JP2008150719A - Cellulose nano-fiber and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本願発明は、セルロース由来のナノファイバーとその製造方法に関し、セルロースを原料とし、これに、すなわちセルロースミクロフィブリル（Cellulose microfibril：ＣＭＦ）凝集体および又はＣＭＦ自体に酵素作用促進処理を施し、所定酵素の浸透性を確保して、酵素の作用によりセルロースナノファイバーを製造する技術に関するものである。 The present invention relates to a nanofiber derived from cellulose and a method for producing the same, using cellulose as a raw material, ie, subjecting cellulose microfibril (CMF) aggregate and / or CMF itself to an enzyme action promoting treatment, The present invention relates to a technique for producing cellulose nanofiber by the action of an enzyme while ensuring permeability.
セルロースは木材等、高等植物を始めとして藻類、酢酸菌等のある種バクテリア、ホヤなどの特定の動物によって生産され、ＣＭＦの形態で存在している。ＣＭＦの断面形態は生物種によって異なっており、その径も４-２０ｎｍと様々である。 Cellulose is produced by certain animals such as wood, higher plants, algae, certain bacteria such as acetic acid bacteria, and sea squirts, and exists in the form of CMF. The cross-sectional form of CMF varies depending on the species, and its diameter varies from 4 to 20 nm.
セルロースを出発原料とする微粒子およびそれらの分散液は、増粘性、乳化安定性、保水性、吸油性、保形性等の特徴を有することから、食品添加剤、錠剤賦形剤、分散剤、保形剤、保水剤、濾過助剤、充填剤、塗料、接着剤用添加剤等として、食品、医薬品、建材、窯業、ゴム・プラスチック等の幅広い分野で使用されている。 Fine particles starting from cellulose and dispersions thereof have characteristics such as thickening, emulsion stability, water retention, oil absorption, shape retention, etc., so food additives, tablet excipients, dispersants, Used as a shape-retaining agent, water-retaining agent, filter aid, filler, paint, additive for adhesives, etc. in a wide range of fields such as food, pharmaceuticals, building materials, ceramics, rubber and plastics.
本願発明に関連する従来技術が以下の文献において開示されている。
セルロースの微細化の方法としては、化学的処理と機械的処理による方法が知られている。化学的処理としてはセルロース原料に硫酸または塩酸等の鉱酸を作用させ加水分解反応を行い、残渣として粉末状セルロースを得る方法が公知であり、例えば１２０-１６０℃という高温下、２０-４５分間希酸で酸加水分解し、残渣として粉末状セルロースを得る方法（特許文献１参照）、２.５規定の塩酸で約１５分間酸加水分解し、粉末状セルロースを得る方法（特許文献２参照）、各種濃度の塩酸水溶液で高温処理し、残渣として粉末状セルロースを得る方法（特許文献３参照）等がある。 As a method for refining cellulose, methods using chemical treatment and mechanical treatment are known. As a chemical treatment, a method is known in which a mineral acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid is allowed to act on a cellulose raw material to carry out a hydrolysis reaction to obtain powdered cellulose as a residue, for example, at a high temperature of 120 to 160 ° C. for 20 to 45 minutes. Method of acid hydrolysis with dilute acid to obtain powdered cellulose as a residue (see Patent Document 1) Method of acid hydrolysis with 2.5 N hydrochloric acid for about 15 minutes to obtain powdered cellulose (see Patent Document 2) Further, there is a method in which high-temperature treatment with various concentrations of aqueous hydrochloric acid is performed to obtain powdered cellulose as a residue (see Patent Document 3).
しかしながら、従来技術に係るそれらの製造方法に関しては、高温、耐酸設備を要する上に、酸加水分解反応や中和工程における薬品コストの低減等が望まれていた。 However, regarding these production methods according to the prior art, high temperature and acid-resistant facilities are required, and reduction of chemical costs in an acid hydrolysis reaction and a neutralization process has been desired.
また、機械的処理としては、公知の分級および／または粉砕技術が利用されている。例えばガラスやアルミナ等を粉砕媒体として用いた振動ミル粉砕装置によってセルロース繊維懸濁液を湿式粉砕する方法（特許文献４参照）、砥粒板の擦り合せによるせん断力でセルロース繊維を湿式粉砕する方法（特許文献５参照）、セルロースの懸濁液を一対のノズルから高圧でそれぞれ噴射させると共に、その噴射流を互いに衝突させて粉砕する方法（特許文献６参照）等が挙げられる。 As the mechanical treatment, a known classification and / or pulverization technique is used. For example, a method of wet pulverizing a cellulose fiber suspension with a vibration mill pulverizer using glass or alumina as a pulverizing medium (see Patent Document 4), a method of wet pulverizing cellulose fibers with a shearing force by rubbing abrasive plates (Refer to Patent Document 5), a method in which a suspension of cellulose is sprayed at a high pressure from a pair of nozzles, and the sprayed streams collide with each other (see Patent Document 6).
一方、上記の化学的処理や機械的処理に対して、酵素処理によるセルロースの微細化の試みもなされている。酵素処理による微細化は、上記の化学的処理や機械的処理に比べて、温和な条件下で反応を実行できるという利点がある。セルロースを分解する酵素であるセルラーゼは、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼといった異なる分解様式の酵素からなる複合酵素系であり、これらの相乗作用によってセルロースはセロビオース等の水溶性物質を経てグルコースにまで解重合される。 On the other hand, attempts have been made to refine cellulose by enzyme treatment in contrast to the above chemical treatment and mechanical treatment. The refinement by the enzyme treatment has an advantage that the reaction can be performed under mild conditions as compared with the above chemical treatment and mechanical treatment. Cellulase, an enzyme that breaks down cellulose, is a complex enzyme system composed of enzymes with different degradation modes such as cellobiohydrolase, endoglucanase, and β-glucosidase. By their synergistic action, cellulose passes through water-soluble substances such as cellobiose. Depolymerized to glucose.
しかしながら、元来セルロースは結晶性を示すため、酵素が作用し難いという問題がある。セルラーゼの主要構成成分であるセロビオハイドロラーゼは、セルロース分子鎖の端からβ-(1,4)-グルコシド結合を一つおき（セロビオースの単位）に順次加水分解する酵素であり、結晶性セルロースに対しても効率的に作用する。従って、セルロースは主にセロビオースに分解され、本酵素処理によるＣＭＦのフィブリル化、すなわちナノファイバーの生成はごくわずかである（非特許文献１参照）。 However, since cellulose originally exhibits crystallinity, there is a problem that the enzyme is difficult to act. Cellobiohydrolase, the main component of cellulase, is an enzyme that sequentially hydrolyzes every other β- (1,4) -glucoside bond (cellobiose unit) from the end of the cellulose molecular chain. Also works efficiently. Therefore, cellulose is mainly decomposed into cellobiose, and fibrillation of CMF by this enzyme treatment, that is, formation of nanofibers is negligible (see Non-Patent Document 1).
一方、エンドグルカナーゼを単独で結晶性セルロースに処理させた場合、セルロースに存在する非晶領域に作用し、セルロースの重合度低下が生じるが、ナノファイバーの生成は報告されていない（非特許文献２）。このように、酵素処理による効率的なセルロースナノファイバーの製造技術は未だ確立されていないのが現状である。 On the other hand, when endoglucanase is treated alone into crystalline cellulose, it acts on an amorphous region present in cellulose, resulting in a decrease in the degree of polymerization of cellulose, but the production of nanofibers has not been reported (Non-Patent Document 2). ). Thus, the present condition is that the manufacturing technique of the efficient cellulose nanofiber by an enzyme process is not yet established.
本願発明は、酵素処理によるセルロース原料からのセルロースナノファイバーの製造において、簡便で効率的な製造方法を提供することを目的としている。すなわち、特別な装置を必要とせず、温和な条件でセルロースナノファイバーを高収率で得るとともに、該セルロースナノファイバーは高結晶性を維持し、素材としての新しい用途が期待でき、本願発明はその工業的意義が極めて大きいセルロースナノファイバーの製造技術の提供を目的としている。 This invention aims at providing the simple and efficient manufacturing method in manufacture of the cellulose nanofiber from the cellulose raw material by an enzyme process. That is, a cellulose nanofiber is obtained in a high yield under mild conditions without requiring a special device, and the cellulose nanofiber maintains high crystallinity, and a new application as a material can be expected. The purpose is to provide a technology for producing cellulose nanofibers, which have extremely large industrial significance.
本願発明は、次の工程からなるセルロースナノファイバーの製造方法を実現して、上記従来の課題を解決しようとするものである。
（イ）緩衝液、セルロース、セルロース分解酵素、反応安定剤等からなる反応懸濁液を調製する工程、（ロ）反応懸濁液中のセルロースに酵素作用促進処理をなすことによりＣＭＦの凝集体および／またはＣＭＦにおける結晶領域に配向の乱れを生じさせて前記セルロースに酵素浸透性を確保する工程、（ハ）前記工程（ロ）に次いで、又はこれに併せて酵素浸透性を得たセルロースにセルロース分解酵素が作用してＣＭＦの凝集体を解きほぐし、および／又はＣＭＦを細裂させて所定のセルロースナノファイバーを反応懸濁液中に生成する工程。
The present invention seeks to solve the above-mentioned conventional problems by realizing a method for producing cellulose nanofiber comprising the following steps.
(A) a step of preparing a reaction suspension comprising a buffer solution, cellulose, cellulolytic enzyme, reaction stabilizer, etc., (b) an aggregate of CMF by subjecting cellulose in the reaction suspension to an enzyme action promoting treatment. And / or a step of causing disorder of orientation in a crystal region in CMF to ensure enzyme permeability in the cellulose, (c) subsequent to or in combination with the step (b), A step in which a cellulose-degrading enzyme acts to unravel CMF aggregates and / or cleave CMF to produce predetermined cellulose nanofibers in the reaction suspension.
また、上記のセルロースナノファイバーの製造方法において、前記酵素作用促進処理は
ＣＭＦあるいはその凝集体における部分的な物理的破壊処理であり、セルロース分解酵素をこの物理的破壊部分を介して作用させるように構成することがある。すなわち、物理的破壊処理によりセルロースにおいて部分的に結晶性を低下（セルロース分子の配向性低下）せしめ、当該部分における水素結合を開放することになる。
In the method for producing cellulose nanofibers, the enzyme action promoting treatment is a partial physical destruction treatment in CMF or an aggregate thereof, and the cellulolytic enzyme is allowed to act via the physical destruction portion. May be configured. That is, the crystallinity is partially lowered (decrease in the orientation of cellulose molecules) in the cellulose by physical destruction treatment, and hydrogen bonds in the portion are released.
さらに、上記セルロースナノファイバーの製造方法において、前記物理的破壊は、ＣＭＦあるいはその凝集体の結晶化度を若干低減させる程度のもので構成することがある。 Furthermore, in the method for producing cellulose nanofiber, the physical destruction may be composed of a material that slightly reduces the crystallinity of CMF or its aggregates.
また、上記のセルロースナノファイバーの製造方法において、ＣＭＦあるいはその凝集体の結晶化度の低減を数％以上に設定することがある。 In the method for producing cellulose nanofibers, the reduction in crystallinity of CMF or an aggregate thereof may be set to several percent or more.
さらにまた、上記いずれかのセルロースナノファイバーの製造方法において、セルロース分解酵素はエンドグルカナーゼで構成することがある。 Furthermore, in any one of the methods for producing cellulose nanofibers, the cellulolytic enzyme may be composed of endoglucanase.
また、上記いずれかのセルロースナノファイバーの製造方法において、前記物理的破壊処理は反応懸濁液中に加えた撹拌子の撹拌によるものとなすことがある。 In any one of the above-described methods for producing cellulose nanofibers, the physical destruction treatment may be performed by stirring a stirring bar added to the reaction suspension.
そして、本願発明は、上記いずれか記載のセルロースナノファイバーの製造方法により産出したセルロースナノファイバーを提供して上記従来の課題を解決しようとするものである。 And this invention intends to solve the said conventional subject by providing the cellulose nanofiber produced by the manufacturing method of one of the said cellulose nanofibers.
セルロースは天然では高等植物等により生産され、ＣＭＦという繊維の形で存在している。木材などからほぼＣＭＦのみ（いわゆるパルプ）を残して懸濁液とし、堆積し圧締して乾燥させたものが紙である。また後述のアビセルはパルプに含まれるセルロース以外の成分を酸などでさらに厳密に除去して製造されるもので、ＣＭＦの形態は維持されているが、製造・乾燥過程でこれらが絡み合い、複雑な水素結合が形成されて鞠の様に固まっている。これを本願発明では「ＣＭＦの凝集体」と呼んでいる。 Cellulose is naturally produced by higher plants and is present in the form of fibers called CMF. Paper is made of wood or the like, leaving almost only CMF (so-called pulp) as a suspension, deposited, pressed and dried. In addition, Avicel, which will be described later, is manufactured by strictly removing components other than cellulose contained in pulp with an acid or the like, and the form of CMF is maintained, but these are entangled and complicated during the manufacturing and drying process. Hydrogen bonds are formed and hardened like cocoons. In the present invention, this is called “aggregate of CMF”.
ＣＭＦは、生産する起源によってその結晶化度や断面のサイズが異なり、木材やコットンなどの場合は３−６ｎｍと小さく、ホヤの場合は１１−１５ｎｍと大きなものである。したがって、ＣＭＦは、ナノ繊維の範疇にあるともいえるが、アビセルやホヤセルロースをスターラーで撹拌すると、ＣＭＦの凝集体や、もともと大きなＣＭＦのある部分の酵素作用促進処理としての物理的破壊が発生し、セルロースにおいて部分的に結晶性が低下（セルロース分子の配向性低下）し、当該部分における水素結合が開放される結果、酵素浸透性が発生するものと考えられる。 CMF differs in crystallinity and cross-sectional size depending on the origin of production, and is as small as 3-6 nm for wood and cotton, and as large as 11-15 nm for squirts. Therefore, although CMF can be said to be in the category of nanofibers, when Avicel or squirt cellulose is stirred with a stirrer, CMF aggregates or physical destruction as a process of promoting enzyme action of a part of a large CMF originally occurs. It is considered that enzyme permeability is generated as a result of partial decrease in crystallinity in cellulose (reduction in orientation of cellulose molecules) and release of hydrogen bonds in the portion.
このことは、エンドグルカナーゼ無添加のセルロース原料の透過電顕観察により確認される。すなわち物理的破壊箇所にエンドグルカナーゼが作用し、凝集していたＣＭＦがほぐれたり、大きなＣＭＦに割れが生じてさらに細いＣＭＦの集合体となる。この現象を指して「ＣＭＦのフィブリル化」ということができる。ＣＭＦの凝集体がほぐれた場合は、木材やコットン起源の場合、得られるナノファイバーは約３ｎｍ径、ＣＭＦの起源がホヤの場合は４−６ｎｍ径となる。 This is confirmed by transmission electron microscopic observation of a cellulose raw material not added with endoglucanase. That is, endoglucanase acts on the physical destruction site, and the agglomerated CMF is loosened or a large CMF is cracked to form a finer CMF aggregate. This phenomenon can be referred to as “CMF fibrillation”. When the aggregate of CMF is loosened, the obtained nanofibers are about 3 nm in the case of wood or cotton, and the diameter is 4-6 nm if the origin of CMF is sea squirt.
本願発明では、ＣＭＦあるいはその凝集体を水に懸濁し、これに撹拌子を入れてスターラーで撹拌しつつ、併せてエンドグルカナーゼを作用させるように構成しているが、エンドグルカナーゼを加えないもので、部分的に物理的破壊が生じていることを透過電顕で確認しており、この段階で結晶化度の低下が見られる。すなわち、物理的破壊（物理的緩みともいえる）を生じさせて、その結果、結晶化度は数〜十数％低下することになる。 In the present invention, CMF or an aggregate thereof is suspended in water, and a stirrer is added to the suspension while stirring with a stirrer, and endoglucanase is allowed to act at the same time, but endoglucanase is not added. It has been confirmed by transmission electron microscopy that a partial physical breakdown has occurred, and a decrease in crystallinity is observed at this stage. That is, physical destruction (also referred to as physical loosening) is caused, and as a result, the crystallinity is reduced by several to tens of percent.
周知のように、セルロースは、直鎖状のセルロース分子鎖が規則正しく並び、水素結合などで強固な高次構造を成して結晶性を有している。このことは、酵素が作用し難く、難分解性であることの原因となっている。本発明の撹拌条件（物理的破壊処理）により、ＣＭＦあるいはその凝集体に酵素の作用し易い部分が生成される。そして、いったん低下した結晶化度は、エンドグルカナーゼの作用により若干増加する。これは撹拌により生じた非晶部分が、エンドグルカナーゼの作用で切れて除かれることにより、結晶領域の割合が高まったためと考えられる。 As is well known, cellulose has crystallinity in which straight-chain cellulose molecular chains are regularly arranged to form a strong higher-order structure by hydrogen bonding or the like. This causes the enzyme to hardly act and to be hardly degradable. According to the stirring conditions (physical destruction treatment) of the present invention, a portion where an enzyme easily acts on CMF or an aggregate thereof is generated. The crystallinity once lowered slightly increases due to the action of endoglucanase. This is presumably because the amorphous part generated by stirring was cut off by the action of endoglucanase, and the ratio of the crystalline region increased.
前記物理的破壊処理（物理的緩みの付与ともいえる）とは、ＣＭＦあるいはその凝集体を物理的に破壊し、結晶性を低下させることであり、透過電顕の観察から、例えば、ＣＭＦがほつれたようになったり、少し小さい凝集体が出来たりしていることから判明する。また、透過電顕では観察できない表面の変化や微細な割れが出来ている可能性が有る。本願発明において「物理的破壊（物理的緩み）」とは以上を併せた概念である。 The physical destruction treatment (which can be said to be imparting physical slack) is to physically destroy CMF or its aggregates to reduce crystallinity. From observation of a transmission electron microscope, for example, CMF is frayed. It becomes clear from the fact that it has become a little or a little agglomerate is made. Moreover, there is a possibility that surface changes and fine cracks that cannot be observed with a transmission electron microscope have been made. In the present invention, “physical destruction (physical loosening)” is a concept that combines the above.
物理的破壊（物理的緩み）を達成する手段としては、超音波処理等も可能である。しかし、本願発明でユニークな点は、この物理的緩みを生じさせつつ、一方で、生成したその緩みにエンドグルカナーゼを作用させてＣＭＦをバラバラにしたり、さらに細いＣＭＦを生成したり、といった反応を同時にできることである。ＣＭＦあるいはその凝集体を形成している水素結合は非常に強固なので、酵素処理をなすには、なんらかの酵素作用促進処理を施すことなくしては簡単にほぐれない。そこで、酵素作用促進処理としての物理的破壊（物理的緩み）によりほぐれ酵素浸透性が得られたところにエンドグルカナーゼを作用させることになる。 As a means for achieving physical destruction (physical slack), ultrasonic treatment or the like is also possible. However, the unique point of the present invention is that this physical relaxation occurs while the endoglucanase is allowed to act on the generated relaxation to break down the CMF or generate a thinner CMF. It can be done at the same time. Since the hydrogen bond forming CMF or its aggregate is very strong, it cannot be easily unwound without performing some enzyme action promoting treatment in order to carry out the enzyme treatment. Therefore, endoglucanase is allowed to act where loose enzyme permeability is obtained by physical disruption (physical loosening) as an enzyme action promoting treatment.
本願発明において、撹拌すなわち、物理的破壊処理はＣＭＦ自体あるいはＣＭＦの凝集体を物理的に破壊するが、物理的破壊処理の目的は酵素浸透性の確保にあり、物理的破壊処理自体によってＣＭＦ自体あるいはＣＭＦの凝集体をフィブリル化させることが目的ではない。従って、結晶を大規模に壊してしまうほど強い衝撃を与える必要はない。 In the present invention, the stirring, that is, the physical destruction treatment physically destroys CMF itself or the aggregate of CMF. The purpose of the physical destruction treatment is to ensure enzyme permeability. Alternatively, it is not intended to fibrillate CMF aggregates. Therefore, it is not necessary to give such a strong impact as to break the crystal on a large scale.
本願発明において、用いるセルロース分解酵素は、セルロースの非晶領域にのみ効率的に作用するエンドグルカナーゼが最適であり、ＣＭＦの凝集体のフィブリル化はエンドグルカナーゼ処理で特に顕著に現れる。一方、セロビオハイドロラーゼは、セルロース分子の端からβ-(1,4)-グルコシド結合を一つおきに順次加水分解する性質上、セロビオースが優先的に生成され、効率的にナノファイバーを生産することは難しい。 In the present invention, the cellulolytic enzyme to be used is optimally an endoglucanase that efficiently acts only on the amorphous region of cellulose, and fibrillation of CMF aggregates is particularly prominent in the endoglucanase treatment. Cellobiohydrolase, on the other hand, hydrolyzes every other β- (1,4) -glucoside bond from the end of the cellulose molecule, so cellobiose is preferentially produced, producing nanofibers efficiently. Difficult to do.
セルロース分解酵素にはβ-(1,4)-グルコシド結合を加水分解するための構造（触媒ドメイン）と、これとは別にセルロース結合モジュール(cellulose binding module: ＣＢＭ)とよばれる不溶性セルロースに結合するための独立した構造を持っているものと持っていないものが存在することが知られている。ＣＢＭが不溶性セルロースに結合することにより、触媒ドメインを基質である不溶性セルロース表面に濃縮させる効果があるため、ＣＢＭを有するセルロース分解酵素は、ＣＢＭを有していない触媒ドメインのみからなる酵素よりも不溶性セルロースを分解する活性が高いと言われている。
しかしながら本願発明においては、懸濁液中での物理的破壊処理操作により、エンドグルカナーゼとセルロースの接触が十分になされるため、エンドグルカナーゼはＣＢＭの有無にかかわらず用いることができる
Cellulose degrading enzyme binds to insoluble cellulose called cellulose binding module (CBM) separately from the structure (catalytic domain) for hydrolyzing β- (1,4) -glucoside bond It is known that there are those that have an independent structure and those that do not. Cellulose-degrading enzyme having CBM is more insoluble than an enzyme consisting only of a catalyst domain having no CBM because CBM has an effect of concentrating the catalytic domain on the surface of insoluble cellulose as a substrate by binding to insoluble cellulose. It is said that it has a high activity of decomposing cellulose.
However, in the present invention, the endoglucanase can be used regardless of the presence or absence of CBM because the contact between the endoglucanase and cellulose is sufficiently achieved by the physical disruption treatment operation in the suspension.
糖質加水分解酵素（Glycoside Hydrolase: ＧＨ）は触媒ドメインの一次構造（酵素のアミノ酸配列）の類似性によって分類されており、エンドグルカナーゼは複数のＧＨファミリーに分類されている。例えば、セルロース分解菌であるTrichoderma reeseiが有しているエンドグルカナーゼは５つのＧＨファミリーに分布している。これらの酵素の構造は全く異なっているが、本願発明に用いるエンドグルカナーゼはいずれのＧＨファミリーに属するものでもよい。 Glycoside hydrolase (GH) is classified according to the similarity of the primary structure of the catalytic domain (amino acid sequence of the enzyme), and endoglucanases are classified into multiple GH families. For example, the endoglucanase possessed by Trichoderma reesei, which is a cellulolytic bacterium, is distributed in five GH families. Although the structures of these enzymes are completely different, the endoglucanase used in the present invention may belong to any GH family.
本願発明で用いる酵素はセルロースの加水分解反応を触媒するため、水分子の存在は不可欠である。また、反応が効率的に行われるようにするため、酵素と基質（本願発明の場合のセルロース）の接触が十分になされる必要があり、そのためには反応を懸濁液中で行う必要がある。さらに、後述段落００３２に示すように、反応系のｐＨを一定にする必要からも懸濁液中での反応が必須となる。 Since the enzyme used in the present invention catalyzes the hydrolysis reaction of cellulose, the presence of water molecules is indispensable. In addition, in order for the reaction to be carried out efficiently, it is necessary to make sufficient contact between the enzyme and the substrate (cellulose in the case of the present invention), and for this purpose, the reaction must be carried out in suspension. . Furthermore, as shown in paragraph 0032 described later, the reaction in the suspension is essential because the pH of the reaction system needs to be constant.
酵素は特定の立体構造をもつタンパク質であり、酵素が反応を触媒するという機能を発揮するためには構造の維持が不可欠である。しかし、酵素の種類や使用条件によっては、酵素の立体構造を長時間維持することが困難になるため、酵素の機能が低下し、期待する酵素反応の速度が低下してしまうことがありえる。
したがって、条件によっては酵素の立体構造を維持することを目的として反応懸濁液に安定剤を添加する場合がある。一般的にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やグリセロールが安定剤として広く用いられている。
An enzyme is a protein having a specific three-dimensional structure, and the maintenance of the structure is indispensable for the enzyme to function to catalyze the reaction. However, depending on the type of enzyme and the use conditions, it may be difficult to maintain the three-dimensional structure of the enzyme for a long time, so that the function of the enzyme may be reduced, and the expected enzyme reaction rate may be reduced.
Therefore, depending on conditions, a stabilizer may be added to the reaction suspension for the purpose of maintaining the three-dimensional structure of the enzyme. In general, bovine serum albumin (BSA) and glycerol are widely used as stabilizers.
酵素には、最も効率的に働くｐＨ領域があり、それ以外では酵素の働きが低下したり、酵素の立体構造が維持できずに失活してしまうこともある。
したがって、酵素反応を行う際には緩衝液で反応懸濁液のｐＨを酵素にとって最適のｐＨに維持することが必須となる。ｐＨを保つための緩衝液にはさまざまな種類があり、目的のｐＨにするのに適した緩衝液を選ぶことができる。本願発明で用いているエンドグルカナーゼの最適ｐＨは４−６付近のため、酢酸緩衝液を用いるが、代わりにリン酸緩衝液なども利用可能である。
Enzymes have a pH region that works most efficiently, and otherwise the enzyme functions may be reduced, or the enzyme's three-dimensional structure may not be maintained and may be deactivated.
Therefore, when performing an enzyme reaction, it is essential to maintain the pH of the reaction suspension at a pH optimum for the enzyme with a buffer solution. There are various types of buffer solutions for maintaining the pH, and a buffer solution suitable for achieving the target pH can be selected. Since the optimum pH of the endoglucanase used in the present invention is around 4-6, an acetate buffer is used, but a phosphate buffer or the like can be used instead.
前述のようにセルロース分子は直鎖状であり、これらが規則正しく並んで水素結合などにより結晶を形成する。結晶領域では、セルロース分子鎖間の間隔は広くても０.６ｎｍで、セルロース分子は隣接したセルロース分子としっかり結合しているため、酵素はセルロース分子を抱え込むことができず、加水分解反応を起こすことが困難である。 As described above, the cellulose molecules are linear, and they are regularly arranged to form crystals by hydrogen bonding or the like. In the crystal region, the distance between cellulose molecular chains is 0.6 nm at most, and the cellulose molecules are tightly bound to the adjacent cellulose molecules, so the enzyme cannot carry the cellulose molecules and causes a hydrolysis reaction. Is difficult.
また、アビセルの様な二次凝集体は、個々のＣＭＦがさらに絡まり合った状態で乾燥してＣＭＦ表面に不規則に水素結合を形成し、塊状になっており、酵素の作用は困難である。前記の物理的破壊処理（物理的緩みの付与）とは、前述のように撹拌子で撹拌することにより部分的に物理的な緩みが生じ、すなわちセルロース分子鎖の配向の乱れた部分（非晶部分）が生じることにより、酵素がセルロース分子を抱え込むこと（酵素浸透性の確保）ができるようにすることである。 このような撹拌による「物理的な緩み」の生成と、その部分の酵素による加水分解が繰り返されることにより、結晶性を有するＣＭＦあるいはアビセルの様な二次凝集体は、ＣＭＦ自体が解かれる、あるいは、凝集体が分散されることになり、ＣＭＦのフィブリル化が実現する。 In addition, secondary aggregates such as Avicel are dried in a state where individual CMFs are further entangled, and irregularly form hydrogen bonds on the surface of the CMF, resulting in lumps and the action of the enzyme is difficult. . As described above, the physical destruction treatment (giving physical slack) is partly caused by physical slack by stirring with a stirrer as described above. (Part)) is to allow the enzyme to hold the cellulose molecule (ensure enzyme permeability). By repeating the generation of “physical slack” by such agitation and the hydrolysis of the part by the enzyme, CMF itself is released from the secondary aggregate such as CMF or Avicel having crystallinity. Alternatively, aggregates are dispersed, and fibrillation of CMF is realized.
本願発明に係る実験で用いたアビセルは、コットンセルロース・木材パルプを原料としており、その製法上、酸加水分解と乾燥によってＣＭＦが凝集し、数十μm径の塊となっている。 また、ホヤセルロースは塩酸処理により精製したもので、若干のＣＭＦの凝集が残っている。特に、アビセルではＣＭＦがランダムに集合し、凝集部分は不規則に水素結合が形成されているものと考えられる。アビセルの透過電顕観察では、工程終了後は細いフィブリルの集合体になっていることから、凝集部分は、撹拌とエンドグルカナーゼによって、ほぐれてバラバラになるものと推定できる。 Avicel used in the experiment according to the present invention uses cotton cellulose / wood pulp as a raw material, and due to its production method, CMF aggregates by acid hydrolysis and drying to form a mass with a diameter of several tens of μm. In addition, squirt cellulose is purified by treatment with hydrochloric acid, and some CMF aggregation remains. In particular, in Avicel, CMF gathers at random, and it is considered that hydrogen bonds are irregularly formed in the aggregated portion. In transmission electron microscopic observation of Avicel, since it is an aggregate of thin fibrils after the process is completed, it can be presumed that the agglomerated part is loosened and broken apart by stirring and endoglucanase.
また、ＣＭＦ自体にも非晶部分が存在し、その部分が撹拌とエンドグルカナーゼによって破壊・除去され、より短いあるいは細いＣＭＦとして分離されると考えられる。このことは、後述の実施例において、撹拌による微細な破砕は結晶領域にも及んでいること（後記表１において「未処理」よりも「撹拌のみ」で結晶化度が低下している）、さらにこの破砕部分をエンドグルカナーゼが分解除去すること（後記表１において「撹拌のみ」よりも「撹拌＋エンドグルカナーゼ」で結晶化度が増加している）により確認している。すなわち、アビセルでもホヤでも、凝集部分のみならず、結晶領域での微細な破砕とその部分のエンドグルカナーゼによる分解によってＣＭＦ自体も分解を受けて、より短いあるいは細いＣＭＦとして分離されると考えられる。 Also, there is an amorphous part in CMF itself, which part is destroyed and removed by stirring and endoglucanase, and is considered to be separated as a shorter or thinner CMF. This means that in the examples described later, fine crushing by stirring extends to the crystal region (in Table 1 below, the degree of crystallinity is reduced by “stirring only” rather than “untreated”). Furthermore, it is confirmed by the endoglucanase decomposing and removing the crushed portion (the degree of crystallinity is increased by “stirring + endoglucanase” rather than “stirring alone” in Table 1 below). That is, in Avicel and sea squirt, it is considered that CMF itself is also decomposed by fine crushing in the crystal region and decomposition by endoglucanase in addition to the agglomerated portion, and separated into shorter or thinner CMF.
本願発明にあっては、上記構成により、特別な装置を必要とせず、温和な条件で、セルロースナノファイバーを高収率で得ることが出来る。本願発明で得られるセルロースナノファイバーは高結晶性を維持しており、素材としての新しい用途が期待され、その工業的意義は極めて大きい。 In the present invention, with the above configuration, a cellulose nanofiber can be obtained in a high yield under mild conditions without requiring a special device. The cellulose nanofiber obtained by the present invention maintains high crystallinity and is expected to be used as a raw material, and its industrial significance is extremely large.
本願発明は、上記従来の課題を解決のための研究過程において、セルロース原料の懸濁
液をスターラーで撹拌しながら、セルラーゼの成分の一つであるエンドグルカナーゼで処理することが有効であることの知見に端を発するものである。
In the present invention, in the research process for solving the above-mentioned conventional problems, it is effective to treat the suspension of cellulose raw material with endoglucanase which is one of the components of cellulase while stirring with a stirrer. It starts with knowledge.
すなわち、スターラーで撹拌することによってＣＭＦの凝集体もしくはＣＭＦそのものの一部に物理的破壊処理による物理的な緩みを生ぜしめ、酵素のセルロース原料への浸透がよくなると同時に、緩みに生じた非晶部分にエンドグルカナーゼを作用させることによってＣＭＦをフィブリル化し、セルロースナノファイバーが生成する。 That is, by stirring with a stirrer, the CMF aggregates or a part of the CMF itself is physically loosened by physical destruction treatment, and the penetration of the enzyme into the cellulose raw material is improved. By causing endoglucanase to act on the part, CMF is fibrillated to produce cellulose nanofibers.
そこで、本願発明の要旨は、セルロースを該ＣＭＦに物理的に緩み（酵素作用促進処理）が生じ得て酵素浸透性が確保される条件下でエンドグルカナーゼ処理することにある。 Accordingly, the gist of the present invention is to subject the cellulose to endoglucanase under conditions where the CMF can be physically loosened (enzyme action promoting treatment) to ensure enzyme permeability.
なお、「該ＣＭＦに物理的に緩みが生じ得る条件下」とは、セルロース原料のＣＭＦの凝集体、もしくはＣＭＦそのものの一部に物理的な緩みが生じることにより、結晶化度が数％から十数％程度低下しうる条件であり、例えばセルロース懸濁液に撹拌子を入れ、スターラーで撹拌することでも実行することができるが、これに限定されるものではない。 Note that “the conditions under which the CMF can be physically loosened” means that the CMF aggregates of the cellulose raw material or a part of the CMF itself is physically loosened, so that the crystallinity is from several percent. The condition can be reduced by about 10% or more, and for example, it can be carried out by putting a stirring bar into a cellulose suspension and stirring with a stirrer, but is not limited thereto.
ここで、あらためて、本願発明の上記要旨を図１ないし５に基づいて模式的に整理説明する。
イ．セルロース分子鎖とエンドグルカナーゼの作用について セルロース分子鎖は、図1に示すように、グルコースがβ-(1,4)-グルコシド結合により直鎖状に重合したものである。エンドグルカナーゼはセルロース分子鎖を抱え込んでβ-(1,4)-グルコシド結合を加水分解するとセルロース分子から離れ、新たにセルロース分子鎖を捕まえてβ-(1,4)-グルコシド結合を加水分解する（非プロセッシブ型）。
したがって、図２に示すようにセルロース分子鎖をエンドグルカナーゼで処理するとセルロース分子鎖の断片化が生じる。
ロ．セルロースの構造について（結晶領域と非晶領域）
天然では、図３のように、セルロース分子鎖は何本かが集まった束の形で存在しており、これがＣＭＦと呼ばれ、生物起源によってその幅や長さは異なってくる。ＣＭＦではセルロース分子鎖が規則的に並んで水素結合、ファンデルワールス力などにより隣接した分子鎖間が結ばれ、強固な３次元構造を形成している。このように、規則的に分子鎖が並んだ状態（結晶）では、エンドグルカナーゼがセルロース分子を抱え込むことができないため、β-(1,4)-グルコシド結合を加水分解することができない。 一方、外部からの強い力による変形やセルロース分子鎖の長さの不均一性などのため、分子鎖の配列の規則性が低い（配向性が低い）領域（非晶領域）が存在する（図４参照）。
このような領域では水素結合がまばらでセルロース分子鎖が緩んだ状態にあり、エンドグルカナーゼがセルロース分子鎖を抱え込んでβ-(1,4)-グルコシド結合を加水分解することが可能となる。セルロースミクロフィブリルには、結晶領域と非晶領域が混在しており、大きなＣＭＦほど結晶領域の割合が高い（結晶化度が高い）傾向が有る。
ハ．アビセルとホヤセルロースの構造 本願発明の実験例で用いたアビセルは、木材パルプやコットンセルロースを酸加水分解して非晶領域を除き、磨砕、乾燥したもので、乾燥の際にＣＭＦが凝集した状態のものである。
一方、ホヤセルロースはそのセルロースを分離・精製後、酸加水分解して非晶部を除いたもので、ＣＭＦの凝集は少なく、ほとんどが結晶領域からなると考えられる。
ニ．撹拌等による物理的破壊とエンドグルカナーゼによる加水分解によるＣＭＦのフィブリル化（図５参照） ＣＭＦは結晶化度が高く、エンドグルカナーゼはほとんど作用できない。しかし、ＣＭＦ懸濁液を撹拌するとＣＭＦと撹拌子、あるいはＣＭＦ同士の接触により部分的に物理的破壊が生じる。この部分はセルロース分子鎖の規則的な配向が低下した状態、つまり非晶領域であり、エンドグルカナーゼによる作用で、非晶領域を除去できる。このような物理的な破壊とエンドグルカナーゼによる分解を繰り返すことにより、徐々にミクロフィブリルのフィブリル化（断片化、細分化）が進行する。
Here, once again, the above gist of the present invention will be schematically explained based on FIGS.
I. Cellulose Molecular Chain and Endoglucanase Action As shown in FIG. 1, the cellulose molecular chain is a product of glucose that is linearly polymerized by β- (1,4) -glucoside bonds. Endoglucanase entraps the cellulose molecular chain and hydrolyzes the β- (1,4) -glucoside bond, leaving the cellulose molecule and newly catching the cellulose molecular chain and hydrolyzing the β- (1,4) -glucoside bond (Non-processive type).
Therefore, when the cellulose molecular chain is treated with endoglucanase as shown in FIG. 2, fragmentation of the cellulose molecular chain occurs.
B. Cellulose structure (crystalline region and amorphous region)
In nature, as shown in FIG. 3, cellulose molecular chains exist in the form of bundles in which several cellulose molecules are gathered. This is called CMF, and its width and length vary depending on the biological origin. In CMF, cellulose molecular chains are regularly arranged, and adjacent molecular chains are connected by hydrogen bonds, van der Waals forces, etc. to form a strong three-dimensional structure. Thus, in a state where the molecular chains are regularly arranged (crystal), the endoglucanase cannot carry the cellulose molecule, and therefore the β- (1,4) -glucoside bond cannot be hydrolyzed. On the other hand, there is a region (amorphous region) in which the regularity of the molecular chain is low (low orientation) due to deformation due to strong external force and nonuniformity of the length of the cellulose molecular chain (Fig. 4).
In such a region, hydrogen bonds are sparse and cellulose molecular chains are loosened, and endoglucanase can entrap cellulose molecular chains and hydrolyze β- (1,4) -glucoside bonds. Cellulose microfibrils have a mixture of crystal regions and amorphous regions, and the larger the CMF, the higher the proportion of crystal regions (the higher the degree of crystallinity).
C. The structure of Avicel and squirt cellulose The Avicel used in the experimental example of the present invention was obtained by acid hydrolysis of wood pulp and cotton cellulose to remove the amorphous region, grinding and drying, and CMF aggregated during drying. Is in state.
On the other hand, squirt cellulose is obtained by separating and purifying the cellulose, and then hydrolyzing the acid to remove the amorphous part, and there is little aggregation of CMF, and it is considered that most of it consists of a crystalline region.
D. Fibrilization of CMF by physical destruction by stirring or the like and hydrolysis by endoglucanase (see FIG. 5) CMF has a high degree of crystallinity, and endoglucanase can hardly act. However, when the CMF suspension is agitated, physical destruction partially occurs due to contact between the CMF and the stirrer or between the CMFs. This portion is a state where the regular orientation of the cellulose molecular chain is lowered, that is, an amorphous region, and the amorphous region can be removed by the action of endoglucanase. By repeating such physical destruction and degradation by endoglucanase, fibrillation (fragmentation, fragmentation) of microfibrils gradually proceeds.
上記本願発明によれば、既存の製造法と比べ、高結晶性セルロースナノファイバーを特別な装置を必要とせず、温和な条件で効率的に生産することが可能となる。 According to the invention of the present application, it is possible to efficiently produce highly crystalline cellulose nanofibers under mild conditions without requiring a special apparatus as compared with the existing production method.
本願発明に係るセルロースナノファイバーは、繊維幅数ｎｍのナノファイバーであり、懸濁状態では優れた粘性を示すことから、各種増粘剤、コーティング剤、保湿剤等の広範な利用価値が期待される。さらに高い結晶化度を有しており、新規な微細繊維材料として期待できる。 The cellulose nanofiber according to the present invention is a nanofiber having a fiber width of several nanometers, and exhibits excellent viscosity in a suspended state. Therefore, a wide range of utility values such as various thickeners, coating agents, and moisturizing agents are expected. The Furthermore, it has a high crystallinity and can be expected as a novel fine fiber material.
本願発明はセルロースを原料に撹拌により、そのＣＭＦの凝集体もしくはＣＭＦそのものの一部に物理的な緩みを起こしつつ、エンドグルカナーゼを作用させることにより、高結晶性のセルロースナノファイバーを効率よく得ることを特徴としている。 The present invention can efficiently obtain highly crystalline cellulose nanofibers by causing endoglucanase to act while agitation of cellulose as a raw material and causing physical loosening of the CMF aggregate or part of CMF itself. It is characterized by.
本願発明で使用する原料は、セルロースであれば特に制限はなく、例えば、木材、綿などの高等植物セルロース、微生物が産生するセルロース（例えば、酢酸菌が産生するバクテリアセルロース）、原索動物（ホヤ）のセルロース、海藻が有するセルロース等が含まれる。 The raw material used in the present invention is not particularly limited as long as it is cellulose. For example, higher plant cellulose such as wood and cotton, cellulose produced by microorganisms (for example, bacterial cellulose produced by acetic acid bacteria), protozoa (squirt) ) Cellulose, cellulose contained in seaweed, and the like.
上記セルロース原料の結晶化度は、最終的に製造されるセルロースナノファイバーの結晶化度に影響する。すなわち高結晶性セルロースを原料とすると、高い結晶化度を有するセルロースナノファイバーを製造することができる。一方、長いフィブリルを有するセルロース原料を用いると、高い粘性を有するセルロースナノファイバー懸濁液を得ることができる。これらのセルロースは、０.１−２０重量％程度で用いられる。 The crystallinity of the cellulose raw material affects the crystallinity of the cellulose nanofiber that is finally produced. That is, when highly crystalline cellulose is used as a raw material, cellulose nanofibers having a high degree of crystallinity can be produced. On the other hand, when a cellulose raw material having long fibrils is used, a cellulose nanofiber suspension having high viscosity can be obtained. These celluloses are used at about 0.1 to 20% by weight.
本願発明において、その用いる酵素、エンドグルカナーゼ（ＥＣ3.2.1.4）は、さまざまな微生物、植物、動物に由来し、セルロースなどのβ-(1,4)-グルコシド結合を非プロセッシブ型に加水分解する反応を触媒する。エンドグルカナーゼとしては精製酵素の他、該酵素を含む微生物菌体や培養液などの粗酵素を利用することができるが、セロビオハイドロラーゼの混入は、その結晶性セルロースを効率的に分解する性質上、生成したセルロースナノファイバーを更に分解するため収量低下を招く。したがって、本願発明において用いる酵素にセロビオハイドロラーゼが含まれる場合には、これを極力除去しておくことが望ましい。なおセロビオハイドロラーゼの除去は各種クロマトグラフィー等で達成することができ、セロビオハイドロラーゼが含まれないことは、結晶性セルロース（例えばアビセル）を分解する活性がほとんどないことで確認することができる。 In the present invention, the enzyme used, endoglucanase (EC 3.2.1.4) is derived from various microorganisms, plants and animals, and hydrolyzes β- (1,4) -glucoside bonds such as cellulose into non-processive forms. To catalyze the reaction. As endoglucanase, crude enzymes such as microbial cells and culture solutions containing the enzyme can be used in addition to the purified enzyme, but the contamination of cellobiohydrolase effectively decomposes the crystalline cellulose. In addition, the yield of the cellulose nanofibers is further degraded due to further degradation. Therefore, when cellobiohydrolase is included in the enzyme used in the present invention, it is desirable to remove it as much as possible. The removal of cellobiohydrolase can be achieved by various types of chromatography, and the absence of cellobiohydrolase can be confirmed by the fact that there is little activity to decompose crystalline cellulose (eg, Avicel). it can.
上記の反応に係る酵素、エンドグルカナーゼの使用比率は、原料のセルロース１ｍｇに対して０.００１-１０単位である。なお、酵素活性の単位は、４０℃において０.５％のカルボキシメチルセルロースナトリウム塩（置換度０.７０）存在下で、１分間に還元糖を１μｍｏｌ生成する酵素量を１単位と定義する。 The ratio of the enzyme and endoglucanase used in the above reaction is 0.001-10 units per 1 mg of the raw material cellulose. The unit of enzyme activity is defined as 1 unit of the amount of enzyme that produces 1 μmol of reducing sugar per minute in the presence of 0.5% carboxymethylcellulose sodium salt (substitution degree 0.70) at 40 ° C.
本願発明の酵素反応は、ＣＭＦに物理的な緩みが生じ得る条件下で実施する必要があり、例えば反応懸濁液に撹拌子を入れ、スターラーで撹拌することで実施することができる。ｐＨと温度は使用する酵素の至適範囲内でコントロールすれば良い。反応系にウシ血清アルブミン、グリセロール、メルカプトエタノール等の安定剤を加えることによって、反応系を安定させることができる。反応時間はセルロース原料の種類や反応条件により異なるが、長時間の反応は収量の低下を招くため、数時間から数十時間程度反応させれば十分である。 The enzyme reaction of the present invention needs to be carried out under conditions that may cause physical looseness in CMF. For example, it can be carried out by putting a stirring bar into the reaction suspension and stirring with a stirrer. The pH and temperature may be controlled within the optimum range of the enzyme used. The reaction system can be stabilized by adding a stabilizer such as bovine serum albumin, glycerol, or mercaptoethanol to the reaction system. Although the reaction time varies depending on the type of cellulose raw material and the reaction conditions, a long-time reaction leads to a decrease in yield, so it is sufficient to react for several hours to several tens of hours.
上記反応によりセルロース原料はフィブリル化し、元の結晶性を維持したセルロースナノファイバーを含む反応懸濁液を得ることが出来る。この反応懸濁液中には、少量のセロオリゴ糖が含有されるが、必要に応じて遠心分離やガラスフィルターによる濾過などの分離手段により、セルロースナノファイバーのみを集め、水洗を繰り返すことにより精製セルロースナノファイバーを得ることができる。 このように本願発明は、特別な装置を必要とすることなく，温和な条件でセルロースナノファイバーを高収率で得ることが出来るという優れた特徴を有している。 The cellulose raw material is fibrillated by the above reaction, and a reaction suspension containing cellulose nanofibers maintaining the original crystallinity can be obtained. This reaction suspension contains a small amount of cellooligosaccharide. If necessary, only cellulose nanofibers are collected by separation means such as centrifugation or filtration through a glass filter, and purified cellulose is repeatedly washed with water. Nanofibers can be obtained. Thus, this invention has the outstanding characteristic that a cellulose nanofiber can be obtained with a high yield on mild conditions, without requiring a special apparatus.
以下、実施例に従って本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
実施例１（アビセルを用いたセルロースナノファイバーの製造）エンドグルカナーゼについてマツノザイセンチュウBursaphelenchus
xylophilusより取得したエンドグルカナーゼの遺伝子を酵母で発現させた組換え酵素BxENGと市販酵素であるメイセラーゼ（Meicelase CEPB-10，明治製菓）から調製した酵素EGIIの二種類を用いた。BxENGはＧＨファミリー４５に属する触媒ドメインのみからなるのに対し、EGIIはＧＨファミリー５に属する触媒ドメインの他に不溶性セルロースに結合するためのセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を具備している。
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail according to an Example, this invention is not limited by this.
Example 1 (Production of cellulose nanofibers using Avicel) Endoglucanase Pine pine nematode Bursaphelenchus
Two kinds of enzymes, EGII prepared from a recombinant enzyme BxENG in which the endoglucanase gene obtained from xylophilus was expressed in yeast and a commercially available enzyme, Meicelase CEPB-10 (Meiji Seika) were used. BxENG consists of only the catalytic domain belonging to GH family 45, while EGII has a cellulose binding module (CBM) for binding to insoluble cellulose in addition to the catalytic domain belonging to GH family 5.
BxENGの調製
BxENGをコードする遺伝子が導入された発現ベクターにはpGAPZαA（Invitrogen社）を用い、これらを酵母で発現させる際の宿主にはPichia pastoris X-33（Invitrogen社）を用いた。指示書に従いエレクトロポレーション法により酵母へ組換えベクターを導入し、形質転換体を獲得した。形質転換酵母は５００ｍｌのＹＰＤ液体培地で２８℃、９６時間振盪培養し、培養終了後、遠心分離して得た上澄液を限外濾過濃縮（分画分子量５,０００）した。
Preparation of BxENG
PGAPZαA (Invitrogen) was used as an expression vector into which a gene encoding BxENG was introduced, and Pichia pastoris X-33 (Invitrogen) was used as a host for expressing them in yeast. A recombinant vector was introduced into yeast by electroporation according to the instructions to obtain a transformant. The transformed yeast was cultured with shaking in 500 ml of YPD liquid medium at 28 ° C. for 96 hours, and after completion of the culture, the supernatant obtained by centrifugation was concentrated by ultrafiltration (fractionated molecular weight: 5,000).
この濃縮液に２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３.８）を加えて濃縮を繰り返し、同緩衝液で平衡化した。この処理液を同緩衝液で平衡化したMonoS 10/100カラム（GE Healthcare社製）に通し、吸着させた。次いで、同緩衝液でカラムを洗浄した後、食塩０Ｍ-１Ｍを含む同緩衝液のリニアグラジエントによりエンドグルカナーゼを溶出した。 A 20 mM acetate buffer (pH 3.8) was added to this concentrated solution, and concentration was repeated, and equilibrated with the same buffer. This treatment solution was passed through a MonoS 10/100 column (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with the same buffer solution and adsorbed. Next, the column was washed with the same buffer, and then endoglucanase was eluted with a linear gradient of the same buffer containing 0 M-1M of sodium chloride.
このエンドグルカナーゼを含む画分を集めて濃縮後、食塩０.１５Ｍを含む同緩衝液で平衡化したSephacrylS-200 16/60カラム（GE Healthcare社製）に通し、溶出したエンドグルカナーゼ画分を集めた。こうして得られたエンドグルカナーゼ(BxENG)の総酵素活性は７３単位であった。 This endoglucanase-containing fraction was collected and concentrated, and then passed through a Sephacryl S-200 16/60 column (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with the same buffer containing 0.15 M sodium chloride to collect the eluted endoglucanase fraction. It was. The total enzyme activity of thus obtained endoglucanase (BxENG) was 73 units.
EGIIの調製
メイセラーゼ１.５gを１５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）に溶解し、同緩衝液で平衡化したHiTrap Q HPカラム（GE Healthcare社製）に通し、吸着せずに溶出したエンドグルカナーゼ画分を集めた。この溶出液を限外濾過濃縮（分画分子量５,０００）し、さらに蒸留水を加えて濃縮を繰り返した後、凍結乾燥した。
Preparation of EGII 1.5 g of Mecellase dissolved in 15 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), passed through a HiTrap Q HP column (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with the same buffer, and endoglucanase eluted without adsorption. Fractions were collected. This eluate was concentrated by ultrafiltration (fraction molecular weight: 5,000), distilled water was further added, and concentration was repeated, followed by lyophilization.
この凍結乾燥粉末を硫酸アンモニウム２Ｍを含む１５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.０）に溶解し、同緩衝液で平衡化したPhenyl Sepharose HPカラム（GE Healthcare社製）に通し、吸着させた。次いで、同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム２Ｍ-０Ｍを含む同緩衝液のリニアグラジエントによりエンドグルカナーゼを溶出した。この溶出液を限外濾過濃縮（分画分子量５,０００）し、さらに蒸留水を加えて濃縮を繰り返した後、凍結乾燥し５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４.５）に溶解した。こうして得られたエンドグルカナーゼ(EGII)の総酵素活性は４９単位であった。 This lyophilized powder was dissolved in 15 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 2 M ammonium sulfate, passed through a Phenyl Sepharose HP column (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with the same buffer, and adsorbed. Next, the column was washed with the same buffer, and then endoglucanase was eluted with a linear gradient of the same buffer containing ammonium sulfate 2M-0M. This eluate was concentrated by ultrafiltration (fractionated molecular weight: 5,000), further concentrated by adding distilled water, freeze-dried, and dissolved in 50 mM acetate buffer (pH 4.5). The total enzyme activity of endoglucanase (EGII) thus obtained was 49 units.
２ｍｌ容のテストチューブに５０ｍＭ酢酸緩衝液（BxENG使用時はｐＨ５．８、EGII使用時はｐＨ４.０に調製）１ｍｌ、アビセル（ＰＨ１０１）１０ｍｇ、各エンドグルカナーゼ０.２単位、ウシ血清アルブミン１ｍｇからなる反応懸濁液を調製し、酵素作用促進処理を施して対象の酵素浸透性を確保した。すなわち、撹拌子（１０ｍｍ×φ４ｍｍ）を加え、スターラーで撹拌しながら（２００ｒｐｍ）４０℃で７２時間、反応させた。比較対照として、エンドグルカナーゼ無添加の反応懸濁液を調製し、合わせて実施した。 1 ml of 50 mM acetate buffer (pH 5.8 when using BxENG, pH 4.0 when using EGII), 10 mg Avicel (PH101), 0.2 units of each endoglucanase, 1 mg of bovine serum albumin in a 2 ml test tube A reaction suspension was prepared and subjected to enzyme action promotion treatment to ensure the target enzyme permeability. That is, a stirring bar (10 mm × φ4 mm) was added, and the mixture was reacted at 40 ° C. for 72 hours while stirring with a stirrer (200 rpm). As a comparative control, a reaction suspension without endoglucanase was prepared and combined.
反応終了後、残渣を遠心分離により回収し、水洗後、凍結乾燥し、セルロースナノファイバー８.７ｍｇ（BxENG使用時）を得た。
透過型電子顕微鏡により形態を観察し、その結果を図６から図８に示す。
アビセルはその製法上酸加水分解処理および乾燥処理によってＣＭＦの凝集が生じ、塊状になっている。これらの図より、撹拌操作のみでエンドグルカナーゼ無添加の場合、凝集した塊のフィブリル化は生じないが（図６参照）、エンドグルカナーゼを添加することにより凝集がほどけ、個々のＣＭＦがバラバラになり、セルロースナノファイバーの生成を確認した（図７および図８参照）。 さらに、エンドグルカナーゼとしてBxENG、EGIIのどちらを用いてもセルロースナノファイバーの生成を確認したことから、エンドグルカナーゼはＣＢＭの有無やＧＨファミリーの違いに関わらず用いることができることを確認した。
After completion of the reaction, the residue was collected by centrifugation, washed with water, and lyophilized to obtain 8.7 mg of cellulose nanofiber (when using BxENG).
The morphology was observed with a transmission electron microscope, and the results are shown in FIGS.
Avicel is agglomerated because CMF aggregates due to acid hydrolysis and drying due to its production method. From these figures, when the endoglucanase is not added only by stirring operation, fibrillation of the aggregated mass does not occur (see FIG. 6), but the aggregation is released by adding endoglucanase, and individual CMFs are separated. The production of cellulose nanofibers was confirmed (see FIGS. 7 and 8). Furthermore, since the production of cellulose nanofibers was confirmed using either BxENG or EGII as the endoglucanase, it was confirmed that endoglucanase can be used regardless of the presence or absence of CBM and the difference in GH family.
実施例２（ホヤセルロースを用いたセルロースナノファイバーの製造）
ホヤセルロースは、ホヤの皮のうをｐＨ４.９の酢酸緩衝液で緩衝化した０.３％亜塩素酸ナトリウム溶液で８０℃、２時間処理し、水洗後５％水酸化カリウム溶液に室温で１晩浸せきした後，水洗するという操作を数回繰り返して精製し、ホモジナイザーで粉砕後、凍結乾燥した。この試料を２.５Ν塩酸で１時間煮沸した後水洗し、微結晶セルロースを得た。
Example 2 (Production of cellulose nanofibers using squirt cellulose)
The squirt cellulose is treated with a 0.3% sodium chlorite solution buffered with a pH 4.9 acetic acid buffer solution at 80 ° C. for 2 hours, washed with water, and then washed with a 5% potassium hydroxide solution at room temperature. After soaking overnight, the operation of washing with water was repeated several times for purification, pulverization with a homogenizer, and lyophilization. This sample was boiled with 2.5% hydrochloric acid for 1 hour and then washed with water to obtain microcrystalline cellulose.
２ｍｌ容のテストチューブに５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５.８）１ｍｌ、ホヤの微結晶セルロース１０ｍｇ、エンドグルカナーゼ(BxENG)０.２単位、ウシ血清アルブミン１ｍｇからなる反応懸濁液を調製して酵素作用促進処理を施して対象の酵素浸透性を確保した。すなわち、撹拌子（１０ｍｍ×φ４ｍｍ）を加え、スターラーで撹拌しながら（２００ｒｐｍ）４０℃で７２時間、反応させた。比較対照として、エンドグルカナーゼ無添加のサンプルついても調製し、合わせて実施した。 Prepare a reaction suspension consisting of 1 ml of 50 mM acetate buffer (pH 5.8), 10 mg of sea squirt microcrystalline cellulose, 0.2 unit of endoglucanase (BxENG), and 1 mg of bovine serum albumin in a 2 ml test tube. Accelerated treatment was applied to ensure the target enzyme permeability. That is, a stirring bar (10 mm × φ4 mm) was added, and the mixture was reacted at 40 ° C. for 72 hours while stirring with a stirrer (200 rpm). As a comparative control, a sample without endoglucanase was also prepared and combined.
反応終了後、残渣を遠心分離により回収し、水洗後、凍結乾燥し、セルロースナノファイバー９．１ｍｇを得た。
次いで、Ｘ線回折により結晶化度を測定し、その結果を次の表１に示す。この表１は、反応条件がホヤセルロースの結晶化度に及ぼす影響を示している。
After completion of the reaction, the residue was collected by centrifugation, washed with water, and lyophilized to obtain 9.1 mg of cellulose nanofibers.
Next, the crystallinity was measured by X-ray diffraction, and the results are shown in Table 1 below. Table 1 shows the effect of reaction conditions on the crystallinity of squirt cellulose.
上記表１に示す通り、撹拌操作によってホヤセルロースの結晶化度は１０％程度低下するが、エンドグルカナーゼを反応懸濁液に添加することにより、結晶化度が増加し、高い結晶化度を維持していることが確認できた。
撹拌とエンドグルカナーゼの作用によって生成したセルロースナノファイバーを透過型電子顕微鏡により形態を観察した。図９はその結果を示すものである。本願発明の製造法により、ホヤセルロースのＣＭＦに長軸方向に沿って割れが入り、細いフィブリルが生じていることを観察した。ホヤセルロース由来のセルロースナノファイバーの幅は４-６ｎｍのものが多く生成し、ホヤセルロース本来のＣＭＦ（１０-１５ｎｍ）よりも細くなっていることを確認した。一方、そのセルロースナノファイバーの長さは１μｍ程度であり、懸濁液は高い粘度を呈した。
As shown in Table 1 above, the crystallinity of squirt cellulose is reduced by about 10% by the stirring operation, but by adding endoglucanase to the reaction suspension, the crystallinity increases and maintains a high crystallinity. I was able to confirm.
The morphology of cellulose nanofibers produced by stirring and the action of endoglucanase was observed with a transmission electron microscope. FIG. 9 shows the result. According to the production method of the present invention, it was observed that cracks occurred in the CMF of squirt cellulose along the major axis direction, and thin fibrils were generated. It was confirmed that many cellulose nanofibers derived from squirt cellulose were 4-6 nm in width and were thinner than squirt cellulose original CMF (10-15 nm). On the other hand, the length of the cellulose nanofiber was about 1 μm, and the suspension exhibited a high viscosity.
Claims (7)
（イ） 緩衝液、セルロース、セルロース分解酵素、反応安定剤等からなる反応懸濁液を調製する工程、
（ロ） 反応懸濁液中のセルロースに酵素作用促進処理をなすことによりセルロースミクロフィブリルの凝集体および／またはセルロースミクロフィブリルにおける結晶領域の配向の乱れを生じさせて前記セルロースに酵素浸透性を確保する工程、
（ハ） 前記工程（ロ）に次いで、又はこれに併せて酵素浸透性を得たセルロースにセルロース分解酵素が作用して、セルロースミクロフィブリルの凝集体を解きほぐし、および／又はセルロースミクロフィブリルを細裂させて、所定のセルロースナノファイバーを反応懸濁液中に生成する工程。 A method for producing cellulose nanofiber comprising the following steps.
(A) preparing a reaction suspension comprising a buffer solution, cellulose, cellulolytic enzyme, reaction stabilizer, etc.
(B) Enzyme action is promoted on the cellulose in the reaction suspension to produce aggregates of cellulose microfibrils and / or disorder in the orientation of crystal regions in the cellulose microfibrils to ensure enzyme permeability in the cellulose. The process of
(C) Subsequent to or in conjunction with the step (b), the cellulose-degrading enzyme acts on cellulose that has obtained enzyme permeability, so as to break up the aggregates of the cellulose microfibrils and / or break the cellulose microfibrils. And producing a predetermined cellulose nanofiber in the reaction suspension.
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