JP2008125438A - 花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の評価方法及びスクリーニング方法、花粉症の予防又は治療のための薬剤及びその製造方法、並びに、花粉症の検査方法及び検査用薬剤 - Google Patents
花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の評価方法及びスクリーニング方法、花粉症の予防又は治療のための薬剤及びその製造方法、並びに、花粉症の検査方法及び検査用薬剤 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】被検物質がペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、を少なくとも含む花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の評価方法及びスクリーニング方法、並びに、花粉症の予防又は治療のための薬剤の製造方法である。また、ペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質を有効成分とする花粉症の予防又は治療のための薬剤である。また、ペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌を検出する花粉症の検査方法、及び、ペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対する抗体を含む花粉症の検査用薬剤である。
【選択図】なし
Description
これに対し、近年は、副作用の心配のない花粉症用の薬剤の開発についても広く研究が行われており、例えば、スフィンゴ脂質を有効成分としたIgE抗体産生抑制剤を含む花粉症の治療剤などが提案されている(特許文献1参照)。
<1> 被検物質が、花粉症に対する予防又は治療作用を有するか否かを評価する方法であって、
(a)前記被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程
を含むことを特徴とする方法である。
<2> 花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、
(a)被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、並びに、
(b)前記工程(a)で前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する工程
を含むことを特徴とする方法である。
<3> 花粉症の予防又は治療のための薬剤の製造方法であって、
(a)被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、
(b)前記工程(a)で前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する工程、
(c)前記工程(b)で選択された物質を生成する工程、並びに、
(d)前記工程(c)で生成された物質と、薬理学的に許容され得る担体とを混合する工程
を含むことを特徴とする製造方法である。
<4> 花粉症の予防又は治療のための薬剤であって、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有する物質を有効成分とすることを特徴とする薬剤である。
<5> (a’)被検体から被検試料を採取する工程、並びに、
(b’)前記工程(a’)で採取した被検試料について、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかを検出する工程
を含むことを特徴とする花粉症の検査方法である。
<6> ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する抗体を含むことを特徴とする花粉症の検査用薬剤である。
本発明の評価方法は、被検物質が、花粉症に対する予防又は治療作用を有するか否かを評価する方法であり、以下の工程(a)を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
また、本発明のスクリーニング方法は、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングする方法であり、以下の工程(a)〜工程(b)を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記評価方法及び前記スクリーニング方法(以下、単に前記「方法」と称することがある)は、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の評価乃至スクリーニングを、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する阻害活性を指標として行うことを特徴とする。
前記評価方法及び前記スクリーニング方法においては、まず、被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか(ペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌)に対して阻害活性を有するか否かを評価する(工程(a))。
前記「被検物質」としては、特に制限はなく、花粉症に対する予防又は治療作用を有するか否かを評価したい任意の物質を用いることができ、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製蛋白質、粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物、既存のペクチン分解酵素阻害薬、既存の抗真菌薬、既存の花粉症用の薬剤などが挙げられる。
前記「ペクチン分解酵素」としては、ペクチンを分解可能な酵素であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンエステラーゼなどが挙げられる。
前記被検物質が前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有するか否かを評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の酵素活性測定方法などを利用することができる。前記被検物質の存在下では、前記被検物質の非存在下と比較して、前記ペクチン分解酵素の酵素活性が低下するときに、前記被検物質は、前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有すると評価することができる。
また、ここで、後述する実施例1で示されるように、花粉内膜はペクチンで構成される膜であることから、前記被検物質が前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有するか否かを評価する方法としては、前記被検物質の存在下及び非存在下での、前記ペクチン分解酵素による花粉内膜の分解の程度の違いを調べてもよい。前記被検物質の存在下では、前記被検物質の非存在下と比較して、前記ペクチン分解酵素による花粉内膜の分解が抑制乃至阻止されたときに、前記被検物質は、前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有すると評価することができる。
前記被検物質が前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有するか否かを評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の真菌数測定方法、公知の真菌活性測定方法などを利用することができる。前記被検物質の存在下では、前記被検物質の非存在下と比較して、前記真菌数が減少するときに、乃至、前記真菌活性が低下するときに、前記被検物質は、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有すると評価することができる。
また、前記被検物質が前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有するか否かを評価する方法としては、間接的に、前記被検物質の存在下及び非存在下での、前記ペクチン分解酵素の酵素活性の違いを調べてもよく、また、前記被検物質の存在下及び非存在下での、前記ペクチン分解酵素による花粉内膜の分解の程度の違いを調べてもよい。
以上、前記工程(a)により、本発明の評価方法を行うことができる。前記評価方法によれば、容易に、かつ効率的に、被検物質が花粉症の予防又は治療作用を有するか否かを評価することができる。
また、前記スクリーニング方法においては、更に、前記工程(a)でペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか(ペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌)に対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する(工程(b))。
種々の被検物質を用いて前記工程(a)による評価を行い、次いで、本工程(b)において、種々の被検物質の中からペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有すると評価された物質を選択することにより、容易に、かつ効率的に、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
本発明の製造方法は、花粉症の予防又は治療のための薬剤の製造方法であり、以下の工程(a)〜工程(d)を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記製造方法における工程(a)及び工程(b)は、前記した本発明の評価方法及び本発明のスクリーニング方法における工程(a)及び工程(b)とそれぞれ同様である。前記工程(a)〜(b)により、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を、容易に、かつ効率的に選択することができる。
前記製造方法においては、次いで、前記工程(a)〜(b)で選択された、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を生成する(工程(c))。
前記生成の手段としては、特に制限はなく、例えば、前記物質の構造や由来などに応じて、化学合成や、分離精製などの公知の生成手段から適宜選択することができる。
前記製造方法においては、次いで、前記工程(c)で生成された物質を、薬学的に許容され得る担体と混合する(工程(d))。
−薬学的に許容され得る担体−
前記薬学的に許容され得る担体としては、特に制限はなく、例えば、製造する薬剤の所望の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記剤型としても、特に制限はなく、例えば、後述する本発明の薬剤の項目で列挙される剤型などが挙げられる。
前記工程(c)で生成された物質と前記薬学的に許容され得る担体との混合方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記物質に前記薬学的に許容され得る担体を添加してもよいし、前記薬学的に許容され得る担体に前記物質を添加してもよいし、双方を同時に容器内に添加し混合してもよい。また、前記混合方法としては、例えば、公知の薬剤の製造方法における各成分の混合方法から適宜選択することができる。
また、前記混合時の、前記物質と前記薬学的に許容され得る担体との使用量比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記工程(d)で得られた混合物を成形する成形工程、などが挙げられる。
前記製造方法により得られた花粉症の予防又は治療のための薬剤の使用形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する本発明の薬剤と同様に使用することができる。
本発明の薬剤は、花粉症の予防又は治療のための薬剤であって、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか(ペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌)に対して阻害活性を有する物質を有効成分として含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。なお、前記薬剤は、前記した本発明の製造方法により製造された薬剤であってもよい。
前記「ペクチン分解酵素」とは、ペクチンを分解する酵素の総称であり、例えば、一般的に、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンエステラーゼなどが知られている。後述する実施例1において示されるように、花粉内膜はペクチンから構成されるため、目や鼻に侵入し、形態変化を起こした花粉内膜に前記ペクチン分解酵素が作用すると、花粉内膜は分解され、内容物であるCryj1、Cryj2タンパク質が放出されて、くしゃみや鼻水などの花粉症のアレルギー症状が引き起こされると考えられる。したがって、前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有する物質は、花粉症を予防又は治療するための有効成分となり得る。
前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有する物質としては、前記ペクチン分解酵素の反応速度を低下させ、その働きを阻害することのできる物質であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システインなどが挙げられる。
前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質としては、特に制限はなく、例えば、アンホテリシンB、フルコナゾール、ミコナゾール、ミカファンギンなどが挙げられる。また、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質としては、中でも、体内、特に鼻腔粘膜内などに存在し得る前記真菌に対して阻害活性を有する物質であることが好ましい。
また、前記ペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質としては、例えば、前記した本発明の評価方法、本発明のスクリーニング方法により、花粉症に対する予防又は治療作用を有すると評価乃至スクリーニングされた物質を使用することもできる。
また、前記有効成分は、いずれか1種を単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。2種以上を併用する場合の、前記薬剤中の各々の有効成分の含有量比にも、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、後述する前記薬剤の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記薬剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて、適宜選択することができる。
前記薬剤の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤(錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等)、経口液剤(内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等)、注射剤(溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等)、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
前記pH調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、EDTA、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
前記薬剤は、例えば、花粉症の患者に投与することにより使用することができる。
前記薬剤の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サルなどが挙げられる。
また、前記薬剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記薬剤の剤型等に応じ、適宜選択することができ、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射、腸内への注入、軟膏塗布による鼻腔内への投与、スプレーによる鼻腔内への投与などが挙げられる。
また、前記薬剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への1日の投与あたり、有効成分の量として、1μg〜1gが好ましく、1μg〜1mgがより好ましい。
また、前記薬剤の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、花粉症のアレルギー症状の発症前に予防的に投与されてもよいし、花粉症のアレルギー症状の発症後に治療的に投与されてもよい。
なお、前記薬剤の予防又は治療対象となる花粉症の、原因となる花粉の種類としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スギ、ヒノキ、スズメノテッポウ、カモガヤ、ブタクサ、ヨモギ等の花粉などが挙げられる。
本発明の花粉症の検査方法(以下、単に「検査方法」と称することがある)は、以下の工程(a’)〜工程(b’)を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記花粉症の検査方法により検査することができる事項としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、検査を受ける被検体が花粉症であるか否か、検査を受ける被検体の花粉症の重症度、などが挙げられる。
なお、前記花粉症の検査方法は、被検体から採取した被検試料中の、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかを検出することを特徴とする。
前記検査方法では、まず、被検体から被検試料を採取する(工程(a’))。
−被検体−
前記被検体としては、前記検査の検査対象となり得る生物であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、花粉症の疑いのある患者などが挙げられる。なお、前記被検体の生物種としても特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
−被検試料−
前記被検試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記被検体の、鼻水、涙、鼻腔粘膜組織などが好適に挙げられる。
前記被検体から前記被検試料を採取する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記被検体から採取された前記被検試料は、例えば、そのまま後述する工程(b’)に供されてもよいし、洗浄、保存などの操作が行われた後に、工程(b’)に供されてもよい。
前記検査方法では、次いで、前記工程(a’)で採取した被検試料について、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか(ペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌)を検出する(工程(b’))。
ここで、前記「ペクチン分解酵素」、及び、前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」としては、前記した本発明の評価方法、本発明のスクリーニング方法の項目と同様である。
前記「ペクチン分解酵素」を検出する方法としては、前記被検試料中のペクチン分解酵素の、酵素量、乃至、酵素活性を測定できる方法であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ペクチン分解酵素と前記ペクチン分解酵素に対する抗体との抗原抗体反応を利用した測定方法、前記ペクチン分解酵素と前記ペクチン分解酵素の基質(ペクチン)との反応を利用した測定方法などが挙げられる。
また、前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」を検出する方法としては、前記被検試料中のペクチン分解酵素を放出する真菌の、真菌量、乃至、真菌活性を測定できる方法であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記真菌と前記真菌に対する抗体との抗原抗体反応を利用した測定方法、前記真菌を分離・培養しコロニー数を調べる測定方法などが挙げられる。
前記判断方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記工程(a’)と並行して、花粉症の疑いの無い健常者からの対照試料を準備し、この対照試料と比較して、前記工程(a’)の被検体から得られた被検試料では、前記ペクチン分解酵素及び/又は前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の、量が多い、乃至は、活性が高いときに、前記被検試料を採取した被検体は、花粉症であると判断することができる。また、前記ペクチン分解酵素及び/又は前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の、量の多さの程度、乃至は、活性の高さの程度に応じて、前記被検体の花粉症の重症度を判断することができる。
本発明の花粉症の検査用薬剤(以下、単に「検査用薬剤」と称することがある)は、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか(ペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌)に対する抗体を含み、必要に応じてその他の成分を含んでなる。
ここで、前記「ペクチン分解酵素」、及び、前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」としては、前記した本発明の評価方法、本発明のスクリーニング方法の項目と同様である。
前記「ペクチン分解酵素」に対する抗体としては、前記ペクチン分解酵素を認識可能な抗体であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ペクチン分解酵素の全体又は一部を抗原として用い、公知の手法により、目的に応じて適宜作製することができる。
前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」に対する抗体としても、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌を認識可能な抗体であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の全体又は一部、例えば膜タンパク質などを抗原として用い、公知の手法により、目的に応じて適宜作製することができる。
また、前記抗体はポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。また、前記抗体は、標識されていてもよい。また、前記抗体としては、市販品を使用することもできる。
また、前記抗体は1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。2種以上を併用する場合の、前記検査用薬剤中の各々の抗体の含有量比としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗体を保存するための保存液などが挙げられる。
前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記花粉症の検査用薬剤は、例えば、前記抗原抗体反応を検出するための検出用薬剤などと組合せ、花粉症の検査用キットとして使用されてもよい。
本発明の評価方法及びスクリーニング方法によれば、ペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対する阻害活性を指標として、容易に、かつ効率的に、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を評価乃至スクリーニングすることができる。また、本発明の製造方法によれば、前記評価乃至スクリーニングされた花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を有効成分とする、花粉症の予防又は治療のための薬剤を効率的に製造することができる。したがって、前記評価方法、スクリーニング方法、及び製造方法は、新たな花粉症用の薬剤の開発に非常に有用である。
また、本発明の薬剤は、ペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質を有効成分として含むので、例えば鼻腔粘膜などに存在する真菌が放出するペクチン分解酵素による花粉内膜の分解を抑制することができ、そのため、スギ花粉の内容物である抗原の放出を抑制し、くしゃみや鼻水などの花粉症のアレルギー症状を抑制することができる。したがって、前記薬剤は、花粉症の予防又は治療に非常に有用である。
また、本発明の花粉症の検査方法及び検査用薬剤によれば、被検体から採取した被検試料中のペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌を検出することにより、前記被検体が花粉症であるか否か、前記被検体の花粉症の重症度、などを検査することができる。したがって、前記花粉症の検査方法及び検査用薬剤は、花粉症の診断に非常に有用である。
従来から、鼻水等のアルカリ性条件下で花粉が形態変化を起こすという現象は、当該技術分野において知られており、この形態変化は、花粉の外膜(細胞壁)が割れ、内膜(細胞膜)に覆われた原形質が現れることから、花粉の「破壊」、「破裂」等とも呼ばれている。目や鼻に侵入し、形態変化を起こした花粉は、現れた内膜(細胞膜)が更に分解されることにより、内容物、即ち花粉のアレルゲンであるとされる抗原、Cryj1、Cryj2タンパク質を放出し、くしゃみや鼻水などの花粉症のアレルギー症状を引き起こすと考えられている。
本実施例1では、スギ花粉が前記したような形態変化を起こすことにより現れるスギ花粉内膜の、ペクチン分解酵素に対する感受性を検討した。
この結果から、スギ花粉内膜は、ペクチンから構成される膜であり、ペクチン分解酵素により分解されることが示された。目や鼻に侵入し、形態変化を起こしたスギ花粉は、このようなペクチン分解酵素の作用により内膜が分解され、内容物、即ちスギ花粉の抗原、Cryj1、Cryj2タンパク質を放出し、花粉症の症状を引き起こしているものと考えられる。
−スギ花粉含有寒天培地の作製−
スギ花粉5gを、50mM K2HPO4を含む水溶液(pH9、弱アルカリ性)50mlに懸濁して形態変化を引き起こさせた。一方、寒天3g、及び馬鈴薯澱粉10gを含む水150mlをオートクレーブ処理(121℃、20分)後、55℃に冷却した。前記スギ花粉液及び前記寒天液を、均一になるまで混合した後、25mlを直径10cmの滅菌したシャーレに流し込み、室温にて冷却させ、固化させてスギ花粉含有寒天培地を作製した。
スギ花粉12.4gを、480mlの50mM Tris/HCl(pH8.2)水溶液中に懸濁し、超音波処理後、50mlの遠心管に分注して、3,000rpmで10分間遠心した。上清を除いた後、室温にて1ヶ月間保存したところ、表面に赤色及び緑色のカビが現れた。このスギ花粉保存液に生じた緑色及び赤色のカビは、前記スギ花粉含有寒天培地上で増殖し、コロニーを形成した。
前記スギ花粉含有寒天培地上でコロニーを形成した緑色のカビ(青カビ)をサブロー液体培地で培養し、遠心(8,000rpm、5分)して上清を得た。この青カビの培養上清に、リン酸2カリウム水溶液(pH9、弱アルカリ性)中で形態変化を起こしたスギ花粉を懸濁し、37℃にて26時間インキュベーションし、位相差顕微鏡下で観察した。結果を図2に示す。
この結果から、前記スギ花粉含有寒天培地上で分離された青カビは、スギ花粉内膜を分解する作用を有することが示された。この青カビが、ペクチン分解酵素を培地中に放出し、そのペクチン分解酵素が、スギ花粉内膜を分解したものと考えられる。
−スギ花粉含有寒天培地の作製−
前記実施例2と同様にして、スギ花粉含有寒天培地を作製した。
ちり紙の代わりに包装用ラップを用いて鼻をかみ、ヒト鼻腔サンプルを採取した(被検体:花粉症患者)。前記スギ花粉含有寒天培地に前記ヒト鼻腔サンプルを塗布し、30℃にて3日間培養した。
用いたスギ花粉含有寒天培地には、ペクチン膜からなる内膜で覆われたスギ花粉以外には窒素源を供給する物質は含まれていないことから、出現したコロニーは、スギ花粉の内膜を破壊し、内部の窒素源を利用して生育したものと考えられる。したがって、この結果から、ヒト(例えば、花粉症患者)の鼻腔内には、ペクチン分解酵素を放出し、ペクチン膜からなるスギ花粉の内膜を破壊する真菌が存在している可能性が示唆された。
前記したようなペクチン分解酵素を放出する真菌は、例えば花粉症患者の鼻腔粘膜などに存在していることが考えられる。即ち、目や鼻に侵入し、鼻水等のアルカリ性条件下で形態変化を起こした花粉の内膜は、鼻腔粘膜などに存在する真菌が放出するペクチン分解酵素により分解され、内容物、即ちスギ花粉のアレルゲンであるとされる抗原、Cryj1、Cryj2タンパク質を放出して、花粉症のアレルギー症状を引き起こすというメカニズムが考えられる。
したがって、ペクチン分解酵素の働きを阻害し得る物質を作用させることにより、また、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の働きを阻害し得る物質を作用させることにより、花粉症のアレルギー症状は効果的に抑制できるものと考えられる。
以上のことから、ペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対する阻害活性を指標として、花粉症の予防又は治療作用を有する物質を、容易、かつ効率的に評価乃至スクリーニングできること、並びに、前記評価乃至スクリーニングされた物質を有効成分として、花粉症の予防又は治療のための薬剤を効率的に製造できることが示された。また、ペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質を有効成分として含む薬剤が、花粉症の予防又は治療に効果的であることが示された。また、被検体から採取した被検試料中のペクチン分解酵素及び/又はペクチン分解酵素を放出する真菌を検出することにより、花粉症の検査を行うことができることが示された。
Claims (6)
- 被検物質が、花粉症に対する予防又は治療作用を有するか否かを評価する方法であって、
(a)前記被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程
を含むことを特徴とする方法。 - 花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、
(a)被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、並びに、
(b)前記工程(a)で前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する工程
を含むことを特徴とする方法。 - 花粉症の予防又は治療のための薬剤の製造方法であって、
(a)被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、
(b)前記工程(a)で前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する工程、
(c)前記工程(b)で選択された物質を生成する工程、並びに、
(d)前記工程(c)で生成された物質と、薬学的に許容され得る担体とを混合する工程
を含むことを特徴とする製造方法。 - 花粉症の予防又は治療のための薬剤であって、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有する物質を有効成分とすることを特徴とする薬剤。
- (a’)被検体から被検試料を採取する工程、並びに、
(b’)前記工程(a’)で採取した被検試料について、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかを検出する工程
を含むことを特徴とする花粉症の検査方法。 - ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する抗体を含むことを特徴とする花粉症の検査用薬剤。
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