JP2008141996A

JP2008141996A - Method for producing s-substituted l-cysteine derivative by fermentation method

Info

Publication number: JP2008141996A
Application number: JP2006331975A
Authority: JP
Inventors: Kiyoshi Toda; 清戸田; Kazumi Araki; 和美荒木
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2006-12-08
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2008-06-26

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an economically advantageous method for producing an S-substituted L-cysteine derivative, on which expectation of the applications as a medical drug for health, or preservative and food additive are placed. <P>SOLUTION: The method for producing the S-substituted L-cysteine derivative includes a microorganism requiring L-methionine and L-cysteine for growth, which is cultured in a fermentation culture medium, and an organic compound having a mercapto group is added to the culture medium and the microorganism is cultured, to thereby accumulate a considerable amount of the S-substituted L-cysteine derivative, corresponding to the organic compound having a mercapto group and added to the fermentation product and the fermentation liquid. A method for sampling the S-substituted L-cysteine derivative is provided. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、発酵法によるS位置換Ｌ-システイン誘導体の製造法に関する。これらは医薬、健康保健薬あるいは食品添加物としての用途が期待される物質であり、また医薬品の合成原料としての用途も期待される物質である。 The present invention relates to a method for producing an S-position substituted L-cysteine derivative by fermentation. These are substances that are expected to be used as pharmaceuticals, health-care drugs or food additives, and are also expected to be used as synthetic raw materials for pharmaceuticals.

発酵法によるS位置換Ｌ-システイン誘導体の製造方法としては、炭素源、窒素源、硫黄源その他微生物の生育に必要な栄養素を含む発酵培地に少なくともＬ-メチオニンを生育に必要とする微生物を培養し、発酵の当初または途中で発酵培地にメルカプト基（-SH基）を有する有機化合物を添加することにより、添加したメルカプト基を有する有機化合物に対応するS位置換Ｌ-システイン誘導体を発酵物および発酵液中に生成・蓄積せしめる、本発明者らの発明にかかる方法が知られていた（特許文献１）。 As a method for producing an S-substituted L-cysteine derivative by fermentation, a microorganism that requires at least L-methionine for growth is cultured in a fermentation medium containing a carbon source, nitrogen source, sulfur source and other nutrients necessary for the growth of the microorganism. Then, by adding an organic compound having a mercapto group (-SH group) to the fermentation medium at the beginning or in the middle of fermentation, the S-substituted L-cysteine derivative corresponding to the added organic compound having a mercapto group is converted into a fermented product and There has been known a method according to the inventors' invention which is produced and accumulated in a fermentation broth (Patent Document 1).

しかし、従来のＬ-メチオニン単独要求性変異株を用いる方法ではS位置換Ｌ-システイン誘導体の他にS位置換Ｌ-ホモシステイン誘導体が発酵物もしくは発酵液中に同時に蓄積する。発酵物もしくは発酵液からS位置換Ｌ-システイン誘導体を単離する途上で、性質が良く似ているS位置換Ｌ-ホモシステイン誘導体を除去することは難しく、それを解決する方法の開発が望まれていた。
特開２００４−２２２５１８号 However, in the conventional method using an L-methionine-requiring mutant, an S-position-substituted L-homocysteine derivative is simultaneously accumulated in a fermentation product or fermentation broth in addition to the S-position-substituted L-cysteine derivative. In the process of isolating S-substituted L-cysteine derivatives from fermented products or fermentation broth, it is difficult to remove S-substituted L-homocysteine derivatives having similar properties, and it is hoped to develop a method for solving them. It was rare.
JP 2004-222518 A

本発明者らは、安価な糖源、窒素源、硫黄源、その他微量の栄養源を含む通常の発酵培地に好適な微生物を常法により培養し、発酵の最初からあるいはその途中で培地にメルカプト基を有する有機化合物を添加し、発酵物および発酵培地に著量のS位置換Ｌ-システイン誘導体を蓄積させる発酵法によるS位置換Ｌ-システイン誘導体の製造法において、少なくともＬ-メチオニンの他にL-システイン（もしくはL-シスチン）も同時に生育に要求する微生物を用いることにより、S位置換Ｌ-システイン誘導体を優先的に発酵物もしくは発酵液中に蓄積させ、S位置換Ｌ-ホモシステイン誘導体の蓄積を抑制することが出来ることを見出した。 The inventors of the present invention cultivated microorganisms suitable for a normal fermentation medium containing an inexpensive sugar source, nitrogen source, sulfur source, and other trace nutrients by a conventional method, and the mercapto was added to the medium from the beginning or during the fermentation. In the method for producing an S-substituted L-cysteine derivative by a fermentation method in which an organic compound having a group is added and a significant amount of the S-substituted L-cysteine derivative is accumulated in the fermentation product and fermentation medium, at least in addition to L-methionine By using a microorganism that also requires L-cysteine (or L-cystine) to grow at the same time, the S-position-substituted L-cysteine derivative is preferentially accumulated in the fermentation product or fermentation broth, and the S-position-substituted L-homocysteine derivative It has been found that the accumulation of can be suppressed.

分離が難しいS位置換Ｌ-ホモシステイン誘導体を発酵物もしくは発酵液から分離する必要が無くなることより、品質が向上し、コスト的にも安価にS位置換Ｌ-システイン誘導体を生産することが出来る。 Since it is not necessary to separate the difficultly separated S-substituted L-homocysteine derivative from the fermentation product or fermentation broth, the quality is improved and the S-substituted L-cysteine derivative can be produced at low cost. .

本発明の方法によれば安価な糖源、窒素源、硫黄源、その他微量の栄養源をほどよく含む通常の発酵培地に好適な微生物を培養するに際して、培地にメルカプト基を有する有機化合物を添加すると、発酵物あるいは発酵培地にS位置換Ｌ-システイン誘導体が著量生成・蓄積する。
添加するメルカプト基を有する有機化合物を一般式（１）
RSH （１）
で表した場合（式中、Ｒは少なくとも炭素を含む化合物であり、炭素以外に他の元素例えば窒素、燐、硫黄、ハロゲンなどを含んでいても良い。）、発酵物および発酵液に生成・蓄積するS位置換Ｌ-システイン誘導体は一般式（２）
(L)-HOOCCH(NH₂)CH₂SR （２）
で表される（式中、Ｒは前記と同じ）。 According to the method of the present invention, an organic compound having a mercapto group is added to a medium when cultivating a microorganism suitable for a normal fermentation medium containing moderately low sugar sources, nitrogen sources, sulfur sources, and other trace nutrients. Then, a significant amount of L-cysteine derivative substituted at the S position is generated and accumulated in the fermented product or fermentation medium.
The organic compound having a mercapto group to be added is represented by the general formula (1)
RSH (1)
(Wherein R is a compound containing at least carbon, and may contain other elements such as nitrogen, phosphorus, sulfur, halogen, etc. in addition to carbon). Accumulated S-substituted L-cysteine derivatives are represented by the general formula (2)
(L) -HOOCCH (NH ₂ ) CH ₂ SR (2)
(Wherein, R is the same as above).

本発明で使用する微生物としては、細菌類、始原菌類、真菌類のいずれの微生物も利用できる。代表例として大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミクム、バチルス属細菌、サッカロミセス・セレビシエー、アスペルギルス属菌類等に属する微生物があげられる。 As the microorganism used in the present invention, any microorganism of bacteria, primordial fungi, and fungi can be used. Representative examples include microorganisms belonging to Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus bacteria, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus fungi and the like.

使用微生物としては例えば大腸菌の変異株が好適である。変異株としては、例えば生育に少なくともL-メチオニンと、L-システインおよび／またはL-シスチンを要求する変異株が好適である。ここで或るアミノ酸を生育に要求するとは、微生物を該アミノ酸を含まない合成培地で培養した時に、生育しないことをいう。この要求性はアミノ酸生合成系酵素に変異が入ったものでもよいし、遺伝子組換え技術を利用して薬剤耐性遺伝子などの挿入により遺伝子を破壊したものでも良く、漏出型（リーキー型）であってもよい。 For example, a mutant strain of E. coli is suitable as the microorganism used. As the mutant, for example, a mutant that requires at least L-methionine and L-cysteine and / or L-cystine for growth is suitable. Here, “requiring a certain amino acid for growth” means that the microorganism does not grow when it is cultured in a synthetic medium not containing the amino acid. This requirement may be a mutation in an amino acid biosynthetic enzyme, or a gene that has been disrupted by insertion of a drug resistance gene using genetic recombination technology, and is a leaky type. May be.

このＬ-メチオニン要求性はL-メチオニンの他に、DL-メチオニン、D-メチオニンによって満たされことがある。また、これらのメチオニン類の他に、L-ホモシステイン、DL-ホモシステイン、L-ホモシスチン、DL-ホモシスチン、ホモシステインチオラクトンのどれかによっても満たされることがある。また、その要求性が上記のメチオニン類では満たされるがホモシステイン類やホモシスチン類では満たされないこともある。 This L-methionine requirement may be satisfied by DL-methionine and D-methionine in addition to L-methionine. In addition to these methionines, it may be satisfied by any of L-homocysteine, DL-homocysteine, L-homocystine, DL-homocystine, and homocysteine thiolactone. In addition, the requirement may be satisfied by the above methionines, but may not be satisfied by homocysteines or homocystins.

またL-システインおよび／またはL-シスチン要求性は、硫化水素（もしくはその塩類）、亜硫酸塩類、チオ硫酸塩類のいずれか一つによって代替される場合がある。 In addition, L-cysteine and / or L-cystine requirement may be replaced by any one of hydrogen sulfide (or its salts), sulfites, and thiosulfates.

さらに、本発明に使用する微生物としては、各種の薬剤（例えばアミノ酸の構造類似体、アミノ酸生合成や核酸生合成の中間体の構造類似体、ビタミン類の構造類似体）に耐性または感受性の性質を持つものが使用される。そして、これらの薬剤耐性と薬剤感受性の性質と上記の栄養要求性の性質の両方を合わせてもつ微生物であっても良い。 Furthermore, the microorganisms used in the present invention are resistant or sensitive to various drugs (for example, structural analogs of amino acids, structural analogs of amino acid biosynthesis and nucleic acid biosynthesis, and structural analogs of vitamins). The one with is used. A microorganism having both of these drug resistance and drug sensitivity properties and the above-mentioned auxotrophic properties may be used.

さらに、本発明に使用する微生物としては、セリン-O-アセチル転移酵素やO-アセチルセリンスルフヒドラーゼ等のシステイン生合成経路の酵素類がL-システインのフィードバック調節に対して耐性になった微生物あるいはホモセリンサクシニル転移酵素やシスタチオニン・ガンマ・シンターゼのようなメチオニン合成酵素類がL-メチオニンあるいはその誘導体のフィードバック調節に対して耐性になった微生物、あるいはその両方の性質の微生物が使用できる。そして、これらのフィードバック調節に対する耐性の性質と、上述の栄養要求性、薬剤耐性あるいは薬剤感受性の性質とを合わせてもつ微生物であっても良い。 Furthermore, as microorganisms used in the present invention, enzymes in the cysteine biosynthetic pathway such as serine-O-acetyltransferase and O-acetylserine sulfhydrase have become resistant to L-cysteine feedback regulation. Microorganisms, microorganisms in which methionine synthases such as homoserine succinyltransferase and cystathionine / gamma / synthase have become resistant to feedback regulation of L-methionine or its derivatives, or microorganisms having both properties can be used. A microorganism having both the resistance property to the feedback regulation and the above-described nutritional requirement, drug resistance, or drug sensitivity property may be used.

さらに、これらの酵素類が遺伝子工学的手法で増強あるいは欠損せしめた組換え株であってもよい。 Furthermore, a recombinant strain in which these enzymes are enhanced or deleted by genetic engineering techniques may be used.

本発明に使用する微生物の代表例として大腸菌に属し、生育に少なくともL-メチオニンまたはL-ホモシステインまたはL-ホモシスチンを要求する変異株Escherichia coli metC/cys (FERM P-21078)をあげることができる。 A representative example of the microorganism used in the present invention is Escherichia coli metC / cys (FERM P-21078), which belongs to Escherichia coli and requires at least L-methionine or L-homocysteine or L-homocystine for growth. .

本菌株は、L-メチオニン、DL-メチオニン、D-メチオニン、DL-ホモシステインまたはL-ホモシステインのうちいずれか１つの化合物と、L-システイン、L-シスチン、硫化水素もしくはその塩類、亜硫酸塩類、チオ硫酸塩類のうちいずれか１つの化合物の両方を生育に必要とする変異株であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター中央第6）に前記受託番号で寄託されている（寄託日：平成18年10月31日）。 This strain comprises any one of L-methionine, DL-methionine, D-methionine, DL-homocysteine or L-homocysteine, L-cysteine, L-cystine, hydrogen sulfide or its salts, sulfites , A mutant strain that requires both one of the thiosulfate compounds for growth. National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (Tsukuba Center, 1-1-1 Higashi Tsukuba, Ibaraki) 6) is deposited with the deposit number (deposit date: October 31, 2006).

本発明に使用する発酵培地としては、炭素源、窒素源、硫黄源、無機塩類その他の栄養物を程良く含有しかつメルカプト基を有する有機化合物を含む培地ならば合成培地、天然培地のいずれでも使用できる。 The fermentation medium used in the present invention may be any of a synthetic medium and a natural medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, a sulfur source, inorganic salts and other nutrients and contains an organic compound having a mercapto group. Can be used.

炭素源としては、使用菌の利用可能なものであればいずれを用いてもよい。例えば、グルコース、フラクトース、しょ糖、乳糖、マンノース、マルトース、廃糖蜜、または、でんぷん加水分解物等の炭水化物、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、または、キシリトール等の糖アルコール、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、シスチン、システイン、アラニン、プロリン、グリシン、トリプトファン、セリン、ホモセリン、または、スレオニン等のアミノ酸類、乳酸、ピルビン酸、酢酸、リンゴ酸、ギ酸、コハク酸、フマール酸、クエン酸、または、各種脂肪酸等の有機酸類、エタノール、プロパノール、ブタノール、または、メタノール等のアルコール類を単独あるいは組み合わせて使用できる。 Any carbon source may be used as long as the bacteria used can be used. For example, carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, lactose, mannose, maltose, molasses, starch hydrolysate, sugar alcohols such as glycerin, sorbitol, mannitol, or xylitol, aspartic acid, glutamic acid, lysine, cystine, Amino acids such as cysteine, alanine, proline, glycine, tryptophan, serine, homoserine, or threonine, organics such as lactic acid, pyruvic acid, acetic acid, malic acid, formic acid, succinic acid, fumaric acid, citric acid, or various fatty acids Acids, ethanol, propanol, butanol, or alcohols such as methanol can be used alone or in combination.

窒素源としては、硫酸アンモニウム、亜硫酸アンモニウム、硫化アンモニウム、チオ硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、または、炭酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、各種の有機酸アンモニウム塩、各種の硝酸塩類、アンモニア水、尿素等を単独あるいは組み合わせて使用できる。 Nitrogen sources include ammonium sulfate, ammonium sulfite, ammonium sulfide, ammonium thiosulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium phosphate, or inorganic ammonium salts such as ammonium carbonate, various organic acid ammonium salts, various nitrate salts, aqueous ammonia, urea Etc. can be used alone or in combination.

硫黄源としては、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、または、硫酸ナトリウム等の硫酸塩、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸カリウム、または、亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩、硫化アンモニウム、硫化カリウム、硫化ナトリウム、または、硫化水素等の硫化物、チオ硫酸塩類、メルカプタン、システイン、または、シスチン等のメルカプト化合物、その他の有機無機硫黄化合物を単独あるいは組み合わせて使用できる。 Sulfur sources such as ammonium sulfate, potassium sulfate or sodium sulfate, ammonium sulfite, potassium sulfite or sulfite such as sodium sulfite, sulfides such as ammonium sulfide, potassium sulfide, sodium sulfide or hydrogen sulfide Products, thiosulfates, mercaptans, cysteine, mercapto compounds such as cystine, and other organic inorganic sulfur compounds can be used alone or in combination.

使用菌の要求物質であるメチオニンおよびホモシステインは、L-型、D-型、DL-型のいずれでも、使用菌の利用できるものであれば単独あるいは組み合わせて利用できる。またこれらを含む天然または合成物質や、容易にこれらに変化しうる物質たとえばメチオニンのヒダントイン、ホモシスチン、ホモシステインチオラクトン等も使用できる。 Methionine and homocysteine, which are required substances for the bacteria used, can be used alone or in combination as long as the bacteria used can be used in any of L-type, D-type and DL-type. In addition, natural or synthetic substances containing them, and substances that can be easily changed to these substances, such as hydantoin of methionine, homocystin, homocysteine thiolactone, etc., can be used.

使用菌のもう一つの要求物質であるL-システイン、L-シスチン、およびそれらの生合成前駆物質（亜硫酸塩、硫化水素及びその塩類、チオ硫酸およびその塩類）は単独または組み合わせて使用できる。またこれらを含む天然または合成物質や、容易にこれらに変化しうる物質が使用できる。 L-cysteine, L-cystine, and their biosynthetic precursors (sulfite, hydrogen sulfide and salts thereof, thiosulfuric acid and salts thereof), which are other required substances of the bacteria used, can be used alone or in combination. In addition, natural or synthetic substances containing them, and substances that can be easily changed to these can be used.

これらの要求物質の使用量は、培地の組成やその他の培養条件によって異なるが、用いた培養条件下で、それらを充分量添加した場合の最大生育量に対して、50-90%程度の生育量が得られるように制限して供給することが望ましい。これらの要求物質は、培養の初期、あるいは培養の途中で分割あるいは一括して添加する事が出来る。 The amount of these required substances varies depending on the composition of the medium and other culture conditions, but the growth rate is about 50-90% of the maximum growth amount when sufficient amounts are added under the culture conditions used. It is desirable to supply in a limited quantity so as to obtain an amount. These required substances can be divided or added together in the initial stage of culture or in the middle of culture.

培養は振とう培養や通気撹拌培養等の好気的条件下で行われる。培養中培養液のpHは5~9に維持されるのが好適である。中和剤としては、アンモニア水、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、燐酸マグネシウム、水酸化カリウム、尿素等を単独であるいは組み合わせて使用できる。 The culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture and aeration and agitation culture. It is preferable that the pH of the culture solution is maintained at 5 to 9 during the culture. As the neutralizing agent, aqueous ammonia, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, calcium carbonate, magnesium phosphate, potassium hydroxide, urea, and the like can be used alone or in combination.

培養期間は通常3-7日間で、主として培養液中に著量のS位置換Ｌ-システイン誘導体が蓄積する。 The culture period is usually 3-7 days, and a significant amount of S-substituted L-cysteine derivatives accumulate mainly in the culture medium.

生成・蓄積するS位置換Ｌ-システイン誘導体は、培地に添加するメルカプト基を有する有機化合物の種類によって異なるが、添加するメルカプト基を有する有機化合物を一般式（１）
RSH （１）
で表した場合（式中、Ｒは少なくとも炭素を含む化合物であり、炭素以外に他の元素例えば窒素、燐、硫黄、ハロゲンなどを含んでいても良い。）、生成・蓄積するS位置換システイン誘導体は一般式（２）
(L)-HOOCCH(NH₂)CH₂SR （２）
で表される（式中、Ｒは前記と同じ）。 The S-substituted L-cysteine derivative produced / accumulated varies depending on the type of organic compound having a mercapto group added to the medium, but the organic compound having a mercapto group to be added is represented by the general formula (1).
RSH (1)
(Wherein R is a compound containing at least carbon, and may contain other elements such as nitrogen, phosphorus, sulfur, halogen, etc. in addition to carbon). The derivative is represented by the general formula (2)
(L) -HOOCCH (NH ₂ ) CH ₂ SR (2)
(Wherein, R is the same as above).

培地に添加するメルカプト基を有する有機化合物と生成・蓄積するS位置換Ｌ-システイン誘導体の例は表1に示す通りであるがこれに限定するものではない。 Examples of the organic compound having a mercapto group added to the medium and the S-position-substituted L-cysteine derivative to be produced / accumulated are as shown in Table 1, but are not limited thereto.

以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
（参考例）要求性の確認
大腸菌変異株FERM P-21078（本発明の使用菌）とその親株である大腸菌変異株FERM P-18891を、ブイヨン寒天培地にそれぞれ接種し37℃で一夜培養した。生育した菌体の一部を採取して、殺菌水2mlに懸濁し、1mlあたり約10^８個の細胞を含む細胞懸濁液をそれぞれ調製した。これらの細胞懸濁液0.1mlずつを、それぞれの菌株について４枚ずつの最少寒天培地｛グルコース 1%、硫酸アンモニウム 0.2%、KH₂PO₄ 0.15%、K₂HPO₄ 0.05%、MgSO₄・7H₂O 0.05%、FeSO₄・7H₂O 0.01%、MnSO₄・4H₂O 0.007%、NaCl 0.01%、無機塩類混液（１Ｌ中にCaCl₂・H₂O 5.3g、CoCl₂ 40mg、CuSO₄・5H₂O 40mg、H₃Bo₃ 30mg、Na₂MoO₄47ｍｇ、ZnSO₄・7H₂O 200mgを含む）を1ml/Lおよび寒天2%を含む培地、pH7｝30mlの基本組成の寒天平板培地とこの基本組成にL-メチオニン30μｇ/mlを加えた寒天平板培地の両方を用いて、それぞれの平板培地の片隅にシリンダーカップを置き、それぞれのカップの中にL-システイン2.5mg/ml）溶液、L-シスチン(2.5mg/ml)溶液、硫化ナトリウム(2.5mg/ml)溶液、亜硫酸ナトリウム（2.5mg/ml）溶液、チオ硫酸ナトリウム（2.5mg/ml）溶液または殺菌水（対照）をそれぞれ0.02mlづつ注入して、30℃で48時間静置培養した。 Specific examples of the present invention are shown below. However, the present invention is not limited to these examples.
(Reference Example) Confirmation of requirement Escherichia coli mutant FERM P-21078 (the bacterium used in the present invention) and its parent strain E. coli mutant FERM P-18891 were inoculated on a broth agar medium and cultured overnight at 37 ° C. A part of the grown cells was collected and suspended in 2 ml of sterilized water to prepare cell suspensions each containing about 10 ⁸ cells per ml. 0.1 ml of each of these cell suspensions, 4 pieces of each agar medium {glucose 1%, ammonium sulfate 0.2%, KH ₂ PO ₄ 0.15%, K ₂ HPO ₄ 0.05%, MgSO ₄ · 7H ₂ O 0.05%, FeSO ₄ · 7H ₂ O 0.01%, MnSO ₄ · 4H ₂ O 0.007%, NaCl 0.01%, inorganic salt mixture (CaCl ₂ · H ₂ O 5.3g in 1L, CoCl ₂ 40mg, CuSO ₄ · 5H ₂ O 40 mg, H ₃ Bo ₃ 30 mg, Na ₂ MoO ₄ 47 mg, ZnSO ₄ · 7H ₂ O 200 mg) (1 ml / L and agar 2%), agar plate with basic composition of pH 7} 30 ml and this Using both the agar plate medium supplemented with 30 μg / ml L-methionine in the basic composition, place a cylinder cup in one corner of each plate medium, and add L-cysteine 2.5 mg / ml solution in each cup, L -Cystine (2.5 mg / ml) solution, sodium sulfide (2.5 mg / ml) solution, sodium sulfite (2.5 mg / ml) solution, sodium thiosulfate (2.5 mg / ml) solution or sterilized water (control) respectively. 0.02ml and increments injection and 48 hours static culture at 30 ° C..

その結果は表2に示すように、対照の親株は基本組成の平板培地上では、6つのどの条件でも全く生育は認められなかった。一方、L-メチオニン30μg/mlを含む平板培地の表面全体に良好な生育が認められた。したがって、対照の親株は、L-メチオニン要求株であることを確認した。 As shown in Table 2, the control parent strain did not grow at all on any of the six conditions on the basic plate medium. On the other hand, good growth was observed on the entire surface of the plate medium containing 30 μg / ml of L-methionine. Therefore, it was confirmed that the control parent strain was an L-methionine-requiring strain.

一方、本発明の使用菌の大腸菌変異株FERM P-21078では、L-メチオニンを含まない基本培地では全く生育しなかったが、L-メチオニンを含む培地では、L-システイン、L-シスチン、硫化ナトリウム、亜硫酸ナトリウムあるいはチオ硫酸ナトリウムを与えたシリンダーカップの周辺に生育ゾーンが認められ、殺菌水（対照）を与えたカップの周辺またはカップから離れた領域ではまったく生育が認められなかった。 On the other hand, the Escherichia coli mutant FERM P-21078 used as a bacterium of the present invention did not grow at all in a basic medium containing no L-methionine, but in a medium containing L-methionine, L-cysteine, L-cystine, sulfide A growth zone was observed around the cylinder cup fed with sodium, sodium sulfite or sodium thiosulfate, and no growth was observed around or away from the cup fed with sterilized water (control).

この様に、本発明の使用菌FERM P-21078は、Ｌ-メチオニンと、Ｌ-システイン、L-シスチン、硫化ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、または、チオ硫酸ナトリウムのいずれか１つの両方を生育に必要とする変異株であることが分かった。 Thus, the fungus FERM P-21078 used in the present invention requires both L-methionine and L-cysteine, L-cystine, sodium sulfide, sodium sulfite, or sodium thiosulfate for growth. It was found to be a mutant strain.

（実施例1）
グルコース10g/l、ポリペプトン10g/l、酵母エキス5g/l、尿素3g/lの組成からなるpH７の種母培地10mlを300ml容三角フラスコに入れて120℃で10分間オートクレーブ殺菌した。これに大腸菌変異株FERM P-21078を接種し、往復振とう培養機上で130rpmの振とう速度で30℃の温度下で24時間振とう培養して種母とした。得られた培養液を下記の基本組成からなる殺菌した発酵培地7mlを含む300ml容三角フラスコに0.7ml接種し、さらに別に殺菌したL-メチオニンとL-システインの培地中の最終濃度が表3のようになるように0-500μg/mlに変えて各フラスコに添加し、種母培養と同様に振とう培養した。

(Example 1)
10 ml of a pH 7 seed medium consisting of 10 g / l of glucose, 10 g / l of polypeptone, 5 g / l of yeast extract and 3 g / l of urea was placed in a 300 ml Erlenmeyer flask and autoclaved at 120 ° C. for 10 minutes. This was inoculated with E. coli mutant strain FERM P-21078, and cultured on a reciprocating shaker at 130 rpm with a shaking speed of 30 ° C. for 24 hours as a seed. The obtained culture broth was inoculated into 0.7 ml of a 300 ml Erlenmeyer flask containing 7 ml of a sterilized fermentation medium having the following basic composition, and the final concentrations of L-methionine and L-cysteine in the medium further sterilized were as shown in Table 3. The mixture was changed to 0-500 μg / ml so as to be added to each flask, and cultured with shaking in the same manner as the seed culture.

発酵培地の基本組成（培地１Lあたり）は次の通りであった。フラクトース 30g、(NH₄)₂SO₄ 10g、FeSO₄・7H₂O 0.01g、MnSO₄・4H₂O 0.007g、MgSO₄・7H₂O 0.5g、KH₂PO₄ 1.5g、K₂HPO₄ 0.5g、NaCl 0.1g、酵母エキス 1g、ウラシル 0.1g、CaCO₃ 20g。ただし、(NH₄)₂SO₄ とCaCO₃は他の培地組成とは別に殺菌して加えた。また、培地のpHをアンモニア水でpH７に調整した後、120℃で10分間オートクレーブ殺菌した。 The basic composition of the fermentation medium (per liter of medium) was as follows. Fructose _{_{30g, (NH 4) 2 SO}} 4 10g, FeSO 4 · 7H 2 O 0.01g, MnSO 4 · 4H 2 O 0.007g, MgSO 4 · 7H 2 O 0.5g, KH 2 PO 4 1.5g, K 2 HPO 4 0.5g, NaCl 0.1g, yeast extract 1g, uracil 0.1g, CaCO ₃ 20g. However, (NH ₄ ) ₂ SO ₄ and CaCO ₃ were added by sterilization separately from other medium compositions. The pH of the medium was adjusted to pH 7 with aqueous ammonia, and then autoclaved at 120 ° C. for 10 minutes.

培養18時間目に殺菌した30%フラクトース溶液を0.7mlづつ各フラスコに添加し、同時にフィルター除菌した20mg/mlの2-メルカプトエタノールを0.7mlづつ添加して、その後さらに培養を続行して合計40時間培養した。その結果、各培養条件下の菌の生育度と培養液中のS-(2-ヒドロキシエチル)-L-システインの蓄積量は表3の通りであった。なお、菌の生育度は東京光電社製光電比色計モデルANA-7Aで、光路長2cmの比色セルを用いてOD₆₆₀を測定し、この値で記した。 Add 0.7 ml of 30% fructose solution sterilized at 18 hours of culture to each flask at the same time, add 0.7 ml of 20 mg / ml 2-mercaptoethanol sterilized by filter at the same time, and then continue the cultivation for a total. Cultured for 40 hours. As a result, the growth degree of the bacteria under each culture condition and the accumulated amount of S- (2-hydroxyethyl) -L-cysteine in the culture solution were as shown in Table 3. In addition, the growth degree of the fungus was measured by OD ₆₆₀ measured using a colorimetric cell having a light path length of 2 cm using a photoelectric colorimeter model ANA-7A manufactured by Tokyo Kodenshi Co., Ltd.

上記と同様に、L-メチオニン250μg/mlとL-システイン100μg/mlを添加した条件で培養を繰り返して発酵液を集めて450mlとし、-20℃で凍結し、それを解凍後8,000rpm、4℃の条件で遠心分離して得た上澄液の中には、S-(2-ヒドロキシエチル)-L-システインが1,360mg含まれていた。この液を内径2.5cm、長さ30cmのH^＋タイプの陽イオン交換樹脂ダイアイオンSK#1B（日本錬水社製）のカラムに、1時間当たり153mlの速度で通液して、S-(2-ヒドロキシエチル)-L-システインを吸着させた。

As above, the culture was repeated under the conditions of adding L-methionine 250 μg / ml and L-cysteine 100 μg / ml, and the fermentation broth was collected to 450 ml, frozen at −20 ° C., and thawed at 8,000 rpm, 4 The supernatant obtained by centrifuging under the condition of ° C. contained 1,360 mg of S- (2-hydroxyethyl) -L-cysteine. This liquid was passed through a column of H ⁺ type cation exchange resin Diaion SK # 1B (manufactured by Nippon Nuisui Co., Ltd.) having an inner diameter of 2.5 cm and a length of 30 cm at a rate of 153 ml per hour, and S- ( 2-Hydroxyethyl) -L-cysteine was adsorbed.

カラムに259mlの水を同様に通液して水洗後、順次各々295mlずつの0.5N、1N、および2N NH₄OHで同様に溶出した。水で溶出した画分は、77mlフラクション3本と28mlフラクション1本に回収した。0.5N、1N、および2N NH₄OHで溶出した画分は、それぞれ77mlフラクション3本と64mlフラクション1本に回収した。全てのフラクションを薄層クロマトグラフィーで分析した結果、1N NH₄OHで溶出した1番目と2番目のフラクションにS-(2-ヒドロキシエチル)-L-システインが主として含まれることが分かった。 259 ml of water was passed through the column in the same manner, washed with water, and then eluted with 295 ml of 0.5N, 1N, and 2N NH ₄ OH, respectively. The fraction eluted with water was collected in three 77 ml fractions and one 28 ml fraction. Fractions eluted with 0.5N, 1N, and 2N NH ₄ OH were collected in three 77 ml fractions and one 64 ml fraction, respectively. As a result of analyzing all the fractions by thin layer chromatography, it was found that S- (2-hydroxyethyl) -L-cysteine was mainly contained in the first and second fractions eluted with 1N NH ₄ OH.

それぞれのフラクションを集めて減圧下で濃縮し、デシケータの中で乾燥させ、S-(2-ヒドロキシエチル)-L-システインの粗精製品を1,150mg得た。粗精製品の一部を5mg/mlになるように溶解し、DevelosilC30-UG5（野村化学社製）の分取用カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで、S-(2-ヒドロキシエチル)-L-システインを分取し、減圧下で濃縮後デシケータ中で乾燥して、精製品を得た。NMRで解析した結果、得られたデータはS-(2-ヒドロキシエチル)-システインと一致した。また、LC-MS解析の結果、分子量は理論値と一致した。

（実施例2）
メルカプト基を有する有機化合物として、2-メルカプトエタノールに代えてエチルメルカプタン、メチルメルカプタン、3-メルカプト-1-プロパノール、メルカプト酢酸、メルカプトベンゼン、2-メルカプトエチルアミン、4-メルカプトフェノール、3-メルカプトプロピオン酸、またはメルカプトコハク酸を各々25mMの最終濃度になるように培地に添加した他は実施例1と同様に実施した結果、表4に示すS位置換L-システイン誘導体が蓄積した。 Each fraction was collected, concentrated under reduced pressure, and dried in a desiccator to obtain 1,150 mg of a crude product of S- (2-hydroxyethyl) -L-cysteine. Dissolve a portion of the crude product to 5 mg / ml, and use S- (2-hydroxyethyl) -L by high performance liquid chromatography using a preparative column of Develosil C30-UG5 (manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.). -Cysteine was collected, concentrated under reduced pressure, and dried in a desiccator to obtain a purified product. As a result of NMR analysis, the obtained data was consistent with S- (2-hydroxyethyl) -cysteine. As a result of LC-MS analysis, the molecular weight agreed with the theoretical value.

(Example 2)
As an organic compound having a mercapto group, instead of 2-mercaptoethanol, ethyl mercaptan, methyl mercaptan, 3-mercapto-1-propanol, mercaptoacetic acid, mercaptobenzene, 2-mercaptoethylamine, 4-mercaptophenol, 3-mercaptopropionic acid As a result of carrying out in the same manner as in Example 1 except that mercaptosuccinic acid was added to the medium to a final concentration of 25 mM, the S-position substituted L-cysteine derivatives shown in Table 4 accumulated.

発酵法によって、S位置換L-システイン誘導体を経済的に有利に生産できる。 S-substituted L-cysteine derivatives can be produced economically and advantageously by fermentation.

Claims

炭素源、窒素源、硫黄源その他微生物の生育に必要な栄養素を含む発酵培地に微生物を培養し、培養の当初あるいは発酵の途上で発酵培地にメルカプト基を有する有機化合物を添加することにより、添加したメルカプト基を有する有機化合物に対応するS位置換Ｌ-システイン誘導体を発酵物および発酵液中に生成・蓄積せしめ、発酵物および発酵液からS位置換Ｌ-システイン誘導体を採取することを特徴とする発酵法において、使用微生物として、その生育にＬ-システイン、Ｌ-シスチン、又は、それらの生合成前駆体硫黄化合物のうち少なくとも１つの化合物、および、Ｌ-メチオニンを要求する微生物を用いることを特徴とする発酵法によるS位置換Ｌ-システイン誘導体の製造法。 Added by culturing microorganisms in a fermentation medium containing carbon source, nitrogen source, sulfur source and other nutrients necessary for the growth of microorganisms, and adding an organic compound having a mercapto group to the fermentation medium at the beginning of culture or during fermentation Characterized in that an S-substituted L-cysteine derivative corresponding to an organic compound having a mercapto group is produced and accumulated in a fermented product and a fermentation broth, and the S-substituted L-cysteine derivative is collected from the fermented product and the fermented solution. In the fermentation method, the microorganism used requires at least one compound of L-cysteine, L-cystine, or their biosynthetic precursor sulfur compound and L-methionine for its growth. A method for producing an S-substituted L-cysteine derivative by a characteristic fermentation method.

使用微生物が大腸菌であることを特徴とする、請求項1記載のS位置換Ｌ-システイン誘導体の製造法。 2. The method for producing an S-position-substituted L-cysteine derivative according to claim 1, wherein the microorganism used is Escherichia coli.

発酵培地に添加するメルカプト基を有する有機化合物が、エチルメルカプタン、L-システイン、DL-システイン、L-ホモシステイン、DL-ホモシステイン、メチルメルカプタン、2-メルカプトエタノール、3-メルカプト-1-プロパノール、メルカプト酢酸、メルカプトベンゼン、2-メルカプトエチルアミン、4-メルカプトフェノール、3-メルカプトプロピオン酸、あるいはメルカプトコハク酸のうちの一つまたはその組み合わせであることを特徴とする、請求項1記載のS位置換Ｌ-システイン誘導体の製造法。 The organic compound having a mercapto group to be added to the fermentation medium is ethyl mercaptan, L-cysteine, DL-cysteine, L-homocysteine, DL-homocysteine, methyl mercaptan, 2-mercaptoethanol, 3-mercapto-1-propanol, The S-position substitution according to claim 1, which is one or a combination of mercaptoacetic acid, mercaptobenzene, 2-mercaptoethylamine, 4-mercaptophenol, 3-mercaptopropionic acid, or mercaptosuccinic acid. A method for producing an L-cysteine derivative.

生成するS位置換システイン誘導体がS-エチル-L-システイン、S-(2-アミノ-2-カルボキシエチル)-L-システイン、S-(3-アミノ-3-カルボキシエチル)-L-システイン、S-メチル-L-システイン、S-カルボキシメチル-L-システイン、S-(2-ヒドロキシエチル)-L-システイン、S-(3-ヒドロキプロピル)-L-システイン、S-ベンジル-L-システイン、S-(2-アミノエチル)-L-システイン、S-4-ヒドロキシベンジル-L-システイン、S-(2-カルボキシエチル)-L-システイン、あるいはＳ-(1,3-ジカルボキシエチル)-Ｌ-システインのうちの一つあるいはその組合せである請求項1記載のS位置換Ｌ-システイン誘導体の製造法。 S-substituted cysteine derivatives produced are S-ethyl-L-cysteine, S- (2-amino-2-carboxyethyl) -L-cysteine, S- (3-amino-3-carboxyethyl) -L-cysteine, S-methyl-L-cysteine, S-carboxymethyl-L-cysteine, S- (2-hydroxyethyl) -L-cysteine, S- (3-hydroxypropyl) -L-cysteine, S-benzyl-L-cysteine , S- (2-aminoethyl) -L-cysteine, S-4-hydroxybenzyl-L-cysteine, S- (2-carboxyethyl) -L-cysteine, or S- (1,3-dicarboxyethyl) 2. The method for producing an S-substituted L-cysteine derivative according to claim 1, which is one of L-cysteine or a combination thereof.