JP2008178390A - 皮膚の状態を評価する方法及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
被験対象の皮膚より採取した角質を用いて遺伝子発現解析を行い、その結果によって皮膚の状態を評価する。好ましい一態様では角質から抽出したmRNAを試料として用いる。
【選択図】なし
Description
本発明は以上の背景に鑑み、低侵襲的であり、且つ客観性の高い評価結果が得られる、皮膚の状態を評価する方法を提供することを主たる課題とする。
[1]被験対象の皮膚より採取した角質を用いて遺伝子発現解析を行い、その結果によって皮膚の状態を評価することを特徴とする、皮膚の状態を評価する方法。
[2]前記遺伝子発現解析が、前記角質から抽出したmRNAを試料とした遺伝子発現解析である、[1]に記載の方法。
[3](1)被験対象の特定部位の皮膚より採取した角質を用意するステップ、
(2)前記角質から抽出したmRNAを試料として遺伝子発現解析を行い、皮膚の状態に関連する遺伝子の発現量を算出するステップ、及び
(3)ステップ(2)で算出した発現量を用いて皮膚の状態を評価するステップ、
を含む、[2]に記載の方法。
[4]ステップ(3)において、ステップ(2)で算出した発現量を基準発現量に照合して皮膚の状態を評価する、[3]に記載の方法。
[5]前記特定部位が顔面部である、[3]又は[4]に記載の方法。
[6]前記遺伝子発現解析がマイクロアレイ法又はPCR法によって行われる、[3]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]前記遺伝子が、UNC5CL、KIAA0251、ECOP、PTGES2、ZNF135、SYT3、C12orf25、FOXA3、TMEM14C、PHF13、CLNS1A、RHOT2、FLG、NUP155、SLC7A6、CYHR1、ZNF304、FGFR4、RNF6、EIF3S7、RPS15、MRPS2、SERGEF、HVCN1、FGFR1、GRK7、TP53I3、RPUSD4、F7、MFHAS1、BOLL、RNF20、及びCYP2S1からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子である、[3]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]前記遺伝子が、TMEM47、SCAND2、SCML2、RFX4、GM2A、ZNF10、ABCD3、C13orf7、MICB、MPP1LC3C、PARP14、TMEM163、KIAA1467、SLC25A16、YARS2、FAM60A、CGNL1、CLN3、HSFY1、PLSCR3、LRRC37A3、C18orf4、ARSD、PITX2、TUBGCP5、RPL36、SMYD4、C3orf39、KBTBD6、MGC4655、PLK1、APOLD1、DDX47、DENND1C、ABTB1、GORASP1、TRERF1、PKMYT1、AKAP9、FZD7、DENND1B、HEL308、PIGO、DCAKD、SEPW1、RTCD1、FBXO21、MLZE、FUT4、MR1、NBPF11、RPL36AL、DFFB、MFAP3L、RDH16、NSF、HLA−DMA、ARHGEF6、RNF38、U2AF1L4、CTBP2、CDK6、GNG10、WDR73、MTMR11、C16orf51、IL6、C21orf58、REEP4、TMEM107、FCHO2、NCAPG2、BAG3、MAP6、AFF3、EBP、ATM、AQP4、CRNKL1、ZFP91、SARDH、TMEM16H、UNKL、TXNDC1、AKT2、BAG1、GATAD2A、及びUSP54からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子である、[3]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[9]前記遺伝子が、ADAMTLS4、ADFP、ATP5A1、ATP5C1、ATP5D、ATP5E、ATP5G1、ATP5G2、ATP5H、ATP5I、ATP5J、CKS1B、COX7C、CRCT1、CRTC2、CST6、DAP3、DCTD、DUSP1、DUT、ECM1、ENTPD1、HIST2H2AA3、NHNRNPA1、JMJD1A、LCE1C、LCE2A、LCE3A、LCE3E、LCE5A、LMNA、NDUFA1、NDUFA13、NDUFB1、NDUFB10、NDUFB7、NDUFB9、NDUFC1、NDUFC2、NDUFS2、NDUFS3、NDUFS4、NDUFS5、NDUFS6、NDUFV2、NIT1、NOL7、NOTCH2NL、NR4A2、NT5E、PDGFB、POLG、POLR2B、POLR2C、POLR2F、PSMB7、RPL37A、RPS23、S100A13、S100A2、SHC1、TPM3、TUFT1、UPP1、及びVEGFからなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子である、請求項3〜6のいずれかに記載の方法。
[10]前記角質が、粘着性のテープを用いて被験対象の皮膚より採取した角質である、[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11]前記皮膚の状態が、老化、しわ、たるみ、弾力性、炎症、色素沈着、乾燥状態、バリア機能、皮脂量、皮膚の新陳代謝、きめの粗さ、透明感、くすみ、血行、日焼け、毛穴の目立ち、知覚過敏、及びニキビからなる群より選択される1種又は2種以上の指標に関する状態である、[1]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[12]前記皮膚の状態が、老化の程度である、[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[13]被験対象に対してトリートメント手段を施す前及び後にそれぞれ、[1]〜[12]のいずれかに記載の方法を実施し、得られた評価結果を比較することによって該トリートメント手段の有効性を評価することを特徴とする、皮膚に対するトリートメント手段を評価する方法。
被験対象は典型的にはヒトである。但し、イヌやネコなどのペット動物のようにスキンケアや皮膚のトリートメントの対象となる動物を被験対象としてもよい。つまり、スキンケア等の対象となる限り、角質層をもつヒト又はヒト以外の動物に対して本発明の皮膚状態評価法を適用することが可能である。ヒト以外の動物の具体例として、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等を挙げることができる。
様々な部位の中でも顔面はスキンケアの対象として最も重要であることから、本発明の好ましい一態様では顔面より角質の採取を行う。
(1)被験対象の特定部位の皮膚より採取した角質を用意するステップ、
(2)前記角質から抽出したmRNAを試料として遺伝子発現解析を行い、皮膚の状態に関連する遺伝子の発現量を算出するステップ、及び
(3)ステップ(2)で算出した発現量を用いて皮膚の状態を評価するステップ。
(a)顆粒層や有棘細胞層などを傷つけないように最外層の角質層の一部を剥離する。例えば、粘着性のテープを皮膚へ付着させた後に剥がし(必要に応じて数回繰り返す)、角質を採取する。
(b)採取した角質を、SDSやβ−メルカプトエタノール、グアニジンイソチオシアネートなどを含む溶解性緩衝液に浸した後、タンパク質分解酵素を加え反応させる。
(c)反応終了後、例えば超音波破砕機等の物理的な力によって角質を破砕する。
(d)上清にエタノール溶液を加え、周知の核酸抽出法に準じた方法や市販されたキットを用いた方法によりRNAを抽出する。例えばグアニジンイソチオシアネート、フェノールおよびクロロホルムを用いたRNA抽出法やニッポンジーン社のISOGEN、インビトロジェン社のTRISOL Reagent、あるいはQIAGEN社のRNeasy KitやAmbion社のRNAqueous Kitなどを用いる方法などでRNAを抽出する。
(e)必要に応じて、DNA分解酵素等の核酸分解酵素を用いることで混在するDNAを除去する。
(f)エタノール沈殿等の核酸濃縮法を用いてRNAを濃縮する。
本発明では、好ましくは、第1遺伝子群より選択される1種又は2種以上の遺伝子のmRNA量、第2遺伝子群より選択される1種又は2種以上の遺伝子のmRNA量、又は第3遺伝子群より選択される1種又は2種以上の遺伝子のmRNA量を測定する。更に好ましくは、第3遺伝子群より選択されるケラチノサイト分化に関わる遺伝子群(ADAMTSL4、CKS1B、CRCT1、CRTC2、DAP3、ECM1、HIST2H2AA3、LCE1C、LCE2A、LCE3A、LCE3E、LCE5A、LMNA、NIT1、NOTCH2NL、S100A13、S100A2、SHC1、TPM3、TUFT1及びPSMB4)、低酸素状態において発現が上昇する遺伝子群(ADFP、DUSP1、HNRPA1、JMJD1A、PDGFB及びVEGF)、NADHデヒドロゲナーゼ遺伝子群(NDUFA1、NDUFA13、NDUFB1、NDUFB10、NDUFB7、NDUFB9、NDUFC1、NDUFC2、NDUFS2、NDUFS3、NDUFS4、NDUFS5、NDUFS6及びNDUFV2)、ピリミジン代謝に関与する遺伝子群(DCTD、DUT、ENTPD1、NT5E、POLG、POLR2B、POLR2C、POLR2F及びUPP1)、PMLシグナル伝達系遺伝子群(ATP5I、COX7C、CST6、NOL7、NR4A2、RPL37A、RPS23及びNDUFA1)、F−TYPE ATPase遺伝子群(ATP5A1、ATP5C1、ATP5D、ATP5E、ATP5G1、ATP5G2、ATP5H及びATP5J)より選択される1種又は2種以上の遺伝子群のmRNA量を測定する。
一般に、解析する遺伝子の数が増加するほど信頼性の高い評価を得ることができるといえる。その一方で、解析する遺伝子の数の増加はデータ処理を複雑にし、簡便性及び迅速性を損ないかねない。また、解析に要する費用の増大をも引き起こす。そこで、解析する遺伝子の数は好ましくは1〜30個、更に好ましくは3〜20個、更に更に好ましくは5〜10個である。
尚、上記の各遺伝子のRefSeq(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/)での番号及び説明と、GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)でのアクセッション番号(Accession number)を図1〜5に示す。また、ケラチノサイト分化に関わる遺伝子群はMarenholz I,et al,Genomics,37,295,1996にEpidermal differentiation complexとして定義されており、低酸素状態において発現が上昇する遺伝子群はLeonard MO,et al,J Biol Chem,2003,278(41),40296に、NADHデヒドロゲナーゼ遺伝子群はHatefi Y,et al,The Enzymes of Biological Membranes,2nd ed,vol.4,Plenum Press,New York,1985,p.1−70に、ピリミジン代謝に関与する遺伝子群はJeremy Berg,et al,In Biochemistry 5th ed,W. H. Freeman and Company,USA,2002に、PMLシグナル伝達系遺伝子群はAppella E,et al,Eur. J. Biochem,2001,268,2764、F−TYPE ATPase遺伝子群はSachs G,et al,Biochim. Biophys. Acta.,162,1968,210に定義されている。
(a)角質の微量RNAからマイクロアレイ用ターゲットあるいはサンプルプローブを調製するために、PCR法あるいはT7 リニア増幅法に基づいた方法でRNAを増幅する。例えば、T7 リニア増幅法を利用したExpress Art Aminoallyl mRNA amplification kit (Artus社、Germany)を用いて行うことができる。参照RNA(リファレンスRNA)や比較対照とする角質の微量RNAの増幅反応も並行して行う。参照RNAは、市販されているマイクロアレイリファレンス用RNAを用いることができる。
(b)目的の皮膚部位から得られた増幅したRNAと、参照RNAまたは比較対照RNAを2種類の蛍光色素でラベル化した後にアルカリ条件下で断片化する。蛍光色素は、2種類のターゲットを識別できる蛍光波長を発するものならばどのような組み合わせでも使用可能であるが、Cy3とCy5、Alexa555とAlexa647などの組み合わせが好ましい。
(c)断片化した蛍光標識RNAを、マイクロアレイにハイブリダイゼーションする。
(d)マイクロアレイを洗浄したのち、スキャニングを行い、各スポットの発現量を測定する。
(a)抽出したRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを作製する。
(b)cDNAを鋳型に、ターゲットとなる遺伝子に対応するプライマーを用いてPCR(polymerase chain reaction)反応を行い、目的の遺伝子に対応するDNA断片を得る。
(c)内部標準となるような遺伝子(GAPDHやβ−アクチンなど)の反応も並行して行う。
(d)得られたDNA断片の電気泳動を行った後、エチジウムブロマイドなどで染色し、バンドの強度を測定し、その遺伝子の発現量とする。
(e)必要に応じて、Syber greenなどの蛍光色素やTaqman probeなどの蛍光プローブを用いて定量PCR反応を行い、発現量を定量する。
(f)内部標準となる遺伝子の発現量に対する目的の遺伝子の発現量の比率を算出する。
(例1:遺伝子発現量の増加が老化の進行と相関する遺伝子を利用した場合の例)
老化度1(低度):発現量<a、老化度2(中程度):a≦発現量<b、老化度3(高度):b≦発現量
(例2:遺伝子発現量の減少が老化の進行と相関する遺伝子を利用した場合の例)
老化度1(20代相当):a<発現量、老化度2(30代相当)b<発現量≦a、老化度3(40代相当):c<発現量≦b、老化度4(50代相当):d<発現量≦c、老化度5(60代相当):発現量≦d
(i)被験対象の第1部位から採取した角質と、該被験対象の第2部位から採取した角質とを用意するステップ
(ii)前記各角質について、そこから抽出したmRNAを試料とした遺伝子発現解析を行い、皮膚の状態に関連する遺伝子の発現量を算出するステップ、及び
(iii)ステップ(ii)で算出した二つの発現量を比較し、第1部位の皮膚の状態を評価するステップ。
(例3:発現量の比率の増加が老化の進行と相関する遺伝子を利用した場合の例)
老化度1(低度):比率<a、老化度2(中程度):a≦比率<b、老化度3(高度):b≦比率
(例4:発現量の比率の減少が老化の進行と相関する遺伝子を利用した場合の例)
老化度1(20代相当):a<比率、老化度2(30代相当)b<比率≦a、老化度3(40代相当):c<比率≦b、老化度4(50代相当):d<比率≦c、老化度5(60代相当):比率≦d
本発明のトリートメント手段評価法では、本発明の皮膚状態評価法を利用する。具体的には、被験対象に対してトリートメント手段を施す前と後にそれぞれ、本発明の皮膚状態評価法を実施し、得られた評価結果を比較することによって、当該トリートメント手段の有効性を評価する。本発明のトリートメント手段評価法は、皮膚の状態に関連する遺伝子の発現量という科学的根拠に基づいた評価を行うことから、その客観性及び信頼性が高い。
「トリートメント手段」とは、皮膚の状態の改善又は回復を目的として皮膚に施される手段をいい、その代表例は化粧品の使用である。用語「トリートメント手段」が表す概念の中にスキンケア方法、トリートメント方法が含まれる。
被験者の頬部皮膚に半径1cmの円状のテープ(3M、Blenderm)を一枚貼付し、十分に接着していることを確認した後、テープを剥がし取り、角質を含むテープを得た。得られた角質に含まれるRNAをRNA抽出キット(Ambion社製、RNAqueous−4PCR Kit)を用いて抽出した。すなわち、角質の付着したテープをテープごと350μLのLysis/Binding Solutionに入れ、proteinase K(Invitrogen社製)を添加し、56℃で1時間インキュベートした。その後、超音波破砕機を用いて、分散させた後、350μLの64%エタノールを加えて攪拌し、テープを取り除き、角質抽出液を得た。付属のFilter CartrigeにRNAを吸着させた後に、100μLの溶出液でRNAを溶出した。得られた溶出液にDNaseIを加え、残存しているDNAを完全に除去した後、エタノールを用いてRNAを沈殿させてRNAを濃縮した。得られたRNAのペレットを必要量の水に溶解して、角質に含まれる残存RNAを得た。
(1)材料及び方法
年齢20代被験者3名および50代被験者3名の頬部および上腕内側部皮膚の角質より上記1.の方法で残存RNAを得た。当該各RNAをExpress Art Aminoallyl mRNA amplification kit (Artus社、 Germany)により増幅し、Cy3とCy5の蛍光色素でラベル化した後にアルカリ条件下で断片化した。次に、断片化したターゲットをヒトオリゴヌクレオチドマイクロアレイHuman 35K (フィルジェン社、名古屋)に42℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、洗浄し、マイクロアレイスキャナースキャンアレイGx(パーキンエルマー)で画像データを読み取った。画像データから、各スポットのシグナル強度をマイクロアレイ解析ソフトウエアであるスキャンアレイエクスプレスで数値化した。顔面部と上腕内側部のテープストリップサンプル6人分のマイクロアレイデータを解析し、上腕内側部に対する顔面部の遺伝子発現比率(log(顔面部の発現値)/(上腕内側部の発現値))を算出した。そして、t検定で20歳代と50歳代で発現差のある遺伝子を検定した。t検定を通過した遺伝子からデータベースでアノテーション情報が得られる遺伝子をさらに選択した。選択した遺伝子を発現様式に応じてk−meanクラスタリング法で分類した。
クラスタリングの結果、上腕内側部に対する顔面部の遺伝子発現比率が20歳代で低く、50歳代で高い遺伝子(即ち、上腕内側部に対する顔面部の遺伝子発現比率と加齢との間に正の相関が認められた遺伝子)を33個、上腕内側部に対する顔面部の遺伝子発現比率が20歳代で高く、50歳代で低い遺伝子(即ち、上腕内側部に対する顔面部の遺伝子発現比率と加齢との間に負の相関が認められた遺伝子)を88個、同定することができた(図6〜8)。このように、皮膚の老化の程度(老化度、老化の進行)を評価するために有用な遺伝子を見出すことに成功した。これらの遺伝子の発現量に注目すれば皮膚の老化の程度を評価できるといえる。また、これらの遺伝子の発現量の増減に注目すれば、老化の進行を評価できるといえる。
また、皮膚は生体の最外層にある臓器であり、外部環境の影響や日常の生活習慣の違いにより、皮膚の状態には個人差や時期的な変化が存在する。したがって、皮膚の状態の特徴となる、しわ、たるみ、弾力性、炎症、色素沈着、乾燥状態、バリア機能、皮脂量、皮膚の新陳代謝、きめの粗さ、透明感、くすみ、血行、日焼け、毛穴の目立ち、知覚過敏、及びニキビなどの指標となる遺伝子発現量を測定することにより、被験者の肌の特徴を評価することができる。
20歳代被験者3名と50歳代被験者3名の頬部および上腕内側部の皮膚角質より上記1.の方法で残存RNAを得た。各RNAをRT−PCRキット(Invitrogen社製、 SuperScript III Platinum SYBR Green Two−step qRT−PCR kit)を用いた定量PCR反応に供し、FLG、FGFR1およびZNF10の発現量を定量した。すべての遺伝子の発現量はβ−アクチンの発現量で規格化(ノーマライズ)した。尚、各遺伝子の発現の測定に使用したプライマーは次の通りである。
AGCCTGGCCAACTTAGTGAAAC(配列番号1)
GTGCCACCATGCCTGGATA(配列番号2)
FGFR1用のプライマーセット
GGAGTCCCGGAAGTGTATCCA(配列番号3)
CCAGCCCAAAGTCAGCAATC(配列番号4)
ZNF10用のプライマーセット
ACACCATGCCCACATACAACA(配列番号5)
GAGCCCCAGTTAAGTGACTATTCTACTC(配列番号6)
β−アクチン用のプライマーセット
CACTCTTCCAGCCTTCCTTCC(配列番号7)
GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG(配列番号8)
以上のようにPCR解析の結果はマイクロアレイ解析の結果と同様の傾向を示した。これによって、マイクロアレイ解析によって見出された遺伝子群の有用性が裏付けられると同時に、マイクロアレイ解析での知見は解析法の種類に依存したものではないことが証明された。
20歳代被験者7名と50歳代被験者4名の頬部の皮膚角質より上記1.の方法で残存RNAを得た。また、リファレンスとしてHuman skin RNA(Cat.No.R1234218−P,コスモバイオ)を用いた。角質の採取の際に、被験者の頬部のキメをレプリカによる6段階評価により、明度をL値としてSpectrophotometer(コニカミノルタ、CM−2600d)により、弾力性を皮膚粘弾性計(Courage+Khazaka社、CW−E&S−001)により測定した。キメの評価点は、少ないほどキメが粗く、多いほどキメが細かいことを示す。また、明度は、少ないほど色素沈着の程度が高く、多いほど色素沈着の程度が低いことを示す。弾力性は、少ないほど皮膚の弾力がなく、色素沈着の程度が皮膚の弾力があることを示す。
当該各RNAをExpress Art mRNA amplification kit (Artus社、 Germany)により増幅し、RT−PCRキット(Invitrogen社製、 SuperScript III Platinum SYBR Green Two−step qRT−PCR kit)を用いた定量PCR反応に供し、ADAMTLS4、ADFP、ATP5A1、ATP5C1、ATP5D、ATP5E、ATP5G1、ATP5G2、ATP5H、ATP5I、ATP5J、CKS1B、COX7C、CRCT1、CRTC2、CST6、DAP3、DCTD、DUSP1、DUT、ECM1、ENTPD1、HIST2H2AA3、NHNRNPA1、JMJD1A、LCE1C、LCE2A、LCE3A、LCE3E、LCE5A、LMNA、NDUFA1、NDUFA13、NDUFB1、NDUFB10、NDUFB7、NDUFB9、NDUFC1、NDUFC2、NDUFS2、NDUFS3、NDUFS4、NDUFS5、NDUFS6、NDUFV2、NIT1、NOL7、NOTCH2NL、NR4A2、NT5E、PDGFB、POLG、POLR2B、POLR2C、POLR2F、PSMB7、RPL37A、RPS23、S100A13、S100A2、SHC1、TPM3、TUFT1、UPP1、及びVEGFの発現量を定量した。すべての遺伝子の発現量はリファレンスのKRT6B遺伝子の発現量で規格化(ノーマライズ)した。尚、各遺伝子の発現の測定に使用したプライマーを図10に示す。
ΔΔCt=(サンプルのターゲット遺伝子のCt値―リファレンスのターゲット遺伝子のCt値)―(サンプルのKRT6B遺伝子のCt値―リファレンスのKRT6B遺伝子のCt値)
遺伝子発現量=2−ΔΔCt
その結果を図11に示す。図示の通り、ADAMTLS4、ADFP、ATP5A1、ATP5C1、ATP5D、ATP5E、ATP5G1、ATP5G2、ATP5H、ATP5I、ATP5J、CKS1B、COX7C、CRCT1、CRTC2、CST6、DAP3、DCTD、DUSP1、DUT、ECM1、ENTPD1、HIST2H2AA3、NHNRNPA1、JMJD1A、LCE1C、LCE2A、LCE3A、LCE3E、LCE5A、LMNA、NDUFA1、NDUFA13、NDUFB1、NDUFB10、NDUFB7、NDUFB9、NDUFC1、NDUFC2、NDUFS2、NDUFS3、NDUFS4、NDUFS5、NDUFS6、NDUFV2、NIT1、NOL7、NOTCH2NL、NR4A2、NT5E、PDGFB、POLG、POLR2B、POLR2C、POLR2F、PSMB7、RPL37A、RPS23、S100A13、S100A2、SHC1、TPM3、TUFT1、UPP1、及びVEGFは、顔面部の遺伝子発現量が20歳代で高く、50歳代で低い。このように、これらの遺伝子発現量が老化の程度の評価・予測に有用であることが示された。
上記4.の方法で測定した20歳代被験者7名と50歳代被験者4名の頬部の皮膚角質より残存RNAのPCR解析結果から得られたΔΔCt値を、ケラチノサイト分化に関わる遺伝子群(ADAMTSL4、CKS1B、CRCT1、CRTC2、DAP3、ECM1、HIST2H2AA3、LCE1C、LCE2A、LCE3A、LCE3E、LCE5A、LMNA、NIT1、NOTCH2NL、S100A13、S100A2、SHC1、TPM3、TUFT1、PSMB4)、低酸素状態において発現が上昇する遺伝子群(ADFP、DUSP1、HNRPA1、JMJD1A、PDGFB、VEGF)、NADHデヒドロゲナーゼ遺伝子群(NDUFA1、NDUFA13、NDUFB1、NDUFB10、NDUFB7、NDUFB9、NDUFC1、NDUFC2、NDUFS2、NDUFS3、NDUFS4、NDUFS5、NDUFS6、NDUFV2)、ピリミジン代謝に関与する遺伝子群(DCTD、DUT、ENTPD1、NT5E、POLG、POLR2B、POLR2C、POLR2F、UPP1)、PMLシグナル伝達系遺伝子群(ATP5I、COX7C、CST6、NOL7、NR4A2、RPL37A、RPS23、NDUFA1)、F−TYPE ATPase遺伝子群(ATP5A1、ATP5C1、ATP5D、ATP5E、ATP5G1、ATP5G2、ATP5H、ATP5J)ごとに標準化(平均=0、標準偏差=1)した。ケラチノサイト分化に関わる遺伝子群のΔΔCt値と被験者の皮膚明度およびキメの程度は負の相関関係が認められた。同様に、低酸素状態において発現が上昇する遺伝子群のΔΔCt値と皮膚の弾力性、NADHデヒドロゲナーゼ遺伝子群のΔΔCt値と皮膚の弾力性、ピリミジン代謝に関与する遺伝子群のΔΔCt値と皮膚の明度、PMLシグナル伝達系遺伝子群のΔΔCt値と皮膚のキメの程度、F−TYPE ATPase遺伝子群のΔΔCt値と皮膚のキメの程度に負の相関が認められた(図12〜17)。ΔΔCtが低いほど遺伝子の発現量が大きいことを示しており、キメの評価点が大きいほどキメが細かい、明度が高いほど色素沈着の程度が低い、弾力性の数値が高いほど皮膚に弾力性があることを示している。すなわち、いずれの遺伝子群もキメが細かい、色素沈着が少ない、弾力性があるほど遺伝子発現が高くなることがわかった。したがって、被験者の角質RNAに含まれるケラチノサイト分化に関わる遺伝子群(ADAMTSL4、CKS1B、CRCT1、CRTC2、DAP3、ECM1、HIST2H2AA3、LCE1C、LCE2A、LCE3A、LCE3E、LCE5A、LMNA、NIT1、NOTCH2NL、S100A13、S100A2、SHC1、TPM3、TUFT1、PSMB4)、PMLシグナル伝達系遺伝子群(ATP5I、COX7C、CST6、NOL7、NR4A2、RPL37A、RPS23、NDUFA1)、F−TYPE ATPase遺伝子群(ATP5A1、ATP5C1、ATP5D、ATP5E、ATP5G1、ATP5G2、ATP5H、ATP5J)の発現を測定することにより、被験者のキメの状態を評価・予測することが可能となる。さらに、ケラチノサイト分化に関わる遺伝子群(ADAMTSL4、CKS1B、CRCT1、CRTC2、DAP3、ECM1、HIST2H2AA3、LCE1C、LCE2A、LCE3A、LCE3E、LCE5A、LMNA、NIT1、NOTCH2NL、S100A13、S100A2、SHC1、TPM3、TUFT1、PSMB4)、ピリミジン代謝に関与する遺伝子群(DCTD、DUT、ENTPD1、NT5E、POLG、POLR2B、POLR2C、POLR2F、UPP1)の発現を測定することにより被験者の色素沈着の程度を、低酸素状態において発現が上昇する遺伝子群(ADFP、DUSP1、HNRPA1、JMJD1A、PDGFB、VEGF)、NADHデヒドロゲナーゼ遺伝子群(NDUFA1、NDUFA13、NDUFB1、NDUFB10、NDUFB7、NDUFB9、NDUFC1、NDUFC2、NDUFS2、NDUFS3、NDUFS4、NDUFS5、NDUFS6、NDUFV2)の遺伝子の発現を測定することにより、被験者の弾力性を評価・予測することが可能となる。また、その結果から、被験者の皮膚の性状にあったスキンケアないしトリートメント方法の選択を選択することが可能である。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (13)
- 被験対象の皮膚より採取した角質を用いて遺伝子発現解析を行い、その結果によって皮膚の状態を評価することを特徴とする、皮膚の状態を評価する方法。
- 前記遺伝子発現解析が、前記角質から抽出したmRNAを試料とした遺伝子発現解析である、請求項1に記載の方法。
- (1)被験対象の特定部位の皮膚より採取した角質を用意するステップ、
(2)前記角質から抽出したmRNAを試料として遺伝子発現解析を行い、皮膚の状態に関連する遺伝子の発現量を算出するステップ、及び
(3)ステップ(2)で算出した発現量を用いて皮膚の状態を評価するステップ、
を含む、請求項2に記載の方法。 - ステップ(3)において、ステップ(2)で算出した発現量を基準発現量に照合して皮膚の状態を評価する、請求項3に記載の方法。
- 前記特定部位が顔面部である、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記遺伝子発現解析がマイクロアレイ法又はPCR法によって行われる、請求項3〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記遺伝子が、UNC5CL、KIAA0251、ECOP、PTGES2、ZNF135、SYT3、C12orf25、FOXA3、TMEM14C、PHF13、CLNS1A、RHOT2、FLG、NUP155、SLC7A6、CYHR1、ZNF304、FGFR4、RNF6、EIF3S7、RPS15、MRPS2、SERGEF、HVCN1、FGFR1、GRK7、TP53I3、RPUSD4、F7、MFHAS1、BOLL、RNF20、及びCYP2S1からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子である、請求項3〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記遺伝子が、TMEM47、SCAND2、SCML2、RFX4、GM2A、ZNF10、ABCD3、C13orf7、MICB、MPP1LC3C、PARP14、TMEM163、KIAA1467、SLC25A16、YARS2、FAM60A、CGNL1、CLN3、HSFY1、PLSCR3、LRRC37A3、C18orf4、ARSD、PITX2、TUBGCP5、RPL36、SMYD4、C3orf39、KBTBD6、MGC4655、PLK1、APOLD1、DDX47、DENND1C、ABTB1、GORASP1、TRERF1、PKMYT1、AKAP9、FZD7、DENND1B、HEL308、PIGO、DCAKD、SEPW1、RTCD1、FBXO21、MLZE、FUT4、MR1、NBPF11、RPL36AL、DFFB、MFAP3L、RDH16、NSF、HLA−DMA、ARHGEF6、RNF38、U2AF1L4、CTBP2、CDK6、GNG10、WDR73、MTMR11、C16orf51、IL6、C21orf58、REEP4、TMEM107、FCHO2、NCAPG2、BAG3、MAP6、AFF3、EBP、ATM、AQP4、CRNKL1、ZFP91、SARDH、TMEM16H、UNKL、TXNDC1、AKT2、BAG1、GATAD2A、及びUSP54からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子である、請求項3〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記遺伝子が、ADAMTLS4、ADFP、ATP5A1、ATP5C1、ATP5D、ATP5E、ATP5G1、ATP5G2、ATP5H、ATP5I、ATP5J、CKS1B、COX7C、CRCT1、CRTC2、CST6、DAP3、DCTD、DUSP1、DUT、ECM1、ENTPD1、HIST2H2AA3、NHNRNPA1、JMJD1A、LCE1C、LCE2A、LCE3A、LCE3E、LCE5A、LMNA、NDUFA1、NDUFA13、NDUFB1、NDUFB10、NDUFB7、NDUFB9、NDUFC1、NDUFC2、NDUFS2、NDUFS3、NDUFS4、NDUFS5、NDUFS6、NDUFV2、NIT1、NOL7、NOTCH2NL、NR4A2、NT5E、PDGFB、POLG、POLR2B、POLR2C、POLR2F、PSMB7、RPL37A、RPS23、S100A13、S100A2、SHC1、TPM3、TUFT1、UPP1、及びVEGFからなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子である、請求項3〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記角質が、粘着性のテープを用いて被験対象の皮膚より採取した角質である、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記皮膚の状態が、老化、しわ、たるみ、弾力性、炎症、色素沈着、乾燥状態、バリア機能、皮脂量、皮膚の新陳代謝、きめの粗さ、透明感、くすみ、血行、日焼け、毛穴の目立ち、知覚過敏、及びニキビからなる群より選択される1種又は2種以上の指標に関する状態である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記皮膚の状態が、老化の程度である、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 被験対象に対してトリートメント手段を施す前及び後にそれぞれ、請求項1〜12のいずれかに記載の方法を実施し、得られた評価結果を比較することによって該トリートメント手段の有効性を評価することを特徴とする、皮膚に対するトリートメント手段を評価する方法。
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