JP2008125396A - Translation synthesis of polypeptide having n-terminal non-natural backbone and application thereof - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To biosynthesize a peptide having a non-natural backbone on an N-terminal by the translation of amino acid sequence information encoded by nucleic acids. <P>SOLUTION: The method for synthesizing peptide, containing an arbitrary amino acid at the N-terminal, comprises making an arbitrary amino acid bond to an initiation tRNA, by using an ARS ribozyme that catalyzes the acylation reaction of a tRNA with an arbitrary amino acid and initiating translation with this initiation tRNA. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、所望のＮ末端構造をもつポリペプチドの新規な合成方法に関する。   The present invention relates to a novel method for synthesizing a polypeptide having a desired N-terminal structure.

（１）ポリペプチド（タンパク質）の生合成
ポリペプチドの生合成において、mRNAを鋳型としてポリペプチドがつくられる段階を翻訳(translation)という。mRNAの連続する3塩基をコドン（codon）という。コドンはそれぞれ１つのアミノ酸に対応するが、UAA, UAG, UGAの3つに対応するアミノ酸はなく、ポリペプチド合成の終止を指定するので終止コドンと呼ばれる。一方、mRNAの翻訳の際、最初に現れるAUGはポリペプチド合成の開始を指定するので開始コドンと呼ばれる。開始コドン以降の配列を３塩基ずつ区切っていくと、それらが１つ１つのアミノ酸に対応する。 (1) Polypeptide (protein) biosynthesis In the biosynthesis of a polypeptide, the step of producing a polypeptide using mRNA as a template is referred to as translation. Three consecutive bases of mRNA are called codon. Each codon corresponds to one amino acid, but there are no amino acids corresponding to three of UAA, UAG, and UGA, and it is called a stop codon because it specifies the end of polypeptide synthesis. On the other hand, during translation of mRNA, AUG that appears first is called the start codon because it specifies the start of polypeptide synthesis. When the sequence after the start codon is divided by 3 bases, they correspond to each amino acid.

翻訳は、ポリペプチド合成の鋳型となるmRNA上に配列された各コドンを読み取る機能を担うtRNAに、関連アミノ酸が正確に対応付けられることが重要である。化学的には、アミノ酸がそのカルボキシル基の部分で特異的なtRNAの3'末端にエステル結合することによって達成される。例えば、開始コドンに対応する開始tRNA（initiator tRNAまたはtRNA^fMet）にはメチオニンが結合し、そのアミノ基がホルミル化（-COH基が結合）されてN-ホルミルメチオニンになる（図１上段：天然に於ける翻訳開始）。これにより、原核細胞の開始tRNA（fMet-tRNA^fMet）が合成される。メチオニンに対応するコドンはAUG一つだけである。 In translation, it is important that the relevant amino acid is accurately associated with the tRNA that has a function of reading each codon arranged on the mRNA used as a template for polypeptide synthesis. Chemically, this is accomplished by esterifying an amino acid at the 3 'end of a specific tRNA at its carboxyl group. For example, methionine binds to the start tRNA (initiator tRNA or tRNA ^fMet ) corresponding to the start codon, and its amino group is formylated (-COH group is bound) to become N-formylmethionine (FIG. 1, upper panel: natural). Translation started in Japan). As a result, a prokaryotic initiation tRNA (fMet-tRNA ^fMet ) is synthesized. There is only one AUG codon corresponding to methionine.

コドンAUGはリボソームにmRNA からの蛋白質翻訳を「開始」させるシグナルを送る開始コドンとしても重要である。リボソームは、５０種以上のリボソームタンパク質と数種のRNA分子（rRNA）が集合したタンパク質合成装置であり、mRNAの遺伝情報を読み取り、アミノ酸の重合を触媒する。リボソームは真核生物でも原核生物でも、構造も機能も極めてよく似ており、いずれも大サブユニット1個と小サブユニット１個がくっついた数百万ダルトンの分子量を超える複合体である。   The codon AUG is also important as an initiation codon that sends a signal to the ribosome to “initiate” protein translation from the mRNA. A ribosome is a protein synthesizer in which 50 or more types of ribosomal proteins and several types of RNA molecules (rRNA) are assembled, reads the genetic information of mRNA, and catalyzes the polymerization of amino acids. Ribosomes, both eukaryotes and prokaryotes, are very similar in structure and function, and both are complexes with a molecular weight of millions of daltons, with one large subunit and one small subunit attached.

原核細胞由来のポリペプチド合成開始の過程は、開始因子（initiation factor: IF）と呼ばれるタンパク質群が関与する多くの段階を経る。まず、メチオニンでアミノアシル化された開始tRNAが、メチオニンtRNAホルミルトランスフェラーゼ（ＭＴＦ）によりN-ホルミルメチオニン-tRNAへと変換され、それが開始因子と結合する。続いて、この開始因子・N-ホルミルメチオニン-tRNA複合体にリボソームの小サブユニットが結合し、このさらなる複合体がmRNA上にあるリボソーム結合部位（SD配列）に結合する。さらに、この複合体が開始シグナル（AUGコドン）を探し当てると、そこに大サブユニットが結合する。同時に、複合体からは開始因子が解離し、mRNA上にはリボソーム・開始tRNA複合体が残る。ペプチドの翻訳合成の開始は、これらの過程を正確に経て起こるため、合成生成物のN末端は、通常ホルミルメチオニンになる。   The process of initiating the synthesis of a prokaryotic cell-derived polypeptide goes through many stages involving a protein group called initiation factor (IF). First, an initiation tRNA aminoacylated with methionine is converted to N-formylmethionine-tRNA by methionine tRNA formyltransferase (MTF), which binds to the initiation factor. Subsequently, the small subunit of ribosome binds to this initiation factor / N-formylmethionine-tRNA complex, and this additional complex binds to the ribosome binding site (SD sequence) on the mRNA. Furthermore, when this complex finds the initiation signal (AUG codon), the large subunit binds there. At the same time, the initiation factor dissociates from the complex, leaving a ribosome-initiating tRNA complex on the mRNA. Since the initiation of peptide translation synthesis occurs through these processes accurately, the N-terminus of the synthesis product is usually formylmethionine.

次いで、リボソームはmRNAに沿って3'末端側に動きながらコドンを一つずつ翻訳し、tRNAを使ってポリペプチドの伸長端にアミノ酸を付け加える。ポリペプチド鎖の伸長末端に付加されるアミノ酸は、そのアミノ酸が結合しているtRNA分子のアンチコドンと、mRNA鎖の次のコドンとの相補的塩基対形成によって選ばれる。こうして、mRNAのコドンに対応するアミノ酸が次々とペプチド結合で連結してポリペプチド合成が進行する。   The ribosome then translates the codons one by one while moving along the mRNA to the 3 ′ end, and uses tRNA to add an amino acid to the extended end of the polypeptide. The amino acid added to the extended end of the polypeptide chain is selected by complementary base pairing between the anticodon of the tRNA molecule to which the amino acid is bound and the next codon of the mRNA chain. In this way, amino acids corresponding to the codons of mRNA are successively linked by peptide bonds, and polypeptide synthesis proceeds.

（２）tRNAのアミノ酸特異性
既に述べたように、遺伝情報としてのmRNAのコドンをアミノ酸に対応付けるアダプターの役割を果たすのはtRNAである。tRNAはそれぞれに特異的なアミノ酸を結合（アミノアシル化）することにより、アダプターとして機能する。翻訳精度の鍵を握る要因として、各tRNAのアンチコドンとアミノ酸との間には厳密な対応関係が要請される。しかし、tRNA及びアンチコドンが直接にアミノ酸を選択するわけではなく、各アミノ酸に対して特異性を示すのはアミノアシルtRNA合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase: ARS）であり、各tRNA分子はそれぞれに適合したARSを特異的に識別してアミノアシル化されることにより、正しいアミノ酸を受容する。すなわち、生体内において、tRNAのアミノ酸特異性はtRNAとARSとの間の特異的な分子識別によって保たれる。 (2) Amino acid specificity of tRNA As already described, it is tRNA that plays the role of an adapter that associates the codon of mRNA as genetic information with an amino acid. Each tRNA functions as an adapter by binding a specific amino acid (aminoacylation). As a key factor for translation accuracy, a strict correspondence is required between the anticodon and amino acid of each tRNA. However, tRNA and anticodon do not directly select amino acids, and it is aminoacyl-tRNA synthetase (ARS) that shows specificity for each amino acid, and each tRNA molecule was adapted to each. ARS is specifically identified and aminoacylated to accept the correct amino acid. That is, in the living body, the amino acid specificity of tRNA is maintained by specific molecular discrimination between tRNA and ARS.

一方、このようなtRNA、ARS、アミノ酸の3者の間の特異的な対応関係を人工的に変化させることにより、tRNAに本来的に受容すべきアミノ酸以外のものをミスチャージさせる方法が考案されている。そのような方法の一つが、本発明者らにより試験管内分子進化を用いて創製されたtRNAのアシル化反応を触媒するARSリボザイム（アシル化触媒ＲＮＡ、または通称「スーパーフレキシザイム」）を用いた方法である。スーパーフレキシザイムは、任意のtRNA及び任意のアミノ酸を用いたアミノアシル化が可能であるという特徴を有する。つまり、任意のtRNAと任意のアミノ酸とを自在に結合させることができる。これは、例えば、非天然（異常）アミノ酸を導入したポリペプチドを翻訳により合成する際に非常に有用である（特許文献１、２、非特許文献１、２、３、４）。   On the other hand, by artificially changing the specific correspondence between these three types of tRNA, ARS, and amino acid, a method was devised that mischarges amino acids other than those that should be originally accepted by tRNA. ing. One such method used an ARS ribozyme (acylation catalytic RNA, also known as “superflexizyme”) that catalyzes the acylation reaction of tRNAs created by the present inventors using molecular evolution in vitro. Is the method. Superflexizyme is characterized in that aminoacylation using any tRNA and any amino acid is possible. That is, any tRNA and any amino acid can be freely combined. This is very useful when, for example, a polypeptide into which an unnatural (abnormal) amino acid is introduced is synthesized by translation (Patent Documents 1, 2, Non-Patent Documents 1, 2, 3, 4).

（３）無細胞合成
ポリペプチドの無細胞合成とは、細胞質の抽出物から構成される遺伝情報翻訳系を人工容器内に揃えて、ポリペプチドを試験管内で合成しようとするものである。無細胞合成では生きた生命体を利用しないので生体内の生理学的制約を受けることがなく、遺伝子からのポリペプチド合成のハイスループット化が可能であり、さらに合成可能なアミノ酸配列の種類を劇的に拡大することができると期待されている。原理的には、無細胞ポリペプチド合成系では、遺伝情報さえあれば、翻訳酵素系の触媒機能を妨害しない限りにおいて、どのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドでも試験管内で自在に合成することができると考えられる。さらには、遺伝情報とうまく対応させることができれば、生体内に存在しない非天然アミノ酸も用いることができる。 (3) Cell-free synthesis The cell-free synthesis of a polypeptide is intended to synthesize a polypeptide in a test tube by arranging a genetic information translation system composed of a cytoplasmic extract in an artificial container. Cell-free synthesis does not use living organisms, so there are no physiological constraints in vivo, enabling high-throughput synthesis of polypeptides from genes, and dramatically increasing the types of amino acid sequences that can be synthesized. It is expected to be able to expand. In principle, in a cell-free polypeptide synthesis system, as long as genetic information is available, a polypeptide consisting of any amino acid sequence can be freely synthesized in vitro as long as it does not interfere with the catalytic function of the translation enzyme system. It is considered possible. Furthermore, non-natural amino acids that do not exist in the living body can be used as long as they can be matched well with genetic information.

（４）Ｎ末端に非天然骨格を持つペプチド性化合物
天然由来のペプチド性化合物には、Ｎ末端に変わった構造のアミノ酸が結合したものが見られる。図２に示す例においては、Somamides Aではhexyl基、Factor A (A54556 complex)では2,4,6-heptatrienyl基がＮ末に存在する。また、生体内で発見される神経ペプチドの多くは、Ｎ末にピログルタミン酸構造をもつ。 (4) Peptide compounds having a non-natural skeleton at the N-terminal Naturally-derived peptidic compounds are those in which an amino acid having a structure changed to the N-terminal is bound. In the example shown in FIG. 2, hexyl group exists in Somamides A, and 2,4,6-heptatrienyl group exists in N-terminal in Factor A (A54556 complex). In addition, many of the neuropeptides found in vivo have a pyroglutamic acid structure at the N-terminus.

これらの分子は長鎖ペプチドであり、化学合成が難しく、合成収率が低いため、高価にならざるを得ない。また、これらのペプチド配列をもとに、多様な類似体ポリペプチドを平行合成（ライブラリー構築）し、薬剤探索を行おうとした場合、ペプチド配列をコードする分子をビーズ上やペプチド分子上に別途化学的に標識する必要があり、技術的な煩雑さがさらに増大する。さらに、ペプチドライブラリーが枯渇した場合、全く新規に合成をし直す必要がある。他方、生細胞系であれ無細胞系であれ、人為的な翻訳系を介してこのようなペプチドが合成された例はこれまで報告されていない。したがって、鋳型mRNAに配列をコードし、これらの特殊ペプチド分子を翻訳合成できる技術を開発すれば、その技術的進歩性は極めて高い。   These molecules are long-chain peptides, are difficult to chemically synthesize, and have low synthesis yields, so they must be expensive. In addition, when synthesizing various analog polypeptides in parallel (library construction) based on these peptide sequences and trying to search for drugs, molecules encoding the peptide sequences are separately placed on beads or peptide molecules. There is a need for chemical labeling, further increasing technical complexity. Furthermore, when the peptide library is depleted, it is necessary to re-synthesize completely. On the other hand, there have been no reports on the synthesis of such peptides via artificial translation systems, whether live or cell-free. Therefore, if a technique for coding a sequence in the template mRNA and translating and synthesizing these special peptide molecules is developed, the technological inventive step is extremely high.

特表２００３−５１４５７２Special table 2003-514572 特表２００５−５２８０９０Special table 2005-528090 H. Murakami, H. Saito, and H. Suga (2003) "A versatile tRNA aminoacylation catalyst based on RNA" Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662H. Murakami, H. Saito, and H. Suga (2003) "A versatile tRNA aminoacylation catalyst based on RNA" Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662 蛋白質 核酸 酵素(2003) Vol.48, No.11, 1511-1518頁Protein Nucleic Acid Enzyme (2003) Vol.48, No.11, 1511-1518 実験医学(2004) Vol.22, No.17, 184-189頁Experimental Medicine (2004) Vol.22, No.17, pp. 184-189 H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) "The flexizyme system: a highly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides" Nature Methods 3, 357-359H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) "The flexizyme system: a highly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides" Nature Methods 3, 357-359

発明が解決しようとする課題は、核酸によりコードされたアミノ酸配列情報の翻訳により、Ｎ末端に非天然骨格（多様なアシル基、Ｄ体アミノ酸、その他の非天然アミノ酸骨格など）を有するポリペプチドを生合成することである。   The problem to be solved by the invention is that a polypeptide having a non-natural skeleton (various acyl groups, D-form amino acids, other non-natural amino acid skeletons, etc.) at the N-terminus is obtained by translating amino acid sequence information encoded by a nucleic acid. It is to biosynthesize.

上記課題は、本発明の、所望のＮ末端構造を持つポリペプチドを翻訳合成する方法により解決できる。具体的には、任意のアミノ酸によるtRNAのアシル化反応を触媒するARSリボザイムを用いることにより、開始tRNAにＮホルミルメチオニン以外の任意のアミノ酸を結合させ、この開始tRNAで翻訳を開始することにより、その任意のアミノ酸をＮ末端に有するポリペプチドが合成できる。開始tRNAに結合させるアミノ酸としては、通常翻訳で使用される天然アミノ酸のみならず、所望の構造を有するアミノ酸を用いることができ、例えば、アミノ基に様々なアシル基が導入されたものや、Ｄ-アミノ酸、β-アミノ酸、γ-アミノ酸、δ-アミノ酸、およびこれらのアミノ酸のN-メチル化体、ピログルタミン酸、およびアミノベンゼンカルボン酸、並びにスタチン（β-ヒドロキシ-γ-アミノ酸）およびその誘導体等の異常アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、及びそれより長鎖のペプチド、であっても開始tRNAに結合させることができる。このような非天然骨格を有するアミノ酸で翻訳を開始することにより、Ｎ末端に非天然骨格を有するポリペプチドを生合成することができる。   The above-described problems can be solved by the method for translational synthesis of a polypeptide having a desired N-terminal structure according to the present invention. Specifically, by using an ARS ribozyme that catalyzes the acylation reaction of tRNA by any amino acid, by binding any amino acid other than N-formylmethionine to the start tRNA, and starting translation with this start tRNA, A polypeptide having any amino acid at the N-terminus can be synthesized. As the amino acid to be bound to the starting tRNA, not only natural amino acids usually used in translation but also amino acids having a desired structure can be used. For example, amino acids having various acyl groups introduced therein, D -Amino acids, β-amino acids, γ-amino acids, δ-amino acids, N-methylated products of these amino acids, pyroglutamic acid, aminobenzenecarboxylic acid, statins (β-hydroxy-γ-amino acids) and their derivatives, etc. Even unusual amino acids, dipeptides, tripeptides, and longer peptides can be bound to the starting tRNA. By starting translation with an amino acid having such a non-natural skeleton, a polypeptide having a non-natural skeleton at the N-terminus can be biosynthesized.

さらに、この合成方法を応用し、翻訳系においてメチオニンtRNAホルミルトランスフェラーゼ(MTF)の存在又は非存在を選択することにより、翻訳合成されるポリペプチドのN末端のホルミル化をコントロールすることができる。   Furthermore, by applying this synthetic method and selecting the presence or absence of methionine tRNA formyltransferase (MTF) in the translation system, the N-terminal formylation of the polypeptide synthesized for translation can be controlled.

すなわち、本願では以下の発明が提供される。
（１）以下の工程を含む、所望のＮ末端構造を持つポリペプチドを翻訳合成する方法：
（ａ）tRNAのアシル化反応を触媒するリボザイムを提供する工程；（ｂ）前記リボザイムによるアシル化反応の基質となる、所望の構造を持つアミノ酸基質を提供する工程；（ｃ）前記（ａ）のリボザイムを用いて、前記（ｂ）のアミノ酸基質で開始tRNAのアシル化反応を行うことにより、所望の構造を持つアミノ酸でアミノアシル化された開始tRNAを得る工程；（ｄ）前記（ｃ）で得られたアミノアシル化開始tRNAを無細胞翻訳系に加えて、所望の構造を持つアミノ酸で翻訳を開始させることにより、所望のＮ末端構造をもつポリペプチドを得る工程。
（２）上記工程（ｃ）で開始tRNAをアミノアシル化するアミノ酸がメチオニン以外の通常アミノ酸である、（１）に記載の方法。
（３）上記工程（ｃ）で開始tRNAをアミノアシル化するアミノ酸が異常アミノ酸である、（１）に記載の方法。
（４）異常アミノ酸が、アミノ基に様々なアシル基が導入されたアミノ酸、Ｄ-アミノ酸、β-アミノ酸、γ-アミノ酸、δ-アミノ酸、およびこれらのアミノ酸のN-メチル化体、ピログルタミン酸、スタチン（β-ヒドロキシ-γ-アミノ酸）およびその誘導体、ジペプチド、トリペプチド、及びそれより長鎖のペプチドからなる群から選択される、（３）に記載の方法。
（５）上記工程（ｂ）で提供されるアミノ酸基質が、弱活性化されたアミノ酸である、（１）に記載の方法。
（６）アミノ酸基質がアミノ酸のシアノメチルエステル、ジニトロベンジルエステル又は4-クロロベンジルチオエステルである、（５）に記載の方法。
（７）tRNAのアシル化反応を触媒するリボザイムが、以下の（１）又は（２）
（１）GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU
（２）GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU
のいずれかのRNA配列からなるリボザイムである、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）開始tRNAが、５’から３’方向に、
GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUNNNAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA
で示されるRNA配列からなる構造を有し、NNNは任意の塩基の組合せからなるアンチコドンを表し、該アンチコドンに対応する開始コドンが、翻訳合成されるポリペプチドの配列をコードするmRNA上に存在し、該開始コドンが所望の構造を持つアミノ酸をコードする、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）開始tRNA中のアンチコドンがCAUであり、mRNA上の開始コドンがAUGである、（８）に記載の方法。
（１０）開始tRNA中のアンチコドンがCAU以外のアンチコドンであり、mRNA上の開始コドンがAUG以外のコドンである、（８）に記載の方法。
（１１）無細胞翻訳系として再構成無細胞翻訳系を用いる、（１）に記載の方法。
（１２）メチオニン又はメチオニルtRNA合成酵素（MetRS）を翻訳系中から除いて、天然の翻訳開始機構を阻害することにより、所望のＮ末端構造を持つポリペプチドだけが翻訳合成される、（１１）に記載の方法。
（１３）メチオニンtRNAホルミルトランスフェラーゼ(MTF)の存在又は非存在を選択することにより、翻訳合成されるポリペプチドのN末端のホルミル化をコントロールする、（１１）に記載の方法。
（１４）以下の成分を含む、Ｎ末端に非天然骨格をもつポリペプチドを翻訳合成するために使用可能なキット：（ａ）以下の（１）又は（２）のいずれかのRNA配列からなる、tRNAのアシル化を触媒する２つのリボザイム：
（１）GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU
（２）GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU；
（ｂ）前記リボザイムの基質となる、非天然骨格をもつアミノ酸基質；（ｃ）開始tRNA；および（ｄ）無細胞合成系。 That is, the following invention is provided in the present application.
(1) A method for translating and synthesizing a polypeptide having a desired N-terminal structure, comprising the following steps:
(A) providing a ribozyme that catalyzes an acylation reaction of tRNA; (b) providing an amino acid substrate having a desired structure that is a substrate for the acylation reaction by the ribozyme; (c) (a) A starting tRNA that is aminoacylated with an amino acid having a desired structure by performing an acylation reaction of the starting tRNA with the amino acid substrate of (b) using the ribozyme of (d); (d) in (c) A step of obtaining a polypeptide having a desired N-terminal structure by adding the obtained aminoacylation initiation tRNA to a cell-free translation system and initiating translation with an amino acid having a desired structure.
(2) The method according to (1), wherein the amino acid for aminoacylating the starting tRNA in the step (c) is a normal amino acid other than methionine.
(3) The method according to (1), wherein the amino acid for aminoacylating the starting tRNA in the step (c) is an abnormal amino acid.
(4) An abnormal amino acid is an amino acid in which various acyl groups are introduced into the amino group, D-amino acid, β-amino acid, γ-amino acid, δ-amino acid, N-methylated products of these amino acids, pyroglutamic acid, The method according to (3), which is selected from the group consisting of statins (β-hydroxy-γ-amino acids) and derivatives thereof, dipeptides, tripeptides, and longer peptides.
(5) The method according to (1), wherein the amino acid substrate provided in the step (b) is a weakly activated amino acid.
(6) The method according to (5), wherein the amino acid substrate is an amino acid cyanomethyl ester, dinitrobenzyl ester or 4-chlorobenzylthioester.
(7) The ribozyme that catalyzes the acylation reaction of tRNA is the following (1) or (2)
(1) GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU
(2) GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU
The method according to any one of (1) to (6), which is a ribozyme consisting of any one of the RNA sequences.
(8) The starting tRNA is in the 5 ′ to 3 ′ direction,
GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCU NNN AACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA
NNN represents an anticodon consisting of any combination of bases, and an initiation codon corresponding to the anticodon is present on the mRNA encoding the sequence of the polypeptide to be translated and synthesized. The method according to any one of (1) to (7), wherein the initiation codon encodes an amino acid having a desired structure.
(9) The method according to (8), wherein the anticodon in the start tRNA is CAU and the start codon on the mRNA is AUG.
(10) The method according to (8), wherein the anticodon in the start tRNA is an anticodon other than CAU, and the start codon on the mRNA is a codon other than AUG.
(11) The method according to (1), wherein a reconstituted cell-free translation system is used as the cell-free translation system.
(12) By removing methionine or methionyl tRNA synthetase (MetRS) from the translation system and inhibiting the natural translation initiation mechanism, only a polypeptide having a desired N-terminal structure is translated and synthesized. (11) The method described in 1.
(13) The method according to (11), wherein the formylation of the N-terminus of the polypeptide synthesized by translation is controlled by selecting the presence or absence of methionine tRNA formyltransferase (MTF).
(14) A kit that can be used for translational synthesis of a polypeptide having a non-natural skeleton at the N-terminus, including the following components: (a) consisting of the RNA sequence of either (1) or (2) below Two ribozymes that catalyze the acylation of tRNA:
(1) GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU
(2) GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU;
(B) an amino acid substrate having a non-natural skeleton serving as a substrate for the ribozyme; (c) an initiation tRNA; and (d) a cell-free synthesis system.

本発明においては、tRNAと任意のアミノ酸とを自在に結合させることができるARSリボザイムで、開始tRNAに所望の構造を有するアミノ酸をアミノアシル化したものを作成し、これを用いて翻訳を開始することにより、Ｎ末に所望の構造を有するポリペプチドを翻訳により合成することが可能であり、生体内に存在しない異常アミノ酸も用いることができる。さらに、翻訳系の制御により翻訳合成されるポリペプチドのN末端の修飾をコントロールすることもできる。   In the present invention, an ARS ribozyme capable of freely binding tRNA and any amino acid, in which an amino acid having a desired structure is aminoacylated on the starting tRNA, is used to start translation. Thus, a polypeptide having a desired structure at the N-terminus can be synthesized by translation, and abnormal amino acids that do not exist in the living body can also be used. Furthermore, modification of the N-terminus of the polypeptide synthesized by translation can be controlled by controlling the translation system.

従って、本発明はＮ末に修飾が入ったポリペプチド全般に適応でき、これまで化学合成が極めて困難であった長鎖の特殊ペプチド分子を簡便且つ安価に合成することができる。   Therefore, the present invention can be applied to all polypeptides having modifications at the N-terminus, and can synthesize a long-chain special peptide molecule that has been extremely difficult to synthesize in a simple and inexpensive manner.

（１）アミノ酸
アミノ酸は、基本的には分子内にアミノ基（−ＮＲ_２）とカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の二つの官能基を持つ化合物を指す。アミノ酸のうち、通常の翻訳で使用されるアミノ酸は、一般構造： (1) Amino acid An amino acid basically refers to a compound having two functional groups, an amino group (—NR ₂ ) and a carboxyl group (—COOH), in the molecule. Among amino acids, amino acids used in normal translation have a general structure:

で示される（Ｒはアミノ酸側鎖である）α-アミノカルボン酸（または置換型α-アミノカルボン酸）である、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、フェニルアラニン(Phe)、メチオニン（Ｍet）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、チロシン（Tyr）、システイン（Ｃys）、グルタミン（Gln）、アスパラギン（Asn）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、アスパラギン酸（Asp）、およびグルタミン酸（Glu）の２０種類の天然アミノ酸である。本明細書においては、アミノ酸には、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両方が含まれ、特にこれらの天然アミノ酸を通常アミノ酸とも称する。 (Wherein R is an amino acid side chain) α-aminocarboxylic acid (or substituted α-aminocarboxylic acid), alanine (Ala), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile), Proline (Pro), tryptophan (Trp), phenylalanine (Phe), methionine (Met), glycine (Gly), serine (Ser), threonine (Thr), tyrosine (Tyr), cysteine (Cys), glutamine (Gln), There are 20 natural amino acids: asparagine (Asn), lysine (Lys), arginine (Arg), histidine (His), aspartic acid (Asp), and glutamic acid (Glu). In the present specification, amino acids include both natural amino acids and unnatural amino acids. In particular, these natural amino acids are also commonly referred to as amino acids.

通常アミノ酸に対する語として、異常アミノ酸は、通常アミノ酸以外のアミノ酸を意味し、人工的に合成したものであっても、自然界に存在するものであってもよい。異常アミノ酸の例としては、アミノ酸骨格内に付加的なメチレン基を有するβ-アミノ酸、γ-アミノ酸及びδ-アミノ酸、並びに通常のアミノ酸の立体異性体であるD-アミノ酸等が挙げられる。また、本明細書においては、アミノ酸の語には、アミノ酸骨格上のアミノ基やカルボキシル基が置換された構造を有する誘導体も包含し、アミノ酸のアミノ基に多様なアシル基が導入されたものや、N-メチル体、スタチン（β-ヒドロキシ-γ-アミノ酸）、ピログルタミン酸、アミノベンゼンカルボン等も異常アミノ酸の例として挙げられる。さらに、ジペプチド、トリペプチド、若しくはそれより長鎖のペプチドもアミノ酸と表現する場合がある。従って、「所望の構造を有するアミノ酸」という場合には、このような本明細書における「アミノ酸」全てを包含する。以上で述べた様々なアミノ酸の代表例の化学構造式を図３に示す。   As a term for an ordinary amino acid, an abnormal amino acid means an amino acid other than an ordinary amino acid, and may be artificially synthesized or may exist in nature. Examples of abnormal amino acids include β-amino acids, γ-amino acids and δ-amino acids having an additional methylene group in the amino acid skeleton, and D-amino acids that are stereoisomers of ordinary amino acids. In the present specification, the term amino acid includes derivatives having a structure in which an amino group or a carboxyl group on the amino acid skeleton is substituted, and those in which various acyl groups are introduced into the amino group of the amino acid. N-methyl, statin (β-hydroxy-γ-amino acid), pyroglutamic acid, aminobenzenecarboxylic acid and the like are also examples of abnormal amino acids. Further, dipeptides, tripeptides, or longer peptides may be expressed as amino acids. Therefore, the term “amino acid having a desired structure” includes all such “amino acids” in the present specification. The chemical structural formulas of representative examples of the various amino acids described above are shown in FIG.

異常アミノ酸を含んだペプチドを「特殊ペプチド」と呼ぶ。天然から単離された特殊ペプチドの例としては、ホルモンペプチド、神経ペプチド、Somamides A, factor A, GPCR103リガンド等が挙げられる。本発明により合成可能な特殊ペプチドはこれらの天然の特殊ペプチドを模倣した類似体に限定されず、上述の様々な異常アミノ酸をＮ末に有するあらゆる特殊ペプチドが合成可能である。   Peptides containing abnormal amino acids are called “special peptides”. Examples of special peptides isolated from nature include hormone peptides, neuropeptides, Somamides A, factor A, GPCR103 ligands and the like. The special peptides that can be synthesized according to the present invention are not limited to analogs that mimic these natural special peptides, and any special peptides having the above-mentioned various abnormal amino acids at the N-terminus can be synthesized.

（２）開始tRNA
mRNAの翻訳の開始には、開始tRNAと呼ばれる特定のtRNAが必要である。翻訳が始まるには、アミノアシル化された開始tRNAが、開始因子(IF)とともにリボソームの小サブユニットに結合し、リボソームの小サブユニットがmRNA上の開始コドンに結合するが、この開始コドンを認識するのが開始tRNAである。従来技術の項で述べたように、天然においては、開始tRNAは必ずメチオニン（原核細胞ではホルミルメチオニン）を運び、開始コドンとしては一般的にはメチオニンのコドンであるAUGが用いられるため、開始tRNAはメチオニンに対応するアンチコドンを有する。 (2) Initiating tRNA
Initiation of mRNA translation requires a specific tRNA called the initiation tRNA. For translation to begin, the aminoacylated initiation tRNA binds to the small subunit of the ribosome along with the initiation factor (IF), and the small subunit of the ribosome binds to the initiation codon on the mRNA, but recognizes this initiation codon. It is the starting tRNA. As mentioned in the prior art section, in nature, the start tRNA always carries methionine (formylmethionine in prokaryotic cells), and AUG which is a codon of methionine is generally used as the start codon. Has an anticodon corresponding to methionine.

これに対して、本発明においては、開始アミノ酸がメチオニンに限定されないことが特徴である。つまり、開始tRNAにメチオニン以外の任意のアミノ酸を結合して翻訳を開始させることが特徴である。また、本発明においては、開始コドンもAUGに限定されない。つまり、開始コドンとして他のコドンを割り当てることも可能である。従って、本発明においては開始tRNAはメチオニンに対応するアンチコドンを有していても、他のアンチコドンで置換されていてもよい。例えば、本発明者らはAUA、CGG、CCG、GGC、GCCのコドンでもそれらのアンチコドンをもつ開始tRNAを用いれば、開始可能であることを確認している。   In contrast, the present invention is characterized in that the starting amino acid is not limited to methionine. That is, the initiation tRNA is characterized by binding any amino acid other than methionine to initiate translation. In the present invention, the initiation codon is not limited to AUG. That is, it is possible to assign another codon as the start codon. Therefore, in the present invention, the initiation tRNA may have an anticodon corresponding to methionine or may be substituted with another anticodon. For example, the present inventors have confirmed that codons of AUA, CGG, CCG, GGC and GCC can be initiated by using an initiation tRNA having those anticodons.

以下は、本発明において使用可能な、開始コドンAUGに対応する天然の開始tRNA（tRNA^fMet）の塩基配列を示す。
5'-GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3' （配列番号１）下線部はアンチコドン部位である。二次構造の図を図４に示すので参照されたい。 The following shows the base sequence of a natural start tRNA (tRNA ^fMet ) corresponding to the start codon AUG that can be used in the present invention.
5′-GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCU CAU AACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3 ′ (SEQ ID NO: 1) The underlined portion is an anticodon site. Refer to FIG. 4 for a diagram of the secondary structure.

開始コドンを変える場合は、それに相補的なアンチコドンをもったtRNAを使用する。従って、開始コドンとして任意のコドン(NNN)を割り当てる場合は、開始tRNAの配列は次のように表される。
5'-GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUNNNAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3' （配列番号２）下線部のNNNは任意の塩基の組合せからなるアンチコドンを表す。NNN以外の部分は、tRNA^fMetのボディ配列であり、開始因子（IF）の結合に必要であると考えられている。 To change the start codon, use a tRNA with an anticodon complementary to it. Therefore, when an arbitrary codon (NNN) is assigned as the start codon, the sequence of the start tRNA is expressed as follows.
5′-GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCU NNN AACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3 ′ (SEQ ID NO: 2) The underlined NNN represents an anticodon consisting of a combination of arbitrary bases. The part other than NNN is the body sequence of tRNA ^fMet and is thought to be necessary for initiation factor (IF) binding.

本発明において、所望のN末端構造を持つポリペプチドを翻訳合成する際には、上記のNNNで表されるアンチコドンに対応する開始コドンが、翻訳合成されるポリペプチドの配列をコードするmRNA上に存在し、その開始コドンがポリペプチドのN末端となる所望の開始アミノ酸をコードすることになる。   In the present invention, when translating and synthesizing a polypeptide having a desired N-terminal structure, an initiation codon corresponding to the anticodon represented by the above NNN is present on the mRNA encoding the sequence of the polypeptide to be translated and synthesized. It will encode the desired starting amino acid which is present and whose start codon is the N-terminus of the polypeptide.

（３）開始tRNAのアミノアシル化
tRNAのアミノアシル化は、tRNAの３’末端の水酸基にアミノ酸のカルボキシル基がエステル結合する反応（アシル化）である。アミノ酸は活性化された中間体を経由してtRNAと結合する。 (3) Aminoacylation of the starting tRNA
The aminoacylation of tRNA is a reaction (acylation) in which the carboxyl group of an amino acid is ester-bonded to the hydroxyl group at the 3 ′ end of tRNA. Amino acids bind to tRNA via activated intermediates.

天然では、ＡＲＳタンパク質酵素が、ＡＴＰの加水分解と共役したアミノ酸基質の活性化（ATPとアミノ酸から高エネルギー中間体であるアミノアシルAMPを合成する反応）と、アミノ酸基質のｔＲＮＡへの結合の２段階の反応を触媒してアミノアシルｔＲＮＡの合成を行っている。まず、アミノ酸のカルボキシル基がＡＭＰ部分と結合して活性化され、アデニル化アミノ酸（アミノアシルAMP）となる。次に、アデニル化アミノ酸からＡＭＰが脱離し、アミノ酸のカルボキシル基はｔＲＮＡの３’末端のリボースの水酸基に移される。この転移によりアミノ酸がｔＲＮＡと活性エステル結合を形成し、アミノアシル化されたｔＲＮＡが生じる。活性化されたアミノ酸とｔＲＮＡとのエステル結合は、加水分解により大きな自由エネルギーを放出する高エネルギー結合であり、この結合のエネルギーはその後のタンパク質合成の段階で、アミノ酸を共有結合でつないでポリペプチド鎖を伸長させるのに使われる。   In nature, the ARS protein enzyme has two steps: activation of an amino acid substrate coupled with ATP hydrolysis (a reaction to synthesize aminoacyl AMP, a high-energy intermediate from ATP and an amino acid), and binding of the amino acid substrate to tRNA. The synthesis of aminoacyl-tRNA is carried out by catalyzing the above reaction. First, the carboxyl group of an amino acid is activated by binding to an AMP moiety to become an adenylated amino acid (aminoacyl AMP). Next, AMP is eliminated from the adenylated amino acid, and the carboxyl group of the amino acid is transferred to the hydroxyl group of ribose at the 3 'end of the tRNA. This transfer causes the amino acid to form an active ester bond with the tRNA, resulting in an aminoacylated tRNA. The ester bond between the activated amino acid and tRNA is a high-energy bond that releases large free energy upon hydrolysis, and this bond energy is a polypeptide obtained by covalently connecting amino acids in the subsequent protein synthesis stage. Used to extend the chain.

天然では、各アミノ酸とtRNAに特異的なアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）により、このようなtRNAのアミノアシル化反応が触媒される。開始tRNAがメチオニンを結合する反応は専用のタンパク質酵素であるメチオニルtRNA合成酵素(MetRS）による。   In nature, aminoacylation reaction of such tRNA is catalyzed by aminoacyl-tRNA synthetase (ARS) specific for each amino acid and tRNA. The reaction in which the starting tRNA binds methionine is performed by methionyl tRNA synthetase (MetRS), which is a dedicated protein enzyme.

これに対して、本発明においては、tRNAのアシル化反応を触媒することができるＲＮＡ分子であるARSリボザイムを用いて、開始tRNAのアミノアシル化を行う。ARSリボザイムとして本発明で使用可能なものは、所望の構造を持つアミノ酸基質を任意のtRNAにアシル化する機能を有するリボザイムである。このようなARSリボザイムは、天然のARSタンパク質酵素とは異なり、各アミノ酸及び各tRNAに対して特異性を持たず、本来チャージすべきアミノ酸以外の任意のアミノ酸を用いたアミノアシル化が可能となるため、開始tRNAに任意のアミノ酸を結合することができる。   In contrast, in the present invention, aminoacylation of the starting tRNA is performed using ARS ribozyme, which is an RNA molecule that can catalyze the acylation reaction of tRNA. What can be used in the present invention as an ARS ribozyme is a ribozyme having a function of acylating an amino acid substrate having a desired structure into an arbitrary tRNA. Unlike the natural ARS protein enzyme, such ARS ribozyme has no specificity for each amino acid and each tRNA, and can be aminoacylated using any amino acid other than the amino acid to be originally charged. Any amino acid can be bound to the starting tRNA.

図１を参照して、開始tRNAのアミノアシル化を説明する。従来技術の項でも説明したように、天然ではtRNA^fMetからMetRS（メチオニルtRNA合成酵素）・MTF（メチオニンtRNAホルミルトランスフェラーゼ）という２つの蛋白質酵素が関与して合成されるfMet-tRNA^fMetが開始tRNAとして働くのに対し（図１上段）、本発明ではMetRSの代わりにARSリボザイム（スーパーフレキシザイム）によって多種にわたるアミノ酸誘導体がtRNA^fMetにチャージされたXaa-tRNA^fMetが開始tRNAとして働く（図１下段：本申請に於ける翻訳開始）。 With reference to FIG. 1, the aminoacylation of the starting tRNA is illustrated. As described in the Background section, as a natural by MetRS from tRNA ^fMet is (methionyl tRNA synthetase) · MTF fMet-tRNA ^fMet start tRNA that two proteins the enzyme (methionine tRNA formyl transferase) is synthesized implicated In contrast, in the present invention, Xaa-tRNA ^fMet in which various amino acid derivatives are charged to tRNA ^fMet by ARS ribozyme (superflexizyme) instead of MetRS works as an initiation tRNA (lower panel in FIG. 1). Translation started in this application).

本発明で使用されるARSリボザイムは、本発明者らにより記載された試験管内分子進化による方法に従って創製可能である(特願2005-352243 多目的アシル触媒とその用途、および H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) "
1163748499187_1.pdf
" Nature Methods 3, 357-359）。この方法により創製されるARSリボザイムは、天然のARSタンパク質酵素とは異なり、アミノアシル化反応の第１段階目である高エネルギー中間体（アミノアシルAMP）の生成の過程をスキップしてアミノ酸基質のtRNAへの結合の過程のみを触媒するように進化させて得られるものであるため、アミノ酸基質としてはあらかじめ弱活性化されたアミノ酸を用いる必要がある。つまり、アミノ酸のアデニル化をスキップする代わりに、アシル化が進行するカルボニル基において弱活性化されたエステル結合を持つアミノ酸誘導体を使用する。一般にアシル基の活性化は電子吸引性をもつ脱離基をエステル結合させることで達成できるが、あまり強力な電子吸引性脱離基を有するエステルでは水中で加水分解が起きるばかりか、ランダムなRNAへのアシル化が併発してしまう。したがって、アミノ酸基質としては無触媒状態でこのような副反応が起きにくいように弱活性化したものを用いる必要がある。このような弱活性化は、例えば、AMP、シアノメチルエステル、チオエステル、又はニトロ基やフッ素その他の電子吸引性の官能基をもったベンジルエステル等を使用して行うことができる。好適なアミノ酸基質の例としては、アミノアシル-シアノメチルエステル（CME：cyanomethyl ester）、アミノアシル-ジニトロベンジルエステル（DNB：3,5-dinitrobenzyl ester）、又はアミノアシル-4-クロロベンジルチオエステル（CBT：p-chloro-benzyl thioester）等が挙げられるが、これらに限定されるわけではなく、当業者であれば反応効率の高い適当な脱離基を適宜スクリーニングして用いることが可能であり、そのような適当な脱離基を有するアミノ酸基質を利用したアシル化反応も本発明の範囲に含まれることは当然である。 The ARS ribozyme used in the present invention can be created according to the method by molecular evolution in vitro described by the present inventors (Japanese Patent Application No. 2005-352243 Multipurpose acyl catalyst and its use, and H. Murakami, A. Ohta , H. Ashigai, H. Suga (2006) "
1163748499187_1.pdf
"Nature Methods 3, 357-359). Unlike the natural ARS protein enzyme, the ARS ribozyme created by this method is the first stage of the aminoacylation reaction, the production of a high-energy intermediate (aminoacyl AMP). Since the process is skipped and evolved to catalyze only the process of binding of the amino acid substrate to tRNA, it is necessary to use a weakly activated amino acid in advance as the amino acid substrate. Instead of skipping adenylation of amino acids, use amino acid derivatives that have weakly activated ester linkages in the carbonyl group where acylation proceeds.Acyl group activation generally uses an electron-withdrawing leaving group as an ester linkage. However, esters with a very strong electron-withdrawing leaving group will not only hydrolyze in water, but Therefore, it is necessary to use a weakly activated amino acid substrate in a non-catalytic state so that such side reactions are unlikely to occur. For example, AMP, cyanomethyl ester, thioester, or benzyl ester having a nitro group, fluorine, or other electron-withdrawing functional group can be used. -Cyanomethyl ester (CME), aminoacyl-dinitrobenzyl ester (DNB: 3,5-dinitrobenzyl ester), or aminoacyl-4-chlorobenzylthioester (CBT) However, the present invention is not limited thereto, and those skilled in the art can appropriately screen and use an appropriate leaving group with high reaction efficiency. Of course, an acylation reaction using an amino acid substrate having such an appropriate leaving group is also included in the scope of the present invention.

本発明で使用可能なARSリボザイムの極めて具体的な例としては、従来技術の項で前述したスーパーフレキシザイム、すなわち、
（１）GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU
（スーパーフレキシザイムeFx：配列番号３）
（２）GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU
（スーパーフレキシザイムdFx：配列番号４）
のいずれかのRNA配列からなるリボザイム、又はその変異型が挙げられる。これらのスーパーフレキシザイムやその原型であるフレキシザイムの創製については、特願2005-352243 多目的アシル触媒とその用途、およびH. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) Nature Methods 3, 357-359、ならびに H. Murakami H. Saito, H. Suga (2003) “A versatile tRNA aminoacylation catalyst based on RNA” Chem. Biol. 10, 655-662に詳細に記載されている。 As very specific examples of ARS ribozymes that can be used in the present invention, the superflexizyme described above in the section of the prior art, that is,
(1) GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU
(Superflexizyme eFx: SEQ ID NO: 3)
(2) GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU
(Superflexizyme dFx: SEQ ID NO: 4)
The ribozyme which consists of any one of these RNA sequences, or its variant is mentioned. For the creation of these super flexizymes and their prototype flexizymes, see Japanese Patent Application 2005-352243 Multipurpose Acyl Catalysts and Their Applications, and H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) Nature Methods 3, 357-359, and H. Murakami H. Saito, H. Suga (2003) “A versatile tRNA aminoacylation catalyst based on RNA” Chem. Biol. 10, 655-662.

ARSリボザイムとしてこれらのスーパーフレキシザイム又はその変異型を用いる場合、アミノ酸基質は、スーパーフレキシザイムで認識されるように、アミノ酸側鎖または脱離基内に芳香環を有していなければならない。このようなアミノ酸基質の構造を一般式で表すと、次のようになる。   When using these superflexizymes or variants thereof as ARS ribozymes, the amino acid substrate must have an aromatic ring in the amino acid side chain or leaving group so that it can be recognized by the superflexizyme. The structure of such an amino acid substrate is represented by the following general formula.

アミノ酸基質のうち、側鎖として芳香環をもつアミノ酸のシアノメチルエステル（左の構造式）の合成については、特表２００５−５２８０９０およびＳｕｇａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０、１１５１〜１１５６、１９９８に記載の方法を参照されたい。本明細書中で後述する実施例においては、シアノメチルエステル(CME)を導入したN-アシル化アミノ酸基質およびペプチド基質の合成の例を示した。   Among amino acid substrates, the synthesis of cyanomethyl esters of amino acids having an aromatic ring as a side chain (the structural formula on the left) is described in JP 2005-528090 and Suga et al. Am. Chem. Soc. 120, 1151-1156, 1998. In the examples described later in this specification, examples of synthesizing N-acylated amino acid substrates and peptide substrates into which cyanomethyl ester (CME) has been introduced are shown.

脱離基として芳香環をもつアミノ酸基質（右の構造式）の合成は、まず（１）アミンをBoc保護したアミノ酸を、ベンジル位にハロゲンを持ち芳香族に電子吸引基を持つ化合物と反応し、エステルを形成させる。次に、酸を用いてBoc保護基を除くことでアミノ酸基質を合成する。あるいは、このエステルは、（２）アミンをBoc保護したアミノ酸を、ベンジル位に水酸基を持ち芳香族に電子吸引基を持つ化合物と、一般的な縮合剤を用いて縮合させることでも合成できる。さらに（３）Boc保護したアミノ酸を活性化したものを、ベンジル位に水酸基を持ち芳香族に電子吸引基を持つ化合物と混ぜることでも合成できる。チオエステルの合成は、上記の（２）又は（３）の方法を用いて行うことができる。ただし、ベンジル位に水酸基を持ち芳香族に電子吸引基を持つ化合物の代わりに、ベンジル位にチオール基を持つ化合物を用いる。チオエステルは、活性が比較的高いので、芳香族の電子吸引基は必ずしも必要ではない。脱離基として芳香環をもつアミノ酸基質の合成についての具体的な方法は、特願2005-352243にも既述されている。本明細書中の後述の実施例では、D-アミノ酸、N-メチル化アミノ酸またはβ-アミノ酸等の異常アミノ酸にジニトロベンジルエステル(DBE)を導入した基質の合成の例を示した。   The synthesis of an amino acid substrate having an aromatic ring as a leaving group (right structural formula) is as follows. First, (1) an amino acid with Boc protection of an amine is reacted with a compound having a halogen at the benzyl position and an electron withdrawing group at the aromatic. An ester is formed. Next, an amino acid substrate is synthesized by removing the Boc protecting group using an acid. Alternatively, this ester can also be synthesized by condensing (2) an amino acid having a Boc protected amine with a compound having a hydroxyl group at the benzylic position and an electron withdrawing group at the aromatic, using a common condensing agent. Furthermore, (3) a compound obtained by activating a Boc-protected amino acid can be synthesized by mixing it with a compound having a hydroxyl group at the benzyl position and an electron withdrawing group in the aromatic. The synthesis of the thioester can be performed using the above method (2) or (3). However, a compound having a thiol group at the benzyl position is used instead of a compound having a hydroxyl group at the benzyl position and an electron withdrawing group in the aromatic. Since thioesters are relatively high in activity, aromatic electron withdrawing groups are not necessarily required. A specific method for the synthesis of an amino acid substrate having an aromatic ring as a leaving group has already been described in Japanese Patent Application No. 2005-352243. In the examples described later in this specification, an example of synthesis of a substrate in which dinitrobenzyl ester (DBE) is introduced into an abnormal amino acid such as a D-amino acid, an N-methylated amino acid, or a β-amino acid is shown.

ARSリボザイムによるアシル化反応は、溶液中で行ってもよいし、担体に固定化したARSリボザイムを用いたカラムを用いて反応させてもよい。例えば、もし翻訳の反応スケールが１００μｌ以下の少ない量であれば、溶液中でARSリボザイムによるｔＲＮＡのアシル化を行い、反応溶液をエタノール沈殿したペレットを適当な緩衝液（例えば１ｍＭの酢酸カリウム、ｐＨ５等）に溶解し、翻訳系に添加すれば良い。反応の条件は適宜好適な条件を選べばよいが、少量スケールの反応条件の一例としては、最終濃度で0.5〜20μMのtRNA、0.5〜20μMのARSリボザイム、2〜10mMのアミノ酸基質、0.6MのMgCl₂を含むpH7.5、0.1Mの反応緩衝液を、０度Ｃで１時間〜２４時間、反応させるとよい。 The acylation reaction with ARS ribozyme may be carried out in a solution, or may be carried out using a column using ARS ribozyme immobilized on a carrier. For example, if the translation reaction scale is as small as 100 μl or less, tRNA is acylated with ARS ribozyme in the solution, and the reaction solution is ethanol-precipitated with an appropriate buffer (eg, 1 mM potassium acetate, pH 5). Etc.) and added to the translation system. The reaction conditions may be selected as appropriate, but examples of small-scale reaction conditions include 0.5-20 μM tRNA, 0.5-20 μM ARS ribozyme, 2-10 mM amino acid substrate, 0.6 M A reaction buffer solution containing MgCl ₂ and pH 7.5, 0.1M may be reacted at 0 ° C. for 1 to 24 hours.

翻訳の反応スケールが１００μｌを超える場合は、ARSリボザイムの再利用を考慮し、担体に固定化したARSボザイムを用いたほうが好都合である。担体として、例えば、樹脂、アガロース、セファロース、磁器ビーズなどを用いることもできるが、特に限定されない。ARSリボザイムを担体に固定化して反応を行わせる場合は、例えば、Murakami, H., Bonzagni, N. J. and Suga, H. (2002). "Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin-immobilized ribozyme." J. Am. Chem. Soc. 124(24): 6834-6835に記載の方法に従って行うことができる。反応産物であるアミノアシル化ｔＲＮＡの分離は、様々な方法で行える。一例としては、１０ｍＭ程度のＥＤＴＡを含有する緩衝液でカラムから溶出する方法がある。ARSリボザイムを固定化した樹脂は、例えば反応バッファーで平衡化することにより、十数回リサイクルすることができる。 When the translation reaction scale exceeds 100 μl, it is more convenient to use the ARS ribozyme immobilized on a carrier in consideration of the reuse of the ARS ribozyme. As the carrier, for example, resin, agarose, sepharose, porcelain beads and the like can be used, but are not particularly limited. When the reaction is performed by immobilizing ARS ribozyme on a carrier, for example, Murakami, H. , Bonzagni, NJ and Suga, H. (2002). "Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin-immobilized ribozyme." J. Am Chem. Soc. 124 (24): 6834-6835. Separation of the reaction product aminoacylated tRNA can be performed by various methods. As an example, there is a method of eluting from a column with a buffer containing about 10 mM EDTA. The resin on which the ARS ribozyme is immobilized can be recycled ten times or more by equilibrating with a reaction buffer, for example.

ARSリボザイムによるアシル化反応についても、さらに具体的には後述の実施例を参照されたい。なお、後述の実施例では、多様なアミノ酸のアシル化を簡便に確認するため、開始tRNAではなく、その短鎖アナログを用いた実験結果を示している。ジペプチドやトリペプチド、もしくはそれより長鎖のペプチド、Ｎ末端に非天然骨格（Ｄ体、N-メチル体、β-アミノ酸、スタチン等）を持つアミノ酸のような異常アミノ酸であっても、アミノアシル化できることが確認されている。   For the acylation reaction by ARS ribozyme, refer to Examples described later in more detail. In the examples described later, in order to easily confirm the acylation of various amino acids, experimental results using a short analog instead of the starting tRNA are shown. Aminoacylation of dipeptides, tripeptides, or longer peptides, and abnormal amino acids such as amino acids with non-natural skeletons (D, N-methyl, β-amino acids, statins, etc.) at the N-terminus It has been confirmed that it can be done.

（４）翻訳
上述の方法により、ARSリボザイムを用いてアミノアシル化された開始tRNAを無細胞翻訳系に添加することにより、Ｎ末端に任意のアミノ酸を有するポリペプチドを合成することができる。 (4) Translation By the above-described method, a polypeptide having an arbitrary amino acid at the N-terminus can be synthesized by adding an initiator tRNA aminoacylated using ARS ribozyme to a cell-free translation system.

天然の翻訳産物ではポリペプチドのＮ末端はメチオニン（原核細胞ではホルミルメチオニン）に限られるが、本発明ではＮ末端にメチオニン以外のアミノ酸、様々なアシル基、Ｄ-アミノ酸、Ｎメチルアミノ酸、β−アミノ酸、スタチン、その他の特殊骨格を有する特殊ペプチドを自由自在に合成可能である。図５に天然の翻訳産物(上段）と本発明で合成可能なポリペプチドの例（下段）を示す（この例では様々なアシル基を有するフェニルアラニン誘導体がＮ末端に存在する）。   In a natural translation product, the N-terminus of a polypeptide is limited to methionine (formylmethionine in prokaryotic cells). In the present invention, amino acids other than methionine, various acyl groups, D-amino acids, N-methyl amino acids, β- It is possible to freely synthesize special peptides having amino acids, statins and other special skeletons. FIG. 5 shows an example of a natural translation product (upper part) and a polypeptide that can be synthesized by the present invention (lower part) (in this example, phenylalanine derivatives having various acyl groups are present at the N-terminus).

無細胞合成系では生体内の制約がないため、どのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドでも自在に合成することができ、合成可能なポリペプチドの長さにも原理的には制限はなく、遺伝情報と対応させることができれば異常アミノ酸も用いることができる。従って、所望の構造を持つアミノ酸でアミノアシル化された開始tRNAを系に加えて翻訳を開始することにより、所望のN末端構造を有するポリペプチドを合成可能であり、さらに、伸長反応で導入するアミノ酸も天然アミノ酸２０種類全てを利用できる。伸長用の天然アミノ酸についても、ARSリボザイムでアシル化されたアミノアシル化tRNAを無細胞翻訳系に添加して用いることが可能である。   In cell-free synthesis systems, there is no restriction in vivo, so any polypeptide consisting of any amino acid sequence can be freely synthesized, and the length of the synthesizable polypeptide is not limited in principle. Abnormal amino acids can also be used if they can be associated with information. Therefore, it is possible to synthesize a polypeptide having a desired N-terminal structure by adding an initiation tRNA aminoacylated with an amino acid having a desired structure to the system and initiating translation. Can also use all 20 natural amino acids. As for natural amino acids for elongation, aminoacylated tRNA acylated with ARS ribozyme can be added to a cell-free translation system.

無細胞翻訳系は一般的には、リボソームタンパク質、アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）、リボソームＲＮＡ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始因子（IF）伸長因子(EF)、終結因子(RF)、およびリボソーム再生因子(RRF)、ならびに翻訳に必要なその他の因子を含み、高効率のものとしては、大腸菌抽出液や小麦胚芽抽出液を利用した系がある。他に、ウサギ赤血球抽出液や昆虫細胞抽出液を利用する系もある。これらは、透析を用いて連続的にエネルギーを供給することで、数百μgから数mg/mLの蛋白質を生産する。遺伝子ＤＮＡからの転写も併せて行うためのＲＮＡポリメレースを含む系もある。本発明では、このような無細胞翻訳系を適宜用いることができる。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロッシュ・ダイアグノスティック社のＲＴＳ−１００（登録商標）やＰＧＩ社のＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等が使用できる。   Cell-free translation systems generally include ribosomal proteins, aminoacyl tRNA synthetases (ARS), ribosomal RNA, amino acids, tRNA, GTP, ATP, translation initiation factor (IF) elongation factor (EF), termination factor (RF), Examples of high-efficiency systems that include ribosome regeneration factor (RRF) and other factors necessary for translation include systems using E. coli extract and wheat germ extract. Other systems use rabbit erythrocyte extract or insect cell extract. These produce several hundred μg to several mg / mL of protein by continuously supplying energy using dialysis. There are also systems that include RNA polymerase for transcription from gene DNA. In the present invention, such a cell-free translation system can be appropriately used. As cell-free translation systems that are commercially available, E. coli-derived systems such as RTS-100 (registered trademark) from Roche Diagnostics and PURESYSTEM (registered trademark) from PGI are used as systems using wheat germ extracts. For example, those from Zoigene or Cell Free Science can be used.

さらに、系を細分化し、各要素を再構成して、より不純物の少ない翻訳系を構築することもできる。具体的な構成としては、リボソーム、ＧＴＰ、ＡＴＰ、IF群、EF群、RF群、RRF、目的のペプチド合成に最低限となるtRNA・ARS群・アミノ酸などがある。このような再構成無細胞翻訳系は、特に本発明において好適である。再構成無細胞翻訳系を用いることにより成分を任意に調節することが可能であり、開始アミノ酸もしくはペプチドの種類を選択することに加えて、ポリペプチドのN末端修飾をさらに自在にコントロールすることができるようになるからである。   Furthermore, a translation system with fewer impurities can be constructed by subdividing the system and reconfiguring each element. Specific configurations include ribosome, GTP, ATP, IF group, EF group, RF group, RRF, and tRNA / ARS group / amino acid that are minimum for target peptide synthesis. Such a reconstituted cell-free translation system is particularly suitable in the present invention. By using a reconstituted cell-free translation system, it is possible to arbitrarily adjust the components, and in addition to selecting the starting amino acid or peptide type, the N-terminal modification of the polypeptide can be controlled more freely. Because it will be possible.

例えば、メチオニン、又はメチオニルtRNA合成酵素（MetRS）を翻訳系中から除くことで天然の翻訳開始機構を阻害することができる。そこに所望の構造を持つアミノ酸でアシル化した開始tRNAを加えることで、所望のＮ末端構造を持つペプチドだけが翻訳系中で生成する。このとき、開始tRNAとしてはアンチコドン部分を改変した開始tRNA^fMetを使う。本発明では開始コドンは天然であるAUGだけに制限されず他のコドンも開始コドンとして利用できる、すなわち、Ｎ末アミノ酸に対して特定のコドンを割り当てることができるのである。このとき、翻訳合成されるポリペプチドをコードする核酸配列において、mRNA上の開始コドンはアシルtRNA^fMetのアンチコドンと相補的であれば（多少の効率の違いは見受けられるが）原則的に何でも良い。原核細胞由来の系を用いる場合、鋳型mRNAには５’末端の近傍にリボソーム結合部位であるSD配列が存在しさらにその下流に開始コドンが存在する必要がある。 For example, a natural translation initiation mechanism can be inhibited by removing methionine or methionyl tRNA synthetase (MetRS) from the translation system. By adding an initiation tRNA acylated with an amino acid having a desired structure, only a peptide having the desired N-terminal structure is generated in the translation system. At this time, an initiation tRNA ^fMet having a modified anticodon portion is used as the initiation tRNA. In the present invention, the initiation codon is not limited to natural AUG, and other codons can be used as initiation codons, that is, a specific codon can be assigned to the N-terminal amino acid. At this time, in the nucleic acid sequence encoding the polypeptide to be translated and synthesized, in principle, the initiation codon on the mRNA may be anything as long as it is complementary to the anti-codon of acyl tRNA ^fMet (although some difference in efficiency can be seen). When a prokaryotic cell-derived system is used, the template mRNA needs to have an SD sequence as a ribosome binding site in the vicinity of the 5 ′ end, and further have an initiation codon downstream thereof.

また、再構成無細胞翻訳系を用いることで、メチオニンtRNAホルミルトランスフェラーゼ(MTF)の存在、非存在を選択でき、これによるＮ末端修飾のコントロールも可能である。MTFは、原核細胞由来の系において、開始tRNAにアシル化されたメチオニンのアミノ基に対し、ホルミル基を結合させる酵素である。この酵素は、一般にはメチオニンに対してホルミル化選択性があると考えられているが、これまでにも間接的な実験結果から、開始tRNAに結合したフェニルアラニンやグルタミンなどのアミノ基に対してもホルミル基が修飾されたとする報告はあった（Mayer, C., Kohrer, C., Prusko, C., RajBhandary, U.L. (2003). "Anticodon Sequence Mutants of Escherichia coli Initiator tRNA: Effects of Overproduction of Aminoacyl-tRNA Synthetases, Methionyl-tRNA Formyltransferase, and Initiation Factor 2 on Activity in Initiation" Biochemistry 42: 4787-4799）。本発明により、合成ペプチドの質量分析により、その直接的な実験結果が得られた。本発明では、さらに多様なアミノ酸を用いても、N末端がホルミル化されたポリペプチドが合成できる事を発見している。   In addition, by using a reconstituted cell-free translation system, the presence or absence of methionine tRNA formyltransferase (MTF) can be selected, thereby controlling the N-terminal modification. MTF is an enzyme that binds a formyl group to an amino group of methionine acylated to an initiation tRNA in a prokaryotic cell-derived system. This enzyme is generally considered to have formylation selectivity for methionine, but from indirect experimental results so far, it has also been shown for amino groups such as phenylalanine and glutamine bound to the starting tRNA. There was a report that the formyl group was modified (Mayer, C., Kohrer, C., Prusko, C., RajBhandary, UL (2003). "Anticodon Sequence Mutants of Escherichia coli Initiator tRNA: Effects of Overproduction of Aminoacyl- tRNA Synthetases, Methionyl-tRNA Formyltransferase, and Initiation Factor 2 on Activity in Initiation "Biochemistry 42: 4787-4799). According to the present invention, direct experimental results were obtained by mass spectrometry of synthetic peptides. In the present invention, it has been discovered that a polypeptide having an N-terminal formylation can be synthesized even using various amino acids.

他方、本発明者らは、MTFを翻訳系内から除去する事で、N末端にホルミル修飾が施されていないポリペプチドを合成できること、さらには、系内のMTFまたはそのドナーとなる基質の有無に関わらず、N末にホルミル修飾がされていないペプチドも合成できることも見出した。これまで、原核由来の開始因子では、ホルミル基もしくは類似のアシル基（アセチル基等）の修飾が必要と考えられていたが、本発明により（ARSリボザイムで様々なアミノ酸を開始tRNAにチャージして翻訳開始をすることで）、その制限がないことが明らかとなった。例えば、アシル基のないアミノ酸でも翻訳を開始できるばかりか、アミノ基に導入するアシル基には任意のＲを付けることができる（R-CO-aa-）。さらに、Ｒをジペプチド、トリペプチドもしくはそれより長鎖のペプチド、又はスタチン骨格にすること、あるいはアミノ酸をＤ体にすることも可能であり、それらによって翻訳開始されたペプチドにはホルミル化が進行せず、ホルミル化されていないペプチドが合成される。   On the other hand, the present inventors can synthesize a polypeptide having no N-terminal formyl modification by removing MTF from the translation system. Furthermore, the presence or absence of MTF in the system or its donor substrate. Regardless, the present inventors also found that peptides having no formyl modification at the N-terminus can be synthesized. Until now, prokaryotic initiation factors were thought to require modification of formyl group or similar acyl group (acetyl group, etc.), but according to the present invention, various amino acids were charged to the starting tRNA with ARS ribozyme. By starting translation) it became clear that there were no restrictions. For example, not only can an amino acid without an acyl group start translation, but an arbitrary R can be attached to an acyl group to be introduced into an amino group (R-CO-aa-). Furthermore, R can be a dipeptide, a tripeptide or a longer peptide, or a statin skeleton, or an amino acid can be a D-form, and the peptide initiated by these can undergo formylation. First, a non-formylated peptide is synthesized.

従って、本発明では、開始アミノ酸もしくはペプチドの種類、MTFの存在下、非存在下で、翻訳合成されるポリペプチドのN末端修飾をコントロールできる。一方で、通常のアミノ酸の立体異性体であるD-アミノ酸やジペプチド、トリペプチドを開始tRNAに結合させ翻訳に用いた場合、MTFが翻訳系内にあってもホルミル化が全く進行しない事も発見している。   Therefore, in the present invention, the N-terminal modification of the polypeptide synthesized and translated can be controlled in the presence or absence of the starting amino acid or peptide type and MTF. On the other hand, when D-amino acids, dipeptides and tripeptides, which are stereoisomers of normal amino acids, are bound to the starting tRNA and used for translation, it was found that formylation does not proceed at all even if MTF is in the translation system. is doing.

（５）キット
上述の方法を用いた、Ｎ末端に非天然骨格をもつポリペプチドを翻訳合成するために使用可能なキット化製品も本発明の範囲に含まれる。キットの最低限の内容としては、
（ａ）以下の（１）又は（２）のいずれかのRNA配列からなる、tRNAのアシル化を触媒する２つのリボザイム：
（１）GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU
（２）GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU
（それぞれ担体に固定化されていてもよい）
（ｂ）前記リボザイムの基質となる、非天然骨格をもつアミノ酸基質
（ｃ）開始tRNA
（ｄ）無細胞合成系
を含んでいればよいが、さらに、反応緩衝液、反応容器、使用説明書等を含んでいてもよい。 (5) Kit A kit product that can be used for translational synthesis of a polypeptide having a non-natural skeleton at the N-terminus using the above-described method is also included in the scope of the present invention. As the minimum contents of the kit,
(A) Two ribozymes that catalyze acylation of tRNA consisting of the RNA sequence of either (1) or (2) below:
(1) GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU
(2) GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU
(Each may be immobilized on a carrier)
(B) an amino acid substrate having a non-natural skeleton serving as a substrate for the ribozyme (c) an initiating tRNA
(D) It only needs to contain a cell-free synthesis system, but may further contain a reaction buffer, a reaction vessel, instructions for use, and the like.

なお、本発明の実施のための材料及び方法は、特に断らないかぎり、化学及び分子生物学の技術分野でよく知られる慣用の方法に従って、様々な一般的な教科書や専門的な参考文献に記載されている方法を用いる。分子生物学についての参考文献としては、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２），およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州（１９９９）を参照されたい。   The materials and methods for carrying out the present invention are described in various general textbooks and specialized references according to conventional methods well known in the chemical and molecular biology art unless otherwise specified. The method is used. References on molecular biology include, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) and Ausubel et al. Green Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York See click York (1999).

上述した発明の内容を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、これは例示であり本発明の範囲はこれに限定されない。明細書及び特許請求の範囲の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。   The contents of the above-described invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, this is an example, and the scope of the present invention is not limited thereto. Various changes and modifications can be made by those skilled in the art based on the description of the specification and the claims, and these changes and modifications are also included in the present invention.

以下に記載する実施例ではARSリボザイムとしては、スーパーフレキシザイムを使用し、翻訳系としては、cDNAからの転写系を含む原核生物由来の再構成無細胞合成系を用いた。   In the examples described below, superflexizyme was used as the ARS ribozyme, and a prokaryotic-derived reconstituted cell-free synthesis system including a transcription system from cDNA was used as the translation system.

１． アミノ酸基質の合成
この実施形態では、スーパーフレキシザイムによるアシル化反応の基質となる、弱活性化されたエステル結合を持つアミノ酸基質（以下、単に「基質」と記載することもある）の合成を記載する。スーパーフレキシザイムにより認識されるために、基質は分子内に芳香環を有する必要があった。脱離基に芳香族を用いる場合、エステル結合は、チオエステルで活性化（CBT）、もしくは芳香族に電子吸引性の官能基を持ったもの（DBE）を使用して活性化した。芳香族を側鎖に持つアミノ酸やペプチドについては、シアノメチルエステル（CME）で活性化した。 1. Synthesis of Amino Acid Substrate This embodiment describes the synthesis of an amino acid substrate having a weakly activated ester bond (hereinafter sometimes simply referred to as “substrate”), which is a substrate for the acylation reaction by superflexizyme. To do. In order to be recognized by the superflexizyme, the substrate had to have an aromatic ring in the molecule. When aromatics were used as the leaving group, ester bonds were activated using thioesters activated (CBT) or aromatics with electron-withdrawing functional groups (DBE). Amino acids and peptides with aromatic side chains were activated with cyanomethyl esters (CME).

１．１． D-アミノ酸、N-メチル化アミノ酸、β-アミノ酸
標題のアミノ酸にDBEを導入した基質の合成の一般的な方法を、D-セリンDBEの例で説明する。α-N-Boc-D-セリン（384 mg, 1.87 mmol）、トリエチルアミン（207 mg, 2.05 mmol）および3,5-ジニトロベンジルクロリド（324 mg, 1.50 mmol）を0.4ｍｌのジメチルホルムアミドに加えて混合し、室温で１２時間攪拌した。反応後、ジエチルエーテル（15ml）を加え、溶液を0.5 M HCl (5 mL x 3)、4 % NaHCO₃ (5 mL x 3) およびブライン (5 mL x1)で洗浄し、硫酸マグネシウムで有機層の中の水を除いてから、減圧下で溶媒を減圧留去した。クルードな残渣を4M塩酸／酢酸エチル（3 ml）に溶解し、室温で２０分静置した。反応後、ジエチルエーテル（３ｍＬ）を加えて溶媒を減圧留去する操作を３回繰り返し、余分のHClを除いた。ジエチルエーテル（３ｍＬ）を加えて沈殿させ、沈澱を濾過により回収して全体で35％の収率で産物を得た（170 mg, 0.53 mmol）。¹H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) d 8.83 (s, 1H), 8.70 (s, 2H), 8.44 (br, 3H), 5.56 (s, 2H), 4.07 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 2.22 (m, 1H), 1.00 (d, J= 7.0 Hz, 3H), 0.97 (d, J = 6.9 Hz, 3H). 1.1. A general method for synthesizing a D-amino acid, N-methylated amino acid, β-amino acid title amino acid by introducing DBE into the amino acid will be described with an example of D-serine DBE. α-N-Boc-D-serine (384 mg, 1.87 mmol), triethylamine (207 mg, 2.05 mmol) and 3,5-dinitrobenzyl chloride (324 mg, 1.50 mmol) were added to 0.4 ml of dimethylformamide and mixed. And stirred at room temperature for 12 hours. After the reaction, diethyl ether (15 ml) was added and the solution was washed with 0.5 M HCl (5 mL x 3), 4% NaHCO ₃ (5 mL x 3) and brine (5 mL x 1), and the organic layer was washed with magnesium sulfate. After removing water therein, the solvent was distilled off under reduced pressure. The crude residue was dissolved in 4M hydrochloric acid / ethyl acetate (3 ml) and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. After the reaction, the operation of adding diethyl ether (3 mL) and evaporating the solvent under reduced pressure was repeated three times to remove excess HCl. Diethyl ether (3 mL) was added for precipitation, and the precipitate was collected by filtration to give the product in a total yield of 35% (170 mg, 0.53 mmol). ¹ H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) d 8.83 (s, 1H), 8.70 (s, 2H), 8.44 (br, 3H), 5.56 (s, 2H), 4.07 (d, J = 4.6 Hz, 1H ), 2.22 (m, 1H), 1.00 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.97 (d, J = 6.9 Hz, 3H).

１．２． N-アシル化アミノ酸
CMEを導入したN-アシル化アミノ酸基質（N-アシル-アミノアシル-CME）の合成の一般的な方法を、N-アセチル-Phe-CMEの例で説明する。フェニルアラニン（33 mg, 0.20 mmo）、酢酸N-ヒドロキシスクシンイミド（38 mg, 0.24 mmol）およびNaHCO₃(50 mg, 0.60 mmol)を50％ジオキサン水溶液（0.3ml）に加えて混合し、室温で１時間攪拌した。反応後、溶媒を減圧留去してジオキサンを除き、酢酸エチル（3 mL x2）で溶液を洗浄した。水層を1M HClで酸性にし、溶液を酢酸エチル（3 mL x2）で抽出し、硫酸マグネシウムで有機層の中の水を除いてから、減圧下で溶媒を減圧留去した。残渣（N-アセチル-Phe-OH）を、ジメチルホルムアミド（0.2ml）にトリエチルアミン（24 mg, 1.2 mmol）およびクロロアセトニトリル（0.1 mL）を加えたものと混合し、反応混合物を室温で１２時間攪拌した。反応後、ジエチルエーテル（9 ml）を加え、1M塩酸 (3 mL x 3）、飽和NaHCO₃ (3 mL x 3)およびブライン（5 mL x1）で溶液を洗浄し、硫酸マグネシウムで有機層の中の水を除いてから、減圧下で溶媒を減圧留去した。クルードな残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフフィーにより精製し、N-アセチル-Phe-CME（28 mg, 55%）を得た。 1.2. N-acylated amino acids
A general method for the synthesis of N-acylated amino acid substrate (N-acyl-aminoacyl-CME) with CME introduced is illustrated by the example of N-acetyl-Phe-CME. Phenylalanine (33 mg, 0.20 mmo), acetic acid N-hydroxysuccinimide (38 mg, 0.24 mmol) and NaHCO ₃ (50 mg, 0.60 mmol) were added to a 50% aqueous dioxane solution (0.3 ml) and mixed for 1 hour at room temperature. Stir. After the reaction, the solvent was distilled off under reduced pressure to remove dioxane, and the solution was washed with ethyl acetate (3 mL × 2). The aqueous layer was acidified with 1M HCl, the solution was extracted with ethyl acetate (3 mL × 2), water in the organic layer was removed with magnesium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue (N-acetyl-Phe-OH) was mixed with dimethylformamide (0.2 ml) plus triethylamine (24 mg, 1.2 mmol) and chloroacetonitrile (0.1 mL) and the reaction mixture was stirred at room temperature for 12 hours. did. After the reaction, diethyl ether (9 ml) was added, the solution was washed with 1M hydrochloric acid (3 mL x 3), saturated NaHCO ₃ (3 mL x 3) and brine (5 mL x 1), and the organic layer was washed with magnesium sulfate. After removing the water, the solvent was distilled off under reduced pressure. The crude residue was purified by silica gel column chromatography to obtain N-acetyl-Phe-CME (28 mg, 55%).

１．３． ペプチド基質
ペプチドは全てFmoc化学を利用した固相合成により合成した。N-Fmocアミノ酸(N-保護アミノ酸）は渡辺化学工業株式会社（日本）から購入したものを用いた。 1.3. All peptide substrate peptides were synthesized by solid phase synthesis using Fmoc chemistry. N-Fmoc amino acid (N-protected amino acid) was purchased from Watanabe Chemical Co., Ltd. (Japan).

CMEを導入したペプチド基質（ペプチド-CME）の合成の一般的な方法の例として、H-^DPhe-^DPhe-Phe-CMEの合成を説明する。まず、H- ^DPhe-^DPhe-Phe-OHを、WANG-alko-レジン（0.15 mmol スケール、渡辺化学工業社製）を用いて固相合成した。得られたトリペプチド（H- ^DPhe-^DPhe-Phe-OH）、Boc₂O (35 mg, 0.16 mmol)およびNaHCO₃(13 mg, 0.16 mmol)を50% ジオキサン水溶液（0.5 mL）に加えて混合し、室温で１時間攪拌した。次いで、反応混合物を減圧留去してジオキサンを除き、酢酸エチル（3 mL x2）で溶液を洗浄した。水層を1M HClで酸性にし、溶液を酢酸エチル（3 mL x2）で抽出し、硫酸マグネシウムで有機層の中の水を除いてから、減圧下で溶媒を減圧留去した。残渣（Boc-^DPhe-^DPhe-Phe-OH）を、ジメチルホルムアミド（0.2ml）にトリエチルアミン（16 mg, 0.16 mmol）およびクロロアセトニトリル（0.1 mL）と加えたものと混合し、反応混合物を室温で１２時間攪拌した。反応後、ジエチルエーテル（9 ml）を加え、1M塩酸 (3 mL x 3）、飽和NaHCO₃ (3 mL x 3)およびブライン（5 mL x1）で溶液を洗浄し、硫酸マグネシウムで有機層の中の水を除いてから、減圧下で溶媒を減圧留去した。クルードな残渣を4M塩酸／酢酸エチル（2 ml）に溶解し、室温で２０分静置した。ジエチルエーテル（3 ml）を加えて溶媒を減圧留去する操作を３回繰り返し、余分のHClを除いた。ジエチルエーテル（3 ml）を加えて沈殿させ、沈澱を濾過により回収して全体で43％の収率で産物を得た（35 mg）。 As an example of a general method for synthesizing a peptide substrate into which CME is introduced (peptide-CME), synthesis of H- ^D Phe- ^D Phe-Phe-CME will be described. First, H- ^D Phe- ^D Phe-Phe-OH was solid-phase synthesized using WANG-alko-resin (0.15 mmol scale, manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.). The obtained tripeptide (H- ^D Phe- ^D Phe-Phe-OH), Boc ₂ O (35 mg, 0.16 mmol) and NaHCO ₃ (13 mg, 0.16 mmol) were added to 50% aqueous dioxane (0.5 mL). And stirred at room temperature for 1 hour. Then, the reaction mixture was distilled off under reduced pressure to remove dioxane, and the solution was washed with ethyl acetate (3 mL × 2). The aqueous layer was acidified with 1M HCl, the solution was extracted with ethyl acetate (3 mL × 2), water in the organic layer was removed with magnesium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue (Boc- ^D Phe- ^D Phe-Phe-OH) is mixed with dimethylformamide (0.2 ml) plus triethylamine (16 mg, 0.16 mmol) and chloroacetonitrile (0.1 mL) and the reaction mixture is allowed to cool to room temperature. For 12 hours. After the reaction, diethyl ether (9 ml) was added, the solution was washed with 1M hydrochloric acid (3 mL x 3), saturated NaHCO ₃ (3 mL x 3) and brine (5 mL x 1), and the organic layer was washed with magnesium sulfate. After removing the water, the solvent was distilled off under reduced pressure. The crude residue was dissolved in 4M hydrochloric acid / ethyl acetate (2 ml) and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. The operation of adding diethyl ether (3 ml) and evaporating the solvent under reduced pressure was repeated three times to remove excess HCl. Diethyl ether (3 ml) was added for precipitation, and the precipitate was collected by filtration to give the product in a total yield of 43% (35 mg).

２． RNAの合成
オリゴヌクレオチドは全てOperon社（日本）から購入した。以下のプライマーを用いて増幅した鋳型DNAからin vitro の転写によりtRNA^fMet _cauを合成した。 2. All RNA synthetic oligonucleotides were purchased from Operon (Japan). TRNA ^fMet _cau was synthesized by in vitro transcription from template DNA amplified using the following primers.

P1: 5’-GTAAT ACGAC TCACT ATAGG CGGGG TGGAG CAGCC TGGTA GCTCG TCGG-3’ (配列番号５）
P2: 5'-GAACC GACGA TCTTC GGGTT ATGAG CCCGA CGAGC TACCA GGCT-3' (配列番号６）
P3: 5'-GCATA TGTAA TACGA CTCAC TATAG-3' (配列番号７）
P4: 5'-TGGTT GCGGG GGCCG GATTT GAACC GACGA TCTTC GGG-3' (配列番号８）
P5: 5'-TGGTT GCGGG GGCCG GATTT-3' (配列番号９）
まず、P1とP2とをアニ−ルさせ、Taq DNA ポリメレースにより伸長した。得られた産物をPCR反応緩衝液で２０倍に希釈し、P3およびP4をそれぞれ5'および3'プライマーとして用いて増幅した。さらに、産物を２００倍に希釈して、P3およびP5をそれぞれ5'および3'プライマーとして用いて増幅してtRNA^fMet _cauに相当するDNAを得た。次いで、T7 RNAポリメレースを用いて、DNA産物を転写し、10％変性PAGEにより精製した。得られたtRNA^fMet _cauを水に溶解し、濃度を200μMに調整した。 P1: 5'-GTAAT ACGAC TCACT ATAGG CGGGG TGGAG CAGCC TGGTA GCTCG TCGG-3 '(SEQ ID NO: 5)
P2: 5'-GAACC GACGA TCTTC GGGTT ATGAG CCCGA CGAGC TACCA GGCT-3 '(SEQ ID NO: 6)
P3: 5'-GCATA TGTAA TACGA CTCAC TATAG-3 '(SEQ ID NO: 7)
P4: 5'-TGGTT GCGGG GGCCG GATTT GAACC GACGA TCTTC GGG-3 '(SEQ ID NO: 8)
P5: 5'-TGGTT GCGGG GGCCG GATTT-3 '(SEQ ID NO: 9)
First, P1 and P2 were annealed and extended by Taq DNA polymerase. The resulting product was diluted 20-fold with PCR reaction buffer and amplified using P3 and P4 as 5 'and 3' primers, respectively. Furthermore, the product was diluted 200 times and amplified using P3 and P5 as 5 ′ and 3 ′ primers, respectively, to obtain DNA corresponding to tRNA ^fMet _cau . The DNA product was then transcribed using T7 RNA polymerase and purified by 10% denaturing PAGE. The obtained tRNA ^fMet _cau was dissolved in water and the concentration was adjusted to 200 μM.

同様に、スーパーフレキシザイムもin vitro 転写法により合成した。具体的には、特願2005-352243 多目的アシル触媒とその用途、およびH. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) Nature Methods 3, 357-359に記載の方法を用いて行った。   Similarly, superflexizyme was synthesized by in vitro transcription. Specifically, using Japanese Patent Application No. 2005-352243 multipurpose acyl catalyst and its use, and the method described in H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) Nature Methods 3, 357-359 went.

３． tRNAのアシル化の確認
本実施形態では、多様なアミノ酸によるアシル化を簡便に確認するため、開始tRNA （tRNA^fMet _cau）の代わりに、その短鎖アナログに相当するマイクロヘリックス（microhelix）またはミニヘリックス（minihelix）を用いてアシル化反応を行い、反応後の溶液はアミノアシル化の効率を確認するために酸性条件下でのアクリルアミド電気泳動分析を行った。Minihelix（またはmicrohelix）に由来するバンドがアミノアシル化されると移動度が遅くなる。Minihelix（またはmicrohelix）のバンドとアシル化minihelix（またはmicrohelix）のバンドの強度を比較することでアミノアシル化効率が決定できる。 3. Confirmation of tRNA acylation In this embodiment, in order to easily confirm acylation by various amino acids, instead of the starting tRNA (tRNA ^fMet _cau ), a microhelix or minihelix corresponding to its short analog is used. (Minihelix) was used for acylation reaction, and the solution after the reaction was subjected to acrylamide electrophoresis analysis under acidic conditions in order to confirm the efficiency of aminoacylation. When the band derived from Minihelix (or microhelix) is aminoacylated, the mobility becomes slower. The aminoacylation efficiency can be determined by comparing the intensity of the Minihelix (or microhelix) band and the acylated minihelix (or microhelix) band.

アシル化反応は、0.1 M Hepes-K buffer（pH 7.5）、 0.1 M KCl, 600 mM MgCl₂ 中で20 μM スーパーフレキシザイム（dFx または eFx）5 μL、20 μM tRNAアナログ（microhelixまたはminihelix）、および5 mM 基質を20 % DMSOに加えて、０℃で２〜６時間反応させた。その詳細な手順としては、まず、40 μM tRNAアナログを0.2 M Hepes-K buffer pH 7.5, 0.2 M KCl (2.5 μL)に加え、95℃で3分加熱し、5分間で25℃まで冷却した。MgCl₂ (3 M, 1 μL)およびスーパーフレキシザイム(200 μM, 0.5 μL)を加え、混合物を25℃で5分静置した。基質（DMSO中25 mM, 1 μL）を加えることによりtRNAアナログのアシル化反応を開始し、氷上で2時間静置した。0.6 M 酢酸ナトリウム、pH 5を15 μL加えることにより反応を停止した。エタノール沈殿後、70%エタノールで洗浄したペレットを2 μLの10 mM 酢酸ナトリウム、pH 5に溶解した。反応後の溶液を酸性条件下、20％の変性PAGE（50 mM 酢酸ナトリウム、6 M 尿素）で解析した。 The acylation reaction consists of 5 μL of 20 μM superflexizyme (dFx or eFx) in 0.1 M Hepes-K buffer (pH 7.5), 0.1 M KCl, 600 mM MgCl ₂ , 20 μM tRNA analog (microhelix or minihelix), and 5 mM substrate was added to 20% DMSO and reacted at 0 ° C. for 2-6 hours. As the detailed procedure, first, 40 μM tRNA analog was added to 0.2 M Hepes-K buffer pH 7.5, 0.2 M KCl (2.5 μL), heated at 95 ° C. for 3 minutes, and cooled to 25 ° C. for 5 minutes. MgCl ₂ (3 M, 1 μL) and superflexizyme (200 μM, 0.5 μL) were added, and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 5 minutes. The acylation reaction of the tRNA analog was started by adding a substrate (25 mM in DMSO, 1 μL) and left on ice for 2 hours. The reaction was stopped by adding 15 μL of 0.6 M sodium acetate, pH 5. After ethanol precipitation, the pellet washed with 70% ethanol was dissolved in 2 μL of 10 mM sodium acetate, pH 5. The solution after the reaction was analyzed by 20% denaturing PAGE (50 mM sodium acetate, 6 M urea) under acidic conditions.

添付の図面で示す実験結果は、基質としてN-アシル基のついたＰｈｅ誘導体（図６〜７）その他を用いた例である。アシル化の結果を図８〜１１に示す。ここでは多種のアミノ酸誘導体が効率よくスーパーフレキシザイムによってアシル化されることが確認された。   The experimental results shown in the accompanying drawings are examples in which a Phe derivative with an N-acyl group (FIGS. 6 to 7) and others are used as a substrate. The results of acylation are shown in FIGS. Here, it was confirmed that various amino acid derivatives are efficiently acylated by superflexizyme.

例示された基質の略称の意味は次の通りである。F = フェニルアラニン (Phe)、 OH-F = ヒドロキシ-deamino-フェニルアラニン、 Ac = アセチル、 N3Ac = アジド-アセチル、 oxP = 4-オキソ-ペンタノイル、 Pen = ペンタ-4-エノイル, Hex = ヘキサノイル, Pyl = ペンタ-5-イノイル, CBA = カルボキシ-ベンジルアミン, Mhe = 5-メチル-ヘキサノイル, Mim = メレイミド, PyE = パイログルタミン, ^DPhe = D-フェニルアラニン The meanings of the abbreviations of the exemplified substrates are as follows. F = phenylalanine (Phe), OH-F = hydroxy-deamino-phenylalanine, Ac = acetyl, N3Ac = azido-acetyl, oxP = 4-oxo-pentanoyl, Pen = penta-4-enoyl, Hex = hexanoyl, Pyl = penta -5-inoyl, CBA = carboxy-benzylamine, Mhe = 5-methyl-hexanoyl, Mim = maleimide, PyE = pyroglutamine, ^D Phe = D-phenylalanine

４． 翻訳
本実施形態では、様々なアミノ酸によりアシル化された開始tRNAを、無細胞翻訳系に加えて翻訳を開始することにより、所望のN末端骨格を持つポリペプチドの翻訳合成を行った。 4). Translation In this embodiment, translation synthesis of a polypeptide having a desired N-terminal skeleton was performed by initiating translation by adding an initiation tRNA acylated with various amino acids to a cell-free translation system.

翻訳系は、cDNAからの転写系を含む原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPGI社のPURESYSTEM（登録商標）を用いた。必要最低限のアミノ酸のみを含んだ翻訳反応混合物にアシル化tRNAを加えた。この時、生成するペプチドの検出のためC¹⁴でラベルされたAspを加えていた。翻訳反応後、tricine-SDS PAGEで解析した。 As a translation system, PURESYSTEM (registered trademark) of PGI, which is a prokaryotic-derived reconstituted cell-free protein synthesis system including a transcription system from cDNA, was used. Acylated tRNA was added to the translation reaction mixture containing only the minimum necessary amino acids. At this time, it had added labeled Asp at C ¹⁴ for the detection of peptides produced. After translation reaction, it was analyzed by tricine-SDS PAGE.

まず、翻訳反応で用いるアシル化開始tRNAを調整した。0.1 M Hepes-K buffer pH 7.5, 0.1 M KCl, 600 mM MgCl₂中で、20 μMスーパーフレキシザイム（dFx または eFx）15 μL、 20 μM tRNA^fMet _CAU, および5 mM 基質、20 % DMSOとを０℃で２〜６時間反応させた後、エタノール沈殿を行い、目的のアミノ酸でアシル化された開始tRNA（tRNA^fMet _cauまたはそのアンチコドンを変えた変異体）を単離した。その詳細な手順としては、40 μM tRNA^Asn _CUA（または変異体）を0.2 M Hepes-K buffer pH 7.5, 0.2 M KCl (7.5 μL) に加え、95℃で3分加熱し、5分間で25℃まで冷却した。MgCl₂(3 M, 3 μL)およびスーパーフレキシザイム(200 μM, 1.5 μL)を加え、混合物を25℃で5分静置した。基質（DMSO中25 mM, 3 μL）を加えることによりアシル化反応を開始し、氷上で2時間静置した。アシル化反応後、0.6 M 酢酸ナトリウム（pH 5）を45 μL加えることにより反応を停止し、エタノール沈殿によりRNAを回収した。ペレットを70%エタノールと0.1 M酢酸ナトリウム（pH 5）で2回洗浄し、70%エタノールで1回洗浄してアシル化開始tRNAを得た。アシル化開始tRNAは、翻訳混合物に添加する直前に0.5 μLの1 mM酢酸ナトリウムに溶解した。 First, acylation initiation tRNA used in the translation reaction was prepared. 15 μL of 20 μM superflexizyme (dFx or eFx), 20 μM tRNA ^fMet _CAU , and 5 mM substrate, 20% DMSO in 0.1 M Hepes-K buffer pH 7.5, 0.1 M KCl, 600 mM MgCl ₂ After reaction at 2 ° C. for 2 to 6 hours, ethanol precipitation was performed to _{isolate the} starting tRNA acylated with the target amino acid (tRNA ^fMet _cau or a mutant in which the anticodon was changed). As a detailed procedure, 40 μM tRNA ^Asn _CUA (or mutant) was added to 0.2 M Hepes-K buffer pH 7.5, 0.2 M KCl (7.5 μL), heated at 95 ° C for 3 minutes, and then at 25 ° C for 5 minutes. Until cooled. MgCl ₂ (3 M, 3 μL) and superflexizyme (200 μM, 1.5 μL) were added, and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 5 minutes. The acylation reaction was started by adding the substrate (25 mM in DMSO, 3 μL) and left on ice for 2 hours. After the acylation reaction, the reaction was stopped by adding 45 μL of 0.6 M sodium acetate (pH 5), and RNA was recovered by ethanol precipitation. The pellet was washed twice with 70% ethanol and 0.1 M sodium acetate (pH 5) and once with 70% ethanol to obtain an acylation initiation tRNA. The acylation initiating tRNA was dissolved in 0.5 μL of 1 mM sodium acetate just prior to addition to the translation mixture.

ペプチドの翻訳合成は、PURE systemを用いて、0.04 μM cDNA および3 mM EDTA、伸長反応用の必要最低限のアミノ酸として200 μM の Thr, Tyr, Lys またはThr, Gly, Phe, Tyr, Lysおよび 50 μM の [¹⁴C]-Asp、ならびに120 μMのアシル化tRNA^fMet _CAU を翻訳反応混合物に添加して行った。３７℃で１時間翻訳反応をさせた後、tricine-SDS PAGEで解析した。 Peptide translational synthesis was performed using the PURE system with 0.04 μM cDNA and 3 mM EDTA, 200 μM Thr, Tyr, Lys or Thr, Gly, Phe, Tyr, Lys and 50 This was done by adding μM [ ¹⁴ C] -Asp and 120 μM acylated tRNA ^fMet _CAU to the translation reaction mixture. After translation reaction at 37 ° C. for 1 hour, analysis was performed by tricine-SDS PAGE.

結果を図１２〜１８に示す。図１８以外は、いずれの例もＮ末端の開始コドンはメチオニンのコドン(ATG)、開始tRNAはtRNA^Asn _CUAを用いたものを示すが（鋳型cDNA配列は図中にYG1またはYG10として示した）、これら以外のcDNA配列でも翻訳合成反応に関し特に制限はないと思われた。また、本実施形態では示していないが、YG1のペプチド配列の中央のFをサプレッサーtRNAで読みとることでペプチド配列の真ん中にも非天然アミノ酸を導入可能である（F前後のT及びGはスペーサーとして配置してある）。ペプチドのＣ末端には精製用のタグとしてFLAG配列が存在する。 The results are shown in FIGS. Except for FIG. 18, in all examples, the N-terminal start codon is a methionine codon (ATG) and the start tRNA is tRNA ^Asn _CUA (the template cDNA sequence is shown as YG1 or YG10 in the figure). Even with other cDNA sequences, it seemed that there was no particular restriction on the translation synthesis reaction. Although not shown in this embodiment, an unnatural amino acid can be introduced into the middle of a peptide sequence by reading the center F of the peptide sequence of YG1 with a suppressor tRNA (T and G before and after F are spacers). Arranged). A FLAG sequence is present as a purification tag at the C-terminus of the peptide.

図１２〜１５は図６〜７で挙げたアミノ酸誘導体をチャージさせた開始tRNAを用いてペプチドが翻訳されるかを確認した実験である。
図１２では、ペプチド合成を様々な脂肪酸様アシル基をもったフェニルアラニンで開始した。ここではcDNA配列としてＹＧ１を利用し、必要最低限のアミノ酸としてThr, Gly, Phe, Tyr, Lysを加えている。メチオニンを系中に加えたポジティブコントロール(wt)では確かにバンドが現れ、ペプチド合成が行われたことを示している。一方メチオニン非存在下、開始tRNAを加えなかったり（-tRNA）、アシル化していない開始tRNAを加えた（Noaa）ネガティブコントロールではバンドが現れず、ペプチド合成が阻害されていることが確認できる。様々な脂肪酸様アシル基をもったフェニルアラニンでアシル化した開始tRNAを加えた場合にはペプチド合成が見られ、これらフェニルアラニン誘導体で翻訳反応が開始したことが示唆される。 12 to 15 are experiments in which it was confirmed whether the peptide was translated using the starting tRNA charged with the amino acid derivatives listed in FIGS.
In FIG. 12, peptide synthesis was initiated with phenylalanine with various fatty acid-like acyl groups. Here, YG1 is used as the cDNA sequence, and Thr, Gly, Phe, Tyr, and Lys are added as the minimum amino acids. In the positive control (wt) in which methionine was added to the system, a band appeared, indicating that peptide synthesis was performed. On the other hand, in the absence of methionine, no band appeared in the negative control with no starting tRNA added (-tRNA) or with an unacylated starting tRNA added (Noaa), confirming that peptide synthesis was inhibited. When an initiator tRNA acylated with phenylalanine having various fatty acid-like acyl groups was added, peptide synthesis was observed, suggesting that the translation reaction was initiated by these phenylalanine derivatives.

図１３では、図１２と同じくＹＧ１をcDNAとし、様々なアシル基をもったフェニルアラニンで翻訳開始させた。ここではアシル基として、翻訳後に化学的に修飾可能な官能基を持つもの（^N3AcF（アジド基）、^PylF（アルキン）、^oxPF（ケト基）、^MimF（マレイミド基））を用いた。 In FIG. 13, as in FIG. 12, YG1 was used as cDNA, and translation was initiated with phenylalanine having various acyl groups. Here, acyl groups having functional groups that can be chemically modified after translation ( ^N3Ac F (azide group), ^Pyl F (alkyne), ^oxPF (keto group), ^Mim F (maleimide group)) were used. .

図１４では、同じくＹＧ１をcDNAとし、カルボキシ-ベンジルアミンでアシル化したフェニルアラニン（^CBAF）で翻訳開始させた。このように立体的に大きなアシル基でも翻訳反応を開始させることができた。 In FIG. 14, YG1 was also used as cDNA, and translation was initiated with phenylalanine ( ^CBA F) acylated with carboxy-benzylamine. Thus, even a sterically large acyl group could initiate the translation reaction.

図１５では、同じくＹＧ１をcDNAとし、様々なフェニルアラニン誘導体で翻訳開始させた。ここではペプチドホルモンのＮ末端に頻繁にみられるピログルタミン酸（^pyEF）・及びＤ-アミノ酸であるＤ-フェニルアラニン（^ＤPheＦ）でアシル化したフェニルアラニンを用いた。さらに、これまで用いてきたものはＬ体のフェニルアラニンであったが、Ｄ体のフェニルアラニン(^DF)やN-アシル化されたＤ?フェニルアラニン(^PenDF)でも翻訳開始可能であることがわかった。 In FIG. 15, YG1 was also used as cDNA, and translation was initiated with various phenylalanine derivatives. Here, phenylalanine acylated with pyroglutamic acid ( ^pyE F) frequently observed at the N-terminus of the peptide hormone and D-phenylalanine ( ^DPhe F), which is a D-amino acid, was used. Moreover, although what has been previously used was a phenylalanine L-form, it was found that even D-phenylalanine ^(D F) and N- acylated D? Phenylalanine ^(PEND F) translatable initiation .

図１６は、20種類の天然アミノ酸をそれぞれアミノアシル化した開始tRNAをポリペプチドの翻訳合成に用いた例を示す。その結果、一部(Pro, Glu, Arg)を除いた全てのアミノ酸で翻訳開始が可能であった。（ここではcDNAとしてＹＧ１０を用いた。）
図１７ではトリペプチドをアシル化した開始tRNA(開始ペプチジル-tRNA)でも翻訳開始が可能であることを示した。（ここではcDNAとしてＹＧ１０を用いた。）２種類のDアミノ酸が含まれている点が重要である。 FIG. 16 shows an example in which an initiation tRNA obtained by aminoacylating 20 kinds of natural amino acids was used for translational synthesis of a polypeptide. As a result, it was possible to start translation with all amino acids except some (Pro, Glu, Arg). (Here, YG10 was used as the cDNA.)
FIG. 17 shows that translation initiation is possible even with a starting tRNA acylated from a tripeptide (starting peptidyl-tRNA). (Here, YG10 was used as the cDNA.) It is important that two types of D amino acids are included.

図１８は、通常の開始コドン以外の４種類のコドンでも開始が可能なことを示した図である。天然の開始tRNAの配列中のアンチコドン部分をAUGからAUA・CGG・CCG・GGC・GCCへと変換した開始tRNAとそれに対応する開始コドンを持つcDNA配列を用いて翻訳開始反応を行った。実験ではアミノ酸をチャージしていないtRNA(-aa, ネガティブコントロール)と、Met, Tyr, ProをそれぞれチャージしたtRNAを用いた。Proは図１６で示した20種類の天然アミノ酸中で何故か開始できないアミノ酸の一つで、開始コドンを変えることでも開始が可能とはならなかったが、他のアミノ酸では問題なく翻訳開始できた。この実験により天然の開始コドン(AUG)以外の配列も開始コドンとして割り当てることが可能であることが分かった。   FIG. 18 is a diagram showing that it is possible to start with four types of codons other than the normal start codon. A translation initiation reaction was carried out using a start tRNA obtained by converting the anticodon part in the sequence of the natural start tRNA from AUG to AUA / CGG / CCG / GGC / GCC and a cDNA sequence having a corresponding start codon. In the experiment, tRNA not charged with amino acid (-aa, negative control) and tRNA charged with Met, Tyr, and Pro were used. Pro is one of the 20 natural amino acids shown in FIG. 16 that cannot be started for some reason, and it could not be started by changing the start codon, but other amino acids could start translation without any problems. This experiment showed that sequences other than the natural start codon (AUG) can be assigned as start codons.

以上より、多種のＮ-アシルアミノ酸、及びＤ-アミノ酸、ならびに特殊骨格を含むポリペプチド骨格などがＮ末端に存在するペプチドを翻訳によって合成できること、開始コドンの改変が可能であることが確認された。   From the above, it was confirmed that various N-acylamino acids, D-amino acids, and polypeptide skeletons including special skeletons can be synthesized by translation and that the start codon can be modified. .

５． ペプチドのマススペクトル測定
ペプチド翻訳産物の分子量をマススペクトル測定により確認した。上述の方法で[¹⁴C]-Aspの代わりにAspを用いて反応を行ってペプチドを翻訳合成した後、生成物のＣ末端に付加させたFLAGタグ配列を利用し、生成物の翻訳混合物からの単離を行った。単離にはSIGMA社から発売されているANTI-FLAG (登録商標）M2アガロースを用いた。単離物をMALDI-MSで解析し、生成物の分子量が予想される分子量と一致すること及び、望まれない不純物(Ｎ末端にホルミルメチオニンが含むペプチドなど)が混入していないことを確認した。 5. Measurement of peptide mass spectrum The molecular weight of the peptide translation product was confirmed by mass spectrum measurement. After the peptide was synthesized by translation using Asp instead of [ ¹⁴ C] -Asp in the above-described manner, the FLAG tag sequence added to the C-terminus of the product was used to extract the product from the translation mixture. Was isolated. For isolation, ANTI-FLAG (registered trademark) M2 agarose sold by SIGMA was used. The isolate was analyzed by MALDI-MS, and it was confirmed that the molecular weight of the product was consistent with the expected molecular weight and that there were no unwanted impurities (such as peptides containing formylmethionine at the N-terminus). .

結果を図１９〜２５に示す。図１９〜２４は図１２〜１５で合成された種々のＮ末端骨格を持つポリペプチドのマススペクトルであり、図２５は図１７で示したトリペプチド開始産物のマススペクトルである。予測されるポリペプチドの分子量と観測された分子量とが一致し、さらに、マススペクトルに目的物の単一ピークしか観測されないことから、目的のポリペプチドのみが合成され、天然の翻訳開始機構を経て得られたペプチド等が混入していないことが明らかとなった。   The results are shown in FIGS. 19 to 24 are mass spectra of polypeptides having various N-terminal skeletons synthesized in FIGS. 12 to 15, and FIG. 25 is a mass spectrum of the tripeptide starting product shown in FIG. Since the predicted molecular weight of the polypeptide matches the observed molecular weight, and only a single peak of the target compound is observed in the mass spectrum, only the target polypeptide is synthesized and passed through the natural translation initiation mechanism. It became clear that the obtained peptide etc. were not mixed.

さらに、N末端アミノ基のホルミル化について新たな知見が得られた。図２２において、^CBAＦ（フェニルアラニンにベンジルアミンをアシル化した誘導体）で開始した翻訳産物（図１４）のN末端はMTFの存在下でもホルミル化されなかったことが示された。また、図２３において、ジペプチドを開始tRNAに結合させて翻訳に用いた場合にホルミル化されないことが示された。また、図２４において、D-アミノ酸をＮ末に有するポリペプチドも何ら問題なく翻訳合成されたことが確認され、さらに、D体フェニルアラニン（^ＤＦ）のN末端がホルミル化されなかったことも示された。なお、L体フェニルアラニンで開始した場合のホルミル化は確認されている。 Furthermore, new knowledge about the formylation of the N-terminal amino group was obtained. FIG. 22 shows that the N-terminus of the translation product (FIG. 14) initiated with ^CBA F (a derivative obtained by acylating benzylamine to phenylalanine) was not formylated even in the presence of MTF. FIG. 23 also shows that when a dipeptide is bound to an initiation tRNA and used for translation, it is not formylated. Further, in FIG. 24, D-amino acid polypeptide with the N-terminal also confirmed to have been translated synthesized without any problems, further, it shows also the N-terminus of the D-phenylalanine ^{(D F)} is not formylated It was done. In addition, formylation when starting with L-form phenylalanine has been confirmed.

天然の（原核）翻訳系における開始tRNAと本発明における開始tRNAの比較。Comparison of the starting tRNA in the natural (prokaryotic) translation system with the starting tRNA in the present invention. ペプチド性天然物のＮ末端部位にみられる特殊骨格の例。An example of a special skeleton found at the N-terminal site of peptidic natural products. 本発明で用いる様々な開始アミノ酸の例。Examples of various starting amino acids used in the present invention. 翻訳開始に使用しているtRNAの配列とその２時構造。本図では通常の開始コドン（AUG）に相補的なアンチコドン（CAU）をもつ一般的なtRNAを示している。Sequence of tRNA used for translation initiation and its 2 o'clock structure. This figure shows a general tRNA with an anticodon (CAU) complementary to the normal start codon (AUG). 天然の（原核）翻訳産物と本発明における翻訳産物の比較。Comparison of the natural (prokaryotic) translation product and the translation product in the present invention. 実施例で用いたアミノ酸誘導体。Amino acid derivatives used in the examples. 実施例で用いたアミノ酸誘導体。Amino acid derivatives used in the examples. 図６と図７で挙げたアミノ酸誘導体のアシル化の効率を確認した結果。The result of having confirmed the efficiency of acylation of the amino acid derivative quoted in FIG. 6 and FIG. 図６と図７で挙げたアミノ酸誘導体のアシル化の効率を確認した結果。The result of having confirmed the efficiency of acylation of the amino acid derivative quoted in FIG. 6 and FIG. 図６と図７で挙げたアミノ酸誘導体のアシル化の効率を確認した結果。The result of having confirmed the efficiency of acylation of the amino acid derivative quoted in FIG. 6 and FIG. 図６と図７で挙げたアミノ酸誘導体のアシル化の効率を確認した結果。The result of having confirmed the efficiency of acylation of the amino acid derivative quoted in FIG. 6 and FIG. 様々なアミノ酸でポリペプチドの翻訳合成を開始した例。Example of starting translational synthesis of polypeptides with various amino acids. 様々なアミノ酸でポリペプチドの翻訳合成を開始した例。Example of starting translational synthesis of polypeptides with various amino acids. 様々なアミノ酸でポリペプチドの翻訳合成を開始した例。Example of starting translational synthesis of polypeptides with various amino acids. 様々なアミノ酸でポリペプチドの翻訳合成を開始した例。Example of starting translational synthesis of polypeptides with various amino acids. 20種類の天然アミノ酸でポリペプチドの翻訳合成を開始した例。An example of starting translational synthesis of a polypeptide with 20 natural amino acids. ２種類のD-アミノ酸を含むトリペプチドでの開始の例。Example of initiation with a tripeptide containing two D-amino acids. 通常の開始コドン以外の４種類のコドンでも開始が可能なことを示した図。The figure which showed that it can start also with four types of codons other than a normal start codon. 図１２〜１５で合成したペプチド翻訳産物のマススペクトル。The mass spectrum of the peptide translation product synthesize | combined in FIGS. 図１２〜１５で合成したペプチド翻訳産物のマススペクトル。The mass spectrum of the peptide translation product synthesize | combined in FIGS. 図１２〜１５で合成したペプチド翻訳産物のマススペクトル。The mass spectrum of the peptide translation product synthesize | combined in FIGS. 図１２〜１５で合成したペプチド翻訳産物のマススペクトル。The mass spectrum of the peptide translation product synthesize | combined in FIGS. 図１２〜１５で合成したペプチド翻訳産物のマススペクトル。The mass spectrum of the peptide translation product synthesize | combined in FIGS. 図１２〜１５で合成したペプチド翻訳産物のマススペクトル。The mass spectrum of the peptide translation product synthesize | combined in FIGS. 図１７で示したトリペプチド開始のペプチドのマススペクトル。The mass spectrum of the peptide of the tripeptide start shown in FIG.

配列番号１：開始tRNA（tRNA^fMet）
配列番号２：アンチコドンを改変した開始tRNA
配列番号３：スーパーフレキシザイムeFx
配列番号４：スーパーフレキシザイムdFx
配列番号５：Ｐ１
配列番号６：Ｐ２
配列番号７：Ｐ３
配列番号８：Ｐ４
配列番号９：Ｐ５ SEQ ID NO: 1 starting tRNA (tRNA ^fMet )
SEQ ID NO: 2: Start tRNA with modified anticodon
SEQ ID NO: 3: Superflexizyme eFx
SEQ ID NO: 4: Superflexizyme dFx
SEQ ID NO: 5: P1
SEQ ID NO: 6: P2
SEQ ID NO: 7: P3
SEQ ID NO: 8: P4
SEQ ID NO: 9: P5

Claims (14)

所望のＮ末端構造を持つポリペプチドを翻訳合成する方法であって、
（ａ）tRNAのアシル化反応を触媒するリボザイムを提供する工程：
（ｂ）前記リボザイムによるアシル化反応の基質となる、所望の構造を持つアミノ酸基質を提供する工程；
（ｃ）前記（ａ）のリボザイムを用いて、前記（ｂ）のアミノ酸基質で開始tRNAのアシル化反応を行うことにより、所望の構造を持つアミノ酸でアミノアシル化された開始tRNAを得る工程；
（ｄ）前記（ｃ）で得られたアミノアシル化開始tRNAを無細胞翻訳系に加えて、所望の構造を持つアミノ酸で翻訳を開始させることにより、所望のＮ末端構造をもつポリペプチドを得る工程
を含む、前記方法。 A method for translating and synthesizing a polypeptide having a desired N-terminal structure,
(A) providing a ribozyme that catalyzes an acylation reaction of tRNA:
(B) providing an amino acid substrate having a desired structure, which is a substrate for the acylation reaction by the ribozyme;
(C) using the ribozyme of (a) to perform an acylation reaction of the starting tRNA with the amino acid substrate of (b), thereby obtaining an starting tRNA aminoacylated with an amino acid having a desired structure;
(D) A step of obtaining a polypeptide having a desired N-terminal structure by adding the aminoacylation initiation tRNA obtained in (c) above to a cell-free translation system and starting translation with an amino acid having a desired structure Said method. 工程（ｃ）で開始tRNAをアミノアシル化するアミノ酸がメチオニン以外の通常アミノ酸である、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the amino acid for aminoacylating the starting tRNA in step (c) is a normal amino acid other than methionine. 工程（ｃ）で開始tRNAをアミノアシル化するアミノ酸が異常アミノ酸である、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, wherein the amino acid that aminoacylates the starting tRNA in step (c) is an abnormal amino acid. 異常アミノ酸が、アミノ基に様々なアシル基が導入されたアミノ酸、Ｄ-アミノ酸、β-アミノ酸、γ-アミノ酸、δ-アミノ酸、およびこれらのアミノ酸のN-メチル化体、ピログルタミン酸、スタチン（β-ヒドロキシ-γ-アミノ酸）およびその誘導体、ジペプチド、トリペプチド、及びそれより長鎖のペプチドからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。   Abnormal amino acids include amino acids having various acyl groups introduced into amino groups, D-amino acids, β-amino acids, γ-amino acids, δ-amino acids, N-methylated products of these amino acids, pyroglutamic acid, statins (β The method according to claim 3, wherein the method is selected from the group consisting of -hydroxy-γ-amino acid) and derivatives thereof, dipeptides, tripeptides, and longer peptides. 工程（ｂ）で提供されるアミノ酸基質が、弱活性化されたアミノ酸である、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, wherein the amino acid substrate provided in step (b) is a weakly activated amino acid. アミノ酸基質がアミノ酸のシアノメチルエステル、ジニトロベンジルエステル又は4-クロロベンジルチオエステルである、請求項５に記載の方法。   6. The method according to claim 5, wherein the amino acid substrate is a cyanomethyl ester, dinitrobenzyl ester or 4-chlorobenzylthioester of an amino acid. tRNAのアシル化反応を触媒するリボザイムが、以下の（１）又は（２）
（１）GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU
（２）GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU
のいずれかのRNA配列からなるリボザイムである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 Ribozymes that catalyze the acylation reaction of tRNA are the following (1) or (2)
(1) GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU
(2) GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU
The method according to any one of claims 1 to 6, which is a ribozyme comprising any one of the RNA sequences. 開始tRNAが、５’から３’方向に、
GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUNNNAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA
で示されるRNA配列からなる構造を有し、NNNは任意の塩基の組合せからなるアンチコドンを表し、該アンチコドンに対応する開始コドンが、翻訳合成されるポリペプチドの配列をコードするmRNA上に存在し、該開始コドンが所望の構造を持つアミノ酸をコードする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 The starting tRNA is in the 5 ′ to 3 ′ direction,
GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCU NNN AACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA
NNN represents an anticodon consisting of any combination of bases, and an initiation codon corresponding to the anticodon is present on the mRNA encoding the sequence of the polypeptide to be translated and synthesized. The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the initiation codon encodes an amino acid having a desired structure. 開始tRNA中のアンチコドンがCAUであり、mRNA上の開始コドンがAUGである、請求項８に記載の方法。   9. The method of claim 8, wherein the anticodon in the start tRNA is CAU and the start codon on the mRNA is AUG. 開始tRNA中のアンチコドンがCAU以外のアンチコドンであり、mRNA上の開始コドンがAUG以外のコドンである、請求項８に記載の方法。   The method according to claim 8, wherein the anticodon in the start tRNA is an anticodon other than CAU, and the start codon on the mRNA is a codon other than AUG. 無細胞翻訳系として再構成無細胞翻訳系を用いる、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein a reconstituted cell-free translation system is used as the cell-free translation system. メチオニン又はメチオニルtRNA合成酵素（MetRS）を翻訳系中から除いて、天然の翻訳開始機構を阻害することにより、所望のＮ末端構造を持つポリペプチドだけが翻訳合成される、請求項１１に記載の方法。   The methionine or methionyl tRNA synthetase (MetRS) is removed from the translation system to inhibit the natural translation initiation mechanism, whereby only the polypeptide having the desired N-terminal structure is translated and synthesized. Method. メチオニンtRNAホルミルトランスフェラーゼ(MTF)の存在又は非存在を選択することにより、翻訳合成されるポリペプチドのN末端のホルミル化をコントロールする、請求項１１に記載の方法。   12. The method according to claim 11, wherein the formylation of the N-terminal of the polypeptide synthesized by translation is controlled by selecting the presence or absence of methionine tRNA formyltransferase (MTF). Ｎ末端に非天然骨格をもつポリペプチドを翻訳合成するために使用可能なキットであって
（ａ）以下の（１）又は（２）のいずれかのRNA配列からなる、tRNAのアシル化を触媒する２つのリボザイム：
（１）GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU
（２）GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU
（ｂ）前記リボザイムの基質となる、非天然骨格をもつアミノ酸基質
（ｃ）開始tRNA
（ｄ）無細胞合成系
を含む、前記キット。 A kit which can be used for translational synthesis of a polypeptide having a non-natural skeleton at the N-terminus, and (a) catalyzes acylation of tRNA comprising either of the following RNA sequences (1) or (2) Two ribozymes to do:
(1) GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU
(2) GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU
(B) an amino acid substrate having a non-natural skeleton serving as a substrate for the ribozyme (c) an initiating tRNA
(D) The kit comprising a cell-free synthesis system.