JP2008131940A - Transgenic nonhuman mammal having mutation in gne gene - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、その作出に関するＤＮＡ及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその一部を用いたスクリーニング法に関する。 The present invention relates to a transgenic non-human mammal, DNA relating to the production thereof, and a screening method using the transgenic non-human mammal or a part thereof.
１９８１年、埜中らによって縁取り空胞型遠位型ミオパチー(Distal Myopathy with Rimmed Vacuoles, ＤＭＲＶ)が報告された(非特許文献１)。ＤＭＲＶは、１５から３０歳で発症することが多く、下腿伸筋群が初期より強く障害され（図１）、その後大腿屈筋群の筋力低下、筋萎縮も加わり、発症１０年以内に車椅子の生活を余儀なくされることが多い難治性疾患である。２００１年、Eisenbergらによって、遺伝性封入体ミオパチー（Hereditary Inclusion Body Myopathy, ＨＩＢＭ）の原因がＧＮＥ(UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase)遺伝子の変異であることが示唆された(非特許文献２)。２００２年、本発明者の浅賀らはＨＩＢＭとＤＭＲＶは同じ遺伝子の変異に起因する疾患であることを報告した(非特許文献４)。しかしながらＧＮＥ遺伝子の欠損は致死性であるため(非特許文献３)、ＧＮＥ遺伝子ノックアウト動物をＤＭＲＶの病態解明と治療方法の開発研究のためにモデル動物として用いることは不可能である。
本発明者の浅賀らは、ＤＭＲＶの日本人患者家系の解析から、ＧＮＥ遺伝子の１７１４番目の塩基がグアニン（Ｇ）からシトシン（Ｃ）に置換され、キナーゼ部位に含まれるＧＮＥタンパク質のＮ末端から５７２番目のアミノ酸残基であるバリン残基がロイシン残基に置換されているという点変異(V572L)を発見した(非特許文献４)（図２）。
ＧＮＥタンパク質は、シアル酸の生合成の鍵となる酵素であり、ウリジン２リン酸Ｎ-アセチルグルコサミン２エピメラーゼ(UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase)及びＮ-アセチルマンノサミンキナーゼ(N-acetylmannosamine kinase)の２つの活性を持っている。リコンビナントＧＮＥタンパク質の研究によりV572L変異ヒトＧＮＥはキナーゼ活性が低下し、その患者の骨格筋のＯ型糖鎖に影響があることが報告されている（Am J Pathol 166: 1211-1130, 2005）。さらに、ＧＮＥ代謝産物であるＮ-アセチルマンノサミンやＮ-アセチルノイラミン酸を加えることで、ＤＭＲＶ患者から採取した細胞のシアル酸化状態が回復したことが報告された(非特許文献５)。
しかしながら、現在においてもＤＭＲＶには有効な治療法は見つかっておらず、臨床現場では徐々に悪化していく状態を、手をこまねいて見ているしかないのが現状である。
From the analysis of the Japanese patient family of DMRV, Asaga et al. Of the present inventor have replaced the 1714th base of the GNE gene from guanine (G) to cytosine (C), and from the N-terminus of the GNE protein contained in the kinase site. A point mutation (V572L) was found in which the valine residue, the 572nd amino acid residue, was substituted with a leucine residue (Non-patent Document 4) (FIG. 2).
GNE protein is a key enzyme for biosynthesis of sialic acid, and includes uridine diphosphate N-acetylglucosamine 2-epimerase and N-acetylmannosamine kinase. ) Has two activities. Studies on recombinant GNE protein have reported that V572L mutant human GNE has a reduced kinase activity and affects the O-type sugar chain of the skeletal muscle of the patient (Am J Pathol 166: 1211-1130, 2005). Furthermore, it was reported that the sialylation state of cells collected from DMRV patients was recovered by adding N-acetylmannosamine or N-acetylneuraminic acid, which are GNE metabolites (Non-patent Document 5).
However, at present, no effective treatment method has been found for DMRV, and the current situation is that the state of gradual worsening in the clinical setting can only be observed with hands.
そこで、ＤＭＲＶの病態解明と治療方法の開発研究のためにも、ＧＮＥ遺伝子に変異を導入したトランスジェニックの作出が切望されてきた。しかしながら、その作出は困難であり、ＧＮＥ欠損白血球や患者由来の繊維芽細胞レベルの開発研究にとどまっているのが現状である。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、変異型ＧＮＥ遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出を目的とする。
Thus, for the purpose of elucidating the pathology of DMRV and developing research on therapeutic methods, it has been eagerly desired to produce a transgenic strain in which a mutation is introduced into the GNE gene. However, its production is difficult, and at present the development of GNE-deficient leukocytes and patient-derived fibroblasts is limited.
The present invention has been made in view of the above circumstances, and aims to produce a transgenic non-human mammal having a mutant GNE gene.
本発明によれば、ＧＮＥ遺伝子のゲノムＤＮＡに変異が導入されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ＧＮＥ遺伝子のゲノムＤＮＡに変異が導入されているため、ＧＮＥ活性が低下しており、ＧＮＥ活性低下モデル動物となり得る。また、ＧＮＥタンパク質はシアル酸生合成経路に関与していることから、シアル酸生合成が不全となっており、シアル酸生合成能不全モデル動物となり得る。ＤＭＲＶモデル動物となり得ることは言うまでもない。さらに、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の腎臓では、アルブミン尿、尿細管拡張、出血、炎症性細胞浸潤、糸球体数の減少が観察されることから、腎臓機能が不全となっており、糸球体腎炎や間質性腎炎、ネフロンろう，ネフローゼ症候群などの腎臓疾患モデル動物にもなり得る。 According to the present invention, there is provided a transgenic non-human mammal characterized in that a mutation is introduced into the genomic DNA of the GNE gene. Since the transgenic non-human mammal of the present invention has a mutation introduced into the genomic DNA of the GNE gene, the GNE activity is reduced and can be a GNE activity-reduced model animal. Further, since the GNE protein is involved in the sialic acid biosynthesis pathway, sialic acid biosynthesis is deficient and can be a model animal with a deficient sialic acid biosynthesis ability. It goes without saying that it can be a DMRV model animal. Furthermore, in the kidney of the transgenic non-human mammal of the present invention, albuminuria, tubule dilatation, bleeding, inflammatory cell infiltration, and a decrease in the number of glomeruli are observed. It can also be a model animal for kidney diseases such as glomerulonephritis, interstitial nephritis, nephron fistula and nephrotic syndrome.
さらに、本発明によれば、ＧＮＥ遺伝子のゲノムＤＮＡに変異が導入されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部を用いた、疾病の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法が提供される。本発明のスクリーニング方法は、ＤＭＲＶや腎臓疾患等のＧＮＥタンパク質、シアル酸生合成に関連した疾病の病態解明と治療方法の開発研究に用いることができるという効果を奏する。 Furthermore, according to the present invention, screening for a therapeutic and / or prophylactic agent for a disease using a transgenic non-human mammal or a part thereof, wherein a mutation is introduced into the genomic DNA of the GNE gene. A method is provided. The screening method of the present invention has the effect of being able to be used for research and development of GNE proteins such as DMRV and kidney diseases and diseases related to sialic acid biosynthesis and development of therapeutic methods.
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ＧＮＥ活性低下モデル動物、シアル酸生合成能不全モデル動物、ＤＭＲＶモデル動物又は腎臓疾患モデル動物として用いることができる。また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、モデル動物またはその一部を用いた、疾病の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法に用いることができる。本発明のスクリーニング方法は、ＤＭＲＶや腎臓疾患等のＧＮＥタンパク質、シアル酸生合成に関連した疾病の病態解明と治療方法の開発研究に用いることができるという効果を奏する。 The transgenic non-human mammal of the present invention can be used as a GNE activity-reduced model animal, a sialic acid biosynthesis deficiency model animal, a DMRV model animal, or a kidney disease model animal. Moreover, the transgenic non-human mammal of the present invention can be used in a screening method for a therapeutic and / or prophylactic agent for a disease using a model animal or a part thereof. The screening method of the present invention has the effect of being able to be used for research and development of GNE proteins such as DMRV and kidney diseases and diseases related to sialic acid biosynthesis and development of therapeutic methods.
本願発明者は、ＧＮＥ遺伝子の点変異(V572L)がＤＭＲＶの原因であると考え、同じ点変異をＧＮＥ遺伝子に導入したマウスを作出し、この点変異がＤＭＲＶ様病態を発症することを証明すると共に、ＤＭＲＶ発症の分子機構の解明と治療法の開発を目指して研究を進めてきた。言うまでもないが、ＧＮＥタンパク質の活性に変化をもたらす部位は、ＧＮＥ活性が低下するという効果を有する限り、特に限定されるものではない。これは、表１表２及び図３からも容易に推察できる。表１表２及び図３に示すように、他の患者家系の解析から、V572L以外の変異を有するＤＭＲＶが存在することが明らかとなっている。特に、表１及び２には、国内外におけるＤＭＲＶ患者に見られる具体的な点変異が示されている。
しかしながら、本願においては下記の実施例に示す様に、ＧＮＥタンパク質の機能及び構造を考慮して、好ましくはＧＮＥタンパク質のキナーゼドメイン、さらに好ましくはＧＮＥ遺伝子のエクソン１０において変異を導入させた。
The present inventor considers that a point mutation of the GNE gene (V572L) is the cause of DMRV, creates a mouse in which the same point mutation is introduced into the GNE gene, and proves that this point mutation develops a DMRV-like pathological condition. At the same time, we have been conducting research aimed at elucidating the molecular mechanism of the onset of DMRV and developing therapeutic methods. Needless to say, the site that causes a change in the activity of the GNE protein is not particularly limited as long as it has the effect of reducing the GNE activity. This can be easily inferred from Table 1, Table 2, and FIG. As shown in Table 1 Table 2 and FIG. 3, it is clear from analysis of other patient families that there is a DMRV having a mutation other than V572L. In particular, Tables 1 and 2 show specific point mutations found in DMRV patients at home and abroad.
However, in the present application, as shown in the Examples below, in consideration of the function and structure of the GNE protein, mutations were preferably introduced in the kinase domain of the GNE protein, more preferably in the exon 10 of the GNE gene.
ＤＭＲＶは、四肢の遠位が好んで侵される病型の骨格筋疾患であり、筋線維の中に細かい顆粒状の物質で縁取られた空胞が見られることが特徴であるが（図４Ａ）、細胞質内に好塩基性封入体が観察されることも特徴である（図４Ｂ）。また、ＤＭＲＶは、常染色体劣性の遺伝形式を示し、血清クレアチンキナーゼの軽度の上昇がみられることもある(J Neurol Sci 64: 33-43, 1984)。したがって、上記の病態は、本願のトランスジェニック非ヒト哺乳動物がＤＭＲＶモデル動物となり得るかの指標となる。 DMRV is a type of skeletal muscle disease that favors the distal extremities, and is characterized by the appearance of vacuoles bordered by fine granular substances in muscle fibers (FIG. 4A). In addition, basophil inclusion bodies are observed in the cytoplasm (FIG. 4B). DMRV also exhibits an autosomal recessive inheritance and may have a slight increase in serum creatine kinase (J Neurol Sci 64: 33-43, 1984). Therefore, the above-mentioned pathological condition is an indicator of whether the transgenic non-human mammal of the present application can be a DMRV model animal.
また、糸球体腎炎や間質性腎炎、ネフロンろう，ネフローゼ症候群などは、腎臓の疾患であり、タンパク尿、尿細管拡張、糸球体硬化、出血（血尿）、炎症性細胞浸潤等が見られることが特徴である。 In addition, glomerulonephritis, interstitial nephritis, nephron fistula, nephrotic syndrome, etc. are kidney diseases with proteinuria, tubule dilatation, glomerulosclerosis, hemorrhage (hematuria), inflammatory cell infiltration, etc. Is a feature.
ＧＮＥタンパク質は、シアル酸の生合成の鍵となる酵素であり、ウリジン２リン酸Ｎ-アセチルグルコサミン２エピメラーゼ及びＮ-アセチルマンノサミンキナーゼの２つの活性を持っており、ウリジン２リン酸Ｎ-アセチルグルコサミン(UDP-N-acetylglucosamine)からＮ-アセチルマンノサミン(N-acetylmannosamine)、Ｎ-アセチルマンノサミンからＮ-アセチルマンノサミン６リン酸(N-acetylmannosamine-6-P)の生合成に関わる酵素である。図５に示すように、哺乳動物細胞におけるシアル酸は、Ｎ-アセチルマンノサミン、もしくは、ウリジン２リン酸Ｎ-アセチルグルコサミンから、一連の酵素反応によって合成される。Ｎ-アセチルマンノサミンのリン酸化によって生合成が開始し、続くフォスフォエノールピルビン酸(PEP)との縮合によってシアル酸９リン酸ができる。特異的な脱リン酸化酵素によってリン酸モノエステルが加水分解されると、シアル酸は核内に輸送され、そこでCTPと縮合しCMP-シアル酸となり、活性化される。このように、ＧＮＥタンパク質はシアル酸の生合成に深く関与することが示されている。 GNE protein is an enzyme that is the key to biosynthesis of sialic acid, and has two activities of uridine diphosphate N-acetylglucosamine 2 epimerase and N-acetyl mannosamine kinase, and uridine diphosphate N- Biosynthesis of N-acetylmannosamine from N-acetylmannosamine from N-acetylmannosamine and N-acetylmannosamine-6-P from N-acetylmannosamine Enzyme involved in. As shown in FIG. 5, sialic acid in mammalian cells is synthesized from N-acetylmannosamine or uridine diphosphate N-acetylglucosamine through a series of enzymatic reactions. Biosynthesis is initiated by phosphorylation of N-acetylmannosamine, followed by condensation with phosphoenolpyruvate (PEP) to produce sialic acid 9-phosphate. When the phosphate monoester is hydrolyzed by a specific phosphatase, sialic acid is transported into the nucleus where it condenses with CTP to become CMP-sialic acid and is activated. Thus, GNE protein has been shown to be deeply involved in sialic acid biosynthesis.
本願のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ＧＮＥ遺伝子の変異により、ＧＮＥタンパク質の活性が低下しているので、ＧＮＥ活性が低下していることが原因の疾患のモデル動物になり得る。具体的には、ＤＭＲＶ，ＨＩＢＭ，Quadriceps sparing myopathyなどのモデル動物になり得ると考えられる。
また、ＧＮＥ活性の低下により、シアル酸の生合成能が不全となっていることが予測されるので、シアル酸生合成能不全が原因の疾患のモデル動物にもなり得る。具体的には、ＤＭＲＶ、ＨＩＢＭ、Quadriceps sparing myopathy、ダウン症候群（Gulesserian等、Amino Acids. 2006 May 26）、筋萎縮性側索硬化症（Niebroj-Dobosz等、Immunochemical quantification of glycoconjugates in serum and cerebrospinal fluid of amyotrophic lateral sclerosis patients. Eur J Neurol. 1999 May;6(3):335-40.）、アルツハイマー病（Functional & Molecular Glycobiology）などのモデル動物になり得ると考えられる。特に、筋萎縮性側索硬化症およびアルツハイマー病については、細胞内封入体が疾患の発症に関与していると考えられている。ダウン症については、ＧＮＥの下流にあるシアル酸合成酵素（Sialic Acid Synthase, SAS）（図５）の低下が関与していると考えられている。
The transgenic non-human mammal of the present application has a decreased GNE protein activity due to a mutation in the GNE gene, and therefore can be a model animal for a disease caused by a decreased GNE activity. Specifically, it is considered that it can be a model animal such as DMRV, HBM, Quadriceps sparing myopathy.
Moreover, since it is predicted that the biosynthesis ability of sialic acid is inferior due to the decrease in GNE activity, it can be a model animal for diseases caused by the incompetence of sialic acid biosynthesis. Specifically, DMRV, HBM, Quadriceps sparing myopathy, Down syndrome (Gulesserian et al., Amino Acids. 2006 May 26), amyotrophic lateral sclerosis (Niebroj-Dobosz et al., Immunochemical quantification of glycoconjugates in serum and cerebrospinal fluid of amyotrophic lateral sclerosis patients. Eur J Neurol. 1999 May; 6 (3): 335-40.), Alzheimer's disease (Functional & Molecular Glycobiology). In particular, for amyotrophic lateral sclerosis and Alzheimer's disease, it is believed that intracellular inclusions are involved in the development of the disease. Down's syndrome is thought to be associated with a decrease in sialic acid synthase (SAS) (FIG. 5) downstream of GNE.
さらに、本願のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ＧＮＥ遺伝子の変異により、腎臓機能が不全となっているので、腎臓疾患モデル動物になり得る。具体的には、糸球体腎炎や間質性腎炎、ネフロンろう，ネフローゼ症候群などのモデル動物になり得ると考えられる。 Furthermore, the transgenic non-human mammal of the present application can be a kidney disease model animal because kidney function is incomplete due to a mutation in the GNE gene. Specifically, it may be a model animal such as glomerulonephritis, interstitial nephritis, nephron fistula, nephrotic syndrome.
本願において、「ＧＮＥ遺伝子のゲノムＤＮＡに変異が導入されている」とは、ＧＮＥ遺伝子の塩基配列の一部に、欠損、置換または付加を生じさせる変異が加えられていることをいう。ＧＮＥ遺伝子のゲノムＤＮＡに変異を導入するためには、ＧＮＥ遺伝子に対して欠失、置換または付加のうち、１つまたは２つ以上の方法を併せて使用してもよい。 In the present application, “mutation is introduced into the genomic DNA of the GNE gene” means that a mutation causing deletion, substitution or addition is added to a part of the base sequence of the GNE gene. In order to introduce a mutation into the genomic DNA of the GNE gene, one or more methods of deletion, substitution or addition to the GNE gene may be used in combination.
本願において、「ＧＮＥタンパク質のキナーゼドメイン」とは、ＧＮＥタンパク質が有するキナーゼ活性に関与する領域のことであり、Ｎ末端から約４０１番目から約６００番目のアミノ酸残基に相当する。 In the present application, the “GNE protein kinase domain” refers to a region involved in the kinase activity of the GNE protein, and corresponds to about the 401st to about 600th amino acid residues from the N-terminus.
本願において、「ＧＮＥ遺伝子のエキソン１０」とは、ＧＮＥ遺伝子塩基配列の１６３４番目から１８１６番目の塩基のことをいう。 In the present application, “exon 10 of the GNE gene” refers to the 1634th to 1816th bases of the GNE gene base sequence.
本願において、「ＧＮＥ活性」とは、ＧＮＥタンパク質のエピメラーゼ活性及び／又はキナーゼ活性のことをいうものとする。 In the present application, “GNE activity” refers to epimerase activity and / or kinase activity of GNE protein.
本願において、「ＧＮＥ活性が低下している」とは、変異型ＧＮＥ遺伝子の発現産物のＧＮＥタンパク質としてのエピメラーゼ活性及び／又はキナーゼ活性が天然型のＧＮＥタンパク質よりも低下していることをいうものとする。 In the present application, “GNE activity is reduced” means that the epimerase activity and / or kinase activity of the expression product of the mutant GNE gene as GNE protein is lower than that of natural GNE protein. And
本願において、「シアル酸生合成能不全である」とは、シアル酸の生合成能が、野生型と比較して低下していることをいうものとする。 In the present application, the expression “insufficient sialic acid biosynthesis ability” means that the biosynthesis ability of sialic acid is reduced as compared with the wild type.
本願において、「縁取り空胞型遠位型ミオパチー表現型を発現している」とは、筋線維の中に細かい顆粒状の物質で縁取られた空胞が見られること、細胞質内に好塩基性封入体が見られること、及び／又は血漿クレアチンキナーゼ値が上昇している状態のことをいうものとする。 In this application, “expressing a fringe vacuolar distal myopathy phenotype” means that vacuoles fringed with fine granular substances are found in myofibers, and basophils in the cytoplasm. It means that the inclusion body is seen and / or that the plasma creatine kinase level is elevated.
本願において、「腎臓機能不全」とは、腎臓の機能が低下又は障害を受けている状態のことをいうものとする。その指標として、尿細管拡張、糸球体硬化、出血（血尿）、炎症性細胞浸潤、尿中アルブミン濃度の上昇等が挙げられる。 In the present application, “kidney dysfunction” refers to a state in which the kidney function is reduced or damaged. Examples of the index include tubule dilation, glomerular sclerosis, hemorrhage (hematuria), inflammatory cell infiltration, and increase in urinary albumin concentration.
本願において、「腎臓疾患」とは、腎臓機能が不全となった状態のことをいい、具体的な疾患としては糸球体腎炎や間質性腎炎、ネフロンろう，ネフローゼ症候群などが挙げられる。 In the present application, “kidney disease” refers to a state in which renal function is in failure, and specific diseases include glomerulonephritis, interstitial nephritis, nephron fistula, nephrotic syndrome, and the like.
本発明のＧＮＥ遺伝子に変異を持つトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、公知の遺伝子相同組み換え法（ジーンターゲッティング法）により作製することができる。ジーンターゲッティング法は、本分野においては良く知られた技術であり、本分野の種々の実験書の教示に従って行うことができる。先ず、マウスのゲノムデータベースからＧＮＥ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を入手する。その情報をもとにＧＮＥ遺伝子の必要な領域をＰＣＲで増幅するか、ゲノムライブラリーから単離する。そして、そのゲノムの情報から、ＧＮＥ遺伝子の機能を低下あるいは欠損させた配列を有するターゲティングベクターを、下記の方法により作製することができる。 The transgenic non-human mammal having a mutation in the GNE gene of the present invention can be produced by a known gene homologous recombination method (gene targeting method). The gene targeting method is a well-known technique in this field, and can be performed according to the teachings of various experimental documents in this field. First, the DNA base sequence of the GNE gene is obtained from the mouse genome database. Based on this information, necessary regions of the GNE gene are amplified by PCR or isolated from a genomic library. And the targeting vector which has a sequence which reduced or deleted the function of the GNE gene from the information of the genome can be produced by the following method.
ターゲティングベクターを設計するにあたり、ＧＮＥ遺伝子の構造に変化をもたらす部位は、ＧＮＥ遺伝子の発現産物がＧＮＥタンパク質としての活性を低下させるという効果を有する限り、特に限定されるものではない。 In designing the targeting vector, the site that causes a change in the structure of the GNE gene is not particularly limited as long as the expression product of the GNE gene has an effect of reducing the activity as a GNE protein.
また、ベクターを導入した組み換え体につき、ターゲティングベクターにより導入した薬剤耐性遺伝子を用いたスクリーニングとサザンブロット法やＰＣＲ法を用いたスクリーニングを併用して、選抜することが好ましい。そのために、それらのスクリーニングを容易に行う事ができるように便宜を考えてターゲティングベクターを設計することが望ましい。薬剤選択のマーカー遺伝子として、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子等を使用することができる。また、ネガティブ選択用遺伝子には、ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Ａ遺伝子等を使用することができる。 In addition, it is preferable to select a recombinant into which a vector has been introduced by combining screening using a drug resistance gene introduced by a targeting vector and screening using Southern blotting or PCR. Therefore, it is desirable to design a targeting vector for convenience so that screening can be performed easily. A neomycin resistance gene, a hygromycin B phosphotransferase gene, or the like can be used as a marker gene for drug selection. Moreover, HSV thymidine kinase gene, diphtheria toxin A gene, etc. can be used for the negative selection gene.
そのＤＮＡ断片を試験管内において遺伝子操作し、ＧＮＥ遺伝子の発現産物がＧＮＥタンパク質としての活性が低下するような変異ＤＮＡを作製する。なお下記の実施例においては、下記に詳しく述べるＣｒｅ−ｌｏｘＰのシステム（Ｒ．Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，１４２７−１４２９，１９９５）を用いて、ＧＮＥ遺伝子を変異させることを可能とするベクターを構築し、ＧＮＥタンパク質の活性を低下させている。しかし、本発明はＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いた方法に限定されるものではなく、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いない最も一般的なトランスジェニックマウスの作製方法によっても、ＧＮＥタンパク質の活性を低下させるような種々の改変を行うことができる。 The DNA fragment is genetically manipulated in a test tube to produce a mutant DNA in which the GNE gene expression product has reduced activity as a GNE protein. In the following Examples, a vector that enables mutation of the GNE gene using the Cre-loxP system (R. Kuhn et al. Science, 269, 1427-1429, 1995) described in detail below. Constructed to reduce the activity of the GNE protein. However, the present invention is not limited to the method using the Cre-loxP system. The most common method for producing a transgenic mouse not using the Cre-loxP system can reduce the activity of the GNE protein. Various modifications can be made.
次いで上記の方法により作製したターゲッティングベクターを使用して、相同組み換えを行う。本願明細書において、「ＧＮＥ遺伝子の相同組み換え」とは、ＧＮＥ遺伝子と同一または類似の塩基配列を有する改変したＧＮＥ遺伝子を、ゲノム中のＧＮＥ遺伝子のＤＮＡ領域に、人工的に組み換えさせることをいう。 Subsequently, homologous recombination is performed using the targeting vector prepared by the above method. In the present specification, “homologous recombination of the GNE gene” means that a modified GNE gene having the same or similar base sequence as the GNE gene is artificially recombined with the DNA region of the GNE gene in the genome. .
目的とする遺伝子の相同組み換えが起こる頻度は低いことが知られており、目的とする相同組み換え体を得るためには、多数の組み換え体をスクリーニングする必要がある。しかし、受精卵では多数のスクリーニングを行うことが技術的に困難である。よって、受精卵と同様に多分化能を有し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる細胞を使用することが好ましい。そして、その目的を達成するためには胚性幹細胞（ＥＳ細胞）による方法を用いることができるが、それに限定されるものではない。 It is known that the frequency of homologous recombination of the target gene is low, and in order to obtain the target homologous recombinant, it is necessary to screen a large number of recombinants. However, it is technically difficult to screen a large number of fertilized eggs. Therefore, it is preferable to use cells that have pluripotency like fertilized eggs and can be cultured in vitro. In order to achieve the object, a method using embryonic stem cells (ES cells) can be used, but the method is not limited thereto.
現在マウス由来のＥＳ細胞株がいくつか確立されており、その一つに下記の実施例で使用しているＥ１４ＴＧ２ａ細胞株がある。しかし、それに限定されるものではなく、他のマウス由来のＥＳ細胞株である、ＴＴ２細胞株、ＡＢ−１細胞株、Ｊ１細胞株、Ｒ１細胞株等を使用することもできる。これらのいずれのＥＳ細胞株を用いるかは、実験の目的や方法により適宜選択して決定することができる。 Several mouse-derived ES cell lines have been established, and one of them is the E14TG2a cell line used in the following examples. However, the present invention is not limited thereto, and other mouse-derived ES cell lines such as TT2 cell line, AB-1 cell line, J1 cell line, R1 cell line, and the like can also be used. Which of these ES cell lines is used can be appropriately selected and determined according to the purpose and method of the experiment.
ＧＮＥ遺伝子を改変してその発現産物の活性を低下させたターゲティングベクターを公知の方法に準じてマウスＥＳ細胞に導入する。そして、ＥＳ細胞中の目的とするＧＮＥ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を、ターゲティングベクター中の活性が低下したＧＮＥ遺伝子による相同組み換えによって置換する。相同組み換えは、ＧＮＥ遺伝子ゲノムＤＮＡ配列と、ターゲティングベクター中の非改変部分との配列との相同性を利用して、ある確率をもって生じさせることができる。 A targeting vector in which the activity of the expression product is reduced by modifying the GNE gene is introduced into mouse ES cells according to a known method. Then, the genomic DNA sequence of the target GNE gene in the ES cell is replaced by homologous recombination with the GNE gene having reduced activity in the targeting vector. Homologous recombination can occur with a certain probability by utilizing the homology between the GNE gene genomic DNA sequence and the sequence of the unmodified portion in the targeting vector.
ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入する方法としては、公知の電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リポソーム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等も利用できるが、導入遺伝子の相同組み換え効率を考えると、電気穿孔法を用いることが好ましい。 As a method for introducing a targeting vector into ES cells, a known electroporation method (electroporation method), liposome method, calcium phosphate method, DEAE-dextran method and the like can be used, but considering the homologous recombination efficiency of the transgene, It is preferable to use electroporation.
得られた組み換えＥＳ細胞につき、相同組み換えが起こっているかどうかのスクリーニングを行う。即ち、まずネオマイシン等の導入した薬剤耐性因子によりスクリーニングを行う。更にスクリーニングを確実にする為に、サザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、スクリーニングを行う。これらのアッセイにより、染色体上に存在する野生型ＧＮＥ遺伝子と導入したＧＮＥ遺伝子の間で正しく相同遺伝子組み換えが起こり、染色体上のＧＮＥ遺伝子に変異が移った細胞を選択することができる。 The obtained recombinant ES cells are screened for homologous recombination. That is, screening is first performed using a drug resistance factor such as neomycin. Furthermore, in order to ensure screening, screening is performed by Southern hybridization or PCR. These assays enable selection of cells in which homologous gene recombination has occurred correctly between the wild-type GNE gene present on the chromosome and the introduced GNE gene, and the mutation has been transferred to the GNE gene on the chromosome.
こうして得た変異遺伝子を持つＥＳ細胞を、野生型マウスの胚盤胞または８細胞期の胚内に導入する。そして、このＥＳ細胞とのキメラ胚を偽妊娠状態の仮親マウスの子宮に移植し、出産させることによりキメラ動物を作製することができる。トランスジェニック動物は、現在はＥＳ細胞が確立しているマウスにおいて作製することができるが、将来の技術進歩により他の動物種においても作製が可能となるであろう。 ES cells having the mutant gene thus obtained are introduced into blastocysts of wild-type mice or embryos at the 8-cell stage. Then, a chimeric animal can be produced by transplanting the chimeric embryo with this ES cell into the uterus of a pseudo-pregnant temporary parent mouse and giving birth. Transgenic animals can now be produced in mice that have established ES cells, but future technological advances will allow production in other animal species.
ＥＳ細胞を胚盤胞等の胚に導入する方法としては、マイクロインジュクション法や凝集法が知られているが、いずれの方法を用いることも可能であり、当業者が適宜改変することができる。マウスの場合には、ホルモン剤（例えば、ＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧおよびＬＨ様作用を有するｈＣＧを使用）により過***処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目に、８細胞期胚を用いる場合には２．５日目に、それぞれ子宮や卵管から初期発生胚を回収する。このようにして回収した胚に対して、ターゲティングベクターを用いて相同組み換えを行ったＥＳ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて注入し、キメラ胚を作製する。 As a method for introducing ES cells into an embryo such as a blastocyst, a microinjection method and an aggregation method are known, but any method can be used and can be appropriately modified by those skilled in the art. . In the case of a mouse, a female mouse subjected to superovulation treatment with a hormone agent (for example, using PMSG having an FSH-like action and hCG having an LH-like action) is mated with a male mouse. Thereafter, early embryos are collected from the uterus and oviduct on the 3.5th day after fertilization when using blastocysts and on the 2.5th day when using 8-cell embryos, respectively. The embryos thus collected are injected in vitro with ES cells that have undergone homologous recombination using a targeting vector to produce chimeric embryos.
一方、仮親とするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などの処置をした雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上記の方法により作製したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠・出産させることによりキメラマウスを作製することができる。キメラ胚の着床、妊娠がより確実に起こるようにするため、受精卵を採取する雌マウスと仮親となる偽妊娠マウスとを、同一の性周期にある雌マウス群から作出することが望ましい。 On the other hand, a pseudopregnant female mouse for use as a temporary parent can be obtained by mating a female mouse having a normal cycle with a male mouse that has undergone treatment such as ligament ligation. A chimeric mouse can be produced by transplanting the chimeric embryo produced by the above method into the uterus to the produced pseudopregnant mouse and allowing it to become pregnant / deliver. In order to ensure the implantation and pregnancy of the chimeric embryo, it is desirable to produce a female mouse from which a fertilized egg is collected and a pseudopregnant mouse as a foster parent from a group of female mice in the same sexual cycle.
ＥＳ細胞に由来する生殖細胞を持つマウス個体が、このようなキメラマウスの中から得られた場合、このキメラマウスを純系のマウスと交配し、そして次世代個体にＥＳ細胞由来の被毛色が現れることにより、ＥＳ細胞がキメラマウス生殖系列へ導入されたことを確認することができる。ＥＳ細胞が生殖系列へ導入されたことを確認するには、様々な形質を指標として用いることができるが、確認の容易さを考慮して、被毛色によることが望ましい。マウスにおいては野ネズミ色（アグーチ色）、黒色、黄土色、チョコレート色および白色などの被毛色が知られているが、使用するＥＳ細胞の由来系統を考慮して、キメラマウスと交配させるマウス系統を適宜選択することができる。また、体の一部（例えば尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイを行うことにより、選抜を行うこともまた可能である。 When a mouse individual having germ cells derived from ES cells is obtained from such a chimeric mouse, this chimeric mouse is crossed with a pure mouse, and the ES cell-derived hair color appears in the next generation individual. This confirms that ES cells have been introduced into the chimeric mouse germline. In order to confirm that the ES cell has been introduced into the germ line, various traits can be used as an index. However, in consideration of ease of confirmation, it is desirable to use a coat color. Although mouse hair colors such as wild mouse color (Agouti color), black color, ocher color, chocolate color and white color are known, mouse strains to be mated with chimeric mice in consideration of the ES cell origin line used Can be appropriately selected. It is also possible to select by extracting DNA from a part of the body (for example, the tip of the tail) and performing Southern blot analysis or PCR assay.
この様に、胚内に移植された組み換えＥＳ細胞が生殖系列に導入された動物を選択し、そのキメラ動物を繁殖させることにより、目的とする遺伝子発現産物の活性が低下した個体を得ることができる。得られたＧＮＥ活性低下ヘテロ接合体マウス同士を交配させることにより、目的とする遺伝子欠損ホモ接合マウスを得ることができる。作出されたＧＮＥ変異遺伝子を保有するヘテロ接合体、あるいはホモ接合体は生殖細胞および体細胞のすべてに安定的にＧＮＥ遺伝子変異を有しており、交配等により効率よくその変異を子孫動物に伝達することができる。 In this way, by selecting an animal into which a recombinant ES cell transplanted into an embryo has been introduced into the germ line and breeding the chimeric animal, an individual with reduced activity of the target gene expression product can be obtained. it can. The intended gene-deficient homozygous mouse can be obtained by crossing the obtained GNE activity-reduced heterozygous mice with each other. The heterozygote or homozygote carrying the generated GNE mutant gene has a stable GNE gene mutation in all germ cells and somatic cells, and efficiently transmits the mutation to progeny animals by mating etc. can do.
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示に過ぎない。例えば、上述したように、変異を導入し、ＧＮＥタンパク質の活性に変化をもたらす部位は、ＧＮＥ活性が低下するという効果を有する限り、特に限定されるものではない。 As mentioned above, although embodiment of this invention was described, these are only illustrations of this invention. For example, as described above, a site for introducing a mutation and causing a change in the activity of the GNE protein is not particularly limited as long as it has an effect of reducing the GNE activity.
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further, this invention is not limited to these.
実施例１ ＧＮＥ点変異（V572L）マウスの作出 Example 1 Generation of GNE point mutation (V572L) mice
（１）ターゲティングベクターの構築
マウスＧＮＥ遺伝子のエキソン10にV572L (GTG → CTG)となるように点突然変異を導入することを目的としてターゲティングベクターを構築した。図６に、エキソン１０に変異を導入するために本発明で使用したターゲティングベクターの構造、及び相同組み換えにより得られる遺伝子の構造を示す。図６において、□で囲まれた数字の５から１２はエキソン５からエキソン１２を、それぞれ示す。
(1) Construction of targeting vector A targeting vector was constructed for the purpose of introducing a point mutation into exon 10 of the mouse GNE gene so as to be V572L (GTG → CTG). FIG. 6 shows the structure of the targeting vector used in the present invention to introduce a mutation into exon 10 and the structure of the gene obtained by homologous recombination. In FIG. 6, numerals 5 to 12 surrounded by squares indicate exons 5 to 12, respectively.
１） カリフォルニア工科大学のマウス バクテリア人工染色体ライブラリー (BAC) (Male CJ7/129SV由来、Research Genetics, Huntsville, AL, USA)をスクリーニングし、マウスＧＮＥ遺伝子を含むBACを得た。
２）National center for biotechnology informationのデータベース (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 及びマウスBACの塩基配列を決定することにより得たデータから制限酵素地図を作製した。
３）ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 用のプライマーを設計
マウスBACを鋳型としてターゲティングベクターの長腕側 (9.0 kb)と短腕側 (1.0 kb)を別々にPCRで増幅し、pBluescript II SK(+)ベクター (Stratagene, La Jolla, CA, USA)にサブクローニングした。
PCRで増幅された全てのエキソン領域並びにエキソンーイントロン境界部分は直接塩基配列を決定しPCRエラーが無いことを確認した。
尚、マウスＧＮＥ遺伝子のエキソン10は長腕側に含まれるようにPCRプライマーを設計し、長腕側PCR産物の3’末端と短腕側PCR産物の5’末端は一部重なる配列を含んでいる。
４）ターゲティングベクターの長腕側をサブクローニングしたベクター（長腕ベクター） 上のＧＮＥ遺伝子エキソン10にsite-directed mutagenesis法を用いてV572Lとなるように点突然変異 (GTG → CTG) を導入した。
５）短腕ベクターにジフテリア毒素A遺伝子（大阪大学大学院生命機能研究科の八木健先生より分与）を導入した。
６）短腕ベクターのマウスＧＮＥ遺伝子のイントロン10にネオマイシン耐性遺伝子（loxP-Neo-loxPカセット）を導入した。
７）点突然変異 (V572L)、ネオマイシン耐性遺伝子およびジフテリア毒素A遺伝子を含む短腕ベクターの一部分を制限酵素で切り出し、長腕を含むベクターにサブクローニングすることで目的とするターゲティングベクターを得た。
1) A mouse bacterial artificial chromosome library (BAC) (derived from Male CJ7 / 129SV, Research Genetics, Huntsville, AL, USA) of California Institute of Technology was screened to obtain a BAC containing the mouse GNE gene.
2) A restriction enzyme map was prepared from the data obtained by determining the nucleotide sequence of mouse BAC and the database of National center for biotechnology information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
3) Design primers for polymerase chain reaction (PCR) Using the mouse BAC as a template, the long arm side (9.0 kb) and short arm side (1.0 kb) of the targeting vector were amplified separately by PCR, and pBluescript II SK (+) Subcloned into vector (Stratagene, La Jolla, CA, USA).
All the exon regions amplified by PCR and the exon-intron boundary portion were directly sequenced to confirm that there were no PCR errors.
The PCR primer was designed so that exon 10 of the mouse GNE gene was included on the long arm side, and the 3 'end of the long arm side PCR product and the 5' end of the short arm side PCR product contained a partially overlapping sequence. Yes.
4) A vector obtained by subcloning the long arm side of the targeting vector (long arm vector) A point mutation (GTG → CTG) was introduced into the GNE gene exon 10 so as to be V572L using the site-directed mutagenesis method.
5) The diphtheria toxin A gene (distributed by Prof. Ken Yagi, Graduate School of Biofunctional Sciences, Osaka University) was introduced into the short arm vector.
6) A neomycin resistance gene (loxP-Neo-loxP cassette) was introduced into intron 10 of the mouse GNE gene of the short arm vector.
7) A part of the short arm vector containing the point mutation (V572L), neomycin resistance gene and diphtheria toxin A gene was excised with a restriction enzyme and subcloned into a vector containing the long arm to obtain the target targeting vector.
（２）ＧＮＥ点変異マウスの作出 (2) Creation of GNE point mutant mice
下記の実施例において示すように、本発明のトランスジェニックマウスを作製するにあたり、コンディショナルなトランスジェニックマウスの作製において汎用されている、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰのシステム（R.Kuhn et al.Science,269,1427-1429,1995）を用いることも可能である。実施例においては既に述べたように、ＧＮＥ遺伝子を変異させることを可能とする、ターゲティングベクターを用いている。
１）相同組換えＥＳ細胞クローンの単離
作成したターゲティングベクターを制限酵素（Kpn I）で切断して直鎖状にした後、エレクトロポレーション（250V, 500μF）によりマウスＥＳ細胞（E14-1）に導入した。ＥＳ細胞を250μg/ml G418を含むＥＳ細胞培地により７-10日間培養し、G418耐性のＥＳ細胞のコロニーを作らせ、順次約670個のコロニーを単離した。各ＥＳ細胞クローンより染色体DNAを調製し、PCRにより相同組換えクローンをスクリーニングした。たった一つであったがPCR陽性のクローンが同定できたので、そのクローンを凍結保存すると共に、PCR産物のDNA塩基配列を読むことにより、思いどおりの点変異がＥＳ細胞のＧＮＥ遺伝子に導入されたことを確認した。
As shown in the Examples below, the Cre / loxP system (R. Kuhn et al. Science, 269, which is widely used in the production of conditional transgenic mice in producing the transgenic mice of the present invention). 1427-1429, 1995) can also be used. In the examples, as already described, a targeting vector that enables mutation of the GNE gene is used.
1) Isolation of homologous recombination ES cell clones The prepared targeting vector was cleaved with a restriction enzyme (Kpn I) to make it linear, and then mouse ES cells (E14-1) by electroporation (250 V, 500 μF) Introduced. The ES cells were cultured in ES cell medium containing 250 μg / ml G418 for 7-10 days to form colonies of G418-resistant ES cells, and about 670 colonies were sequentially isolated. Chromosomal DNA was prepared from each ES cell clone, and homologous recombination clones were screened by PCR. Since only one PCR-positive clone was identified, the clone was cryopreserved and the desired DNA mutation was introduced into the ES cell GNE gene by reading the DNA base sequence of the PCR product. I confirmed that.
２）相同組換えＥＳ細胞からのネオマイシン耐性遺伝子の除去
相同組換えＥＳ細胞を融解・培養し、Cre遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクター（Adex-CANCre、東京大学医科学研究所の斎藤泉先生より分与）を感染させた。感染させたＥＳ細胞からコロニーを作らせ、約30個のコロニーを単離し、Creが発現してloxP配列で挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が除去されたＥＳ細胞クローンをPCRにより選別した。約80％のクローンで思いどおりの除去に成功しており、12個のクローンを凍結保存すると共に、各クローンの核型（染色体の数）をカウントした。
2) Removal of neomycin resistance gene from homologous recombination ES cells Adenovirus vector (Adex-CANCre, Dr. Izumi Saito, Institute of Medical Science, The University of Tokyo) Given). Colonies were made from the infected ES cells, about 30 colonies were isolated, and ES cell clones in which Cre was expressed and the neomycin resistance gene sandwiched between loxP sequences was removed were selected by PCR. Approximately 80% of the clones were successfully removed as expected. Twelve clones were cryopreserved and the karyotype (number of chromosomes) of each clone was counted.
３）相同組換えＥＳ細胞からキメラマウスの作出
核型の正常なクローンを２つ選抜し、野生型マウスの８細胞期胚とＥＳ細胞塊を接着させる凝集法（集合キメラ法）によりキメラ胚を作成し、偽妊娠受容雌マウスの子宮に移植した（図７）。各々のＥＳ細胞クローンからキメラ率の高い（毛色判定で80％以上）キメラマウスを複数匹得ることができた（図８）。
3) Production of chimeric mice from homologous recombination ES cells Two normal karyotype clones were selected and chimeric embryos were obtained by the aggregation method (aggregation chimera method) in which 8-cell embryos of wild-type mice and ES cell masses were adhered. And was transplanted into the uterus of a pseudopregnant female mouse (FIG. 7). From each ES cell clone, a plurality of chimeric mice having a high chimera rate (80% or more by hair color judgment) could be obtained (FIG. 8).
４）キメラマウスからＧＮＥ点変異ホモマウスの作出
キメラ率の高い雄のキメラマウスと野生型のC57BL/6マウスとを交配し、ＥＳ細胞由来の***が受精したF1マウスを得ることに成功した。尾部から調製した染色体DNAをPCRで解析することにより、ＧＮＥ点変異ヘテロマウスが得られていることを確認した。ついでＧＮＥ点変異ヘテロマウス同士を交配することにより、目的のＧＮＥ点変異ホモマウスの作出に成功した（図９）。ＧＮＥ完全破壊マウスは胎生致死であることが報告されているが、ＧＮＥ点変異ホモマウスは正常に出生し成長した。また、雌雄共に繁殖能力は正常であった。なお、先に選抜した２つのクローンの両方からＧＮＥ点変異ホモマウスを得ることができ、以下に述べるＧＮＥ点変異ホモマウスの病態は両方のマウスに共通に見られた。
4) Production of GNE point mutant homo mouse from chimeric mouse A male chimeric mouse having a high chimera rate and a wild type C57BL / 6 mouse were crossed to successfully obtain F1 mice fertilized with ES cell-derived sperm. By analyzing the chromosomal DNA prepared from the tail by PCR, it was confirmed that GNE point mutant hetero mice were obtained. Subsequently, by crossing GNE point mutant hetero mice, the target GNE point mutant homo mouse was successfully produced (FIG. 9). Although GNE completely disrupted mice have been reported to be embryonic lethal, GNE point mutant homo mice were born and grew normally. Both males and females had normal reproductive ability. In addition, GNE point mutant homo mice can be obtained from both of the two previously selected clones, and the pathological conditions of the GNE point mutant homo mice described below were commonly seen in both mice.
実施例２ ＧＮＥ点変異（V572L）マウスの表現型 Example 2 Phenotype of GNE point mutation (V572L) mice
（１）筋肉の凍結切片の作製
マウスはエーテル麻酔下で頸椎脱臼により安楽死させた。
背筋、大腿四頭筋、前脛骨筋の３カ所の骨格筋を筋線維にそってなるべく長くなるように摘出した。
摘出された筋組織はクリオモルドに対して筋線維を垂直にたてるように配置し、筋組織のほとんどが露出するように少量の包埋剤を流し込んだ。
クリオモルドをピンセットではさみ、あらかじめ十分に冷却したイソペンタン中に沈め、細かく揺すりながら凍結させた。
イソペンタンは、100mlビーカーに70ml程を注ぎ入れ、液体窒素中にビーカーを浸けて冷却した。
クライオスタットを用いて10μmの厚さの切片を作製し、MASコートされたスライドグラスに貼付けた。
ティシュー・テック クリオモルド2号（Tissue-Tek 4566） サクラファインテックジャパン株式会社
凍結組織切片作製用包埋剤（M.E CRYO COMPOUND）株式会社マイクロ・エッヂ・インスツルメント
クライオスタット ライカ凍結ミクロトーム CMシリーズ（LEICA CM1900）ライカマイクロシステムズ株式会社
MATUNAMI MASコート付 MICRO SLIDE GLASS
イソペンタン（isopentane）和光純薬166-00615
(1) Preparation of frozen section of muscle Mice were euthanized by cervical dislocation under ether anesthesia.
Three skeletal muscles, the back muscle, quadriceps muscle, and anterior tibialis muscle, were extracted as long as possible along the muscle fibers.
The extracted muscle tissue was placed so that the muscle fibers were perpendicular to the cryomold, and a small amount of embedding agent was poured so that most of the muscle tissue was exposed.
Cryomold was sandwiched with tweezers, submerged in well-cooled isopentane, and frozen with fine shaking.
About 70 ml of isopentane was poured into a 100 ml beaker, and the beaker was immersed in liquid nitrogen and cooled.
A 10 μm-thick section was prepared using a cryostat and attached to a MAS-coated slide glass.
Tissue-Tek 4566 Sakura Finetech Japan Co., Ltd. Frozen tissue section preparation (ME CRYO COMPOUND) Micro Edge Instruments Cryostat Leica Frozen Microtome CM Series (LEICA CM1900) Leica Microsystems Co., Ltd.
With MATUNAMI MAS coat MICRO SLIDE GLASS
Isopentane Wako Pure Chemical 166-00615
（２）ヘマトキシリンエオジン染色法
ハリスヘマトキシリン液で5分間染色後、流水で10分間水洗。その後、0.5%エオジン液で1分間染色し、流水で1分水洗した。アルコールで脱水し、キシレンで透徹後、カナダバルサムで封入した。なお、この実施例においては、下記の試薬等を用いて下記の条件で処理を行った。
試薬
ヘマトキシリン
Harris hematoxylin solution (Merck, Darmstadt, Germany)
エオジン
Eosin Y-solution 0.5% (Merck, Darmstadt, Germany)
カナダバルサム
Nacalai tesque
1. Harris ヘマトキシリン液 ５min
2. 水洗 10 min
3. 0.5% エオジン液 1 min
4. 水洗 1min
5. アルコール脱水
70% 2分
80% 2分
95% 2分
99% 3分
99% 3分
6. キシレン 3分
7. キシレン ３分
8. カナダバルサムで封入
(2) Hematoxylin and eosin staining method After staining with Harris hematoxylin solution for 5 minutes, rinse with running water for 10 minutes. Thereafter, it was stained with 0.5% eosin solution for 1 minute and washed with running water for 1 minute. It was dehydrated with alcohol, cleared with xylene, and sealed with Canadian balsam. In this example, the treatment was performed under the following conditions using the following reagents and the like.
Reagent hematoxylin
Harris hematoxylin solution (Merck, Darmstadt, Germany)
Eosin
Eosin Y-solution 0.5% (Merck, Darmstadt, Germany)
Canadian Balsam
Nacalai tesque
1. Harris Hematoxylin 5min
2. Water wash 10 min
3.0.5% eosin solution 1 min
4. Water wash 1min
5. Alcohol dehydration
70% 2 minutes
80% 2 minutes
95% 2 minutes
99% 3 minutes
99% 3 minutes
6. Xylene 3 minutes
7. Xylene 3 minutes
8. Enclosed with Canadian Balsam
（３）NADH-TR染色
凍結保存してあるNADH液を解凍しNBT液と1:1の割合で混ぜる。この混合液を凍結切片にまんべんなくかけ、乾燥しないように湿潤したチャンバー内に置き、37℃で30分間インキュベートした。次いでイオン交換水で軽く水洗し、アセトンで分別し、水洗後グリセリンゼリーで封入した。
試薬
Gelatin (Difco)
Glycerol (Nacalai tesque)
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced (NADH) (関東化学)
Nitro blue tetrazolium (Merck, Darmstadt, Germany)
＜グリセリンゼリー＞
ゼラチンをイオン交換水で溶解しグリセリンとフェノールを加えて80℃で混和した。37℃に温めて使用した。
１． 凍結保存してあるNADH液を解凍後NBT液に加えた。
２． 上記混合液をスライドガラス上の凍結切片にかけ、チャンバー内で37℃、30分間インキュベートした。
３． イオン交換水で軽く洗浄した。
４． 30%アセトンに数秒間浸漬した。
５． 60%アセトンに数秒間浸漬した。
６． 90%アセトンに数秒間浸漬した。
７． イオン交換水で軽く洗浄した。
８． グリセリンゼリーで封入した。
(3) NADH-TR staining Thaw frozen NADH solution and mix with NBT solution at a ratio of 1: 1. This mixture was spread evenly over the frozen sections, placed in a humid chamber so as not to dry, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Subsequently, it was lightly washed with ion-exchanged water, fractionated with acetone, washed with water and sealed with glycerin jelly.
reagent
Gelatin (Difco)
Glycerol (Nacalai tesque)
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced (NADH) (Kanto Chemical)
Nitro blue tetrazolium (Merck, Darmstadt, Germany)
<Glycerin jelly>
Gelatin was dissolved in ion-exchanged water, glycerin and phenol were added, and the mixture was mixed at 80 ° C. It was used after warming to 37 ° C.
1. The frozen NADH solution was added to the NBT solution after thawing.
2. The above mixture was applied to a frozen section on a slide glass and incubated in a chamber at 37 ° C. for 30 minutes.
3. Lightly washed with ion exchange water.
4). It was immersed in 30% acetone for several seconds.
5. It was immersed in 60% acetone for several seconds.
6). It was immersed in 90% acetone for several seconds.
7). Lightly washed with ion exchange water.
8). Encapsulated with glycerin jelly.
（４）抗ユビキチン抗体を用いた免疫組織化学染色
作成した筋肉の凍結切片を、ペルオキシダーゼブロッキング溶液を用いて−２０℃で２０分間処理し，２％ヤギ血清を用いて常温で６０分間ブロッキングした。その後、一次抗体を適当に希釈し４℃で一晩反応させ、ＴＢＳＴで洗浄した後に二次抗体を反応させた。ABC Rabbit IgG Kit（Vector PK-6101）で処理した後，ＤＡＢ溶液（Vector SK-4100）で発色させた。
(4) Immunohistochemical staining using anti-ubiquitin antibody The prepared frozen section of muscle was treated with a peroxidase blocking solution at −20 ° C. for 20 minutes, and blocked with 2% goat serum for 60 minutes at room temperature. Thereafter, the primary antibody was appropriately diluted, reacted at 4 ° C. overnight, washed with TBST, and then reacted with the secondary antibody. After treatment with ABC Rabbit IgG Kit (Vector PK-6101), color was developed with DAB solution (Vector SK-4100).
免疫染色に使用した一次抗体は、ウサギ抗ユビキチン抗体（DakoCytomation, Cat#Z-0458）である。二次抗体はヤギ抗ウサギIgGビオチン化抗体(Vector BA-1000)を用いた。 The primary antibody used for immunostaining is a rabbit anti-ubiquitin antibody (DakoCytomation, Cat # Z-0458). As the secondary antibody, goat anti-rabbit IgG biotinylated antibody (Vector BA-1000) was used.
（５）透過電子顕微鏡による観察
マウスを２．５％グルタールアルデヒドを含む０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で心臓より灌流固定し、組織を取り出し同じ固定液でさらに１時間固定した。その後、１％四酸化オスミウムを含む０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１時間、後固定した。次に上昇エタノール系列とプロピレンオキシドで脱水後、エポン包埋した。超薄切片作製後、酢酸ウランとクエン酸鉛で二重染色し、透過電子顕微鏡（日立 Ｈ７６００）で観察・撮影した。
(5) Observation by transmission electron microscope The mouse was fixed by perfusion from the heart with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) containing 2.5% glutaraldehyde, and the tissue was taken out and fixed with the same fixing solution for another hour. . Thereafter, it was post-fixed with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% osmium tetroxide for 1 hour. Next, it was dehydrated with ascending ethanol series and propylene oxide, and embedded in Epon. After the ultrathin section was prepared, it was double-stained with uranium acetate and lead citrate, and observed and photographed with a transmission electron microscope (Hitachi H7600).
（６）血漿クレアチンキナーゼ値測定
測定には３ヶ月齢から２４ヶ月齢のマウスを、野生型個体１１匹、ヘテロ個体２７匹、ホモ個体２８匹用いた。
(6) Measurement of plasma creatine kinase level For the measurement, 11 wild type individuals, 27 heterozygous individuals, and 28 homozygous individuals were used from 3 to 24 months of age.
ヘパリンコート処理したヘマトクリット毛細管（ドラモンド社製）を用いて、マウス尾部より30-50μlの血液を採取した。遠心分離操作（6,600回転、5分間）後、血漿成分のみを分離して試料とした。測定は富士ドライケム3500（富士フイルムメディカル製）及び同社製のクレアチンキナーゼ測定用スライド（CPK-PIII）による比色法を用いて行った。 30-50 μl of blood was collected from the tail of the mouse using a heparin-coated hematocrit capillary tube (Drummond). After centrifugation (6,600 rpm, 5 minutes), only the plasma component was separated and used as a sample. The measurement was performed using a colorimetric method using Fuji Dry Chem 3500 (manufactured by Fuji Film Medical) and a slide for creatine kinase measurement (CPK-PIII) manufactured by the same company.
（７）尿中アルブミン濃度測定
測定には３ヶ月齢から２４ヶ月齢のマウスを、野生型個体１０匹、ヘテロ個体２１匹、ホモ個体１８匹用い、ＥＬＩＳＡ法により測定した。
(7) Measurement of urinary albumin concentration For measurement, 3 to 24 months old mice were measured by ELISA using 10 wild type individuals, 21 hetero individuals, and 18 homo individuals.
ＧＮＥ点変異（V572L）マウスの表現型
ＧＮＥ完全破壊マウスは胎生致死であったのに対し、ＧＮＥ点変異マウスは正常に生まれてきた。雌雄ともに妊よう性に異常はなく、外見上は特に異常は認められなかった。
ＤＭＲＶは、筋線維の中に縁取り空胞が認められることが特徴であるが、細胞質内に好塩基性封入体が観察されることも特徴であり、これらの病理的変化が診断の決め手となる。本願発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の骨格筋を、月齢を追って解析したところ、明らかな縁取り空胞の形成は認められないが、患者でも病変が出やすい大腿四頭筋において、１０ヵ月齢以降の個体において好塩基性封入体が観察された（図１０及び図１１）。１５ヵ月齢まで観察を続けたところ、多くの筋繊維で封入体が観察された。さらに、電子顕微鏡を用いて１５ヵ月齢のＧＮＥ点変異マウスの大腿四頭筋の封入体を観察したところ、オートファゴソーム、オートリソソーム、グリコゲノソーム様構造や管状構造が観察された（図１２）。これらは、縁取り空胞の出現の前兆であると考えられる。
また、再生筋線維と思われる像も観察されたことから、筋線維の破壊の指標となる血漿クレアチンキナーゼ値を測定したところ、野生型マウスに比べてＧＮＥ点変異ホモマウスとヘテロマウスで高い値を示す個体がいることがわかった（図１３）。さらに、糸球体障害の指標となり、慢性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、腎硬化症など糸球体に組織変化をきたす腎臓疾患患者の尿中に出現する尿中アルブミン濃度を測定したところ、野生型マウスとＧＮＥ点変異ヘテロマウスの間には大きな違いは見られなかったが、ＧＮＥ点変異ホモマウスでは、有意に高い値を示し、糸球体に障害を有することが推察された（図１４）。そこで、腎臓組織を採取し観察したところ、皮質においては尿細管拡張、出血及び炎症性細胞浸潤が見られ（図１５）、髄質においては出血が見られ（図１６）、腎臓機能が不全となっていることが明らかとなった。
さらに、本発明のＧＮＥ点変異ホモマウス、ＧＮＥ点変異ヘテロマウス及び野生型マウスの５００日齢までの生存率を確認したところ、離乳した全てのマウスにおいて１ヵ月や２ヵ月で死亡するマウスは確認されず、８０日齢までの生存率がほぼ１００％であった（図１７）。その後、ＧＮＥ点変異ホモマウスの生存率は、ＧＮＥ点変異ヘテロマウス及び野生型マウスと比較して低い傾向を示したが、約４０％が５００日齢まで生存し、モデル動物として有用であることが明らかとなった。
以上のことから、本発明のＧＮＥ点変異マウスは、ＤＭＲＶの特徴的な病態を発症しており、ＤＭＲＶモデルマウスであることが明らかとなっただけでなく、腎臓疾患モデルマウスであることも明らかとなった。
Phenotype of GNE Point Mutant (V572L) Mice Completely disrupted GNE mice were embryonic lethal, whereas GNE point mutant mice were born normally. There was no abnormality in fertility in both sexes, and no abnormalities were observed in appearance.
DMRV is characterized by the presence of rimmed vacuoles in muscle fibers, but also characterized by the presence of basophil inclusions in the cytoplasm, and these pathological changes are decisive for diagnosis. . When the skeletal muscle of the transgenic non-human mammal of the present invention was analyzed with age, no obvious border vacuole formation was observed, but in patients with quadriceps that are likely to develop lesions even after 10 months of age Basophilic inclusion bodies were observed in the individual (FIGS. 10 and 11). When observation was continued until the age of 15 months, inclusion bodies were observed in many muscle fibers. Furthermore, when the inclusion body of the quadriceps femoris of a 15-month-old GNE point mutant mouse was observed using an electron microscope, autophagosomes, autolysosomes, glycogenosome-like structures and tubular structures were observed (FIG. 12). These are thought to be precursors of the appearance of rimmed vacuoles.
In addition, since an image that seems to be a regenerated muscle fiber was also observed, the plasma creatine kinase level, which is an index of muscle fiber destruction, was measured. The value was higher in the GNE point mutant homo mouse and hetero mouse than in the wild type mouse. It was found that there were individuals to show (FIG. 13). Furthermore, when measuring the urinary albumin concentration that appears in the urine of patients with kidney diseases that cause tissue changes in the glomeruli such as chronic glomerulonephritis, nephrotic syndrome, nephrosclerosis, etc. Although there was no significant difference between the GNE point mutant hetero mice, the GNE point mutant homo mice showed a significantly high value, and it was inferred that the glomerulus was damaged (FIG. 14). Thus, when kidney tissue was collected and observed, tubular expansion, bleeding and inflammatory cell infiltration were observed in the cortex (FIG. 15), bleeding was observed in the medulla (FIG. 16), and renal function was incomplete. It became clear that.
Furthermore, when the survival rate of the GNE point mutant homo mouse, GNE point mutant hetero mouse and wild type mouse of the present invention up to 500 days of age was confirmed, mice that died in 1 month or 2 months were confirmed in all weaned mice. The survival rate up to 80 days of age was almost 100% (FIG. 17). Thereafter, the survival rate of GNE point mutant homo mice tended to be lower than that of GNE point mutant hetero mice and wild type mice, but about 40% survived to 500 days of age and were useful as model animals. It became clear.
From the above, the GNE point mutant mouse of the present invention has developed a characteristic pathology of DMRV, and it has been clarified that it is a DMRV model mouse as well as a kidney disease model mouse. It became.
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。 In the above, this invention was demonstrated based on the Example. It is to be understood by those skilled in the art that this embodiment is merely an example, and that various modifications are possible and that such modifications are within the scope of the present invention.
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|---|---|---|---|---|
| WO2017135452A1 (en) * | 2016-02-05 | 2017-08-10 | 国立大学法人大阪大学 | Transgenic silkworm having mammalian-type sugar chain attached thereto |
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2007
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