JP2008125453A - Alternative test method for sensitizing property of sparingly soluble substance - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、温度感応性ハイドロゲルを使用する難水溶性物質の感作性インビトロ評価方法及び感作性物質を活性化又は抑制する難水溶性物質の評価方法に関する。 The present invention relates to a sensitization in vitro evaluation method for a poorly water-soluble substance using a temperature-sensitive hydrogel, and a method for evaluating a hardly water-soluble substance that activates or suppresses the sensitizer substance.
生体においてアレルギー等を誘発する物質（感作性物質）を評価する方法としては、実験動物に被験物質を適用し、そして該実験動物の皮膚などに生ずる反応を視察する方法が行われている。しかしながら、この方法は動物愛護等の見地から見直しがせまられている。 As a method for evaluating a substance (sensitizing substance) that induces allergies or the like in a living body, a method in which a test substance is applied to an experimental animal and a reaction occurring on the skin of the experimental animal is observed. However, this method has been reviewed from the viewpoint of animal welfare.
外来物質によりアレルギー反応が惹起される最初の段階では、抗原提示細胞が感作性物質に暴露されると、抗原は該細胞により従属リンパ節に運ばれる。そこで、該細胞は、その細胞表面に抗原を担持したＭＨＣクラスＩＩタンパク質や、ＣＤ８６分子などを発現し、Ｔ細胞に抗原提示を行う。これにより、抗原特異的な獲得性免疫応答が成立する。この一連の過程では、該細胞は多くのサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２など）やケモカイン（ＭＩＰ−１αやＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）を産生することで、活性化し、従属リンパ節への遊走が可能になる。このような抗原提示細胞としては樹状細胞やヒト単核球細胞株が知られている。しかしながら、樹状細胞の性質には個人差があり、また再現性に問題があり、一定の特性を有する樹状細胞を安定的に入手することが困難である。また、樹状細胞はその調製に困難さが伴う。 In the first stage where an allergic reaction is elicited by a foreign substance, when the antigen-presenting cell is exposed to the sensitizing substance, the antigen is carried by the cell to the dependent lymph node. Therefore, the cell expresses MHC class II protein carrying an antigen on its cell surface, CD86 molecule, etc., and presents the antigen to T cells. This establishes an antigen-specific acquired immune response. In this series of processes, the cells are activated and dependent by producing many cytokines (IL-1β, IL-6, IL-12, etc.) and chemokines (MIP-1α, MIP-1β, RANTES, etc.). Migration to lymph nodes becomes possible. As such antigen-presenting cells, dendritic cells and human mononuclear cell lines are known. However, there are individual differences in the nature of dendritic cells, and there is a problem in reproducibility, and it is difficult to stably obtain dendritic cells having certain characteristics. Dendritic cells are also difficult to prepare.
他方、ヒト単核球細胞株は細胞の取扱いは、比較的容易であり、現時点ではヒト単核球細胞株に感作性物質を作用させた場合、該細胞表面に感作性物質の量や特性を反映してＣＤ８６分子が発現されることが明らかとなっている。特開２００１−２２１７９６号公報はＣＤ８６の発現を指標とする感作性物質のインビトロ評価方法を開示する。また、金属ニッケルやコバルトのように、ヒト単核球細胞株に作用させてもＣＤ８６の発現を亢進させない場合については、特開２００５−２７８６２８号公報において、刺激を受けた白血球や他の組織細胞、腫瘍細胞で生産されるペプチドであり、ＣＣケモカインの一つであるＭＩＰ−１の発現を指標とする評価方法が開示されている。更に、特開２００６−１３６２１５号公報においては、ケモカインレセプターの一つであるＣＣＲ７、樹状細胞などで発現しているサイトカインの一種であるＩＬ−２３、及び多くの細胞でＵＶなどのストレスに応答して発現する転写因子であるＡＴＦ−３を指標とする評価方法が開示されている。しかしながら、これらの試験方法においては、被験物質を培養水溶液中で適用することから、被験物質が難水溶性物質である場合にはその適用が困難であるという問題があり、その改良が強く望まれていた。 On the other hand, human mononuclear cell lines are relatively easy to handle, and at present, when sensitizing substances are allowed to act on human mononuclear cell lines, the amount of sensitizing substances on the cell surface It has been shown that CD86 molecules are expressed reflecting their properties. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-221796 discloses an in vitro method for evaluating a sensitizing substance using CD86 expression as an index. In addition, regarding the case where the expression of CD86 is not enhanced by acting on a human mononuclear cell line, such as metallic nickel or cobalt, in JP-A-2005-278628, stimulated leukocytes and other tissue cells An evaluation method using MIP-1 expression, which is a peptide produced in tumor cells and one of CC chemokines, as an index is disclosed. Furthermore, in Japanese Patent Laid-Open No. 2006-136215, CCR7, which is one of chemokine receptors, IL-23, which is a kind of cytokine expressed in dendritic cells, and many cells respond to stress such as UV. An evaluation method using ATF-3, which is a transcription factor expressed as an index, is disclosed. However, in these test methods, since the test substance is applied in an aqueous culture solution, there is a problem that the test substance is difficult to apply when the test substance is a poorly water-soluble substance. It was.
従って、本発明は、温度感応性ハイドロゲルを使用する難水溶性物質の感作性インビトロ評価方法及び感作性物質を活性化又は抑制する難水溶性物質の評価方法を供する。 Accordingly, the present invention provides an in vitro evaluation method for sensitization of poorly water-soluble substances using a temperature-sensitive hydrogel and an evaluation method for poorly water-soluble substances that activates or suppresses sensitizing substances.
上記問題を解決するために、本発明者は、ハイドロゲル培地中でヒト単核球細胞を三次元培養し、かかる培養ゲルにおいて難水溶性物質を適用すると、該難水溶性物質がゲル中に浸潤することにより、ゲル内の細胞を暴露させることを見出した。しかしながら、難水溶性物質の感作性を評価するためには、細胞の回収が容易であり、且つ高い細胞生存率を得る必要がある。かかる課題を解決するために、培地として環境変化（温度変化及びｐＨ変化）によりゾル−ゲル化が生じるハイドロゲルを使用することを試みた。本発明者は、ヒト単核球細胞がｐＨ変化よりも温度変化に対して抵抗性を有し、更にｐＨ感応性ハイドロゲルよりも、温度感応性ハイドロゲルを使用した場合のほうが、回収が容易であることを見出し、かかる温度感応性ハイドロゲル培地を利用することにより、再現性及びコストパフォーマンスに優れ、かつ簡単に行うことができる難水溶性物質の感作性の評価を可能にした。尚、ハイドロゲル培地とは、ハイドロゲルと細胞培養培地を混合して得られる細胞支持体（scaffold)を意味する。 In order to solve the above problem, the present inventor has three-dimensionally cultured human mononuclear cells in a hydrogel medium, and when the poorly water-soluble substance is applied to the culture gel, the poorly water-soluble substance is contained in the gel. It has been found that by infiltration, cells in the gel are exposed. However, in order to evaluate the sensitization property of a poorly water-soluble substance, it is necessary to easily collect cells and obtain a high cell viability. In order to solve this problem, an attempt was made to use a hydrogel in which sol-gelation occurs due to environmental changes (temperature changes and pH changes) as a medium. The present inventor found that human mononuclear cells are more resistant to temperature changes than pH changes, and that recovery is easier when temperature sensitive hydrogels are used than pH sensitive hydrogels. By using such a temperature-sensitive hydrogel medium, it was possible to evaluate the sensitization of a poorly water-soluble substance that is excellent in reproducibility and cost performance and can be easily performed. The hydrogel medium means a cell support obtained by mixing hydrogel and cell culture medium.
温度感応性ハイドロゲルには、例えば、メビオールジェル（登録商標）があり、これはポリマー素材を使用した温度に反応する細胞・組織培養用マトリックス、寒天ゲルやゼラチンゲルとは逆に、低温（１５℃以下）で水溶液、高温（２５℃以上）で透明なゲル状になり、立体的な培養が可能で、温度を下げることにより融解する温度感応性ハイドロゲル培地であり、細胞の回収が容易な培地として知られている（例えば、H. N. MadhavanらのA study on the growth of continuous culture cell lines embedded in Mebiol gelを参照のこと）。かかる温度感応性ハイドロゲル培地を培地として利用することにより、ゲル化状態において難水溶性物質に細胞を暴露させ、そして温度を低下させてゾル化（液状化）させることにより高い生存率において細胞の回収を可能にした。 An example of a temperature-sensitive hydrogel is Meviol Gel (registered trademark), which is a low temperature (in contrast to an agar gel or gelatin gel, a matrix for cell / tissue culture that reacts to temperature using a polymer material). It is a temperature-sensitive hydrogel medium that forms an aqueous solution at 15 ° C or lower), a transparent gel at high temperatures (25 ° C or higher), can be three-dimensionally cultured, and melts when the temperature is lowered, and cells can be easily recovered. (See, for example, HN Madhavan et al., A study on the growth of continuous culture cell lines embedded in Mebiol gel). By using such a temperature-sensitive hydrogel medium as a culture medium, cells are exposed to a poorly water-soluble substance in a gelled state, and sol-formation (liquefaction) is performed by lowering the temperature. Collection was made possible.
従って、本発明の第一の観点において、ヒト単核球細胞上で発現される分子を指標として難水溶性物質の感作性をインビトロ評価する方法において、ゲル状の温度感応性ハイドロゲル培地に難水溶性被験物質を浸潤させることにより、該被験物質により培地中のヒト単核球細胞を暴露させ、ヒト単核球細胞上で発現される分子を検出する前に、温度を下げることにより温度感応性ハイドロゲル培地をゾル化させてヒト単核球細胞を回収し、そして通常培地で培養することを特徴とする方法、を供する。 Therefore, in the first aspect of the present invention, in a method for in vitro evaluation of sensitization of a poorly water-soluble substance using a molecule expressed on human mononuclear cells as an index, a gel-like temperature-sensitive hydrogel medium is used. By infiltrating a poorly water-soluble test substance, human mononuclear cells in the medium are exposed by the test substance, and before detecting molecules expressed on the human mononuclear cells, the temperature is lowered by lowering the temperature. A method is provided which comprises solubilizing a sensitive hydrogel medium to recover human mononuclear cells and culturing in a normal medium.
本発明の第二の観点において、ヒト単核球細胞上で発現される分子を指標として難水溶性物質の感作性をインビトロ評価する方法であって、ゾル状の温度感応性ハイドロゲル培地にヒト単核球細胞を混合し、昇温することにより該ハイドロゲル培地をゲル化させて該細胞を培養する工程、該細胞を含むゲル状の培地に難水溶性被験物質を適用する工程、そして該細胞上で発現される分子を検出する工程、を含んで成る方法、を供する。 In a second aspect of the present invention, there is provided a method for evaluating in vitro the sensitization of a poorly water-soluble substance using a molecule expressed on human mononuclear cells as an index, which is applied to a sol-like temperature-sensitive hydrogel medium. Mixing human mononuclear cells and heating the gel to gel the hydrogel medium and culturing the cells; applying a poorly water-soluble test substance to the gelled medium containing the cells; and Detecting a molecule expressed on the cell.
本発明の第三の観点において、ヒト単核球細胞上で発現される分子を指標として難水溶性被験物質が難水溶性感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤であるか否かを評価する方法であって、温度感応性ハイドロゲル培地に難水溶性感作性試料と難水溶性被験物質を一緒に適用し、これらをゲル状の温度感応性ハイドロゲル培地内に浸潤させることにより培地中のヒト単核球細胞を暴露させることを特徴とする方法、を供する。 In the third aspect of the present invention, it is evaluated whether or not a poorly water-soluble test substance is an activator or inhibitor for a poorly water-soluble sensitizer using a molecule expressed on human mononuclear cells as an index. A method comprising applying a sparingly water-soluble sensitizing sample and a sparingly water-soluble test substance together to a temperature-sensitive hydrogel medium, and infiltrating the gel into the gel-like temperature-sensitive hydrogel medium. A method comprising exposing human mononuclear cells is provided.
本発明の第一から第三の観点の好適な態様において、前記ヒト単核球細胞上で発現される分子が、ＣＤ８６分子、ＣＤ５４分子、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＣＣＲ７、ＩＬ−２３、ＡＴＦ−３、又はこれらの組み合わせであることを特徴とする。 In a preferred embodiment of the first to third aspects of the present invention, the molecule expressed on the human mononuclear cell is CD86 molecule, CD54 molecule, MIP-1α, MIP-1β, CCR7, IL-23, It is ATF-3 or a combination thereof.
本発明の第一から第三の観点の更に好適な態様において、ゲル状の温度感応性ハイドロゲル培地におけるヒト単核球細胞の培養時間が約２時間である。 In a further preferred embodiment of the first to third aspects of the present invention, the culture time of human mononuclear cells in a gel-like temperature-sensitive hydrogel medium is about 2 hours.
本発明の第一から第三の観点の更に好適な態様において、通常培地中の培養時間が約２２時間である。 In a further preferred embodiment of the first to third aspects of the present invention, the culture time in the normal medium is about 22 hours.
本発明の第一から第三の観点の更に好適な態様において、ヒト単核球細胞がＴＨＰ−１細胞である。 In a further preferred embodiment of the first to third aspects of the present invention, the human mononuclear cell is a THP-1 cell.
本発明の第一から第三の観点の更に好適な態様において、温度感応性ハイドロゲルがメビオールジェル（登録商標）である。 In a further preferred embodiment of the first to third aspects of the present invention, the temperature sensitive hydrogel is Meviol Gel (registered trademark).
本発明により、難水溶性物質の感作性をインビトロにおいて評価することが可能となる。 The present invention makes it possible to evaluate in vitro the sensitization properties of poorly water-soluble substances.
本発明において用いる細胞としては、感作性物質の特性を反映して、ＣＤ８６分子、ＣＤ５４分子、ＭＩＰ−１分子、即ち、ＭＩＰ−１α及び／又はＭＩＰ−１β、ＣＣＲ７、ＩＬ−２３、及び／又はＡＴＦ−３を放出するものであれば特に限定されず、哺乳動物の単核球細胞、特にヒト単核球細胞等であってよく、具体例としてＴＨＰ−１細胞が挙げられる。ＴＨＰ−１細胞は樹立された培養細胞であって、当業界の研究者により広く用いられており、容易に入手することができる。具体的には、ＴＨＰ−１細胞は公的な細胞バンクまたは民間企業より入手することができる。 The cells used in the present invention reflect CD86 molecule, CD54 molecule, MIP-1 molecule, that is, MIP-1α and / or MIP-1β, CCR7, IL-23, and / or reflecting the characteristics of the sensitizing substance. Or it will not specifically limit if it releases ATF-3, A mononuclear cell of a mammal, especially a human mononuclear cell etc. may be sufficient, A THP-1 cell is mentioned as a specific example. THP-1 cells are established cultured cells that are widely used by researchers in the field and are readily available. Specifically, THP-1 cells can be obtained from public cell banks or private companies.
ＣＤ８６分子及びＣＤ５４分子は、ヒト単核球細胞に感作性物質を作用させた場合に、該細胞の表面に、感作性物質の量や特性を反映して発現される単鎖膜貫通型タンパクであり、感作性の指標と使用することができる。 The CD86 molecule and the CD54 molecule are expressed on the surface of cells when a sensitizing substance is allowed to act on human mononuclear cells, reflecting the amount and characteristics of the sensitizing substance. It is a protein and can be used as an indicator of sensitization.
ＭＩＰ−１（マクロファージ由来炎症性タンパク質１）（ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１β）は、ヒト単核球細胞に感作性物質を作用させた場合に、感作性物質の量や特性を反映して放出される、白血球や他の組織細胞、腫瘍細胞で生産されるペプチドであり、これはＣＣケモカインの１つであり、感作性の指標と使用することができる。 MIP-1 (macrophage-derived inflammatory protein 1) (MIP-1α and MIP-1β) reflects the amount and characteristics of sensitizing substances when sensitizing substances are allowed to act on human mononuclear cells. Is a peptide produced by leukocytes, other tissue cells, and tumor cells, which is a CC chemokine and can be used as an indicator of sensitization.
ＣＣＲ７は、ケモカインレセプターの一つであり、活性化した樹状細胞表面に発現しているタンパク質であり、樹状細胞の所属リンパ節への遊走に関与している。ＩＬ−２３は、樹状細胞などで発現しているサイトカインの一種であり、メモリーＴ細胞やナイーブＴ細胞の増殖に関与している。ＡＴＦ−３は、多くの細胞でＵＶなどのストレスに応答して発現する転写因子である。ヒト単核球細胞株に感作性物質を作用させた場合、感作性物質の量や特性に反映してこれらの分子が発現され、感作性の指標と使用することができる。 CCR7 is one of chemokine receptors, a protein expressed on the surface of activated dendritic cells, and is involved in migration of dendritic cells to the regional lymph nodes. IL-23 is a kind of cytokine expressed in dendritic cells and is involved in proliferation of memory T cells and naive T cells. ATF-3 is a transcription factor expressed in response to stresses such as UV in many cells. When a sensitizing substance is allowed to act on a human mononuclear cell line, these molecules are expressed by reflecting the amount and characteristics of the sensitizing substance and can be used as an index of sensitization.
本発明において用いる温度感応性ハイドロゲルは、温度変化によりゲル−ゾル化するハイドロゲルであり、好ましくはメビオールジェル（登録商標）である。メビオールジェル（登録商標）は（株）池田理研から購入することができ、細胞や組織の培養試薬であり、低温（１５℃以下）下においてゾル上のメビオールジェル（登録商標）を含有する培地中に細胞を混合し、昇温（２５℃以上）することによりゲル化させることができ、細胞を三次元培養することが可能である。温度を下げることによりメビオールジェル（登録商標）培地は再びゾル化するために容易に回収することができ、細胞へのストレスを抑えることが可能である。 The temperature-sensitive hydrogel used in the present invention is a hydrogel that becomes a gel-sol by temperature change, and is preferably Meviol Gel (registered trademark). Meviol Gel (registered trademark), which can be purchased from Ikeda Riken Co., Ltd., is a cell and tissue culture reagent, and contains meviol gel (registered trademark) on sol at low temperature (15 ° C or lower). Cells can be gelled by mixing the cells in the medium and raising the temperature (25 ° C. or higher), and the cells can be cultured three-dimensionally. By lowering the temperature, Meviol Gel (registered trademark) medium can be easily recovered for solification again, and stress on cells can be suppressed.
メビオールジェル（登録商標）培地は、クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）を含むフラスコに１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０を加え、１５℃以下で３時間以上静置し、その後振盪してメビオールジェル（登録商標）を培地中に完全に溶解させ、泡消するまで低温下で静置することにより調製する。 For Meviol Gel (registered trademark) medium, 10 mL of RPMI 1640 was added to a flask containing Meviol Gel (registered trademark) in a clean bench, left at 15 ° C. or lower for 3 hours or longer, and then shaken to give Meviol Gel ( (Registered trademark) is completely dissolved in the medium and prepared by allowing to stand at a low temperature until the foam disappears.
本明細書でいう、通常培地とは、細胞を培養するために一般的に用いられる培地を意味し、上述のメビオールジェル（登録商標）培地の調製に使用される培地も含む。例えば具体例としてＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地等が挙げられる。これらの培地にはおよそ１０％程度のウシ胎児血清が添加されていてよい。 The normal medium as used herein means a medium generally used for culturing cells, and includes a medium used for preparing the above-mentioned Meviol Gel (registered trademark) medium. Specific examples include RPMI 1640 medium, DMEM medium, Dulbecco's modified Eagle medium, and the like. About 10% of fetal calf serum may be added to these media.
低温下、好ましくは１５℃以下において、ＴＨＰ−１細胞数が１×１０6細胞／５００μＬ／ウェル、２×１０6細胞／５００μＬ／ウェル、又は４×１０6細胞／５００μＬ／ウェルとなるように上述のメビオールジェル（登録商標）培地と混合し、該混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種し、好ましくは２５℃以上に昇温することにより、該混合液をゲル化させる。一方難水溶性の被験物質を適当な溶媒、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、適当な担体、好ましくは、流動パラフィンを用いて被験物質溶液を調製し、該調製液を５００μＬ／ウェルにおいて上記のゲル状培地に適用し、３７℃でインキュベーションする。かかるインキュベーション（培養）時間は、好ましくは２時間である。その後培養プレートを氷冷することでゾル化させた細胞混合液をエッペンドルフチューブに回収して、遠心分離を行う。その後１ｍＬのＲＰＭＩ培地で洗浄し、上清を除去した後、１ｍＬのＲＰＭＩ培地を加え、２４ウェルプレートに移す。通常培地、好ましくはＲＰＭＩ培地にて、２２時間培養後、感作性物質に起因するＴＨＰ−１細胞由来の発現物質を検出又は測定する。感作性物質に起因して指標とされるＴＨＰ−１細胞由来の発現物質は、好ましくはＣＤ８６分子、ＣＤ５４分子、ＭＩＰ−１分子、例えば、ＭＩＰ−１α若しくはＭＩＰ−１β、ＣＣＲ７、ＩＬ−２３、及び／又はＡＴＦ−３であり、より好ましくはＣＤ８６分子、及び／又はＣＤ５４分子であり、最も好ましくはＣＤ８６分子である。 At a low temperature, preferably at 15 ° C. or lower, the THP-1 cell count is 1 × 10 6 cells / 500 μL / well, 2 × 10 6 cells / 500 μL / well, or 4 × 10 6 cells / 500 μL / well. The mixture is mixed with the above-mentioned Meviol Gel (registered trademark) medium, seeded in a 24-well plate at 500 μL / well, and preferably heated to 25 ° C. or higher to gel the mixture. On the other hand, a poorly water-soluble test substance is dissolved in an appropriate solvent, preferably dimethyl sulfoxide (DMSO), and then a test substance solution is prepared using an appropriate carrier, preferably liquid paraffin. Apply to the above gel medium in wells and incubate at 37 ° C. Such incubation (culture) time is preferably 2 hours. Thereafter, the cell mixture that has been solated by cooling the culture plate with ice is collected in an Eppendorf tube and centrifuged. After washing with 1 mL of RPMI medium and removing the supernatant, 1 mL of RPMI medium is added and transferred to a 24-well plate. After culturing in a normal medium, preferably an RPMI medium for 22 hours, the expressed substance derived from THP-1 cells caused by the sensitizing substance is detected or measured. The expression substance derived from THP-1 cells, which is an index due to the sensitizing substance, is preferably a CD86 molecule, a CD54 molecule, a MIP-1 molecule, for example, MIP-1α or MIP-1β, CCR7, IL-23. And / or ATF-3, more preferably a CD86 molecule and / or a CD54 molecule, and most preferably a CD86 molecule.
細胞の表面に発現されたＣＤ８６分子又はＣＤ５４分子の検出又は測定方法は特に限定されないが、抗ヒトＣＤ８６抗体又は抗ヒトＣＤ５４抗体を用いた免疫測定が好ましく、フローサイトメトリー法が特に好ましい。抗ヒトＣＤ８６／ＣＤ５４抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、ＣＤ８６又はＣＤ５４を表面に発現している細胞を免疫原として用いた常法に従って調製することができる。フローサイトメトリー法も常法に従って行うことができる（特開２００１−２２１７９６号公報を参照のこと）。 The method for detecting or measuring CD86 molecule or CD54 molecule expressed on the surface of the cell is not particularly limited, but immunoassay using anti-human CD86 antibody or anti-human CD54 antibody is preferable, and flow cytometry method is particularly preferable. The anti-human CD86 / CD54 antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and can be prepared according to a conventional method using cells expressing CD86 or CD54 on the surface as an immunogen. The flow cytometry method can also be performed according to a conventional method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-221796).
ＭＩＰ−１の検出又は測定方法は、細胞における遺伝発現を検出する定量的又は定性的ＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング等の方法やＭＩＰ−１に対する抗体との反応性に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウスタンブロッティング等の方法を用いることができる。いずれの方法によってもＭＩＰ−１の測定が可能であるが、操作の簡便性、感度、設備等の点からヒト単核球細胞から培地中に放出されたＭＩＰ−１分子をエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ法）で測定するのが好ましい（特開２００５−２７８６２８号公報を参照のこと）。 Methods for detecting or measuring MIP-1 include quantitative or qualitative RT-PCR methods for detecting genetic expression in cells, microarrays, northern blotting, enzyme immunoassays based on reactivity with antibodies to MIP-1, radio Methods such as immunoassay and Ustan blotting can be used. MIP-1 can be measured by any of the methods, but MIP-1 molecules released from human mononuclear cells into the medium from the standpoint of ease of operation, sensitivity, equipment, etc. are determined by enzyme immunoassay (ELISA method). ) Is preferable (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-278628).
ＣＣＲ７、ＩＬ−２３及び／又はＡＴＦ−３の検出又は測定方法は、ＣＣＲ７、ＩＬ−２３及び／又はＡＴＦ−３分子を発現する細胞における遺伝発現を検出する定量的又は定性的ＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング等の方法を用いることができる。また、ＣＣＲ７については、ＣＣＲ７に対する抗体との反応性に基づくフローサイトメトリー法等の方法を用いることができ、ＩＬ−２３については、ＩＬ−２３に対する抗体との反応性に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング等の方法を用いることができる。測定については、操作の簡便性、感度、設備等の点からＣＣＲ７、ＩＬ−２３、ＡＴＦ−３を発現する細胞から発現されるＣＣＲ７、ＩＬ−２３、ＡＴＦ−３をコードする遺伝子、例えば、対応のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法で測定するのが好ましい（特開２００６−１３６２１５号公報を参照のこと）。 A method for detecting or measuring CCR7, IL-23 and / or ATF-3 is a quantitative or qualitative RT-PCR method for detecting genetic expression in cells expressing CCR7, IL-23 and / or ATF-3 molecule, Methods such as microarray and Northern blotting can be used. For CCR7, a method such as a flow cytometry method based on the reactivity with an antibody against CCR7 can be used. For IL-23, an enzyme immunoassay or radioimmunoassay based on a reactivity with an antibody against IL-23. A method such as Western blotting can be used. For measurement, genes encoding CCR7, IL-23, and ATF-3 expressed from cells expressing CCR7, IL-23, and ATF-3 from the viewpoint of convenience of operation, sensitivity, equipment, etc. Is preferably measured by RT-PCR (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-136215).
感作性物質の評価においては、好ましくは、被験物質を加えないで、上記の同様の培養を行い対照とする。 In the evaluation of the sensitizing substance, preferably, the same culture as described above is performed as a control without adding the test substance.
また難水溶性感作性物質を阻害又は活性化する難水溶性物質の評価においては、ゲル状の温度感応性ハイドロゲル培地、例えば、メビオールジェル（登録商標）培地中のヒト単核球細胞、好ましくはＴＨＰ−１を、既知の難水溶性感作性物質とともに難水溶性被験物質に暴露し、好ましくは２時間後、好ましくは通常培地中で２２時間培養を行い、そして上述の難水溶性物質の感作性インビトロ評価方法と同様にヒト単核球細胞由来の発現物質、好ましくはＣＤ８６分子、ＣＤ５４分子、ＭＩＰ−１分子、例えば、ＭＩＰ−１α若しくはＭＩＰ−１β、ＣＣＲ７、ＩＬ−２３、及び／又はＡＴＦ−３、より好ましくはＣＤ８６分子、及び／又はＣＤ５４分子を検出又は測定する。この場合も、好ましくは被験物質を加えないで上記と同様の培養を行い、対象とする。 In the evaluation of a poorly water-soluble substance that inhibits or activates a poorly water-soluble sensitizer, a gel-like temperature-sensitive hydrogel medium, for example, human mononuclear cells in Meviol Gel (registered trademark) medium, Preferably, THP-1 is exposed to a poorly water-soluble test substance together with a known poorly water-soluble sensitizer, preferably after 2 hours, and preferably cultured in a normal medium for 22 hours, and the aforementioned poorly water-soluble substance In the same way as the in vitro sensitization method described above, an expression substance derived from human mononuclear cells, preferably CD86 molecule, CD54 molecule, MIP-1 molecule, for example, MIP-1α or MIP-1β, CCR7, IL-23, and Detecting or measuring ATF-3, more preferably CD86 molecules and / or CD54 molecules. Also in this case, it is preferable to carry out the same culture as described above without adding the test substance.
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 The following examples further illustrate the present invention.
実験１：メビオールジェル（登録商標）（温度感応性ハイドロゲル）及びＢＤ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲル（ｐＨ感応性ハイドロゲル）の比較
本発明における培養担体として温度感応性のメビオールジェル（登録商標）とｐＨ感応性ハイドロゲルのＢＤ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルのどちらが適しているかを、細胞生存率及び細胞の回収方法について以下のとおり比較検討を行った。
Experiment 1: Comparison of Meviol Gel (registered trademark) (temperature-sensitive hydrogel) and BD PuraMatrix (registered trademark) peptide hydrogel (pH-sensitive hydrogel) As a culture carrier in the present invention, temperature-sensitive meviol gel ( The cell viability and the cell recovery method were compared as follows to determine which of the registered trademark) and the pH sensitive hydrogel BD PuraMatrix (registered trademark) peptide hydrogel was suitable.
材料
細胞：ＴＨＰ−１（３３７４０５３）
培地：ＲＰＭＩ１６４０
試薬：メビオールジェル（登録商標）（（株）池田理研、型番：ＰＭＷ２０−１００５）、ＢＤ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲル（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、商品番号３５４２５０）、１０％ショ糖溶液（和光社）
Material Cell: THP-1 (33774053)
Medium: RPMI 1640
Reagent: Meviol Gel (registered trademark) (Ikeda Riken, model number: PMW20-1005), BD PuraMatrix (registered trademark) peptide hydrogel (BD bioscience, product number 354250), 10% sucrose solution (Wako)
方法
（１）メビオールジェルを用いた細胞培養
メビオールジェル（登録商標）培地の準備
クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）入りのフラスコに上記培地１０ｍＬを加え、低温下（１５℃以下）で３時間以上静置し、その後、振盪してメビオールジェル（登録商標）に完全に溶解させた。完全に溶解したら消泡するまで低温下で数時間〜数日間、静置し保存した。
Method (1) Cell culture using mebiol gel Preparation of mebiol gel (registered trademark) medium 10 mL of the above medium was added to a flask containing mebiol gel (registered trademark) in a clean bench, and the temperature was low (15 ° C or lower). And then allowed to stand for 3 hours or longer, and then shaken to completely dissolve in Meviol Gel (registered trademark). When completely dissolved, the solution was allowed to stand for several hours to several days under low temperature until it was defoamed and stored.
メビオールジェル（登録商標）培地と細胞の混合
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、２×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、低温下においてあるメビオールジェル（登録商標）で調整した。
Mixing of Meviol Gel (registered trademark) medium and cells Using a calculator, the number of THP-1 cells was counted, and Meviol Gel (registered) was kept at a low temperature so that it would be 2 × 10 6 cells / 500 μL / well. Trademark).
播種及び培養
調整したＴＨＰ−１細胞・メビオールジェル（登録商標）培地混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種した。その後、培地を５００μＬ／ウェルずつ加え、３７℃のインキュベーターで培養した。
Seeding and culture The adjusted THP-1 cell / Meviol gel (registered trademark) medium mixture was seeded in a 24-well plate at 500 μL / well. Thereafter, 500 μL / well of medium was added and cultured in a 37 ° C. incubator.
（２）ＢＤ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルを用いた細胞培養
ＢＤ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルの準備
ＢＤ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルを３０分間ソニケーションする。
(2) Cell Culture Using BD PuraMatrix (R) Peptide Hydrogel Preparation of BD PuraMatrix (R) Peptide Hydrogel BD PuraMatrix (R) peptide hydrogel is sonicated for 30 minutes.
細胞の準備
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、１０％ショ糖溶液で洗浄後、２×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、１０％ショ糖溶液に懸濁した。
Cell preparation The number of THP-1 cells was counted using a calculator, washed with 10% sucrose solution, and suspended in 10% sucrose solution to 2 × 10 6 cells / 500 μL / well. .
ＢＤ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルと細胞の混合
ＢＤ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルと細胞／ショ糖混合液を等量ずつとり混合した。これを２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルずつ加えた。５〜１０分後、培地を交換した。３０分以内に該培地交換を２回行った後、３７℃のインキュベーターで培養した。
Mixing of BD PuraMatrix (registered trademark) peptide hydrogel and cells BD PuraMatrix (registered trademark) peptide hydrogel and cell / sucrose mixture were mixed in equal amounts. 500 μL / well of this was added to a 24-well plate. After 5-10 minutes, the medium was changed. The medium was changed twice within 30 minutes, and then cultured in a 37 ° C. incubator.
（３）細胞の回収
メビオールジェル（登録商標）
培養終了後、培地を５００μＬ／ウェルずつ加え、プレートごと５分間氷冷した。完全にゾル状になったらエッペンドルフチューブに回収し、遠心を行った。上清を除去し、新しい培地を１ｍＬ加えた。
(3) Cell recovery Mebiol Gel (registered trademark)
After completion of the culture, 500 μL / well of medium was added, and the whole plate was ice-cooled for 5 minutes. When it was completely sol, it was collected in an Eppendorf tube and centrifuged. The supernatant was removed and 1 mL of fresh medium was added.
ＢＤ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲル
ピペッティングを行いゲルを破壊した。滑らかになったらエッペンドルフチューブに回収し、遠心を行った。上清を除去し、新しい培地１ｍＬを加えた。
BD PuraMatrix® peptide hydrogel was pipetted to break the gel. When smooth, it was collected in an Eppendorf tube and centrifuged. The supernatant was removed and 1 mL of fresh medium was added.
（４）トリパンブルー染色
細胞溶解液と０．４％トリパンブルー（GIBCO社）を（１：１）で混合し、計算盤で生細胞数を計測した。
(4) Trypan blue staining Cell lysate and 0.4% trypan blue (GIBCO) were mixed at (1: 1), and the number of viable cells was counted with a calculation board.
その結果を表１に示す。
ＢＤ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲル及びメビオールジェル（登録商標）のいずれにおいても、８０％以上の生存率が得られた。しかしながら、細胞の回収において、ＢＤ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルは何度洗浄を行っても、ゲルと完全には分離しなかった。 In both BD PuraMatrix (registered trademark) peptide hydrogel and Meviol gel (registered trademark), a survival rate of 80% or more was obtained. However, in the cell recovery, the BD PuraMatrix® peptide hydrogel did not completely separate from the gel after many washes.
考察
培養後にインビトロ皮膚感作性試験法を用いて感作性を評価することを考えると、細胞の回収が容易なメビオールジェル（登録商標）が培養担体として適している可能性が示唆された。
Discussion Considering the evaluation of sensitization using an in vitro skin sensitization test method after culture, it was suggested that Meviol Gel (registered trademark), which allows easy cell recovery, may be suitable as a culture carrier. .
結論
インビトロ皮膚感作性試験法を用いた感作性評価試験においては、培養担体としてメビオールジェル（登録商標）の方がＢＤ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドハイドロゲルより適している。
Conclusion In the sensitization evaluation test using the in vitro skin sensitization test method, Meviol Gel (registered trademark) is more suitable as a culture carrier than BD PuraMatrix (registered trademark) peptide hydrogel.
実験２：播種細胞数・培養時間の検討
メビオールジェル（登録商標）を培養担体としたときの播種細胞数及び培養時間の最適条件を設定する。
Experiment 2: Examination of the number of seeded cells and culture time The optimal conditions for the number of seeded cells and the culture time when Mebiol Gel (registered trademark) is used as a culture carrier are set.
材料
細胞：ＴＨＰ−１（３３７４０５３）
培地：ＲＰＭＩ１６４０
試薬：メビオールジェル（登録商標）（（株）池田理研、型番：ＰＭＷ２０−１００５）
Material Cell: THP-1 (33774053)
Medium: RPMI 1640
Reagent: Mebiol Gel (registered trademark) (RIKEN Ikeda, model number: PMW20-1005)
方法
（１）メビオールジェル（登録商標）培地の準備
クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）入りのフラスコに上記培地１０ｍＬを加え、低温下（１５℃以下）で３時間以上静置し、その後、振盪してメビオールジェル（登録商標）に完全に溶解させた。完全に溶解したら消泡するまで低温下で数時間〜数日間、静置し保存した。
Method (1) Preparation of meviol gel (registered trademark) medium In a clean bench, add 10 mL of the medium to a flask containing meviol gel (registered trademark), and leave it at low temperature (15 ° C. or less) for 3 hours or more. Then, it was shaken and completely dissolved in Meviol Gel (registered trademark). When completely dissolved, the solution was allowed to stand for several hours to several days under low temperature until it was defoamed and stored.
メビオールジェル（登録商標）培地と細胞の混合
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、１×１０6、２×１０6、及び４×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、低温下においてあるメビオールジェル（登録商標）で調整した。
Mixing of Meviol Gel (registered trademark) medium and cells Count the number of THP-1 cells using a calculator, so that it becomes 1 × 10 6 , 2 × 10 6 , and 4 × 10 6 cells / 500 μL / well. In addition, it was adjusted with Meviol Gel (registered trademark) at a low temperature.
播種及び培養
調整したＴＨＰ−１細胞・メビオールジェル（登録商標）培地混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種した。その後、培地を５００μＬ／ウェルずつ加え、３７℃のインキュベーターで培養した。
Seeding and culture The adjusted THP-1 cell / Meviol gel (registered trademark) medium mixture was seeded in a 24-well plate at 500 μL / well. Thereafter, 500 μL / well of medium was added and cultured in a 37 ° C. incubator.
細胞の回収と生存率測定
１２、２４、及び４８時間経過したプレートを氷冷することにより培地をゾル化させ、細胞をエッペンドルフチューブに回収し、ＦＡＣＳ用バッファーで洗浄した。その後ヨウ化プロピジウムで核染色し、フローサイトメトリーにて細胞の生存率を測定した。
Cell Recovery and Viability Measurement Plates that had passed 12, 24, and 48 hours were ice-cooled to make the medium sol, and the cells were collected in an Eppendorf tube and washed with FACS buffer. Thereafter, the cells were stained with propidium iodide and the cell viability was measured by flow cytometry.
その結果を表２に示す。
播種細胞数については、０．５×１０6、１．０×１０6、及び２．０×１０6細胞／１ｍＬ／ウェルで播種した試料で良好な生存率が得られた。培養時間については２４時間で最も生存率が良好であった。しかしながら、現行のインビトロ皮膚感作試験では無処置群で９０％の生存率が得られない場合、データとして採用されないことから、培養時間については再度検討が必要であると考えられた。 Regarding the number of seeded cells, good survival rates were obtained with samples seeded at 0.5 × 10 6 , 1.0 × 10 6 , and 2.0 × 10 6 cells / 1 mL / well. Regarding the culture time, the best survival rate was 24 hours. However, in the current in vitro skin sensitization test, if 90% survival rate was not obtained in the untreated group, it was not adopted as data, so it was considered that the culture time needs to be examined again.
結論
播種細胞数は１．０×１０6細胞／１ｍＬ／ウェル、培養時間は２４時間が最適であった。
Conclusion The number of seeded cells was 1.0 × 10 6 cells / 1 mL / well, and the culture time was optimal for 24 hours.
実験３：ゲル内での培養時間の検討
生存率が９０％以上となる、培養時間の最適条件を検討する。
Experiment 3: Examination of the culture time in the gel The optimum condition of the culture time at which the survival rate is 90% or more is examined.
材料
細胞：ＴＨＰ−１（３３７４０５３）
培地：ＲＰＭＩ１６４０
試薬：メビオールジェル（登録商標）（（株）池田理研、型番：ＰＭＷ２０−１００５）
Material Cell: THP-1 (33774053)
Medium: RPMI 1640
Reagent: Mebiol Gel (registered trademark) (RIKEN Ikeda, model number: PMW20-1005)
方法
（１）メビオールジェル（登録商標）培地の準備
クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）入りのフラスコに上記培地１０ｍＬを加え、低温下（１５℃以下）で３時間以上静置し、その後、振盪してメビオールジェル（登録商標）に完全に溶解させた。完全に溶解したら消泡するまで低温下で数時間〜数日間、静置し保存した。
Method (1) Preparation of meviol gel (registered trademark) medium In a clean bench, add 10 mL of the medium to a flask containing meviol gel (registered trademark), and leave it at low temperature (15 ° C. or less) for 3 hours or more. Then, it was shaken and completely dissolved in Meviol Gel (registered trademark). When completely dissolved, the solution was allowed to stand for several hours to several days under low temperature until it was defoamed and stored.
メビオールジェル（登録商標）培地と細胞の混合
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、１×１０6、２×１０6、及び４×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、低温下においてあるメビオールジェル（登録商標）で調整した。
Mixing of Meviol Gel (registered trademark) medium and cells Count the number of THP-1 cells using a calculator, so that it becomes 1 × 10 6 , 2 × 10 6 , and 4 × 10 6 cells / 500 μL / well. In addition, it was adjusted with Meviol Gel (registered trademark) at a low temperature.
播種及び培養
調整したＴＨＰ−１細胞・メビオールジェル（登録商標）培地混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種した。その後、培地を５００μＬ／ウェルずつ加え、３７℃のインキュベーターで培養した。
Seeding and culture The adjusted THP-1 cell / Meviol gel (registered trademark) medium mixture was seeded in a 24-well plate at 500 μL / well. Thereafter, 500 μL / well of medium was added and cultured in a 37 ° C. incubator.
細胞の回収と生存率測定
２時間経過したプレートを氷冷することでゾル状にした細胞混合液を、エッペンドルフチューブに回収し、遠心を行った。その後ＲＰＭＩ培地１ｍＬで洗浄し、上清を除去した後、ＲＰＭＩ培地を１ｍＬ加え、２４ウェルプレートに移した。ＲＰＭＩ培地で２２時間培養後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で核染色し、フローサイトメトリーにて細胞の生存率を測定した。
Cell Recovery and Viability Measurement The cell mixture that had been made into a sol form by cooling the plate after 2 hours with ice was collected in an Eppendorf tube and centrifuged. After washing with 1 mL of RPMI medium and removing the supernatant, 1 mL of RPMI medium was added and transferred to a 24-well plate. After culturing in RPMI medium for 22 hours, nuclear staining was performed with propidium iodide (PI), and cell viability was measured by flow cytometry.
２４時間経過したプレートを氷冷することでゾル状にした細胞混合液をエッペンドルフチューブに回収し、フローサイトメトリーバッファーで洗浄した。その後ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で核染色し、フローサイトメトリーにて細胞の生存率を測定した。 The cell mixture which was made into a sol form by cooling the plate after 24 hours with ice was collected in an Eppendorf tube and washed with a flow cytometry buffer. Thereafter, the cells were stained with propidium iodide (PI) and the viability of the cells was measured by flow cytometry.
その結果を表３に示す。
ゲル内で２時間培養した後、通常の液体培地であるＲＰＭＩ培地で２２時間培養した場合、生存率が９０％以上となることがわかった。 It was found that after culturing in the gel for 2 hours and then culturing in RPMI medium, which is a normal liquid medium, for 22 hours, the survival rate is 90% or more.
考察
ゲル内で長時間（２４時間）培養を行うと、剪断応力などトラップされることによる影響が細胞の生存率を低下させる可能性が示唆された。
Discussion When long-term (24 hours) culturing was performed in a gel, it was suggested that the effects of trapping such as shear stress may reduce the cell viability.
結論
ゲル内での培養時間は２時間とし、その後ＲＰＭＩ培地で２２時間培養することが好ましい。
Conclusion The culture time in the gel is preferably 2 hours and then cultured in RPMI medium for 22 hours.
実験４：被験物質適用条件の検討（ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ））
代表的な感作性物質であるジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）の適用でＣＤ８６値が上昇するかを確認する。
Experiment 4: Examination of test substance application conditions (dinitrochlorobenzene (DNCB))
It is confirmed whether the CD86 value is increased by application of dinitrochlorobenzene (DNCB), which is a typical sensitizing substance.
材料
細胞：ＴＨＰ−１（３３７４０５３）
培地：ＲＰＭＩ１６４０
試薬：メビオールジェル（登録商標）（（株）池田理研、型番：ＰＭＷ２０−１００５）
Material Cell: THP-1 (33774053)
Medium: RPMI 1640
Reagent: Mebiol Gel (registered trademark) (RIKEN Ikeda, model number: PMW20-1005)
方法
（１）メビオールジェル（登録商標）培地の準備
クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）入りのフラスコに上記培地１０ｍＬを加え、低温下（１５℃以下）で３時間以上静置し、その後、振盪してメビオールジェル（登録商標）に完全に溶解させた。完全に溶解したら消泡するまで低温下で数時間〜数日間、静置し保存した。
Method (1) Preparation of meviol gel (registered trademark) medium In a clean bench, add 10 mL of the medium to a flask containing meviol gel (registered trademark), and leave it at low temperature (15 ° C. or less) for 3 hours or more. Then, it was shaken and completely dissolved in Meviol Gel (registered trademark). When completely dissolved, the solution was allowed to stand for several hours to several days under low temperature until it was defoamed and stored.
ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）の調製
ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）（最終濃度２、２．４、２．９、３．４、４．２、５、６、及び７．２μｇ／ｍＬ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、ＲＰＭＩ培地を用いて調製した。
Preparation of dinitrochlorobenzene (DNCB) Dinitrochlorobenzene (DNCB) (
メビオールジェル（登録商標）培地と細胞の混合
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、１×１０6、２×１０6、及び４×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、低温下においてあるメビオールジェル（登録商標）で調整した。
Mixing of Meviol Gel (registered trademark) medium and cells Count the number of THP-1 cells using a calculator, so that it becomes 1 × 10 6 , 2 × 10 6 , and 4 × 10 6 cells / 500 μL / well. In addition, it was adjusted with Meviol Gel (registered trademark) at a low temperature.
播種及び培養
調整したＴＨＰ−１細胞・メビオールジェル（登録商標）培地混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種した。その後、無処理群には上記培地を、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）処理群には上記で調製したジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）調製液をそれぞれ５００μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃のインキュベーターで培養した。
Seeding and culture The adjusted THP-1 cell / Meviol gel (registered trademark) medium mixture was seeded in a 24-well plate at 500 μL / well. Thereafter, the above medium was added to the untreated group, and the dinitrochlorobenzene (DNCB) preparation solution prepared above was added to the dinitrochlorobenzene (DNCB) treated group in an amount of 500 μL / well, respectively, and cultured in a 37 ° C. incubator.
細胞の回収と生存率測定
２時間経過したプレートを氷冷することでゾル状にした細胞混合液を、エッペンドルフチューブに回収し、遠心を行った。その後ＲＰＭＩ培地１ｍＬで洗浄し、上清を除去した後、ＲＰＭＩ培地を１ｍＬ加え、２４ウェルプレートに移した。２２時間培養後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で核染色し、フローサイトメトリーにて細胞の生存率を測定した。
Cell Recovery and Viability Measurement The cell mixture that had been made into a sol form by cooling the plate after 2 hours with ice was collected in an Eppendorf tube and centrifuged. After washing with 1 mL of RPMI medium and removing the supernatant, 1 mL of RPMI medium was added and transferred to a 24-well plate. After culturing for 22 hours, the cells were stained with propidium iodide (PI), and the cell viability was measured by flow cytometry.
ＣＤ８６値及びＣＤ５４値の測定
ＣＤ８６値及びＣＤ５４値の測定において、培養後の細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣで蛍光標識した抗ヒトＣＤ８６抗体又は抗ヒトＣＤ５４抗体を用いて氷水中で３０分間染色し、そして染色した細胞をＰＢＳで洗浄し、洗浄後の細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳに浮遊させた。その細胞浮遊液を用いてフローサイトメトリーにより生細胞の蛍光強度を測定し、被験物質無処理のコントロールを比較した。
Measurement of CD86 value and CD54 value In measurement of CD86 value and CD54 value, the cultured cells were washed with PBS, and stained with iced water using anti-human CD86 antibody or anti-human CD54 antibody fluorescently labeled with FITC for 30 minutes. The stained cells were washed with PBS, and the washed cells were suspended in PBS containing 1% BSA. Using the cell suspension, the fluorescence intensity of the living cells was measured by flow cytometry, and the control without test substance treatment was compared.
その結果を表４に示す。
考察
ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）の感作性を評価できる可能性が示唆された。更に二次元培養時とは異なる濃度反応性を示したことから、三次元培養にすることで二次元培養とは物質の浸透性等が異なる可能性が示唆され、三次元培養独自の濃度設定が必要であることが考えられた。
Discussion The possibility that sensitization of dinitrochlorobenzene (DNCB) could be evaluated was suggested. Furthermore, since the concentration responsiveness was different from that in 2D culture, it was suggested that the 3D culture may have different substance permeability from 2D culture. It was considered necessary.
結論
該三次元培養モデルにおいてジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）の適用によりＣＤ８６値の上昇が認められた。
Conclusion In the three-dimensional culture model, an increase in CD86 value was observed by applying dinitrochlorobenzene (DNCB).
実験５：被験物質適用条件の検討
感作性物質であるニッケルやグルタルアルデヒドの適用でＣＤ８６値が上昇するか、また非感作性物質であるラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）でＣＤ８６値が上昇しないかを確認する。
Experiment 5: Examination of test substance application conditions Is CD86 value increased by the application of nickel or glutaraldehyde as a sensitizing substance, or is CD86 value not increased by sodium lauryl sulfate (SLS) as a non-sensitizing substance? Confirm.
材料
細胞：ＴＨＰ−１（３３７４０５３）
培地：ＲＰＭＩ１６４０
試薬：メビオールジェル（登録商標）（（株）池田理研、型番：ＰＭＷ２０−１００５）
Material Cell: THP-1 (33774053)
Medium: RPMI 1640
Reagent: Mebiol Gel (registered trademark) (RIKEN Ikeda, model number: PMW20-1005)
方法
（１）メビオールジェル（登録商標）培地の準備
クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）入りのフラスコに上記培地１０ｍＬを加え、低温下（１５℃以下）で３時間以上静置し、その後、振盪してメビオールジェル（登録商標）に完全に溶解させた。完全に溶解したら消泡するまで低温下で数時間〜数日間、静置し保存した。
Method (1) Preparation of meviol gel (registered trademark) medium In a clean bench, add 10 mL of the medium to a flask containing meviol gel (registered trademark), and leave it at low temperature (15 ° C. or less) for 3 hours or more. Then, it was shaken and completely dissolved in Meviol Gel (registered trademark). When completely dissolved, the solution was allowed to stand for several hours to several days under low temperature until it was defoamed and stored.
被験物質の調製
ニッケル（最終濃度：７２．３、８６．８、１０４．２、１２５、１５０、１８０、２１６、及び２５９．２μｇ／ｍＬ）を生理食塩水に溶解させた後、ＲＰＭＩ培地を用いて調製した。
Preparation of test substance Nickel (final concentrations: 72.3, 86.8, 104.2, 125, 150, 180, 216, and 259.2 μg / mL) was dissolved in physiological saline, and then RPMI medium was used. Prepared.
グルタルアルデヒド（最終濃度：２．７、３．２、３．９、４．６、５．６、６．７、８、及び９．６μｇ／ｍＬ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、ＲＰＭＩ培地を用いて調製した。 After dissolving glutaraldehyde (final concentrations: 2.7, 3.2, 3.9, 4.6, 5.6, 6.7, 8, and 9.6 μg / mL) in dimethyl sulfoxide (DMSO) And using RPMI medium.
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）（最終濃度：２４、２９、３５、４２、５０、６０、及び７２μｇ／ｍＬ）を生理食塩水に溶解させた後、ＲＰＭＩ培地を用いて調製した。 Sodium lauryl sulfate (SLS) (final concentrations: 24, 29, 35, 42, 50, 60, and 72 μg / mL) was dissolved in physiological saline and then prepared using RPMI medium.
メビオールジェル（登録商標）培地と細胞の混合
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、１×１０6、２×１０6、及び４×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、低温下においてあるメビオールジェル（登録商標）で調整した。
Mixing of Meviol Gel (registered trademark) medium and cells Count the number of THP-1 cells using a calculator, so that it becomes 1 × 10 6 , 2 × 10 6 , and 4 × 10 6 cells / 500 μL / well. In addition, it was adjusted with Meviol Gel (registered trademark) at a low temperature.
播種及び培養
調整したＴＨＰ−１細胞・メビオールジェル（登録商標）培地混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種した。その後、無処理群には培地を、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）処理群には上で調製した被験物質調製液をそれぞれ５００μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃のインキュベーターで培養した。
Seeding and culture The adjusted THP-1 cell / Meviol gel (registered trademark) medium mixture was seeded in a 24-well plate at 500 μL / well. Thereafter, the medium was added to the untreated group, and the test substance preparation solution prepared above was added to the dinitrochlorobenzene (DNCB) -treated group in an amount of 500 μL / well and cultured in a 37 ° C. incubator.
細胞の回収と生存率測定
２時間経過したプレートを氷冷することでゾル状にした細胞混合液を、エッペンドルフチューブに回収し、遠心を行った。その後ＲＰＭＩ培地１ｍＬで洗浄し、上清を除去した後、ＲＰＭＩ培地を１ｍＬ加え、２４ウェルプレートに移した。２２時間培養後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で核染色し、フローサイトメトリーにて細胞の生存率を測定した。
Cell Recovery and Viability Measurement The cell mixture that had been made into a sol form by cooling the plate after 2 hours with ice was collected in an Eppendorf tube and centrifuged. After washing with 1 mL of RPMI medium and removing the supernatant, 1 mL of RPMI medium was added and transferred to a 24-well plate. After culturing for 22 hours, the cells were stained with propidium iodide (PI), and the cell viability was measured by flow cytometry.
ＣＤ８６値及びＣＤ５４値の測定
ＣＤ８６値及びＣＤ５４値の測定において、培養後の細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣで蛍光標識した抗ヒトＣＤ８６抗体又は抗ヒトＣＤ５４抗体を用いて氷水中で３０分間染色し、そして染色した細胞をＰＢＳで洗浄し、洗浄後の細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳに浮遊させた。その細胞浮遊液を用いてフローサイトメトリーにより生細胞の蛍光強度を測定し、被験物質無処理のコントロールを比較した。
Measurement of CD86 value and CD54 value In measurement of CD86 value and CD54 value, the cultured cells were washed with PBS, and stained with iced water using anti-human CD86 antibody or anti-human CD54 antibody fluorescently labeled with FITC for 30 minutes. The stained cells were washed with PBS, and the washed cells were suspended in PBS containing 1% BSA. Using the cell suspension, the fluorescence intensity of the living cells was measured by flow cytometry, and the control without test substance treatment was compared.
その結果を表５に示す。
考察
生存率から考えると、濃度をもう少し振り、用量依存性を検討する必要がある。
Discussion Considering the survival rate, it is necessary to shake the concentration a little more and examine the dose dependency.
実験６：被験物質適用条件の検討（難水溶性物質）
難水溶性物質の適用条件について検討を行う。
Experiment 6: Examination of test substance application conditions (poorly water-soluble substances)
Examine the application conditions of poorly water-soluble substances.
材料
細胞：ＴＨＰ−１（３３７４０５３）
培地：ＲＰＭＩ１６４０
試薬：メビオールジェル（登録商標）（（株）池田理研、型番：ＰＭＷ２０−１００５）
Material Cell: THP-1 (33774053)
Medium: RPMI 1640
Reagent: Mebiol Gel (registered trademark) (RIKEN Ikeda, model number: PMW20-1005)
方法
（１）メビオールジェル（登録商標）培地の準備
クリーンベンチ内でメビオールジェル（登録商標）入りのフラスコに上記培地１０ｍＬを加え、低温下（１５℃以下）で３時間以上静置し、その後、振盪してメビオールジェル（登録商標）に完全に溶解させた。完全に溶解したら消泡するまで低温下で数時間〜数日間、静置し保存した。
Method (1) Preparation of meviol gel (registered trademark) medium In a clean bench, add 10 mL of the medium to a flask containing meviol gel (registered trademark), and leave it at low temperature (15 ° C. or less) for 3 hours or more. Then, it was shaken and completely dissolved in Meviol Gel (registered trademark). When completely dissolved, the solution was allowed to stand for several hours to several days under low temperature until it was defoamed and stored.
被験物質の調製
ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）（最終濃度：８．６μｇ／ｍＬ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、ｉ）流動パラフィン、ii）ワセリン、iii ）ミエルナイトクリーム、iv）ＲＰＭＩ培地、を用いて調製した。
Preparation of test substance After dinitrochlorobenzene (DNCB) (final concentration: 8.6 μg / mL) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), i) liquid paraffin, ii) petrolatum, iii) myelnite cream, iv) RPMI medium , And was prepared using.
メビオールジェル（登録商標）培地と細胞の混合
計算盤を用いてＴＨＰ−１の細胞数を計測し、１×１０6、２×１０6、及び４×１０6細胞／５００μＬ／ウェルになるように、低温下においてあるメビオールジェル（登録商標）で調整した。
Mixing of Meviol Gel (registered trademark) medium and cells Count the number of THP-1 cells using a calculator, so that it becomes 1 × 10 6 , 2 × 10 6 , and 4 × 10 6 cells / 500 μL / well. In addition, it was adjusted with Meviol Gel (registered trademark) at a low temperature.
播種及び培養
調整したＴＨＰ−１細胞・メビオールジェル（登録商標）培地混合液を２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルで播種した。その後、無処理群には培地を、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）処理群には上で調製した被験物質調製液をそれぞれ５００μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃のインキュベーターで培養した。
Seeding and culture The adjusted THP-1 cell / Meviol gel (registered trademark) medium mixture was seeded in a 24-well plate at 500 μL / well. Thereafter, the medium was added to the untreated group, and the test substance preparation solution prepared above was added to the dinitrochlorobenzene (DNCB) -treated group in an amount of 500 μL / well and cultured in a 37 ° C. incubator.
細胞の回収と生存率測定
２時間経過したプレートを氷冷することでゾル状にした細胞混合液を、エッペンドルフチューブに回収し、遠心を行った。その後ＲＰＭＩ培地１ｍＬで洗浄し、上清を除去した後、ＲＰＭＩ培地を１ｍＬ加え、２４ウェルプレートに移した。２２時間培養後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で核染色し、フローサイトメトリーにて細胞の生存率を測定した。
Cell Recovery and Viability Measurement The cell mixture that had been made into a sol form by cooling the plate after 2 hours with ice was collected in an Eppendorf tube and centrifuged. After washing with 1 mL of RPMI medium and removing the supernatant, 1 mL of RPMI medium was added and transferred to a 24-well plate. After culturing for 22 hours, the cells were stained with propidium iodide (PI), and the cell viability was measured by flow cytometry.
ＣＤ８６値及びＣＤ５４値の測定
ＣＤ８６値及びＣＤ５４値の測定において、培養後の細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣで蛍光標識した抗ヒトＣＤ８６抗体又は抗ヒトＣＤ５４抗体を用いて氷水中で３０分間染色し、そして染色した細胞をＰＢＳで洗浄し、洗浄後の細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳに浮遊させた。その細胞浮遊液を用いてフローサイトメトリーにより生細胞の蛍光強度を測定し、被験物質無処理のコントロールを比較した。
Measurement of CD86 value and CD54 value In measurement of CD86 value and CD54 value, the cultured cells were washed with PBS, and stained with iced water using anti-human CD86 antibody or anti-human CD54 antibody fluorescently labeled with FITC for 30 minutes. The stained cells were washed with PBS, and the washed cells were suspended in PBS containing 1% BSA. Using the cell suspension, the fluorescence intensity of the living cells was measured by flow cytometry, and the control without test substance treatment was compared.
その結果を表６に示す。
ＲＰＭＩ培地及び流動パラフィンにジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）を混合した試料においてＣＤ８６値の上昇が認められた。 An increase in CD86 value was observed in a sample in which dinitrochlorobenzene (DNCB) was mixed with RPMI medium and liquid paraffin.
考察
生存率を見ると、ワセリン及びクリームではゲルにジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）が移行していないことがわかる。今後、媒体の移行性等、更なる検討が必要であるが、難水溶性物質を直接適用できる可能性も示唆された。
Discussion Looking at the survival rate, it is understood that dinitrochlorobenzene (DNCB) is not transferred to the gel in petrolatum and cream. In the future, further investigations such as the transferability of the medium are necessary, but it was suggested that a poorly water-soluble substance could be applied directly.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2006314819A JP2008125453A (en) | 2006-11-21 | 2006-11-21 | Alternative test method for sensitizing property of sparingly soluble substance |
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| JP (1) | JP2008125453A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017526378A (en) * | 2014-09-19 | 2017-09-14 | セフォ カンパニー リミテッド | Three-dimensional cell culture system and cell culture method using the same |
-
2006
- 2006-11-21 JP JP2006314819A patent/JP2008125453A/en not_active Withdrawn
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