または有害糖尿病媒介タンパク質としての同定のためにさらに試験される。 In the method for identification of diabetes-mediating proteins of the present invention, insulin-secreting cells or cells that can grow into insulin-secreting cells are transplanted into a host animal. Transplanted cells are rescued at a time between transplantation and the onset of diabetes, and protein expression is determined, and syngraft and protein expression in untransplanted islet cells and animals that do not develop diabetes Are compared. The method of the invention makes it possible to identify proteins that show altered expression during the onset of diabetes. The identified protein is then isolated and further tested for identification as a protective or harmful diabetes-mediating protein.

インシュリン産生細胞に成長し得る細胞として、膵臓島細胞およびβ細胞が挙げられる。移植された細胞は、ヒトを含む目的の任意の種から得ることができる。宿主動物は、好ましくは、移植された細胞が宿主動物中で拒絶されないように、移植される細胞と免疫学的に適合性である動物である。 Cells that can grow into insulin-producing cells include pancreatic islet cells and β cells. The transplanted cells can be obtained from any species of interest, including humans. The host animal is preferably an animal that is immunologically compatible with the cells to be transplanted so that the transplanted cells are not rejected in the host animal.

宿主動物は、糖尿病を発症する任意の動物であり得、そして研究に便利である。好ましい宿主動物は、マウス、ラット、およびハムスターであり、ラットおよびマウスが最も好ましい。特に好ましい実施態様において、宿主動物は、糖尿病の発病率の増大のために交配された株（BB−DPラットおよびNODマウスを含む）から選択される。本発明の方法はまた、予め決定された時間に（例えば、特異的抗原への暴露の際に）糖尿病を発症するように操作された宿主動物で使用され得る。例えば、Oldstoneら、APMIS104:689-97（1996)：von Herrathら、J．Clin．Invest．98:1324-1331（1996)；Morganら、J．Immunol．157:978983（1996)を参照のこと。他の可能性のある宿主動物として、Mus（例えば、マウス）およびRattus（例えば、ラット）、Oryctolagus（例えば、ウサギ）、およびMesocricetus（例えば、ハムスター）、およびCavia（例えば、モルモット）から選択される属に属する動物が挙げられる。一般に、交配および維持が容易である、１kg未満の正常の完全に成長した成体体重を有する哺乳動物が、使用され得る。 The host animal can be any animal that develops diabetes and is convenient for research. Preferred host animals are mice, rats, and hamsters, with rats and mice being most preferred. In a particularly preferred embodiment, the host animal is selected from a strain (including BB-DP rats and NOD mice) bred for increased incidence of diabetes. The methods of the invention can also be used in host animals that have been engineered to develop diabetes at a predetermined time (eg, upon exposure to a specific antigen). See, for example, Oldstone et al., APMIS 104: 689-97 (1996): von Herrath et al. Clin. Invest. 98: 1324-1331 (1996); Morgan et al. Immunol. 157: 978983 (1996). Other possible host animals are selected from Mus (eg mouse) and Rattus (eg rat), Oryctolagus (eg rabbit), and Mesocricetus (eg hamster), and Cavia (eg guinea pig) Examples include animals belonging to the genus. In general, mammals with normal fully grown adult weight of less than 1 kg that are easy to mate and maintain can be used.

タンパク質発現を決定するための方法。タンパク質発現は、一次元または二次元ゲル電気泳動およびイムノブロッティングを含む、当該分野で公知の種々に手段によって評価され得る。 A method for determining protein expression. Protein expression can be assessed by various means known in the art, including one-dimensional or two-dimensional gel electrophoresis and immunoblotting.

二次元ゲル電気泳動（2-DGE）は、タンパク質の混合物を分離するための特に有効な方法である（Andersenら、Diabetes44:400-407（1995)）。細胞タンパク質抽出物は、ゲル上に載せられ、そして個々のタンパク質は、最初に電荷によって、次いで大きさによって分離される。結果は、それぞれが通常は単一のタンパク質である、1,000〜5,000個程度のスポットの特徴的な写真である。解像度は、ゲルの大きさを大きくすることによって、ならびに放射性標識法、銀染色の使用、および1.5mm以下にゲルの厚さを薄くすることによって感受性を増強することによって改善される。 Two-dimensional gel electrophoresis (2-DGE) is a particularly effective method for separating protein mixtures (Andersen et al., Diabetes 44: 400-407 (1995)). Cellular protein extracts are placed on a gel and individual proteins are separated first by charge and then by size. The result is a characteristic photograph of as many as 1,000 to 5,000 spots, each usually a single protein. Resolution is improved by increasing the size of the gel and by increasing the sensitivity by using radiolabeling methods, the use of silver staining, and reducing the thickness of the gel below 1.5 mm.

糖尿病媒介タンパク質の単離のための方法。以下の実施例に記載されるように、2Dゲルから回収される単一のタンパク質が、各ペプチドのトリプシン切断パターンおよび正確な分子量を得るために質量スペクトル分析によって同定され得る。次いで、これらの観察された値は、以前に同定されたタンパク質と適合するものが存在するかどうかを決定するために、DNAおよびタンパク質のデータベースを検索するために使用される。同一性は、既知のタンパク質から決定され得るか、または既知のタンパク質に対する高い相同性によって推定され得る。2Dゲル電気泳動が、糖尿病の発症の間の変化した合成を示すタンパク質のスポットを分離および同定するために使用される場合、同定されたタンパク質スポットはゲルから切り出され、そしてペプチドを産生するためにトリプシンで消化される。ペプチドはゲルから回収され、そして質量スペクトル分析（マトリックス補助レーザー吸収／イオン化質量スペクトル分析）（MALDI）に供され、そして得られるMS-プロフィールが、公の配列ベータベース中に見出される全ての配列のコンピューター化されたMS-プロフィールに対して、および適切な配列情報に対して分析される。以前にクローニングされた配列に対するいくらかの適合が得られる場合、対応する遺伝子およびコードされるタンパク質についての情報が集められる。同定された糖尿病媒介タンパク質が以前にクローニングされているタンパク質と適合しない場合は、タンパク質は、当該分野で公知の方法によって微配列決定されて、部分的なアミノ酸配列情報が得られ得る（以下の実施例５を参照のこと）。データベース検索またはアミノ酸配列決定によって得られた結果に基づいて、特異的なまたは縮重プライマーが構築され、そしてラットおよびヒト島ライブラリーをスクリーニングするために使用されるか、またはPCRによる第１鎖cDNAが、対応するcDNA配列の部分的配列をクローニングするために使用される。次いで、得られた配列は、5'-racePCRまたは従来のハイブリダイゼーションスクリーニング技術のいずれかによって完全長のコード領域を得るため、続く組換えタンパク質の発現のために使用される（Karlsenら、Proc.Natl. Acad．Sci．USA 88:8337-8341(1991)；Karlsenら、Insulin secretion and pancreaticB-cell research、Flatt，P.R.編、Smith-Gordon、USA；第64章、１〜９頁（1994）；Karlsenら、Diabetes44:757-758（1995)）。 A method for the isolation of diabetes-mediating proteins. As described in the examples below, a single protein recovered from a 2D gel can be identified by mass spectral analysis to obtain the tryptic cleavage pattern and the correct molecular weight of each peptide. These observed values are then used to search DNA and protein databases to determine if there is a match for a previously identified protein. Identity can be determined from known proteins or estimated by high homology to known proteins. When 2D gel electrophoresis is used to separate and identify protein spots that exhibit altered synthesis during the onset of diabetes, the identified protein spots are excised from the gel and produce peptides Digested with trypsin. The peptide is recovered from the gel and subjected to mass spectral analysis (Matrix Assisted Laser Absorption / Ionization Mass Spectral Analysis) (MALDI) and the resulting MS-profile of all sequences found in the public sequence beta base Analyzed against computerized MS-profile and against appropriate sequence information. If some match to the previously cloned sequence is obtained, information about the corresponding gene and encoded protein is collected. If the identified diabetes-mediating protein is not compatible with a previously cloned protein, the protein can be microsequenced by methods known in the art to obtain partial amino acid sequence information (see below). See Example 5). Based on results obtained by database searching or amino acid sequencing, specific or degenerate primers are constructed and used to screen rat and human islet libraries or first strand cDNA by PCR Are used to clone partial sequences of the corresponding cDNA sequences. The resulting sequence is then used for subsequent expression of the recombinant protein to obtain the full-length coding region by either 5'-race PCR or conventional hybridization screening techniques (Karlsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8337-8341 (1991); Karlsen et al. Karlsen et al., Diabetes 44: 757-758 (1995)).

糖尿病媒介タンパク質は、生物学的材料からの精製、組換えDNAの発現を含む、当該分野で公知の種々の方法で単離され得る（上記を参照のこと）。従来の方法の工程は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および電気泳動を含む。例えば、糖尿病媒介タンパク質を発現する細胞は、遠心分離によってまたは適切な緩衝液を用いて回収され得、溶解され得、そしてカラムクロマトグラフィー（例えば、DEAE-セルロース、ホスホセルソース、ポリリボシチジル酸アガロース、ヒドロキシアパタイト）、または電気泳動、または免疫沈降によってタンパク質が単離され得る。あるいは、糖尿病媒介タンパク質は、特異的な抗体の使用によって免疫沈降によって単離され得る。 Diabetes-mediating proteins can be isolated by various methods known in the art, including purification from biological material, expression of recombinant DNA (see above). Conventional method steps include extraction, precipitation, chromatography, affinity chromatography, and electrophoresis. For example, cells expressing diabetes-mediating proteins can be harvested by centrifugation or using appropriate buffers, lysed, and column chromatography (eg, DEAE-cellulose, phosphocellose, polyribocytidylate agarose, hydroxy The protein can be isolated by apatite), or electrophoresis, or immunoprecipitation. Alternatively, diabetes mediating proteins can be isolated by immunoprecipitation through the use of specific antibodies.

III．糖尿病媒介タンパク質トランスジーンを発現するトランスジェニック動物。 III. A transgenic animal expressing a diabetes-mediating protein transgene.

１つの局面において、本発明は、糖尿病媒介タンパク質をコードする遺伝子を含むトランスジェニック動物、および本発明のトランスジェニック動物の子孫であるトランスジェニック動物を含む。糖尿病媒介タンパク質をコードする遺伝子は、天然に存在するポリヌクレオチド配列、または部分的にもしくは全体が人工のポリヌクレオチド配列（すなわち、コドン配列が天然の遺伝子配列には存在しない）からなり得る。上昇したレベルの本発明の糖尿病媒介遺伝子の発現を有するトランスジェニック動物は、例えば、増強したプロモーター、および／または高コピー数の天然の遺伝子を用いる遺伝子の過剰発現によって得ることができる。トランスジェニック動物はまた、特に、１つ以上の糖尿病媒介タンパク質遺伝子（単数または複数）が除去されている動物とトランスジェニック動物とを交配させることによって産生される、ハイブリッドトランスジェニック動物を含む。 In one aspect, the present invention includes a transgenic animal comprising a gene encoding a diabetes-mediating protein, and a transgenic animal that is a descendant of the transgenic animal of the present invention. The gene encoding the diabetes-mediating protein can consist of a naturally occurring polynucleotide sequence or a partially or wholly artificial polynucleotide sequence (ie, the codon sequence is not present in the naturally occurring gene sequence). Transgenic animals with elevated levels of expression of the diabetes-mediating genes of the present invention can be obtained, for example, by overexpression of genes using enhanced promoters and / or high copy number natural genes. Transgenic animals also specifically include hybrid transgenic animals produced by crossing an animal from which one or more diabetes-mediating protein gene (s) have been removed with a transgenic animal.

本発明のトランスジェニック動物は、糖尿病の発症の際の候補の防御または有害糖尿病媒介タンパク質の効果を決定するためのアッセイを含む、多数の方法において有用である。例えば、候補防御タンパク質のトランスジーンを有するトランスジェニック動物は、糖尿病の発症の際の防御トランスジーンの発現の効果を決定するために有用である。 The transgenic animals of the invention are useful in a number of methods, including assays for determining the efficacy of a candidate defense or harmful diabetes-mediating protein during the development of diabetes. For example, a transgenic animal having a candidate protective protein transgene is useful for determining the effect of expression of the protective transgene upon the development of diabetes.

好ましい宿主動物は、マウス、ラット、およびハムスターであり、ラット、およびマウスは、トランスジェニック動物の産生についての多くの知見が存在する点で最も好ましい。他の可能性のある宿主動物として、Mus（例えば、マウス）、Rattus（例えば、ラット）、Oryctolagus（例えば、ウサギ）、Mesocricetus（例えば、ハムスター）、およびCavia（例えば、モルモット）から選択される属に属する動物が挙げられる。一般に、交配および維持が容易である、１kg未満の正常の完全に成長した生体体重を有する哺乳動物が、使用され得る。 Preferred host animals are mice, rats, and hamsters, and rats and mice are most preferred in that there is much knowledge about the production of transgenic animals. Other possible host animals are genera selected from Mus (eg mouse), Rattus (eg rat), Oryctolagus (eg rabbit), Mesocricetus (eg hamster), and Cavia (eg guinea pig) Animals belonging to In general, mammals with a normal fully grown live weight of less than 1 kg that are easy to mate and maintain can be used.

本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物（好ましくは、ラットまたはマウス）は、哺乳動物またはその哺乳動物の祖先に胚または生殖細胞段階に導入された、糖尿病媒介タンパク質（例えば、１つ以上の防御タンパク質または有害タンパク質）をコードする遺伝子を、有核細胞のいくらかまたは全ての中に有する。この「胚段階」は、胎児の胚発生の全ての段階にわたる、時間の概念による任意の時点（例えば、***または卵子が外来遺伝子を保有する時）であり得る。本明細書中で使用される「トランスジェニック動物」は、その有核細胞の全てまたはいくらかの中に、同種または異種に由来する１つ以上の遺伝子を有する哺乳動物を示す；外来遺伝子を有する細胞が動物の生殖系細胞を含む場合、遺伝子は、動物の子孫に伝達され得る。 A transgenic non-human mammal (preferably a rat or mouse) of the invention is a diabetes-mediating protein (eg, one or more protective proteins) that has been introduced into the mammal or its ancestors at the embryonic or germline stage. Or a gene encoding a harmful protein) in some or all of the nucleated cells. This “embryonic stage” can be any point in time, such as when a sperm or egg carries a foreign gene, throughout all stages of embryonic embryonic development. As used herein, “transgenic animal” refers to a mammal having one or more genes derived from the same or different species in all or some of its nucleated cells; cells having a foreign gene When contains animal germline cells, the gene can be transmitted to the animal's offspring.

本発明の遺伝子構築物および方法論は、それらの遺伝的成り立ちにより糖尿病を発症し、そして予想される時間に疾患の症状を示す動物を作成するために使用され得る。好ましい実施態様において、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、70±10日で80％の糖尿病の発病率を示し、より好ましくは、60±５日で90％の糖尿病の発病率を示し；最も好ましくは、55±５日で95％の糖尿病の発病率を示し；そしてなおより好ましくは、50±５日で97％の糖尿病の発症率を示す。本発明の動物は、候補の防御または有害糖尿病媒介タンパク質、または糖尿病の発症を予防、増強、または遅延させる化合物の能力を試験するためのアッセイで使用される。 The genetic constructs and methodologies of the present invention can be used to create animals that develop diabetes due to their genetic origin and exhibit symptoms of the disease at the expected time. In a preferred embodiment, the transgenic mammal of the invention exhibits an incidence of 80% diabetes at 70 ± 10 days, more preferably an incidence of 90% diabetes at 60 ± 5 days; Exhibits a 95% diabetes incidence at 55 ± 5 days; and even more preferably a 97% diabetes incidence at 50 ± 5 days. The animals of the invention are used in assays to test candidate protective or harmful diabetes-mediating proteins, or the ability of compounds to prevent, enhance, or delay the onset of diabetes.

本発明の１つの局面において、本発明の遺伝子構築物および方法論が、候補の防御または有害タンパク質をコードするトランスジーンを有する動物を作成するために使用される。トランスジェニック動物は、糖尿病を発症しやすい遺伝的バックグラウンドによって選択され得るか、または予想可能な糖尿病を、短期間に発症する二重トランスジェニック動物であり得る。本発明のこの実施態様において、動物は、疾患の発病率を阻害するかまたは低下させる候補の防御タンパク質の能力を試験するためのアッセイにおいて使用される。関連する局面において、動物は、防御タンパク質の発現を誘導する化合物の能力を試験するため、およびそれにより疾患の発症から動物を防御するためのアッセイにおいて使用される。 In one aspect of the invention, the genetic constructs and methodologies of the invention are used to create animals having a transgene encoding a candidate defense or harmful protein. The transgenic animals can be selected according to a genetic background susceptible to developing diabetes or can be double transgenic animals that develop predictable diabetes in a short time. In this embodiment of the invention, the animals are used in an assay to test the ability of candidate protective proteins to inhibit or reduce disease incidence. In a related aspect, animals are used in assays to test the ability of compounds to induce the expression of protective proteins and thereby protect the animals from the development of disease.

本発明の1つの局面において、本発明の遺伝子構築物および方法論は、それらの遺伝的成り立ちにより予想される時間内に糖尿病を発症する動物を作成するために使用される。例えば、1つの実施態様において、例えばモルタリンのような有害な糖尿病媒介疾患を発現するトランスジェニック動物が作成される。本発明の動物は、糖尿病の発症を防止するかまたは遅延することのできる試験化合物のアッセイにおいて使用される。1つの実施態様において、コピー数の増大は疾患の発症に必要な時間を短縮する傾向があるので、比較的高いコピー数でトランスジェニック動物中で有害タンパク質遺伝子を含むことが好ましい。 In one aspect of the invention, the genetic constructs and methodologies of the invention are used to create animals that develop diabetes within the time expected by their genetic origin. For example, in one embodiment, a transgenic animal is created that expresses a detrimental diabetes-mediated disease such as mortalin. The animals of the invention are used in assays for test compounds that can prevent or delay the onset of diabetes. In one embodiment, it is preferred to include the harmful protein gene in the transgenic animal at a relatively high copy number, since increasing copy number tends to reduce the time required for disease onset.

さらに、調整が、コピー数を増大させることなく発現のレベルを上昇させるために、増強プロモーターの特定の型の使用に関してなされ得る。コピー数の増大を伴わずに糖尿病媒介タンパク質トランスジーンの発現の増強を提供する特定の型の増強プロモーターは、公知である。増強プロモーターは、構成的または誘導的に作動し得る。 Furthermore, adjustments can be made regarding the use of specific types of enhanced promoters to increase the level of expression without increasing copy number. Certain types of enhanced promoters that provide enhanced expression of diabetes-mediated protein transgenes without increasing copy number are known. An enhanced promoter can operate constitutively or inducibly.

本発明はまた、糖尿病または糖尿病関連疾患についての動物モデルを作成するための手段を提供する。本発明のトランスジェニック動物は、糖尿病の可能性のある治療法を開発および試験する方法を提供し、そして最終的にこの疾患の治癒を導く。 The present invention also provides a means for creating animal models for diabetes or diabetes related diseases. The transgenic animals of the invention provide a way to develop and test potential therapies for diabetes and ultimately lead to the cure of the disease.

IV．糖尿病媒介タンパク質の発現をもたらし得る薬物のスクリーニングのためのアッセイ。 IV. Assays for screening for drugs that can result in the expression of diabetes-mediating proteins.

本発明によって提供されるアッセイ方法は、糖尿病媒介タンパク質の発現をもたらし得る、従って、哺乳動物における糖尿病の発症をもたらし得る化合物をスクリーニングするために有用である。１つ以上の糖尿病媒介タンパク質の発現をもたらし得る薬物をスクリーニングするための1つのモデルは、培養物中の細胞に有利な効果を有すると推測される化合物（アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む）の投与である。有用な細胞は、RIN、トランスフェクトされた細胞、または島細胞である。次いで、タンパク質の発現に対する試験化合物の効果は、2Dゲル電気泳動によってアッセイされ得る。 The assay methods provided by the present invention are useful for screening for compounds that can result in the expression of diabetes-mediating proteins and thus can lead to the development of diabetes in mammals. One model for screening for drugs that can result in the expression of one or more diabetes-mediating proteins is the administration of compounds (including antisense oligonucleotides) suspected of having a beneficial effect on cells in culture. is there. Useful cells are RIN, transfected cells, or islet cells. The effect of the test compound on protein expression can then be assayed by 2D gel electrophoresis.

別のスクリーニングモデルは、糖尿病の発症の危険性を有する哺乳動物を使用するインビボの方法である。簡潔には、糖尿病の増大した危険性を有する哺乳動物（例えば、糖尿病の傾向があるBBラット、またはNODマウス）が、試験化合物に曝され、そして糖尿病の発症に対する試験化合物への暴露の効果が決定される。 Another screening model is an in vivo method using mammals at risk of developing diabetes. Briefly, mammals with an increased risk of diabetes (eg, BB rats or NOD mice prone to diabetes) are exposed to the test compound and the effect of exposure to the test compound on the development of diabetes is It is determined.

糖尿病の発症は、１つ以上の糖尿病媒介タンパク質の発現を決定することによって発症の期間にわたってモニターされ、そして疾患の発病の時間と、疾患の発症の非存在下での発現および時期とを比較することによって比較され得る。１つ以上の糖尿病媒介タンパク質の発現の決定は、糖尿病媒介タンパク質自体、翻訳後の改変産物、および／または糖尿病媒介タンパク質分解産物を含む。1つの実施態様において、糖尿病媒介タンパク質の活性化は、試験サンプル中の糖尿病媒介タンパク質発現のレベルを測定することによって決定される。適切な試験サンプルとして、体液（例えば、血液、尿、または髄液）、またはそれらに由来する液体（例えば、血漿または血清）が挙げられる。特定の実施態様において、試験サンプル中のタンパク質発現のレベルは、ウエスタンブロット分析によって測定される。サンプル中に存在するタンパク質は、ゲル電気泳動によって分画され、メンブレンに移され、そしてタンパク質（単数または複数）に特異的な標識抗体でプローブされる。別の特異的な実施態様において、糖尿病媒介タンパク質の発現レベルは、ノーザンブロット分析によって測定される。ポリアデニル化［poly(A)⁺］mRNAが試験サンプルから単離される。mRNAは、電気泳動によって分画され、そしてメンブレンに移される。メンブレンは、標識cDNAでブローブされる。別の実施態様において、タンパク質発現は、発現されたmRNAに対して適用された定量的PCRによって測定される。 The onset of diabetes is monitored over the period of onset by determining the expression of one or more diabetes-mediating proteins, and the time of onset of the disease is compared with the onset and timing of the onset of the disease. Can be compared. Determining the expression of one or more diabetes mediating proteins includes the diabetes mediating protein itself, a post-translational modification product, and / or a diabetes mediating protein degradation product. In one embodiment, activation of diabetes-mediating protein is determined by measuring the level of diabetes-mediating protein expression in the test sample. Suitable test samples include body fluids (eg, blood, urine, or spinal fluid) or fluids derived therefrom (eg, plasma or serum). In certain embodiments, the level of protein expression in the test sample is measured by Western blot analysis. Proteins present in the sample are fractionated by gel electrophoresis, transferred to a membrane, and probed with a labeled antibody specific for the protein or proteins. In another specific embodiment, the expression level of diabetes-mediating protein is measured by Northern blot analysis. Polyadenylated [poly (A) ⁺ ] mRNA is isolated from the test sample. The mRNA is fractionated by electrophoresis and transferred to a membrane. The membrane is probed with labeled cDNA. In another embodiment, protein expression is measured by quantitative PCR applied to the expressed mRNA.

より特定の実施態様において、糖尿病を発症し得る哺乳動物は、糖尿病の発病率を増大させるために交配された哺乳動物株から選択される哺乳動物である。好ましくは、哺乳動物は、69±25日で75％の糖尿病の発病の機会を示す株から選択される。より好ましくは、哺乳動物は、予想される時間内に糖尿病の高い発病率を示すように操作されたトランスジェニック哺乳動物である、特定の実施態様において、トランスジェニック哺乳動物は、70±10日で80％の糖尿病の発病率を示し；より好ましくは、60±５日で90％の糖尿病の発病率を示し；最も好ましくは、55±５日で95％の糖尿病の発病率を示し；そしてなおより好ましくは、50±５日で97％の糖尿病の発症率を示す。 In a more particular embodiment, the mammal capable of developing diabetes is a mammal selected from mammalian strains that have been mated to increase the incidence of diabetes. Preferably, the mammal is selected from a strain that exhibits a chance of developing 75% diabetes in 69 ± 25 days. More preferably, the mammal is a transgenic mammal that has been engineered to exhibit a high incidence of diabetes within the expected time. In certain embodiments, the transgenic mammal is at 70 ± 10 days. Showing an incidence of 80% diabetes; more preferably showing an incidence of 90% diabetes in 60 ± 5 days; most preferred showing an incidence of 95% diabetes in 55 ± 5 days; and still More preferably, the incidence of diabetes is 97% in 50 ± 5 days.

なお別の局面において、本発明は、内因性の有害タンパク質の発現を抑制または減少させ得る化合物を同定するための方法、および内因性の有害タンパク質の発現を抑制または減少させ得る化合物の治療有効量を投与することによって糖尿病を予防および／または処置する方法を提供する。 In yet another aspect, the present invention provides a method for identifying a compound capable of suppressing or reducing endogenous harmful protein expression, and a therapeutically effective amount of a compound capable of suppressing or reducing endogenous harmful protein expression. To prevent and / or treat diabetes.

本発明の糖尿病媒介タンパク質はまた、糖尿病媒介タンパク質活性を調節する試薬をスクリーニングするために有用である。従って、１つの局面において、本発明は、糖尿病媒介タンパク質を発現する細胞を試験試薬とともにインキュベートし、そして糖尿病媒介タンパク質の合成、リン酸化、機能、または活性に対する試験試薬の効果を測定することにより、糖尿病媒介タンパク質の活性を調節する試薬を同定する方法を特徴とする。糖尿病媒介タンパク質の活性化がリン酸化を介する場合、試験試薬は、糖尿病媒介タンパク質と、γ標識-ATPまたは［³⁵S］メチオニンのいずれかとともにインキュベートされ、そしてリン酸化の速度が決定される。別の実施態様において、試験試薬は、糖尿病媒介タンパク質ポリヌクレオチド発現ベクターでトランスフェクトされた細胞とともにインキュベートされ、そして糖尿病媒介タンパク質の転写に対する試験試薬の効果がノーザンブロット分析によって測定される。さらなる実施態様において、糖尿病媒介タンパク質の合成に対する試験試薬の効果が、糖尿病媒介タンパク質に対する抗体を使用するウェスタンブロット分析によって測定される。なお別の実施態様において、糖尿病媒介タンパク質活性に対する試薬の効果が、糖尿病媒介タンパク質を、試験試薬、［³²P］-ATP、および糖尿病媒介タンパク質経路の基質とともにインキュベートすることによって測定される。全ての実験は、タンパク質発現の調節を決定するために、通常の［³⁵S］メチオニン標識した細胞と比較される。基質のリン酸化の速度は、当該分野で公知の方法によって決定される。 The diabetes-mediating proteins of the invention are also useful for screening reagents that modulate diabetes-mediating protein activity. Accordingly, in one aspect, the present invention comprises incubating a cell expressing a diabetes-mediating protein with a test reagent and measuring the effect of the test reagent on the synthesis, phosphorylation, function, or activity of the diabetes-mediating protein, Features a method of identifying a reagent that modulates the activity of a diabetes-mediating protein. If activation of the diabetes-mediating protein is mediated by phosphorylation, the test reagent is incubated with the diabetes-mediating protein, either γ-labeled-ATP or [ ³⁵ S] methionine, and the rate of phosphorylation is determined. In another embodiment, the test reagent is incubated with cells transfected with a diabetes-mediating protein polynucleotide expression vector, and the effect of the test reagent on diabetes-mediated protein transcription is measured by Northern blot analysis. In a further embodiment, the effect of the test reagent on the synthesis of diabetes-mediating protein is measured by Western blot analysis using an antibody against the diabetes-mediating protein. In yet another embodiment, the effect of a reagent on diabetes-mediated protein activity is measured by incubating the diabetes-mediated protein with a test reagent, [ ³² P] -ATP, and a substrate for the diabetes-mediated protein pathway. All experiments are compared to normal [ ³⁵ S] methionine labeled cells to determine the regulation of protein expression. The rate of substrate phosphorylation is determined by methods known in the art.

用語、糖尿病媒介タンパク質活性の調節は、アゴニストおよびアンタゴニストを含む。本発明は、有害タンパク質の活性を阻害する試薬をスクリーニングするために特に有用である。このような試薬は、糖尿病の処置または予防に有用である。 The term modulation of diabetes-mediated protein activity includes agonists and antagonists. The present invention is particularly useful for screening reagents that inhibit the activity of harmful proteins. Such reagents are useful for the treatment or prevention of diabetes.

Ｖ．治療適用
本発明は、治療有効量の防御糖尿病媒介タンパク質を投与することによる、哺乳動物において糖尿病を予防および／または処置するための方法を提供する。好ましくは、哺乳動物は、糖尿病の危険性を有するヒト被験体である。 V. Therapeutic Applications The present invention provides a method for preventing and / or treating diabetes in a mammal by administering a therapeutically effective amount of a protective diabetes-mediating protein. Preferably, the mammal is a human subject at risk for diabetes.

同定した糖尿病媒介タンパク質および関連する糖尿病治療薬を使用する薬物スクリーニング。本発明の薬物スクリーニングアッセイにおいて、同定した防御または有害糖尿病媒介タンパク質が、それらの発現をもたらし得る試験化合物を同定するために使用される。そのように同定された試験化合物は、危険性を有する被験体における糖尿病の発病を妨げる、緩和する、または遅延させるための候補治療薬である。 Drug screening using identified diabetes-mediating proteins and related diabetes therapeutics. In the drug screening assays of the present invention, the identified protective or harmful diabetes-mediating proteins are used to identify test compounds that can lead to their expression. Test compounds so identified are candidate therapeutics for preventing, alleviating, or delaying the onset of diabetes in subjects at risk.

糖尿病媒介タンパク質の発現をもたらしる試験治療化合物は、以下であり得るがこれらに限定されない：核酸、化合物、タンパク質、エレメント、脂質、抗体、糖類、放射性同位元素、炭水化物、画像化剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、検出可能なプローブ、および抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つ。これらは、本明細書中に記載のように、抗体を標識するために検出可能に標識され得る。このような標識として以下が挙げられるが、これらに限定されない：酵素標識、放射性同位元素または放射活性化合物またはエレメント、蛍光化合物または金属、化学発光化合物および生物発光化合物。 Test therapeutic compounds that result in the expression of diabetes-mediating proteins can be but are not limited to: nucleic acids, compounds, proteins, elements, lipids, antibodies, sugars, radioisotopes, carbohydrates, imaging agents, lipoproteins, At least one selected from glycoproteins, enzymes, detectable probes, and antibodies or fragments thereof, or any combination thereof. These can be detectably labeled to label the antibody as described herein. Such labels include, but are not limited to: enzyme labels, radioisotopes or radioactive compounds or elements, fluorescent compounds or metals, chemiluminescent compounds and bioluminescent compounds.

治療化合物は、防御タンパク質の発現を誘導または増強し、その結果、糖尿病の発症の危険性を有する被験体において疾患の発症を予防または遅延させるその能力によって、本発明の薬物スクリーニングアッセイにおいて同定される。候補の治療化合物がまた、有害タンパク質の発現を妨げるかまたは減少させ、その結果、糖尿病の発症の危険性を有する被験体において疾患の発症を妨げるかまたは遅延させるその能力によって、同定される。 A therapeutic compound is identified in the drug screening assay of the present invention by its ability to induce or enhance the expression of protective proteins, thereby preventing or delaying the onset of disease in a subject at risk of developing diabetes. . Candidate therapeutic compounds are also identified by their ability to prevent or reduce the expression of harmful proteins, thereby preventing or delaying the onset of the disease in subjects at risk of developing diabetes.

治療化合物としての治療用核酸は、標的細胞に対して少なくとも1つの以下の治療効果を有するが、これらに限定されない：有害タンパク質のDNA配列の転写の阻害；有害タンパク質のRNA配列の翻訳の阻害；有害タンパク質に対応するRNAまたはDNA配列の逆転写の阻害；タンパク質の翻訳後修飾の阻害；防御タンパク質に対応するDNA配列の転写の誘導；防御タンパク質に対応するRNA配列の翻訳の誘導；防御タンパク質に対応するRNAまたはDNA配列の逆転写の誘導；タンパク質または酵素としての核酸の翻訳；ならびに治療用核酸の構成的または一過性の発現のための標的細胞の染色体への核酸の組み込み。 A therapeutic nucleic acid as a therapeutic compound has at least one of the following therapeutic effects on a target cell, including but not limited to: inhibition of transcription of a harmful protein DNA sequence; inhibition of translation of a harmful protein RNA sequence; Inhibition of reverse transcription of RNA or DNA sequences corresponding to harmful proteins; inhibition of post-translational modification of proteins; induction of transcription of DNA sequences corresponding to protection proteins; induction of translation of RNA sequences corresponding to protection proteins; Induction of reverse transcription of the corresponding RNA or DNA sequence; translation of the nucleic acid as a protein or enzyme; and integration of the nucleic acid into the chromosome of the target cell for constitutive or transient expression of the therapeutic nucleic acid.

治療用核酸の治療効果は、以下を含み得るが、これらに限定されない：アンチセンスRNAまたはDNAのような、有害遺伝子をオフにするかまたはその発現をプロセシングする；ウイルスの複製または合成を阻害する；治療用タンパク質または対応する欠損タンパク質をコードする異種核酸を発現するような遺伝子治療；hnRNA、mRNA、tRNA、またはrRNAのようなRNAの欠損または過少発現を改変する；薬物、プロドラッグ、または糖尿病媒介タンパク質もしくはペプチドを発現する病理学的細胞もしくは正常細胞中の薬物もしくはプロドラッグのような化合物を生成する酵素をコードする；ならびに任意の他の公知の治療効果。 The therapeutic effects of therapeutic nucleic acids may include, but are not limited to: turn off or process the expression of harmful genes, such as antisense RNA or DNA; inhibit viral replication or synthesis Gene therapy such as expressing a heterologous nucleic acid encoding a therapeutic protein or corresponding defective protein; altering the deficiency or underexpression of RNA such as hnRNA, mRNA, tRNA, or rRNA; drug, prodrug, or diabetes Encodes enzymes that produce compounds such as drugs or prodrugs in pathological or normal cells that express mediator proteins or peptides; and any other known therapeutic effect.

防御糖尿病媒介タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供することによる遺伝子治療もまた、本発明に含まれる。 Gene therapy by providing a polynucleotide encoding a protective diabetes-mediating protein is also included in the present invention.

本発明はさらに、インビボでの有害糖尿病媒介タンパク質の発現を阻害するポリヌクレオチドの治療有効量を投与するよって糖尿病を予防するための方法を含む。 The invention further includes a method for preventing diabetes by administering a therapeutically effective amount of a polynucleotide that inhibits expression of a harmful diabetes-mediating protein in vivo.

本発明の治療方法において、治療化合物は、ヒト患者に慢性的または急性的に投与される。必要に応じて、防御タンパク質が、治療化合物とは異なる経路で作用する、有効量の化合物と組み合わせて慢性的に投与される。本発明の治療化合物は、糖尿病の他の処置または糖尿病の管理方法と併用され得る。 In the therapeutic methods of the invention, the therapeutic compound is administered chronically or acutely to a human patient. If desired, protective proteins are administered chronically in combination with an effective amount of the compound that acts by a different route than the therapeutic compound. The therapeutic compounds of the present invention may be used in combination with other treatments for diabetes or methods for managing diabetes.

糖尿病を処置または予防するための治療化合物の治療処方物は、任意の生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版、Oslo，A.編、1980）を所望の純度で有する化合物と混合されることによって、凍結乾燥された塊または水溶液の形態での貯蔵のために調製される。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そして以下を含む：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンのようなアミノ酸；一単糖、二単糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；EDTAのようなキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成カウンターイオン；ならびに／あるいはTween、Pluronics、またはポリエチレングリコール（PEG）のような非イオン性界面活性剤。化合物はまた、種々の非タンパク質ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）の１つに適切に、米国特許第4,640,835号、同第4,496,689号；同第4,301,144号；同第4,670,417号；同第4,791、192号、または同第4,179,337号に示される様式で連結される。処方物中で使用されるキャリアの量は、約１〜99重量％、好ましくは、約80〜99重量％、必要に応じて90〜99重量％の間の範囲であり得る。 A therapeutic formulation of a therapeutic compound for treating or preventing diabetes is any physiologically acceptable carrier, excipient, or stabilizer (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. Ed., 1980). Is prepared for storage in the form of a lyophilized mass or aqueous solution by mixing with a compound having the desired purity. Acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations used and include: phosphates, citrates, and other organic acids Buffers such as; antioxidants including ascorbic acid; small molecule (less than about 10 residues) polypeptides; proteins such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulin; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; glycine, Amino acids such as glutamine, asparagine, arginine, or lysine; monosaccharides, dimonosaccharides, and other carbohydrates including glucose, mannose, or dextrin; chelating agents such as EDTA; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol Salt forming counter ions such as sodium; and / or Tween, Pluronics Or nonionic surfactants such as polyethylene glycol (PEG). The compound is also suitable for one of a variety of non-protein polymers (eg, polyethylene glycol, polypropylene glycol, or polyoxyalkylene), US Pat. Nos. 4,640,835, 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417. Connected in the manner shown in US Pat. No. 4,791,192 or US Pat. No. 4,179,337. The amount of carrier used in the formulation can range from about 1-99% by weight, preferably about 80-99% by weight, optionally between 90-99% by weight.

インビボでの投与に使用される治療化合物は、滅菌でなければならない。これは、当該分野で公知の方法によって（例えば、凍結乾燥および再構成前のまたは後の滅菌の濾過メンブレンを通す濾過によって）容易に達成される。治療化合物は通常、凍結乾燥形態でまたは溶液中におかれる。 The therapeutic compound used for in vivo administration must be sterile. This is readily accomplished by methods known in the art (eg, by filtration through a sterile filtration membrane before or after lyophilization and reconstitution). The therapeutic compound is usually placed in lyophilized form or in solution.

治療組成物は一般に、滅菌の接触穴を有する容器（例えば、静脈内溶液バッグ、またはストッパー付きの刺し通すことができる皮下注射針のバイアル）内に入れられる。 The therapeutic composition is generally placed in a container with sterile contact holes (eg, an intravenous solution bag or a pierceable hypodermic needle vial with a stopper).

慢性の様式での治療化合物の投与は、例えば、以下の経路の１つである：静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、または病変内経路による注入または注射、経口、あるいはいかに記載されるような徐放システムを使用して。治療化合物は、クリアランス速度が十分に遅い場合は注射または周期的な大量瞬時投与によって連続的に投与されるか、あるいは血流またはリンパへの投与によって投与される。好ましい投与の態様は、目的の組織（β細胞または膵臓細胞）に対して指向され、その結果、供給源に対して分子を標的化し、そして化合物の副作用を最小にする。 Administration of the therapeutic compound in a chronic manner is, for example, one of the following routes: infusion or injection by intravenous, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, or intralesional route, oral Or using a sustained release system as described. The therapeutic compound is administered continuously by injection or periodic bolus administration if the clearance rate is sufficiently slow, or by administration to the bloodstream or lymph. Preferred modes of administration are directed against the tissue of interest (β cells or pancreatic cells), thus targeting the molecule to the source and minimizing compound side effects.

除放調製物の適切な例として、タンパク質を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。このマトリックスは、成形された粒子（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の形態である。徐放マトリックスの例として以下が挙げられる：ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）（Langerら、J. Biomed．Mater．Res．15:167-277（1981)およびLangerChem．Tech．12:98-105（1982）に記載される）、またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号、EP58,481）、L-グルタミン酸およびγ-エチル-L-グルタミン酸塩のコポリマー（Sidmanら、Biopolymers 22:547-556（1983)）、非分解性エチレンビニルアセテート（Langerら、前出（1981)）、LupronDepot^TMのような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸-グリコール酸コポリマーおよびロイプロリド酢酸から構成される注射可能なマイクロスフェア）、ならびにポリ-D-(-)-3-ヒドロキシブチル酸（EP133,988）。 Suitable examples of sustained release preparations include solid hydrophobic polymer semipermeable matrices containing proteins. This matrix is in the form of shaped particles (eg, films or microcapsules). Examples of sustained release matrices include: polyesters, hydrogels such as poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981) and LangerChem. Tech. 12: 98-105 (1982)), or poly (vinyl alcohol), polylactide (US Pat. No. 3,773,919, EP58,481), a copolymer of L-glutamic acid and γ-ethyl-L-glutamate ( Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983)), non-degradable ethylene vinyl acetate (Langer et al., Supra (1981)), degradable lactic acid-glycolic acid copolymers such as LupronDepot ^™ (lactic acid-glycolic acid copolymers and Injectable microspheres composed of leuprolide acetic acid), as well as poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid (EP133,988).

治療化合物はまた、調製されたマイクロカプセル中に、例えば、以下によって捕捉され得る：コアセルベーション技術または種間（interracial）重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセル、およびポリ-［メチルメタクリレート］マイクロカプセル）によって、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中、またはマイクロエマルジョン中。このような技術は、Remington'sPharmaceutical Sciences（前出）に開示されている。 The therapeutic compound can also be captured in the prepared microcapsules, for example by: coacervation techniques or interracial polymerization (eg, hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules, respectively, and poly- [methyl Methacrylate] microcapsules), in colloidal drug delivery systems (eg, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles, and nanocapsules) or in microemulsions. Such techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences (supra).

エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーが100日以上にわたって分子を放出し得るが、特定のヒドロゲルはより短期間に分子を放出する。カプセル化された分子が長期間体内に維持される場合、それらは、37℃にて湿気に曝された結果、変性または凝集し得、生物学的活性の欠失および免疫原性の可能な変化を生じる。合理的なストラテジーは、例えば、適切な添加剤の使用および特定のポリマーマトリックス組成物の開発により、関与するメカニズムに依存して安定化のために工夫され得る。 While polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid can release molecules for over 100 days, certain hydrogels release molecules in a shorter period of time. When encapsulated molecules remain in the body for extended periods of time, they can denature or aggregate as a result of exposure to moisture at 37 ° C, resulting in a loss of biological activity and possible changes in immunogenicity Produce. Reasonable strategies can be devised for stabilization depending on the mechanism involved, for example by using appropriate additives and developing specific polymer matrix compositions.

徐放組成物はまた、リポソームに捕捉された治療化合物（単数または複数）を含む。治療化合物（単数または複数）を含むリポソームは、それ自体が公知である方法によって調製される：DE 3,218,121；Epsteinら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:3688-3692（1985）；Hwangら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA77:4030-4034（1980）；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本国特許出願第83-118008号；米国特許第4,485,045号、および同第4,544,545号；ならびにEP102,324。通常、リポソームは、小さい（約200〜800オングストローム）単層型であり、ここで脂質含量は、約30mol％コレステロールより大きく、選択された比率が、適切なアゴニスト治療のために調節される。適切な徐放処方物の特定の例は、EP647,449にある。 The sustained release composition also includes the therapeutic compound (s) encapsulated in the liposomes. Liposomes containing the therapeutic compound (s) are prepared by methods known per se: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Japanese Patent Application No. 83-118008; US Pat. . Usually, liposomes are small (about 200-800 angstroms) monolayer type, where the lipid content is greater than about 30 mol% cholesterol and the selected ratio is adjusted for proper agonist treatment. A specific example of a suitable sustained release formulation is in EP 647,449.

治療的に使用される治療化合物の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態に依存する。従って、医師は、適切な治療効果を得るために必要な場合は、投与量を滴定することおよび投与経路を改変することが必要である。 The effective amount of therapeutic compound used therapeutically depends, for example, on the therapeutic objectives, the route of administration, and the condition of the patient. Therefore, the physician will need to titrate the dose and modify the route of administration if necessary to obtain an appropriate therapeutic effect.

２つの治療化合物がともに投与される場合、これらは、同じ経路で、そして同じ処方物中で投与される必要はない。しかし、これらは、所望される場合は、１つの処方物中で組み合わされ得る。両方の治療化合物が、それぞれの有効量で、またはそれぞれ最適に満たないが組み合わされた場合は効果である量で、患者に投与され得る。１つの実施態様において、両方の治療化合物の投与は、使用されるタンパク質の型に依存して、例えば、静脈内または皮下手段を使用して注射による。代表的には、医師は、投与量が糖尿病の処置または予防について所望の効果を達成する量に到達するまで、治療化合物（単数または複数）を投与する。例えば、この量は、糖尿病の症状を緩和し、そして正常血糖を回復する量である。この治療の進行は、従来のアッセイによって容易にモニターされる。 When two therapeutic compounds are administered together, they need not be administered by the same route and in the same formulation. However, they can be combined in one formulation if desired. Both therapeutic compounds may be administered to the patient in their respective effective amounts or in amounts that are each sub-optimal but effective when combined. In one embodiment, administration of both therapeutic compounds depends on the type of protein used, for example, by injection using intravenous or subcutaneous means. Typically, the physician will administer the therapeutic compound (s) until a dosage is reached that achieves the desired effect for the treatment or prevention of diabetes. For example, this amount is an amount that alleviates the symptoms of diabetes and restores normoglycemia. The progress of this therapy is easily monitored by conventional assays.

本発明のこの局面の特異的な実施態様において、治療化合物は、gal-3をコードする防御糖尿病媒介遺伝子および／またはgal-3の翻訳後改変産物である。代表的な、単独で使用される治療化合物の１日の投与量は、上記の因子に依存して患者の体重あたり約１μg/kg/日〜100mg/kg/日の範囲またはそれ以上であり、好ましくは約10μg/kg/日〜50mg/kg/日である。 In a specific embodiment of this aspect of the invention, the therapeutic compound is a protective diabetes-mediating gene encoding gal-3 and / or a post-translational modification product of gal-3. A typical daily dose of a therapeutic compound used alone is in the range of about 1 μg / kg / day to 100 mg / kg / day or more per patient body weight, depending on the above factors, Preferably, it is about 10 μg / kg / day to 50 mg / kg / day.

遺伝子治療。本発明はまた、防御ポリペプチドによって改善されるかまたは緩和される糖尿病および糖尿病関連障害の処置のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、インシュリン産生細胞への防御ポリヌクレオチドの導入によってその治療効果を達成する。防御ポリヌクレオチドの送達は、キメラウイルスのような組換え発現ベクター、またはコロイド状分散システムを使用して達成され得る。配列の治療的送達には、標的化リポソームの使用が特に好ましい。 Gene therapy. The invention also provides gene therapy for the treatment of diabetes and diabetes related disorders that are ameliorated or alleviated by protective polypeptides. Such treatment achieves its therapeutic effect by introducing protective polynucleotides into insulin producing cells. Delivery of protective polynucleotides can be accomplished using a recombinant expression vector such as a chimeric virus, or a colloidal dispersion system. The use of targeted liposomes is particularly preferred for therapeutic delivery of sequences.

本明細書中で教示される遺伝子治療のために利用され得る種々のウイルスベクターとして、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または好ましくは、レトロウイルスのようなRNAウイルスが挙げられる。好ましくは、インビトロの細胞の形質転換のためのレトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルスであるアデノウイルスの誘導体である。他のトランスフェクション法と比較してアデノウイルス形質導入の利点は、高いトランスフェクション効率および全島をトランスフェクトする能力である。さらに、発現のレベルが、使用されるウイルスの濃度および形質導入時間によって調節され得る。アデノウイルス媒介発現は一過性であるが、島内での発現は、少なくとも数週間の間安定である（Beckerら、J．Biol．Chem．269:21234（1994)；Korbuttら、TransplantationProc．27:3414（1995)）。 Various viral vectors that can be utilized for gene therapy as taught herein include adenoviruses, herpesviruses, vaccinia viruses, or preferably RNA viruses such as retroviruses. Preferably, the retroviral vector for in vitro cell transformation is a derivative of an adenovirus that is a murine or avian retrovirus. The advantage of adenovirus transduction compared to other transfection methods is the high transfection efficiency and ability to transfect the whole islet. Furthermore, the level of expression can be regulated by the concentration of virus used and the transduction time. Adenovirus-mediated expression is transient, but islet expression is stable for at least several weeks (Becker et al., J. Biol. Chem. 269: 21234 (1994); Korbutt et al., Transplantation Proc. 27: 3414 (1995)).

哺乳動物へのトランスジーンの安定な組み込みのために、レトロウイルスベクターが好ましい。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（MoMuLV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳腫瘍ウイルス（MuMTV）、およびラウス肉腫ウイルス（RSV）。好ましくは、被験体がヒトである場合、gibbonサル白血病ウイルス（GaLV）のようなベクターが利用される。多数のさらなるレトロウイルスベクターが、複数の遺伝子を取り込み得る。これらのベクターの全てが、選択マーカーの遺伝子を導入または取り込み得、その結果、形質導入した細胞が同定および作成され得る。特定の標的細胞に対するレセプターのリガンドをコードする別の遺伝子とともにウイルスベクター中に目的の糖尿病媒介タンパク質を挿入することによって、例えば、ベクターは、ここで標的特異的になる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質を付着させることによって標的特異的にされ得る。好ましい標的化は、レトロウイルスベクターを標的化する抗体を使用して達成される。当業者は、レトロウイルスゲノムに挿入され得るかまたはウイルスエンベロープに付着され得る特異的なポリヌクレオチド配列が、防御ポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にするか、または過度の実験を行うことなく容易に確認し得る。 Retroviral vectors are preferred for stable integration of the transgene into the mammal. Examples of retroviral vectors into which a single foreign gene can be inserted include, but are not limited to: Moloney murine leukemia virus (MoMuLV), Harvey murine sarcoma virus (HaMuSV), mouse mammary tumor virus (MuMTV) , And Rous sarcoma virus (RSV). Preferably, when the subject is a human, a vector such as gibbon simian leukemia virus (GaLV) is utilized. A number of additional retroviral vectors can incorporate multiple genes. All of these vectors can introduce or incorporate a gene for a selectable marker so that transduced cells can be identified and generated. By inserting the diabetes-mediating protein of interest into a viral vector along with another gene encoding a receptor ligand for a particular target cell, for example, the vector now becomes target-specific. Retroviral vectors can be made target specific, for example, by attaching sugars, glycolipids, or proteins. Preferred targeting is achieved using antibodies that target retroviral vectors. Those skilled in the art will recognize that specific polynucleotide sequences that can be inserted into the retroviral genome or attached to the viral envelope allow for target-specific delivery of retroviral vectors containing protective polynucleotides or undue experimentation. It can be easily confirmed without performing.

組換えレトロウイルスが欠損であるので、これらは、感染性ウイルス粒子を産生するために補助を必要とする。この補助は、例えば、LTR中の調節配列の制御下にレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株を使用することによって、提供され得る。これらのプラスミドは、キャプシド化のためにRNA転写物を認識するパッケージング機構を可能にするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルの欠失を有するヘルパー細胞株として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：例えば、ψ2、PA317、およびPA12。これらの細胞株は空のビリオンを産生する。なぜなら、ゲノムがパッケージングされないからである。レトロウイルスベクターは、パッケージングシグナルは完全であるが、構造遺伝子は他の目的の遺伝子と置き換えられているこのような細胞に導入される場合、ベクターはパッケージングされ得、そしてベクタービリオンが産生される。 Since recombinant retroviruses are defective, they require assistance to produce infectious viral particles. This assistance can be provided, for example, by using a helper cell line containing a plasmid that encodes all of the retroviral structural genes under the control of regulatory sequences in the LTR. These plasmids lack nucleotide sequences that allow a packaging mechanism to recognize RNA transcripts for encapsidation. Helper cell lines having a lack of packaging signal include, but are not limited to: ψ2, PA317, and PA12. These cell lines produce empty virions. This is because the genome is not packaged. When retroviral vectors are introduced into such cells where the packaging signal is complete, but the structural gene is replaced by another gene of interest, the vector can be packaged and vector virions are produced. The

あるいは、NIH 3T3または他の組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによってレトロウイルス構造遺伝子gag、pol、およびenvをコードするプラスミドで直接トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られる細胞は、培養培地にレトロウイルスベクターを放出する。 Alternatively, NIH 3T3 or other tissue culture cells can be directly transfected with a plasmid encoding the retroviral structural genes gag, pol, and env by conventional calcium phosphate transfection. These cells are then transfected with a vector plasmid containing the gene of interest. The resulting cells release the retroviral vector into the culture medium.

防御ポリヌクレオチドの別の標的化された送達システムは、コロイド状分散システムである。コロイド状分散システムとして、マクロ分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質に基づくシステムが挙げられる。本発明の好ましいコロイド状システムは、リポソームである。リポソームはインビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして有用な、人工的な膜ビヒクルである。0.2〜4.0μmの大きさの範囲である大きな単層ベシクル（LW）が、大きなマクロ分子を含有する水性緩衝液の実質的な割合をカプセル化し得る。RNA、DNA、および完全なビリオンは、水溶性の内部にカプセル化され得、そして生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る（Fraleyら、TrendsBiochem．Sci．6:77（1981)）。哺乳動物細胞に加えて、リポソームは、植物、酵母、および細菌細胞中でポリヌクレオチドを送達するために使用されている。リポソームが有効な遺伝子送達ビヒクルであるために、以下の特性が存在するべきである：（１）それらの生物学的活性を損傷することなく、高い効率で目的の遺伝子をカプセル化する；（２）非標的細胞と比較して、標的細胞に対する、優先的および実質的な結合；（３）高い効率で標的細胞の細胞質にベシクルの水溶性内容物を送達する；および（４）遺伝情報の迅速および効果的な発現（Manningら、Biotechniques6:682（1988)）。 Another targeted delivery system for protective polynucleotides is a colloidal dispersion system. Colloidal dispersion systems include macromolecular complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipid-based systems including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes. The preferred colloidal system of the present invention is a liposome. Liposomes are artificial membrane vehicles that are useful as delivery vehicles in vitro and in vivo. Large unilamellar vesicles (LW) ranging in size from 0.2 to 4.0 μm can encapsulate a substantial proportion of aqueous buffer containing large macromolecules. RNA, DNA, and intact virions can be encapsulated in a water-soluble interior and delivered to cells in a biologically active form (Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6:77 (1981)). In addition to mammalian cells, liposomes have been used to deliver polynucleotides in plant, yeast, and bacterial cells. In order for liposomes to be an effective gene delivery vehicle, the following properties should exist: (1) Encapsulate the gene of interest with high efficiency without damaging their biological activity; (2 ) Preferential and substantial binding to target cells compared to non-target cells; (3) Deliver the water-soluble contents of vesicles to the target cell cytoplasm with high efficiency; and (4) Rapid genetic information And effective expression (Manning et al., Biotechniques 6: 682 (1988)).

リポソームの組成物は、通常、リン脂質の組み合わせであり、通常は、ステロール（特に、コレステロール）と組み合わせた、特に、高い相転移温度のリン脂質の組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質もまた使用され得る。リポソームの生理学的特性は、pH、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。 The composition of the liposome is usually a combination of phospholipids, usually a combination of phospholipids, particularly high phase transition temperatures, in combination with sterols (especially cholesterol). Other phospholipids or other lipids can also be used. The physiological properties of liposomes depend on pH, ionic strength, and the presence of divalent cations.

リポソームの産生に有用な脂質の例として、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジル-グリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）が挙げられる。脂質部分が14〜18個の炭素原子（特に、16〜18個の炭素原子）を含み、そして飽和している、ジアシルホスファチジルグリセロールが特に有用である。例示的なリン脂質として、卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（dipalmitoylphosphatidylcholine）およびジステロイルホスファチジルコリンが挙げられる。 Examples of lipids useful for the production of liposomes include phosphatidyl compounds such as phosphatidyl-glycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, sphingolipids, cerebrosides, and gangliosides. Particularly useful are diacylphosphatidylglycerols, where the lipid moiety contains 14-18 carbon atoms (especially 16-18 carbon atoms) and is saturated. Exemplary phospholipids include egg phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, and disteloylphosphatidylcholine.

リポソームの標的化は、構造的および機械的因子に基づいて分類され得る。構造的分類は、選択性（例えば、器官特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性）のレベルに基づく。機械的標的化は、それが受動的または能動的のいずれであるかに基づいて、区別され得る。受動的な標的化は、シヌソイド毛細血管を含む器官の網内皮系（RES）の細胞に分布するリポソームの天然の傾向を利用する。一方、能動的な標的化は、特異的なリガンド（例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質）へのリポソームのカップリング、あるいは天然に生じる局在部位よりも、器官および細胞型に対する標的化を達成するためのリポソームの組成物または大きさを変化させることによる、リポソームの変更を含む。 The targeting of liposomes can be classified based on structural and mechanical factors. Structural classification is based on the level of selectivity (eg, organ specificity, cell specificity, and organelle specificity). Mechanical targeting can be distinguished based on whether it is passive or active. Passive targeting takes advantage of the natural tendency of liposomes to be distributed in cells of the reticuloendothelial system (RES) of organs containing sinusoidal capillaries. On the other hand, active targeting is the targeting of organs and cell types rather than the coupling of liposomes to specific ligands (eg, monoclonal antibodies, sugars, glycolipids, or proteins) or naturally occurring localization sites. Modification of the liposomes by changing the composition or size of the liposomes to achieve crystallization.

標的化送達系の表面は、種々の方法において改変され得る。リポソーム標的化送達系の場合、脂質の群は、リポソーム二重層と安定に会合した標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層に取り込まれ得る。種々の架橋基が、標的リガンドへの脂質側鎖の連結のために使用され得る。 The surface of the targeted delivery system can be modified in various ways. In the case of a liposomal targeted delivery system, a group of lipids can be incorporated into the lipid bilayer of the liposome to maintain the target ligand stably associated with the liposomal bilayer. A variety of bridging groups can be used for linking the lipid side chain to the target ligand.

治療化合物の生物学的活性が、二次的な治療化合物の合成を増強するので、このような二次的なタンパク質の発現に関連する障害への適用を含む、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用する種々の適用が存在する。 The polypeptides or polynucleotides of the present invention, including application to disorders associated with the expression of such secondary proteins, since the biological activity of the therapeutic compound enhances the synthesis of the secondary therapeutic compound There are various applications that use.

本発明は、有害糖尿病媒介遺伝子の発現または活性の調節により改善または緩和される、糖尿病および糖尿病関連障害の処置のための方法を提供する。本発明のこの局面の１つの特異的な実施態様において、有害糖尿病媒介遺伝子は、モルタリンをコードする。用語「調節」は、モルタリンの発現の抑制を想定する。 The present invention provides methods for the treatment of diabetes and diabetes-related disorders that are ameliorated or alleviated by modulation of the expression or activity of harmful diabetes-mediating genes. In one specific embodiment of this aspect of the invention, the deleterious diabetes-mediating gene encodes mortalin. The term “modulation” assumes suppression of the expression of mortalin.

有害タンパク質の発現の抑制（例えば、モルタリンの抑制）が所望される場合、翻訳レベルでモルタリンの発現を妨害する核酸配列が、使用され得る。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸、リボザイム、または特異的なモルタリンmRNAの転写もしくは翻訳をブロックする三部（triplex）試薬を、そのmRNAをアンチセンス核酸もしくは三部試薬でマスクするか、またはリボザイムでそれを切断するかのいずれかによって利用し得る。 If suppression of harmful protein expression (eg, mortalin suppression) is desired, nucleic acid sequences that interfere with mortalin expression at the translational level can be used. This approach may involve, for example, masking a triplex reagent that blocks transcription or translation of an antisense nucleic acid, ribozyme, or specific mortalin mRNA, or masking that mRNA with an antisense nucleic acid or tripartite reagent, or a ribozyme. Can be utilized either by cutting it in.

アンチセンス核酸は、特定のmRNA分子の少なくとも一部に相補的である、DNAまたはRNA分子である（WeintraubScientific American 262:40（1990)）。細胞中で、アンチセンス核酸は対応するmRNAにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。アンチセンス核酸は、mRNAの翻訳を妨害する。なぜなら、細胞は、二本鎖であるmRNAを翻訳しないからである。約15ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。なぜなら、これらは、容易に合成され、そして標的のモルタリン産生細胞に導入された場合により長い分子よりも問題を生じる可能性が少ないからである。 Antisense nucleic acids are DNA or RNA molecules that are complementary to at least a portion of a particular mRNA molecule (Weintraub Scientific American 262: 40 (1990)). In the cell, the antisense nucleic acid hybridizes to the corresponding mRNA to form a double-stranded molecule. Antisense nucleic acids interfere with the translation of mRNA. This is because cells do not translate double-stranded mRNA. An antisense oligomer of about 15 nucleotides is preferred. This is because they are easily synthesized and are less likely to cause problems than longer molecules when introduced into target mortalin producing cells.

区画（stall）転写のためのオリゴヌクレオチドの使用は、三部ストラテジーとして公知である。なぜなら、オリゴマーが二重らせんのDNAのまわりに撒きついて三本鎖ヘリックスを形成するからである。従って、これらの三部化合物は、選択された遺伝子上の独特の部位を認識するように設計され得る（Maherら、AntisenceRes． and Dev．1:227（1991)；Helene、Anticancer Drug Design、6:569（1991))。 The use of oligonucleotides for stall transcription is known as a three-part strategy. This is because the oligomer hangs around the double helix DNA to form a triple helix. Thus, these tripartite compounds can be designed to recognize unique sites on selected genes (Maher et al., Antisense Res. And Dev. 1: 227 (1991); Helene, Anticancer Drug Design, 6: 569 (1991)).

リボザイムは、DNA制限エンドヌクレアーゼに類似な様式で、他の１本鎖RNAを特異的に切断するための能力を保有する、RNA分子である。これらのRNAをコードするヌクレオチド配列の改変を介して、RNA分子中の特異的なヌクレオチド配列を認識し、そしてそれを切断する分子を操作することが可能である（CechJ. Amer.Med.Assn. 260:3030（1988））。このアプローチの主要な利点は、それらが配列特異的であるので、特定の配列を有するmRNAのみが不活性化されることである。 Ribozymes are RNA molecules that possess the ability to specifically cleave other single-stranded RNAs in a manner similar to DNA restriction endonucleases. Through modification of the nucleotide sequence encoding these RNAs, it is possible to manipulate molecules that recognize and cleave specific nucleotide sequences in RNA molecules (CechJ. Amer. Med. Assn. 260: 3030 (1988)). The main advantage of this approach is that only mRNAs with a specific sequence are inactivated because they are sequence specific.

リボザイムの２つの基本的な型、すなわち、テトラヒメナ型（HasselhoffNature 334:585（1988））および「ハンマーヘッド」型が存在する。テトラヒメナ型リボザイムは、４塩基長である配列を認識し、一方「ハンマーヘッド」型リボザイムは、11〜18塩基長の塩基配列を認識する。認識配列が長くなるほど、配列が標的mRNA種に排他的に生じる可能性は高くなる。その結果として、ハンマーヘッド型リボザイムは、特定のmRNA種を不活性化するために、テトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、そして18塩基の認識配列は、より短い認識配列よりも好ましい。 There are two basic types of ribozymes, the Tetrahymena type (Hasselhoff Nature 334: 585 (1988)) and the “hammerhead” type. Tetrahymena ribozymes recognize sequences that are 4 bases in length, while “hammerhead” ribozymes recognize base sequences that are 11-18 bases in length. The longer the recognition sequence, the more likely it is that the sequence occurs exclusively in the target mRNA species. As a result, hammerhead ribozymes are preferred over tetrahymena ribozymes to inactivate specific mRNA species, and 18 base recognition sequences are preferred over shorter recognition sequences.

抗モルタリン抗体、またはモルタリンアンチセンスポリヌクレオチドのいずれかで、モルタリン作用をブロックすることは、糖尿病を遅延または改善するために有用であり得る。防御的なポリヌクレオチドを送達するための上記の方法は、望ましい場合、モルタリンの発現および／または活性を特異的にブロックするためのモルタリンアンタゴニストを送達するために、十分に適用可能である。モルタリンアンタゴニストは、モルタリン抗体、アンチセンスポリヌクレオチド配列、またはモルタリンの発現を抑制もしくは阻害する化合物であり得る。
糖尿病媒介性タンパク質の同定および特徴づけ
高い分離能の二次元（2D）ゲル電気泳動が、約2500個のタンパク質スポットを分離するために使用され得、各スポットは分子量およびpIに従うタンパク質に相当する。81％の定性再現性を伴って、1373個のWFラットの島タンパク質のコンピューター化された2-Dゲルデータベースが、最近、報告されている（AndersenらDiabetes 44:400-407（1995））（図１Ａ〜１Ｂ）。IL-1βは、インビトロでインキュベートされたBB-DP島細胞において、82個のタンパク質の発現の変化を誘導することが示されている。糖尿病の発病後に動物から採取されたBB-DP島のインビトロインキュベーションは、IL-1βに応答することが決定された82個のタンパク質のうちの33個が、糖尿病の発病時に、発現の有意な変化を示すことを示す。 Blocking mortalin action with either anti-mortalin antibodies or mortalin antisense polynucleotides may be useful for delaying or ameliorating diabetes. The above methods for delivering protective polynucleotides are well applicable to deliver mortalin antagonists to specifically block mortalin expression and / or activity, if desired. Mortarin antagonists can be mortalin antibodies, antisense polynucleotide sequences, or compounds that suppress or inhibit the expression of mortalin.
Identification and Characterization of Diabetes-Mediated Proteins High resolution two-dimensional (2D) gel electrophoresis can be used to separate approximately 2500 protein spots, each spot corresponding to a protein according to molecular weight and pI. A computerized 2-D gel database of 1373 WF rat islet proteins with 81% qualitative reproducibility has recently been reported (Andersen et al. Diabetes 44: 400-407 (1995)) ( 1A-1B). IL-1β has been shown to induce changes in the expression of 82 proteins in BB-DP islet cells incubated in vitro. In vitro incubation of BB-DP islands collected from animals after the onset of diabetes revealed that 33 of the 82 proteins determined to respond to IL-1β were significantly altered in expression during the onset of diabetes. Indicates that

2Dゲル分析、およびペプチド配列決定、または質量分析解析の結果に基づいて、いくつかの候補糖尿病媒介性タンパク質が同定されて（表１）、そしてラットおよびヒトの島細胞からクローン化されており、iNOS、モルタリン、およびガレクチン-3を含む（MadsenらInsulin secretion and pancreatic B cell research、P.R.FlattおよびS.Lenzen編、Smith-Gordon、USA、61-68頁（1994））。マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（MnSOD）は、アデノウイルス媒介性の遺伝子移入および発現を使用して、β細胞および全ランゲルハンス島にトランスフェクトされている。トランスフェクションは、安定なまたは一時的にトランスフェクトされた細胞の生成を含む。 Based on the results of 2D gel analysis and peptide sequencing, or mass spectrometry analysis, several candidate diabetes-mediating proteins have been identified (Table 1) and have been cloned from rat and human islet cells; Contains iNOS, mortalin, and galectin-3 (Madsen et al. Insulin secretion and pancreatic B cell research, edited by PRFlatt and S. Lenzen, Smith-Gordon, USA, pp. 61-68 (1994)). Manganese superoxide dismutase (MnSOD) has been transfected into beta cells and whole islets of Langerhans using adenovirus-mediated gene transfer and expression. Transfection involves the generation of stable or transiently transfected cells.

トランスフェクション、サブクローニング、およびCMVまたはインスリンプロモーターの制御下で、目的のタンパク質のコード領域またはアンチセンス画分を発現する安定なRINクローンの樹立後、目的の糖尿病媒介性タンパク質は、機能的に特徴づけられる。予備的な結果は、RIN細胞における100%の形質導入、および単離された島における70%までの形質導入を示す。最初に、トランスフェクトされた細胞におけるタンパク質の増加または減少した発現が、NO生成、インスリン分泌、および／または細胞傷害性の測定によって、インビトロで特徴づけられる。さらに、細胞周期およびミトコンドリア活性は、FACS分析（Mandrup-PoulsenらDiabetes/Metabolism Reviews 9:295-309（1993））によって、および多重PCR（Nerupら Anales EspanolesPediatria 58:40-41（1994））により特徴づけられる遺伝子発現の半定量的分析によって、決定され得る。さらに、タンパク質の過剰発現または過小発現の、ならびに翻訳後修飾の二次的な細胞影響は、トランスフェクトされた細胞の2Dゲル電気泳動によって特徴づけられ得る。この分析は、タンパク質の発現パターンにおけるIL-1β誘導性の変化における一次的な影響と、二次的な影響との間で区別がなされることを許容する。 After transfection, subcloning, and establishment of a stable RIN clone that expresses the coding region or antisense fraction of the protein of interest under the control of the CMV or insulin promoter, the target diabetes-mediating protein is functionally characterized. It is done. Preliminary results indicate 100% transduction in RIN cells and up to 70% transduction in isolated islets. Initially, increased or decreased expression of a protein in transfected cells is characterized in vitro by measuring NO production, insulin secretion, and / or cytotoxicity. Furthermore, cell cycle and mitochondrial activity are characterized by FACS analysis (Mandrup-Poulsen et al. Diabetes / Metabolism Reviews 9: 295-309 (1993)) and by multiplex PCR (Nerup et al. Anales Espanoles Pediatria 58: 40-41 (1994)) Can be determined by semi-quantitative analysis of gene expression. In addition, secondary cellular effects of protein over- or under-expression, as well as post-translational modifications, can be characterized by 2D gel electrophoresis of transfected cells. This analysis allows a distinction to be made between primary and secondary effects in IL-1β-induced changes in protein expression patterns.

島細胞におけるIL-1β誘導性の変化を確立するために、NO生成およびインスリン放出を、IL-1β曝露、およびIL-1曝露から生じるタンパク質の変化を検出するための高い分離能の二次元ゲル電気泳動の後、インビトロでBB-DPのランゲルハンス島において測定した（実施例２）。コントロールの島におけるNO生成およびインスリン放出は、WF島において観察されたものに類似した。IL-1βは、NO生成を4.4倍、およびインスリン放出を3.4倍、阻害した。2Dゲル分析は、IL-1βが82個のタンパク質の発現を変化させたことを示し−22個のタンパク質がアップレギュレートされ、および60個のタンパク質がダウンレギュレートされた。 High resolution two-dimensional gel to detect NO production and insulin release, IL-1β exposure, and protein changes resulting from IL-1 exposure to establish IL-1β-induced changes in islet cells After electrophoresis, measurement was performed in vitro on BB-DP islets of Langerhans (Example 2). NO production and insulin release in control islands were similar to those observed in WF islands. IL-1β inhibited NO production 4.4-fold and insulin release 3.4-fold. 2D gel analysis showed that IL-1β altered the expression of 82 proteins—22 proteins were up-regulated and 60 proteins were down-regulated.

高い分離能の2DGEをまた使用して、30日齢のBB-DPラットに移植されたBB-DP島同族移植片における、タンパク質の変化を検出した（実施例３）。新しく糖尿病を発病したBB-DPラットからのBB-DP島同族移植片において、これらの82個のタンパク質のうち15個が発現のレベルを変化することが見出されたが、WF島同族移植片においては見出されなかった（実施例４）。 High resolution 2DGE was also used to detect protein changes in BB-DP island homologous grafts transplanted into 30 day old BB-DP rats (Example 3). In BB-DP islet homologous grafts from newly-developed BB-DP rats, 15 of these 82 proteins were found to change expression levels, but the WF islet homologous graft (Example 4).

インビトロでのタンパク質発現におけるIL-1β誘導性の変化を、BB-DP島同族移植片中の疾患発生のプロセスにおける（実施例４）、またはBB-DP島同種移植片拒絶における（実施例６）、タンパク質変化に比較した。新しく糖尿病を発病したBB-DPラットからのBB-DP島同族移植片において、これらの82個のタンパク質のうち15個が発現のレベルを変化することが見出されたが、WF島同族移植片においては見出されなかった。 IL-1β-induced changes in protein expression in vitro in the process of disease development in BB-DP island homologous grafts (Example 4) or in BB-DP island allograft rejection (Example 6) Compared to protein changes. In BB-DP islet homologous grafts from newly-developed BB-DP rats, 15 of these 82 proteins were found to change expression levels, but the WF islet homologous graft It was not found in.

同族移植された島における糖尿病の発病を伴って、変化した発現を示すタンパク質を、さらに特徴づけした（実施例５）。変化したタンパク質のスポットのうちの１つが、アミノ酸配列決定により、熱ショック70タンパク質（モルタリン）に高い相同性を有することが同定された。熱ショック70タンパク質は、核周辺から細胞質領域へのこの構成的に発現されるタンパク質のトランスロケーション後の、細胞死およびアポトーシスに関与することが実証されている（WadhwaらJ.Biol.Chem. 268:6615および268:22239（1993））。アミノ酸配列に基づいて、モルタリンcDNAは、糖尿病発症におけるその関与のさらなる特徴づけのために、ラットおよびヒトの島からクローン化された。CMVプロモーター下での、ラットインスリノーマ（RIN）β細胞におけるモルタリンの過剰発現は、β細胞に致死的であった。 A protein with altered expression was further characterized with the onset of diabetes in the cognate transplanted island (Example 5). One of the altered protein spots was identified by amino acid sequencing to have a high homology to the heat shock 70 protein (Mortarin). The heat shock 70 protein has been demonstrated to be involved in cell death and apoptosis following translocation of this constitutively expressed protein from the perinuclear to the cytoplasmic region (Wadhwa et al. J. Biol. Chem. 268 : 6615 and 268: 22239 (1993)). Based on the amino acid sequence, mortalin cDNA was cloned from rat and human islets for further characterization of its involvement in the development of diabetes. Overexpression of mortalin in rat insulinoma (RIN) β cells under the CMV promoter was lethal to β cells.

別の糖尿病媒介性タンパク質は、ガレクチン-3として同定された。ガレクチン-3（gal-3）は、2Dゲルにおいて、スポット1S（２回リン酸化された）、スポット16（１回リン酸化された）、およびスポット19（リン酸化されなかった）として同定された（AndersenらDiabetes 44:400-407（1995））（実施例５）。gal-3は、島発生およびアポトーシスの阻害に関与するタンパク質である。ヌクレオチド配列を用いて、gal-3は、ラットおよびヒトの島からクローン化され、サブクローン化され、そして安定なクローンの選択後、RIN細胞において発現された。gal-3を発現するRIN細胞は、増加した代謝活性および増殖速度を示し、サイトカインのネガティブな影響に対してより耐性になった。gal-3発現のインビボでの影響を、200の新生児の島を、30日齢の糖尿病傾向のBio-Breedingラット（BB-DP）に移植することによって研究した（実施例８）。 Another diabetes-mediating protein has been identified as galectin-3. Galectin-3 (gal-3) was identified in 2D gel as spot 1S (two times phosphorylated), spot 16 (one time phosphorylated), and spot 19 (not phosphorylated) (Andersen et al. Diabetes 44: 400-407 (1995)) (Example 5). Gal-3 is a protein involved in the inhibition of islet development and apoptosis. Using the nucleotide sequence, gal-3 was cloned from rat and human islets, subcloned, and expressed in RIN cells after selection of stable clones. RIN cells expressing gal-3 showed increased metabolic activity and proliferation rate and became more resistant to the negative effects of cytokines. In vivo effects of gal-3 expression were studied by transplanting 200 neonatal islets into 30-day-old diabetic Bio-Breeding rats (BB-DP) (Example 8).

NIGMS（National Institute of GeneralMedical Science）のヒト／ラット体細胞ハイブリッドマッピングパネル番号２、およびgal-3遺伝子の第２イントロンからのプライマーを用いるさらなる研究は、gal-3を第14染色体にマップした。同じプライマーを用いて、P1クローンが、GenomeSystems，Inc.から得られ、FISHについて使用した。48の測定で得られた最初のFISHの結果は、14q13領域に局在化された6.2%、14q21領域に局在化された54.2%、および14q22領域に局在化された39.6％を示した。これは、14q21.3領域における末端の位置を示す。 Further studies using the NIGMS (National Institute of General Medical Science) human / rat somatic cell hybrid mapping panel number 2 and primers from the second intron of the gal-3 gene mapped gal-3 to chromosome 14. Using the same primers, a P1 clone was obtained from GenomeSystems, Inc. and used for FISH. The first FISH results from 48 measurements showed 6.2% localized in the 14q13 region, 54.2% localized in the 14q21 region, and 39.6% localized in the 14q22 region . This indicates the terminal position in the 14q21.3 region.

誘導性の一酸化窒素シンターゼ（iNOS）がクローン化された（KarlsenらDiabetes 44:753（1995））。iNOS遺伝子は、マウス第11染色体にマップされ、これはidd4領域の真ん中（糖尿病傾向のNODマウスにおける糖尿病連鎖領域として同定されている領域（GerlingらMammalian Genome 5:318（1994））にある。線維芽細胞において組換えタンパク質として発現された場合、組換えiNOSが酵素的に活性であることが見出された。 Inducible nitric oxide synthase (iNOS) has been cloned (Karlsen et al. Diabetes 44: 753 (1995)). The iNOS gene maps to mouse chromosome 11, which is in the middle of the idd4 region (a region identified as a diabetic chain region in diabetic NOD mice (Gerling et al. Mammalian Genome 5: 318 (1994)). It was found that recombinant iNOS is enzymatically active when expressed as a recombinant protein in blasts.

マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（MnSOD）は、2Dゲル分析によって、ダウンレギュレートされるタンパク質として同定された。MnSODの発現は、アデノウイルス形質導入および移植後、インビトロおよびインビボでβ細胞および島細胞において、さらに特徴づけされた。ミトコンドリアイソクエン酸（isocitate）デヒドロゲナーゼを糖尿病媒介性タンパク質として同定した。 Manganese superoxide dismutase (MnSOD) was identified as a down-regulated protein by 2D gel analysis. MnSOD expression was further characterized in beta cells and islet cells in vitro and in vivo after adenovirus transduction and transplantation. Mitochondrial isocitate dehydrogenase was identified as a diabetes-mediating protein.

同種移植片拒絶と関連するタンパク質発現における変化がまた、測定された。30日齢のWKラットへ移植された新生児のBB-DP島細胞は、12日後に回収され、そしてタンパク質の発現が測定された（実施例６）。WKラットにおけるBB-DP島同種移植片において、82個のタンパク質のうちの９個が発現のレベルを変化したことが見出されたが、WF島同族移植片においては見出されなかった。 Changes in protein expression associated with allograft rejection were also measured. Neonatal BB-DP islet cells transplanted into 30-day-old WK rats were harvested after 12 days and protein expression was measured (Example 6). In BB-DP islet allografts in WK rats, 9 of 82 proteins were found to have altered levels of expression, but not in WF islet homologous grafts.

同族移植されたBB-DP島および同種移植されたBB-DP島の両方が、インビトロでBB-DP島のIL-1曝露の間、発現レベルを変化することが見出されたタンパク質に関して、移植されなかったBB-DP島と比較された。移植手順によって誘導されるタンパク質変化について制御するために、200の新生児のWF島が、30日齢のWFラットに移植された。コロニーにおいておよび同族移植されたBB-DPラットにおいて、糖尿病の発病の平均時間に対応する、移植後48日目に、移植片は回収された。IL-1インキュベーションの間に変化されることが以前に見出された105個のタンパク質に関して、WFコントロール島との比較について記載されたように、移植片は、プロセスおよび分析された。これは、IL-1および島同族移植の両方によって誘導性のタンパク質の変化を同定するために、ならびに拒絶特異的タンパク質を同定するためになされた。 For proteins where both cognate transplanted BB-DP islands and allografted BB-DP islands were found to change expression levels during IL-1 exposure of BB-DP islands in vitro Compared to BB-DP island that was not done. To control for protein changes induced by the transplantation procedure, 200 neonatal WF islets were transplanted into 30-day-old WF rats. Grafts were harvested 48 days after transplantation, corresponding to the mean time of onset of diabetes, in colonies and in cognate transplanted BB-DP rats. For the 105 proteins previously found to be altered during IL-1 incubation, the grafts were processed and analyzed as described for comparison with WF control islands. This was done to identify inducible protein changes by both IL-1 and islet cognate transplants, as well as to identify rejection specific proteins.

糖尿病病因論におけるこれらのタンパク質の潜在的な役割をさらに決定するために、ならびに治療的化合物、および治療的化合物の発現を誘導する化合物を同定するために、候補タンパク質をコードする遺伝子を保有し、そして組織特異的プロモーター下で候補タンパク質を発現し得る、トランスジェニック動物が作製される。本発明のトランスジェニック動物は、インスリンプロモーター、アミリンプロモーター、CMVプロモーター、またはHLAプロモーターのような特異的なプロモーター下で、候補タンパク質を発現する。 To further determine the potential role of these proteins in diabetes etiology, and to identify therapeutic compounds and compounds that induce the expression of therapeutic compounds, possess genes encoding candidate proteins, A transgenic animal is then generated that can express the candidate protein under a tissue-specific promoter. The transgenic animals of the invention express the candidate protein under a specific promoter such as an insulin promoter, amylin promoter, CMV promoter, or HLA promoter.

最初に、ベクター誘導性の毒性の不在下での、アデノウイルス媒介性の、ランゲルハンス島への遺伝子移入について、至適な条件を決定するための研究が行われた。実施例Ｘに記載されるように、島のアデノウイルス媒介性の形質導入は、用量依存性の効率の良い遺伝子移入を生じ、毒性の不在下で、導入遺伝子を安定に発現した。 Initially, studies were conducted to determine the optimal conditions for adenovirus-mediated gene transfer into the islets of Langerhans in the absence of vector-induced toxicity. As described in Example X, islet adenovirus-mediated transduction resulted in a dose-dependent efficient gene transfer and stably expressed the transgene in the absence of toxicity.

実施例
以下の実施例は、本発明の、キメラ遺伝子、トランスジェニックマウス、およびアッセイをどのように作製しそして使用するのかの完全な開示および説明を、当業者に提供するために記載され、そして本発明者らが、本発明者らの発明であると考える範囲を制限することを意図しない。使用される数に関して（例えば、量、温度など）正確性を確実するために努力がなされたが、いくつかの実験誤差が考慮されるべきであり、偏差は考慮されるべきである。他に記載しない限り、部は重量による割合であり、分子量は、量平均分子量であり、温度は摂氏においてであり、圧力は大気でまたは大気の近くである。
Examples The following examples are described to provide one of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the chimeric genes, transgenic mice, and assays of the present invention, and We do not intend to limit the scope of what we believe is our invention. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (eg amounts, temperature, etc.) but some experimental errors should be accounted for and deviations should be accounted for. Unless indicated otherwise, parts are parts by weight, molecular weight is weight average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is at or near atmosphere.

実施例１。材料および方法
試薬。ケタミンをPark-Davis（Barcelona、Spain）から、キシラジンをBayer（Leverkusen、Germany）から、およびTemgesic（登録商標）をReckittand Colemann（Hull、UK）から購入した。RPMI 1640、Hanks平衡化塩溶液（HBSS）、およびDMEMを、Gibco、Paisley、Scotlandから購入した。RPMI1640は、11mmol D-グルコースを含み、20mM HEPES緩衝液、100,000IU/lペニシリン、および100mg/l ストレプトマイシンが補充された。真正の組換えヒトIL-1βは、NovoNordisk Ltd.（Bagsvaerd、Denmark）から提供され、400 U/ngの比活性を有した。 Example 1. Materials and Methods Reagents. Ketamine was purchased from Park-Davis (Barcelona, Spain), xylazine from Bayer (Leverkusen, Germany), and Temgesic® from Reckittand Colemann (Hull, UK). RPMI 1640, Hanks balanced salt solution (HBSS), and DMEM were purchased from Gibco, Paisley, Scotland. RPMI 1640 contained 11 mmol D-glucose and was supplemented with 20 mM HEPES buffer, 100,000 IU / l penicillin, and 100 mg / l streptomycin. Authentic recombinant human IL-1β was provided by NovoNordisk Ltd. (Bagsvaerd, Denmark) and had a specific activity of 400 U / ng.

使用した他の試薬：2-メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン（BSA）、TrisHCl、Tris塩基、グリシン、（Sigma、St．Louis、USA）；トリクロロ酢酸（TCA）、リン酸、NaOH、グリセロール、n-ブタノール、ブロモフェノールブルー、ニトロプルシドナトリウム（SNP）、H₃PO₄、およびNaNO₂（Merck、Darmstadt、Germany）；フィルター類（HAWP0.25mmの孔サイズ）（Millipore、Boston、USA）；RNAse Ａ、DNAse I（Worthington、Freehold、NJ、USA）；[³⁵S]-メチオニン（SJ204、比活性：>1.000Ci/mmol、0.1% 2-メルカプトエタノールを含有する）、Amplify（登録商標）（AmershamInternational、Amersham、UK）；尿素（超純粋）（Schwarz/Mann、Cambridge、MA、USA）；アクリルアミド、ビスアクリルアミド、TEMED、過硫酸アンモニウム（BioRad、Richmond、CA、USA）；両性電解質類：pH５〜７、pH3.5〜10、pH７〜９、pH８〜9.5（Pharmacia、Uppsala、Sweden）；NonidentP-40（BDH、Poole、UK）；両性電解質類：pH５〜７およびドデシル硫酸ナトリウム（Serve、Heidelberg、Germany）；アガロース（Litex、Copenhagen、Denmark）；エタノール（無水96％）（DanishDistillers、Aalborg、Denmark）；メタノール（Prolabo、Brione Le Blanc、France）；酢酸（工業用、99％氷状）（Bie& Berntsen、Arhus、Denmark）およびＸ線フィルム（Curix RP-2）（AGFA）。 Other reagents used: 2-mercaptoethanol, bovine serum albumin (BSA), TrisHCl, Tris base, glycine (Sigma, St. Louis, USA); trichloroacetic acid (TCA), phosphoric acid, NaOH, glycerol, n- Butanol, bromophenol blue, sodium nitroprusside (SNP), H ₃ PO ₄ , and NaNO ₂ (Merck, Darmstadt, Germany); filters (HAWP 0.25 mm pore size) (Millipore, Boston, USA); RNAse A, DNAse I (Worthington, Freehold, NJ, USA); [ ³⁵ S] -methionine (SJ204, specific activity:> 1.000 Ci / mmol, containing 0.1% 2-mercaptoethanol), Amplify® (Amersham International, Amersham, UK); urea (ultra pure) (Schwarz / Mann, Cambridge, MA, USA); acrylamide, bisacrylamide, TEMED, ammonium persulfate (BioRad, Richmond, CA, USA); ampholytes: pH 5-7, pH 3.5 -10, pH 7-9, pH 8-9.5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden); Nonident P-40 (BDH, Poole, UK); Amphoteric electrolytes: pH 5-7 and sodium dodecyl sulfate (Serve, Heidelberg, Germany); Agarose (Litex, Copenhagen, Denmark); Ethanol (anhydrous 96%) (Danish Distillers, Aalborg, Denmark); Methanol (Prolabo, Brione Le Blanc, France); Acetic acid (industrial, 99% ice) (Bie & Berntsen, Arhus, Denmark) and X-ray film (Curix RP) -2) (AGFA).

動物。30（28〜32）日齢のBB/Wor/Mol-BB2（BB-DP）ラット、WistarFurth（WF）ラットおよびWistar Kyoto（WK）ラットを、Mollegarden、Ll、Skensved、Denmarkから購入した。Mollegardenにおいて、およびStenoDiabetes Center/Hagedorn Research Institute（Gentofte、Denmark）の動物施設において、BB-DPラットは、特定の病原体がいない環境において、別々に飼育された。全てのラットは、移植の５日前から屠殺されるまで、光（午前6:00〜午後6:00までの照明）、湿度（60〜70%）、および温度（20〜22℃）の制御された条件下、飼育された。ラットは、標準的なラットの食事（Altromin、Chr.PetersenA/S、Ringsted、Denmark）、および水道水への自由な接近を与えられた。４〜５日齢のBB-DPラットおよびWFラットを、島単離の日の午前中にMollegardenにて集め、そして動物輸送ボックスにおいて輸送した。 animal. 30 (28-32) day old BB / Wor / Mol-BB2 (BB-DP), WistarFurth (WF) and Wistar Kyoto (WK) rats were purchased from Mollegarden, Ll, Skensved, Denmark. In Mollegarden and in the animal facility of StenoDiabetes Center / Hagedorn Research Institute (Gentofte, Denmark), BB-DP rats were housed separately in an environment free of specific pathogens. All rats are controlled for light (light from 6:00 am to 6:00 pm), humidity (60-70%), and temperature (20-22 ° C.) from 5 days prior to implantation until sacrifice. Were bred under certain conditions. Rats were given free access to a standard rat diet (Altromin, Chr. Petersen A / S, Ringsted, Denmark) and tap water. 4-5 day old BB-DP and WF rats were collected at Mollegarden in the morning of the day of islet isolation and transported in an animal transport box.

移植手順および移植片回収。新生児の島を、以前に記載されるように（KorsgrenらJ.Clin.Invest. 75:509-514(1990)）、滅菌条件下で28〜32日齢のレシピエントラットの腎臓被膜下に移植した。糖尿病発病率は、雄性および雌性のBB-DPマウスにおいて同様であったので（PriesらFrontiers in Diabetes Research：8:19-24（Shafrir，E．編）、Smith-Gordon、London(1991)）、両方の性別を、等しく使用した。任意の性関連の不適合性に起因する移植片拒絶の潜在的な危険性を減少するために、雄性の島を、雄性レシピエントに移植し、および雌性の島を、雌性レシピエントに移植した（SteinerらElectrophoresis 16:1969-1976（1995））。200（範囲：187〜215）の島を、10ml Transpferpettor（Brand、Germany）ピペットを使用して、手で集めた。島を沈殿させ、そして可能な限り多くの上清を、１〜２mlの容量の移植のまえに除去した。レシピエントラットを秤量し、そして血液グルコース（BG）を測定した。次いで、ラットを、ケタミン（8.75mg/100g）およびキシラジン（0.7mg/100g）腹腔内で、麻酔した。小切開を、左腎臓上で行い、腎臓を前方に持ち上げ、そしてナイフを用いて小切開を行った。平らな器具を用いて、穴を被膜に穏やかに作製した。島を、腎臓下極に向って、被膜の下に置いた。筋肉および皮膚を縫合し、ラットを手術施設におけるかごの中で回復させ、そして動物施設に戻す前に、首中にTemgesic（0.01mg）皮下を与えた。移植後３日間、ラットに、毎日２回、Temgesicを与えた。血液グルコース（BG）を、３日毎に測定した。ラットを、頸椎脱臼によって殺傷し、そしてその後即座に、移植された腎臓を取り出した。移植片を、顕微鏡下で腎臓および被膜から注意深く切開し、そしてHBSS中に置いた。 Transplantation procedure and graft recovery. Neonatal islets are transplanted under the kidney capsule of 28-32 day old recipient rats under sterile conditions as previously described (Korsgren et al. J. Clin. Invest. 75: 509-514 (1990)) did. Since the incidence of diabetes was similar in male and female BB-DP mice (Pries et al. Frontiers in Diabetes Research: 8: 19-24 (Shafrir, E.), Smith-Gordon, London (1991)) Both genders were used equally. To reduce the potential risk of graft rejection due to any sex-related incompatibility, male islets were transplanted into male recipients and female islets were transplanted into female recipients ( Steiner et al. Electrophoresis 16: 1969-1976 (1995)). 200 (range: 187-215) islands were collected by hand using a 10 ml Transpferpettor (Brand, Germany) pipette. The islets were allowed to settle and as much of the supernatant as possible was removed prior to implantation in a 1-2 ml volume. Recipient rats were weighed and blood glucose (BG) was measured. Rats were then anesthetized intraperitoneally with ketamine (8.75 mg / 100 g) and xylazine (0.7 mg / 100 g). A small incision was made on the left kidney, the kidney was lifted forward, and a small incision was made using a knife. Using a flat instrument, holes were gently made in the coating. The island was placed under the capsule, facing the kidney's lower pole. Muscles and skin were sutured, rats were allowed to recover in a cage in the surgical facility, and Temgesic (0.01 mg) subcutaneous was given in the neck before returning to the animal facility. Rats were given Temgesic twice daily for 3 days after transplantation. Blood glucose (BG) was measured every 3 days. Rats were killed by cervical dislocation and immediately afterwards the transplanted kidney was removed. The graft was carefully dissected from the kidney and capsule under a microscope and placed in HBSS.

移植片および島の標識化。移植片を回収後すぐに標識した。培養した島を、IL-1を伴うまたは伴わない、24時間のインキュベーションの後、標識した。移植片および島を、HBSS中で２回洗浄し、そしてアミノ酸に対して透析された10％NHS、および移植片について330mCi[35S]-メチオニン、または島について200mCi[35S]メチオニンのいずれかを含有する、メチオニン非含有Dulbecco改変Eagle培地（DMEM）の200ml中で、37℃で４時間、標識した。2-メルカプトエタノールを除去するために、[35]-メチオニンを標識化の前に少なくとも４時間、凍結乾燥した。標識後、移植片および島を、HBSS中で３回洗浄し、上清を除去し、そして組織を即座に-80℃で凍結した。 Graft and island labeling. Implants were labeled immediately after collection. Cultured islets were labeled after 24 hours incubation with or without IL-1. Grafts and islets were washed twice in HBSS and containing either 10% NHS dialyzed against amino acids and either 330mCi [35S] -methionine for grafts or 200mCi [35S] methionine for islets Then, labeling was carried out in 200 ml of Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) without methionine for 4 hours at 37 ° C. To remove 2-mercaptoethanol, [35] -methionine was lyophilized for at least 4 hours prior to labeling. After labeling, the grafts and islets were washed 3 times in HBSS, the supernatant was removed, and the tissue was immediately frozen at -80 ° C.

サンプル調製。凍結された移植片を、乳鉢中で破砕した。移植片および島を100mlDNAse I/RNAse A溶液中に再懸濁し、そして２回の凍結−解凍によって溶解した。２回目の解凍後、核酸の消化のために、サンプルを氷上で30分間放置し、次いで一晩凍結乾燥した。サンプルを、120ml溶解緩衝液（8.5M 尿素、２% Nonident P-40、５% 2-メルカプトエタノール、および２% 両性電解質、pH範囲７〜９）中で、最小４時間、振とうすることによって溶解した。 Sample preparation. The frozen graft was crushed in a mortar. Grafts and islets were resuspended in 100 ml DNAse I / RNAse A solution and lysed by two freeze-thaws. After the second thawing, the samples were left on ice for 30 minutes and then lyophilized overnight for nucleic acid digestion. Samples are shaken in 120 ml lysis buffer (8.5 M urea, 2% Nonident P-40, 5% 2-mercaptoethanol, and 2% ampholyte, pH range 7-9) for a minimum of 4 hours. Dissolved.

[35S]-メチオニン取込みの測定。[35S]-メチオニン取込みの量を、10mgBSA（0.2mg/ml H₂O）をタンパク質キャリアとして、各サンプルの1:10希釈物の５mlに２連で添加し、次いで0.5mlの10％TCAを添加することによって、定量した。これを30分間４℃で沈殿させ、その後0.25mm HAWPフィルターを介して濾過した。フィルターを乾燥し、そしてカウントのためにシンチレーション液中に置いた。 Measurement of [35S] -methionine uptake. The amount of [35S] -methionine incorporation was added in duplicate to 5 ml of a 1:10 dilution of each sample using 10 mg BSA (0.2 mg / ml H ₂ O) as a protein carrier and then 0.5 ml of 10% TCA. Quantified by adding. This was allowed to settle for 30 minutes at 4 ° C. and then filtered through a 0.25 mm HAWP filter. Filters were dried and placed in scintillation fluid for counting.

2-Dゲル電気泳動。この手順は、以前に記載されている（O’Farrellら、Cell12:1133-1142(1977)）。簡潔には、１次元ゲルは、４%アクリルアミド、0.25%ビスアクリルアミドおよび両性電解質を含んだ。各サンプルの等数のカウント（106cpm）を、ゲルに適用した。より低い量の放射能の場合、比較可能な全体の光学密度が得られるように、ゲルの暴露時間を調節する必要があった。サンプルを、等電点電気泳動（IEF；pH3.5〜７）および非平衡pH勾配電気泳動（NEPHGE；pH6.5-10.5）ゲルの両方に対して分析した。２次元ゲルは、12.5％アクリルアミドおよび0.063％ビスアクリルアミドを含み、そして一晩電気泳動した。電気泳動後、ゲルを固定し、そして蛍光間接撮影法のために、Amplify（登録商標）で処理し、その後乾燥した。ゲルを、Ｘ線フィルムと接触させて置き、そして-70℃で３〜40日間、露光した。各ゲルを少なくとも３回の期間露光し、Ｘ線フィルムの動力学的範囲の損失について補った。 2-D gel electrophoresis. This procedure has been previously described (O'Farrell et al., Cell 12: 1133-1142 (1977)). Briefly, the one-dimensional gel contained 4% acrylamide, 0.25% bisacrylamide and an ampholyte. An equal count of each sample (106 cpm) was applied to the gel. For lower amounts of radioactivity, it was necessary to adjust the gel exposure time to obtain a comparable overall optical density. Samples were analyzed against both isoelectric focusing (IEF; pH 3.5-7) and non-equilibrium pH gradient electrophoresis (NEPHGE; pH 6.5-10.5) gels. The two-dimensional gel contained 12.5% acrylamide and 0.063% bisacrylamide and was electrophoresed overnight. After electrophoresis, the gel was fixed and treated with Amplify® for fluorescence indirect imaging and then dried. The gel was placed in contact with the X-ray film and exposed at -70 ° C for 3-40 days. Each gel was exposed for a period of at least 3 times to compensate for the loss of X-ray film dynamic range.

MWおよびpIの測定。タンパク質の分子量を、標準ゲルとの比較によって測定した。ゲル上の個々のタンパク質についてのpIを、pI検定キットによって測定した。目印のタンパク質を、以下の技術：イムノブロッティング、免疫沈降、微量配列決定、またはぺプチドマッピングのうちの１つまたはいくつかによって、ゲル上に同定した。 MW and pI measurements. The molecular weight of the protein was measured by comparison with a standard gel. The pI for each protein on the gel was measured by a pI assay kit. Marker proteins were identified on the gel by one or several of the following techniques: immunoblotting, immunoprecipitation, microsequencing, or peptide mapping.

蛍光間接撮影のコンピューター解析。SunsparcワークステーションにおけるBioImage（登録商標）プログラム（バージョン6.1）を用いて、コンピューター解析を行った。先ず、蛍光間接撮影をスキャンし、そしてスポットを同定し、そしてBioImage（登録商標）プログラムによって定量した。次いで、アンカーポイントをゲル上に置き（各ゲルにおける同じスポットは、同じアンカーポイントを割り当てられた）、そしてコンピューターでゲルを適合させた。コンピューターでの適合後、手動編集を行って、同定を確実にし、コンピューターの正確な適合によりスポットが見出され、そしてスポットの定量は、最初は、コンピュータープログラムによって見出されなかった。最後に、データを、QuatroPro（登録商標）スプレッドシート（Borland バージョン4.0）における算定のために導き出した。IEFおよびNEPHGE亜群における重複スポットの存在を回避するために、IEFゲルの塩基部分またはNEPHGEゲルの酸性部分のいずれかにおける重複するスポットを、解析から削除した。 Computer analysis of fluorescence indirect imaging. Computer analysis was performed using the BioImage® program (version 6.1) on a Sunsparc workstation. First, fluorescence indirect photography was scanned and spots were identified and quantified by the BioImage® program. The anchor points were then placed on the gel (the same spot on each gel was assigned the same anchor point) and the gel was fitted with a computer. After computer fitting, manual editing was performed to ensure identification, spots were found by computer exact fitting, and spot quantification was not initially found by the computer program. Finally, data was derived for calculations in a QuatroPro® spreadsheet (Borland version 4.0). In order to avoid the presence of overlapping spots in the IEF and NEPHGE subgroups, overlapping spots in either the base portion of the IEF gel or the acidic portion of the NEPHGE gel were removed from the analysis.

統計学的解析。Studentのｔ検定を適用し、そしてP<0.01を、有意性のレベルとして選択した。 Statistical analysis. Student's t test was applied and P <0.01 was selected as the level of significance.

実施例２。インビトロでの亜硝酸塩およびインスリンの測定
BB-DP島におけるIL-1誘導性のタンパク質の変化を調査するために、150の新生児BB-DPラットの島を、150pg/mlのIL-1とともに、またはこれを伴わないで、24時間インキュベートし、その後、培地を亜硝酸塩およびインスリンの測定のためにサンプリングした。島の２次元ゲル分析を下記のように行い、そして島の蛍光間接撮影をコンピューターで解析し（以下を参照、各群についてｎ=３）、そしてIL-1を曝露されたWFラットの島の以前に確立されたタンパク質データベースと比較した。 Example 2. In vitro measurement of nitrite and insulin
To investigate IL-1-induced protein changes in BB-DP islands, 150 neonatal BB-DP rat islets were incubated for 24 hours with or without 150 pg / ml IL-1. The media was then sampled for nitrite and insulin measurements. A two-dimensional gel analysis of the islands was performed as follows, and the fluorescence indirect imaging of the islands was analyzed by computer (see below, n = 3 for each group), and IL-1 exposed WF rat islands were analyzed. Comparison with a previously established protein database.

島の単離および培養。４〜５日齢の近交系BB-DPラットおよびWFラットの膵臓からの島を、Brunstedtら（Methodsin Diabetes Research、第１巻、Wiley & Sons、New York、254-288頁(1984)（本明細書中に参考として具体的に援用される））によって記載されるように、コラゲナーゼ消化後、単離した。RPMI1640＋10% 胎児ウシ血清中での前培養の４日後、島を以下のように培養した：150のBB-DP島を、300ml RPMI 1640＋0.5% 正常ヒト血清（NHS）中で、150pa/mlIL-18の添加を伴ってまたは伴わないで、24時間、37℃の加湿化された雰囲気の空気においてインキュベートした。別個の実験の系列において、200のBB-DPラットまたはWFラットの島を、300mlRPMI 1640＋0.5% NHS中で、移植の前に24時間インキュベートした。 Islet isolation and culture. Islets from the pancreas of 4-5 day old inbred BB-DP and WF rats were analyzed by Brunstedt et al. (Methodsin Diabetes Research, Volume 1, Wiley & Sons, New York, pages 254-288 (1984) (book) Isolated after collagenase digestion as described by)), which is specifically incorporated herein by reference. After 4 days of pre-culture in RPMI 1640 + 10% fetal bovine serum, islets were cultured as follows: 150 BB-DP islets were 150 pa / ml IL− in 300 ml RPMI 1640 + 0.5% normal human serum (NHS). Incubated in air in a humidified atmosphere at 37 ° C. for 24 hours with or without the addition of 18. In a series of separate experiments, 200 BB-DP or WF rat islets were incubated in 300 ml RPMI 1640 + 0.5% NHS for 24 hours prior to transplantation.

亜硝酸塩およびインスリンの測定。亜硝酸塩を、以前に記載されるように（Greenら、Anal.Biochem．126:131-138(1982)）、Griess試薬によって測定した。アッセイの検出限界は、１mmol/lであり、2pmol/島に対応した。島を含有しない対応の培地の亜硝酸塩レベルを、島非含有培地が検出限界を超えた場合、引き算した。実験を、同じアッセイにおいて行った。標準曲線上の３点から算定されたアッセイ内およびアッセイ間の変動係数は：１mmol/l：1.6%、16.3%；10mmol/l：1.6%、15.3%；25mmol/l：1.5、17.0％であった。インスリンをRIAによって測定した（Yangら、Proc．Natl．Acad．Sci．93:6737-6742(1996)）。検出限界は、35fmol/mlであった。３つの公知のコントロール間のアッセイ内およびアッセイ間の変動係数は、Ａ：5.4%、12.5%；Ｂ：3.6%、10.2%；Ｃ：3.1%、9.4%であった。 Nitrite and insulin measurements. Nitrite was measured by Griess reagent as previously described (Green et al., Anal. Biochem. 126: 131-138 (1982)). The detection limit of the assay was 1 mmol / l, corresponding to 2 pmol / islet. The nitrite level of the corresponding medium without islands was subtracted if the medium without islands exceeded the detection limit. The experiment was performed in the same assay. The intra- and inter-assay coefficients of variation calculated from 3 points on the standard curve were: 1 mmol / l: 1.6%, 16.3%; 10 mmol / l: 1.6%, 15.3%; 25 mmol / l: 1.5, 17.0%. It was. Insulin was measured by RIA (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 6737-6742 (1996)). The detection limit was 35 fmol / ml. The intra- and inter-assay coefficients of variation between the three known controls were A: 5.4%, 12.5%; B: 3.6%, 10.2%; C: 3.1%, 9.4%.

結果。2-Dゲル分析のために以前に使用された（Andersenら、前出(1995)）、BB-DP島とWF島との間の作用（蓄積されたインスリンの放出）およびIL-1に対する応答の点における比較可能性を確実にするために、NO生成およびインスリン放出を、IL-1を伴う、またはこれを伴わない24時間のインキュベーションの後、測定した。基底のインスリン放出およびNO生成は、WF島からのデータに類似した（基底のインスリン放出（WF島）3.3±0.5対（BB-DP島）2.0±1.1pmol^*島-1^*24時間-１、基底のNO生成＜2pmol^*島-１^*24時間-１（BB-DP島およびWF島の両方について）。IL-1は、蓄積された島インスリンの放出を3.4%倍阻害し、そして新生児WFラットの島を用いて得られる結果に類似して、NO生成を4.4倍増加させた（IL-1誘導性のNO生成：（WF島）9,29±1,21対（BB-DP島）8.91±1.05pmol^*島-１^*24時間-１、およびインスリン放出：（WF島）1,4±0,3対（BB-DP島）0,6±0.6pmol^*島-１^*24時間-１、18、19）。 result. Previously used for 2-D gel analysis (Andersen et al., Supra (1995)), action between BB-DP and WF islands (release of accumulated insulin) and response to IL-1 In order to ensure comparability in this respect, NO production and insulin release were measured after 24 hours incubation with or without IL-1. Basal insulin release and NO production were similar to the data from WF islands (basal insulin release (WF islands) 3.3 ± 0.5 vs. BB-DP islands 2.0 ± 1.1 pmol ^* island-1 ^* 24 hours-1; Basal NO production <2 pmol ^* islet-1 ^* 24 hr-1 (for both BB-DP and WF islets) IL-1 inhibits the release of accumulated islet insulin 3.4% fold and neonatal WF Similar to the results obtained with rat islets, NO production was increased 4.4-fold (IL-1-induced NO production: (WF island) 9,29 ± 1,21 pairs (BB-DP island) 8.91 ± 1.05pmol ^* island-1 ^* 24 hours-1 and insulin release: (WF island) 1,4 ± 0,3 vs. (BB-DP island) 0,6 ± 0.6pmol ^* island-1 ^* 24hours- 1, 18, 19).

BB-DPラットの島±IL-1からの蛍光間接撮影の分析。新生児BB-DPラットの島ホモジネートの２次元ゲルのコンピューターベースの解析において、全1815（1275個のIEFおよび540個のNEPHGE）個のタンパク質が12,5％アクリルアミドゲルの３つのうちの３つにおいて、見出された。IL-1とともに、24時間、インキュベートした新生児BB-DPラットの島において、1721（1171個のIEFおよび550個のNEPHGE）個が３つのゲルのうちの３つにおいて、見出された。IL-1は、コントロール島に比べて、82個のタンパク質の発現レベルを有意に変化させることが見出され（P<0.01）；60個のタンパク質は発現レベルが減少し、および22個のタンパク質は発現レベルが増加した（P<0.01）(表１)。 Analysis of fluorescence indirect imaging from BB-DP rat islet ± IL-1. In a computer-based analysis of a two-dimensional gel of a neonatal BB-DP rat islet homogenate, a total of 1815 (1275 IEF and 540 NEPHGE) proteins were found in 3 out of 3 of the 12.5% acrylamide gel. Was found. In the islets of neonatal BB-DP rats incubated with IL-1 for 24 hours, 1721 (1171 IEF and 550 NEPHGE) were found in three of the three gels. IL-1 was found to significantly change the expression level of 82 proteins compared to control islands (P <0.01); 60 proteins had reduced expression levels, and 22 proteins Increased the expression level (P <0.01) (Table 1).

実施例３。動物移植モデル。 Example 3. Animal transplant model.

実験１。最初に、IDDMの発症の間に生じる細胞性事象および分子性事象の調査のために同調モデルを作製するために、200の新生児BB-DPラットの島を単離し、そして30日齢のBB-DPラットの腎臓被膜下に移植した。血液グルコースを３日毎に測定し、そして糖尿病の発病率を測定した。 Experiment 1. First, to create a synchronized model for the investigation of cellular and molecular events that occur during the onset of IDDM, islets of 200 neonatal BB-DP rats were isolated, and 30-day-old BB- It was transplanted under the kidney capsule of DP rats. Blood glucose was measured every 3 days and the incidence of diabetes was measured.

移植後７、12、23、37、48、および173日目に、または糖尿病の発病時に、ラットを屠殺した（各群においてn=６）。移植片をインスリンおよび以下のMHCクラスI、II、αβ-TCR、CD4、CD8、またはED1うちの１つについて二重染色した。染色は、全移植片面積の百分率として（インスリン）またはmm²あたりの染色された細胞の数として、表した。インサイチュの宿主島を、同じ方法で染色し、そして島細胞の全数のうちの炎症を起こした島のパーセントとして表した。統計的解析を、SpearmanRank CorrelationおよびMann-Witneyで行った。 Rats were sacrificed on days 7, 12, 23, 37, 48, and 173 after transplantation or at the onset of diabetes (n = 6 in each group). The grafts were double stained for insulin and one of the following MHC class I, II, αβ-TCR, CD4, CD8, or ED1. Staining was expressed as a percentage of total graft area (insulin) or as the number of cells stained per mm ² . In situ host islets were stained in the same manner and expressed as the percentage of inflamed islets out of the total number of islet cells. Statistical analysis was performed with SpearmanRank Correlation and Mann-Witney.

結果。糖尿病の発病率（75%）または糖尿病の発症の日（69±25日）は、移植されなかったBB-DPラットと有意に異ならなかった。移植片およびインサイチュの島の両方において、浸潤する細胞の数の２〜３倍の増加が、12日目および37日目に見られた。移植の48日後、糖尿病を発症するラットについて、移植片およびインサイチュの島の両方において、それぞれ、前糖尿病のラットにおける37日目、および48日目での非糖尿病ラットと比較して、細胞の数が増加した（P<0.04）。移植片インスリン染色面積は、非糖尿病移植片において80〜90%であり、および糖尿病移植片において全移植片面積の30%であり、インスリン含量と細胞性浸潤とは逆比例した。全ての細胞型について、および全ての研究された時点で、宿主膵臓スライドガラスにおける浸潤された島の百分率と、同じ動物からの移植片における浸潤する細胞の数との間に、正の相関が見出された（P=0.002〜0.00001；ｒ=0.4〜0.7）。 result. Diabetes incidence (75%) or day of onset of diabetes (69 ± 25 days) was not significantly different from non-transplanted BB-DP rats. A 2-3 fold increase in the number of infiltrating cells was seen on days 12 and 37 in both grafts and in situ islets. For rats that develop diabetes 48 days after transplantation, the number of cells in both the graft and in situ islands, compared to non-diabetic rats on day 37 and day 48, respectively, in prediabetic rats, respectively. Increased (P <0.04). Graft insulin stained area was 80-90% in non-diabetic grafts and 30% of total graft area in diabetic grafts, and insulin content and cellular infiltration were inversely proportional. There is a positive correlation between the percentage of infiltrated islets in the host pancreas glass slide and the number of infiltrating cells in grafts from the same animal for all cell types and at all studied time points. (P = 0.002-0.00001; r = 0.4-0.7).

実験２．200の新生児BB-DPラットの島を、30日齢のBB-DPラットの腎臓被膜下に移植した。WisterFurth島からWistar Kyotoラットへの同種異系移植を、コントロールとして同様に行った。 Experiment 2. 200 newborn BB-DP rat islets were transplanted under the kidney capsule of 30 day old BB-DP rats. Allogeneic transplantation from WisterFurth Island to Wistar Kyoto rats was similarly performed as a control.

移植された島は、IDDM発病率および疾患発病の時間に影響を与えなかった。糖尿病発病の日（78±５日）およびコントロールWK動物において17日目に、移植片を免疫組織化学および[³⁵S]-メチオニン標識化のために切り出した。 The transplanted islets did not affect the incidence of IDDM and the time of disease onset. Grafts were excised for immunohistochemistry and [ ³⁵ S] -methionine labeling on the day of diabetes onset (78 ± 5 days) and on day 17 in control WK animals.

結果。糖尿病BBラットからの移植片の免疫組織化学的実験は、MHCクラスIポジティブ細胞（1982/mm²±534）、マクロファージ（661/mm²±406）、Ｔ-ヘルパー細胞（1331/mm²±321）、細胞傷害性Ｔ細胞（449/mm²±117）との広範囲におよぶ炎症を実証し、およびインスリンポジティブ細胞は、移植片の33〜66$に減少した。同種異系移植のコントロールは、線維症を示し、単核細胞、MHCクラスIIポジティブ細胞（152/mm²）、MHCクラスIポジティブ細胞（48/mm²）、マクロファージ（172/mm²）、Ｔ-へルーパー細胞（254/mm²）、細胞傷害性Ｔ細胞（42/mm²）の炎症をほとんど示さず、および残存細胞における100%のインスリン含量を示した。 result. Immunohistochemical experiments of grafts from diabetic BB rats were performed using MHC class I positive cells (1982 / mm ² ± 534), macrophages (661 / mm ² ± 406), T-helper cells (1331 / mm ² ± 321). ), Demonstrated extensive inflammation with cytotoxic T cells (449 / mm ² ± 117), and insulin positive cells were reduced to 33-66 $ in the graft. Allogeneic transplant controls showed fibrosis, mononuclear cells, MHC class II positive cells (152 / mm ² ), MHC class I positive cells (48 / mm ² ), macrophages (172 / mm ² ), T -Showed little inflammation of Heloper cells (254 / mm ² ), cytotoxic T cells (42 / mm ² ) and 100% insulin content in the remaining cells.

2Dゲルのコンピューター解析はIL-1曝露によってインビトロで変化された33個のタンパク質のうちの18個の発現の、２倍を超える増加を示した。14個は、BB-DP動物における同族移植片に特異的であった。８個のタンパク質は、発現のレベルを特異的に変化した。 Computer analysis of 2D gels showed more than a 2-fold increase in expression of 18 of 33 proteins altered in vitro by IL-1 exposure. Fourteen were specific for cognate grafts in BB-DP animals. Eight proteins specifically changed the level of expression.

実施例４。糖尿病発症によって誘導されるタンパク質発現における変化
糖尿病発生の間のBB-DP島の同族移植片におけるタンパク質の変化を調査するために、200の新生児BB-DPラットの島を、30日齢のBB-DPラットに移植した。標識、２次元ゲル電気泳動および移植されていないBB-DP島とのコンピューターベースの比較のために、移植片を、糖尿病の発症時に回収した（連続２日間でBG>14mmol/lとして規定された、n=５）。 Example 4. Changes in protein expression induced by the onset of diabetes To investigate protein changes in BB-DP islet homologous grafts during the onset of diabetes, 200 neonatal BB-DP rat islets were examined on 30-day-old BB- Transplanted into DP rats. Grafts were harvested at the onset of diabetes (defined as BG> 14 mmol / l for 2 consecutive days) for computer-based comparison with labeled, 2D gel electrophoresis and untransplanted BB-DP islands N = 5).

新しく糖尿病を発症したBB-DPラットからの同族島移植片からの蛍光間接撮影の分析。新しく糖尿病を発症したBB-DPラットからのBB-DP島同族移植片において、コンピューター解析は、1818個のタンパク質（1259個のIEFおよび577個のNEPHGE）が、５つのゲルのうちの５つに存在することを示した。（これらのデータは、コントロールの新生児BB-DPラット島に比較した場合に、発現レベルが変化した（64個は発現レベルが増加し、そして131個は発現レベルが減少した）（P<0.01、データ示さず）インビトロでの島および移植片の両方に存在する予備的なタンパク質である）。インビトロでIL-1インキュベーション後にBB-DPラットの島において発現のレベルが変化した、82個のタンパク質のうちの71個が、移植片において再同定された。71個の再同定されたタンパク質のうちの33個は、糖尿病の発症時での島同族移植片において、発現レベルが有意に変化した（４個がアップレギュレートされ、29個がダウンレギュレートされた）（表２）。 Analysis of indirect fluorescence imaging from homologous islet grafts from newly diabetic BB-DP rats. In BB-DP island homologous grafts from newly diabetic BB-DP rats, computer analysis shows that 1818 proteins (1259 IEF and 577 NEPHGE) are in 5 of 5 gels. It was shown to exist. (These data show that expression levels changed when compared to control neonatal BB-DP rat islets (64 increased expression levels and 131 decreased expression levels) (P <0.01, Data not shown) Preliminary protein present in both islets and grafts in vitro). Seventy-one of the 82 proteins whose levels of expression were altered in BB-DP rat islets after IL-1 incubation in vitro were re-identified in the graft. 33 of 71 re-identified proteins had significantly altered expression levels (4 were upregulated and 29 were downregulated in islet homologous grafts at the onset of diabetes (Table 2).

島WF同族移植片からの蛍光間接撮影の解析。移植手順自体によって引き起こされるタンパク質発現における変化を制御するために、WF島の同族移植片を、インビトロでWF新生児の島においてIL-1によって引き起こされるタンパク質の変化に比較した。インビトロでIL-1とともにインキュベートされたWF島において発現レベルが変化した、105個のタンパク質のうちの89個のタンパク質が、WFコントロール島と比較した場合、再同定されたのに対し、12個は、WF島移植片において存在しなかった（n=３）。93個の再同定されたタンパク質のうちの42個は、発現のレベルが有意に変化した（27個が減少し、および15個が増加した、ｐ<0.01、表５）。インビトロでのIL-1誘導性のタンパク質は、疾患発生の間、または島−移植片拒絶の間に、島−移植片において特異的に見られた。インビトロでのIL-1インキュベーション後に島における発現のレベルが変化することが見出され、および同族移植されたWF島において発現のレベルの有意な変化が見出されなかったタンパク質は、同族移植されたBB-DP島において見出された場合、疾患の発生に特異的であると示されるか、またはWKラットへ同種移植されたBB-DP島において見出された場合、移植片拒絶に特異的であると示された。同族移植されたBB-DP島における28個のタンパク質、および同種移植されたBB-DP島における29個のタンパク質は、発現のレベルが変化した（データは示さず）。BB-DP同種移植片における14個のタンパク質、およびWKラットにおけるBB-DP同族移植片における８個のタンパク質は、特異的に発現のレベルが変化した。 Analysis of indirect fluorescence imaging from an island WF cognate graft. To control the changes in protein expression caused by the transplantation procedure itself, WF island cognate grafts were compared to protein changes caused by IL-1 in WF neonatal islets in vitro. Of the 105 proteins with altered expression levels in WF islands incubated with IL-1 in vitro, 89 proteins were re-identified when compared to WF control islands, whereas 12 , Not present in WF island grafts (n = 3). Forty-two of the 93 re-identified proteins had a significant change in the level of expression (27 decreased and 15 increased, p <0.01, Table 5). In vitro IL-1-inducible proteins were found specifically in islet-grafts during disease development or during islet-graft rejection. Proteins that were found to have altered levels of expression in the islets after in vitro IL-1 incubation, and no significant changes in the level of expression were found in the cognate transplanted WF islands were cognate transplanted When found in BB-DP islands, it is shown to be specific for disease development, or when found in BB-DP islands allografted into WK rats, it is specific for graft rejection. It was shown that there was. The 28 proteins in the cognate transplanted BB-DP islands and the 29 proteins in the allografted BB-DP islands had altered levels of expression (data not shown). The 14 proteins in the BB-DP allograft and the 8 proteins in the BB-DP cognate graft in WK rats specifically changed the level of expression.

実施例５。糖尿病媒介性タンパク質の特徴づけ
合成のIL-1β誘導を示すタンパク質を、以下に記載するように、質量分析および微量配列決定によって分析した。市販のタンパク質データベースを、適合性について検索し、これらは、SWISS-PROT、PIR、NIH、およびGENEBANKを含んだ。 Example 5. Characterization of Diabetes-Mediated Proteins Proteins that show synthetic IL-1β induction were analyzed by mass spectrometry and microsequencing as described below. Commercial protein databases were searched for suitability and included SWISS-PROT, PIR, NIH, and GENEBANK.

微量配列決定。2DGEによって、糖尿病媒介性タンパク質として同定されたタンパク質スポットを、公知の方法に従って、ゲル中でトリプシンで消化し、濃縮し、HPLC分離し、ピークを配列決定し、そして部分配列を、公知の配列と比較することによって、さらに特徴づけした。微量配列決定の結果は、以下のようである：
タンパク質22（ピーク22）：AQYEELIANG(D)(M)(配列番号５)
（ピーク13）：KKPLVYDEG(K)(配列番号６)
タンパク質25（ピーク15）：LLEXTXXLX(配列番号７)
（ピーク16）：PSLNSXEX(配列番号８)
ガレクチン-3（ピーク22）：IELXEIX(配列番号９)
１つのタンパク質（分子量 68,700）の直接的な配列決定は、以下の部分配列を生じた：PEAIKGAVVGIDLG(配列番号10)(表２：GR75)。このタンパク質は、75kDグルコース調節タンパク質（GR75、表２）（PBP74、P66mot、モルタリン）に高い相同性を示し；hsp70タンパク質ファミリーの構成メンバーであり、非熱誘導性であり；異なる組織において偏在的に発現され；75kDが66kDにプロセスされるの46残基のリーダーペプチドを含み；ミトコンドリアにおいて見出され；細胞死と、および抗原提示と関連する。 Trace sequencing. Protein spots identified as diabetes-mediating proteins by 2DGE are digested with trypsin in gels, concentrated, HPLC separated, peaks sequenced and subsequences identified as known sequences according to known methods. Further characterization was made by comparison. The results of the microsequencing are as follows:
Protein 22 (Peak 22): AQYEELIANG (D) (M) (SEQ ID NO: 5)
(Peak 13): KKPLVYDEG (K) (SEQ ID NO: 6)
Protein 25 (Peak 15): LLEXTXXLX (SEQ ID NO: 7)
(Peak 16): PSLNSXEX (SEQ ID NO: 8)
Galectin-3 (Peak 22): IELXEIX (SEQ ID NO: 9)
Direct sequencing of one protein (molecular weight 68,700) resulted in the following partial sequence: PEAIKGAVVGIDLG (SEQ ID NO: 10) (Table 2: GR75). This protein shows high homology to the 75 kD glucose regulatory protein (GR75, Table 2) (PBP74, P66mot, mortalin); is a member of the hsp70 protein family and is non-heat-inducible; ubiquitously in different tissues Expressed; contains a 46-residue leader peptide of 75 kD processed to 66 kD; found in mitochondria; associated with cell death and antigen presentation.

１つのタンパク質は、ガレクチン-3と同定され、これはいくつかの組織に存在する27kDのタンパク質であり、プレmRNAスプライシング因子としての役割を有することが知られている。ヒトgal-3のアミノ酸配列を、図５（配列番号４）に示す。 One protein was identified as galectin-3, which is a 27 kD protein present in several tissues and is known to have a role as a pre-mRNA splicing factor. The amino acid sequence of human gal-3 is shown in FIG. 5 (SEQ ID NO: 4).

質量分析。インサイチュ消化を、本発明に従う少なくとも１つのゲルにおいて少なくとも１つのタンパク質スポットを含む、少なくとも１つのゲルプラグに対して行う。Feyら Electrophoresis18:1-12(1997)に記載されるように、RosenfeldらAnal.Biochem.203:173-179(1992)の方法の改変によって（これらの両方は、本明細書中に参考として詳細に援用される）ゲルを調製する。簡潔には、ゲルを迅速に染色し、そして脱染色する。￥メスでタンパク質を含有するゲルバンドを切断し、そしてUHQ水を含有するエッペンドルフチューブに-20℃で保存することによって、目的のタンパク質を得る。40%アセトニトリル／60%消化緩衝液中で、クマシー染色が除去されるまで、少なくとも１時間、ゲルプラグを洗浄することによって、タンパク質を消化する。この洗浄は、クマシー染色、ゲル緩衝液、SDS、および塩を除去する。必要であれば、洗浄は反復され得る。次いで、ゲルプラグを、プラグが縮み、そして表面が白くなるまで、真空遠心機で、20〜30分間、乾燥させる。乾燥時間は、ゲルプラグのサイズおよび厚さに依存する。トリプシン（または使用する酵素）を、消化緩衝液に溶解し、そして５mlをゲルプラグに添加する（分析されるべきゲル中のタンパク質の量（0.1mg）に依存する）。さらなる消化緩衝液を、ゲルプラグが、チューブの底において、緩衝液にほとんど覆われるまで添加する（約10ml）。次いで、ゲルプラグを、37℃で６時間または一晩インキュベートし、次いで70〜100ml60%アセトニトリル／40%水とともに、２〜６時間インキュベートして、ペプチドを抽出する。抽出は、回収を増大するために反復され得る。次いで、抽出物を凍結乾燥し、そしてMALDI-MSによって分析する前に、30%アセトニトリル／２%TFA中で溶解する。 Mass spectrometry. In situ digestion is performed on at least one gel plug comprising at least one protein spot in at least one gel according to the invention. By modification of the method of Rosenfeld et al. Anal. Biochem. 203: 173-179 (1992) as described in Fey et al. Electrophoresis 18: 1-12 (1997) (both of which are described in detail herein by reference). Prepare a gel). Briefly, the gel is quickly stained and destained. Cut the gel band containing the protein with a scalpel and store at −20 ° C. in an Eppendorf tube containing UHQ water to obtain the protein of interest. The protein is digested in 40% acetonitrile / 60% digestion buffer by washing the gel plug for at least 1 hour until Coomassie staining is removed. This wash removes Coomassie stain, gel buffer, SDS, and salt. If necessary, the washing can be repeated. The gel plug is then dried in a vacuum centrifuge for 20-30 minutes until the plug shrinks and the surface is white. The drying time depends on the size and thickness of the gel plug. Trypsin (or the enzyme used) is dissolved in the digestion buffer and 5 ml is added to the gel plug (depending on the amount of protein in the gel to be analyzed (0.1 mg)). Additional digestion buffer is added until the gel plug is almost covered with buffer at the bottom of the tube (about 10 ml). The gel plug is then incubated at 37 ° C. for 6 hours or overnight and then incubated with 70-100 ml 60% acetonitrile / 40% water for 2-6 hours to extract the peptides. The extraction can be repeated to increase recovery. The extract is then lyophilized and dissolved in 30% acetonitrile / 2% TFA before analysis by MALDI-MS.

図６〜48は、表１および２に示されるタンパク質について得られた、質量分析のデータを提供する。 Figures 6-48 provide the mass spectrometry data obtained for the proteins shown in Tables 1 and 2.

実施例６。同種移植片拒絶の間のインビボでのタンパク質の発現
拒絶の間のBB-DP島同種移植片におけるタンパク質の変化を調査するために、200の新生仔BB-DPラットの島を、30日齢のWKラットに移植した（N=３）。実質的な単核浸潤が予測される時点の、移植後12日目に移植片を回収した。移植片を、上述のようにプロセスし、そして分析した。 Example 6. In vivo protein expression during allograft rejection To investigate protein changes in BB-DP island allografts during rejection, 200 neonatal BB-DP rat islets were WK rats were transplanted (N = 3). Grafts were harvested 12 days after transplant, when substantial mononuclear infiltration was expected. Grafts were processed and analyzed as described above.

WKラットにおけるBB-DP島同種移植片からの蛍光光度分析。移植後12日目に、移植片において単核細胞の浸潤が観察され(18)、そしてこの時点でサンプリングされたBB-DP島同種移植片からの蛍光光度のコンピューター解析は、1714（1064IEFおよび650 NEPHGE）個のタンパク質が、３つのゲルのうちの３つに存在することを示した。BB-DP島同種移植片のゲルを、インビトロでのIL-１のインキュベーション後にBB-DP島における発現のレベルが有意に変化した82個のタンパク質に関して、新生仔のBB-DPラットの島のゲルに比較した。82個のタンパク質のうちの66個が再び同定された。66個の再び同定されたタンパク質のうちの33個が、発現レベルを変化することが見出された（28個が減少し、そして５個が増大した。p<0.01）。 Fluorescence analysis from BB-DP island allografts in WK rats. At day 12 post-transplantation, mononuclear cell infiltration was observed in the graft (18), and computer analysis of the fluorescence intensity from the BB-DP island allografts sampled at this time showed 1714 (1064 IEF and 650 NEPHGE) proteins were present in 3 out of 3 gels. BB-DP islet allograft gels were analyzed for 82 proteins whose levels of expression in BB-DP islands were significantly altered following in vitro incubation of IL-1 with neonatal BB-DP rat islet gels. Compared to. 66 of 82 proteins were identified again. 33 out of 66 re-identified proteins were found to change expression levels (28 decreased and 5 increased, p <0.01).

実施例７。島細胞における非毒性のアデノウイルス媒介性の遺伝子移入の確立。 Example 7. Establishment of non-toxic adenovirus-mediated gene transfer in islet cells.

ベクター誘導性の毒性の不在下での、ランゲルハンス島へのアデノウイルス媒介性の遺伝子移入についての至適な条件を決定するために、新生仔ラットの島を、島あたり、０、10、100、および1000pfuの感染多重度（moi）の用量で、アデノウイルスベクターβ-ガラクトシダーゼ（AdβGal）を用いて、３連で、25の群において形質導入した。遺伝子移入の効率を、おおまかな検査によって測定し、そして形質導入後１、４、７、および10日目での島分散後の、6-ガラクトシダーゼポジティブ細胞のパーセントによって評価した。簡潔には、島の毒性を、各時点での蓄積されたインスリンレベルを測定することによって、ならびに３および10日目での高血糖症に応じてインスリン放出を評価することによって、評価した。 To determine the optimal conditions for adenovirus-mediated gene transfer into Langerhans islets in the absence of vector-induced toxicity, neonatal rat islets were assigned 0, 10, 100, And transduced in groups of 25 in triplicate using adenoviral vector β-galactosidase (AdβGal) at doses of multiplicity of infection (moi) of 1000 pfu. The efficiency of gene transfer was measured by a rough test and assessed by the percentage of 6-galactosidase positive cells after islet dispersion on days 1, 4, 7, and 10 after transduction. Briefly, islet toxicity was assessed by measuring accumulated insulin levels at each time point and by assessing insulin release as a function of hyperglycemia at days 3 and 10.

結果。島への効率の良い用量依存性の遺伝子移入を、形質導入後１、４、７、および10日目で記録した。１日目で、moi10、100、1000にて、それぞれ、分散された島における8.3%、34.1%、および58.6%の細胞が、導入遺伝子を発現した。導入遺伝子発現は、実験の持続時間について安定であった。インスリン蓄積は、各時点で、形質導入された島と形質導入されない島との間で、差異はなく；そして10日目で発現された蓄積されたインスリンは、島あたりのインスリンnmolとして、14.3±1.5（0のmoiで）、15.0±2.6（10のmoiで）、22.0±7.8（100のmoiで）、および15.3±1.5（1,000のmoiで）であった。 result. Efficient dose-dependent gene transfer to the islets was recorded at 1, 4, 7, and 10 days after transduction. On day 1, at moi10, 100, and 1000, 8.3%, 34.1%, and 58.6% of the cells in the dispersed islands expressed the transgene, respectively. Transgene expression was stable for the duration of the experiment. Insulin accumulation is not different between transduced and non-transduced islets at each time point; and the accumulated insulin expressed on day 10 is 14.3 ± as insulin nmol per islet. 1.5 (at 0 moi), 15.0 ± 2.6 (at 10 moi), 22.0 ± 7.8 (at 100 moi), and 15.3 ± 1.5 (at 1,000 moi).

同様に、グルコースに対するインスリン分泌応答は、高いグルコースインキュベーションに対するインスリン応答を、低いグルコースインキュベーションに対するインスリンの応答で割ることによって得られ、研究した全ての用量で、３日目での形質導入された島および形質導入されない島において、類似であった（mod０；12.7±4.1；moi10、14.9±7.9；moi100、15.7±0.7；およびmoi1,000．22.3±6.7）。形質導入後10日目で、形質導入された細胞および形質導入されない細胞における比率は類似であった。 Similarly, the insulin secretory response to glucose was obtained by dividing the insulin response to high glucose incubation by the response of insulin to low glucose incubation, and at all doses studied the transduced islets on day 3 and In the non-transduced islands were similar (mod 0; 12.7 ± 4.1; moi 10, 14.9 ± 7.9; moi 100, 15.7 ± 0.7; and moi 1,000.22.3 ± 6.7). At 10 days after transduction, the ratios in transduced and non-transduced cells were similar.

実施例８。IDDMの自然発症におけるガレクチン-3の発現。 Example 8. Expression of galectin-3 in spontaneous development of IDDM.

200の新生仔BB-DPラットの島を、30日齢のBB-DPラットの腎臓被膜下に移植した。移植片を、移植の７日後（前糖尿病、n=６）、糖尿病発病時（n=６）、または移植の174日後（糖尿病を免れた動物、n=３）に回収し、そしてIL-1β刺激しした新生仔BB-DP島およびIL-1β刺激しなかった新生仔BB-DP島を、[35S]-メチオニンで標識し、そして高い分離度の２次元ゲル電気泳動のために調製した。 200 newborn BB-DP rat islets were transplanted under the kidney capsule of 30-day-old BB-DP rats. Grafts were harvested 7 days after transplantation (pre-diabetes, n = 6), at the onset of diabetes (n = 6), or 174 days after transplantation (animals free of diabetes, n = 3) and IL-1β Stimulated neonatal BB-DP islets and neonatal BB-DP islets that were not stimulated with IL-1β were labeled with [35S] -methionine and prepared for high resolution two-dimensional gel electrophoresis.

各サンプルを、等電点電気泳動（IEF、pH3.5〜７）および非平衡pH勾配電気泳動（NEPHGE、pH6.5〜10.5）について行った。ゲルの蛍光光度を、上述のように分析した。タンパク質の発現レベルにおける変化は、0.01よりも低いｐ値で有意性を考慮された（Studentのｔ検定）。 Each sample was performed for isoelectric focusing (IEF, pH 3.5-7) and non-equilibrium pH gradient electrophoresis (NEPHGE, pH 6.5-10.5). The gel fluorescence was analyzed as described above. Changes in protein expression levels were considered significant with a p-value lower than 0.01 (Student's t-test).

結果。インビトロでIl-1βで刺激された新生仔BB-DP島は、82個のタンパク質における変化を示した。これらのタンパク質のうちの97〜98％は、全ての時点で、全ての移植片において同定された。インビトロでの刺激されない正常なBB-DP島と比較された移植片タンパク質の発現レベルは、以下の変化を示した：新生仔島細胞をインビトロでIL-βで処理した場合、増大した発現を示す82個のタンパク質のうちの42個が７日目の移植島において増大し、31個が糖尿病の発病とともに増大し、そして14個が糖尿病を発症しなかった動物において増大した。増大したタンパク質のうち、それらのうち４個が、IDDMの発病時にのみ見られ、そして詳述される時点で見られない。７日目に、インビトロでのIL-β曝露で変化しない５個のタンパク質が、変化することが観察されたが、２個のタンパク質は、糖尿病の発症時に変化することが観察され、そして３個のタンパク質が、糖尿病を発症しなかった動物において観察された。インビボで変化するが、インビトロで変化しないことが観察されたタンパク質のうちの、これらの１個が、IDDM特異的であるとして同定された。Gel-3発現は、７日目およびIDDMの開始時で、顕著にダウンレギュレートされた。対照的に、gal-3発現は、インビトロでIL-1β刺激された島において、および糖尿病を発症しなかった動物からの移植片において、増大された。 result. Neonatal BB-DP islets stimulated with Il-1β in vitro showed changes in 82 proteins. 97-98% of these proteins were identified in all grafts at all time points. Graft protein expression levels compared to unstimulated normal BB-DP islets in vitro showed the following changes: increased expression when neonatal islet cells were treated with IL-β in vitro Of the 82 proteins, 42 increased in the transplanted islets on day 7, 31 increased with the onset of diabetes, and 14 increased in animals that did not develop diabetes. Of the increased proteins, 4 of them are only seen at the onset of IDDM and not at the time detailed. On day 7, five proteins that were not changed by in vitro IL-β exposure were observed to change, but two proteins were observed to change at the onset of diabetes and 3 Of proteins were observed in animals that did not develop diabetes. Of these proteins that were observed to change in vivo but not in vitro, one of these was identified as being IDDM specific. Gel-3 expression was markedly downregulated at day 7 and at the beginning of IDDM. In contrast, gal-3 expression was increased in IL-1β-stimulated islets in vitro and in grafts from animals that did not develop diabetes.

実施例９。インスリン産生細胞における、IL-1変換酵素（ICE）、誘導性の一酸化窒素シンターゼ（iNOS）、およびアポトーシスのサイトカイン誘導。 Example 9. IL-1 converting enzyme (ICE), inducible nitric oxide synthase (iNOS), and apoptosis cytokine induction in insulin producing cells.

ICE、iNOSの発現、およびアポトーシスの誘導を調査した。ラットインスリノーマおよび多能性細胞株のRIN-SAHおよびMSL-G2を、20時間、サイトカインの混合物（IL-1β、TNFoα、およびIFNγ）とともに培養し、RNAを単離し、そしてICE、iNOS、およびSP-1（正規化のためのハウスキーピングコントロールとして使用される、一般的な転写因子）に対するプライマーを用いて、多重PCR分析（27サイクル）を形成した。ゲル電気泳動分離、およびPhosphorImager定量後、結果を、SP-1mRNA発現に対して正規化し、そしてケイ酸した。 ICE, iNOS expression, and induction of apoptosis were investigated. Rat insulinoma and pluripotent cell lines RIN-SAH and MSL-G2 were cultured with a mixture of cytokines (IL-1β, TNFoα, and IFNγ) for 20 hours, RNA was isolated, and ICE, iNOS, and SP Multiplex PCR analysis (27 cycles) was formed using primers to -1 (a general transcription factor used as a housekeeping control for normalization). After gel electrophoresis separation and PhosphorImager quantification, the results were normalized to SP-1 mRNA expression and silicated.

結果。ICE発現もiNOS発現も、コントロール細胞において見出されなかった。SP-1遺伝子産物のアップレギュレーションのレベルに対して顕著なアップレギュレーションが、サイトカイン曝露の20時間後に、ICEおよびiNOSの両方において見られた。RIN細胞において、ICEはSP-1の98％で産生され、およびiNOSはSP-1の97%で産生された。アポトーシスもNOS産生も、コントロール細胞において観察されなかったが、サイトカインで誘導されたiNOS産生は、その後アポトーシス頻度およびNO産生を高度に増大した。RIN細胞において、蓄積された亜硝酸塩は、３日後に19.7±0.7μMであると測定された。
result. Neither ICE expression nor iNOS expression was found in control cells. Significant upregulation relative to the level of SP-1 gene product upregulation was seen in both ICE and iNOS 20 hours after cytokine exposure. In RIN cells, ICE was produced in 98% of SP-1 and iNOS was produced in 97% of SP-1. Neither apoptosis nor NOS production was observed in control cells, but cytokine-induced iNOS production subsequently highly increased apoptosis frequency and NO production. In RIN cells, the accumulated nitrite was determined to be 19.7 ± 0.7 μM after 3 days.

実施例８：ラット島におけるタンパク質発現のインターロイキン-1DF誘導した変化：コンピューター処理化データベース
要約
膵臓島タンパク質の２次元（2-D）ゲル電気泳動は、インスリン依存性糖尿病の分子的病原性の研究を容易にする重要なツールであり得る。インスリン依存性糖尿病は、ランゲルハンス島のβ細胞の自己免疫破壊によって引き起こされる。サイトカインのインターロイキン1βはインスリン放出を阻害し、そして単離された膵臓のラット島におけるβ細胞に対して選択的に細胞傷害性である。免疫応答の引き金になる１つまたは複数の抗原、ならびにインターロイキン1βが媒介したβ細胞細胞傷害性の作用の細胞内メカニズムは、知られていない。しかし、これまでの研究は、タンパク質合成の変化に関連することを見いだしている。したがって、島タンパク質の2-Dゲル電気泳動は、1)β細胞の免疫破壊を開始する一次抗原（単数または複数）の同定、2)サイトカインによって誘導される特定の島タンパク質の定性的および定量的変化の決定、および3)サイトカイン作用を調節する薬剤の効果の決定を導き得る。したがって、この研究の目的は、標準化された培養条件下で標識された、新生仔ラット島における10％および15％アクリルアミド2-Dゲル（10％および15％DB）上のすべての再生可能に検出可能なタンパク質スポットのデータベースを作製することであった。1792スポットが、15％DBにおける５つのゲルのうちの５つに存在したが、1373スポットが、10％DBにおける５つのゲルのうちの５つに存在し、75.2％と91.7％との間の定量的再生性を得た。両方のDBでは、すべてのゲルに存在するスポットについての積分した光学密度のパーセントの変動（％IODのCV％）の平均係数は、42.4％と45.7％との間であった。同じ試料を、異なる日に、ゲルの連続的セットで分析した場合（アッセイ間分析）、％IODの平均CV％は、35.5％〜36.1％であった。同じ試料をゲルの１つのセットで繰り返して分析した場合（アッセイ内分析）、％IODの平均CV％は、IEFゲルでは30.2％であったが、％IODの平均CV％は、NEPHGEゲルでは変わらなかった（45.7％）。IL-1βによって発現が変化したタンパク質を区別するために10％DBを適用すると、105の現在未同定のタンパク質スポットは、IL-1βによって新たにアップ／ダウンレギュレートまたは合成されることを見いだした。結果として、本発明者らは、ランゲルハンスの新生仔ラット島の第１の10％および15％アクリルアミド2-Dゲルタンパク質データベースを示し、そしてIL-1βによって発現が変化したタンパク質を同定するための利用を証明する。 Example 8: Interleukin-1DF-induced changes in protein expression in rat islets: computerized database Summary Two-dimensional (2-D) gel electrophoresis of pancreatic islet proteins is a molecular pathogenicity study of insulin-dependent diabetes Can be an important tool to facilitate Insulin-dependent diabetes is caused by autoimmune destruction of β cells on the islets of Langerhans. The cytokine interleukin 1β inhibits insulin release and is selectively cytotoxic to β cells in isolated pancreatic rat islets. One or more antigens that trigger an immune response, as well as the intracellular mechanisms of interleukin 1β-mediated β-cell cytotoxic effects are unknown. However, previous studies have found that it is related to changes in protein synthesis. Thus, islet protein 2-D gel electrophoresis can be used to: 1) identify primary antigen (s) that initiate β-cell immune destruction; 2) qualitative and quantitative analysis of specific islet proteins induced by cytokines. It can lead to the determination of changes and 3) the determination of the effects of agents that modulate cytokine action. Therefore, the purpose of this study was to detect all reproducibly on 10% and 15% acrylamide 2-D gels (10% and 15% DB) in neonatal rat islets labeled under standardized culture conditions It was to create a database of possible protein spots. 1792 spots were present in 5 out of 5 gels in 15% DB, while 1373 spots were present in 5 out of 5 gels in 10% DB, between 75.2% and 91.7% Quantitative reproducibility was obtained. In both DBs, the average coefficient of percent variation of integrated optical density (% IOD CV%) for spots present in all gels was between 42.4% and 45.7%. When the same sample was analyzed on different days with a continuous set of gels (inter-assay analysis), the average CV% of% IOD was 35.5% to 36.1%. When the same sample was analyzed repeatedly on one set of gels (intra-assay analysis), the average CV% for% IOD was 30.2% for IEF gels, but the average CV% for% IOD was different for NEPHGE gels. None (45.7%). When applying 10% DB to discriminate proteins whose expression was altered by IL-1β, we found that 105 currently unidentified protein spots were newly up / down regulated or synthesized by IL-1β . As a result, we show the first 10% and 15% acrylamide 2-D gel protein database of Langerhans neonatal rat islets and use to identify proteins whose expression has been altered by IL-1β. Prove that.

序論
サイトカインのインターロイキン1βは、インスリン放出を阻害し、そして単離された膵臓ラット島においてβ細胞に対して選択的に細胞傷害性である（Mandrup-Poulsen,T, Diabetologia in press (1996)）。活性タンパク質合成は、サイトカインのような発作後のβ細胞破壊、防御、および修復の重要な部分である。遊離ラジカル一酸化窒素（NO）は、島α細胞におけるサイトカインの有害な効果の重要なメディエーターであることが証明されている（Southernら,FEBS. Lett. 276:42-44 (1990)；Welshら, Endocrinol. 129:3167-3173 (1991)；Corbettら,J. Biol. Chem. 266:21351-21354 (1991)）。したがって、NO産生のための基質であるL-アルギニンのアナログは、インターロイキン1β（IL-1β）の有害な効果を防止し（Southernら,FEBS. Lett. 276:42-44 (1990)；Welshら, Endocrinol. 129:3167-3173 (1991)；Corbettら,J. Biol. Chem. 266:21351-21354 (1991)）、そしてサイトカイン誘導性イソ型のNOシンターゼ（iNOS）についてのmRNAは、β細胞でIL-1βによって誘導されるがα細胞では誘導されない（Corbettら,J. Clin. Invest. 90:2384-2391 (1992)）。本発明者らは、最近、新生仔ラット島からiNOSをクローニングし、そして２次元（2-D）ゲル上の一連のスポットとして、おそらくリン酸化したイソ型としての組換えiNOSの発現を証明し、131kDaの予測分子量および6.8〜7.0の範囲のpI値を有する（Karlsenら,Diabetes 44:753-758 (1995)）。 Introduction The cytokine interleukin 1β inhibits insulin release and is selectively cytotoxic to β cells in isolated pancreatic rat islets (Mandrup-Poulsen, T, Diabetologia in press (1996)) . Active protein synthesis is an important part of beta cell destruction, protection, and repair after stroke, such as cytokines. Free radical nitric oxide (NO) has been shown to be an important mediator of the deleterious effects of cytokines in islet α cells (Southern et al., FEBS. Lett. 276: 42-44 (1990); Welsh et al. , Endocrinol. 129: 3167-3173 (1991); Corbett et al., J. Biol. Chem. 266: 21351-21354 (1991)). Thus, an analog of L-arginine, a substrate for NO production, prevents the deleterious effects of interleukin 1β (IL-1β) (Southern et al., FEBS. Lett. 276: 42-44 (1990); 129: 3167-3173 (1991); Corbett et al., J. Biol. Chem. 266: 21351-21354 (1991)), and the mRNA for the cytokine-induced isoform of NO synthase (iNOS) is β Induced by IL-1β in cells but not in α cells (Corbett et al., J. Clin. Invest. 90: 2384-2391 (1992)). We have recently cloned iNOS from neonatal rat islets and demonstrated the expression of recombinant iNOS, possibly as a phosphorylated isoform, as a series of spots on a two-dimensional (2-D) gel. With a predicted molecular weight of 131 kDa and a pI value in the range of 6.8 to 7.0 (Karlsen et al., Diabetes 44: 753-758 (1995)).

さらに、タンパク質合成のインヒビターは、島機能におけるIL-1βの阻害効果をブロックし（Hughesら,J. Clin. Invest. 86:856-863 (1990)）、このことは新たなタンパク質合成がIL-1βの有害な効果に必要であることを示す。IL-1βはまた、熱ショックタンパク質（HSP）HSP32（ヘムオキシゲナーゼ）およびHSP70の合成を誘導し（Helqvistら,Acta Endocrinol. (Copenh.) 121:136-140 (1989)；Helqvistら, Diabetologia34:150-156 (1991)；Welshら, Autoimmunity 9:33-40 (1991)）、細胞性ストレスに対する防御および細胞修復において役割を果たすことが公知である（Kaufmann,Immunol. Today 11:129-136 (1990)）。さらに、IL-1βは、島における45、50（Hughesら, J. Clin.Invest. 86:856-863 (1990)）、75、85、95、および120kDa（Welshら, Autoimmunity 9:33-40(1991)）の分子量を有する多くの未知のタンパク質の合成を阻害する。2-Dゲル電気泳動を使用して、本発明者らは、最近、IL-1βが、新生仔ラット島においてそれぞれ29および３タンパク質をアップレギュレートおよびダウンレギュレートすることを証明した。 In addition, inhibitors of protein synthesis block the inhibitory effect of IL-1β on islet function (Hughes et al., J. Clin. Invest. 86: 856-863 (1990)), which suggests that new protein synthesis It is necessary for the harmful effects of 1β. IL-1β also induces the synthesis of heat shock proteins (HSP) HSP32 (heme oxygenase) and HSP70 (Helqvist et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 121: 136-140 (1989); Helqvist et al., Diabetologia 34: 150 -156 (1991); Welsh et al., Autoimmunity 9: 33-40 (1991)), known to play a role in protection against cellular stress and cell repair (Kaufmann, Immunol. Today 11: 129-136 (1990) )). In addition, IL-1β is found in 45, 50 (Hughes et al., J. Clin. Invest. 86: 856-863 (1990)), 75, 85, 95, and 120 kDa (Welsh et al., Autoimmunity 9: 33-40 in the islands. (1991)) which inhibits the synthesis of many unknown proteins having a molecular weight. Using 2-D gel electrophoresis, we have recently demonstrated that IL-1β up-regulates and down-regulates 29 and 3 proteins in neonatal rat islets, respectively.

内分泌島細胞は、β細胞破壊およびおそらく生存に重要な役割を果たし得る。島細胞の分散およびソーティングは、タンパク質合成パターンに影響を及ぼし得る潜在的に有害な手順である。選択した島細胞材料の不都合は、他の細胞からの合成によって希釈されるので、１つの細胞タイプにおけるタンパク質発現の何らかの変化が、より小さく現れることである。 Endocrine islet cells may play an important role in beta cell destruction and possibly survival. Islet cell dispersion and sorting is a potentially detrimental procedure that can affect protein synthesis patterns. The disadvantage of the selected islet cell material is that any change in protein expression in one cell type appears smaller because it is diluted by synthesis from other cells.

したがって、この研究の目的は、スポット検出再現性を決定すること、およびすべての(^３５S)-メチオニン標識した島タンパク質データベーススポットについて積分した光学密度のパーセントの変動（％IODのCV％）の係数を算出することであった。さらに、本発明者らは、スポットの％IODの総CV％に対するゲル調製のアッセイ内およびアッセイ間変動の寄与を研究する必要があった。最後に、本発明者らは、コンピュータ分析によって島タンパク質パターンのIL-1β誘導された変化の数を定義する必要があった。 Therefore, the purpose of this study was to determine spot detection reproducibility and coefficient of percent variation in optical density integrated (% IOD CV%) for all ( ³⁵ S) -methionine labeled islet protein database spots Was to calculate. Furthermore, we needed to study the contribution of intra- and inter-assay variability of gel preparation to the total CV% of spot% IOD. Finally, we needed to define the number of IL-1β induced changes in the islet protein pattern by computer analysis.

材料および方法
試薬。DMEM、RPMI 1640、およびハンクス平衡化塩溶液（HBSS）を、Gibco,Paisley, Scotlandから購入した。RPMI 1640に、20mM HEPES緩衝液、100,000 IU/Iペニシリン、および100mg/Lストレプトマイシンを補充した。認証された組換えヒトIL-1βは、NovoNordisk Ltd. (Bagsvaerd, Denmark)によって提供された。比活性は、400 U/ngであった（Moelvigら, Scand.J. Immunol. 31:225-235 (1990)）。以下の他の試薬を使用した：2-メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン（BSA）、TrisHCl、Tris塩基、グリシン（Sigma, St. Louis USA）；トリクロロ酢酸（TCA）、リン酸、NaOH、グリセロール、n-ブタノール、ブロモフェノールブルー（Merck,Darmstadt, Germany）；(^３５S)-メチオニン（SJ 204, 比活性：＞1.000 Ci/mmol、0.1％ 2-メルカプトエタノールを含む）、Amplify（登録商標）（AmershamInternational .Amersham, UK）；フィルター（HAWP 0.25μm孔サイズ）（Millipore, Boston, USA）；RNA'seA、DNA'se I（Worthington, Freehold, NJ, USA）；尿素（超純粋）（Schwartz/Mann, Cambridge,MA, USA）；アクリルアミド、ビスアクリルアミド、TEMED、過硫酸アンモニウム（BioRad, Richmond, CA, USA）；両性電解質：pH5-7、pH 3.5-10,pH 7-9、pH 8-9.5（Pharmacia, Uppsala, Sweden）；Nonidet P-40（BDH,Poole, UK）；両性電解質：pH 5-7およびドデシル硫酸ナトリウム（Serva, Heidelberg, Germany）；アガロース（Litex,Copenhagen, Denmark）；エタノール（無水96％）（Danish Distillers, Aalborg, Denmark）；メタノール（Prolabo,Brione Le Blanc, France）；酢酸（技術品質、99％氷酢酸）（Bie & Berntsen, Arhus, Denmark）、およびＸ線フィルム（CurixRP-2）（AGFA）。 Materials and Methods Reagents. DMEM, RPMI 1640, and Hanks balanced salt solution (HBSS) were purchased from Gibco, Paisley, Scotland. RPMI 1640 was supplemented with 20 mM HEPES buffer, 100,000 IU / I penicillin, and 100 mg / L streptomycin. Certified recombinant human IL-1β was provided by NovoNordisk Ltd. (Bagsvaerd, Denmark). The specific activity was 400 U / ng (Moelvig et al., Scand. J. Immunol. 31: 225-235 (1990)). The following other reagents were used: 2-mercaptoethanol, bovine serum albumin (BSA), TrisHCl, Tris base, glycine (Sigma, St. Louis USA); trichloroacetic acid (TCA), phosphoric acid, NaOH, glycerol, n -Butanol, bromophenol blue (Merck, Darmstadt, Germany); ( ³⁵ S) -methionine (SJ 204, specific activity:> 1.000 Ci / mmol, containing 0.1% 2-mercaptoethanol), Amplify® (Amersham International) Filters (HAWP 0.25 μm pore size) (Millipore, Boston, USA); RNA'seA, DNA'se I (Worthington, Freehold, NJ, USA); Urea (ultra pure) (Schwartz / Mann, Cambridge, MA, USA); acrylamide, bisacrylamide, TEMED, ammonium persulfate (BioRad, Richmond, CA, USA); ampholytes: pH 5-7, pH 3.5-10, pH 7-9, pH 8-9.5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden); Nonidet P-40 (BDH, Poole, UK); Amphoteric electrolytes: pH 5-7 and Sodium dodecyl sulfate (Serva, Heidelberg, Germany); agarose (Litex, Copenhagen, Denmark); ethanol (anhydrous 96%) (Danish Distillers, Aalborg, Denmark); methanol (Prolabo, Brione Le Blanc, France); acetic acid (technical quality) , 99% glacial acetic acid) (Bie & Berntsen, Arhus, Denmark), and X-ray film (CurixRP-2) (AGFA).

島単離および培養。データベースおよびアッセイ変動実験について、12の異なる島単離（データベースについては10、アッセイ内分析については１、およびアッセイ間分析については１）を行った。IL-1βに関する研究については、３つのさらなる島単離を行った。 Islet isolation and culture. For the database and assay variation experiments, 12 different islet isolations were performed (10 for database, 1 for intra-assay analysis, and 1 for inter-assay analysis). For studies on IL-1β, three additional islet isolations were performed.

４日齢の近交系Wistar Fursthラット（Mollegard, LilleSkensved, Denmark）の膵臓からの島を、コラゲナーゼ切断後に単離した(Brunstedt, Larner, J, Polh, S.L.(編), MethodsIn Diabetes Research, 1巻 (Laboratory methods, Part C). Wiley & Sons, NewYork, 254-288頁(1984)）。RPMI 1640＋10％ウシ胎児血清中での４日間の前培養後、150島を、300μl RPMI 1640＋0.5％正常ヒト血清（NHS）中で24時間インキュベートした。別のシリーズの実験では、150島を、150pg/mlIL-1βの添加ありまたはなしで、300μl RPMI 1640＋0.5％NHS中で24時間インキュベートした。 Islets from the pancreas of 4-day-old inbred Wistar Fursth rats (Mollegard, LilleSkensved, Denmark) were isolated after collagenase cleavage (Brunstedt, Larner, J, Polh, SL (ed.), Methods In Diabetes Research, Volume 1 (Laboratory methods, Part C). Wiley & Sons, New York, 254-288 (1984)). After 4 days of pre-culture in RPMI 1640 + 10% fetal calf serum, 150 islets were incubated in 300 μl RPMI 1640 + 0.5% normal human serum (NHS) for 24 hours. In another series of experiments, 150 islets were incubated in 300 μl RPMI 1640 + 0.5% NHS for 24 hours with or without the addition of 150 pg / ml IL-1β.

島標識。培養の24時間後、150島細胞を採取し、HBSSで２回洗浄し、そしてアミノ酸について透析した10％NHSを含む200μlのメチオニン非含有ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、および200μCi(^３５S)-メチオニン中で４時間標識した。2-メルカプトエタノールを除去するために、(^３５S)-メチオニンを、標識前に少なくとも４時間凍結乾燥した。標識後、島をHBSSで３回洗浄し、ペレットにし、そして−80℃で凍結した。 Island sign. After 24 hours of culture, 150 islet cells were harvested, washed twice with HBSS, and dialyzed for amino acids 200 μl methionine-free Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), and 200 μCi ( ³⁵ S) − Labeled for 4 hours in methionine. To remove 2-mercaptoethanol, ( ³⁵ S) -methionine was lyophilized for at least 4 hours prior to labeling. After labeling, islets were washed 3 times with HBSS, pelleted, and frozen at -80 ° C.

試料調製。凍結した島を、100μl DNAse I/RNAse A溶液に再懸濁し、そして２回凍結融解することによって溶解した。２回目の融解後、それらを核酸の切断のために30分間氷上に放置した。次いで、溶解した試料を一晩凍結乾燥した。試料を、最大４時間120μl溶解緩衝液（8.5M尿素、２％Nonidet P-40、５％ 2-メルカプトエタノール、および２％両性電解質pH範囲7-9）中で振盪することによって溶解した。 Sample preparation. Frozen islets were lysed by resuspending in 100 μl DNAse I / RNAse A solution and freeze-thawing twice. After the second thawing, they were left on ice for 30 minutes for nucleic acid cleavage. The dissolved sample was then lyophilized overnight. Samples were lysed by shaking in 120 μl lysis buffer (8.5 M urea, 2% Nonidet P-40, 5% 2-mercaptoethanol, and 2% ampholyte pH range 7-9) for up to 4 hours.

(^３５S)-メチオニン取り込みの決定。(^３５S)-メチオニン取り込みの量を、各試料の1:10希釈の５μlにキャリアとして10μgBSA（0.2μg/ml H_２O）を、次いで0.5mlの10％TCAを添加することによって、二連で定量した。これを、0.25μmフィルターを通して濾過する前に、40℃にて30分間沈殿させるために放置した。HAWPフィルターを乾燥し、そしてカウントのためにシンチレーション液に入れた。 Determination of ( ³⁵ S) -methionine uptake. The amount of ( ³⁵ S) -methionine incorporation was determined in duplicate by adding 10 μg BSA (0.2 μg / ml H ₂ O) as a carrier to 5 μl of a 1:10 dilution of each sample followed by 0.5 ml of 10% TCA. Quantified with. This was left to precipitate for 30 minutes at 40 ° C. before being filtered through a 0.25 μm filter. The HAWP filter was dried and placed in scintillation fluid for counting.

2-Dゲル電気泳動。手順は、本質的に、O'Farrellら, Cell12:1133-1142 (1977)およびFey, S.J.ら, The protein variation in basal cells andcertain basal cell related benign and malignant diseases, Faculty of NaturalScience, University of Aarhus, Denmark (1984)に記載のとおりであった。簡単にいえば、第一次元ゲルは、４％アクリルアミド、0.25％ビスアクリルアミド、および両性電解質（実際の比はバッチに依存する）を含み、そして175mm長および1.55mm直径であった。各試料の等しい数のカウント（10^６cpm）を、ゲルにアプライした。より低い量の放射活性の場合、比較できる総光学密度を得るようにゲルの曝露時間を調節する必要があった。試料を、等電点電気泳動（IEF；pH3.5-7）および非平衡pHグラジエント電気泳動（NEPHGE；pH 6.5-10.5）ゲルの両方で分析した。IEFゲルを、140μA/ゲル（限界電流）で約４時間プレフォーカシングし、次いで、試料をアプライし、そして1200V（限界電圧）にて18時間フォーカシングした。NEPHGEゲルを、限界パラメータとして140μA/ゲルおよび1200Vを使用して約6.5時間フォーカシングした。 2-D gel electrophoresis. The procedure was essentially the same as O'Farrell et al., Cell 12: 1133-1142 (1977) and Fey, SJ et al., The protein variation in basal cells andcertain basal cell related benign and malignant diseases, Faculty of Natural Science, University of Aarhus, Denmark (1984). Briefly, the first dimension gel contained 4% acrylamide, 0.25% bisacrylamide, and ampholyte (the actual ratio is batch dependent) and was 175 mm long and 1.55 mm diameter. An equal number of counts (10 ⁶ cpm) for each sample was applied to the gel. For lower amounts of radioactivity, it was necessary to adjust the gel exposure time to obtain comparable total optical densities. Samples were analyzed on both isoelectric focusing (IEF; pH 3.5-7) and non-equilibrium pH gradient electrophoresis (NEPHGE; pH 6.5-10.5) gels. The IEF gel was prefocused at 140 μA / gel (limit current) for about 4 hours, then the sample was applied and focused at 1200 V (limit voltage) for 18 hours. The NEPHGE gel was focused for approximately 6.5 hours using 140 μA / gel and 1200 V as the limiting parameters.

第二次元ゲルは、１mm厚、200mm長、および185mm幅であり、これは15％アクリルアミドおよび0.075％ビスアクリルアミド、または10％アクリルアミドおよび0.05％ビスアクリルアミドのいずれかを含み、そして一晩泳動した。電気泳動後、ゲルを、45％エタノールおよび7.5％酢酸中で45分間固定し、そして乾燥前に45分間Amplify（登録商標）での蛍光写真のために処理した。ゲルを、Ｘ線フィルムと接触して置き、そして−70℃で１〜40日間曝露した。各ゲルを、少なくとも３倍の期間曝露して、Ｘ線フィルムのダイナミックレンジの欠乏を補った。 The second dimension gel was 1 mm thick, 200 mm long, and 185 mm wide, which contained either 15% acrylamide and 0.075% bisacrylamide, or 10% acrylamide and 0.05% bisacrylamide, and was run overnight. After electrophoresis, the gel was fixed in 45% ethanol and 7.5% acetic acid for 45 minutes and processed for fluorescent photography with Amplify® for 45 minutes before drying. The gel was placed in contact with X-ray film and exposed for 1-40 days at -70 ° C. Each gel was exposed for a period of at least 3 times to compensate for the lack of dynamic range of the X-ray film.

分子量およびpIの決定。タンパク質の分子量を、標準ゲルとの比較によって決定した（Fey,S.J.ら, The protein variation in basal cells and certain basal cell relatedbenign and malignant diseases, Faculty of Natural Science, University ofAarhus, Denmark (1984)）。ゲル上の個々のタンパク質のpIを、pI較正キットの使用によって決定した。目標タンパク質を、以下の技法の１つまたはいくつかによってゲルで同定した：免疫ブロッティング、免疫沈降法、マイクロ配列決定、またはペプチドマッピング。 Determination of molecular weight and pI. The molecular weight of the protein was determined by comparison with a standard gel (Fey, S. J. et al., The protein variation in basal cells and certain basal cell related benign and malignant diseases, Faculty of Natural Science, University of Aarhus, Denmark (1984)). The pI of individual proteins on the gel was determined by using a pI calibration kit. The target protein was identified on the gel by one or several of the following techniques: immunoblotting, immunoprecipitation, microsequencing, or peptide mapping.

実験的設計。研究は、以下の３つの異なるシリーズの分析を含んだ：データベース分析、アッセイ内分析、およびアッセイ間分析。各分析について、IEFおよびNEPHGEゲルを、第二次元で10％および15％アクリルアミドを使用して流した。これは４つの亜群を提供した：10％IEF；15％IEF；10％NEPHGE；15％NEPHGE。10％アクリルアミドゲルでは、検出のおおよその分子量範囲は20と250kDaとの間であったが、15％アクリルアミドゲルでの検出のおおよその範囲は６と125kDaとの間であった。結果として、20と125kDaとの間の分子量を有するタンパク質は両方のデータベースに含まれるが、より低いおよびより高い分子量を有するタンパク質は、それぞれ15％および10％DBに特定された。10％および15％DBの比較は、10％IEFおよびNEPHGE亜群の両方で検出可能なより低い数の検出スポットを示した（結果を参照のこと）。結果として、アッセイ内およびアッセイ間分析（以下を参照のこと）を、15％IEFおよびNEPHGEゲルでのみ行った。 Experimental design. The study included three different series of analyses: database analysis, intra-assay analysis, and inter-assay analysis. For each analysis, IEF and NEPHGE gels were run using 10% and 15% acrylamide in the second dimension. This provided four subgroups: 10% IEF; 15% IEF; 10% NEPHGE; 15% NEPHGE. For the 10% acrylamide gel, the approximate molecular weight range for detection was between 20 and 250 kDa, while the approximate range for detection on the 15% acrylamide gel was between 6 and 125 kDa. As a result, proteins with molecular weights between 20 and 125 kDa are included in both databases, while proteins with lower and higher molecular weights were identified as 15% and 10% DB, respectively. Comparison of 10% and 15% DB showed a lower number of detection spots detectable in both 10% IEF and NEPHGE subgroups (see results). As a result, intra- and inter-assay analyzes (see below) were performed only on 15% IEF and NEPHGE gels.

データベースは、ゲルの１つのセットにおいて分析した10の異なる単離物に基づいた。2-Dゲル電気泳動後、最良の技術的品質および比較可能な光学密度を有する５つのゲルを、コンピュータ分析のために選択した。コンピュータ分析前に、各亜群における１つのゲルを、他の４つのデータベースゲル、５つのアッセイ内ゲル、および５つのアッセイ間ゲルでの比較のために使用した「マスターゲル」であるように任意に選択した。データベース「マスターゲル」を、アッセイ内およびアッセイ間分析についてマスターとして使用して、所定のスポットが、３つのシリーズの分析において同じ適合数を有することを確実にした。「マスターゲル」からのデータは、データベース分析にのみ含まれる。「マスターゲル」は、すべての４つの亜群における同じ単離物からであるが、４つの他のデータベースゲルを生じる単離物の同定は、亜群から亜群までわずかに変化した（表３）。 The database was based on 10 different isolates analyzed in one set of gels. After 2-D gel electrophoresis, five gels with the best technical quality and comparable optical density were selected for computer analysis. Prior to computer analysis, one gel in each subgroup was chosen to be the “master gel” used for comparison with the other 4 database gels, 5 intra-assay gels, and 5 inter-assay gels. Selected. The database “master gel” was used as the master for intra- and inter-assay analysis to ensure that a given spot had the same number of matches in the three series of analyses. Data from the “master gel” is only included in the database analysis. The “master gel” is from the same isolate in all four subgroups, but the identification of isolates that yielded four other database gels varied slightly from subgroup to subgroup (Table 3). ).

アッセイ内分析について、同じ試料の10ゲルを、１つのセットのゲルで分析した。2-Dゲル電気泳動後、最良の技術的品質および比較可能な光学密度を有する５つのゲルを、コンピュータ分析のために選択した（表３）。 For in-assay analysis, 10 gels of the same sample were analyzed with one set of gels. After 2-D gel electrophoresis, five gels with the best technical quality and comparable optical density were selected for computer analysis (Table 3).

アッセイ間分析について、同じ試料を、異なる日に10の連続したセットのゲルで分析した。2-Dゲル電気泳動後、最良の技術的品質および比較可能な光学密度を有する５つのゲルを、コンピュータ分析のために選択した（表３）。 For inter-assay analysis, the same sample was analyzed on 10 consecutive sets of gels on different days. After 2-D gel electrophoresis, five gels with the best technical quality and comparable optical density were selected for computer analysis (Table 3).

IL-1βによって発現が変化したタンパク質同定について、これまでに可視的に分析された(Andersenら,Diabetes 44:400-407 (1995)）、IL-1βで曝露した島の10％IEFおよびNEPHGEゲルを、10％IEFおよびNEPHGE DBに適合した。 10% IEF and NEPHGE gels of islands exposed to IL-1β have been visibly analyzed for the identification of proteins whose expression was altered by IL-1β (Andersen et al., Diabetes 44: 400-407 (1995)). Was fitted with 10% IEF and NEPHGE DB.

蛍光写真のコンピュータ分析。コンピュータ分析を、SunsparcワークステーションでBioImage（登録商標）プログラム（バージョン4.6M）を使用して行った。第１に、蛍光写真をスキャンし、そしてスポットを同定し、そしてBioImage（登録商標）プログラム,BioImage, Ann Arbor, MA, USAによって定量した。次に、各非マスターゲルを、「マスターゲル」と比較し、そしてコンピュータプログラムによって最初に見いだされないスポットの同定および定量を確実にするために手動で編集した。この比較を、BioImage（登録商標）プログラムを使用して同じ観察者（H.U.A.）によって行った。これに続いて、ゲルをBioImage（登録商標）プログラムによって適合し、そして適合の正確性を検査し、そして同じ観察者によって修正した。最後に、データを、QuattroPro（登録商標）スプレッドシート（Borland バージョン4.0）での算出について抽出した。 Computer analysis of fluorescent photographs. Computer analysis was performed using the BioImage® program (version 4.6M) on a Sunsparc workstation. First, fluorescent photographs were scanned and spots were identified and quantified by the BioImage® program, BioImage, Ann Arbor, MA, USA. Each non-master gel was then compared with a “master gel” and manually edited to ensure the identification and quantification of spots not initially found by the computer program. This comparison was made by the same observer (H.U.A.) using the BioImage® program. Following this, the gel was fitted by the BioImage® program and the accuracy of the fit was checked and corrected by the same observer. Finally, the data was extracted for calculation on a QuattroPro® spreadsheet (Borland version 4.0).

IEFおよびNEPHGE亜群の二重スポットの存在を避けるために、IEFゲルの塩基性部分またはNEPHGEゲルの酸性部分のいずれかの重複スポットを、データベースにおける解析およびアッセイ解析から除いた。 To avoid the presence of double spots in the IEF and NEPHGE subgroups, overlapping spots in either the basic part of the IEF gel or the acidic part of the NEPHGE gel were excluded from analysis in the database and assay analysis.

統計学的解析。２つの異なる解析を、IL-1βによる発現で変化したタンパク質を区別するために適用した。第一の解析では、IL-1β曝露ゲルにおけるスポットの平均％IODが、DBにおける同じスポットの平均％IOD±2SDより高いかまたは低い場合、変化が有意であると見なした。二群間の第二の比較では、スチューデントｔ検定を適用し、ｐ＜0.01を有意性のレベルとして選択した。 Statistical analysis. Two different analyzes were applied to distinguish proteins that were altered by expression by IL-1β. In the first analysis, changes were considered significant if the mean% IOD of the spots in the IL-1β exposed gel was higher or lower than the average% IOD ± 2SD of the same spots in the DB. For the second comparison between the two groups, the Student t test was applied and p <0.01 was selected as the level of significance.

新生仔ラット島タンパク質データベースおよびアッセイ解析の質的再現性。1293〜1411個（IEF）および605〜764個（NEPHGE）のスポットが15％DBを構築するために用いた個々のゲルにおいて見出され、一方、1101〜1200個（IEF）および462〜577個（NEPHGE）のスポットが10％DBについて用いたゲルにおいて見出された（表４および表５）。「マスターゲル」を10％のIEFおよびNEPHGEDBのために作製した。全体で、1792個のスポットが15％DBにおいて５つのゲルの内５つに存在し、一方、1373個のスポットが10％DBにおいて５つのゲルの内５つに存在した。このことは、75.2％（NEPHGE10％）〜91.7％（IEF 15％）の間の亜群における質的再現性（５つのゲルの内５つに見出されるスポットの百分率の平均）を生じた（表４および５）（５つのゲルの内５つに存在する各スポットについて、データベースは、スポット適合数、５つの個々のスポットに対する％IOD、平均％IOD、％IODの標準偏差、％IODのCV％、MW、およびpIからなる）。 Qualitative reproducibility of the neonatal rat islet protein database and assay analysis. 1293-1411 (IEF) and 605-764 (NEPHGE) spots were found in the individual gels used to construct the 15% DB, while 1101-1200 (IEF) and 462-577 (NEPHGE) spots were found in the gel used for 10% DB (Tables 4 and 5). A “master gel” was made for 10% IEF and NEPHGEDB. In total, 1792 spots were present in 5 out of 5 gels at 15% DB, while 1373 spots were present in 5 out of 5 gels at 10% DB. This resulted in qualitative reproducibility (average of the percentage of spots found in 5 out of 5 gels) between 75.2% (NEPHGE 10%) and 91.7% (IEF 15%) subgroup (Table 4 and 5) (For each spot present in 5 out of 5 gels, the database shows the number of spot fits,% IOD for 5 individual spots, average% IOD, standard deviation of% IOD, CV% of% IOD. , MW, and pI).

表４および５に示されるように、個々のゲル中のスポットの総数、ならびに５つのゲルのうち５つに存在するスポットの数および百分率は、10％DBにおいて15％DBにおけるよりも少なかった。しかし、データベースを５つのゲルのうち少なくとも３つのゲルに存在するスポットを含むように拡張する場合、２つのデータベース間では、存在するスポットの百分率において差異は見られなかった（IEF：15％：98.8±1.2；10％：97.4±1.5；NEPHGE：15％：94.8±5.7；10％：94.1±3.5、表４および５）。両データベースにおいて、５つのゲルの内５、４、３、または２つに存在するスポットの百分率は、NEPHGEゲルにおいてIEFゲルにおけるより低かった（表４および５）。５未満のゲルに存在するスポットの空間的位置を調査した。これは、スポットが１、２、３または４つのゲルに存在するか否かに依存してゲルの特定の領域において群分けされなかったことを示す。 As shown in Tables 4 and 5, the total number of spots in each gel, as well as the number and percentage of spots present in 5 out of 5 gels, were less in 10% DB than in 15% DB. However, when the database was expanded to include spots present in at least 3 out of 5 gels, there was no difference in the percentage of existing spots between the two databases (IEF: 15%: 98.8 ± 1.2; 10%: 97.4 ± 1.5; NEPHGE: 15%: 94.8 ± 5.7; 10%: 94.1 ± 3.5, Tables 4 and 5). In both databases, the percentage of spots present in 5, 4, 3, or 2 of 5 gels was lower in NEPHGE gels than in IEF gels (Tables 4 and 5). The spatial location of spots present in less than 5 gels was investigated. This indicates that spots were not grouped in specific areas of the gel depending on whether spots were present in 1, 2, 3 or 4 gels.

アッセイ内解析およびアッセイ間解析を15％ゲルにおいてのみ実施した。なぜなら、検出可能なスポットの数がこのデータベースにおいてより高かったからであった。両解析において、個々のゲル中のスポットの数ならびに５つのゲルの内５つに存在するスポットの数および百分率は、15％DBに比較してわずかに（９％〜19％）減少した（表４および６を比較する）。 Intra-assay and inter-assay analyzes were performed only on 15% gels. This is because the number of detectable spots was higher in this database. In both analyses, the number of spots in each gel and the number and percentage of spots present in 5 out of 5 gels were slightly reduced (9% -19%) compared to 15% DB (Table 4 and 6 are compared).

新生仔ラット島タンパク質データベースおよびアッセイ解析の量的再現性。量的再現性を、５つのゲルのうち５つに存在する各スポットについての％IODのCV％の平均として定義した。データベースについて、平均CV％は、ゲルの10％および15％の両方のIEFならびにNEPHGE亜群において相当のレベルであった（42.4％〜45.7％）（表７）。全DB亜群について、CV％は、3.0％〜167.9％の間の範囲であった（表７）。アッセイ間解析について、平均CV％は、IEFおよびNEPHGEゲル亜群の両方について35.5％〜36.1％であった。一方、平均CV％は、IEFゲルのアッセイ内解析について30.2％であり、そしてNEPHGEゲルについて45.7％であった。 Quantitative reproducibility of the neonatal rat islet protein database and assay analysis. Quantitative reproducibility was defined as the average CV% of% IOD for each spot present in 5 out of 5 gels. For the database, the average CV% was at a significant level (42.4% -45.7%) in both 10% and 15% IEF and NEPHGE subgroups of the gel (Table 7). For all DB subgroups, CV% ranged between 3.0% and 167.9% (Table 7). For inter-assay analysis, mean CV% was between 35.5% and 36.1% for both the IEF and NEPHGE gel subgroups. On the other hand, the average CV% was 30.2% for in-assay analysis of IEF gels and 45.7% for NEPHGE gels.

続いて、全てのゲル中に存在するデータベーススポットを、％IODのCV％の桁を増大させて階級付けした。これは、４つのデータベース亜群全てにおいて、スポットに対して同様のシグモイド型曲線を生じる。従って、スポットの30％は、29.7％〜32.5％より低いCV％を有し、スポットの50％は、37.8％〜42.8％より低いCV％を有し、スポットの90％は、68.4％〜80.6％より低いCV％を有した。曲線の傾斜は、最高CV％を伴う５％〜10％のスポットが％IODの平均CV％に有意に寄与することを示している。これは、データベースの亜群のメジアン値が、亜群の平均値より2.3％〜5.5％低いという事実によって支持される（表７）。 Subsequently, the database spots present in all gels were ranked by increasing the CV% order of% IOD. This produces similar sigmoid curves for the spots in all four database subgroups. Thus, 30% of the spots have a CV% lower than 29.7% -32.5%, 50% of the spots have a CV% lower than 37.8% -42.8%, and 90% of the spots are 68.4% -80.6 % Had a CV% lower than%. The slope of the curve shows that 5-10% spots with the highest CV% contribute significantly to the average CV% of% IOD. This is supported by the fact that the median value of the subgroup of the database is 2.3% to 5.5% lower than the average value of the subgroup (Table 7).

データベース亜群における各スポットに対する平均％IODと％IODのCV％との間の回帰解析。NEPHGEの10％および15％のDB亜群において、最高平均IOD％を伴う10個のスポットのうちそれぞれ２個および６個が最低CV％を伴うパーセント点において見出された（上記を参照のこと）。最高平均IOD％を伴う10個のスポットのどれもがIEFDB亜群においてはこのパーセント点で見出されなかったが、回帰解析を行ってスポットの平均％IODとCV％との間に相関があるか否かを調べた。回帰解析は、これらの２つのパラメーター間で有意な負の相関があることを示した（範囲：ｐ＝０（IEF10％）−ｐ＝0.00288（IEF 15％））。しかし、Ｒ^２値は全ての亜群に対して非常に低かったので（範囲：Ｒ^２＝0.0072（IEF15％）Ｒ^２＝0.0317（IEF 10％））、CV％の可変性の大部分は、平均％IODの変動によっては説明されない。 Regression analysis between mean% IOD and CV% of% IOD for each spot in the database subgroup. In the 10% and 15% DB subgroups of NEPHGE, 2 and 6 of the 10 spots with the highest average IOD%, respectively, were found at the percent points with the lowest CV% (see above) ). None of the 10 spots with the highest average IOD% were found at this percentage in the IEFDB subgroup, but a regression analysis was performed to correlate between the spot average% IOD and CV% I investigated whether or not. Regression analysis showed that there was a significant negative correlation between these two parameters (range: p = 0 (IEF 10%)-p = 0.00288 (IEF 15%)). However, since R ² values were very low for all subgroups (range: R ² = 0.0072 (IEF 15%) R ² = 0.0317 (IEF 10%)), most of the variability of CV% is Not explained by changes in average% IOD.

IL-1βによる発現において変化したタンパク質を区別するための10％IEFおよびNEPHGEDBの適用。近年の論文で、本発明者らは、IL-1βＢが新生仔ラット島タンパク質の2-Dゲルにおいて、29個のタンパク質をアップレギュレートし、そして４つのタンパク質をダウンレギュレートすることをそれぞれ示した（Andersenら、Diabetes44:400-407 (1991)）。10％ゲルを、本研究と類似の条件下で培養した（35S）メチオニン標識Wistar Furth新生仔ラット島から調製した。従って、ラット島の10％のIEFおよびNEPHGEDBを、以前の論文（Andersenら、Diabetes 44:400-407(1991)）で可視解析したIL-1β曝露島のコンピューター解析ゲルとの比較のために使用した。各DBスポットのIOD％の±2SDをカットオフレベルとして用いて（可視解析における有意なアップまたはダウンレギュレーションのための基準に匹敵する）、10％DBとの比較は、これらの変化の32個を確認し、そして予期されるようにいくつかの新規なタンパク質変化を同定した。従って、IL-1βによって、全部で183個のスポットがアッブレギュレートされ、113個がダウンレギュレートされ、そして34個が新規に合成された（結果は示さず）。スチューデントｔ検定においてｐ＜0.01をカットオフレベルとして用いた場合、最終的な解析は、IL-1βによって、52個のスポットがアップレギュレートされ、47個がダウンレギュレートされ、そして６個が新規に合成されることを示し、これらのうち13個は、可視解析により選択された33個のスポット中に含まれた。 Application of 10% IEF and NEPHGEDB to distinguish proteins altered in expression by IL-1β. In a recent paper, we show that IL-1βB up-regulates 29 proteins and down-regulates 4 proteins in 2-D gels of neonatal rat islet protein, respectively. (Andersen et al., Diabetes 44: 400-407 (1991)). A 10% gel was prepared from (35S) methionine labeled Wistar Furth neonatal rat islets cultured under conditions similar to this study. Therefore, 10% rat islet IEF and NEPHGEDB were used for comparison with a computer-analyzed gel of IL-1β-exposed islands analyzed in a previous paper (Andersen et al., Diabetes 44: 400-407 (1991)). did. Comparison with 10% DB using 32 IOD% of each DB spot as the cutoff level (comparable to criteria for significant up or down regulation in visual analysis) Confirmed and identified some novel protein changes as expected. Thus, IL-1β aggregated a total of 183 spots, 113 were down-regulated, and 34 were newly synthesized (results not shown). When p <0.01 was used as the cut-off level in Student's t test, the final analysis was that 52 spots were up-regulated, 47 were down-regulated, and 6 were new by IL-1β. Of these, 13 were included in 33 spots selected by visual analysis.

考察：
本研究において、本発明者らは、新生仔ラットランゲルハンス島の10％および15％のアクリルアミド2-Dゲルタンパク質DBを提示する。これは、任意の種における島またはインスリン分泌細胞の第一のタンパク質データベースを含む。1792個のスポットが15％DBにおいて５つのゲルのうち５つに存在したが、一方、1373個のスポットが10％DBにおいて５つのゲルのうち５つに存在した。このことは、75.2％〜91.7％の間の質的再現性を生じている。両データベースにおいて、％IODの平均CV％は、42.4％〜45.7％の間であった。IL-1βによる発現で変化したタンパク質を区別するために10％DBを適用し、105個の現在未同定のタンパク質スポットが、IL-1βによりアップ／ダウンレギュレートされるかまたは新規に合成されることが分かった。 Discussion:
In this study, we present 10% and 15% acrylamide 2-D gel protein DB of newborn rat islets of Langerhans. This includes the first protein database of islets or insulin secreting cells in any species. 1792 spots were present in 5 out of 5 gels at 15% DB, while 1373 spots were present in 5 out of 5 gels at 10% DB. This results in a qualitative reproducibility between 75.2% and 91.7%. In both databases, the average CV% for% IOD was between 42.4% and 45.7%. Apply 10% DB to distinguish proteins altered by IL-1β expression, and 105 currently unidentified protein spots are up / down regulated by IL-1β or newly synthesized I understood that.

新生仔Wistar Furthラット島の特徴。可変性を減少させるために、ラットの同系繁殖WistarFurth系を本発明者らのデータベースの島供給者として選択した。この系統は、本発明者らの研究所において島実験のために日常的に使用されている異系交配Wistarの同系繁殖変種である（Andersenら、Diabetes43:770-777(1994)）。本発明者らは、IL-1βを用いてまたは用いずに培養したWistar Furth新生仔ラット島の機能がWistar新生仔ラット島の機能に匹敵することを以前に決定し（Andersenら、Diabetes44:400-407(1995)；Andersenら、Acta Endocrinol. 120:92-98(1989)）、そしてWistar Furth島の2-Dゲルタンパク質パターンに対するIL-1βの効果を決定した（Andersenら、Diabetes44:400-407(1995)）。本データベースは新生仔ラット島に基づくのであって、成体ラット島には基づいていないので、本発明者らは、成体島のタンパク質パターンが異なることを排除できない。しかし、異系交配Wistarラット由来の成体および新生仔島は、IL-1の有害な影響に対して同等に感受性である（Mandrup-Poulsenら、Diabetes36:641-647（1987)）。 Features of newborn Wistar Furth rat island. In order to reduce variability, the inbred WistarFurth line of rats was selected as the island supplier in our database. This line is an inbred variant of the outbred Wistar routinely used for island experiments in our laboratory (Andersen et al., Diabetes 43: 770-777 (1994)). We have previously determined that the function of Wistar Furth neonatal rat islets cultured with or without IL-1β is comparable to that of Wistar neonatal rat islets (Andersen et al., Diabetes 44: 400 -407 (1995); Andersen et al., Acta Endocrinol. 120: 92-98 (1989)), and the effect of IL-1β on the 2-D gel protein pattern of Wistar Furth Island was determined (Andersen et al., Diabetes44: 400- 407 (1995)). Since this database is based on newborn rat islets and not on adult rat islets, we cannot exclude that the protein patterns of adult islets are different. However, adult and neonatal islets from outbred Wistar rats are equally susceptible to the deleterious effects of IL-1 (Mandrup-Poulsen et al., Diabetes 36: 641-647 (1987)).

島単離のために使用される新生仔ラットの各同腹仔は、代表的には、種々の頻度で雄または雌である８〜12の仔ラットからなる。雄および雌の異系交配Wistarラット由来の肝臓タンパク質のクマシーブルー染色ゲルの比較は、250個の解析したスポットのうち７個において量的差異を示し、そして６つのタンパク質が雄において独占的に見出され、そして１つのタンパク質が雌において独占的に見出された（Steinerら、Electrophoresis16:1969-1976 (1995)）ので、本発明者らのデータベースにおけるタンパク質のいくつかは、性特異的または性調節的であると考えられる。従って、本発明者らのデータベースにおけるスポットのいくつかの高い変動は、本発明者らが雄および雌のラット由来の島の別個のデータベースを作成するために選択した場合減少され得る。しかし、肝臓タンパク質のゲルを、非培養細胞において実施した。これは、性決定タンパク質可変性は、循環性ステロイドによって誘導され得、肝細胞自体の固有の形質ではないことを意味し得る。循環ホルモンは、本発明者らのタンパク質パターンに干渉しないと思われる。なぜなら、Ｉ）本発明者らは、実験前に４日間島を予備培養し、そしてII）性ステロイドの血清濃度における差異は思春期前には見られないからである。さらに、本発明者らは、雄および雌異系交配Wistarラット由来の島は、IL-1の有害な影響に対して同等に感受性であることを以前に示した（Steinerら、Electrophoresis16:1969-1976（1995)）。 Each litter of newborn rats used for islet isolation typically consists of 8-12 pups that are male or female at varying frequencies. Comparison of Coomassie blue stained gels of liver proteins from male and female outbred Wistar rats showed quantitative differences in 7 out of 250 analyzed spots, and 6 proteins were seen exclusively in males Since one protein was found exclusively in females (Steiner et al., Electrophoresis 16: 1969-1976 (1995)), some of the proteins in our database are sex-specific or sex-specific. It is considered to be regulatory. Thus, some high variability of spots in our database can be reduced if we choose to create separate databases of islets from male and female rats. However, liver protein gels were performed in uncultured cells. This may mean that sex-determining protein variability can be induced by circulating steroids and not an inherent trait of the hepatocyte itself. Circulating hormones do not appear to interfere with our protein pattern. Because I) we pre-culture the islands for 4 days before the experiment, and II) no difference in sex steroid serum concentrations is seen before puberty. Furthermore, we have previously shown that islets from male and female outbred Wistar rats are equally susceptible to the deleterious effects of IL-1 (Steiner et al., Electrophoresis 16: 1969- 1976 (1995)).

島タンパク質の検出。本発明者らのデータベースにおいて検出された全てのスポットが、異なるタンパク質体(entity)を表しているわけではない。なぜなら、いくつかのスポットは他のタンパク質の改変（例えば、アセチル化、メチル化、リン酸化、またはカルバミル化）を表し得るからである。しかし、スポットの検出数は、島タンパク質の総数の低めの見積もりである。なぜなら、タンパク質データベースは、感度限界未満のタンパク質、メチオニンを含まないタンパク質、6kDaより低いかもしくは250kDaより高い分子量を有するタンパク質、または3.5より低いかもしくは10.5より高いpHを有するタンパク質を含まない。さらに、検出限界を上回るIODを有するスポットの約40％は、以前には、それらが他のスポットに覆われているので失われていると見積もられていた（Garrels、J.Biol. Chem. 264:5269-5282 (1989)）。最後に、４時間の標識化期間が、高い合成速度でのタンパク質の標識化を与えるが、より長い標識化期間が、全てのタンパク質が定常状態にあるデータベースを作成するために必要とされ得る。 Islet protein detection. Not all spots detected in our database represent different protein entities. This is because some spots may represent other protein modifications (eg, acetylation, methylation, phosphorylation, or carbamylation). However, the number of detected spots is a lower estimate of the total number of island proteins. This is because the protein database does not include proteins below the sensitivity limit, proteins that do not contain methionine, proteins that have a molecular weight below 6 kDa or above 250 kDa, or proteins that have a pH below 3.5 or above 10.5. Furthermore, approximately 40% of spots with IOD above the detection limit were previously estimated to be lost because they are covered by other spots (Garrels, J. Biol. Chem. 264: 5269-5282 (1989)). Finally, a 4 hour labeling period provides protein labeling at a high synthesis rate, but a longer labeling period may be required to create a database where all proteins are in steady state.

質的再現性。2-Dゲルタンパク質データベースの質的再現性の以前の報告は少なく、結果は可変である：クマシーブルー染色2-Dゲルのマウス肝臓タンパク質データベースでは、826個のスポットがマスター画像に存在し、平均して500個のスポットが他のマウス肝臓パターンの85％において適合した（Giomettiら、Electrophoresis13:970-991(1992)）。（³⁵Ｓ）-メチオニン標識マウス胚のタンパク質データベースでは、４つのゲル画像の各々において80％以上のスポットが、自動的に標準画像に適合された（Shiら、Molec.Reprod. Develop. 37:34-47 (1994)）。本発明者らの研究では、1792個のスポット（75.2％〜91.7％）が15％DB中の５つのゲルの内５つに存在したが、５つのゲルの内５つに存在するスポットの平均百分率は10％DBにおけるより５〜10％低かった。これは、おそらく10％ゲルでのみ解析可能な高分子量領域には、15％ゲルでのみ解析可能な低分子量領域におけるよりも、より少ないタンパク質が存在するという事実に起因する。解析した全ての群において、NEPHGEゲルの質的再現性は、IEFゲルにおける再現性より低かった。NEPHGEゲルは、IEFゲルとは反対に、非平衡性ゲルなので、同一のスポットがわずかに異なる水平位置を有する危険性が増大する。しかし、本発明者らの手動編集は、この問題が可能な限り取り除かれていることを確認した。 Qualitative reproducibility. Previous reports of qualitative reproducibility of the 2-D gel protein database are few and results are variable: in the mouse liver protein database of Coomassie Blue stained 2-D gel, 826 spots are present in the master image and average 500 spots matched in 85% of other mouse liver patterns (Giometti et al., Electrophoresis 13: 970-991 (1992)). In the protein database of ( ³⁵ S) -methionine labeled mouse embryos, over 80% of the spots in each of the four gel images were automatically adapted to the standard image (Shi et al., Molec. Reprod. Develop. 37:34 -47 (1994)). In our study, 1792 spots (75.2% -91.7%) were present in 5 out of 5 gels in 15% DB, but the average of the spots present in 5 out of 5 gels The percentage was 5-10% lower than in 10% DB. This is probably due to the fact that there are fewer proteins in the high molecular weight region that can only be analyzed with the 10% gel than in the low molecular weight region that can only be analyzed with the 15% gel. In all groups analyzed, the qualitative reproducibility of the NEPHGE gel was lower than that of the IEF gel. NEPHGE gels, as opposed to IEF gels, are non-equilibrium gels, increasing the risk that the same spot will have slightly different horizontal positions. However, our manual editing has confirmed that this problem has been eliminated as much as possible.

量的再現性。量的再現性に関しては、他の研究との比較は困難である。なぜなら、スポット同定のために用いられる方法は同一ではないからである。さらに、以前に公開されたデータベースのほとんどにおける％IODのCV％の計算に含まれるスポットは、種々の基準に従って適合スポットの総数から選択される。雄および雌のWistarラット肝タンパク質の10個のクーマシーブルー染色ゲルにおいて、「マスターゲル」に存在する1,000個より多くのスポットのうち250個を、良好な形状、大きさ、および解像度、ならびに以前の実験における存在および良好な質に従って選択した（Steinerら、Electrophoresis16:1969-1976(1995)）。これらの基準を用いて、スポットの３分の１は、20％を下回るCV％を有し、半分より多くは、30％を下回るCV％を有し、そして４分の３は40％を下回るCV％を有した(Steinerら、Electrophoresis16:1969-1976(1995)）。緻密八細胞(compacted eight-cell;CEC)マウス胚の５つのゲルおよび胞胚期(BS)マウス胚の４つのゲルからなる（³⁵Ｓ）-メチオニン標識マウス胚のタンパク質データベースでは、それぞれ1,674個のスポットおよび1,653個のスポットが、全てのゲルにおいて適合した（Shiら、Molec.Reprod. Develop. 37:34-47 (1994)）。全ての適合スポットに基づいて算定すると、これらのスポットの74％（CEC）または79％（BS）の百分率誤差（SEM×100/平均として定義）は50％未満であり、そしてスポットの45％（CEC）または47％（BS）は30％を下回る百分率誤差を有した（Shiら、Molec.Reprod. Develop. 37:34-47 (1994)）。比較のために、SDのSEMへの変換（SEM＝SD/√ｎ）が、島IEFの15％DBにおいて20.3％の平均CV％を与え、スポットの97.7％および83.2％は、それぞれ50％および30％を下回る百分率誤差を有する。 Quantitative reproducibility. In terms of quantitative reproducibility, it is difficult to compare with other studies. This is because the method used for spot identification is not the same. In addition, the spots included in the% IOD CV% calculation in most previously published databases are selected from the total number of matching spots according to various criteria. In 10 Coomassie blue-stained gels of male and female Wistar rat liver proteins, 250 out of more than 1,000 spots present in the “master gel” had good shape, size, and resolution, and previously Selected according to their presence and good quality in their experiments (Steiner et al., Electrophoresis 16: 1969-1976 (1995)). Using these criteria, one third of the spots have CV% below 20%, more than half have CV% below 30%, and three quarters are below 40% CV% (Steiner et al., Electrophoresis 16: 1969-1976 (1995)). Dense eight cells; consisting (compacted eight-cell CEC) mouse embryos 5 gels and blastocyst stage (BS) mouse embryos four gel ⁽³⁵ S) - The protein database methionine labeled mouse embryos, 1,674 spots, respectively And 1,653 spots fit in all gels (Shi et al., Molec. Reprom. Develop. 37: 34-47 (1994)). When calculated based on all matched spots, the 74% (CEC) or 79% (BS) percentage error (defined as SEM x 100 / average) of these spots is less than 50%, and 45% of spots ( CEC) or 47% (BS) had a percentage error of less than 30% (Shi et al. Molec. Reprom. Develop. 37: 34-47 (1994)). For comparison, conversion of SD to SEM (SEM = SD / √n) gives an average CV% of 20.3% in the 15% DB of the island IEF, 97.7% and 83.2% of the spots are 50% and Has a percentage error of less than 30%.

本発明者らの研究の量的再現性は、マウス胚における研究（Shiら、Molec. Reprod.Develop. 37:34-47 (1994)）に匹敵するか、またはずっとより良好であるが、本発明者らのデータベースにおける％IODの平均CV％はなお相対的に高い。以前に述べたように、島の異種細胞集団および島単離の異なる雄／雌比がゲル可変性に寄与し得る。本発明者らは、匹敵する全光学密度を有するゲルを用いるよう試みた（各亜群内の最大差異は3.5の係数(factor)であった（ゲルDB10対ゲルDB３、IEF15% DB、表３)）が、Ｘ線フィルムの非線形飽和が全データベーススポットについてのCV％の大きさに寄与する。ホスホイメージング（本研究が開始されたとき本発明者らの研究室では利用可能ではなかった技術）の適用は、この現象のCV％の大きさへの寄与を減少させた。最後に、コンピューター解析における電気ノイズおよびスポット境界規定の差異が、CV％の大きさに寄与し得る。いくつかの他のゲル解析プログラムとは反対に、BioImage（登録商標）プログラムは、境界規定のために局所的であって、全体的ではないバックグラウンドを使用し、後者の因子のCV％への寄与を減少させる。 The quantitative reproducibility of our study is comparable to or much better than that in mouse embryos (Shi et al., Molec. Reprod.Develop. 37: 34-47 (1994)) The average CV% of% IOD in our database is still relatively high. As previously mentioned, islet heterogeneous cell populations and different male / female ratios of islet isolation can contribute to gel variability. We attempted to use gels with comparable total optical density (the maximum difference within each subgroup was a factor of 3.5 (gel DB10 vs. gel DB3, IEF 15% DB, Table 3 )), The non-linear saturation of the X-ray film contributes to the CV% magnitude for all database spots. The application of phosphoimaging (a technology that was not available in our lab when the study was initiated) reduced the contribution of this phenomenon to the CV% magnitude. Finally, electrical noise and spot boundary definition differences in computer analysis can contribute to the magnitude of CV%. Contrary to some other gel analysis programs, the BioImage® program uses a background that is local and not global for boundary definition, and the latter factor to CV% Reduce contribution.

複製ゲルの研究。（³⁵Ｓ）-メチオニン標識REF 52細胞の10の複製ゲルの研究において、Garrelsは、全体で約2,000スポットのうち最も優勢なスポットの1109個を選択し、そして＜５％および＞100％の間の範囲ならびに10％と15％との間の様式値(modalvalue）では、平均CV％が26.5％であることを見出した（Garrels、J. Biol. Chem. 264：5269-5282 (1989)）。試料を連続して解析したか同じセットのゲルで解析したかは明確ではない。スポットの質（Gaussian形状への適合、隣接スポットの重複）に従ってスポットを群分けし、そして全てのゲルにおいて低密度を有するスポットを省くとき、最高の質の19.1％のスポットは、13.0％の平均CV％を有した（Garrels、J.Biol. Chem. 264：5269-5282 (1989)）。予期されるように、％IODの平均CV％は、15％IEFおよびNEPHGEアッセイ間解析を15％IEFDBに比較したとき減少した。この減少は、約９％である。アッセイ内解析ではゲル調製物の日毎の変動を除いたので、平均CV％はよりずっと減少すると予期された。15％IEF亜群において、CV％は、データベースに比較して約15％減少したが、15％NEPHGE亜群では減少は見られなかった。15％NEPHGEアッセイ内亜群（これはまた、全ての亜群のうち最も低い質的再現性を有する（表４〜６)）における高い平均CV％の理由は、不明である。データベースゲルもまた１セットのゲルにおいて解析したとき、生物学的変動に起因するCV％の部分は、データベースと所定のスポットに対するアッセイ内解析との間のCV％における差異によって与えられるべきである。従って、15％NEPHGEアッセイ内解析の結果が無視される場合、IOD％の平均CV％の約３分の１は、生物学的変動に起因する。 Duplicate gel study. In a study of 10 replicate gels of ( ³⁵ S) -methionine labeled REF 52 cells, Garrels selected 1109 of the most dominant spots out of about 2,000 spots overall, and between <5% and> 100% In the range of 10% and 15%, the average CV% was found to be 26.5% (Garrels, J. Biol. Chem. 264: 5269-5282 (1989)). It is not clear whether the samples were analyzed sequentially or with the same set of gels. When spotting is grouped according to spot quality (adapted to Gaussian shape, overlap of adjacent spots) and spots with low density in all gels are omitted, the highest quality 19.1% spot averages 13.0% CV% (Garrels, J. Biol. Chem. 264: 5269-5282 (1989)). As expected, the average CV% of% IOD was reduced when comparing 15% IEF and NEPHGE inter-assay analysis to 15% IEFDB. This reduction is about 9%. Since the intra-assay analysis excluded daily variations in gel preparations, the average CV% was expected to be much reduced. In the 15% IEF subgroup, CV% decreased by about 15% compared to the database, but no decrease was seen in the 15% NEPHGE subgroup. The reason for the high average CV% in the 15% NEPHGE intra-assay subgroup (which also has the lowest qualitative reproducibility of all subgroups (Tables 4-6)) is unknown. When the database gel is also analyzed in a set of gels, the portion of CV% due to biological variation should be given by the difference in CV% between the database and the in-assay analysis for a given spot. Thus, if the results of 15% NEPHGE in-assay analysis are ignored, approximately one third of the average CV% of IOD% is due to biological variation.

島タンパク質発現に対するIL-1βの影響。IL-1βは、105個のこれまで同定されていないタンパク質の発現を変化させた。島細胞におけるIL-1β作用機構は十分に解明されていないが、３つの異なるタンパク質群は重要な役割を果たしている：シグナル伝達に関与するタンパク質およびいわゆる初期応答および後期応答遺伝子によりコードされたタンパク質（Eizirikら、Diabetologia39:875-890 (1996)）。標的細胞におけるIL-1β誘導シグナル伝達は、４つの主要なシグナル伝達経路を包含すると思われる：核因子-κb、ストレス活性化タンパク質キナーゼ（SAPK/JNK）、タンパク質キナーゼＣ、およびチロシンキナーゼ（Mandrup-Poulsen,T.、Diabetologia 39:1005-1029 (1996)；Eizirikら、Diabetologia 39:875-890 (1996)）。３つの経路は、c-fos、c-jun、およびインターフェロン応答因子-1が島細胞におけるサイトカイン作用に関与している初期応答遺伝子の迅速でかつ一過的な誘導を導く。初期応答遺伝子は、島において有害な可能性のある作用（iNOS、シクロキシゲナーゼ-2、およびリポキシゲナーゼ）および保護的作用（HSP72、ヘムオキシゲナーゼ、Mnスーパーオキシドジスムターゼ）を伴う特定の遺伝子を活性化する（Mandrup-Poulsen,T.、Diabetologia 39:1005-1029 (1996)；Eizirikら、Diabetologia 39:875-890 (1996)）。従って、島細胞におけるIL-1β作用機構に関する情報はなお限定されており、そしてIL-1βによる発現で変化された105個のタンパク質の同定は、シグナル伝達ならびに保護作用および有害作用を伴うタンパク質に関する新たな知識を導き得る。 Effect of IL-1β on islet protein expression. IL-1β altered the expression of 105 previously unidentified proteins. Although the mechanism of IL-1β action in islet cells has not been fully elucidated, three distinct protein groups play an important role: proteins involved in signal transduction and proteins encoded by so-called early and late response genes ( Eizirik et al., Diabetologia 39: 875-890 (1996)). IL-1β-induced signaling in target cells appears to encompass four major signaling pathways: nuclear factor-κb, stress-activated protein kinase (SAPK / JNK), protein kinase C, and tyrosine kinase (Mandrup- Poulsen, T., Diabetologia 39: 1005-1029 (1996); Eizirik et al., Diabetologia 39: 875-890 (1996)). The three pathways lead to rapid and transient induction of early response genes where c-fos, c-jun, and interferon response factor-1 are involved in cytokine action in islet cells. Early response genes activate specific genes with actions (iNOS, cycloxygenase-2, and lipoxygenase) that may be harmful in the islands and protective actions (HSP72, heme oxygenase, Mn superoxide dismutase) (Mandrup-Poulsen, T., Diabetologia 39: 1005-1029 (1996); Eizirik et al., Diabetologia 39: 875-890 (1996)). Therefore, information on the mechanism of IL-1β action in islet cells is still limited, and the identification of 105 proteins altered by expression by IL-1β has led to new information on proteins with signaling and protective and deleterious effects Can lead to knowledge.

結論
本発明者らは、他の細胞および組織において以前に公開されたデータベースを改善する、高い質的再現性および量的再現性を有する新生仔ラットランゲルハンス島のタンパク質データベースを確立した。さらに、本発明者らは、新生仔ラット島タンパク質データベースのアッセイ内変動およびアッセイ間変動を決定した。このデータベースはさらに、IL-1βによる発現において変化したタンパク質（IL-1β作用機構において重要な役割を有し得る）を同定するために適用される。IL-1βは、インスリン産生ラットＢ細胞に対して細胞傷害性であるので、現在、質量分析法および微量配列決定により行われているこれらのタンパク質の同定は、インスリン依存性糖尿病の病原に関して重要な知識を生じると期待される。
CONCLUSION We have established a protein database of neonatal rat islets of Langerhans with high qualitative and quantitative reproducibility that improves the previously published database in other cells and tissues. In addition, we determined intra-assay and inter-assay variability of the neonatal rat islet protein database. This database is further applied to identify proteins that are altered in expression by IL-1β, which may have an important role in the IL-1β mechanism of action. Since IL-1β is cytotoxic to insulin-producing rat B cells, identification of these proteins currently performed by mass spectrometry and microsequencing is important for the pathogenesis of insulin-dependent diabetes Expected to generate knowledge.

本明細書中において引用されるすべての参考文献（ジャーナル論文もしくは要約、公開もしくは係属中の米国もしくは外国の特許出願、発行された米国もしくは外国の特許、または任意の他の参考文献を含む）は、その全体（その引用された参考文献のすべてのデータ、表、図、および文章を含むが本明細書中において参考として援用される。さらに、本明細書中で引用された参考文献において引用された参考文献の全内容もまた、その全体が参考として援用される。 All references cited herein, including journal articles or abstracts, published or pending US or foreign patent applications, issued US or foreign patents, or any other reference , In its entirety (including all data, tables, figures, and text of that cited reference, which is incorporated herein by reference. In addition, it is cited in the references cited herein. The entire contents of these references are also incorporated by reference in their entirety.

公知の方法工程、従来の方法工程、公知の方法、または従来の方法の参照は、本発明の任意の局面、説明、または実施態様が、関連する技術において開示されるか、教示されるか、または示唆されるという承認では決してない。 Known method steps, conventional method steps, known methods, or references to conventional methods, are any aspects, descriptions, or embodiments of the invention disclosed or taught in the related art, It is never an approval to be suggested or suggested.

特定の実施態様の先述の説明は、本発明の一般的な性質を十分に示すので、他の人々が、当該分野の技術内の知識（本明細書中において引用された参考文献の内容を含む）を適用することによって、過度の実験なしに、本発明の一般的な概念から逸脱することなしに、種々の適用のためにそのような特定の実施態様を容易に改変および／または応用し得る。従って、そのような応用および改変は、本明細書中において示される教示および案内に基づいて、開示された実施態様の等価物の意味および範囲内であることが意図される。本明細書の術語または専門用語が、当業者の知識と組み合わせて、本明細書中に示される教示および案内を考慮して、当業者によって解釈されるように、本明細書中における専門用語または術語は、説明の目的であり、限定の目的ではないことが理解されるべきである。 The foregoing description of specific embodiments is sufficient to demonstrate the general nature of the present invention, so that others have knowledge in the art (including the contents of the references cited herein). ) Can be easily modified and / or applied for various applications without undue experimentation and without departing from the general concept of the invention. . Accordingly, such applications and modifications are intended to be within the meaning and scope of the equivalents of the disclosed embodiments based on the teachings and guidance presented herein. The terminology or terminology used herein should be interpreted in accordance with the terminology or terminology herein as interpreted by one of ordinary skill in the art in view of the teachings and guidance presented herein in combination with the knowledge of one of ordinary skill in the art. It should be understood that the terminology is for purposes of explanation and not for purposes of limitation.

（配列表） (Sequence Listing)

図1Aおよび1Bは、RPMI 1640＋0．5％の正常なヒト血清中で24時間インキュベートし、続いて［³⁵S］-メチオニンで４時間標識した新産のラットの島細胞中で発現されたタンパク質の２次元ゲルの蛍光写真を示す。図1Aは、等電収束ゲルである（IEF；pH3．5〜７）。図1Bは、非平衡pH勾配電気泳動ゲルである（NEPHGE；pH 6.5〜10.5）。矢印は、105個の糖尿病媒介タンパク質を示す。FIGS. 1A and 1B show the expression of proteins expressed in RPMI 1640 + 0.5% normal human serum for 24 hours followed by 4 hours of labeling with [ ³⁵ S] -methionine in newborn rat islets. The fluorescence photograph of a two-dimensional gel is shown. FIG. 1A is an isoelectric focusing gel (IEF; pH 3.5-7). FIG. 1B is a non-equilibrium pH gradient electrophoresis gel (NEPHGE; pH 6.5-10.5). Arrows indicate 105 diabetes-mediating proteins. 図1Aおよび1Bは、RPMI 1640＋0．5％の正常なヒト血清中で24時間インキュベートし、続いて［³⁵S］-メチオニンで４時間標識した新産のラットの島細胞中で発現されたタンパク質の２次元ゲルの蛍光写真を示す。図1Aは、等電収束ゲルである（IEF；pH3．5〜７）。図1Bは、非平衡pH勾配電気泳動ゲルである（NEPHGE；pH 6.5〜10.5）。矢印は、105個の糖尿病媒介タンパク質を示す。FIGS. 1A and 1B show the expression of proteins expressed in RPMI 1640 + 0.5% normal human serum for 24 hours followed by 4 hours of labeling with [ ³⁵ S] -methionine in newborn rat islets. The fluorescence photograph of a two-dimensional gel is shown. FIG. 1A is an isoelectric focusing gel (IEF; pH 3.5-7). FIG. 1B is a non-equilibrium pH gradient electrophoresis gel (NEPHGE; pH 6.5-10.5). Arrows indicate 105 diabetes-mediating proteins. 図２は、マウスのモルタリンのアミノ酸配列である。FIG. 2 is the amino acid sequence of mouse mortalin. 図３は、ヒトのモルタリンのアミノ酸配列である。FIG. 3 is the amino acid sequence of human mortalin. 図４は、ラットのガレクチンのアミノ酸配列である。FIG. 4 is the amino acid sequence of rat galectin. 図５は、ヒトのガレクチンのアミノ酸配列である。FIG. 5 is the amino acid sequence of human galectin. 図６は、図に示すパラメーターを使用して決定した、糖尿病媒介タンパク質GR75（モルタリン）、IEFSpot No．340の質量スペクトルである。FIG. 6 shows the diabetes-mediating protein GR75 (Mortarin), IEFSpot No. 1, determined using the parameters shown in the figure. 340 mass spectrum. 図７は、示したように決定した、ラミン IEF Spot No．655として仮に同定された糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 7 shows the Ramin IEF Spot No. determined as indicated. 2 is a mass spectrum of diabetes-mediating protein tentatively identified as 655. 図８〜10は、示したように決定した、ピルビン酸キナーゼ NEPHGE Spot No．1として仮に同定された糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。8-10 show pyruvate kinase NEPHGE Spot No. determined as indicated. 2 is a mass spectrum of diabetes-mediating protein tentatively identified as 1. 図８〜10は、示したように決定した、ピルビン酸キナーゼ NEPHGE Spot No．1として仮に同定された糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。8-10 show pyruvate kinase NEPHGE Spot No. determined as indicated. 2 is a mass spectrum of diabetes-mediating protein tentatively identified as 1. 図８〜10は、示したように決定した、ピルビン酸キナーゼ NEPHGE Spot No．1として仮に同定された糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。8-10 show pyruvate kinase NEPHGE Spot No. determined as indicated. 2 is a mass spectrum of diabetes-mediating protein tentatively identified as 1. 図11は、示したように決定した、6-ホスホブルクトース-2-キナーゼ NEPHGESpot No．169として仮に同定された糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 11 shows 6-phosphoburtose-2-kinase NEPHGESpot No. determined as indicated. 2 is a mass spectrum of diabetes-mediating protein tentatively identified as 169. 図12は、示したように決定した、トリオースリン酸イソメラーゼ NEPHGE SpotNo．334として仮に同定された糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 12 shows triose phosphate isomerase NEPHGE Spot No. determined as indicated. 3 is a mass spectrum of diabetes-mediating protein tentatively identified as 334. 図13は、示したように決定した、フルクトース二リン酸アルドラーゼ NEPHGESpot No．668として仮に同定された糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 13 shows fructose diphosphate aldolase NEPHGESpot No. determined as indicated. 2 is a mass spectrum of a diabetes-mediating protein tentatively identified as 668. 図14〜15は、示したように決定した、分子量42,243ダルトンおよびpI 5.82を有する、「IEFSpot No．665」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIGS. 14-15 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 665” having a molecular weight of 42,243 daltons and a pI of 5.82, determined as indicated. 図14〜15は、示したように決定した、分子量42,243ダルトンおよびpI 5.82を有する、「IEFSpot No．665」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIGS. 14-15 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 665” having a molecular weight of 42,243 daltons and a pI of 5.82, determined as indicated. 図16は、示したように決定した、分子量25,851ダルトンおよびpI 5.09を有する、「IEFSpot No．939」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。16 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 939” having a molecular weight of 25,851 daltons and a pI of 5.09, determined as indicated. 図17〜18は、示したように決定した、分子量22,704ダルトンおよびpI 5.15を有する、「IEFSpot No．941」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。Figures 17-18 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called "IEFSpot No. 941" having a molecular weight of 22,704 daltons and a pI of 5.15, determined as indicated. 図17〜18は、示したように決定した、分子量22,704ダルトンおよびpI 5.15を有する、「IEFSpot No．941」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。Figures 17-18 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called "IEFSpot No. 941" having a molecular weight of 22,704 daltons and a pI of 5.15, determined as indicated. 図19は、示したように決定した、分子量25,753ダルトンおよびpI 4.53を有する、「IEFSpot No．950」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。19 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 950” having a molecular weight of 25,753 daltons and a pI of 4.53, determined as indicated. 図20〜23は、示したように決定した、分子量143,064ダルトンおよびpI5.41を有する、「IEF Spot No．1196」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIGS. 20-23 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called “IEF Spot No. 1196” having a molecular weight of 143,064 daltons and a pI of 5.41 determined as indicated. 図20〜23は、示したように決定した、分子量143,064ダルトンおよびpI5.41を有する、「IEF Spot No．1196」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIGS. 20-23 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called “IEF Spot No. 1196” having a molecular weight of 143,064 daltons and a pI of 5.41 determined as indicated. 図20〜23は、示したように決定した、分子量143,064ダルトンおよびpI5.41を有する、「IEF Spot No．1196」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIGS. 20-23 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called “IEF Spot No. 1196” having a molecular weight of 143,064 daltons and a pI of 5.41 determined as indicated. 図20〜23は、示したように決定した、分子量143,064ダルトンおよびpI5.41を有する、「IEF Spot No．1196」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIGS. 20-23 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called “IEF Spot No. 1196” having a molecular weight of 143,064 daltons and a pI of 5.41 determined as indicated. 図24は、示したように決定した、分子量65,522ダルトンおよびpI 7.28を有する、「IEFSpot No．7」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 24 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 7” having a molecular weight of 65,522 daltons and a pI of 7.28, determined as indicated. 図25は、示したように決定した、分子量115,709ダルトンおよびpI 8.33を有する、「IEFSpot No．9」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 25 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 9” having a molecular weight of 115,709 daltons and a pI of 8.33, determined as indicated. 図26は、示したように決定した、分子量63,560ダルトンおよびpI 7.26を有する、「IEFSpot No．102」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 26 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 102” having a molecular weight of 63,560 daltons and a pI of 7.26, determined as indicated. 図27は、示したように決定した、分子量57,040ダルトンおよびpI 8.17を有する、「IEFSpot No．123」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 27 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 123” having a molecular weight of 57,040 daltons and a pI of 8.17, determined as indicated. 図28は、示したように決定した、分子量57,609ダルトンおよびpI 7.72を有する、「IEFSpot No．129」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 28 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 129” having a molecular weight of 57,609 daltons and a pI of 7.72, determined as indicated. 図29は、示したように決定した、分子量55,734ダルトンおよびpI 8.07を有する、「IEFSpot No．130」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 29 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 130” having a molecular weight of 55,734 daltons and a pI of 8.07, determined as indicated. 図30〜31は、示したように決定した、分子量53,830ダルトンおよびpI 7.92を有する、「IEFSpot No．174」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。Figures 30-31 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called "IEFSpot No. 174" having a molecular weight of 53,830 daltons and a pI of 7.92, determined as indicated. 図30〜31は、示したように決定した、分子量53,830ダルトンおよびpI 7.92を有する、「IEFSpot No．174」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。Figures 30-31 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called "IEFSpot No. 174" having a molecular weight of 53,830 daltons and a pI of 7.92, determined as indicated. 図32〜33は、示したように決定した、分子量49,422ダルトンおよびpI 7.40を有する、「IEFSpot No．181」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。Figures 32-33 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called "IEFSpot No. 181" having a molecular weight of 49,422 daltons and a pI of 7.40, determined as indicated. 図32〜33は、示したように決定した、分子量49,422ダルトンおよびpI 7.40を有する、「IEFSpot No．181」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。Figures 32-33 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called "IEFSpot No. 181" having a molecular weight of 49,422 daltons and a pI of 7.40, determined as indicated. 図34〜35は、示したように決定した、分子量54,098ダルトンおよびpI 7.61を有する、「IEFSpot No．182」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。34-35 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 182” having a molecular weight of 54,098 daltons and a pI of 7.61, determined as indicated. 図34〜35は、示したように決定した、分子量54,098ダルトンおよびpI 7.61を有する、「IEFSpot No．182」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。34-35 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 182” having a molecular weight of 54,098 daltons and a pI of 7.61, determined as indicated. 図36は、示したように決定した、分子量47,925ダルトンおよびpI 7.28を有する、「IEFSpot No．211」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。36 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 211” having a molecular weight of 47,925 daltons and a pI of 7.28, determined as indicated. 図37は、示したように決定した、分子量44,362ダルトンおよびpI 8.34を有する、「IEFSpot No．231」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 37 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 231” having a molecular weight of 44,362 daltons and a pI of 8.34, determined as indicated. 図38は、示したように決定した、分子量43,162ダルトンおよびpI 7.90を有する、「IEFSpot No．236」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。38 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 236” having a molecular weight of 43,162 daltons and a pI of 7.90, determined as indicated. 図39〜40は、示したように決定した、分子量39,160ダルトンおよびpI 9.05を有する、「IEFSpot No．253」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。Figures 39-40 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called "IEFSpot No. 253" having a molecular weight of 39,160 daltons and a pI of 9.05, determined as indicated. 図39〜40は、示したように決定した、分子量39,160ダルトンおよびpI 9.05を有する、「IEFSpot No．253」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。Figures 39-40 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called "IEFSpot No. 253" having a molecular weight of 39,160 daltons and a pI of 9.05, determined as indicated. 図41は、示したように決定した、分子量34,600ダルトンおよびpI 4.76を有する、「IEFSpot No．831」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 41 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 831” having a molecular weight of 34,600 daltons and a pI of 4.76, determined as indicated. 図42〜43は、示したように決定した、分子量26,800ダルトンおよびpI 4.49を有する、「IEFSpot No．949」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。42-43 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 949” having a molecular weight of 26,800 daltons and a pI of 4.49, determined as indicated. 図42〜43は、示したように決定した、分子量26,800ダルトンおよびpI 4.49を有する、「IEFSpot No．949」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。42-43 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 949” having a molecular weight of 26,800 daltons and a pI of 4.49, determined as indicated. 図44〜46は、示したように決定した、分子量57,600ダルトンおよびpI 7.72を有する、「IEFSpot No．129」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。44-46 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 129” having a molecular weight of 57,600 daltons and a pI of 7.72, determined as indicated. 図44〜46は、示したように決定した、分子量57,600ダルトンおよびpI 7.72を有する、「IEFSpot No．129」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。44-46 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 129” having a molecular weight of 57,600 daltons and a pI of 7.72, determined as indicated. 図44〜46は、示したように決定した、分子量57,600ダルトンおよびpI 7.72を有する、「IEFSpot No．129」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。44-46 are mass spectra of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 129” having a molecular weight of 57,600 daltons and a pI of 7.72, determined as indicated. 図47は、示したように決定した、分子量35,800ダルトンおよびpI 7.57を有する、「IEFSpot No．310」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 47 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 310” having a molecular weight of 35,800 daltons and a pI of 7.57, determined as indicated. 図48は、示したように決定した、分子量34,500ダルトンおよびpI 8.62を有する、「IEFSpot No．326」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。FIG. 48 is a mass spectrum of a novel diabetes-mediating protein called “IEFSpot No. 326” having a molecular weight of 34,500 daltons and a pI of 8.62, determined as indicated.

Claims

明細書に記載の発明。 Invention described in the specification.