JP2008157890A - ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面にイオン性ポリマーを固定化した泳動路と、アニオン性基を有する水溶性アクリル系ポリマーを含有する緩衝液とを用いるヘモグロビン類の測定方法。
【選択図】なし
Description
従来から、このHbA1cの測定方法としては、HPLC法、免疫法、電気泳動法等が用いられている。このうち、臨床検査分野で多く用いられているHPLC法では、1試料当たり1〜2分での測定が可能であり、また、同時再現性試験のCV値が1.0%程度の測定精度が実現されている。糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための測定方法としては、このレベルの性能が必要とされている。
電気泳動法によるHb類の測定は、通常とは異なるアミノ酸配列を有する異常Hb類の分離方法として古くから用いられているが、HbA1cの分離は非常に困難であり、ゲル電気泳動の手法では30分以上の時間が必要であった。このように電気泳動法は、臨床検査分野に応用した場合、測定精度及び測定時間の点で問題があるため、糖尿病診断への応用はほとんど行われていなかった。
しかしながら、特許文献1に開示された方法を用いた場合、測定時間が長いという問題点は解消されず、加えて、使用する緩衝液のpHが9〜12と高く、Hbが変性してしまう可能性があることから、この方法を臨床検査に適用することは困難であった。
以下に本発明を詳述する。
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、泳動路であるキャピラリー14の内面にイオン性ポリマーが固定化されている。陽極槽12内、陰極槽13内又はキャピラリー14内の緩衝液は、アニオン性基を有する水溶性アクリル系ポリマーを含有する緩衝液である。
そして、ヘモグロビン類を測定する際には、キャピラリー14の一方より試料を注入して、高圧電源15から所定の電圧を印加することにより、キャピラリー14内を移動する目的成分を検出器16によって測定する。
上記泳動路の内面とは、具体的には、例えば、キャピラリー電気泳動法の場合は、キャピラリーの泳動路内面のことをいい、マイクロチップ型電気泳動法の場合は、マイクロチップ型電気泳動装置におけるマイクロチップ溝の泳動路内面のことをいう。
上記泳動路は、内部に充填剤粒子等の固形物質を有していてもよい。
上記イオン性ポリマーは、イオン性の種類により、アニオン性ポリマーと、カチオン性ポリマーとに大別される。
上記アニオン性の官能基としては、特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。
上記カチオン性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、アミノ化多糖類、アミノ基含有有機合成高分子等が挙げられる。
上記カチオン性の官能基としては、特に限定されず、例えば、1〜4級のアミノ基等が挙げられる。
上記カチオン性ポリマーは、親水性を有することが好ましい。
上記イオン性ポリマー溶液の濃度としては、好ましい下限が0.01%、好ましい上限が20%である。0.01%未満であると、固定化が不充分となることがある。20%を超えると、上記イオン性ポリマーからなる層を均一に形成することができず、ヘモグロビン類の測定途中に剥離し、再現性低下の原因となることがある。
上記緩衝液は、電気泳動時に上記泳動路の内部に満たされる緩衝液、電気泳動時に上記泳動路の両端に設置される陽極槽及び陰極槽に満たされる緩衝液、上記泳動路の内部を洗浄する緩衝液、試料を溶解希釈する溶血希釈液等に用いられる。
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、これら全ての緩衝液がアニオン性基を有するアクリル系ポリマーを含有するものであってもよく、一部の緩衝液のみがアニオン性基を有するアクリル系ポリマーを含有するものであってもよい。
上記緩衝液には、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等、一般的に用いられる添加剤を適宜添加してもよい。
上記アニオン性基としては特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等の従来公知のアニオン性を有する官能基である。なかでも、スルホン酸基を有することが好ましい。
上記アクリル系ポリマーは、分子中に、上記アニオン性基を複数有していてもよく、異なる種類の上記アニオン性基を有していてもよい。
上記アクリル系ポリマーは、使用時に上記緩衝液に完全に溶解した状態であればよいが、水に対する溶解度の好ましい下限が1g/Lである。1g/L未満であると、アクリル系ポリマーを低濃度でしか用いることができないため効果が現れにくく、測定精度が不充分となることがある。より好ましい下限は5g/Lである。
本発明のヘモグロビン類の測定方法において、上記アクリル系ポリマーとは、(メタ)アクリル酸、その誘導体類、及び、エステル類等を主成分とするポリマーをいう。
上記アニオン性基を有しない(メタ)アクリルモノマーとしては、上記アニオン性基を有する(メタ)アクリルモノマーと共重合が可能な(メタ)アクリルモノマーであれば特に限定されないが、例えば、親水性を有する(メタ)アクリル酸エステル類が好ましい。上記非イオン性及び親水性を有する(メタ)アクリル酸エステル類としては特に限定されず、例えば、2−ヒドロキシエチル(メタ)アクリレート、2−ヒドロキシプロピル(メタ)アクリレート、グリセロール(メタ)アクリレート;グリシジル(メタ)アクリレート、シアノ(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコール(メタ)アクリレート、ポリプロピレングリコール(メタ)アクリレート等が挙げられる。
(1)泳動路のコーティング
アニオン性ポリマーであるデキストラン硫酸(和光純薬社製)を0.2重量%含有する水溶液を調製した。次いで、フューズドシリカ製キャピラリー(GLサイエンス製:内径25μm×全長30cm)に、0.2NのNaOH水溶液、イオン交換水、0.5NのHCl水溶液をこの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、得られたデキストラン硫酸水溶液を20分間通液した。その後、空気をキャピラリー内に注入してデキストラン硫酸水溶液を追い出し、40℃の乾燥機内で12時間乾燥させた。その後、再びデキストラン硫酸水溶液を注入し、空気の注入及び乾燥を5回繰り返すことによって、キャピラリー内面をコーティングした。
得られた内面をコーティングしたキャピラリーを、キャピラリー電気泳動装置(PAC/E MDQ、Beckman Coulter社製)にセットした。
アニオン性基を有するアクリル系モノマーとして2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸(和光純薬社製)3.0g及びアニオン性基を有しないアクリル系モノマーとしてヒドロキシエチルメタクリレート(和光純薬社製)2.0gを50mLのイオン交換水に溶解して、溶液を作製した。得られた溶液に、過硫酸カリウム0.05gを添加し、窒素雰囲気下で攪拌しながら80℃に昇温して重合した。10時間重合後、得られた内容物の全量を透析チューブ(三光純薬社製:UC C65−50)に移し、イオン交換水中にて12時間透析を行うことによって、緩衝液に用いるアクリル系ポリマーを得た。
得られたアクリル系ポリマーを2.0重量%含有するクエン酸緩衝液(pH4.7)をキャピラリーの両端にセットし、キャピラリー内に満たした。
健常人血よりヘパリン採血した健常人全血70μLに、上述の(2)緩衝液の調製で得られたアクリル系ポリマーを2重量%含有するクエン酸緩衝液(pH6.0)200μLを添加して溶血希釈したものを試料として用いた。
キャピラリーの一方から試料を注入し、キャピラリーの両端の緩衝液に20kVの電圧をかけて電気泳動を行い、415nmの可視光における吸光度変化を測定することにより、ヒト血液中の安定型HbA1cのキャピラリー電気泳動法による測定を行った。
図2は、実施例1において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。図2中、ピーク1は安定型HbA1c、ピーク2はHbA0を示す。実施例1では、約1.5分の電気泳動時間で、安定型HbA1cの分離を行うことができた。
健常人血よりヘパリン採血した健常人全血に、グルコースを2000mg/dLとなるように添加し、修飾Hbの一種である不安定型HbA1cを多量に含む試料を人為的に調製した。
キャピラリーの一方から試料を注入し、キャピラリーの両端の緩衝液に20kVの電圧をかけて電気泳動を行い、415nmの可視光における吸光度変化を測定することにより、ヒト血液中の安定型HbA1cのキャピラリー電気泳動法による測定を行った。
図3は、実施例1において、修飾Hbを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
図3中、ピーク1は安定型HbA1c、ピーク2はHbA0、ピーク3は修飾Hb(不安定型HbA1c)を示す。図3に示すように、安定型HbA1cと修飾Hbである不安定型HbA1cとが良好に分離された。
デキストラン硫酸水溶液を用いた代わりに、アニオン性ポリマーであるポリメタクリル酸の0.5重量%水溶液を用いた以外は、実施例1と同様の方法よって、キャピラリー内面をコーティングした。
その後、アニオン性基を有するアクリル系モノマーとしてスルホプロピルメタクリレート(メルク社製)3.0g及びアニオン性基を有しないアクリル系モノマーとしてポリエチレングリコールメタクリレート(新中村化学社製)2.0gを用いた以外は、実施例1と同様の方法によって重合し、緩衝液に用いるアクリル系ポリマーを得た。
実施例1におけるアクリル系ポリマーを2重量%含有するクエン酸緩衝液(pH4.7)を用いた代わりに、得られたアクリル系ポリマー2.0重量%含有するリンゴ酸緩衝液(pH4.7)を用いた以外は、実施例1と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Hbを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図2と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Hbを含む試料の測定では、図3と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
ガラス製マイクロチップ(50mm×75mm×3mm)にクロス十字型の泳動路を作製し、該泳動路の両端に緩衝液槽を設置した。デキストラン硫酸水溶液を用いた代わりに、アニオン性ポリマーであるコンドロイチン硫酸の1重量%水溶液を用いた以外は、実施例1と同様の方法によって泳動路をコーティングした。実施例1で用いたアクリル系ポリマー含有緩衝液と同様の緩衝液を用いて、1000Vのマイクロチップ電気泳動法によって、健常人血の測定及び修飾Hbを含む試料の測定を行った。
図4は、実施例3において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。図4中、ピーク1は安定型HbA1c、ピーク2はHbA0を示す。図5は、実施例3において、修飾Hbを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムを示す模式図である。図5中、ピーク1は安定型HbA1c、ピーク2はHbA0、ピーク3は修飾Hb(不安定型HbA1c)を示す。図5に示すように、安定型HbA1cと修飾Hbである不安定型HbA1cとが良好に分離された。
なお、実施例3では、約60秒の電気泳動時間で、安定型HbA1cの分離を行うことができた。
デキストラン硫酸水溶液を用いた代わりに、カチオン性ポリマーであるキトサン(キトサン100、和光純薬社製)を0.2重量%含有する0.2N塩酸溶液を用いた以外は、実施例1と同様の方法よって、キャピラリー内面をコーティングした。実施例1で用いたアクリル系ポリマー含有緩衝液と同様の緩衝液を用いて、健常人血の測定及び修飾Hbを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図2と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Hbを含む試料の測定では、図3と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
キトサン溶液を用いた代わりに、カチオン性ポリマーであるポリブレン(ナカライテスク社製)の0.5重量%水溶液を用いた以外は、実施例1と同様の方法によって、キャピラリー内面のコーティングを行った。実施例2で用いたアクリル系ポリマー含有緩衝液と同様の緩衝液を用いて、健常人血の測定及び修飾Hbを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図2と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Hbを含む試料の測定では、図3と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
ガラス製マイクロチップ(50mm×75mm×3mm)にクロス十字型の泳動路を作製し、該泳動路の両端に緩衝液槽を設置した。デキストラン硫酸水溶液を用いた代わりに、実施例1で得られたアクリル系ポリマーの0.5重量%水溶液を用いた以外は、実施例1と同様の方法によって泳動路をコーティングした。実施例1で用いたアクリル系ポリマー含有緩衝液と同様の緩衝液を用いて、1000Vのマイクロチップ電気泳動法によって、健常人血の測定及び修飾Hbを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図4と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Hbを含む試料の測定では、図5と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
フューズドシリカ製キャピラリー(GLサイエンス製:内径25μm×全長30cm)に0.2NのNaOH水溶液、イオン交換水、0.5NのHCl水溶液の順で通液してキャピラリー内を洗浄した。実施例1で用いたデキストラン硫酸(アニオン性ポリマー)水溶液を1分間通液して、キャピラリー内を動的にコーティングした。次に、実施例2で得られたアクリル系ポリマーを2.0重量%含有するリンゴ酸緩衝液(pH4.7)をキャピラリーの両端にセットし、キャピラリー内に満たした。
実施例1と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Hbを含む試料の測定を行った。いずれの試料の測定の場合も、得られたエレクトロフェログラムには、ピークが検出されなかった。すなわち、固定化コーティング法を用いずに、動的コーティング法を用いた場合は、ヘモグロビン類の測定ができないことがわかった。
フューズドシリカ製キャピラリー(GLサイエンス製:内径25μm×全長30cm)を0.2NのNaOH水溶液、イオン交換水、0.5NのHCl水溶液の順で通液してキャピラリー内を洗浄した。0.5重量%のウマ血清アルブミン(カチオン性ポリマー)を含むリンゴ酸緩衝液(pH4.7)を1分間通液して、キャピラリー内を動的にコーティングした。次に、0.2重量%のコンドロイチン硫酸(和光純薬社製:非アクリル系ポリマー)を含むリンゴ酸緩衝液(pH4.7)を上記キャピラリーの両端にセットし、キャピラリー内に満たした。
得られたキャピラリー電気泳動装置と、緩衝液とを用いた以外は、実施例1と同様の方法により、キャピラリー電気泳動法によって、健常人血の測定及び修飾Hbを含む試料の測定を行った。
図6は、比較例2において、修飾Hbを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
図6中、ピーク1は安定型HbA1c、ピーク2はHbA0、ピーク3は修飾Hb(不安定型HbA1c)を示す。図6に示すように、得られたエレクトロフェログラムにおいて、安定型HbA1cを示すピーク1と修飾Hbを示すピーク3とが重なっている。固定化コーティング法ではなく動的コーティング法を用い、かつ、アクリル系ポリマー含有緩衝液を用いなかった場合は、安定型HbA1cが修飾Hbと分離できず、安定型HbA1cの正確な測定ができなかった。
実施例4におけるアクリル系ポリマー含有クエン酸緩衝液(実施例1で調製したもの)の代わりに、アクリル系ポリマーを含まないクエン酸緩衝液(pH4.7)を用いた以外は、実施例4と同様の方法によって、健常人血及び修飾Hbを含む試料の測定を行った。いずれの試料の測定の場合も、得られたエレクトロフェログラムには、ピークが検出されなかった。すなわち、アクリル系ポリマー含有緩衝液を用いずに、アクリル系ポリマーを含有しない緩衝液を用いた場合は、ヘモグロビン類の分離ができないことがわかった。
実施例1〜6及び比較例2の測定条件について、以下の評価を行った。
なお、比較例1及び比較例3の測定条件では、上述のようにピークが検出されず、ヘモグロビン類の測定ができなかったため、評価から除外した。
実施例1〜6及び比較例2について、健常人血試料と、該健常人血試料と同一の健常人血を元に調製した修飾Hb含有試料、すなわち、実施例1(4)修飾Hbを含む試料の測定において調製した健常人血にグルコースを2000mg/dLとなるように添加して得られた不安定型HbA1c含有試料と、更に、他の修飾Hb含有試料、すなわち、健常人血にアセトアルデヒドを50mg/dLとなるように添加して得られたアセチル化Hb含有試料と、シアン酸ナトリウムを50mg/dLとなるように添加して得られたカルバミル化Hb含有試料とを調製し、各試料における安定型HbA1c値を求めた。
なお、各試料の安定型HbA1c値は、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型HbA1cピークの面積の比率(%)を求めることにより算出した。
得られた修飾Hb含有試料の安定型HbA1c値から、得られた健常人血試料の安定型HbA1c値を差し引いた値を求めた。
結果を表1に示した。
実施例1〜6及び比較例2について、健常人血試料の同一試料を10回連続して測定した場合の安定型HbA1c値のCV値を測定した。
なお、CV値は(標準偏差/平均値)を算出することにより求めた。
また、比較例2では、1回の測定が終了した時点で、0.2NのNaOHで1分間、0.2重量%のコンドロイチン硫酸を含むリンゴ酸緩衝液(pH4.7)で2分間順次送液して洗浄した。また、次の試料を測定する前には、比較例2において行ったのと同様にして動的コーティングを再び行ったうえで連続測定を実施し、同時再現性試験を行った。
結果を表2に示した。
実施例1〜6及び比較例2の測定条件を用いて、健常人血試料の同一試料を100回連続して測定して得られた安定型HbA1c値の最大値と最小値との差(R値)を算出した。
結果を表2に示した。
この結果から、実施例1〜6の測定条件を用いた場合、優れた測定再現性を有し、多数回の繰り返し測定においても良好な測定値安定性を示すことがわかった。また、上述の評価において得られたエレクトロフェログラムは図2又は図4と同等のものであり、繰り返し測定後も良好な状態を保ったままであった。更に、動的コーティング法のように、測定毎の洗浄、コーティング操作等が不要であるため、より短時間の測定が可能であった。
12 陽極槽
13 陰極槽
14 キャピラリー
15 高圧電源
16 検出器
17 電極
18 電極
1 安定型HbA1cのピーク
2 HbA0のピーク
3 修飾Hb(不安定型HbA1c)のピーク
Claims (2)
- 電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、
内面にイオン性ポリマーを固定化した泳動路と、アニオン性の官能基を有する水溶性アクリル系ポリマーを含有する緩衝液とを用いる
ことを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。 - 水溶性アクリル系ポリマーが有するアニオン性の官能基がスルホン酸基であることを特徴とする請求項1記載のヘモグロビン類の測定方法。
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