JP2008092808A - Genetic cluster specifically raising expression in marrow or peripheral blood cell derived from humans afflicted by rheumatoid arthritis - Google Patents
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本発明は、慢性関節リウマチの判定方法、慢性関節リウマチの診断用試薬、測定手段のセット、慢性関節リウマチの予防又は治療剤及びそのスクリーニング方法などを提供する。 The present invention provides a method for determining rheumatoid arthritis, a diagnostic reagent for rheumatoid arthritis, a set of measuring means, a prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis, a screening method thereof, and the like.
慢性関節リウマチ（Rheumatoid Arthritis：ＲＡ）は、滑膜細胞の過増殖を伴う全身的な関節の慢性炎症を優位に生じる関節炎により特徴付けられる全身性自己免疫疾患である。これは、関節における進行性の軟骨及び骨の破壊、並びに引き続く身体障害を誘導する。ＲＡ発症は遺伝的要因に関与し得るので、多くのグループが健常又は罹患した個体からのサンプルを、大規模な比較のためにＤＮＡ核酸アレイ解析に供している。これらの研究は、ＲＡ発症に有益な洞察を提供した（非特許文献１及び２）。試験された第１のサンプルは、ＲＡ及び変形性関節症（Osteoarthritis：ＯＡ）患者由来の滑膜試料（非特許文献３〜８）、及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（非特許文献９）であり、得られた核酸アレイ遺伝子発現データのクラスター解析は、ＲＡ発症において特異的な役割を果たし得る幾つかの候補遺伝子を示した。 Rheumatoid Arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease characterized by arthritis that predominates with chronic inflammation of the systemic joints with hyperproliferation of synoviocytes. This induces progressive cartilage and bone destruction in the joints and subsequent disability. Since RA development can be associated with genetic factors, many groups have submitted samples from healthy or affected individuals to DNA nucleic acid array analysis for large-scale comparisons. These studies provided valuable insights into the development of RA (Non-Patent Documents 1 and 2). The first samples tested were synovial samples from RA and Osteoarthritis (OA) patients (Non-Patent Documents 3-8), and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) (Non-Patent Document 9). And cluster analysis of the resulting nucleic acid array gene expression data showed several candidate genes that could play a specific role in RA development.
ＲＡ発症において鍵となる因子を探索するための他の研究において、抗リウマチ性滑膜細胞抗体を用いるイムノスクリーニングは、シノビオリン（synoviolin）／Ｈｒｄ１がリウマチ滑膜において高度に発現している酵素（Ｅ３ユビキチンリガーゼ）であることを同定した（非特許文献１０）。シノビオリンはＲＡの病原性因子のようである。なぜなら、この酵素を過剰発現するマウスは、自然に関節症を発病し、一方、ヘテロ接合性ノックダウンは滑膜細胞のアポトーシスの増加及びコラーゲン誘導性関節炎に対する抵抗性を生じたからである（非特許文献１１）。シノビオリン過剰発現に起因する、折り畳まれていないタンパク質の過剰な除去は、滑膜細胞の過増殖を誘発することが提唱されている（非特許文献１２）。従って、シノビオリンは、小胞体（ＥＲ）−関連分解（ＥＲＡＤ）系を介したタンパク質の品質管理におけるその機能に起因する関節症の発症において中心的な役割を果たすのかもしれない；従って、その発現の上昇は、滑膜の過形成を引き起こす抗アポトーシス効果を有する。 In other studies to search for key factors in the development of RA, immunoscreening using anti-rheumatic synovial cell antibodies has demonstrated that synoviolin / Hrd1 is highly expressed in rheumatoid synovium (E3). Ubiquitin ligase) (Non-patent Document 10). Synoviolin appears to be a virulence factor for RA. This is because mice that overexpress this enzyme spontaneously developed arthropathy, whereas heterozygous knockdown resulted in increased apoptosis of synovial cells and resistance to collagen-induced arthritis (non-patented). Reference 11). It has been proposed that excessive removal of unfolded protein due to synoviolin overexpression induces synovial cell hyperproliferation (Non-Patent Document 12). Synoviolin may therefore play a central role in the development of arthropathy due to its function in protein quality control via the endoplasmic reticulum (ER) -associated degradation (ERAD) system; The increase in has an anti-apoptotic effect that causes synovial hyperplasia.
骨髄由来単核細胞（ＢＭＭＣ）は、ＲＡ発症に関与し得る鍵となる遺伝子の同定を目的とする解析に対する別の標的である。なぜなら、蓄積している証拠は、ＢＭＭＣ細胞異常はＲＡの発症及び実験的関節炎モデルに貢献し得ることを示唆するからである（非特許文献１３〜１６）。さらに、ＲＡ患者は、中枢及び末梢Ｂ細胞トレランスチェックポイントを受け（非特許文献１７）、それらは先ず、初期未熟Ｂ細胞ステージと未熟Ｂ細胞ステージとの間に骨髄で生じる（自己抗体発現Ｂ細胞の第２カウンター選択ステップは、新たな移動細胞（emigrant）が成熟ナイーブＢ細胞になるときに末梢で生じる）（非特許文献１７及び１８）。さらに、ＲＡ滑膜で見出されたのと同様の炎症性変化が、関与するＲＡ関節の肋軟骨下骨髄で生じるようであり（非特許文献１９）、滑膜炎症性組織は、皮質性バリアを十分に破壊することにより隣接する骨髄に到達できる（非特許文献２０）。従って、ＢＭＭＣ細胞はＲＡ発症に関与する特定の遺伝子の同定を試みる研究についての興味深い対象である。 Bone marrow-derived mononuclear cells (BMMC) are another target for analysis aimed at identifying key genes that may be involved in RA development. This is because accumulated evidence suggests that BMMC cell abnormalities may contribute to the development of RA and experimental arthritis models (Non-Patent Documents 13 to 16). In addition, RA patients undergo central and peripheral B cell tolerance checkpoints (Non-Patent Document 17), which first occur in the bone marrow between the early and immature B cell stages (autoantibody expressing B cells). This second counter selection step occurs at the periphery when a new migrant becomes a mature naive B cell) (Non-patent Documents 17 and 18). Furthermore, inflammatory changes similar to those found in RA synovium appear to occur in the subchondral bone marrow of the RA joint involved (Non-Patent Document 19), and synovial inflammatory tissue is a cortical barrier. It is possible to reach the adjacent bone marrow by sufficiently destroying (Non-patent Document 20). BMMC cells are therefore an interesting subject for studies that attempt to identify specific genes involved in RA development.
ところで、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）については、以下が報告されている。ＡＲＥＧの過剰発現は、マウス及びヒトにおける乾癬に関連している（非特許文献２１及び２２）。乾癬は、炎症性細胞の表皮及び真皮への浸潤につながる、ケラチノサイトの過増殖及び表皮バリア機能の損失により特徴付けられる。ＡＲＥＧはまた、野生型及びドミナントネガティブ形態のオーファン核内レセプターＮｕｒｒ１が過剰発現している、ＲＡ患者由来の滑膜細胞株でアップレギュレートしている（非特許文献２３）。興味深いことに、トランスジェニックマウスの基底表皮におけるＡＲＥＧ過剰発現は、滑膜炎症に関連する表現型を誘導する（非特許文献２４）。さらに、我々は以前に、ＡＲＥＧ発現がまたＳＬＥ及び特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）患者のＰＢＭＣにおいて亢進していることを示している（非特許文献２５）。 By the way, the following has been reported for amphiregulin (AREG). AREG overexpression is associated with psoriasis in mice and humans (21, 22). Psoriasis is characterized by keratinocyte hyperproliferation and loss of epidermal barrier function leading to infiltration of inflammatory cells into the epidermis and dermis. AREG is also up-regulated in RA patient-derived synovial cell lines overexpressing wild-type and dominant negative forms of the orphan nuclear receptor Nurr1 (Non-patent Document 23). Interestingly, AREG overexpression in the basal epidermis of transgenic mice induces a phenotype associated with synovial inflammation (24). Furthermore, we have previously shown that AREG expression is also elevated in PBMCs of patients with SLE and idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) (Non-patent Document 25).
ＦＫＢＰ５は、ＦＫ５０６に対する細胞レセプターであり、プロテインフォスファターゼカルシニューリンの阻害により、活性化Ｔ細胞に対する免疫抑制効果を示す（非特許文献２６）。ＦＫＢＰ５は、ＲＡに伴う痛みを低減するための効果的な薬物であることが示唆されている（非特許文献２７）。これは、ＦＫＢＰ５がプロスタグランジンＥ２の滑膜細胞による産生を阻害することにより炎症を抑制し得るからである；ＦＫＢＰ５は、白血球によるＩＬ−１β産生を抑制することによりそのように働き得る（非特許文献２８）。 FKBP5 is a cell receptor for FK506, and exhibits an immunosuppressive effect on activated T cells by inhibiting protein phosphatase calcineurin (Non-patent Document 26). FKBP5 has been suggested to be an effective drug for reducing the pain associated with RA (Non-patent Document 27). This is because FKBP5 can suppress inflammation by inhibiting the production of prostaglandin E2 by synovial cells; FKBP5 can do so by suppressing IL-1β production by leukocytes (non- Patent Document 28).
ＴＰＳＴ１は、翻訳後修飾のチロシンＯ−硫酸化を媒介する２つのゴルジチロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ（ＴＰＳＴ１及びＴＰＳＴ２）の１つである。ＴＰＳＴ１は、トランス−ゴルジ系内のチロシン硫酸化を媒介し、真核生物細胞における全てのチロシンのうち１％のチロシンに影響を及ぼす。この翻訳後修飾が自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たすのかもしれないことが以前より示唆されている。なぜなら、それは、リガンドとレセプターとの間の相互作用を亢進することにより免疫応答の種々の段階で単核細胞の機能を調節するからである（非特許文献２９）。 TPST1 is one of two Golgi tyrosyl protein sulfotransferases (TPST1 and TPST2) that mediate post-translationally modified tyrosine O-sulfation. TPST1 mediates tyrosine sulfation within the trans-Golgi system and affects 1% of all tyrosines in eukaryotic cells. It has previously been suggested that this post-translational modification may play an important role in the development of autoimmune diseases. Because it regulates the function of mononuclear cells at various stages of the immune response by enhancing the interaction between the ligand and the receptor (Non-patent Document 29).
ＣＬＥＣＳＦ９は、カルシウム依存性カルボヒドレート認識ドメインを保持するマクロファージ誘導性Ｃ型レクチン（Ｍｉｎｃｌｅ）をコードする。ＣＬＥＣＳＦ９は、糖鎖を認識することにより複数の機能を示すマクロファージ誘導性Ｃ型レクチンに属する；それは、マクロファージ機能において重要な役割を果たす。特に、ＤＣ特異的細胞内接着分子３−grabbing非インテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）と呼ばれるＣ型レクチンもまた、ＲＡ患者の滑膜においてマクロファージにより高度に発現している（非特許文献３０）。 CLECSF9 encodes a macrophage-inducible C-type lectin (Mincle) that retains the calcium-dependent carbohydrate recognition domain. CLECSF9 belongs to a macrophage-inducible C-type lectin that exhibits multiple functions by recognizing sugar chains; it plays an important role in macrophage function. In particular, a C-type lectin called DC-specific intracellular adhesion molecule 3-grabbing non-integrin (DC-SIGN) is also highly expressed by macrophages in the synovium of RA patients (Non-patent Document 30).
ＡＵＲＡ１は、チオエステラーゼに類似する新規タンパク質をコードする。チオエステラーゼホモログは広範であるため、チオエステラーゼの機能はヒトゲノムで変動する（非特許文献３１）。従って、ＡＵＲＡ１の生理学的機能は未知のままである。 AURA1 encodes a novel protein similar to thioesterase. Since thioesterase homologues are extensive, the function of thioesterase varies in the human genome (Non-patent Document 31). Therefore, the physiological function of AURA1 remains unknown.
Ｇ０Ｓ２は、細胞周期のＧ０からＧ１期までのそれらのレクチン誘導性スイッチの間において、リンパ球で差示的に発現しているＧ０／Ｇ１スイッチ（Ｇ０Ｓ）遺伝子の一つである（非特許文献３２）。Ｇ０Ｓ２に関しては、我々は以前に、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者及び健康な若い女性の双方のＰＢＭＣが亢進したレベルのＧ０Ｓ２ ｍＲＮＡを発現していることを示した（非特許文献２５）。 G0S2 is one of the G0 / G1 switch (G0S) genes that are differentially expressed in lymphocytes among those lectin-inducible switches from the G0 to G1 phases of the cell cycle (Non-patent literature). 32). Regarding G0S2, we have previously shown that PBMC in both systemic lupus erythematosus (SLE) patients and healthy young women express elevated levels of G0S2 mRNA (Non-patent Document 25).
ＣＸＣＲ４（間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２）と呼ばれるケモカインに対するレセプター）は、造血幹細胞の移動、ホーミング及び生存に重要である。虚血性心筋により分泌されるＳＤＦ−１は、白血球のホメオスタティック及び炎症性トラフィックに関与し、ＲＡ患者の滑膜組織において高度に発現している（非特許文献３３）。ＣＸＣＲ４はまた、色素性絨毛結節性滑膜炎（ＰＶＮＳ）の患者の滑膜細胞でアップレギュレートしている炎症関連遺伝子として同定されている（非特許文献３４）。ＣＸＣＲ４発現はまた、自己免疫中枢神経系（ＣＮＳ）炎症の動物モデルである、実験的自己免疫性脳脊髄炎の動物の脊髄でアップレギュレートされる（非特許文献３５）。 CXCR4, a receptor for a chemokine called stromal cell-derived factor-1 (SDF-1 / CXCL12), is important for hematopoietic stem cell migration, homing and survival. SDF-1 secreted by ischemic myocardium is involved in leukocyte homeostatic and inflammatory traffic, and is highly expressed in the synovial tissue of RA patients (Non-patent Document 33). CXCR4 has also been identified as an inflammation-related gene that is up-regulated in synovial cells of patients with pigmented chorio-nodal synovitis (PVNS) (Non-patent Document 34). CXCR4 expression is also upregulated in the spinal cord of animals with experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model of autoimmune central nervous system (CNS) inflammation (35).
ＮＦ−κＢは、各細胞の細胞質にある転写因子であり、広範な種々の薬剤（サイトカインを含む）により活性化されると核にトランスロケートする（非特許文献３６）。ＮＦ−κＢは、ＮＦ−κＢのレセプターアクチベータ（receptor activator of NF-κB：ＲＡＮＫ）及びそのリガンドＲＡＮＫＬと共に、ＲＡの病態生理学的プロセスにおいて中心的な役割を果たすことが見出されている（非特許文献３７）。
本発明は、慢性関節リウマチの診断及び治療などに役立ち得る種々の手段を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide various means that can be useful for diagnosis and treatment of rheumatoid arthritis.
本発明者らは、５０人のＲＡ患者のプールしたＢＭＭＣ ｍＲＮＡにおいて５０人のＯＡ患者と比較して発現が劇的に誘導されているか、又は減少している遺伝子を同定するために、これらのプールしたｍＲＮＡを、本発明者らが以前に開発した独自の技術であるステップワイズ・サブトラクション（Fujii, T.ら, 2002, EMBO Rep., 3, 367-372）に供した。この方法は、ＲＡ発症の間に特異的にアップ又はダウンレギュレートされるこれらの遺伝子の包括的な同定を可能にする。本発明者らはまた核酸アレイ解析（アジレント社製：Hu44K）を補完的に用いて取りこぼしを最小限に抑えた。本発明者らはこれらの実験におけるコントロールとして、変形性関節症(OA:Osteo Arthritis)患者由来のＢＭＭＣ ＲＮＡを供した。これらの解析は最終的に１０３個のＲＡ患者で発現亢進しているＡＵＲＡ遺伝子の単離につながった。このうち、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）は、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）によりＲＡ患者において最も顕著に誘導される遺伝子であることが明らかとなった。興味深いことに、本発明者らはまた、ＡＲＥＧが、滑膜細胞において、上皮増殖因子レセプター（ＥＦＧＲ）シグナリング経路を介してシノビオリンの上流に作用し得ることなどを見出した。本発明者らは、これらの知見より、ＲＡの判定に役立ち得る種々の発明、並びにＲＡの治療薬及びそのスクリーニング方法等の発明を想起し、本発明を完成するに至った。 We have identified these genes in the pooled BMMC mRNA of 50 RA patients to identify genes whose expression is dramatically induced or decreased compared to 50 OA patients. The pooled mRNA was subjected to stepwise subtraction (Fujii, T. et al., 2002, EMBO Rep., 3, 367-372), a unique technique previously developed by the inventors. This method allows for comprehensive identification of those genes that are specifically up- or down-regulated during RA development. The inventors also used nucleic acid array analysis (Agilent: Hu44K) in a complementary manner to minimize spillage. The present inventors provided BMMC RNA derived from an osteoarthritis (OA) patient as a control in these experiments. These analyzes ultimately led to the isolation of the AURA gene that is upregulated in 103 RA patients. Of these, amphiregulin (AREG) was found to be the most prominent gene in RA patients by quantitative real-time RT-PCR (QRT-PCR). Interestingly, the inventors have also found that AREG can act upstream of Synoviolin via the epidermal growth factor receptor (EFGR) signaling pathway in synovial cells. Based on these findings, the present inventors have conceived various inventions that can be useful for the determination of RA and inventions such as therapeutic agents for RA and screening methods thereof, and have completed the present invention.
即ち、本発明は、下記の通りである：
〔１〕ヒトから採取された生体試料においてＡＲＥＧの発現量を測定し、該ヒトが慢性関節リウマチを発症しているか否かを評価することを含む、慢性関節リウマチの判定方法；
〔２〕生体試料が骨髄液又は末梢血である、上記〔１〕の方法；
〔３〕慢性関節リウマチと変形性関節症との間の識別方法として用いられる、上記〔１〕又は〔２〕の方法；
〔４〕ヒトから採取された生体試料において切断型ＡＲＥＧの量を測定し、該ヒトが慢性関節リウマチを発症しているか否かを評価することを含む、慢性関節リウマチの判定方法；
〔５〕プライマー、核酸プローブ及び抗体からなる群より選ばれる１以上のＡＲＥＧ測定用手段を含む、慢性関節リウマチの診断用試薬；
〔６〕Ｇ０Ｓ２、ＣＸＣＲ４、ＮＦ−κＢ、ＡＵＲＡ１、ＦＫＢＰ５、ＣＬＥＣＳＦ９、ＴＰＳＴ１及びＡＵＲＡ２からなる群より選ばれる１以上の遺伝子に対する、プライマー、核酸プローブ及び抗体からなる群より選ばれる１以上の測定用手段をさらに含む、上記〔５〕の試薬；
〔７〕測定用手段のセットであって、
（ｉ）ＡＲＥＧに対する測定用手段、並びに（ｉｉ）Ｇ０Ｓ２、ＣＸＣＲ４、ＮＦ−κＢ、ＡＵＲＡ１、ＦＫＢＰ５、ＣＬＥＣＳＦ９、ＴＰＳＴ１及びＡＵＲＡ２からなる群より選ばれる１以上の遺伝子に対する、プライマー、核酸プローブ及び抗体からなる群より選ばれる１以上の測定用手段を含む、セット；
〔８〕測定用手段のセットが、プライマーのセット、あるいは核酸アレイ又は抗体アレイである、上記〔７〕のセット；
〔９〕（ｉｉ）における１以上の遺伝子が、（ａ）Ｇ０Ｓ２、ＣＸＣＲ４及びＮＦ−κＢからなる群より選ばれる１以上の遺伝子、並びに（ｂ）ＡＵＲＡ１、ＦＫＢＰ５、ＣＬＥＣＳＦ９、ＴＰＳＴ１及びＡＵＲＡ２からなる群より選ばれる１以上の遺伝子を少なくとも含む、上記〔７〕又は〔８〕のセット；
〔１０〕ＡＲＥＧの発現又は機能を阻害し得る物質を含む、慢性関節リウマチの予防又は治療剤；
〔１１〕ＡＲＥＧの機能を阻害し得る物質が中和抗体である、上記〔１０〕の剤；
〔１２〕被験物がＡＲＥＧの発現又は機能を阻害し得るか否かを評価することを含む、慢性関節リウマチの予防又は治療剤のスクリーニング方法；
〔１３〕慢性関節リウマチに罹患したヒト由来の細胞を用いて、被験物がＡＲＥＧの機能を阻害し得るか否かを評価することを含む、上記〔１２〕の方法；
〔１４〕細胞が滑膜細胞である、上記〔１３〕の方法；
〔１５〕細胞がＡＲＥＧで処理された細胞である、上記〔１３〕又は〔１４〕の方法；
〔１６〕被験物が、ＡＲＥＧ切断プロテアーゼの機能を阻害することにより、ＡＲＥＧの機能を阻害し得るか否かを評価することを含む方法である、上記〔１３〕の方法；
〔１７〕ＡＲＥＧで処理された、慢性関節リウマチに罹患したヒト由来の滑膜細胞；
〔１８〕動物から採取された生体試料においてＡＵＲＡ１〜１０３からなる群より選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定し、該動物が慢性関節リウマチを発症しているか否かを評価することを含む、慢性関節リウマチの判定方法；
〔１９〕ＡＵＲＡ１〜１０３からなる群より選ばれる１以上の遺伝子に対する１以上の測定用手段を含む、慢性関節リウマチの診断用試薬；
〔２０〕ＡＵＲＡ１〜１０３からなる群より選ばれる２以上の遺伝子に対する２以上の測定用手段を含む、セット；
〔２１〕ＡＵＲＡ１〜１０３からなる群より選ばれる１以上の遺伝子の発現又は機能を阻害し得る物質を含む、慢性関節リウマチの予防又は治療剤；
〔２２〕被験物が、ＡＵＲＡ１〜１０３からなる群より選ばれる１以上の遺伝子の発現又は機能を阻害し得るか否かを評価することを含む、慢性関節リウマチの予防又は治療剤のスクリーニング方法。
That is, the present invention is as follows:
[1] A method for determining rheumatoid arthritis, comprising measuring the expression level of AREG in a biological sample collected from a human and evaluating whether or not the human has developed rheumatoid arthritis;
[2] The method according to [1] above, wherein the biological sample is bone marrow fluid or peripheral blood;
[3] The method according to [1] or [2] above, which is used as a method for distinguishing between rheumatoid arthritis and osteoarthritis;
[4] A method for determining rheumatoid arthritis, comprising measuring the amount of truncated AREG in a biological sample collected from a human and evaluating whether or not the human has developed rheumatoid arthritis;
[5] A diagnostic reagent for rheumatoid arthritis, comprising one or more AREG measurement means selected from the group consisting of a primer, a nucleic acid probe, and an antibody;
[6] One or more measuring means selected from the group consisting of primers, nucleic acid probes and antibodies for one or more genes selected from the group consisting of G0S2, CXCR4, NF-κB, AURA1, FKBP5, CLECSF9, TPST1 and AURA2. The reagent of [5] above, further comprising:
[7] A set of measuring means,
(I) means for measuring AREG, and (ii) primers, nucleic acid probes and antibodies for one or more genes selected from the group consisting of G0S2, CXCR4, NF-κB, AURA1, FKBP5, CLECSF9, TPST1 and AURA2. A set comprising one or more measuring means selected from the group;
[8] The set of [7] above, wherein the set of measurement means is a primer set, or a nucleic acid array or an antibody array;
[9] One or more genes in (ii) are (a) one or more genes selected from the group consisting of G0S2, CXCR4 and NF-κB, and (b) a group consisting of AURA1, FKBP5, CLECSF9, TPST1 and AURA2 The set of [7] or [8] above, comprising at least one or more genes selected from the above;
[10] A prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis, comprising a substance capable of inhibiting the expression or function of AREG;
[11] The agent according to [10] above, wherein the substance capable of inhibiting the function of AREG is a neutralizing antibody;
[12] A screening method for a prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis, comprising evaluating whether or not a subject can inhibit the expression or function of AREG;
[13] The method according to [12] above, comprising evaluating whether or not the test substance can inhibit the function of AREG, using cells derived from a human suffering from rheumatoid arthritis;
[14] The method of [13] above, wherein the cell is a synovial cell;
[15] The method of [13] or [14] above, wherein the cell is a cell treated with AREG;
[16] The method according to [13] above, which comprises evaluating whether or not the test substance can inhibit the function of AREG by inhibiting the function of AREG-cleaving protease;
[17] Synovial cells derived from humans with rheumatoid arthritis treated with AREG;
[18] measuring the expression level of one or more genes selected from the group consisting of AURA1 to 103 in a biological sample collected from an animal, and evaluating whether or not the animal has developed rheumatoid arthritis , A method for determining rheumatoid arthritis;
[19] A diagnostic reagent for rheumatoid arthritis, comprising one or more measuring means for one or more genes selected from the group consisting of AURA1 to 103;
[20] A set comprising two or more measuring means for two or more genes selected from the group consisting of AURA 1 to 103;
[21] A prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis, comprising a substance capable of inhibiting the expression or function of one or more genes selected from the group consisting of AURA 1 to 103;
[22] A screening method for a prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis, comprising evaluating whether a test substance can inhibit the expression or function of one or more genes selected from the group consisting of AURA1 to 103.
本発明の判定方法は、例えば、慢性関節リウマチの判定、並びに慢性関節リウマチ及び変形性関節症の識別に有用であり得る。本発明の判定方法はまた、簡便、迅速かつ低コストであり、高感度及び特異性も高いというメリットを有し得る。
本発明の診断用試薬及びセットは、例えば、慢性関節リウマチの判定、並びに慢性関節リウマチ及び変形性関節症の識別に有用であり得、また、本発明の判定方法を行うための簡便な手段としても有用であり得る。
本発明の剤は、例えば、慢性関節リウマチの予防及び治療に有用であり得る。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、慢性関節リウマチの予防及び治療剤の開発に有用であり得る。
本発明の細胞は、例えば、慢性関節リウマチの予防及び治療剤の開発、慢性関節リウマチの病態解析、並びに本明細書中に開示される所定の標的遺伝子が関連し得る他の疾患の予防及び治療剤の開発、及び当該他の疾患の病態解析などに有用であり得る。
The determination method of the present invention can be useful, for example, for determination of rheumatoid arthritis and discrimination between rheumatoid arthritis and osteoarthritis. The determination method of the present invention can also have merits that it is simple, quick and low-cost, and has high sensitivity and specificity.
The diagnostic reagent and set of the present invention can be useful for, for example, determination of rheumatoid arthritis and identification of rheumatoid arthritis and osteoarthritis, and as a simple means for performing the determination method of the present invention. Can also be useful.
The agent of the present invention may be useful, for example, for prevention and treatment of rheumatoid arthritis.
The screening method of the present invention can be useful, for example, in the development of preventive and therapeutic agents for rheumatoid arthritis.
The cells of the present invention can be used, for example, for the development of agents for the prevention and treatment of rheumatoid arthritis, the pathological analysis of rheumatoid arthritis, and the prevention and treatment of other diseases that can be associated with the predetermined target genes disclosed herein. It may be useful for the development of drugs and the pathological analysis of other diseases.
本発明は、慢性関節リウマチの判定方法を提供する。 The present invention provides a method for determining rheumatoid arthritis.
本発明の方法は、例えば、動物由来の生体試料において標的遺伝子の発現量を測定し、該動物が慢性関節リウマチを発症しているか否かを評価することを含み得る。 The method of the present invention can include, for example, measuring the expression level of a target gene in a biological sample derived from an animal and evaluating whether the animal has developed rheumatoid arthritis.
生体試料としては、標的遺伝子の発現細胞を含むか、又は標的遺伝子が分泌タンパク質の遺伝子である場合は当該分泌タンパク質を含む動物由来試料である限り特に限定されず、例えば、骨髄液、末梢血が挙げられる。なお、これらの生体試料は、所定の処理（例、分画処理）に供されたものであってもよい。生体試料が由来し得る動物としては、げっ歯類（例、マウス、ラット）、霊長類（例、ヒト、サル）等の哺乳動物が挙げられるが、ヒトが好ましい。本発明で用いられる生体試料は、動物から採取された生体試料であり得るが、特定の局面では、本発明の方法は、動物から生体試料を採取することを含み得る。 The biological sample is not particularly limited as long as it contains cells expressing the target gene, or the target gene is a secreted protein gene, as long as it is an animal-derived sample containing the secreted protein. Can be mentioned. These biological samples may be subjected to a predetermined process (eg, fractionation process). Examples of animals from which the biological sample can be derived include mammals such as rodents (eg, mice, rats), primates (eg, humans, monkeys), and humans are preferred. Although the biological sample used in the present invention can be a biological sample collected from an animal, in certain aspects, the methods of the present invention can include collecting a biological sample from an animal.
標的遺伝子の発現量の測定は、標的遺伝子の転写産物又は翻訳産物を対象として自体公知の方法により行うことができる。例えば、標的遺伝子の転写産物の発現量は、生体試料からの総ＲＮＡの調製後、ＰＣＲ（例、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）（例えば、WO00/28082参照）、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）（例えば、WO00/56877参照）等の遺伝子増幅法、あるいはノザンブロッティング、核酸アレイなどにより測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、生体試料からの抽出液の調製後、免疫学的手法により測定され得る。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法が挙げられる。標的遺伝子の発現量の測定を可能とする上記以外の方法としては、例えば、質量分析法が挙げられる。標的遺伝子の発現量の測定はまた、後述の試薬及びセットを用いて行われ得る。 The expression level of the target gene can be measured by a method known per se for the transcription product or translation product of the target gene. For example, the expression level of the transcript of the target gene can be determined by preparing PCR (eg, RT-PCR, real-time PCR, quantitative PCR), LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) (for example, WO00) after preparing total RNA from a biological sample. / 28082), gene amplification methods such as ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids) (see, for example, WO00 / 56877), Northern blotting, nucleic acid arrays, and the like. Moreover, the expression level of a translation product can be measured by an immunological technique after preparing an extract from a biological sample. Examples of such immunological techniques include enzyme immunoassay (EIA) (eg, direct competition ELISA, indirect competition ELISA, sandwich ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), Examples include immunochromatography, luminescence immunoassay, spin immunoassay, western blot, and immunohistochemical staining. Examples of methods other than the above that enable measurement of the expression level of the target gene include mass spectrometry. The measurement of the expression level of the target gene can also be performed using the reagents and sets described below.
次いで、標的遺伝子の発現量の測定結果に基づき、動物が慢性関節リウマチを発症しているか否かが評価され得る。慢性関節リウマチを発症している動物と当該疾患を発症していない動物との間では標的遺伝子の発現量に差異が認められることから、慢性関節リウマチを発症している動物及び当該疾患を発症していない動物を識別し得るカットオフ値を適宜設定することで、このような評価が可能となる。 Then, based on the measurement result of the expression level of the target gene, it can be evaluated whether or not the animal has developed rheumatoid arthritis. Since there is a difference in the expression level of the target gene between animals that develop rheumatoid arthritis and animals that do not develop the disease, animals that develop rheumatoid arthritis and those that develop the disease Such an evaluation can be performed by appropriately setting a cut-off value that can identify an animal that is not.
慢性関節リウマチに罹患した動物の生体試料で特異的に発現が亢進している遺伝子（以下、必要に応じて、（ａ）の遺伝子と省略する）としては、例えば、ＡＲＥＧ、ＡＵＲＡ１、ＦＫＢＰ５、ＣＬＥＣＳＦ９、ＴＰＳＴ１、ＡＵＲＡ２、Ｇ０Ｓ２、ＣＸＣＲ４、ＮＦ−κＢなどの後述の表１に記載される遺伝子（例、ＡＵＲＡ１〜１０３）が挙げられる。慢性関節リウマチに罹患した動物の生体試料で特異的に発現が亢進している遺伝子はまた、（ａ１）慢性関節リウマチに罹患した動物の骨髄液及び末梢血の双方で特異的に発現が亢進している遺伝子（例、ＡＲＥＧ、Ｇ０Ｓ２、ＣＸＣＲ４、ＮＦ−κＢ）、並びに（ａ２）慢性関節リウマチに罹患した動物の骨髄液で特異的に発現が亢進しているが、末梢血で発現が亢進していない遺伝子（例、ＡＵＲＡ１、ＦＫＢＰ５、ＣＬＥＣＳＦ９、ＴＰＳＴ１、ＡＵＲＡ２）に分類することができる。 Examples of genes whose expression is specifically enhanced in biological samples of animals suffering from rheumatoid arthritis (hereinafter abbreviated as (a) as necessary) include, for example, AREG, AURA1, FKBP5, CLECSF9 , TPST1, AURA2, G0S2, CXCR4, NF-κB and other genes described in Table 1 described later (eg, AURA1 to 103). A gene whose expression is specifically enhanced in a biological sample of an animal suffering from rheumatoid arthritis is also (a1) a gene whose expression is specifically enhanced in both bone marrow fluid and peripheral blood of an animal suffering from rheumatoid arthritis. Gene (eg, AREG, G0S2, CXCR4, NF-κB) and (a2) expression is specifically increased in bone marrow fluid of animals affected by rheumatoid arthritis, but expression is increased in peripheral blood Genes (eg, AURA1, FKBP5, CLECSF9, TPST1, AURA2) that are not present.
慢性関節リウマチ（自己免疫疾患の一種）及び変形性関節炎（自己免疫疾患ではない）は互いに異なる疾患であるものの、共に関節炎を主な臨床症状とする疾患である点で共通している。従って、慢性関節リウマチに特異的な病態を理解する上で、変形性関節炎はその比較対象としてしばしば用いられている（例、Finis et al., 2006, Arthritis Rheum., 54, 1009-1019）。本発明者らは、慢性関節リウマチと変形性関節炎との間で特異的に発現が目覚しく亢進されている遺伝子を解析したところ、慢性関節リウマチでは変形性関節炎に比し１０３個の遺伝子の発現が亢進しているのに対し、変形性関節炎では慢性関節リウマチに比し発現が亢進している遺伝子が殆ど存在しないことを見出した。この結果は、慢性関節リウマチに特異的なこのような遺伝子の発現増強に起因する機能獲得（gain of function）が、慢性関節リウマチの発症又は病態に重要であることを示唆する。従って、これらの遺伝子の発現が増強されているか否かを評価することで、慢性関節リウマチの判定が可能である。また、変形性関節症を比較対象として用いたことにより単なる炎症（特に関節炎）関連遺伝子が排除でき、慢性関節リウマチについてより特異的な遺伝子の同定に成功したことから、本発明の方法は、より特異的な慢性関節リウマチの判定を可能とするというさらなる利点を有する。 Although rheumatoid arthritis (a type of autoimmune disease) and osteoarthritis (not an autoimmune disease) are different from each other, both are common in that arthritis is a major clinical symptom. Therefore, osteoarthritis is often used as a comparative object in understanding the pathology specific to rheumatoid arthritis (eg, Finis et al., 2006, Arthritis Rheum., 54, 1009-1019). The present inventors analyzed a gene whose expression is remarkably enhanced between rheumatoid arthritis and osteoarthritis. As a result, the expression of 103 genes in rheumatoid arthritis is higher than that in osteoarthritis. On the other hand, it was found that in osteoarthritis, there are almost no genes whose expression is increased compared to rheumatoid arthritis. This result suggests that gain of function due to the enhanced expression of such genes specific to rheumatoid arthritis is important for the development or pathology of rheumatoid arthritis. Therefore, it is possible to determine rheumatoid arthritis by evaluating whether the expression of these genes is enhanced. In addition, by using osteoarthritis as a comparison target, simple inflammation (especially arthritis) -related genes can be eliminated, and more specific genes for rheumatoid arthritis have been successfully identified. It has the further advantage of allowing the determination of specific rheumatoid arthritis.
本発明の判定方法（及び以下に記載される他の発明）では、１つの遺伝子のみならず、２以上（例、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上）の遺伝子を標的遺伝子として利用することができる。 In the determination method of the present invention (and other inventions described below), not only one gene but also two or more (eg, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10) genes are included. It can be used as a target gene.
特定の実施形態では、本発明の方法は、慢性関節リウマチと変形性関節症との間の識別方法として用いられる。 In certain embodiments, the methods of the present invention are used as a method for distinguishing between rheumatoid arthritis and osteoarthritis.
例えば、本発明の方法が慢性関節リウマチを変形性関節症から識別するために用いられる場合、変形性関節症に罹患した動物に比し、慢性関節リウマチに罹患した動物の生体試料で特異的に発現が亢進している遺伝子（以下、必要に応じて、（ｂ）の遺伝子と省略する）が標的遺伝子として利用され得る。このような遺伝子としては、例えば、ＡＲＥＧ、ＡＵＲＡ１、ＦＫＢＰ５、ＣＬＥＣＳＦ９、ＴＰＳＴ１、ＡＵＲＡ２、Ｇ０Ｓ２、ＣＸＣＲ４、ＮＦ−κＢ、ＡＵＲＡ１７が挙げられる。上記（ｂ）の遺伝子はまた、（ｂ１）変形性関節症に罹患した動物に比し、慢性関節リウマチに罹患した動物の骨髄液及び末梢血の双方で特異的に発現が亢進している遺伝子（例、ＡＲＥＧ、Ｇ０Ｓ２、ＣＸＣＲ４、ＮＦ−κＢ、ＡＵＲＡ１７）、並びに（ｂ２）変形性関節症に罹患した動物に比し、慢性関節リウマチに罹患した動物の骨髄液で特異的に発現が亢進しているが、末梢血で発現が亢進していない遺伝子（例、ＡＵＲＡ１、ＦＫＢＰ５、ＣＬＥＣＳＦ９、ＴＰＳＴ１、ＡＵＲＡ２）に分類することができる。 For example, when the method of the present invention is used to distinguish rheumatoid arthritis from osteoarthritis, it is specific to a biological sample of an animal suffering from rheumatoid arthritis as compared to an animal suffering from rheumatoid arthritis. A gene whose expression is enhanced (hereinafter, abbreviated as gene (b), if necessary) can be used as a target gene. Examples of such genes include AREG, AURA1, FKBP5, CLECSF9, TPST1, AURA2, G0S2, CXCR4, NF-κB, and AURA17. The gene of (b) above is also (b1) a gene whose expression is specifically enhanced in both bone marrow fluid and peripheral blood of an animal afflicted with rheumatoid arthritis, compared to an animal afflicted with osteoarthritis. (Eg, AREG, G0S2, CXCR4, NF-κB, AURA17) and (b2) expression is specifically increased in bone marrow fluid of animals suffering from rheumatoid arthritis, compared to animals suffering from osteoarthritis However, it can be classified into genes (eg, AURA1, FKBP5, CLECSF9, TPST1, AURA2) whose expression is not enhanced in peripheral blood.
本発明はまた、切断型ＡＲＥＧの量を測定し、慢性関節リウマチを発症しているか否かを評価することを含む、慢性関節リウマチの判定方法を提供する。 The present invention also provides a method for determining rheumatoid arthritis, comprising measuring the amount of truncated AREG and evaluating whether or not rheumatoid arthritis has developed.
切断型ＡＲＥＧの量の測定に供される生体試料は、上述したものと同様であり得るが、所定の処理に供された、ＡＲＥＧ発現細胞を含まない生体試料（例、無細胞試料）を使用してもよい。また、ウエスタンブロット等により、ＡＲＥＧの分子量を評価することで、切断型ＡＲＥＧの量を測定することもできる。さらに、プロテアーゼによるＡＲＥＧの切断により生じるＮ末端側ポリペプチド及び／又はＣ末端側ポリペプチドに対して特異的な抗体を利用することで、切断型ＡＲＥＧの量を測定することもできる。 The biological sample used for the measurement of the amount of cleaved AREG may be the same as described above, but a biological sample that does not contain AREG-expressing cells (eg, a cell-free sample) that has been subjected to a predetermined treatment is used. May be. In addition, the amount of cleaved AREG can also be measured by evaluating the molecular weight of AREG by Western blot or the like. Furthermore, the amount of cleaved AREG can also be measured by using an antibody specific for the N-terminal polypeptide and / or the C-terminal polypeptide generated by cleavage of AREG by a protease.
次いで、標的遺伝子の発現量の測定結果に基づき、動物が慢性関節リウマチを発症しているか否かが評価され得る。慢性関節リウマチを発症している動物の少なくとも一部と当該疾患を発症していない動物との間では切断型ＡＲＥＧの量に差異が認められ得ることから、慢性関節リウマチを発症している動物及び当該疾患を発症していない動物を識別し得るカットオフ値を適宜設定することで、このような評価が可能となる。 Then, based on the measurement result of the expression level of the target gene, it can be evaluated whether or not the animal has developed rheumatoid arthritis. Since there may be a difference in the amount of truncated AREG between at least some of the animals that develop rheumatoid arthritis and animals that do not develop the disease, animals that develop rheumatoid arthritis and Such an evaluation can be performed by appropriately setting a cut-off value that can identify an animal that does not develop the disease.
本発明はまた、慢性関節リウマチの診断用試薬、及び標的遺伝子の測定用手段のセットを提供する。 The present invention also provides a diagnostic reagent for rheumatoid arthritis and a set of means for measuring a target gene.
本発明の試薬は、１以上の標的遺伝子の測定用手段を含み得る。このような測定用手段としては、例えば、プライマー、核酸プローブ、抗体が挙げられる。本発明はまた、このような測定用手段自体をも提供する。本発明の試薬は、例えば、本発明の方法を簡便に行うことを可能にする。 The reagent of the present invention may comprise a means for measuring one or more target genes. Examples of such measuring means include primers, nucleic acid probes, and antibodies. The present invention also provides such a measuring means itself. The reagent of the present invention enables, for example, the method of the present invention to be easily performed.
本発明の試薬に含まれ得るプライマーは、標的遺伝子の増幅及び検出を可能とする限り特に限定されない。例えば、プライマーのサイズは、少なくとも約１２ｂｐ以上、好ましくは約１５〜１００ｂｐ、より好ましくは約１６〜５０ｂｐ、さらにより好ましくは約１８〜３５ｂｐであり得る。また、遺伝子増幅法の種類に応じて必要とされるプライマー数が異なるため、本発明の試薬に含まれ得るプライマー数は特に限定されないが、例えば、本発明の試薬は、２以上のプライマーを含み得る。２以上のプライマーは、予め混合されていても、混合されていなくてもよい。このようなプライマーは、自体公知の方法により作製できる。 Primers that can be included in the reagent of the present invention are not particularly limited as long as amplification and detection of a target gene are possible. For example, the size of the primer can be at least about 12 bp or more, preferably about 15-100 bp, more preferably about 16-50 bp, even more preferably about 18-35 bp. In addition, since the number of primers required differs depending on the type of gene amplification method, the number of primers that can be included in the reagent of the present invention is not particularly limited. For example, the reagent of the present invention includes two or more primers. obtain. Two or more primers may be mixed in advance or may not be mixed. Such a primer can be prepared by a method known per se.
本発明の試薬に含まれ得る核酸プローブは、標的遺伝子の転写産物の検出を可能とする限り特に限定されない。核酸プローブはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸又はそれらのキメラ分子などであり得るが、安定性、簡便性等を考慮するとＤＮＡが好ましい。核酸プローブはまた、１本鎖又は２本鎖のいずれでもよい。核酸プローブのサイズは、標的遺伝子の転写産物に特異的にハイブリダイズし得る限り特に限定されないが、例えば約１５又は１６ｂｐ以上、好ましくは約１５〜１０００ｂｐ、より好ましくは約５０〜５００ｂｐである。核酸プローブは、核酸アレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。このような核酸プローブは、自体公知の方法により作製できる。 The nucleic acid probe that can be contained in the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it enables detection of the transcription product of the target gene. The nucleic acid probe can be DNA, RNA, modified nucleic acid, or a chimeric molecule thereof, but DNA is preferable in consideration of stability, convenience and the like. Nucleic acid probes can also be either single stranded or double stranded. The size of the nucleic acid probe is not particularly limited as long as it can specifically hybridize to the transcription product of the target gene, but is, for example, about 15 or 16 bp or more, preferably about 15 to 1000 bp, more preferably about 50 to 500 bp. The nucleic acid probe may be provided in a form immobilized on a substrate like a nucleic acid array. Such a nucleic acid probe can be prepared by a method known per se.
本発明の試薬に含まれ得る抗体は、標的遺伝子の翻訳産物に特異的に結合し得る抗体である限り特に限定されない。例えば、翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体はまた、抗体のフラグメント（例、Fab、F(ab’)2）、組換え抗体（例、ｓｃＦｖ、）であってもよい。抗体は、プレート等の基板上に固定された形態で提供されてもよい。抗体は、自体公知の方法により作製できる。標的遺伝子がＡＲＥＧである場合、プロテアーゼによるＡＲＥＧの切断により生じるＮ末端側ポリペプチド又はＣ末端側ポリペプチドに対する抗体のいずれか、あるいはその双方を利用することができる。 The antibody that can be contained in the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it can specifically bind to the translation product of the target gene. For example, the antibody against the translation product may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. The antibody may also be a fragment of an antibody (eg, Fab, F (ab ′) 2 ), a recombinant antibody (eg, scFv). The antibody may be provided in a form immobilized on a substrate such as a plate. The antibody can be produced by a method known per se. When the target gene is AREG, either an N-terminal polypeptide or an antibody against the C-terminal polypeptide generated by cleavage of AREG by a protease, or both can be used.
例えば、ポリクローナル抗体は、標的遺伝子の翻訳産物あるいはその部分ペプチド（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリアタンパク質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例、完全又は不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。 For example, a polyclonal antibody has a translation product of a target gene or a partial peptide thereof (if necessary, a complex cross-linked to a carrier protein such as bovine serum albumin or KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)) as an antigen, Administration with a commercially available adjuvant (eg, complete or incomplete Freund's adjuvant) about 2 to 4 times every 2 to 3 weeks subcutaneously or intraperitoneally in an animal (the antibody titer of the partially collected serum is determined by a known antigen-antibody reaction) It can be obtained by measuring whole blood and collecting the whole blood about 3 to about 10 days after the final immunization and purifying the antiserum. Examples of animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, guinea pigs, and hamsters.
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん―基礎と臨床―」、第2-14頁、サイエンスフォーラム出版、1985年）により作製できる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［J. Immunol. Methods,81(2): 223-228 (1985)］でも電圧パルス法［Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡ又はＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、又はマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清及び動物の腹水から取得できる。 Monoclonal antibodies can be obtained by cell fusion methods (eg, Takeshi Watanabe, principles of cell fusion methods and preparation of monoclonal antibodies, Akira Taniuchi, Toshitada Takahashi, “Monoclonal Antibodies and Cancer: Basic and Clinical”, 2-14). Page, Science Forum Publishing, 1985). For example, the factor is administered to a mouse subcutaneously or intraperitoneally 2-4 times together with a commercially available adjuvant, and about 3 days after the final administration, the spleen or lymph node is collected and white blood cells are collected. The leukocytes and myeloma cells (eg, NS-1, P3X63Ag8, etc.) are fused to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the factor. The cell fusion may be PEG method [J. Immunol. Methods, 81 (2): 223-228 (1985)] or voltage pulse method [Hybridoma, 7 (6): 627-633 (1988)]. A hybridoma producing a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to an antigen from the culture supernatant using a well-known EIA or RIA method. The hybridoma producing the monoclonal antibody can be cultured in vitro or in vivo, such as mouse or rat, preferably mouse ascites, and the antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma and the ascites of the animal, respectively.
測定用手段は、必要に応じて、標識用物質で標識された形態で提供され得る。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。 The measuring means can be provided in a form labeled with a labeling substance, if necessary. Examples of the labeling substance include fluorescent substances such as FITC and FAM, luminescent substances such as luminol, luciferin, and lucigenin, radioisotopes such as 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, and 123 I, biotin, and streptavidin. And the like, and the like.
本発明の試薬は、測定用手段に加え、さらなる構成要素を含むキットの形態で提供されてもよい。この場合、キットに含まれる各構成要素は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器に格納された形態で提供され得る。例えば、測定用手段が標識用物質で標識されていない場合、このようなキットは、標識用物質をさらに含み得る。 The reagent of the present invention may be provided in the form of a kit containing additional components in addition to the measurement means. In this case, each component included in the kit may be provided in an isolated form, for example, stored in a different container. For example, if the measuring means is not labeled with a labeling substance, such a kit can further comprise a labeling substance.
より詳細には、本発明の試薬がキットの形態で提供される場合、測定用手段の種類に応じたさらなる構成要素を含み得る。例えば、測定用手段がプライマーである場合、キットは、逆転写酵素、核酸抽出液をさらに含み得る。測定用手段が核酸プローブである場合、キットは、核酸抽出液をさらに含んでいてもよい。測定用手段が抗体である場合、キットは、２次抗体（例、抗ＩｇＧ抗体）、２次抗体の検出用試薬をさらに含んでいてもよい。 More specifically, when the reagent of the present invention is provided in the form of a kit, it may contain additional components depending on the type of measuring means. For example, when the measurement means is a primer, the kit may further contain a reverse transcriptase and a nucleic acid extract. When the measurement means is a nucleic acid probe, the kit may further contain a nucleic acid extract. When the measurement means is an antibody, the kit may further contain a secondary antibody (eg, anti-IgG antibody) and a secondary antibody detection reagent.
また、本発明の試薬がキットの形態で提供される場合、動物から生体試料を採取し得る手段をさらに含み得る。動物から生体試料を採取し得る手段は、動物から生体サンプルを入手可能である限り特に限定されないが、例えば、採血器具、生検針等の生検器具が挙げられる。 In addition, when the reagent of the present invention is provided in the form of a kit, it may further include means for collecting a biological sample from an animal. The means for collecting the biological sample from the animal is not particularly limited as long as the biological sample can be obtained from the animal, and examples thereof include a blood sampling instrument and a biopsy instrument such as a biopsy needle.
本発明のセットは、２以上の標的遺伝子に対する２以上の測定用手段（例、プライマー、核酸プローブ、抗体）を含み得る。好ましくは、本発明のセットは、プライマーのセット、核酸アレイ（マイクロアレイと同義）、抗体アレイであり得る。 The set of the present invention may comprise two or more measuring means (eg, primers, nucleic acid probes, antibodies) for two or more target genes. Preferably, the set of the present invention may be a set of primers, a nucleic acid array (synonymous with microarray), an antibody array.
核酸アレイの支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、メンブレン（例えば、ナイロン膜）、ガラス、プラスチック、金属などが挙げられる。本発明における核酸アレイの形態としては、当該分野で周知の形態を用いることができ、例えば、支持体上で核酸が直接合成されるアレイ（いわゆるアフィメトリクス方式）、支持体上に核酸が固定化されるアレイ（いわゆるスタンフォード方式）、繊維型アレイ、電気化学的アレイ（ＥＣＡ）等が挙げられる（例、特開２００５−１０２６９４参照）。 The support for the nucleic acid array is not particularly limited as long as it is a support commonly used in the art, and examples thereof include membranes (for example, nylon membrane), glass, plastics, metals, and the like. As a form of the nucleic acid array in the present invention, a form well known in the art can be used. For example, an array in which nucleic acids are directly synthesized on a support (so-called affiliometric method), or a nucleic acid is immobilized on the support. Array (so-called Stanford method), fiber type array, electrochemical array (ECA) and the like (for example, see JP-A-2005-102694).
本発明の試薬及びセットに含まれ得る１以上の標的遺伝子（これらの遺伝子はまた、本発明の方法で用いられ得る）としては、例えば、以下１〜７が挙げられる：
１．上記（ａ）の１以上の遺伝子〔例、上記（ａ１）の１以上の遺伝子、上記（ａ２）の１以上の遺伝子〕；
２．上記（ａ１）の１以上の遺伝子及び上記（ａ２）の１以上の遺伝子の組合せ；
３．上記（ｂ）の１以上の遺伝子〔例、上記（ｂ１）の１以上の遺伝子、上記（ｂ２）の１以上の遺伝子）；
４．上記（ｂ１）の１以上の遺伝子及び上記（ｂ２）の１以上の遺伝子の組合せ；
５．発現において相関性を示す１以上の遺伝子（例、実施例参照）の組合せ；
６．測定用手段が抗体である場合、プロテアーゼによるＡＲＥＧの切断により生じるＮ末端側ポリペプチド又はＣ末端側ポリペプチドに対して特異的な抗体のいずれか、あるいはその双方；
７．上記１〜６の任意の組合せ。
One or more target genes that can be included in the reagents and sets of the present invention (these genes can also be used in the methods of the present invention) include, for example, 1-7 below:
1. One or more genes of (a) above (eg, one or more genes of (a1) above, one or more genes of (a2) above);
2. A combination of one or more genes of (a1) and one or more genes of (a2);
3. One or more genes of (b) above (eg, one or more genes of (b1) above, one or more genes of (b2) above);
4). A combination of one or more genes of (b1) and one or more genes of (b2);
5. A combination of one or more genes (eg, see Examples) that are correlated in expression;
6). When the measuring means is an antibody, either the N-terminal polypeptide or the antibody specific for the C-terminal polypeptide generated by cleavage of AREG by protease, or both;
7). Any combination of the above 1-6.
本発明の試薬及びセットは、コントロールとして、慢性関節リウマチに罹患した動物の生体試料で発現が亢進していない遺伝子の測定用手段をさらに含んでいてもよい。このような遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子、又は非ハウスキーピング遺伝子（例、ＯＡ１３、ＯＡ１４）であり得る。ハウスキーピング遺伝子としては、例えば、ＧＡＰＤＨ（グルセルアルデヒド−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ）、β-アクチン，β２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ１（ヒポキサンチン ホスホリボシルトランスフェラーゼ１）が挙げられる。 As a control, the reagent and set of the present invention may further comprise a means for measuring a gene whose expression is not enhanced in a biological sample of an animal suffering from rheumatoid arthritis. Such genes can be housekeeping genes or non-housekeeping genes (eg, OA13, OA14). Examples of housekeeping genes include GAPDH (Gluceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), β-actin, β2-microglobulin, and HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1).
本発明はまた、慢性関節リウマチの予防又は治療剤を提供する。 The present invention also provides a preventive or therapeutic agent for rheumatoid arthritis.
例えば、本発明の剤は、慢性関節リウマチの予防又は治療に用いられる場合、有効成分として、標的遺伝子の発現又は機能を阻害し得る物質を含み得る。このような阻害物質としては、例えば、標的遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸（細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉を誘導し得るポリヌクレオチド：例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、中和抗体（例えば、上述した抗体に加えて、ヒト化抗体又はヒト抗体も使用できる）及びそれらの発現ベクター、並びに低分子有機化合物が挙げられる。標的遺伝子としてＡＲＥＧについて述べれば、本発明者らは、ＲＡ患者においてＡＲＥＧの発現が顕著に亢進していること、並びにＲＡ患者由来の滑膜細胞がＡＲＥＧにより高い感受性を示し、ＥＲＡＤ系が活性化され得ることを見出している。従って、ＡＲＥＧ自体、又はＡＲＥＧにより駆動され得るＥＲＡＤ系の阻害により、ＲＡが予防又は治療され得ると考えられる。例えば、ＡＲＥＧ又はＥＲＡＤ系の機能を阻害し得る物質としては、ＡＲＥＧの標的であるＥＧＦＲに対する中和抗体（例、トラスツズマブ（ハーセプチンとしても知られる））が報告されている。また、ＡＲＥＧ切断プロテアーゼとしては、ＡＤＡＭ１７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００３１８３参照）が報告されているので、本発明では、ＡＤＡＭ１７の阻害剤（例、上述したアンチセンス等）もまたＲＡの予防又は治療に用いることができる。さらに、乾癬の原因物質としてＡＲＥＧが同定され、中和抗体を含む治療の試みが始まっているので、このようなものもまた、本発明において利用することができる（Chung et al., 2005, J Invest Dermatol. 124(6), 1134-40）。 For example, when used for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis, the agent of the present invention may contain a substance capable of inhibiting the expression or function of the target gene as an active ingredient. Examples of such inhibitors include antisense nucleic acids, ribozymes, RNAi-inducible nucleic acids (polynucleotides that can induce RNA interference when introduced into cells: eg, siRNA), dominant negative mutations Body, neutralizing antibodies (for example, in addition to the above-mentioned antibodies, humanized antibodies or human antibodies can also be used) and their expression vectors, and small organic compounds. Speaking of AREG as a target gene, the present inventors show that the expression of AREG is remarkably enhanced in RA patients, and that synovial cells derived from RA patients are highly sensitive to AREG, and the ERAD system is activated Finds that can be done. Therefore, it is believed that RA can be prevented or treated by inhibition of AREG itself or the ERAD system that can be driven by AREG. For example, as a substance capable of inhibiting the function of the AREG or ERAD system, a neutralizing antibody against EGFR that is a target of AREG (eg, trastuzumab (also known as Herceptin)) has been reported. Further, since ADAM17 (see GenBank accession number: NM_003183) has been reported as an AREG-cleaving protease, in the present invention, an ADAM17 inhibitor (eg, the above-mentioned antisense or the like) is also used for the prevention or treatment of RA. Can be used. Furthermore, since AREG has been identified as a causative agent of psoriasis and treatment attempts including neutralizing antibodies have begun, such can also be used in the present invention (Chung et al., 2005, J Invest Dermatol. 124 (6), 1134-40).
本発明の剤が有効成分として発現ベクターを含む場合、発現ベクターは、標的遺伝子の発現又は機能を阻害し得る物質をコードするポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。 When the agent of the present invention contains an expression vector as an active ingredient, the expression vector can contain a polynucleotide encoding a substance capable of inhibiting the expression or function of the target gene, and a promoter operably linked to the polynucleotide. .
本発明で用いられ得る発現ベクターが含み得るプロモーターは、その制御下にある因子の発現を可能とする限り特に限定されず、因子の種類により適宜選択され得るが、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター）、哺乳動物用プロモーター（例、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター）が挙げられる。 The promoter that can be included in the expression vector that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it allows the expression of the factor under its control, and can be appropriately selected depending on the type of factor. For example, a polIII promoter (eg, tRNA) Promoter, U6 promoter, H1 promoter), and promoters for mammals (eg, CMV promoter, CAG promoter, SV40 promoter).
本発明で用いられ得る発現ベクターはさらに、選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含んでいてもよい。 The expression vector that can be used in the present invention further contains a selection marker gene (a gene that confers resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, phosphinothricin, a gene that complements an auxotrophic mutation, etc.). Further, it may be included.
本発明で用いられ得る発現ベクターのバックボーン（backbone）としては、ヒト等の哺乳動物細胞中で、標的遺伝子の発現又は機能を阻害し得る物質を産生できるものであれば特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターが挙げられる。哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。 The backbone of the expression vector that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can produce a substance capable of inhibiting the expression or function of the target gene in mammalian cells such as humans. Examples include plasmid vectors and virus vectors. Suitable vectors for administration to mammals include viral vectors such as adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, poxvirus, poliovirus, Sindbis virus, Sendai virus and the like.
本発明の剤は、薬学的に許容される担体を含み得る。薬学的に許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。 The agent of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier. Examples of pharmaceutically acceptable carriers include sucrose, starch, mannitol, sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate and other excipients, cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, polypropyl Binding agents such as pyrrolidone, gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch, starch, carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, sodium-glycol starch, sodium bicarbonate, calcium phosphate, calcium citrate and other disintegrants, stearic acid Lubricants such as magnesium, aerosil, talc, sodium lauryl sulfate, fragrances such as citric acid, menthol, glycyllysine / ammonium salt, glycine, orange powder, sodium benzoate Preservatives such as lithium, sodium hydrogen sulfite, methyl paraben, propyl paraben, stabilizers such as citric acid, sodium citrate, acetic acid, suspensions such as methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, aluminum stearate, dispersants such as surfactants, Examples include, but are not limited to, water, physiological saline, diluents such as orange juice, base waxes such as cacao butter, polyethylene glycol, and white kerosene.
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。 Preparations suitable for oral administration include solutions in which an effective amount of a substance is dissolved in a diluent such as water or physiological saline, capsules, sachets or tablets containing an effective amount of the substance as solids or granules. Examples thereof include a suspension in which an effective amount of a substance is suspended in a suitable dispersion medium, and an emulsion in which a solution in which an effective amount of a substance is dissolved is dispersed in an appropriate dispersion medium and emulsified.
非経口的な投与（例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。 Formulations suitable for parenteral administration (eg, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, local injection, intraperitoneal administration, etc.) include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions. May contain antioxidants, buffers, antibacterial agents, tonicity agents and the like. Also, aqueous and non-aqueous sterile suspensions can be mentioned, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like. The preparation can be enclosed in a container in unit doses or multiple doses like ampoules and vials. Alternatively, the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in a state that may be dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle immediately before use.
本発明の剤の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約１０ｇ／ｋｇであり得るが、これらに限定されない。 The dose of the agent of the present invention varies depending on the type / activity of the active ingredient, the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administration target, body weight, age, etc. The amount of active ingredient may be about 0.001 to about 10 g / kg, but is not limited thereto.
本発明はまた、慢性関節リウマチの予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。 The present invention also provides a screening method for a prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis.
本発明のスクリーニング方法は、例えば、被験物が標的遺伝子の発現又は機能を調節（例、活性化又は阻害）し得るか否かを評価することを含み得る。 The screening methods of the invention can include, for example, assessing whether a test subject can modulate (eg, activate or inhibit) the expression or function of a target gene.
スクリーニング方法に供される被験物は、いかなる化合物又は組成物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、タンパク質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリ、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリ、天然成分（例、微生物、動植物、海洋生物等由来の成分）、あるいは食品、飲料水等が挙げられる。 The subject to be subjected to the screening method may be any compound or composition, such as a nucleic acid (eg, nucleoside, oligonucleotide, polynucleotide), carbohydrate (eg, monosaccharide, disaccharide, oligosaccharide, Polysaccharides), lipids (eg, saturated or unsaturated linear, branched and / or cyclic fatty acids), amino acids, proteins (eg, oligopeptides, polypeptides), small organic compounds, combinatorial chemistry techniques Examples include compound libraries prepared, random peptide libraries prepared by solid-phase synthesis and phage display methods, natural components (eg, components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, etc.), foods, drinking water, and the like.
本発明のスクリーニング方法は、被験物が標的遺伝子の発現又は機能を調節し得るか否かを評価可能である限り、如何なる形態でも行われ得る。例えば、本発明のスクリーニング方法では、細胞、動物又は再構成系を用いて、標的遺伝子の発現又は機能が評価され得る。 The screening method of the present invention can be carried out in any form as long as it can be evaluated whether or not the subject can regulate the expression or function of the target gene. For example, in the screening method of the present invention, the expression or function of a target gene can be evaluated using cells, animals or a reconstitution system.
より詳細には、細胞を用いて標的遺伝子の発現を評価するスクリーニング方法（方法論Ｉ）は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含み得る：
（ａ）被験物を標的遺伝子の発現を解析可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物を接触させた細胞における標的遺伝子の発現量を測定する工程；
（ｃ）該発現量を、被験物を接触させない対照細胞における標的遺伝子の発現量と比較する工程；
（ｄ）上記（ｃ）の比較結果に基づいて、標的遺伝子の発現量を調節する被験物を選択する工程。
More specifically, the screening method (methodology I) for evaluating the expression of a target gene using cells may include, for example, the following steps (a) to (d):
(A) contacting the test substance with a cell capable of analyzing the expression of the target gene;
(B) a step of measuring the expression level of the target gene in the cell contacted with the test substance;
(C) comparing the expression level with the expression level of the target gene in a control cell that is not brought into contact with the test substance;
(D) A step of selecting a test substance that regulates the expression level of the target gene based on the comparison result of (c) above.
方法論Ｉの工程（ａ）では、被験物が標的遺伝子の発現を解析可能な細胞と接触条件下におかれる。標的遺伝子の発現を解析可能な細胞に対する被験物の接触は、培地中で行われ得る。 In step (a) of methodology I, the test subject is placed in contact with cells capable of analyzing the expression of the target gene. Contact of a test subject with a cell capable of analyzing the expression of a target gene can be performed in a medium.
標的遺伝子の発現を解析可能な細胞とは、標的遺伝子の産物（例、転写産物、翻訳産物）の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。標的遺伝子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、標的遺伝子発現細胞であり得、一方、標的遺伝子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、標的遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。標的遺伝子の発現を解析可能な細胞は、上述した動物の細胞であり得る。 A cell capable of analyzing the expression of a target gene refers to a cell capable of directly or indirectly evaluating the expression level of a target gene product (eg, transcription product, translation product). A cell that can directly evaluate the expression level of the target gene product can be a target gene-expressing cell, whereas a cell that can indirectly evaluate the expression level of the target gene product can be a transcriptional regulatory region of the target gene. Cells that allow reporter assays for. The cell capable of analyzing the expression of the target gene may be an animal cell described above.
標的遺伝子発現細胞は、標的遺伝子を潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。また、標的遺伝子が上記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子である場合、単核細胞（例、骨髄単核細胞、末梢血単核細胞）を用いることも好ましい。より詳細には、このような単核細胞としては、例えば、単球、マクロファージ、顆粒球、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、赤血球、あるいはそれらの前駆細胞又は幹細胞（例、造血幹細胞）が挙げられる。さらに、標的遺伝子が上記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子である場合、慢性関節リウマチ患者由来の細胞を用いることも好ましい。 The target gene-expressing cell is not particularly limited as long as it potentially expresses the target gene. Such cells can be easily identified by those skilled in the art, and primary cultured cells, cell lines derived from the primary cultured cells, commercially available cell lines, cell lines available from cell banks, and the like can be used. In addition, when the target gene is the gene of (a) or (b), it is also preferable to use a mononuclear cell (eg, bone marrow mononuclear cell, peripheral blood mononuclear cell). More specifically, examples of such mononuclear cells include monocytes, macrophages, granulocytes, lymphocytes (eg, T cells, B cells, NK cells), erythrocytes, or progenitor cells or stem cells thereof (eg, , Hematopoietic stem cells). Furthermore, when the target gene is the gene (a) or (b), it is also preferable to use cells derived from rheumatoid arthritis patients.
標的遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、標的遺伝子の転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。標的遺伝子の転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。標的遺伝子の転写調節領域は、標的遺伝子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、各標的遺伝子の転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つこれらの標的遺伝子の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能なタンパク質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。 A cell that enables a reporter assay for a transcriptional regulatory region of a target gene is a cell that includes a transcriptional regulatory region of the target gene and a reporter gene operably linked to the region. The transcriptional regulatory region of the target gene, the reporter gene can be inserted into an expression vector. The transcriptional regulatory region of the target gene is not particularly limited as long as it is a region that can control the expression of the target gene. For example, the region from the transcription start point of each target gene to about 2 kbp upstream, or 1 in the base sequence of the region Examples include a region consisting of a base sequence in which the above bases are deleted, substituted or added, and having the ability to control the transcription of these target genes. The reporter gene may be any gene that encodes a detectable protein or an enzyme that produces a detectable substance. For example, a GFP (green fluorescent protein) gene, GUS (β-glucuronidase) gene, LUC (luciferase) gene, CAT (Chloramphenicol acetyltransferase) gene and the like.
標的遺伝子の転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、標的遺伝子の転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、標的遺伝子に対する生理的な転写調節因子を発現し、標的遺伝子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、標的遺伝子発現細胞が好ましい。 A cell into which a transcriptional regulatory region of a target gene and a reporter gene operably linked to the region are introduced can be analyzed quantitatively, as long as the transcriptional regulatory function of the target gene can be evaluated. As long as it is, it is not particularly limited. However, a target gene-expressing cell is preferable as the cell to be introduced because it expresses a physiological transcriptional regulatory factor for the target gene and is considered to be more suitable for evaluation of the expression regulation of the target gene.
被験物と標的遺伝子の発現を解析可能な細胞とが接触される培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。 The medium in which the test substance is brought into contact with the cells capable of analyzing the expression of the target gene is appropriately selected according to the type of cells used, but is, for example, a minimum essential containing about 5 to 20% fetal bovine serum. Medium (MEM), Dulbecco's modified minimal essential medium (DMEM), RPMI 1640 medium, 199 medium, and the like. The culture conditions are also appropriately determined according to the type of cells used, etc. For example, the pH of the medium is about 6 to about 8, the culture temperature is usually about 30 to about 40 ° C., and the culture time is About 12 to about 72 hours.
方法論Ｉの工程（ｂ）では、被験物を接触させた細胞における標的遺伝子の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、上述した自体公知の方法により行われ得る。また、標的遺伝子の発現を解析可能な細胞として、標的遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。 In step (b) of methodology I, the expression level of the target gene in the cell contacted with the test substance is measured. The measurement of the expression level can be performed by a method known per se described above in consideration of the type of cells used. When a cell capable of analyzing a target gene transcription regulatory region is used as a cell capable of analyzing the expression of the target gene, the expression level can be measured based on the signal intensity of the reporter.
方法論Ｉの工程（ｃ）では、被験物を接触させた細胞における標的遺伝子の発現量が、被験物を接触させない対照細胞における標的遺伝子の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物を接触させない対照細胞における標的遺伝子の発現量は、被験物を接触させた細胞における標的遺伝子の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。 In step (c) of methodology I, the expression level of the target gene in the cell contacted with the test object is compared with the expression level of the target gene in the control cell not contacted with the test object. The comparison of expression levels is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference. The expression level of the target gene in the control cells not contacted with the test object is the expression level measured at the same time, even if the expression level is measured in advance, compared to the measurement of the target gene expression level in the cells contacted with the test object. Although it may be present, it is preferably the expression level measured simultaneously from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.
方法論Ｉの工程（ｄ）では、標的遺伝子の発現量を調節する被験物が選択される。例えば、標的遺伝子の発現量を増加させる（発現を促進する）、又は標的遺伝子の発現量を減少させる（発現を抑制する）被験物は、例えば、上述した慢性関節リウマチの予防又は治療に有用である。 In step (d) of methodology I, a test substance that regulates the expression level of the target gene is selected. For example, a test subject that increases the expression level of the target gene (promotes the expression) or decreases the expression level of the target gene (suppresses the expression) is useful for, for example, prevention or treatment of the above-mentioned rheumatoid arthritis. is there.
また、標的遺伝子の機能を解析可能な細胞を用いて標的遺伝子の機能を評価するスクリーニング方法（方法論ＩＩ）は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含み得る：
（ａ）被験物を標的遺伝子の機能を解析可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物を接触させた細胞における標的遺伝子の機能を測定する工程；
（ｃ）該機能を、被験物を接触させない対照細胞における標的遺伝子の機能と比較する工程；
（ｄ）上記（ｃ）の比較結果に基づいて、標的遺伝子の機能を調節する被験物を選択する工程。
Moreover, the screening method (methodology II) which evaluates the function of a target gene using the cell which can analyze the function of a target gene may include the following process (a)-(d), for example:
(A) contacting the test substance with a cell capable of analyzing the function of the target gene;
(B) measuring the function of the target gene in the cell contacted with the test substance;
(C) comparing the function with the function of the target gene in a control cell that is not contacted with the test substance;
(D) A step of selecting a test substance that regulates the function of the target gene based on the comparison result of (c) above.
方法論ＩＩの工程（ａ）では、被験物が標的遺伝子の機能を解析可能な細胞と接触条件下におかれる。標的遺伝子の機能を解析可能な細胞に対する被験物の接触は、培地中で行われ得る。培地は、方法論Ｉのものと同様であり得る。 In step (a) of methodology II, the test subject is placed in contact with cells capable of analyzing the function of the target gene. Contact of the test subject with a cell capable of analyzing the function of the target gene can be performed in a medium. The medium can be similar to that of Methodology I.
標的遺伝子の機能を解析可能な細胞は、標的遺伝子が分泌タンパク質の遺伝子である場合には、当該分泌タンパク質が作用し得る細胞又は当該分泌タンパク質で処理された細胞であり得る。従って、この場合、本発明のスクリーニング方法は、標的遺伝子の機能を解析可能な細胞を分泌タンパク質で処理することを含んでいてもよい。一方、標的遺伝子が非分泌タンパク質の遺伝子である場合には、標的遺伝子の機能を解析可能な細胞は、標的遺伝子の発現細胞と同様であり得る。標的遺伝子の機能を解析可能な細胞はまた、その機能解析に際して検出感度等を高める目的のため、所定のシグナル伝達経路に関与する因子の発現が増強された細胞（例、シグナル伝達経路に関与する因子の発現ベクターが導入された形質転換体）であってもよい。 When the target gene is a gene for a secreted protein, the cell capable of analyzing the function of the target gene can be a cell on which the secreted protein can act or a cell treated with the secreted protein. Therefore, in this case, the screening method of the present invention may comprise treating a cell capable of analyzing the function of the target gene with a secreted protein. On the other hand, when the target gene is a gene of a non-secretory protein, the cell capable of analyzing the function of the target gene can be the same as the cell expressing the target gene. A cell capable of analyzing the function of a target gene is also a cell in which expression of a factor involved in a predetermined signal transduction pathway is enhanced (eg, involved in a signal transduction pathway) for the purpose of enhancing detection sensitivity and the like during the functional analysis. A transformant into which an expression vector for the factor has been introduced).
例えば、標的遺伝子がＡＲＥＧである場合には、ＡＲＥＧの機能を解析可能な細胞は、滑膜細胞であり得る。滑膜細胞としては、初代培養細胞、細胞株などを使用できる。滑膜細胞はまた、慢性関節リウマチ患者由来の細胞であり得る。滑膜細胞はさらに、ＡＲＥＧで処理された滑膜細胞であってもよい。滑膜細胞はまた、所定のシグナル伝達経路に関与する因子の発現ベクターが導入された形質転換体であってもよい。このような因子としては、例えば、ＥＧＦＲ（例、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２）、ＥＲＫ１／２、ＧＲＰ９４が挙げられる。本発明はまた、標的遺伝子の機能を解析可能なこのような細胞を提供する。 For example, when the target gene is AREG, the cell capable of analyzing the function of AREG can be a synovial cell. As synovial cells, primary cultured cells, cell lines and the like can be used. Synovial cells can also be cells from patients with rheumatoid arthritis. The synoviocytes may further be synoviocytes treated with AREG. The synovial cell may also be a transformant into which an expression vector for a factor involved in a predetermined signal transduction pathway has been introduced. Examples of such factors include EGFR (eg, EGFR1, EGFR2), ERK1 / 2, and GRP94. The present invention also provides such a cell capable of analyzing the function of the target gene.
方法論ＩＩの工程（ｂ）では、被験物を接触させた細胞における標的遺伝子の機能が測定される。機能の測定は、細胞内シグナリングの活性化又は阻害の程度、細胞の表現型又は性質（例、増殖能）の変化等に基づき、自体公知の方法により行われ得る。例えば、標的遺伝子がＡＲＥＧである場合には、ＥＧＦＲシグナリング又はＥＲＡＤ系の活性化の阻害（例、リン酸化ＥＲＫ１／２の減少、ＧＲＰ９４又はシノビオリンの発現抑制）、滑膜細胞の増殖の抑制が好ましい指標である。 In step (b) of methodology II, the function of the target gene in the cell contacted with the test substance is measured. The measurement of the function can be performed by a method known per se, based on the degree of activation or inhibition of intracellular signaling, changes in cell phenotype or properties (eg, proliferation ability), and the like. For example, when the target gene is AREG, inhibition of EGFR signaling or activation of the ERAD system (eg, reduction of phosphorylated ERK1 / 2, suppression of GRP94 or synoviolin expression), suppression of synovial cell proliferation is preferable It is an indicator.
方法論ＩＩの工程（ｃ）では、被験物を接触させた細胞における標的遺伝子の機能が、被験物を接触させない対照細胞における標的遺伝子の機能と比較される。機能の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物を接触させない対照細胞における標的遺伝子の機能は、被験物を接触させた細胞における標的遺伝子の機能の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものであることが好ましい。 In step (c) of methodology II, the function of the target gene in cells contacted with the test object is compared with the function of the target gene in control cells not contacted with the test object. The comparison of functions is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference. The function of the target gene in the control cell not contacted with the test substance may be measured in advance or simultaneously with respect to the measurement of the function of the target gene in the cell contacted with the test object. However, it is preferable that they are measured simultaneously from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.
方法論ＩＩの工程（ｄ）では、標的遺伝子の機能を調節する被験物が選択される。例えば、標的遺伝子の機能を促進又は阻害する被験物は、例えば、上述した疾患の予防又は治療に有用である。 In step (d) of methodology II, a test substance that modulates the function of the target gene is selected. For example, a test substance that promotes or inhibits the function of a target gene is useful for, for example, prevention or treatment of the above-mentioned diseases.
動物を用いる本発明のスクリーニング方法（方法論ＩＩＩ）は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含み得る：
（ａ）被験物を動物に投与する工程；
（ｂ）被験物を投与した動物における標的遺伝子の発現又は機能を測定する工程；
（ｃ）該発現又は機能を被験物を投与しない対照動物における標的遺伝子の発現又は機能と比較する工程；
（ｄ）上記（ｃ）の比較結果に基づいて、標的遺伝子の発現量又は機能レベルを調節する被験物を選択する工程。
なお、本方法論は、（ｂ）〜（ｄ）の工程のみを必須とすることもできる。
The screening method (methodology III) of the present invention using an animal can include, for example, the following steps (a) to (d):
(A) administering a test article to an animal;
(B) measuring the expression or function of the target gene in the animal to which the test substance has been administered;
(C) comparing the expression or function with the expression or function of the target gene in a control animal not administered with the test;
(D) A step of selecting a test substance that regulates the expression level or functional level of the target gene based on the comparison result of (c) above.
In addition, this methodology can also make only the process of (b)-(d) essential.
方法論ＩＩＩの工程（ａ）では、動物として、例えば、上述の動物が使用される。動物としてはまた、慢性関節リウマチのモデル動物が使用され得る。被験物の動物への投与は自体公知の方法により行われ得る。動物はまた、標的遺伝子（例、ＡＲＥＧ）の発現ベクター又はタンパク質が投与された動物であり得る。 In step (a) of methodology III, for example, the above-mentioned animals are used as animals. As animals, model animals of rheumatoid arthritis can also be used. The test substance can be administered to the animal by a method known per se. The animal can also be an animal to which a target gene (eg, AREG) expression vector or protein has been administered.
方法論ＩＩＩの工程（ｂ）では、標的遺伝子の発現又は機能の測定は、自体公知の方法（又は上述の方法）により測定され得る。また、本工程（ｃ）及び（ｄ）は、方法論Ｉ又はＩＩの対応工程と同様に測定され得る。 In step (b) of methodology III, the expression or function of the target gene can be measured by a method known per se (or the method described above). Moreover, this process (c) and (d) can be measured similarly to the corresponding process of Methodology I or II.
また、標的遺伝子がＡＲＥＧである場合、被験物がＡＲＥＧの機能を阻害し得るか否かの評価は、被験物がＡＲＥＧ切断プロテアーゼの機能を阻害し得るか否かの評価により行うこともできる（方法論ＩＶ）。被験物がＡＲＥＧ切断プロテアーゼの機能を阻害し得るか否かは、細胞、動物又は再構成系を用いて評価することができる。例えば、このようなスクリーニング方法は、細胞を用いる場合、被験物がＡＲＥＧ発現細胞（例、マクロファージ）の表面上に発現しているＡＲＥＧの切断を低減し得る否かを評価することにより行うことができる。また、このようなスクリーニング方法は、動物を用いる場合、被験物が生体液（例、血液）又はその処理試料（例、無細胞試料）中におけるＡＲＥＧの量を低減し得るか否かを評価することにより行われ得る。さらには、ＡＲＥＧ切断プロテアーゼの機能を測定可能な再構成系（例、当該プロテアーゼ及びその基質（例、ＡＲＥＧタンパク質又はその部分ペプチド）、並びに被験物質を含む非細胞系）を用いて、本発明のスクリーニングを行うこともできる。ＡＲＥＧ切断プロテアーゼの機能を阻害し得る物質は、慢性関節リウマチの予防又は治療に有用であり得る。 When the target gene is AREG, the evaluation of whether or not the test substance can inhibit the function of AREG can also be performed by the evaluation of whether or not the test substance can inhibit the function of AREG-cleaving protease ( Methodology IV). Whether a test substance can inhibit the function of AREG cleaving protease can be evaluated using a cell, an animal, or a reconstitution system. For example, in the case of using cells, such a screening method can be performed by evaluating whether or not a test substance can reduce the cleavage of AREG expressed on the surface of AREG-expressing cells (eg, macrophages). it can. In addition, in the case of using an animal, such a screening method evaluates whether or not the test substance can reduce the amount of AREG in a biological fluid (eg, blood) or a treated sample (eg, a cell-free sample). Can be done. Furthermore, using a reconstitution system capable of measuring the function of an AREG-cleaving protease (eg, the protease and its substrate (eg, AREG protein or a partial peptide thereof) and a non-cellular system containing a test substance) Screening can also be performed. A substance capable of inhibiting the function of the AREG cleaving protease may be useful for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis.
本明細書中で用いられる略語は、以下の通りである。
ＡＵＲＡ：augmented Rheumatoid Arthritis
ＡＲＥＧ：アンフィレギュリン
ＢＭＭＣ：骨髄由来単核細胞
ＣＬＥＣＳＦ９：Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバー９
ＣＸＣＲ４：ケモカインレセプター４
ＥＧＦＲ：上皮増殖因子レセプター
ＤＣ−ＳＩＧＮ：ＤＣ特異的細胞間接着分子３−grabbing非インテグリン
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定法
ＥＲＡＤ：小胞体（ＥＲ）−関連分解
ＥＲＫ：細胞外シグナル調節キナーゼ
ＦＫＢＰ５：ＦＫ５０６結合タンパク質５
Ｇ０Ｓ２：リンパ球Ｇ０／Ｇ１スイッチ遺伝子
ＩＮＣＬ：小児性神経性セロイドリポフスチン症
ＩＴＰ：特発性血小板減少性紫斑病
ＬＲＲ：ロイシンリッチリピート
Ｍｉｒｏ：ミトコンドリアＲｈｏ
ＭＴＣ：複数（multiple）組織ｃＤＮＡ
ＮＦ−κＢ：核因子−κＢ
ＯＡ：変形性関節症
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞
ＰＰＴ１：パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ
ＰＶＮＳ：色素性絨毛結節性滑膜炎
ＰＹＫ：プロテインチロシンキナーゼ
ＲＡ：慢性関節リウマチ
ＲＡＮＫ：ＮＦ−κＢのレセプターアクチベータ
ＲＴ−ＰＣＲ：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤＦ−１：間質細胞由来因子−１
ＳＥ：標準誤差
ＳＬＥ：全身性エリテマトーデス
ＴＰＳＴ１：チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ１
Abbreviations used in this specification are as follows.
AURA: augmented Rheumatoid Arthritis
AREG: Amphiregulin BMMC: Bone marrow-derived mononuclear cell CLECSF9: C-type lectin superfamily member 9
CXCR4: Chemokine receptor 4
EGFR: epidermal growth factor receptor DC-SIGN: DC specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing non-integrin ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay ERAD: endoplasmic reticulum (ER) -related degradation ERK: extracellular signal-regulated kinase FKBP5: FK506 Binding protein 5
G0S2: Lymphocyte G0 / G1 switch gene INCL: Pediatric neuronal ceroid lipofuscinosis ITP: Idiopathic thrombocytopenic purpura LRR: Leucine rich repeat Miro: Mitochondrial Rho
MTC: multiple tissue cDNA
NF-κB: Nuclear factor-κB
OA: Osteoarthritis PBMC: Peripheral blood mononuclear cell PPT1: Palmitoyl protein thioesterase PVNS: Pigmented chorionic nodular synovitis PYK: Protein tyrosine kinase RA: Rheumatoid arthritis RANK: NF-κB receptor activator RT-PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction SDF-1: Stromal cell-derived factor-1
SE: standard error SLE: systemic lupus erythematosus TPST1: tyrosyl protein sulfotransferase 1
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。 The contents of all publications, including patents and patent application specifications cited in this specification, are hereby incorporated by reference herein to the same extent as if all were explicitly stated. Is.
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
（患者、材料及び方法）
１）ヒト被験体及び倫理的綱領
全てのＲＡ患者は、米国リウマチ学会（American College of Rheumatology：ＡＣＲ）の１９８７年改定の診断基準（Arnett, F.C.ら, 1988, Arthritis Rheum., 31, 315-324）を満たした。全てのＯＡ患者は、臀部又は膝ＯＡについてのＡＣＲ基準（Altman, R.D. 1991, J. Rheumatol Suppl, 10-12）を満たした。ＲＡ及びＯＡ患者群は、それらの平均年齢及び性別の点で大体一致した。本研究は、阪大微生物病研究所の倫理審査委員会により検討・認可された。従って、書面のインフォームド・コンセントを、ヒト組織の採取前に各参加者から得た。
(Patients, materials and methods)
1) Human subjects and ethical codes All RA patients are diagnosed by the American College of Rheumatology (ACR) revised 1987 criteria (Arnett, FC et al., 1988, Arthritis Rheum., 31, 315-324). ) All OA patients met ACR criteria (Altman, RD 1991, J. Rheumatol Suppl, 10-12) for hip or knee OA. The RA and OA patient groups were largely consistent in terms of their mean age and gender. This study was reviewed and approved by the Ethics Review Committee of the Osaka University Research Institute for Microbial Diseases. Therefore, written informed consent was obtained from each participant prior to collection of human tissue.
２）ＲＮＡの調製
ＲＡ及びＯＡ患者から得られたＢＭＭＣ及びＰＭＢＣのＲＮＡを、以前（Ishii, T.ら, 2006, DNA Res., 112, 1-11）に記載されるように調製した。簡潔には、ヘパリン処理した骨髄液（１０ｍＬ）又は静脈血（１０ｍＬ）を等容量の２％デキストラン／生理食塩水溶液と混合し、室温で３０分間インキュベートして、赤血球を沈殿させた。次いで、上清中のＢＭＭＣ又はＰＢＭＣを、Ｐｅｒｃｏｌｌ上での密度勾配遠心分離（密度＝１．０６４ｇ/ｍＬ）により精製した。総ＲＮＡを、グアニジン−チオシアネート溶液を加えることによりＢＭＭＣ又はＰＭＢＣペレットから抽出し、サンプルをｃＤＮＡライブラリ調製及びサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション、又は核酸アレイ、ノザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱＲＴ−ＰＣＲ解析のための酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出に用いた。ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを、ＴａＫａＲａ Ｃｏ．Ｌｔｄ．（日本国，大津市）から購入した。
2) Preparation of RNA BMMC and PMBC RNA obtained from RA and OA patients were prepared as previously described (Ishii, T. et al., 2006, DNA Res., 112, 1-11). Briefly, heparinized bone marrow fluid (10 mL) or venous blood (10 mL) was mixed with an equal volume of 2% dextran / saline solution and incubated at room temperature for 30 minutes to precipitate red blood cells. The BMMC or PBMC in the supernatant was then purified by density gradient centrifugation on Percoll (density = 1.004 g / mL). Total RNA is extracted from BMMC or PMBC pellets by adding guanidine-thiocyanate solution and samples are acidized for cDNA library preparation and subtractive hybridization, or nucleic acid arrays, Northern blots, RT-PCR and QRT-PCR analysis Used for guanidinium-phenol-chloroform extraction. ExTaq DNA polymerase was purchased from TaKaRa Co. Ltd .. (Otsu City, Japan).
３）ｃＤＮＡライブラリの調製及びステップワイズ・サブトラクション
９８０万又は９６０万の独立したクローンを有するＲＡ及びＯＡのＢＭＭＣ ｃＤＮＡライブラリをそれぞれ、以前（Kobori, M.ら, 1998, Genes Cells, 3, 459-475）に記載されるように、ｐＡＰ３ｎｅｏベクターを用いたリンカー−プライマー法により、ＲＡ又はＯＡ患者のプールしたＢＭＭＣ ｍＲＮＡから構築した。我々はまた、フォトビオチンで同じｍＲＮＡをビオチン化して、相反（reciprocal）ｃＤＮＡサブトラクション（Kobori, M.ら, 1998, Genes Cells, 3, 459-475）を行った。ステップワイズ・サブトラクション（即ち、ＲＡからＯＡをマイナスするか、又はＯＡからＲＡをマイナスする）を、以前（Fujii, T.ら, 2002, EMBO Rep., 3, 367-372）に記載されるように行った。簡潔には、ｆ１ヘルパーファージでのトランスフェクションによりｃＤＮＡライブラリを一本鎖形態に変換した後、我々は、それをビオチン化ｍＲＮＡとハイブリダイズさせ、それをビオチン−アビジン相互作用によりサブトラクトした。ハイブリダイズしなかったクローンを二本鎖形態に変換した後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換して、サブトラクトされたｃＤＮＡライブラリを生成した。このサブトラクトされたｃＤＮＡライブラリの品質を解析するため、我々は、無作為に選んだ数百のｃＤＮＡクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、番号付けした。次いで、各プラスミドＤＮＡのアリコートを、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、１％アガロースゲル上でそれらのｃＤＮＡインサートを精製し、それらをビオチン標識して、ノザン解析のためのプローブとして用いて、ＡＵＲＡクローンを同定した。各ノザンシートは、ＲＡ及びＯＡのＢＭＭＣから抽出したＲＮＡについての２つのレーンのみを含んだ。Gene Images Random/Prime Labelling and Detection System（GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ）を用いて、プローブの標識及び検出を行った。従って、ハイブリダイズしていない殆ど全てのｃＤＮＡの選択を我々が完了するまでこれらの操作を繰り返すことにより、ステップワイズ・サブトラクションを継続した。候補ＡＵＲＡ遺伝子のＤＮＡ配列を、ジデオキシ鎖停止反応によりｃＤＮＡインサートの５’端から決定して、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いてＥＳＴデータベースを検索するために用いた。得られた候補ＲＡ又はＯＡアップレギュレート遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて、我々は、ＲＴ−ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、これらの候補遺伝子のアップレギュレーションを試験及び／又は確認した。
3) Preparation of cDNA library and stepwise subtraction RA and OA BMMC cDNA libraries with 9.8 million or 9.6 million independent clones were previously described (Kobori, M. et al., 1998, Genes Cells, 3, 459-475, respectively). ) From pooled BMMC mRNA of RA or OA patients by the linker-primer method using the pAP3neo vector. We also biotinylated the same mRNA with photobiotin and performed reciprocal cDNA subtraction (Kobori, M. et al., 1998, Genes Cells, 3, 459-475). Stepwise subtraction (ie, minus OA from RA or minus RA from OA) as previously described (Fujii, T. et al., 2002, EMBO Rep., 3, 367-372) Went to. Briefly, after converting a cDNA library to single stranded form by transfection with f1 helper phage, we hybridized it with biotinylated mRNA and subtracted it by biotin-avidin interaction. After converting the non-hybridized clones to double-stranded form, E. coli cells were transformed to generate a subtracted cDNA library. To analyze the quality of this subtracted cDNA library, we prepared and numbered plasmid DNA from hundreds of randomly selected cDNA clones. An aliquot of each plasmid DNA was then digested with EcoRI and NotI, their cDNA inserts were purified on a 1% agarose gel, they were biotinylated and used as probes for Northern analysis, and AURA clones were Identified. Each Northern sheet contained only two lanes for RNA extracted from RA and OA BMMC. Probe labeling and detection were performed using the Gene Images Random / Prime Labeling and Detection System (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ). Therefore, stepwise subtraction was continued by repeating these operations until we completed selection of almost all unhybridized cDNA. The DNA sequence of the candidate AURA gene is determined from the 5 ′ end of the cDNA insert by dideoxy chain termination reaction, and an EST database is created using the BLAST algorithm (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Used to search. Based on the DNA sequences of the candidate RA or OA upregulated genes obtained, we designed oligonucleotide primers for RT-PCR and tested and / or confirmed the upregulation of these candidate genes.
４）ＤＮＡ核酸アレイ解析
ＲＮＡサンプルの品質を、Agilent 2100 Bioanalyzer（G2940BA; Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA）上でRNA 6000 Nano LabChip Kit（p/n 5065-4476）を用いることにより調べた。５０人のＲＡ患者又は５０人のＯＡ患者のＢＭＭＣ由来の総ＲＮＡ（５００ｎｇ）をプールし、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むオリゴ−ｄＴプライマーを用いて逆転写し、次いで、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写にｃＤＮＡを供して、ｃＤＮＡをＣｙ３又はＣｙ５（CyDye, Amercham Phamacia Biotech, Piscataway, NJ）で標識した。次いで、ＲＡ患者からのＣｙ標識ｃＲＮＡ（１μｇ）を、ＯＡ患者からプールした等量のｃＲＮＡからの同量の反対色のＣｙ標識産物と混合した。全てのヒトｃＤＮＡ核酸アレイ（Ｈｕ４４Ｋ）に対するハイブリダイゼーション、リンス、スキャン及び遺伝子解析は、製造業者のプロトコルに従って行った。Fluorophoreリバーサル（ダイスワップ）二連物を、二色ＤＮＡ核酸アレイ実験で用いた。最高レベルのアップ又はダウンレギュレーションを示した７０個の遺伝子を選び、ＲＡ又はＯＡ患者の骨髄ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ解析に供した。これらのうち、２０個をＡＵＲＡ遺伝子として同定した（図１参照）。
4) DNA Nucleic Acid Array Analysis The quality of RNA samples was examined by using RNA 6000 Nano LabChip Kit (p / n 5065-4476) on Agilent 2100 Bioanalyzer (G2940BA; Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA). . Total RNA (500 ng) from BMMC of 50 RA patients or 50 OA patients was pooled and reverse transcribed with an oligo-dT primer containing a T7 RNA polymerase promoter sequence, then in vitro with T7 RNA polymerase The cDNA was subjected to transcription, and the cDNA was labeled with Cy3 or Cy5 (CyDye, Amercham Phamacia Biotech, Piscataway, NJ). Cy-labeled cRNA (1 μg) from RA patients was then mixed with the same amount of oppositely colored Cy-labeled product from an equal amount of cRNA pooled from OA patients. Hybridization, rinsing, scanning and gene analysis for all human cDNA nucleic acid arrays (Hu44K) were performed according to the manufacturer's protocol. Fluorophore reversal (die swap) duplexes were used in two-color DNA nucleic acid array experiments. Seventy genes showing the highest level of up- or down-regulation were selected and subjected to RT-PCR analysis using bone marrow RNA from RA or OA patients. Of these, 20 were identified as AURA genes (see FIG. 1).
５）定量的リアルタイムＰＣＲ
製造業者の使用説明書に従って、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）並びにアッセイ・オン・デマンドＴａｑＭａｎプローブ及び関連プライマーを用いることにより、ＱＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ（ＡＢＩ）を用いることにより、酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出により得られた総ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写した。製造業者の使用説明書（ＴａＫａＲａ）に従って、２×Ｍａｓｔｅｒ ＭＩＸを用いて、５０μＬ反応におけるＰＣＲのための鋳型としてｃＤＮＡを用いた。ＰＣＲは、最初の変性（９５℃，１０分）、続いて４０サイクルの変性（９５℃，１５ｓ）及びアニーリング／伸長（６０℃，１分）からなるものであった。各サンプルを４連でアッセイし、中央閾値サイクル（ｍｅｄｉａｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ：ＣＴ）値を用いて、処理サンプルとコントロールサンプルとの間のフォールド変化（ＦＣ）を算出した。各プライマーについての増幅データからの標準曲線は、ＢＭＭＣ又はＰＢＭＣ由来の総ＲＮＡの希釈系列を鋳型として用いることにより作成した。フォールド変化値は、製造業者のプロトコルに従って標準曲線法を用いることにより、ＧＡＰＤＨレベルに対してノーマライズした。大部分のＱＲＴ−ＰＣＲについて、５０人のＯＡ患者のうち数人のみから無作為に選択したサンプルを試験した。幾つかのＱＲＴ−ＰＣＲについて、４４人のＲＡ患者及び６人のＯＡ患者から得られたＰＢＭＣ由来のＲＮＡを用いた（本明細書及び図面中、それぞれＲＡｐ又はＯＡｐと示す）。
5) Quantitative real-time PCR
QRT-PCR was performed by using ABI PRISM 7900 (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) And assay-on-demand TaqMan probes and related primers according to the manufacturer's instructions. By using High Capacity cDNA Archive Kit (ABI), total RNA (500 ng) obtained by acid guanidinium-phenol-chloroform extraction was reverse-transcribed. The cDNA was used as a template for PCR in a 50 μL reaction using 2 × Master MIX according to the manufacturer's instructions (TaKaRa). PCR consisted of initial denaturation (95 ° C., 10 min) followed by 40 cycles of denaturation (95 ° C., 15 s) and annealing / extension (60 ° C., 1 min). Each sample was assayed in quadruplicate and the median threshold cycle (C T ) value was used to calculate the fold change (FC) between the treated and control samples. A standard curve from the amplification data for each primer was generated by using a dilution series of total RNA derived from BMMC or PBMC as a template. Fold change values were normalized to GAPDH levels by using the standard curve method according to the manufacturer's protocol. For most QRT-PCR, randomly selected samples from only a few of the 50 OA patients were tested. For some QRT-PCRs, RNA from PBMC obtained from 44 RA patients and 6 OA patients was used (indicated herein as RAp or OAp, respectively).
６）繊維芽細胞様滑膜細胞の単離
滑膜組織は、インフォームド・コンセントにより、関節再建手術を受けている５人のＲＡ患者及び３人のＯＡ患者から手術中に採取した。凍結した滑膜組織を解離させ、その後ただちに１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有する氷冷ＤＭＥＭ中に使用するまで浸しておいた。組織を３−５ｍｍ片に細かくミンスし、５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブに置き、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（ＧＩＢＣＯ，１７０１８−０２９）及び１ユニット／ｍＬディスパーゼ（ＧＩＢＣＯ，１７１０５−０４１）を含有するＤＭＥＭ中で２０分毎にチューブを逆さにすることにより、３７℃で２時間インキュベートした。ろ過により小片を除いた後、室温にて２００×ｇで遠心分離することにより細胞を回収し、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中に懸濁し、直径１００ｍｍの培養皿中に播種した。非接着細胞及び残存する小片を、１−２日毎に培地交換することにより除いた。細胞を単離１週間後に継代し、さらに１週間培養し、次いでストックした。本研究で用いた滑膜細胞は、３回継代したものであった。
6) Isolation of fibroblast-like synoviocytes Synovial tissue was collected during surgery from 5 RA patients and 3 OA patients undergoing joint reconstruction surgery with informed consent. Frozen synovial tissue was dissociated and immediately immersed in ice-cold DMEM containing 100 U / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin until use. The tissue is minced into 3-5 mm pieces and placed in a 50 mL Falcon tube every 20 minutes in DMEM containing 1 mg / mL collagenase (GIBCO, 17018-029) and 1 unit / mL dispase (GIBCO, 17105-041). Incubated for 2 hours at 37 ° C by inverting the tube. After removing small pieces by filtration, the cells were recovered by centrifugation at 200 × g at room temperature, suspended in DMEM containing 10% FBS, 100 U / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin, and having a diameter of 100 mm. Seeds in culture dishes. Non-adherent cells and remaining small pieces were removed by changing the medium every 1-2 days. Cells were passaged one week after isolation, cultured for an additional week, and then stocked. The synovial cells used in this study were passaged 3 times.
７）ウエスタンブロット解析
滑膜細胞を、培養の種々の時点で１ｍＬ ＰＢＳ（−）中で２回洗浄することにより回収し、１×ＳＤＳサンプルバッファー中でスクラップし、次いで−８０℃で保存した。ウエスタンブロット解析のために、サンプルを煮沸し、８％又は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ポリビニリジンジフルオリド（ＰＶＤＦ）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に転写した。フィルターを、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）からの、ＥＧＦレセプターに特異的なウサギポリクローナル抗体、ＥＲＫ１／２及びホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、又はＧｒｐ７８／９４に特異的なマウスモノクローナル抗体（１０Ｃ３，Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びα−チューブリンに特異的なマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）のいずれかと共に、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗ラット又はマウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と共に連続してインキュベートした。化学発光ブロッティング基質（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を、製造業者の推奨に従って検出工程で用いた。
7) Western blot analysis Synovial cells were collected by washing twice in 1 mL PBS (−) at various time points in culture, scraped in 1 × SDS sample buffer, and then stored at −80 ° C. For Western blot analysis, samples were boiled, separated by 8% or 10% SDS-PAGE, and transferred to polyvinylidine difluoride (PVDF) filters (Millipore, Bedford, Mass.). Filters were purchased from Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA), a rabbit polyclonal antibody specific for the EGF receptor, ERK1 / 2 and phospho-ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204), or a mouse monoclonal antibody specific for Grp78 / 94 (10C3, Stressgen, San) Diego, CA) and mouse monoclonal antibodies specific for α-tubulin (Sigma-Aldrich Co., Milwaukee, Wis.) Followed by horseradish peroxidase-conjugated anti-rat or mouse IgG (Amersham, Piscataway, NJ) ) In a continuous incubation. A chemiluminescent blotting substrate (Perkin-Elmer, San Jose, CA) was used in the detection step according to the manufacturer's recommendations.
８）細胞増殖アッセイ
各患者由来の滑膜細胞を、１×１０５細胞／ウェルにて、コーティングされていない３５ｍｍ組織培養プレート上に播種し、５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で培養した。１２時間後、細胞を、ＡＲＥＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ７０８０）（１００ｎｇ／ｍｌ）と共に又はそれを用いずに、新鮮な５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中でインキュベートした。各プレートの中心領域付近の固定領域から、４つの写真を、０、１、３及び４日の時点にて４連で撮影した。各時点での細胞を、これらの４つの写真から計数し、平均±標準誤差（ＳＥ）として表した。
8) Cell proliferation assay Synoviocytes from each patient were seeded at 1 × 10 5 cells / well onto uncoated 35 mm tissue culture plates and cultured in 5% FBS / DMEM. After 12 hours, cells were incubated in fresh 5% FBS / DMEM with or without AREG (Sigma-Aldrich, A7080) (100 ng / ml). Four photographs were taken in quadruplicate at 0, 1, 3, and 4 days from a fixed area near the center area of each plate. Cells at each time point were counted from these four photographs and expressed as mean ± standard error (SE).
９）統計解析
Spearman’s rank correlation（図２０）又はマン−ホイットニーＵ検定（図２〜７、９、１０、１３）を用いて有意差を決定した。データは、平均±ＳＥとして表した。Ｐ＜０．０５又はＰ＜０．０１を統計的に有意とみなした。
9) Statistical analysis
Significant differences were determined using Spearman's rank correlation (FIG. 20) or Mann-Whitney U test (FIGS. 2-7, 9, 10, 13). Data were expressed as mean ± SE. P <0.05 or P <0.01 was considered statistically significant.
実施例１：ステップワイズ・サブトラクション及びＤＮＡ核酸アレイ解析によるＲＡ又はＯＡ特異的遺伝子の同定
ＯＡ患者のＢＭＭＣでアップレギュレートされている遺伝子に比し、ＲＡ患者のＢＭＭＣでアップレギュレートされている推定ＲＡ特異的遺伝子を単離するために、我々は、我々のステップワイズ・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション法を用いた。簡潔には、我々は、ｐＡＰ３ｎｅｏベクターを用いたリンカープライマー法（Kobori, M.ら, 1998, Genes Cells, 3, 459-475）により、５０人のＲＡ患者のＢＭＭＣからプールしたｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを調製した。次いで、ステップワイズ・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションを、以前に記載（Fujii, T.ら, 2002, EMBO Rep., 3, 367-372）したように、５０人のＯＡ患者のＢＭＭＣからプールしたビオチン化ｍＲＮＡを用いて行い、ＲＡ ＢＭＭＣにおけるアップレギュレーションを示し得る候補遺伝子のみを選択した。候補遺伝子がＲＡ ＢＭＭＣで実際にアップレギュレートされ、ＯＡ ＢＭＭＣではアップレギュレートされていないことを調べるために、我々は、５０人のＲＡ患者及び５０人のＯＡ患者のＢＭＭＣからプールしたｍＲＮＡを用いて、ノザンブロット解析及び／又はＲＴ−ＰＣＲを行った（図１）。本方法によって重要なＲＡ特異的発症遺伝子を欠落する可能性を低減させるために、我々はまた、上記のＲＡ及びＯＡ患者のＢＭＭＣから得られた同じプールのＲＮＡサンプルと共にAgilent Hu44Kアレイを用いて、ゲノムワイドな相補的ＤＮＡ核酸アレイ解析を行った。以上より、我々は、１０３個のＲＡアップレギュレート遺伝子を同定し（表１、図１）、それらをＡＵＲＡ（augmented in RA）と命名した。表１に示されるように、１５個のＡＵＲＡ遺伝子（ＡＵＲＡ１〜ＡＵＲＡ７及びＡＵＲＡ１０〜ＡＵＲＡ１７）は特徴付けされていない新規遺伝子である。
Example 1: Identification of RA- or OA-specific genes by stepwise subtraction and DNA nucleic acid array analysis Estimated up-regulated in BMMC of RA patients compared to genes up-regulated in BMMC of OA patients To isolate RA specific genes, we used our stepwise subtractive hybridization method. Briefly, we generated a cDNA library from mRNA pooled from BMMCs of 50 RA patients by the linker primer method using the pAP3neo vector (Kobori, M. et al., 1998, Genes Cells, 3, 459-475). Prepared. Stepwise subtractive hybridization was then biotinylated pooled from BMMCs of 50 OA patients as previously described (Fujii, T. et al., 2002, EMBO Rep., 3, 367-372). Only candidate genes that were able to show up-regulation in RA BMMC were selected using mRNA. To test that the candidate gene was actually up-regulated in RA BMMC and not up-regulated in OA BMMC, we used mRNA pooled from BMMCs of 50 RA patients and 50 OA patients. Northern blot analysis and / or RT-PCR was performed (FIG. 1). In order to reduce the possibility of missing important RA-specific pathogenic genes by this method, we also used an Agilent Hu44K array with the same pool of RNA samples obtained from BMMC of RA and OA patients described above, Genome-wide complementary DNA nucleic acid array analysis was performed. From the above, we have identified 103 amino RA upregulated genes (Table 1, Figure 1), was named them as AURA (au gmented in RA). As shown in Table 1, 15 AURA genes (AURA1-AURA7 and AURA10-AURA17) are novel uncharacterized genes.
我々はまた同様の実験を行い、５０人のＯＡ患者のＢＭＭＣからプールしたｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製し、次いでサブトラクションのために５０人のＲＡ患者のＢＭＭＣからプールしたビオチン化ｍＲＮＡを用いることにより、候補となるＯＡアップレギュレート遺伝子を得た。ＤＮＡ核酸アレイ解析はまた、上記のような多くの候補ＯＡ特異的遺伝子を生じた。しかし、我々は、これらの候補遺伝子がＯＡ ＢＭＭＣにおいて真に特異的にアップレギュレートされているのかどうかをノザンブロット解析及び／又はＲＴ−ＰＣＲによってチェックしたとき、我々は、２個の遺伝子のみについてこれを確認できた。これらの２つのＯＡアップレギュレート遺伝子は、核内レセプターコアクチベータ１及びハイポセティカルタンパク質（ＦＬＪ２０５８１）をコードしている。この結果は、ＲＡアップレギュレート候補遺伝子の発現増強に起因する機能獲得がＲＡの発症に重要であることを示唆する。従って、我々は引き続き、ＲＡアップレギュレート遺伝子について我々の研究を集中した。 We also performed a similar experiment, creating a cDNA library from mRNA pooled from BMMC of 50 OA patients, and then using biotinylated mRNA pooled from BMMC of 50 RA patients for subtraction, Candidate OA up-regulated genes were obtained. DNA nucleic acid array analysis also yielded many candidate OA specific genes as described above. However, when we checked by Northern blot analysis and / or RT-PCR whether these candidate genes were truly specifically up-regulated in OA BMMC, we found that only two genes Was confirmed. These two OA up-regulated genes encode nuclear receptor coactivator 1 and hypothetical protein (FLJ20581). This result suggests that gain of function due to enhanced expression of RA upregulation candidate genes is important for the development of RA. Therefore, we continued to focus our research on the RA upregulated gene.
実施例２：個々のＲＡ又はＯＡ患者におけるＲＡアップレギュレート遺伝子の発現プロフィール
１０３個のＲＡ特異的候補遺伝子のアップレギュレーションが多くのＲＡ患者で広範なものであるか又は少数の患者でのみ生じているかを決定するため、我々は、ＲＡ患者のＢＭＭＣ又はＰＢＭＣから個別に調製したＲＮＡサンプルを用いてＱＲＴ−ＰＣＲを行った。１０３個の候補遺伝子のうち、機能が未知である５個の遺伝子及び増殖調節又は免疫応答に関与する１２個の遺伝子を、ＱＲＴ−ＰＣＲにより解析した。ＯＡ患者もまた、ネガティブコントロールとして試験した。各ＱＲＴ−ＰＣＲにおいて、健常ボランティアのＰＢＭＣからの標準ＲＮＡを用いた（相対強度１．０の正常として示す）。これは、本研究で試験した遺伝子の発現プロファイルについての相互比較を可能にする。さらに、我々は、このようなコントロールを用いたことにより、本研究における遺伝子の発現プロファイルを、他の自己免疫疾患に関する我々の以前の報告（Ishii, T.ら, 2006, DNA Res., 112, 1-11）で試験された他の遺伝子の発現プロファイル、及び健常個体における遺伝子の発現プロファイルと比較することが可能であった。
Example 2: Expression profile of RA up-regulated genes in individual RA or OA patients Up-regulation of 103 RA-specific candidate genes is extensive in many RA patients or occurs only in a few patients We performed QRT-PCR using RNA samples prepared individually from BMMC or PBMC of RA patients. Of the 103 candidate genes, 5 genes with unknown function and 12 genes involved in growth regulation or immune response were analyzed by QRT-PCR. OA patients were also tested as negative controls. In each QRT-PCR, standard RNA from PBMC of healthy volunteers was used (shown as normal with a relative intensity of 1.0). This allows an intercomparison of the expression profiles of the genes tested in this study. Furthermore, by using such controls, we have analyzed the gene expression profile in this study in our previous report on other autoimmune diseases (Ishii, T. et al., 2006, DNA Res., 112, It was possible to compare with the expression profiles of other genes tested in 1-11) and the expression profiles of genes in healthy individuals.
１７個の試験したＡＵＲＡ遺伝子（表１でＸとして示す）のうち、ＡＲＥＧ（ＡＵＲＡ９）が、多くのＲＡ患者のＢＭＭＣで最も顕著にアップレギュレートされており、一方、対照的にＯＡ ＢＭＭＣは、この遺伝子を非常に低いレベルで常に発現していた（図２）。同様に、多くのＲＡ患者のＰＢＭＣはＡＲＥＧを強く発現しており、一方、非常に低い発現のみがＯＡ患者のＰＢＭＣで検出された。ＡＲＥＧは、自己分泌／接触分泌様式において標的細胞のＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）シグナリングを活性化することにより細胞増殖を刺激するＥＧＦ様増殖因子の一つである（Shoyab, M.ら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 85, 6528-6532）。 Of the 17 AURA genes tested (shown as X in Table 1), AREG (AURA9) is most significantly up-regulated in BMMC of many RA patients, whereas OA BMMC, in contrast, This gene was always expressed at very low levels (FIG. 2). Similarly, many RA patients 'PBMCs strongly expressed AREG, while only very low expression was detected in OA patients' PBMCs. AREG is one of EGF-like growth factors that stimulate cell proliferation by activating target cell EGF receptor (EGFR) signaling in an autocrine / contact secretory manner (Shoyab, M. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. US A., 85, 6528-6532).
ＡＵＲＡ１は、多くのＲＡ患者のＢＭＭＣにおいて次に最も顕著にアップレギュレートされている遺伝子であり、一方、全てのＯＡ患者のＢＭＭＣはこの遺伝子の非常に低い発現のみを示した（図３）。しかし、ＡＲＥＧとは異なり、ＲＡ患者のＰＢＭＣは、ＡＵＲＡ１の発現において無視し得る亢進を示した。 AURA1 is the next most significantly up-regulated gene in BMMC of many RA patients, while BMMC of all OA patients showed only very low expression of this gene (FIG. 3). However, unlike AREG, PBMCs in RA patients showed negligible enhancement in AURA1 expression.
ＦＫ５０６（タクロリムス）結合タンパク質５（ＦＫＢＰ５＝ＡＵＲＡ４５）をコードする遺伝子もまた、ＲＡ患者のＢＭＭＣサンプルの約半分において発現の増強を示し、一方、ＯＡ患者のＢＭＭＣサンプル又はＲＡ患者のＰＢＭＣでは、そのような増強は全く観察されなかった（図４）。 The gene encoding FK506 (tacrolimus) binding protein 5 (FKBP5 = AURA45) also shows enhanced expression in about half of RA patient BMMC samples, while in OA patient BMMC samples or RA patient PBMCs No significant enhancement was observed (Figure 4).
ＲＡ患者ＢＭＭＣサンプルの約半分が、正常コントロールＰＢＭＣサンプルよりも、ＣＬＥＣＳＦ９（＝ＡＵＲＡ２４）、ＴＰＳＴ１（＝ＡＵＲＡ５２）及びＡＵＲＡ２の５〜５０倍のより高い発現を示した（図５〜７）。ＯＡ患者のＢＭＭＣ又はＲＡ患者のＰＢＭＣでは、このような増加は全く観察されなかった。 About half of RA patient BMMC samples showed 5-50 times higher expression of CLECSF9 (= AURA24), TPST1 (= AURA52) and AURA2 than normal control PBMC samples (FIGS. 5-7). No such increase was observed in BM patients from OA patients or PBMC from RA patients.
Ｇ０Ｓ２（＝ＡＵＲＡ８）、ケモカインレセプター４（ＣＸＣＲ４＝ＡＵＲＡ８６）、核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ＝ＡＵＲＡ２５）及びＡＵＲＡ１７は、ＯＡ患者のＢＭＭＣ及びＰＢＭＣにおける発現と比較した場合に、数人のＲＡ患者のＢＭＭＣ及びＰＢＭＣの双方において増強した発現を示したが、ＲＡサンプルとＯＡサンプルとの間の差異は、以前に考察した遺伝子については、有意ではなかった（図８〜１１）。 G0S2 (= AURA8), chemokine receptor 4 (CXCR4 = AURA86), nuclear factor-κB (NF-κB = AURA25) and AURA17 are compared to the expression in BM patients and PBMCs of OA patients in several RA patients. Although it showed enhanced expression in both BMMC and PBMC, the difference between the RA and OA samples was not significant for the previously discussed genes (FIGS. 8-11).
実施例３：ＰＢＭＣにおけるＡＵＲＡ遺伝子の発現パターン
ＡＵＲＡ遺伝子が特定のヒト血液細胞で発現しているかどうかを決定するために、我々は、Clontech（Palo Alto, CA）からの複数組織ｃＤＮＡパネル（ＭＴＣ）に対してＲＴ−ＰＣＲを行った。図１２に示されるように、ＲＴ−ＰＣＲは、単球並びにＴ及びＢ細胞の双方、特に活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＡＲＥＧ ｍＲＮＡを検出した。ＡＵＲＡ１は、休止ＣＤ４＋（Ｔヘルパー／インデューサー）及び活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞において優位に検出された。ＣＬＥＣＳＦ９は、活性化ＣＤ１９＋Ｔ細胞を除く殆どの細胞型で発現しており、一方、Ｇ０Ｓ２は、単球において主に見出された。ＦＫＢＰ５、ＴＰＳＴ１、ＣＸＣＲ４、ＡＵＲＡ２及びＮＦ−κＢは、殆どの細胞型で遍在的に発現している。
Example 3: Expression pattern of AURA gene in PBMC To determine whether the AURA gene is expressed in specific human blood cells, we have developed a multi-tissue cDNA panel (MTC) from Clontech (Palo Alto, CA). RT-PCR was performed on As shown in FIG. 12, RT-PCR detected AREG mRNA in both monocytes and T and B cells, particularly activated CD4 + T cells. AURA1 was detected predominantly in resting CD4 + (T helper / inducer) and activated CD4 + T cells. CLECSF9 is expressed in most cell types except activated CD19 + T cells, whereas G0S2 was found primarily in monocytes. FKBP5, TPST1, CXCR4, AURA2 and NF-κB are ubiquitously expressed in most cell types.
実施例４：ＡＲＥＧは滑膜細胞の増殖を刺激する
ＡＲＥＧは、多くのＲＡ患者で最も顕著にアップレギュレートされている遺伝子と思われたので、我々は、それをさらなる解析に供した。我々は先ず、単離された滑膜細胞の増殖を刺激するその能力を調べた。なぜなら、ＡＲＥＧは、ＥＧＦＲのリガンドの一つであり、細胞増殖を誘導することが知られているためである。従って、我々は、関節再建外科中である５人のＲＡ患者及び３人のＯＡ患者から得られた滑膜組織から滑膜細胞を単離した。培養培地においてＡＲＥＧの非存在下では、ＲＡ及びＯＡの双方の患者由来の滑膜細胞は、同様の速度で増殖した（図１３及び１４）。しかし、ＡＲＥＧが存在した場合、ＲＡ患者由来の滑膜細胞は、ＯＡ患者由来の滑膜細胞よりも増殖能が高かった（Ｐ＜０．０５）（図１３）。
Example 4: AREG stimulates synoviocyte proliferation Since AREG appeared to be the most prominently upregulated gene in many RA patients, we submitted it for further analysis. We first examined its ability to stimulate the proliferation of isolated synoviocytes. This is because AREG is one of the ligands of EGFR and is known to induce cell proliferation. Therefore, we isolated synovial cells from synovial tissue obtained from 5 RA patients and 3 OA patients undergoing joint reconstruction surgery. In the absence of AREG in the culture medium, synovial cells from both RA and OA patients proliferated at similar rates (FIGS. 13 and 14). However, when AREG was present, synovial cells from RA patients had higher proliferative potential than synovial cells from OA patients (P <0.05) (FIG. 13).
この現象が滑膜細胞のシグナル伝達マシーナリに反映されているかどうかを調べるために、我々は、ＡＲＥＧ処理及び未処理ＲＡ滑膜細胞におけるＥＧＦＲシグナリング経路の活性化を調査した。我々は先ず、ウエスタンブロット解析によりＴｈｒ２０２及びＴｙｒ２０４での細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ１／２）のリン酸化を調べた。ＥＲＫ１／２リン酸化は、ＥＧＦＲシグナリング経路の活性化を示す（Shin, H.S.ら, 2003, Circ. Res., 93, 302-310）。図１５に示されるように、ＲＡ滑膜細胞におけるリン酸化ＥＲＫ１／２バンドは、細胞をＡＲＥＧで処理した場合に、強度において増加を示した；この効果は、ＡＲＥＧ処理後の８〜１２時間ピークにあったが、２〜３日間継続した。一方、ＥＲＫ１／２タンパク質レベルは、ＡＲＥＧ処理によっては殆ど影響を受けないままであった。 To investigate whether this phenomenon is reflected in synoviocyte signaling machinery, we investigated activation of the EGFR signaling pathway in AREG-treated and untreated RA synoviocytes. We first examined phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK1 / 2) at Thr202 and Tyr204 by Western blot analysis. ERK1 / 2 phosphorylation indicates activation of the EGFR signaling pathway (Shin, H.S. et al., 2003, Circ. Res., 93, 302-310). As shown in FIG. 15, phosphorylated ERK1 / 2 bands in RA synovial cells showed an increase in intensity when the cells were treated with AREG; this effect peaked 8-12 hours after AREG treatment. But continued for 2-3 days. On the other hand, ERK1 / 2 protein levels remained largely unaffected by AREG treatment.
ＲＡ患者とＯＡ患者との間のＥＧＦＲシグナリングの活性化を比較するために、我々は、５人のＲＡ患者及び３人のＯＡ患者由来の滑膜細胞におけるＥＧＦＲシグナリング経路の活性化を調べた（図１６）。従って、我々は、ウエスタンブロットによりリン酸化ＥＲＫ１／２発現レベルを評価し、より低いリン酸化バンドの強度をデンシトメトリにより測定することにより定量的に結果を表し、そしてそれをＥＲＫ１／２バンド強度と比較した（図１７）。我々は、ＲＡ患者及びＯＡ患者由来の滑膜細胞が、ＡＲＥＧ処理にかかわらず、同等レベルのＥＧＦＲ及びＥＲＫ１／２タンパク質を示したことを見出した。一方、ＡＲＥＧ処理は、ＯＡ患者由来の滑膜細胞よりも、ＲＡ患者由来の滑膜細胞において、はるかにより強いリン酸化ＥＲＫ１／２発現レベルをアップレギュレートする傾向が認められた。 To compare the activation of EGFR signaling between RA and OA patients, we investigated the activation of the EGFR signaling pathway in synovial cells from 5 RA patients and 3 OA patients ( FIG. 16). We therefore evaluated the phosphorylated ERK1 / 2 expression level by Western blot, expressed the results quantitatively by measuring the intensity of the lower phosphorylated band by densitometry, and compared it to the ERK1 / 2 band intensity (FIG. 17). We found that synovial cells from RA and OA patients showed comparable levels of EGFR and ERK1 / 2 proteins regardless of AREG treatment. On the other hand, AREG treatment tended to up-regulate much stronger phosphorylated ERK1 / 2 expression levels in RA patient-derived synovial cells than in OA patient-derived synovial cells.
シノビオリンは、ＥＲＡＤ系を制御することにより、ＲＡの滑膜過形成において役割を果たす（Amano, T.ら, 2003, Genes Dev., 17, 2436-2449）。ＲＡ滑膜細胞が異常なＥＲＡＤ系を有するかどうかを決定するために、我々は、折り畳まれていないタンパク質の蓄積につながり得るストレス誘導性ＥＲ機能不全から細胞を保護するＥＲストレスタンパク質ＧＲＰ７８／ＢｉＰ及びＧＲＰ９４（Lee, A.S. 2001, Trends Biochem. Sci., 26, 504-510）のそれらのレベルを測定した。我々は、ＲＡ及びＯＡ患者の滑膜細胞が同様のレベルのＧＲＰ７８／ＢｉＰを有しているものの（図１６及び図１８）、ＲＡ滑膜細胞は、それらがＡＲＥＧで刺激されているかどうかにかかわらず、増強したレベルのＧＲＰ９４を示すことを見出した。これは、ＥＲストレス応答経路の少なくとも一部（即ち、ＧＲＰ９４により媒介される経路）がＯＡ滑膜細胞よりもＲＡ滑膜細胞でより活性化されることを示唆する。従って、ＥＲＡＤ経路は、ＲＡ滑膜細胞において異常にアップレギュレートされるようである。我々は、ＲＡ患者ＲＡ１〜５のＢＭＭＣ及びＰＢＭＣ細胞が、ＯＡ患者ＯＡ１〜３のＢＭＭＣ及びＰＢＭＣとは異なり、ＡＲＥＧ ｍＲＮＡレベルの亢進を示すことを、ＱＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図１９）。従って、ＡＲＥＧ／ＥＧＦＲシグナリングの慢性活性化が、ＲＡ患者において増強しているようである。ＡＲＥＧは、細胞外ドメインで切断され可溶性増殖因子を放出する膜貫通前駆体として発現する（Lee, D.C.ら, 2003, Ann. N. Y. Acad. Sci., 995, 22-38）ので、我々は、ＲＡ患者の血清（ＰＢ）及び骨髄液（ＢＭ）が、ＯＡ患者の同液と比較して、切断ＡＲＥＧレベルの増強を示すかもしれないと推察した。我々は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により試験したところ、切断ＡＲＥＧレベルの増強を示すＲＡ患者が確認された（データ示さず）。従って、ＲＡ患者の少なくとも一部は、高レベルのＡＲＥＧを分泌している可能性がある。 Synoviolin plays a role in synovial hyperplasia of RA by regulating the ERAD system (Amano, T. et al., 2003, Genes Dev., 17, 2436-2449). To determine whether RA synovial cells have an abnormal ERAD system, we have ER stress proteins GRP78 / BiP that protect cells from stress-induced ER dysfunction that can lead to accumulation of unfolded proteins and Their levels of GRP94 (Lee, AS 2001, Trends Biochem. Sci., 26, 504-510) were measured. Although we have similar levels of GRP78 / BiP in RA and OA patient synovial cells (FIGS. 16 and 18), RA synovial cells do not depend on whether they are stimulated with AREG. It was found to show enhanced levels of GRP94. This suggests that at least a portion of the ER stress response pathway (ie, the pathway mediated by GRP94) is more activated in RA synoviocytes than OA synoviocytes. Thus, the ERAD pathway appears to be abnormally upregulated in RA synovial cells. We confirmed by QRT-PCR that BMMC and PBMC cells of RA patients RA1-5 showed an increase in AREG mRNA levels, unlike BMMC and PBMC of OA patients OA1-3 (FIG. 19). Thus, it appears that chronic activation of AREG / EGFR signaling is enhanced in RA patients. Since AREG is expressed as a transmembrane precursor that is cleaved in the extracellular domain and releases soluble growth factors (Lee, DC et al., 2003, Ann. NY Acad. Sci., 995, 22-38), we It was speculated that patient serum (PB) and bone marrow fluid (BM) may show enhanced cleaved AREG levels compared to the same fluid of OA patients. We tested RA by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and confirmed RA patients with enhanced levels of cleaved AREG (data not shown). Thus, at least some of RA patients may secrete high levels of AREG.
実施例５：相関解析
我々は、ＲＡ患者におけるＡＲＥＧ、ＡＵＲＡ１、ＦＫＢＰ５、ＣＬＥＣＳＦ９、ＴＰＳＴ１、ＡＵＲＡ２、Ｇ０Ｓ２、ＣＸＣＲ４、ＮＦκＢ及びＡＵＲＡ１７遺伝子の発現レベルが互いに相関するかどうかを調べた。従って、図２〜１１に示されるＱＲＴ−ＰＣＲデータの全ての可能性のある組合せを相関解析に供した。その結果、我々は、ＦＫＢＰ５がＲＡ患者のＢＭＭＣサンプルでアップレギュレートされる程度が、同サンプルにおけるＴＰＳＴ１の発現レベルと正に相関すること、並びにＣＬＥＣＳＦ９及びＡＵＲＡ２の発現レベルと相対的により弱く正に相関することを見出した（図２０）。
Example 5: Correlation analysis We investigated whether the expression levels of AREG, AURA1, FKBP5, CLECSF9, TPST1, AURA2, G0S2, CXCR4, NFκB and AURA17 genes in RA patients were correlated with each other. Therefore, all possible combinations of QRT-PCR data shown in FIGS. 2-11 were subjected to correlation analysis. As a result, we found that the degree to which FKBP5 is up-regulated in the BMMC sample of RA patients is positively correlated with the expression level of TPST1 in that sample, and relatively weakly positive with the expression levels of CLECSF9 and AURA2. Correlation was found (FIG. 20).
（考察）
本研究では、我々は、ＯＡ患者ＢＭＭＣにおけるそれらの発現に比し、ＲＡ患者のＢＭＭＣにおいてｍＲＮＡ発現の増強を示すＡＵＲＡ遺伝子の我々による包括的な単離を報告する（図１及び表１）。ＲＡ患者は、欠陥的な中心及び末梢Ｂ細胞寛容チェックポイントを受け、しばしば二次的組換え調節不全を示唆する異常なイムノグロブリン軽鎖レパートリーを表示する（Samuels, J.ら, 2005, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1062, 116-126）ので、我々は、多くの免疫応答遺伝子がＡＵＲＡ遺伝子として同定されるであろうことを予測した。実際、１０％を超えるＡＵＲＡ遺伝子が免疫応答に直接的に関連する；さらに、他のＡＵＲＡ遺伝子は一見すると免疫応答に無関係のようであるものの、これらのうち多くもまた、免疫応答に関与し得る（表１）。個々の患者サンプルに対するＱＲＴ−ＰＣＲ解析は、上記で議論したＡＵＲＡ遺伝子が、我々が試験した５０人のＲＡ患者のうちの多くのＢＭＭＣで有意に増強していることを示した（図２〜１１）。従って、これらの遺伝子の同定は、ＲＡの発症についての我々の理解に役立つかもしれない。
(Discussion)
In this study, we report our comprehensive isolation of the AURA gene showing enhanced mRNA expression in BMMC of RA patients compared to their expression in OA patients BMMC (Figure 1 and Table 1). RA patients undergo a defective central and peripheral B cell tolerance checkpoint and often display an abnormal immunoglobulin light chain repertoire suggesting secondary recombination dysregulation (Samuels, J. et al., 2005, Ann. NY Acad. Sci., 1062, 116-126), we predicted that many immune response genes would be identified as AURA genes. Indeed, more than 10% of the AURA genes are directly related to the immune response; in addition, although other AURA genes seem to be unrelated to the immune response at first glance, many of these can also be involved in the immune response (Table 1). QRT-PCR analysis on individual patient samples showed that the AURA gene discussed above was significantly enhanced in many BMMCs out of the 50 RA patients we tested (Figures 2-11). ). Thus, the identification of these genes may help our understanding of the development of RA.
ＡＲＥＧは、多くのＲＡ患者のＢＭＭＣ及びＰＢＭＣの双方で発現の最も顕著な亢進を示した（図２）。我々はまた、ＲＡ患者の滑膜細胞が、ＯＡ患者のものに比し、増殖の点で、ＡＲＥＧにより高い感受性を示すことを見出した（図１３及び１４）。これは、ＥＧＦＲの発現亢進に起因せず（図１６、最上のレーン）、より活性化されたＥＧＦＲシグナリング経路に起因する。なぜなら、ＥＲＫ１／２のリン酸化が、ＡＲＥＧ処理ＯＡ患者滑膜細胞のものよりも、ＡＲＥＧ処理ＲＡ患者滑膜細胞でより亢進していたからである（図１５及び１６）。ＥＲＫ１／２のこのリン酸化の亢進は、多くの下流標的遺伝子の発現を上昇させ、これはまた、ＥＲＡＤ系の活性化を必要とし得る（図２２）。シノビオリン遺伝子の近位プロモーターのＥｔｓ結合部位（ＥＢＳ）がその発現を担うこと（Tsuchimochi, K.ら, 2005, Mol. Cell Biol., 25, 7344-7356）、及びＥＢＳ保有遺伝子もまた、ＥＲＫ経路からのシグナリング事象により活性化されること（Hoffmeyer, A.ら, 1998, J. Biol. Chem., 273, 10112-10119）を考慮すると、ＡＲＥＧにより誘導されるＥＧＦＲシグナリングの活性化の亢進は、シノビオリンの発現及び他の遺伝子の発現を直接的に活性化し、それにより滑膜細胞の過増殖を誘導するのかもしれない。従って、ＲＡ患者におけるＥＲＡＤ系は、シノビオリンにより過剰活性化されるのかもしれない。なぜなら、血液細胞、おそらくはマクロファージにおけるＡＲＥＧ発現の増強がＲＡ患者の滑膜細胞の近傍で生じ、増強した量のＡＲＥＧを放出するからである（図２１及び２２）。我々は、ＢＭＭＣ及びＰＢＭＣにおけるＡＲＥＧの発現亢進がＲＡの発症において中心的な役割を果たし得ることを提唱する。 AREG showed the most marked increase in expression in both BMMC and PBMC in many RA patients (FIG. 2). We have also found that synovial cells from RA patients are more sensitive to AREG in terms of proliferation compared to those from OA patients (FIGS. 13 and 14). This is not due to increased expression of EGFR (FIG. 16, top lane), but due to a more activated EGFR signaling pathway. This is because ERK1 / 2 phosphorylation was more enhanced in AREG-treated RA patient synovial cells than in AREG-treated OA patient synovial cells (FIGS. 15 and 16). This enhanced phosphorylation of ERK1 / 2 increases the expression of many downstream target genes, which may also require activation of the ERAD system (FIG. 22). The Ets binding site (EBS) of the proximal promoter of the Synoviolin gene is responsible for its expression (Tsuchimochi, K. et al., 2005, Mol. Cell Biol., 25, 7344-7356), and the EBS-bearing gene is also an ERK pathway In view of being activated by a signaling event from (Hoffmeyer, A. et al., 1998, J. Biol. Chem., 273, 10112-10119), the enhanced activation of EGFR signaling induced by AREG is It may directly activate the expression of synoviolin and other genes, thereby inducing synovial cell hyperproliferation. Thus, the ERAD system in RA patients may be overactivated by Synoviolin. This is because enhanced AREG expression in blood cells, presumably macrophages, occurs in the vicinity of RA patient synovial cells, releasing enhanced amounts of AREG (FIGS. 21 and 22). We propose that upregulation of AREG in BMMC and PBMC may play a central role in the development of RA.
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