JP2008048684A - Substrate plate for immobilizing cell, capable of regulating cellular function, and device for producing the same - Google Patents
Substrate plate for immobilizing cell, capable of regulating cellular function, and device for producing the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008048684A JP2008048684A JP2006229658A JP2006229658A JP2008048684A JP 2008048684 A JP2008048684 A JP 2008048684A JP 2006229658 A JP2006229658 A JP 2006229658A JP 2006229658 A JP2006229658 A JP 2006229658A JP 2008048684 A JP2008048684 A JP 2008048684A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- fine particles
- substrate
- cells
- solid substrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Surface Treatment Of Glass (AREA)
Abstract
Description
本発明は細胞固定用基板およびその製造方法に関する。より詳しくは，固体基板と、該固定基板表面に誘電泳動によって配列化された後に固定化された微粒子とで構成される細胞固定用の培養基板に関する。 The present invention relates to a cell fixing substrate and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a cell-fixing culture substrate composed of a solid substrate and fine particles that are immobilized on the surface of the fixed substrate by dielectrophoresis.
近年、生命工学とマイクロマシニング技術を融合することで核酸，酵素，抗体，細胞等の生体由来材料を機能素子材料として用いたマイクロチップ（バイオチップ）の開発が盛んに検討されている。バイオチップを作製するに当たっては、半導体製造プロセスによって培われたマイクロマシニング技術を用いることにより、微小領域への測定対象の集積化や微小量での測定が可能になるといったスケールの違いによる有意な効果を得ることができる。種々のマイクロチップの詳細について、例えば、非特許文献１あるいは２で詳細に論じられている。そして、上記の生体由来材料の中でもより高度な生命現象を内包している細胞をターゲットとした技術分野に対して特に注目が集まっている。一部の細胞群を除いて、一般に動物細胞は接着性細胞であり、細胞自身が担体表面に接着することで接着，増殖，分化，生存，未分化状態の維持，細胞死等の細胞機能を呈することが知られている。そして基板に細胞をアレイ状に集積させた細胞アレイは、種々の薬物に対する安全性試験や変異原性試験，薬物代謝活性試験，薬物スクリーニング等への応用が期待されている。細胞アレイの製造については温度応答性高分子を用いる方法や微小液滴吐出手段を用いる方法等が開示されている（特許文献１あるいは２参照）。また、近年注目が集まっている再生医療の分野においても、目的の細胞や臓器を生体外（インビトロ）で培養することで所望の組織又は臓器の構築を目指す試みが行われている。このように、生体外（インビトロ）で細胞機能を保持した状態で培養を行なうことの出来る試みは現在非常に多くの研究が成されている。例えば、特許文献３においてはインビトロで間質組織を構築する方法が開示されている。
In recent years, development of microchips (biochips) using bio-derived materials such as nucleic acids, enzymes, antibodies, cells, etc. as functional element materials has been actively studied by fusing biotechnology and micromachining technology. In producing biochips, the use of micromachining technology cultivated in the semiconductor manufacturing process enables the integration of measurement objects in a minute region and the measurement effect with a small amount of significant effects. Can be obtained. Details of various microchips are discussed in detail in, for example, Non-Patent
一方で生体外（インビトロ）での細胞培養に際して接着細胞の接着状態や細胞の機能に関して積極的な制御を与える要素として、培養担体表面にマイクロメートルレベルの微細な溝や凹凸等の表面形状が重要であることが知られている（非特許文献３参照）。
本発明の目的は細胞接着や細胞機能に対して積極的な制御を与え得る細胞固定用の培養担体、およびその製造方法を提供することである。より詳しくは、細胞固定用基板、細胞固定用基板の製造方法に係り、固体基板上にマイクロメートルレベルの大きさを有する微粒子を固定化した細胞培養担体，細胞培養担体の製造方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a culture carrier for cell fixation capable of positively controlling cell adhesion and cell function, and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a cell-immobilizing substrate and a method for producing a cell-immobilizing substrate, and to provide a cell culture carrier in which micrometer-level microparticles are immobilized on a solid substrate, and a method for producing a cell culture carrier. It is in.
生体外（インビトロ）で細胞に対する試験を行なうための技術開発はすでに報告がなされている。 Technical developments for testing cells in vitro (in vitro) have already been reported.
例えば、非特許文献４は平板マイクロ電極が配置された流路内で誘電泳動力を発生させることにより細胞を任意の領域にマニピュレートする。その後光開始剤を含むハイドロゲルの前駆体溶液で満たされた空間に対して紫外光（ＵＶ）を照射し、ゾル・ゲル転移を引き起こすことによって、流路内でハイドロゲル表面に細胞アレイを製造する方法を開示するものである。ところが、流路中で細胞を捕捉する際や、細胞を含む空間をゲル化する際に、細胞に対して電場勾配やＵＶを直接暴露するという製造方法をとっている。
For example, Non-Patent
また、特許文献４は表層部に光変形を起こす材料を配置した担体にマスクを介して光を照射することで目的の領域に生体材料等を固定化する方法を開示するものである。ところが、光照射による生体物質の変性や生体物質を固定化することによる細胞活性への影響に関しては不明な点が残されていた。
そこで本発明においては生体外（インビトロ）環境下で細胞培養を行なうに際して、そのための細胞培養担体を提供するためのものであり、具体的には培養担体表面にある細胞の接着状態や機能に対して積極的な制御を与えることができる細胞培養担体を提供することを目的とするものである。 Therefore, in the present invention, when cell culture is performed in an in vitro environment, the present invention is intended to provide a cell culture carrier for that purpose. Specifically, the cell adhesion state and function on the surface of the culture carrier are to be provided. It is an object of the present invention to provide a cell culture carrier that can be positively controlled.
本発明の第一は、細胞を固定して培養を行うための細胞固定用基板であって、
表面に凹凸を形成する微粒子を固定化した固体基板を有し、
前記微粒子が細胞の接着、固定を可能とする表面を有することを特徴とする細胞固定用基板である。
The first of the present invention is a cell fixing substrate for culturing with cells fixed,
Having a solid substrate on which fine particles that form irregularities on the surface are fixed,
A cell-fixing substrate, wherein the fine particles have a surface that enables cell adhesion and fixation.
本発明の第二は、微粒子がアレイ状に配列された態様の第一の細胞固定用基板を製造する方法であって、
前記微粒子を誘電泳動力により前記固体基板表面にアレイ状に配列させる工程と、
前記配列された微粒子を前記固体基板表面に固定化する工程と、
を有することを特徴とする細胞固定用基板の製造方法である。
The second of the present invention is a method for producing a first cell immobilization substrate in a form in which fine particles are arranged in an array,
Arranging the fine particles in an array on the surface of the solid substrate by dielectrophoretic force;
Immobilizing the arranged microparticles on the surface of the solid substrate;
A method for producing a cell immobilization substrate, comprising:
微粒子の固定化により固体基板表面にマイクロメートルレベルの凹凸形状を付与することで細胞接着に影響を与えることが出来る構造体であると共に薬剤や遺伝子等を担持した微粒子を固定化することで細胞機能制御が可能な細胞固定化用担体を提供することが可能となる。また微粒子の配列には誘電泳動力を駆動力として使うことを特徴としており、微粒子の帯電状態によらないマニピュレーションが可能となる。 It is a structure that can affect cell adhesion by imparting micrometer level irregularities on the surface of solid substrates by immobilizing fine particles, and cell functions by immobilizing fine particles carrying drugs, genes, etc. It is possible to provide a cell immobilization carrier that can be controlled. In addition, the arrangement of the fine particles is characterized by using a dielectrophoretic force as a driving force, and enables manipulation not depending on the charged state of the fine particles.
本発明の細胞固定用基板は、固体基板上に固定化されたマイクロメートルレベルの微粒子を備えることで担体表面にマイクロメートルレベルの構造変化を作り出す。その結果細胞の接着，増殖，分化，生存，未分化状態の維持，細胞死等の細胞機能に影響を及ぼすことを特徴とする。微粒子上での細胞培養法はビーズ状の担体表面に細胞を接着させて、ビーズを含む培地を攪拌しながら培地を循環させるマイクロキャリア培養という浮遊培養が公知である。基板上に置かれた微粒子間隙で動物細胞を培養して骨や軟骨組織の再生を行なう培養担体に関しては特許文献５等において報告がなされている。しかし、いずれの場合においても細胞のサイズに比べて培養ビーズが遥かに大きなサイズであり、具体的に微粒子直径は１０００００ ｎｍを超える大きさのものを用いて細胞培養を行なっている。また、マイクロキャリア培養は浮遊培養であり、培養液及びビーズをスターラー等で攪拌させながら培養を行なうものである。よって本明細書記載の固体基板上に微粒子が固定化されている細胞固定用基板とは構成を異にする。一般に、マイクロメートルレベルの構造体が細胞機能に与える影響については非特許文献４等において公知であった。しかし、マイクロメートルレベルの微粒子を用いて細胞固定用基板を製造する方法および静置培養で細胞機能を制御する試みに関する報告は成されていなかった。本発明は固体基板表面にマイクロメートルレベルの微粒子を固定化する際に、（ｉ）配列、（ｉｉ）固定化という２段階の工程を経て作製され、微粒子を配列させる際に駆動力として誘電泳動力を用いることを特徴とする細胞固定用基板の製造方法である。誘電泳動力（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ： ＤＥＰ）とは、空間的に高周波数帯域の交流電圧を印加することによって生じる不均一電場中での分極可能な物質または物体の移動である。周知の電気泳動の現象とは完全に異なり、誘電泳動力はクーロン力からの寄与を受けないことから、電荷を帯びない物質または物体の捕捉やマニピュレーションに対しても適用することができる。誘電泳動を利用した力は電場の不均一性と、電界によって誘導された分離対象粒子内での電荷の再分布との間の相互作用によって生じる。誘電泳動を駆動力とした物質または物体捕捉やマニピュレーションに関しては特許文献６、特許文献７、特許文献８、非特許文献５等において公知であり微粒子や細胞を用いた報告がなされている。また、誘電泳動力は高周波数帯域の交流電圧によって発生する不均一電場によって誘起されるものなので、電気二重層の緩和時間が有限であるために電気二重層が微粒子に与える影響は無視できる。このようなことから、誘電泳動における物体捕捉やマニピュレーションは電気泳動のそれと比べると脆弱な力であるものの、非帯電物質等への適用が可能であること、対象物に対する影響も小さなものであること等が特徴として挙げられる。不均一電場中においてプローブ電極と微粒子を考えた場合、微粒子の性質に関連して２種類の誘電泳動力が考えられる。例えば微粒子が溶媒等の周囲環境よりも分極されやすい場合、微粒子がより高磁場の領域に引っ張られる誘電泳動力（正の誘電泳動力；ポジティブＤＥＰ）が観察される。逆に微粒子が周囲環境よりも分極されにくい場合、微粒子がより弱い磁場領域に向かって押される誘電泳動力（負の誘電泳動力；ネガティブＤＥＰ）がそれぞれ観察される。本発明ではその目的や用途に応じてポジティブＤＥＰおよびネガティブＤＥＰを適宜用いる。
The cell immobilization substrate of the present invention comprises micrometer level microparticles immobilized on a solid substrate, thereby creating a structural change at the micrometer level on the carrier surface. As a result, it affects cell functions such as cell adhesion, proliferation, differentiation, survival, maintenance of undifferentiated state, and cell death. As a cell culture method on fine particles, suspension culture called microcarrier culture is known in which cells are adhered to the surface of a bead-like carrier and the medium is circulated while stirring the medium containing the beads.
本発明の態様に従うと、固体基板表面に少なくとも１種類の微粒子を固定化した構造体であり、微粒子アレイの表面に細胞を接着，固定する構成であることを特徴とする細胞固定用基板が提供される。細胞、特に接着細胞が基板に接着、固定するとは次のような状態を指す。接着細胞は底面基板上に接着することによって増殖等の細胞機能を発現するが、細胞は懸濁状態で系に導入された後に、基板表面に接触し、底面の足場を認識した後に細胞体の伸展を伴って基板表面に接着する。このように、接着とは細胞自身が自発的に足場を選択して自らの力で基板表面に付くことを指し、基板表面への細胞の接触から細胞体の伸展までを含んでいる。一方で、固定とは、ある一定領域内で細胞体の伸展及び遊走が制限されている状態を含む。たとえば、細胞表面に有する置換基と基板とを化学的な結合で結びつける状態がこれに含まる。更に詳しく述べれば、細胞表面に有するアミノ基と表面に適当な置換基を配した基板（例えばアミノ基）を作成し、両者を化学的に結合させる架橋剤（NHS基）を介して細胞を化学的に固定化するという一例が挙げられる。また、基板と細胞間がビオチン−アビジン結合や、抗原−抗体反応による結合であってもよい。さらに、細胞の伸展および遊走を細胞の非接着領域をパターンすることで制御する態様では、細胞は接着、固定の両方の状態を含むことになる。よって、本発明の態様に従うと、この細胞固定用基板は細胞活性を制御し得る表面を与える。本明細書中で使用されるとき、“細胞活性”とは前記基板を構成する基材である微粒子と接触できる細胞、組織、の細胞機能に影響を有する能力を指す。ここで言う細胞機能とは例えば、細胞接着，細胞増殖，細胞分化，生存，細胞未分化状態の維持，細胞分化状態の制御，細胞死の誘導等のことである。前記基板表面は、該表面への細胞の付着を促進または阻害するように調製でき、または表面に対する細胞，接着蛋白質の非特異吸着防止等の消極的な相互作用により細胞反応を起こさせるためにも使用できる。該細胞反応性表面は、固体基板表面に微粒子を固定化された表面を与えることによって表面形状により細胞機能に影響を与えることができる。例えば、適当な寸法の表面形状が存在すると、その凹凸構造が特定の細胞種の細胞機能や相互作用に対して寄与することが非特許文献４に示されているので、細胞の相互作用を促進または阻害するために使用できる。微粒子はまた、細胞表面蛋白質との相互作用を付与させる構成も好ましく用いられるものであり、かつ細胞反応を誘発できる様々な部分にカップリングできるものを適宜用いることができる。該細胞固定用基板は例えば生体外（インビトロ）で使用されて、細胞機能評価をはじめとする細胞機能評価試験や機能性細胞の創出，細胞培養のための担体として使用することができる。ここで言う機能性細胞とは、例えば肝細胞や神経細胞等の生体を構成する体性細胞のことを指す。細胞機能評価試験を行なう場合、固体基板上に目的の微粒子を固定化して細胞培養基板を作製した後に、微粒子表面に検出対象である接着性の細胞を通常播種により微粒子表面に培養することができる。つまり、微粒子上に接着した細胞が特に影響を受けるような細胞固定用基板が提供される。さらに、目的微粒子をパターン状に配列あるいはアレイ状に集積させることによって固体基板上に微粒子を接着足場とした細胞アレイを作製することも可能である。前記微粒子アレイを細胞固定用基板として用いることで細胞アレイを構築することが可能となる。細胞アレイを用いて、蛍光，発光，電気化学法，等の任意の検出方法で細胞機能の創出を行なう。
According to an aspect of the present invention, there is provided a cell immobilization substrate characterized in that it is a structure in which at least one kind of fine particles is immobilized on the surface of a solid substrate, and has a structure in which cells are adhered and fixed to the surface of the fine particle array. Is done. Adhering and fixing cells, particularly adherent cells, to a substrate refers to the following state. Adherent cells express cell functions such as proliferation by adhering to the bottom substrate, but after the cells are introduced into the system in a suspended state, they contact the surface of the substrate and recognize the scaffold on the bottom surface. Adheres to the substrate surface with stretching. Thus, adhesion means that the cell itself selects a scaffold spontaneously and attaches to the substrate surface with its own force, and includes from contact of the cell to the substrate surface to cell body extension. On the other hand, fixation includes a state in which cell body extension and migration are restricted within a certain region. For example, this includes a state in which a substituent on the cell surface and a substrate are linked by a chemical bond. More specifically, a substrate (for example, an amino group) having an amino group on the cell surface and an appropriate substituent on the surface (for example, an amino group) is prepared, and the cell is chemically mediated through a cross-linking agent (NHS group) that chemically bonds the two. One example is to fix it. Further, the substrate and the cell may be bound by biotin-avidin bond or antigen-antibody reaction. Further, in embodiments where cell spreading and migration are controlled by patterning non-adherent regions of cells, the cells will include both adherent and fixed states. Thus, according to embodiments of the present invention, the cell immobilization substrate provides a surface that can control cell activity. As used herein, “cell activity” refers to the ability to affect the cellular function of cells, tissues, which can be contacted with the microparticles that are the substrate that make up the substrate. The cell functions mentioned here include, for example, cell adhesion, cell proliferation, cell differentiation, survival, maintenance of cell undifferentiated state, control of cell differentiation state, induction of cell death, and the like. The substrate surface can be prepared to promote or inhibit cell adhesion to the surface, or to cause a cellular reaction by negative interaction such as prevention of nonspecific adsorption of cells and adhesion proteins to the surface. Can be used. The cell-reactive surface can influence the cell function depending on the surface shape by providing a surface on which solid particles are immobilized on the surface of the solid substrate. For example, it is shown in
機能性細胞の創出を行なう場合は、例えば、播種した実質細胞に対して分化や機能制御を与えつづけるようなサイトカイン等の薬剤を内包した微粒子を固定化させておくことができる。例えば造血幹細胞を固定化した微粒子担体表面で成長因子が除放されるようにしておくことで血管新生モデルの構築が可能となる。更に機能性細胞を微粒子の上に単純に固定化するだけでなく、微粒子上で２種類以上の有意な細胞を培養する担体としても用いることができる。より詳しくは細胞の共培養系の培養担体としての利用挙げられる。共培養系の構成としては例えば機能性細胞と機能性細胞の働きを助ける細胞の２種類の細胞を同一基板上で培養する構成が挙げられる。この構成を実現することによって、例えば生体内の細胞―細胞間相互作用を再現することができ、生体の有用なモデルの再構築を容易に実現できるといった利点が挙げられる。より具体的には例えば非実質細胞に血管内皮細胞，実質細胞に肝細胞を選択することで薬剤代謝試験等に有効な幹細胞モデルを構築することが可能となる。ここで言う実質細胞とは例えば、肝臓においては肝細胞といった、対象となる臓器や組織における最も重要な働きを担う細胞のことである。本態様において実質細胞と機能性細胞とは同義に扱われる。更にここで言う非実質細胞とは例えば、神経系におけるグリア細胞といった、実質細胞の機能を補助する能力を有する細胞または、実質細胞の間を埋める間質細胞のことを言う。さらに本明細書における細胞培養担体は、再生医療における分野に利用することができ、例えば皮膚や臓器の一部等の微小組織を構築し、その後微粒子を固体基板上から遊離，破壊，消化させるなどといった方法で回収するための培養担体として用いられても良い。 When creating functional cells, for example, microparticles encapsulating drugs such as cytokines that continue to give differentiation and functional control to seeded parenchymal cells can be immobilized. For example, an angiogenesis model can be constructed by allowing growth factors to be released on the surface of a fine particle carrier on which hematopoietic stem cells are immobilized. Furthermore, not only can functional cells be simply immobilized on microparticles, but they can also be used as carriers for culturing two or more types of significant cells on microparticles. More specifically, it may be used as a culture carrier for a cell co-culture system. As a configuration of the co-culture system, for example, a configuration in which two types of cells, that is, a functional cell and a cell that assists the function of the functional cell, are cultured on the same substrate. By realizing this configuration, for example, the cell-cell interaction in the living body can be reproduced, and an advantage that a useful model of the living body can be easily reconstructed can be mentioned. More specifically, for example, by selecting vascular endothelial cells as non-parenchymal cells and hepatocytes as parenchymal cells, it is possible to construct a stem cell model effective for drug metabolism tests and the like. The parenchymal cells referred to here are, for example, cells that play the most important role in the target organ or tissue, such as hepatocytes in the liver. In this embodiment, parenchymal cells and functional cells are treated synonymously. Furthermore, the non-parenchymal cells mentioned here refer to cells having the ability to assist the function of parenchymal cells, such as glial cells in the nervous system, or stromal cells filling between the parenchymal cells. Furthermore, the cell culture carrier in the present specification can be used in the field of regenerative medicine. For example, a microtissue such as a part of skin or an organ is constructed, and then the microparticles are released, destroyed, or digested from the solid substrate. It may be used as a culture carrier for recovery by such a method.
（細胞固定用基板、及びこれを含む装置）
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。まず、図１は、本発明の細胞固定用基板を製造するに当たって用いられる装置の概略図であり、本発明に係る微粒子を捕捉する固体基板上の領域（以下、「捕捉部」と略称）の基本構成の概念を簡略に示す上方から見た平面図である。図２は、図１のＡ−Ａ線に沿った断面図である。
(Cell fixing substrate and apparatus including the same)
DESCRIPTION OF EXEMPLARY EMBODIMENTS Hereinafter, preferred embodiments for carrying out the invention will be described with reference to the accompanying drawings. First, FIG. 1 is a schematic view of an apparatus used for producing the cell fixing substrate of the present invention, and shows an area (hereinafter abbreviated as “capturing part”) on a solid substrate for capturing fine particles according to the present invention. It is the top view seen from the top which shows the concept of a basic composition simply. FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG.
本発明の態様に従うと当該装置は、天井部６と底面部７を構成する２枚の固体基板と側壁となるスペーサ８とを有し、これらにより形成される微小空間内に固体基板上に微粒子を捕捉するための捕捉部３を有する。当該装置は、さらに試薬等の導入口１を少なくとも１つ備えている。導入口１から容器内にポンプのような送液機器により流体が導入され、該装置の内部の捕捉部３を経て、余剰流体は排出口２から排出されるような流路構造を備えていてもよい。本発明における装置内の当該微小空間の高さ（天井部と底面部間の距離）は１００μｍ程度であり、用いる微粒子の大きさや後述する捕捉部３の構造等に応じて適宜選択するものとする。
According to the aspect of the present invention, the apparatus has two solid substrates constituting the
本発明の態様に従うと、上述の天井部基板６及び底面部基板７の材料としてはガラス，シリコン，石英，またはケイ素をベースとする材料，プラスチック類およびポリマー類等の絶縁性の材料を利用することができる。より望ましくは倒立顕微鏡等の光学顕微鏡での観察が可能な程度の光透過性を有し、該微粒子を表面に固定化する前に、清浄化、前処理等により基板の表面改質を行なえる材質であることが望ましい。本発明における基板の表面改質とは例えば、スライドガラスおよび石英基板等を固体基板として用いる場合に予め、酸、プラズマ、オゾン、有機系溶剤、水系溶剤、界面活性剤等から選択されるものを利用した方法等を行う工程、シランカップリング等の処理により所望置換基を固体基板表面へ導入する工程または表面自由エネルギーを制御する工程のことである。
According to the aspect of the present invention, as the material of the above-mentioned
本発明の態様に従うと、図２に示された符号８は流路の側壁を示しており例えばガラス、テフロン等の高分子材料、その他の好適材料から製造されるスペーサを用いることができる。このスペーサ８の厚みが、流路内の高さ（天井部と底面部間の距離）を規定しており、このスペーサの形状が捕捉部自体の形状や容量を規定している。 According to the embodiment of the present invention, reference numeral 8 shown in FIG. 2 indicates the side wall of the flow path, and a spacer made of a polymer material such as glass or Teflon, or other suitable material can be used. The thickness of the spacer 8 defines the height in the flow path (distance between the ceiling portion and the bottom surface portion), and the shape of the spacer defines the shape and capacity of the capturing portion itself.
（微粒子の捕捉、配列化）
本発明の態様に従うと、図２に示された符号３の捕捉部によって微粒子は捕捉，配列される。微粒子を固体基板上に配列させるための捕捉手段とは、当該微粒子を捕捉してかつマイクロメートルレベルの表面形状を有する構造体を作製するための手段であり、微粒子の材質や状態に依存しない汎用性の高い捕捉力を有することが望ましい。本発明においては例えば、誘電泳動力による捕捉、微小液滴製造装置による基板表面への滴下等から選択される。本発明で用いられる誘電泳動力（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ： ＤＥＰ）とは、空間的に高周波数帯域の交流電圧を印加することによって生じる不均一電場中での分極可能な物質または物体の移動であると理解されている。
(Capturing and arranging fine particles)
According to the embodiment of the present invention, the fine particles are captured and arranged by the capturing
固体基板表面に微粒子を捕捉する手段として誘電泳動力によるものを用いる場合の態様を以下に説明する。微粒子の捕捉は前記流路中の捕捉部で行なわれ、捕捉部の一部または全部に沿って、少なくとも１個の電極を取り付ける。これら１個以上の電極は各々電気導線に電気的に結合される。電極は前述の捕捉部の天井部、底面部のいずれか、または両方に配置させることができる。本明細書において使用される電極とは、一定の電気シグナルを印加するために備えられているものであり、周囲より導電性の高い材料で作られた構造体を示す。さらに、電極は電気シグナルを発生させるための電極構成物と電気的に接続されている。電極構成物としてはマルチファンクションシンセサイザと，該マルチファンクションシンセサイザと電極とをつなぐ電気導線部分と、該電気導線部分と電極との接触箇所である接合部とを有する構成を好適に用いることができる。マルチファンクションシンセサイザは、本発明において少なくとも１つの電気シグナルを発生させるために必要な電圧、周波数、位相、波形のパラ―メータを調節することができる。電極は流路内の捕捉部に置かれていて、必ずしも基板の表面に露出している必要はなく、内部に配置されていても構わない。一形態として例えば、平板電極が選択される。電極材料は前記の通り周囲より導電性の高い材料で作られた物で、電極間が絶縁されている物を指す。電極は望ましくは金属で構成される。更に望ましくは金、白金、クロム、チタニウムおよびＩＴＯ（インジウム―スズ―酸化物）等から選択される。電極はスパッタリング法，蒸着法，めっき法のいずれかの方法により固体基板上に形成される。ここで例えば金を最表面の電極材料に選択した場合、金と基板間の結合力が弱いので、これらの間の結合力を向上させるために、クロム、チタニウム、タングステン等の金属薄膜を形成した後、金をスパッタ法、蒸着法、めっき法等により成膜する。電極はフォトリソグラフィー法およびリフトオフ法等の一般的に電極を形成するのに使用される他の方法を使用して形成することができる。更に、平板電極として固体基板上に配置させる場合には電極同士が流路内において独立に存在していれば良く、金属等の導電性物質を全面にコートした後にレジスト等の絶縁薄膜で周囲を区切ることで目的の形状を露出させ電極として用いてもよい。 A mode in the case of using a device based on dielectrophoretic force as a means for capturing fine particles on the solid substrate surface will be described below. The capturing of the fine particles is performed in the capturing part in the flow path, and at least one electrode is attached along a part or all of the capturing part. Each of the one or more electrodes is electrically coupled to an electrical lead. The electrodes can be arranged on either the ceiling part, the bottom part or both of the capturing part. The electrode used in the present specification indicates a structure which is provided for applying a certain electric signal and is made of a material having higher conductivity than the surroundings. Furthermore, the electrode is electrically connected to an electrode structure for generating an electrical signal. As the electrode structure, a structure having a multi-function synthesizer, an electric conductor portion connecting the multi-function synthesizer and the electrode, and a joint portion which is a contact portion between the electric conductor portion and the electrode can be suitably used. The multifunction synthesizer can adjust the voltage, frequency, phase and waveform parameters necessary to generate at least one electrical signal in the present invention. The electrode is placed on the capturing part in the flow path, and does not necessarily have to be exposed on the surface of the substrate, and may be disposed inside. For example, a plate electrode is selected as one form. As described above, the electrode material is a material made of a material having higher conductivity than the surroundings, and the electrode is insulated. The electrode is preferably made of metal. More preferably, it is selected from gold, platinum, chromium, titanium and ITO (indium-tin-oxide). The electrode is formed on the solid substrate by any one of sputtering, vapor deposition, and plating. Here, for example, when gold is selected as the electrode material on the outermost surface, the bonding force between the gold and the substrate is weak, so in order to improve the bonding force between them, a metal thin film such as chromium, titanium, tungsten or the like was formed. Thereafter, a gold film is formed by sputtering, vapor deposition, plating, or the like. The electrodes can be formed using other methods commonly used to form electrodes, such as photolithography and lift-off methods. Furthermore, when the electrodes are arranged on a solid substrate as flat electrodes, the electrodes need only exist independently in the flow path, and the periphery is covered with an insulating thin film such as a resist after coating a conductive material such as metal on the entire surface. The desired shape may be exposed by partitioning and used as an electrode.
本発明の態様に従うと、捕捉手段を有した電極が配置された装置が提供される。当該装置は電極を適切な位置に配置することで少なくとも１種類の微粒子を所望の位置に捕捉および配列できる。さらに、捕捉のための印加手段および印加電圧の条件を時間的に制御することで、使用者は所望の位置に複数種類の微粒子を配置できる。 According to an aspect of the invention, an apparatus is provided in which an electrode with capture means is arranged. The apparatus can capture and arrange at least one kind of fine particles at a desired position by arranging the electrodes at appropriate positions. Furthermore, the user can place a plurality of types of fine particles at desired positions by temporally controlling the conditions of the application means and applied voltage for capturing.
本発明の態様に従うと、微粒子は底面部の固体基板表面に配列される。微粒子の捕捉力としては、電界強度の強い方向に働く正の誘電泳動力または電界強度の弱い方向に働く負の誘電泳動力の少なくとも一方を任意に選択する。微粒子捕捉は微粒子を溶解または懸濁させた溶媒中で行なわれる。ここに、溶媒の種類は制限されないが、その後に細胞を培養することを考慮すると水系の液状媒体が好ましく用いられる。ここで更に好ましくは電気伝導率が６×１０-8Ｓ／ｃｍ以下に調整された脱イオン水、または脱イオン水を主媒体とする組成液が好ましく用いられる。 According to the embodiment of the present invention, the fine particles are arranged on the surface of the solid substrate in the bottom portion. As the fine particle capturing force, at least one of a positive dielectrophoretic force acting in a direction where the electric field strength is strong and a negative dielectrophoretic force acting in a direction where the electric field strength is weak is arbitrarily selected. Fine particle capture is performed in a solvent in which fine particles are dissolved or suspended. Here, the type of the solvent is not limited, but an aqueous liquid medium is preferably used in consideration of culturing cells thereafter. More preferably, deionized water whose electrical conductivity is adjusted to 6 × 10 −8 S / cm or less or a composition liquid containing deionized water as a main medium is preferably used.
本発明の態様に従うと、誘電泳動力の発生手段として捕捉領域で印加せられる電気信号は高周波数帯の正弦交流波である。ここで高周波数の範囲は１０ｋＨｚ〜１００ＭＨｚの周波数帯域にあるものを指す。本発明においては微小空間内へのジュール熱や装置への影響を考慮すると１００ｋ〜１０ＭＨｚの範囲で行なわれるのが好ましい。また、その際に印加する電圧は１〜１０Ｖの範囲から選ばれる。 According to an aspect of the present invention, the electrical signal applied in the capture region as a means for generating dielectrophoretic force is a high frequency sine AC wave. Here, the high frequency range refers to that in the frequency band of 10 kHz to 100 MHz. In the present invention, considering the Joule heat in the minute space and the influence on the apparatus, it is preferably performed in the range of 100 k to 10 MHz. Moreover, the voltage applied in that case is selected from the range of 1-10V.
（固体基板に固定される微粒子）
本発明において誘電泳動力による捕捉が行なわれる場合、用いられる微粒子は望ましくは誘電体から選択される。ここで言う誘電体とは、電界を加えると誘電分極を生ずる物質を言い、一般的には絶縁体として理解される物質である。本発明における誘電体微粒子の材質は例えば、合成ポリマー，分解性のポリマー，ガラス類等の中から選択される。ここで言う分解性のポリマーとは種々の酵素反応や外部的な刺激等によって時間変化とともに構造が崩壊する性質を有するものを言う。分解性のポリマーを基材として用いた分解性微粒子は細胞に対して非毒性であるが、幾つかの場合において、該微粒子が細胞の接着，細胞増殖，細胞分化，生存，細胞未分化状態の維持，細胞分化状態の制御，細胞死の誘導等に有用な薬剤を含むことができる。当該薬剤として、例えば分化制御因子または抗微生物剤が挙げられる。分解性微粒子は、該微粒子の崩壊により、コートする基材の表面から放出できる生物学的に活性な薬剤を含むことができる。
(Fine particles fixed on solid substrate)
In the present invention, when capturing by dielectrophoretic force is performed, the fine particles used are preferably selected from dielectrics. The dielectric as used herein refers to a substance that generates dielectric polarization when an electric field is applied, and is generally a substance understood as an insulator. The material of the dielectric fine particles in the present invention is selected from, for example, synthetic polymers, degradable polymers, glasses and the like. The degradable polymer mentioned here refers to a polymer having a property that its structure collapses with time due to various enzyme reactions or external stimuli. Degradable microparticles using a degradable polymer as a substrate are non-toxic to cells, but in some cases the microparticles are in a state of cell adhesion, cell proliferation, cell differentiation, survival, cell undifferentiated state. Agents useful for maintenance, control of cell differentiation state, induction of cell death, and the like can be included. Examples of the drug include differentiation regulators and antimicrobial agents. The degradable microparticles can include a biologically active agent that can be released from the surface of the substrate to be coated by the collapse of the microparticles.
更に具体的には、例えば誘電体微粒子の材質としての合成ポリマーはポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）等から選択される。誘電体微粒子の材質としての分解性のポリマーは、例えばデキストラン、ポリ乳酸、ポリ（乳酸・グリコール酸）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリアルケン無水物、ポリペプチド、ポリ酸無水物およびポリエステル（ポリヒドロキシアルカノエート）等から選択される。誘電体微粒子の材質としてのガラス類としては制御された多孔質ガラス（ＣＰＧ）およびシリカ（非多孔質ガラス）を包含するガラス等の中から適宜選択される。さらに例えば酸化チタンを含有するセラミック等からも選択され得る。 More specifically, for example, the synthetic polymer as the material of the dielectric fine particles is selected from polymethyl methacrylate, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyamide, polyester, polyvinylidene difluoride (PVDF) and the like. Examples of the degradable polymer as the material of the dielectric fine particles include dextran, polylactic acid, poly (lactic acid / glycolic acid) copolymer, polycaprolactone, polyorthoester, polyalkene anhydride, polypeptide, polyanhydride and polyester. (Polyhydroxyalkanoate) or the like. The glass as the material of the dielectric fine particles is appropriately selected from controlled porous glass (CPG) and glass including silica (non-porous glass). Further, for example, it may be selected from ceramics containing titanium oxide.
本発明の分解性微粒子の基材として生分解性ポリマーを用いる場合の実施形態を以下に説明する。生分解性ポリマーは滅菌処理が可能な、非毒性および生分解性である物質から形成される。ここで言う滅菌処理とはオートクレーブ，アルコール，ＵＶ，プラズマ等による処理工程のことを示す。本発明の態様における生分解性ポリマーには、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の微粒子の基材として用いる生分解性ポリマーとして、好ましくはポリ（α−ヒドロキシ酸）を用いる。特に好ましくは、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドもしくはグリコール酸とのコポリマー、またはＤ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマーを用いる。Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドもしくはグリコール酸とのコポリマーとして、例えば、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−グルコリド）（「ＰＬＧ」）またはポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−グリコール酸）（「ＰＬＧＡ」）が挙げられる。 An embodiment in which a biodegradable polymer is used as the base material of the degradable fine particles of the present invention will be described below. Biodegradable polymers are formed from non-toxic and biodegradable materials that can be sterilized. As used herein, sterilization refers to a treatment process using autoclave, alcohol, UV, plasma, or the like. Biodegradable polymers in aspects of the present invention include, but are not limited to, poly (α-hydroxy acid), polyhydroxybutyric acid, polycaprolactone, polyorthoester, polyanhydride. As the biodegradable polymer used as the base material of the fine particles of the present invention, poly (α-hydroxy acid) is preferably used. Particularly preferably, poly (lactide) (“PLA”) or a copolymer of D, L-lactide and glycolide or glycolic acid or a copolymer of D, L-lactide and caprolactone is used. As a copolymer of D, L-lactide and glycolide or glycolic acid, for example, poly (D, L-lactide-co-glycolide) (“PLG”) or poly (D, L-lactide-co-glycolic acid) (“ PLGA ").
生分解性ポリマーを基材とする微粒子は、種々の分子量、そしてＰＬＧのようなコポリマーの場合、所望の分解時間に応じた任意のラクチド：グリコリド比を有する。一般に５０：５０（ラクチド：グリコシド：％）である場合に比べて６０：４０，８０：２０と変化させることによって高い分解速度を得ることができ、一方で４０：６０，２０：８０と変化させることによって低い分解速度を得ることになる。この性質は増加及び減少したラクチドに依存して変化させ得る。種々のラクチド：グリコリド比を有するＰＬＧポリマーの入手は容易であり、例えば和光純薬社，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社等から入手できる。本発明の微粒子に用いる生分解性ポリマーは機械的な強度は必要ないため５００００程度の分子量（数平均）を有するポリマーであってよい。 Microparticles based on biodegradable polymers have different lactide: glycolide ratios depending on the various molecular weights and, in the case of copolymers such as PLG, depending on the desired degradation time. In general, it is possible to obtain a high degradation rate by changing the ratio to 60:40, 80:20 as compared with the case of 50:50 (lactide: glycoside:%), while changing to 40:60, 20:80. A low degradation rate. This property can be varied depending on the increased and decreased lactide. It is easy to obtain PLG polymers having various lactide: glycolide ratios, for example, from Wako Pure Chemicals, Birmingham Polymers, etc. Since the biodegradable polymer used for the fine particles of the present invention does not require mechanical strength, it may be a polymer having a molecular weight (number average) of about 50,000.
本発明の態様に従うと、本発明で用いられる微粒子は直径が１０００ ｎｍ以上５００００ ｎｍ以下の範囲の球体であることが好ましい。更に直径の他に以下の少なくとも１つに特徴を備えていても良い。（１）材質または表面置換基に特徴を有するもの，（２）除放性を有するもの。 According to the embodiment of the present invention, the fine particles used in the present invention are preferably spheres having a diameter in the range of 1000 nm to 50000 nm. Further, in addition to the diameter, at least one of the following features may be provided. (1) Those having characteristics in materials or surface substituents, (2) Those having release characteristics.
（１）は細胞もしくは細胞外マトリックス蛋白質の接着を促進する機能を有している材質もしくは表面置換基を有する微粒子群である。この微粒子群は、例えば、疎水性材質のもの、又は細胞接着性置換基表面、細胞外マトリックス蛋白質、細胞表面提示抗体、細胞表面提示抗原、特定の細胞膜受容体蛋白質と特異的に結合するリガンドもしくは多糖類と結合する蛋白質、を有するものから選択される。更に１つの態様においては疎水性材質とはポリスチレン等のプラスチック微粒子から選ばれる。また、細胞接着性置換基表面を有するものとは結合対象となる細胞の足場蛋白質や架橋剤の構成により適当に選択され、例えばカルボニル基，チオール基，アルデヒド基，またはアミノ基表面から選ばれる。アルデヒド基を有する微粒子を用いることで細胞の足場蛋白質またはアミンに固定化させるために用いることができるし、アミノ基を有する微粒子を用いることで固体基板上に様々な反応性部分を介して固定化することができる。例えばハプテン及びスクシンイミド基およびイソチオシアネート、または細胞の足場たんぱく質のカルボン酸にカップリングするために使用できる。 (1) is a group of fine particles having a material or surface substituent having a function of promoting adhesion of cells or extracellular matrix proteins. This fine particle group is, for example, of a hydrophobic material, or a cell-adhesive substituent surface, an extracellular matrix protein, a cell surface-presenting antibody, a cell surface-presenting antigen, a ligand that specifically binds to a specific cell membrane receptor protein, or Selected from those having a protein that binds to polysaccharides. In one embodiment, the hydrophobic material is selected from plastic fine particles such as polystyrene. Moreover, what has a cell-adhesive substituent surface is appropriately selected depending on the structure of the cell scaffold protein or cross-linking agent to be bound, and is selected from, for example, a carbonyl group, thiol group, aldehyde group, or amino group surface. It can be used to immobilize cell scaffolding proteins or amines by using microparticles with aldehyde groups, and it can be immobilized on solid substrates via various reactive moieties by using microparticles with amino groups. can do. For example, it can be used to couple to carboxylic acids of hapten and succinimide groups and isothiocyanates, or cellular scaffolding proteins.
（２）は細胞機能を制御し得る薬剤を内に含むもので、さらに外殻を構成する物質が除放（タイムリリース）能を有すること高分子であることを特徴とする。ここで言う薬剤とは生物学的に活性な化合物であれば良い。当該薬剤は、例えば抗生物質，防腐剤，酵素阻害剤，解熱剤，消炎剤，増殖因子，抗増殖因子，トランキライザー，サイトカイン，ホルモン，ステロイド，エストロゲン，酵素，抗原，抗体，ペプチドの中から選択される。微粒子は、例えばＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社，Ｍｏｒｉｔｅｘ社，ＤＹＮＡＬ ＢＩＯＴＥＣＨ社，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，および大日精化社等から市販で入手できる。 (2) contains a drug capable of controlling cell function, and the substance constituting the outer shell has a release (time release) ability and is a polymer. The drug referred to here may be a biologically active compound. The drug is selected from, for example, antibiotics, antiseptics, enzyme inhibitors, antipyretics, anti-inflammatory agents, growth factors, anti-proliferative factors, tranquilizers, cytokines, hormones, steroids, estrogens, enzymes, antigens, antibodies, peptides . The fine particles are commercially available from, for example, Cayman Chemical Company, Polysciences, Moritex, DYNAL BIOTECH, Invitrogen, and Dainichi Seika.
（微粒子の前処理）
本発明の態様において当該微粒子へ機能を付加する目的や当該微粒子を固体基板表面へ固定化する目的を達成するために、固体基板に固定化する前に当該微粒子に対して前処理を行なうことができる。ここで言う前処理とは当該微粒子への置換基の導入，当該微粒子への物質の導入，当該微粒子への被覆または当該微粒子への薬剤の封入等のことである。上記の前処理を行なうに当たっては界面重合法、懸濁重合法、乳化重合法、ｉｎ−ｓｉｔｕ重合法、コアセルベーション（相分離）法、液中乾燥法、等の化学的方法を適用することができる。界面重合法とは２種のモノマーもしくは反応物を分散相と連続相に別々に溶解しておき、両者の界面においてモノマーを重合させて壁膜を形成させる方法である。懸濁重合法とは、水性媒体中で芯物質をモノマー中に分散し、次いで系の温度を上昇することで壁膜を形成させる方法である。乳化重合法とは、界面活性剤を溶解した水媒体中に水不溶のモノマーを添加して攪拌し、乳化剤のミセルにモノマーを取り込ませ、ミセル内でモノマーを重合して壁膜を形成させる方法である。ｉｎ−ｓｉｔｕ重合法とは、液体または気体のモノマーと触媒もしくは反応性の物質２種を連続相核粒子側のどちらか一方から供給して反応を起こさせ壁膜を形成させる方法である。コアセルベーション（相分離）法とは、芯物質粒子を分散している高分子溶液を高分子濃度の高い濃厚相と希薄相に分離させ、壁膜を形成させる方法である。液中乾燥法とは、芯物質を壁膜物質の溶液に分散した液を調製し、この分散液の連続相が混和しない液中に分散液を入れて複合エマルションとし、壁膜物質を溶解している媒質を徐々に除くことで壁膜を形成させる方法である。
(Pretreatment of fine particles)
In an embodiment of the present invention, in order to achieve the purpose of adding a function to the fine particles and the purpose of immobilizing the fine particles on the surface of the solid substrate, the fine particles may be pretreated before being immobilized on the solid substrate. it can. The pretreatment referred to here includes introduction of a substituent into the fine particle, introduction of a substance into the fine particle, coating on the fine particle, encapsulation of a drug in the fine particle, and the like. In performing the above pretreatment, chemical methods such as interfacial polymerization method, suspension polymerization method, emulsion polymerization method, in-situ polymerization method, coacervation (phase separation) method, in-liquid drying method, etc. should be applied. Can do. The interfacial polymerization method is a method in which two types of monomers or reactants are separately dissolved in a dispersed phase and a continuous phase, and the monomers are polymerized at the interface between the two to form a wall film. The suspension polymerization method is a method of forming a wall film by dispersing a core substance in a monomer in an aqueous medium and then raising the temperature of the system. The emulsion polymerization method is a method in which a water-insoluble monomer is added to an aqueous medium in which a surfactant is dissolved and stirred, the monomer is taken into the micelle of the emulsifier, and the monomer is polymerized in the micelle to form a wall film. It is. The in-situ polymerization method is a method in which a liquid or gas monomer and a catalyst or two kinds of reactive substances are supplied from either one of the continuous phase core particles to cause a reaction to form a wall film. The coacervation (phase separation) method is a method in which a polymer solution in which core material particles are dispersed is separated into a dense phase and a dilute phase having a high polymer concentration to form a wall film. In the liquid drying method, a liquid in which a core material is dispersed in a solution of a wall membrane material is prepared, and the dispersion is put into a liquid in which the continuous phase of this dispersion is not miscible to form a composite emulsion to dissolve the wall membrane material. In this method, the wall film is formed by gradually removing the medium.
上記の１つの態様として、微粒子表面へ抗体分子を導入する際の前処理に関しては、微粒子を分散させた懸濁溶液中で高濃度の所望の抗体溶液をスターラー等で攪拌させた状態で接触させることで実現される。微粒子当たりに導入された置換基等の決定には、免疫蛍光フローサイトメトリー法や一般的な蛋白質定量法として公知の方法によって行なうことができる。具体的にはＬｏｗｒｙ法，Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎａｔｅ（ＢＣＡ）法，Ｂｉｕｒｅｔ法，Ｂｒａｄｆｏｌｄ法等の比色法を適宜用いることができる。蛋白質定量法に関しては各社から市販の測定キットが市販されておりＳＥＲＶＡ社，ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社，同仁化学社等から購入できる。更に別の１つの態様として、内部に薬剤を含む分解性のポリマーの合成方法は一般的には、Ｗ／Ｏ／Ｗ（Ｗａｔｅｒ ｉｎ Ｏｉｌ ｉｎ Ｗａｔｅｒ）型エマルション法、Ｏ／Ｗ（Ｏｉｌ ｉｎ Ｗａｔｅｒ）型エマルション法等によって調製することができる。具体的にはラクチドまたはラクチド―グリコシド共重合体をクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、そこへ薬剤を含む水溶液を添加して乳化させ、Ｗ／Ｏ型エマルションを得る。その後減圧条件下での蒸発等により、有機溶剤を除去することにより、微小球状の沈澱物を生成させ、必要に応じて回収及び乾燥を行い、分解性の薬剤を含有する微粒子を調製することができる。 As one aspect of the above, regarding the pretreatment when antibody molecules are introduced to the surface of the fine particles, the desired antibody solution having a high concentration is brought into contact in a suspension solution in which the fine particles are dispersed while being stirred with a stirrer or the like. This is realized. Substituents introduced per fine particle can be determined by methods known as immunofluorescence flow cytometry methods and general protein quantification methods. Specifically, a colorimetric method such as a Lowry method, a Bicintonate (BCA) method, a Biuret method, or a Bradfold method can be used as appropriate. Regarding the protein quantification method, commercially available measurement kits are commercially available from various companies, and can be purchased from SERVA, INVITROGEN, Dojindo, and the like. As yet another aspect, a method for synthesizing a degradable polymer containing a drug inside is generally a W / O / W (Water in Oil in Water) type emulsion method, O / W (Oil in Water). It can be prepared by a mold emulsion method or the like. Specifically, lactide or a lactide-glycoside copolymer is dissolved in an organic solvent such as chloroform, and an aqueous solution containing a drug is added thereto and emulsified to obtain a W / O type emulsion. After that, by removing the organic solvent by evaporation under reduced pressure, etc., a microspherical precipitate is generated, and if necessary, collected and dried to prepare fine particles containing a degradable drug. it can.
（微粒子の固定化方法）
本発明の態様に従うと、微粒子を固定化させるための手段は、前記の微粒子が保持力によって捕捉部に留め置かれている途中もしくはその直後に行なうことが望ましい。上記何れの場合も微粒子が目的の領域に配列している状態で行なわれる。固体基板と微粒子との固定化方法は種類および特性に応じて、それ自身公知の方法を用いて行ってよい。例えば、結合および相互作用を介した固定化，熱を利用した固定化，生化学反応を利用した固定化等の中から選択される。ここで言う結合とは共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、ファン・デル・ワールス結合等の少なくとも１つから選択される結合を介して固体基板表面に微粒子が固定化されることを意味する。本発明の態様においてより好ましくは共有結合が好ましく形成される。固体基板表面への微粒子の結合は分子のカップリングによって行なわれるものである。当該結合は、固体基板表面と微粒子表面の両者の置換基が直接的に結合される構成、または適当なクロスリンカー（架橋剤）による結合を介して両者が間接的に結合される構成のいずれかの形から選択される。微粒子がクロスリンカーを介して固体基板表面に結合される場合、該微粒子表面または固体基板表面を予めクロスリンカーでコートしておくことも出来る。目的に応じて様々なクロスリンカーが適宜選択される。例えば微粒子及び固体基板上に導入されたアミノ残基により微粒子を固定化する場合には両末端にスクシンイミド基，アルデヒド基，またはマレイミド基を有するクロスリンカー等を選択する。様々な置換基を活性化するクロスリンカーは同仁化学社，ＰＩＥＲＣＥ社等から入手可能である。相互作用を介した固定化とは、非化学的相互作用（例えば疎水性相互作用）を介して固体基板表面に微粒子が固定化されることを意味する。更に詳しくは化学吸着を利用した固定化とは例えば表面置換基や架橋剤を介する化学的な架橋を利用した固定化を指す。また、熱を利用した固定化とは例えばアニールによる固定化を指す。また生化学反応とは例えばストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、プロテインＡ、ＩｇＧ抗体等を介する免疫抗体反応を指す。更にこれらの変性微粒子はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社等から購入することが可能である。
(Fixing method of fine particles)
According to the aspect of the present invention, it is desirable that the means for immobilizing the fine particles is performed during or immediately after the fine particles are retained on the capturing portion by the holding force. In either case, the process is performed in a state where the fine particles are arranged in the target region. The method for immobilizing the solid substrate and the fine particles may be performed using a method known per se according to the type and characteristics. For example, it is selected from immobilization via binding and interaction, immobilization using heat, immobilization using biochemical reaction, and the like. The term “bond” as used herein means that fine particles are immobilized on the surface of a solid substrate through a bond selected from at least one of a covalent bond, an ionic bond, a coordination bond, a hydrogen bond, a van der Waals bond, and the like. means. In the embodiment of the present invention, a covalent bond is preferably formed. The fine particles are bonded to the surface of the solid substrate by molecular coupling. The bond is either a structure in which substituents on both the solid substrate surface and the fine particle surface are directly bonded, or a structure in which both are indirectly bonded through a bond with an appropriate crosslinker (crosslinking agent). Selected from the shapes. When the fine particles are bonded to the surface of the solid substrate via a cross linker, the surface of the fine particles or the surface of the solid substrate can be coated with a cross linker in advance. Various crosslinkers are appropriately selected depending on the purpose. For example, when the fine particles are immobilized by the fine particles and amino residues introduced on the solid substrate, a crosslinker having a succinimide group, an aldehyde group, or a maleimide group at both ends is selected. Crosslinkers that activate various substituents are available from Dojindo, PIERCE, and the like. Immobilization via interaction means that fine particles are immobilized on the surface of a solid substrate via non-chemical interaction (for example, hydrophobic interaction). More specifically, immobilization utilizing chemical adsorption refers to immobilization utilizing chemical cross-linking via, for example, a surface substituent or a cross-linking agent. Also, immobilization using heat refers to immobilization by annealing, for example. The biochemical reaction refers to an immune antibody reaction via, for example, streptavidin, avidin, biotin, protein A, IgG antibody and the like. Furthermore, these modified fine particles can be purchased from Invitrogen.
（基板表面の前処理）
本発明の態様に従うと本発明において、細胞は固体基板上に固定化された微粒子表面に接着することで、細胞機能に影響を受け得る。そのため、細胞と接触しない領域または意図的に接触させたくない領域に対して予め細胞を接着させないための前処理を行なっても良い。ここで言う細胞と接触しない領域とは例えば、微粒子が固定化されない部分，固体基板表面全面，微粒子を捕捉する電極パターン形状等を指す。細胞を微粒子表面に選択的に接着させたい場合には予め固定基板担体表面の所望の領域に細胞足場蛋白質の非特異的な吸着を制御し得る物質で処理をしておくことが可能である。その際に用いられる物質は一般にブロッキング剤として知られている物質を用いれば良く、被検対象でない蛋白質の当該基材上への非特異的な吸着の防止、展開の容易性、並びに固定化した特異的結合物質の保存安定性の観点から、公知の方法に従ってブロッキング剤、界面活性剤及び所望により糖を含有する溶液に浸漬し、乾燥して用いるのが好ましい。ここで、使用するブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール，リン脂質およびそれらを含む化合物等の中から選択される。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン，オクチルフェニルエーテル，ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート，ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等が挙げられる。糖としては、サッカロース、トレハロース，ヘパリン，低分子ヘパリン等が挙げられる。なお、前記処理液中のブロッキング剤の含有量は、好ましくは０．１〜１０重量％である。前記処理液中の界面活性剤の含有量は、好ましくは０．０１〜１重量％である。前記処理液中の糖の含有量は、好ましくは０．１〜１０重量％である。
(Pretreatment of substrate surface)
According to an embodiment of the present invention, in the present invention, cells can be affected by cell function by adhering to the surface of fine particles immobilized on a solid substrate. Therefore, pretreatment may be performed in advance to prevent cells from adhering to a region that does not contact cells or a region that is not intentionally contacted. The region that does not come into contact with the cells here refers to, for example, a portion where the fine particles are not immobilized, the entire surface of the solid substrate, an electrode pattern shape for capturing the fine particles, and the like. In order to selectively adhere cells to the surface of the fine particles, it is possible to previously treat a desired region on the surface of the fixed substrate carrier with a substance capable of controlling nonspecific adsorption of the cell scaffold protein. The substance used at that time may be a substance generally known as a blocking agent, which prevents nonspecific adsorption of non-tested protein on the substrate, ease of development, and immobilization. From the viewpoint of the storage stability of the specific binding substance, it is preferable to use it by immersing it in a solution containing a blocking agent, a surfactant and optionally a sugar and drying it according to a known method. Here, the blocking agent to be used is selected from bovine serum albumin, casein, gelatin, skim milk, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyethylene glycol, phospholipid and compounds containing them. Examples of the surfactant include polyoxyethylene, octylphenyl ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene alkyl allyl ether phosphate, polyoxyethylene alkyl ether phosphate, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, and the like. It is done. Examples of the sugar include saccharose, trehalose, heparin, low molecular weight heparin and the like. The content of the blocking agent in the treatment liquid is preferably 0.1 to 10% by weight. The content of the surfactant in the treatment liquid is preferably 0.01 to 1% by weight. The sugar content in the treatment liquid is preferably 0.1 to 10% by weight.
以下、実施例を用いて本発明の実施形態を示すが本発明を限定することを意図するものではない。 Hereinafter, although an embodiment of the present invention is shown using an example, it is not intended to limit the present invention.
本発明の態様に従うと、本例において微粒子によって固体基板上に形成される表面トポグラフィは細胞の接着に影響を与える程度の大きさを備えるものであることが望ましい。細胞は種類によって様々な大きさを有するが、おしなべて１０〜１００μｍの範囲にあり、かつ流路の高さが１００μｍ程度の高さである。これらから、微粒子は直径が１０００ ｎｍ以上５００００ ｎｍ以下の範囲に含まれる大きさを有する微粒子群の中から選択されることが望ましい。 According to the aspect of the present invention, it is desirable that the surface topography formed on the solid substrate by the fine particles in this example has a size that affects the adhesion of cells. Although the cells have various sizes depending on the type, the cells are generally in the range of 10 to 100 μm, and the height of the channel is about 100 μm. From these, it is desirable that the fine particles are selected from a group of fine particles having a size within a range of 1000 nm to 50000 nm.
＜固体基板表面への微粒子の固定化の評価＞
固体基板表面に微粒子を固定化するに当たって、その固定化の強さを比較するために結合を利用した固定化、物理的な相互作用を用いた固定化を利用して下記の実施例に示す方法に従って構造体の作製を行なう。さらに誘電泳動以外の手法を用いて微粒子の固定化を比較例に示す方法に従って行い、評価する。
<Evaluation of immobilization of fine particles on solid substrate surface>
In immobilizing fine particles on the surface of a solid substrate, in order to compare the strength of the immobilization, the method shown in the following examples using immobilization using binding and immobilization using physical interaction The structure is manufactured according to the above. Furthermore, immobilization of fine particles is performed according to the method shown in the comparative example using a method other than dielectrophoresis, and is evaluated.
（実施例１）
本発明の細胞固定用基板の製造に用いる装置は、図１に示したように流路の内部に微粒子を捕捉する捕捉部３を備える構造となっている。流路は天井部６と底面部７を構成する２枚の基板、および高さを規定しかつ側壁を構成するためのスペーサ８とによって形成される。天井部および底面部を構成する基板は、例えばガラス、シリコン、ポリスチレン等のプラスチック類およびＰＤＭＳポリマー類等の絶縁性物質を用いて形成することが可能である。スペーサ８は、例えばガラス、テフロン等の高分子材料、その他の好適材料から製造される。また、流路を構成する材料は流通させる溶液に浸食されない物質で、かつ顕微鏡で流路内が観察可能な透明な材質が選択されることが好ましい。本実施例では天井部および底面部は共にスライドガラス（ｍａｔｓｕｎａｍｉ）を選択した。前記の２枚の基板をスペーサ８で挟み込み、さらに天井部に流入口１，排出口２およびシリンジポンプ等の液体流通装置を取り付けることにより流路となる。流通装置には特に制限はなく、例えばシリンジポンプ，ペリスタポンプ等から選択される。天井部６と底面部７との間隙を決するスペーサ８の厚みは微粒子，細胞またはその両方のサイズに依存する。本発明の方法を実施するためには当該間隙の高さは１ ｍｍを下回ることが好ましい。更に好ましくは５０ 〜 ５００μｍの範囲の厚みである。本実施例においては厚さが９０ μｍのスペーサを用いた。微粒子の捕捉は捕捉部３で行われ、本発明においては流路内に配置した平板電極で発生させた誘電泳動力を用いる。本実施例では天井部および底面部の捕捉部３にアレイ電極４および５を配置して正の誘電泳動力により微粒子を捕捉する。平板電極の材料には、チタニウムを下地に金を用いる。天井部の電極５はガラス基板上の捕捉部３内にチタニウムおよび金を各５ ｎｍ，４０ ｎｍずつ蒸着法により成膜して完成する。底面部の電極４の形成は、まずガラス基板上の捕捉部３内にチタニウムおよび金を各５ ｎｍ、４０ ｎｍずつ蒸着法により成膜する。さらにその後一般的なフォトリソグラフィーによって直径１００ μｍのホール状の孔を有するレジストパターン（厚さ１．５ μｍ）を作製し、電解めっき法によりホール内のレジストの高さに及ぶまで金をめっきする。
(Example 1)
As shown in FIG. 1, the apparatus used for manufacturing the cell fixing substrate of the present invention has a structure including a capturing
１２０℃でベークすることにより基板とレジストとの密着性を高めた後、最後に全面に二酸化ケイ素を蒸着法により成膜して作製する。その後両基板は有機系溶剤，アルコール系溶剤，水系溶剤，脱イオン水で順に洗浄を行ない、使用する直前まで脱イオン水中で保管した。天井部および底面部はスペーサ―を介して互いに孤立しているため、電気的に絶縁されている。天井部および底面部はそれぞれ銀ペースト（アサヒ化学研究所）により電気的にリード９に接合させる。さらにリードはマルチファンクションシンセサイザ１０（ｎｆ ｃｏｒｐ．）に接続されている。本実施例においては底面部基板７表面を酸素プラズマによりクリーニングし、アミノプロピルトリエトキシシラン（信越シリコーン）を用いて基板表面にアミノ基を導入する。ここで更にアレイ状に配置した電極４上にのみ選択的にアミノ基を導入されていても良い。具体的にはリフトオフ法またはステンシルを用いた方法等により固体基板表面の電極上に選択的にアミノ基を導入する方法等が選択される。固体基板とシラン化合物との反応は有機系溶媒中に静置することによって行なわれる。この際に用いられる有機系溶剤は親油的なもので鎖長の長いアルカン，例えばデカン，ヘキサデカンまたはベンゼン溶液等の溶媒から選択される。さらにアミノ基を介してスクシンイミド基末端（ＮＨＳ）を有するビオチン（ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ， ＶＥＣＴＯＲ ｌａｂ．）を固定化し、固体基板表面をビオチン化する。本実施例で用いられる微粒子は表面にストレプトアビジンが被覆されている直径２０ μｍのポリマー微粒子（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）、溶媒には脱イオン水を用いた。流路内に微粒子の懸濁水溶液を導入しマルチファンクションシンセサイザを用いて印加周波数を２ ＭＨｚ、 印加電圧を±５ Ｖの正弦交流波を５分間印加することにより、正の誘電泳動力を発生させ、底面部の電極上に微粒子を捕捉する。懸濁水溶液中の微粒子濃度は１×１０6 ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ／ ｍＬである。
After the adhesion between the substrate and the resist is improved by baking at 120 ° C., silicon dioxide is finally formed on the entire surface by vapor deposition. Thereafter, both substrates were sequentially washed with an organic solvent, an alcohol solvent, an aqueous solvent, and deionized water, and stored in deionized water until immediately before use. Since the ceiling and the bottom are isolated from each other via a spacer, they are electrically insulated. The ceiling part and the bottom part are electrically joined to the lead 9 by silver paste (Asahi Chemical Research Laboratory). Furthermore, the lead is connected to a multifunction synthesizer 10 (nf corp.). In this embodiment, the surface of the
図３に正の誘電泳動力によって底面部に捕捉された微粒子の模式図を示す。底面部の電極によって捕捉された微粒子はさらにビオチン−ストレプトアビジンの結合により固体基板表面に固定化される。その後基板表面をクリーンベンチ内にて室温下で３０分間静置する。微粒子表面はさらに細胞外蛋白質等をコーティングすることによって細胞接着を促す工夫をすることができる。具体的には末端がビオチンで修飾された抗フィブロネクチン抗体（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて微粒子表面と反応させる。さらにビオチンが導入された微粒子表面に細胞外基質蛋白質であるフィブロネクチン水溶液を接触させることで微粒子表面をフィブロネクチンによってコーティングして、細胞固定化用の微粒子固定化基板を作製することができる。各工程の間には余剰な未反応の物質を基板表面から取り除くために、脱イオン水を送液することで十分に洗浄をしてから次の工程へと進んだ。 FIG. 3 shows a schematic diagram of fine particles captured on the bottom surface portion by a positive dielectrophoretic force. The fine particles captured by the bottom electrode are further immobilized on the surface of the solid substrate by biotin-streptavidin binding. Thereafter, the substrate surface is left in a clean bench at room temperature for 30 minutes. The surface of the fine particles can be further devised to promote cell adhesion by coating with extracellular proteins or the like. Specifically, an anti-fibronectin antibody (INVITROGEN) whose end is modified with biotin is used to react with the surface of the fine particles. Furthermore, a fine particle-immobilized substrate for cell immobilization can be produced by coating the surface of the fine particle with fibronectin by bringing a fibronectin aqueous solution, which is an extracellular matrix protein, into contact with the fine particle surface into which biotin has been introduced. In order to remove excess unreacted substances from the surface of the substrate during each step, the deionized water was sufficiently fed to perform cleaning and then proceeded to the next step.
（実施例２）
固体基板への微粒子の固定化方法以外は実施例１と同じ工程により細胞固定用基板を製造した。また、実施例１と同様の電極構成で正の誘電泳動力を用いて微粒子の配列を行なった。微粒子は表面の相互作用を用いて固定化した。本実施例で用いた固定化基板はスライドガラスを用いて、有機系溶剤，水系溶剤，およびプラズマ洗浄で処理したものを用いる。スライドガラスにスパッタリング，フォトリソグラフィーおよびリフトオフ法により金の平板電極を構築する。オクタデシルトリエトキシシラン（関東化学）を用いて電極表面にのみアルキル基を導入する。スライドガラスに目的のアルキル基が導入されているかは基板表面に微小水滴を滴下し、その際の接触角を測定することで判定する。水の接触角計測は液滴法により行なった（ＦＡＭＡＳ；協和界面科学）。具体的には材料の上から液滴を滴下し、横からＣＣＤ で液滴の観察を行い付属のソフトにより接触角を計測する。接触角の算出はθ／２法により行なう。θ／２法とは、固液界面・水平線と液滴端での接線、この２つの線がなす角を接触角とした場合に、液滴頂点と液滴端を結ぶ線がなす角（測定角）が接触角の半分（１／２） の関係になることを利用して測定角から接触角を算出する方法である。接触角は０〜１８０度の間の値で表され、表面の疎水性が高くなればその角度は大きなもの（値が１８０度に近づく）となる。基板表面へのアルキル基の導入を接触角測定により確認した後に基板をさらに有機系溶媒，水系溶媒の順に洗浄して底面部とする。電極構成および印加した電圧の条件は実施例１と同様である。微粒子には直径が１０μｍのポリスチレンを用いた。溶媒には脱イオン水を用いた。交流電圧を印加して正の誘電泳動力を発生させて微粒子の捕捉を行なう。疎水相互作用により固体基板上の電極上にポリスチレン粒子の配列・固定化を行なう。
(Example 2)
A cell immobilization substrate was produced by the same process as in Example 1 except for the method for immobilizing fine particles on a solid substrate. In addition, fine particles were arranged using a positive dielectrophoretic force with the same electrode configuration as in Example 1. The microparticles were immobilized using surface interactions. As the immobilization substrate used in this example, a glass substrate treated with an organic solvent, an aqueous solvent, and plasma cleaning is used. A gold plate electrode is constructed on a slide glass by sputtering, photolithography and lift-off. An alkyl group is introduced only on the electrode surface using octadecyltriethoxysilane (Kanto Chemical). Whether the target alkyl group is introduced into the slide glass is determined by dropping a fine water droplet on the surface of the substrate and measuring the contact angle at that time. The water contact angle was measured by the droplet method (FAMAS; Kyowa Interface Science). Specifically, a droplet is dropped from above the material, the droplet is observed from the side with a CCD, and the contact angle is measured with the attached software. The contact angle is calculated by the θ / 2 method. The θ / 2 method is the angle formed by the line connecting the droplet apex and the droplet edge when the angle between the solid-liquid interface / horizon line and the droplet edge, and the angle formed by these two lines as the contact angle (measurement) This is a method of calculating the contact angle from the measurement angle using the fact that the angle) is a half (1/2) of the contact angle. The contact angle is represented by a value between 0 and 180 degrees, and the higher the surface hydrophobicity, the larger the angle (value approaches 180 degrees). After confirming the introduction of the alkyl group to the substrate surface by contact angle measurement, the substrate is further washed in the order of an organic solvent and an aqueous solvent to form a bottom surface portion. The electrode configuration and applied voltage conditions are the same as in Example 1. As the fine particles, polystyrene having a diameter of 10 μm was used. Deionized water was used as the solvent. An AC voltage is applied to generate a positive dielectrophoretic force to capture fine particles. Polystyrene particles are arranged and immobilized on electrodes on a solid substrate by hydrophobic interaction.
（実施例３）
固体基板への微粒子の固定化方法以外は実施例１と同じ工程により細胞固定用基板を製造する。また、実施例１と同様の電極構成で正の誘電泳動力を用いて微粒子の配列を行なう。配列時の溶媒には脱イオン水を用いる。微粒子の固定化は、微粒子と固体基板表面に導入された置換基を用いて架橋剤を介して行なう。具体的には微粒子にアミノ基，固体基板表面にメルカプト基を導入したものに対して、各々に対して反応を示す架橋剤を用いて固定化を行なうものである。本実施例で用いた微粒子は表面にアミノ基が導入された直径６μｍのラテックス微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ）を用いる。金電極表面上に３―メルカプトプロピルトリエトキシシラン（信越化学）を用いてメルカプト基を導入する。その後Ｎ−（４−マレイミドブチロキシ）スクシンイミド（同仁化学）を流路内に導入して、メルカプト基とマレイミド基との反応を起こすことにより固体基板表面にスクシンイミド基を導入する。さらに実施例１と同様にして正の誘電泳動力でアミノ基を有する微粒子を捕捉する。基板表面に導入したスクシンイミド基と微粒子表面のアミノ基が反応することで固体基板上に微粒子の配列・固定化を行なう。
(Example 3)
A cell immobilization substrate is produced by the same process as in Example 1 except for the method of immobilizing fine particles on a solid substrate. In addition, fine particles are arranged using a positive dielectrophoretic force with the same electrode configuration as in Example 1. Deionized water is used as the solvent for the alignment. The fine particles are immobilized through a crosslinking agent using the fine particles and a substituent introduced on the surface of the solid substrate. Specifically, immobilization is performed using a cross-linking agent that reacts with each of those in which amino groups are introduced into fine particles and mercapto groups are introduced into the surface of a solid substrate. The fine particles used in this example are latex fine particles (Polysciences, Inc.) having a diameter of 6 μm with amino groups introduced on the surface. Mercapto groups are introduced onto the gold electrode surface using 3-mercaptopropyltriethoxysilane (Shin-Etsu Chemical). Thereafter, N- (4-maleimidobutyroxy) succinimide (Dojindo Laboratories) is introduced into the flow path, and a succinimide group is introduced onto the surface of the solid substrate by causing a reaction between the mercapto group and the maleimide group. Further, in the same manner as in Example 1, fine particles having amino groups are captured with a positive dielectrophoretic force. The succinimide group introduced on the substrate surface reacts with the amino group on the surface of the fine particle to arrange and immobilize the fine particle on the solid substrate.
（実施例４）
固体基板への微粒子の固定化方法以外は実施例１と同じ工程により細胞固定用基板を製造する。また、実施例１と同様の電極構成で正の誘電泳動力を用いて微粒子の配列を行なう。微粒子の固定化は、固体基板表面に微粒子を配列させた後に基板をアニールさせることにより粒子を固体基板表面に配列・固定化させる。本実施例で用いた微粒子は直径２０μｍのポリエチレン微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ）を用いた。溶媒には脱イオン水を用いた。作製法は実施例１と同様にして正の誘電泳動力でポリエチレン微粒子を捕捉しその後、１５０℃で１０〜３０分間アニールすることで固体基板上にポリエチレン微粒子の配列・固定化を行なう。
Example 4
A cell immobilization substrate is produced by the same process as in Example 1 except for the method of immobilizing fine particles on a solid substrate. In addition, fine particles are arranged using a positive dielectrophoretic force with the same electrode configuration as in Example 1. The fine particles are fixed by arranging and fixing the particles on the surface of the solid substrate by annealing the substrate after arranging the fine particles on the surface of the solid substrate. The fine particles used in this example were polyethylene fine particles having a diameter of 20 μm (Polysciences, Inc). Deionized water was used as the solvent. In the same manner as in Example 1, polyethylene fine particles are captured with a positive dielectrophoretic force and then annealed at 150 ° C. for 10 to 30 minutes to arrange and immobilize the polyethylene fine particles on the solid substrate.
（比較例１）
実施例１のビオチン―ストレプトアビジン相互作用を用いた固定化法により微粒子の固定化を行う。作製した微粒子パターンは実施例１で用いた電極形状と同様の直径１００μｍのポストであり、シリコーンエラストマーのスタンプを用いて微粒子のパターンを形成させる。本比較例ではエラストマーにｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ（ＰＤＭＳ： ｓｙｌｇａｒｄ１８４， Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて、フォトリソグラフィーによりスライドガラス上にレジストパターンを形成し、鋳型とする。レジストには市販のネガレジスト（ＳＵ−８； ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）を用いてフォトリソグラフィーを行った。ＰＤＭＳのプレポリマーを鋳型に流し込み、鋳型とプレポリマーをスライドガラスで挟んだ状態で９０ ℃ １時間オーブンで加熱し、ポリマーを固化させる。その後、鋳型からＰＤＭＳを剥離しガラス等の固体平面基板に貼り付けることでＰＤＭＳスタンプを得る。なお、鋳型とスライドガラスはＰＤＭＳスタンプの剥離を容易にするために予め３，３，４，４，５，５，６，６，６−Ｎｏｎａｆｌｕｏｒｏｈｅｘｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ（信越化学）等を用いて撥水処理をしておいても良い。ＰＤＭＳスタンプを使用する前には有機系溶剤、水系溶剤で洗浄して、酸素プラズマ（８０Ｗ，３０秒）処理をしておく。スタンプ表面を上向けにして脱イオン水に懸濁させたストレプトアビジン微粒子水溶液をスタンプ表面に滴下して、室温雰囲気下で溶媒を徐々に蒸発させてスタンプ表面に微粒子を自発的にパッキングさせる。スタンプ表面が完全に乾燥してしまう前にスタンプを下向きにして、ビオチンを表面に導入した固体基板上に押し付けて湿度８０％以上および温度３０℃に制御した環境下で３時間静置してピラー部分の凸部分を転写する。その際にＰＤＭＳスタンプには変形を生じない程度の適当な圧力を印加しておく。その後、固体基板表面からＰＤＭＳスタンプを静かに剥離して微粒子パターンを形成する。
(Comparative Example 1)
The fine particles are immobilized by the immobilization method using the biotin-streptavidin interaction in Example 1. The produced fine particle pattern is a post having a diameter of 100 μm, which is the same as the electrode shape used in Example 1, and a fine particle pattern is formed using a silicone elastomer stamp. In this comparative example, a resist pattern is formed on a slide glass by photolithography using polydimethylsiloxane (PDMS: sylgard 184, Dow Corning) as an elastomer, and used as a mold. The resist was subjected to photolithography using a commercially available negative resist (SU-8; MicroChem Corp.). PDMS prepolymer is poured into a mold, and the mold and the prepolymer are sandwiched between glass slides and heated in an oven at 90 ° C. for 1 hour to solidify the polymer. Thereafter, the PDMS is peeled from the mold and attached to a solid flat substrate such as glass to obtain a PDMS stamp. In addition, the mold and the slide glass are subjected to water repellent treatment using 3,3,4,4,5,5,6,6,6-nonafluorohexylchlorosilane (Shin-Etsu Chemical) etc. You can keep it. Before using the PDMS stamp, it is cleaned with an organic solvent or an aqueous solvent, and is subjected to an oxygen plasma (80 W, 30 seconds) treatment. The aqueous solution of streptavidin fine particles suspended in deionized water with the stamp surface facing upward is dropped onto the stamp surface, and the solvent is gradually evaporated at room temperature to spontaneously pack the fine particles on the stamp surface. Before the surface of the stamp is completely dried, the stamp is faced down and pressed onto a solid substrate into which biotin is introduced. Transfer the convex part of the part. At this time, an appropriate pressure is applied to the PDMS stamp so as not to cause deformation. Thereafter, the PDMS stamp is gently peeled from the surface of the solid substrate to form a fine particle pattern.
（比較例２）
実施例２の固定化手法およびＰＤＭＳスタンプを用いた比較例１の条件下で、疎水相互作用により固体基板上の電極上にポリスチレン粒子の配列・固定化を行なう。
(Comparative Example 2)
Under the conditions of Comparative Example 1 using the immobilization technique of Example 2 and a PDMS stamp, polystyrene particles are aligned and immobilized on the electrode on the solid substrate by hydrophobic interaction.
（比較例３）
ＰＤＭＳスタンプを用いた比較例１の条件下で、実施例３と同様の固定化手法である、基板表面に導入したスクシンイミド基と微粒子表面のアミノ基との反応により微粒子の配列・固定化を行なう。
(Comparative Example 3)
Under the conditions of Comparative Example 1 using a PDMS stamp, the fine particles are arranged and fixed by the reaction between the succinimide group introduced onto the substrate surface and the amino group on the fine particle surface, which is the same immobilization technique as in Example 3. .
（比較例４）
ＰＤＭＳスタンプを用いた比較例１の条件下において、実施例４と同様の固定化手法である、１５０℃で１０〜３０分間のアニーリングによりすることで固体基板上にポリエチレン微粒子の配列・固定化を行なう。
以上の実施例１〜４および比較例１〜４の比較を行なう。以後の実施例においては実施例３によるものを用いて評価を行なう。
(Comparative Example 4)
Under the conditions of Comparative Example 1 using a PDMS stamp, the polyethylene fine particles are arrayed and immobilized on a solid substrate by annealing at 150 ° C. for 10 to 30 minutes, which is the same immobilization technique as in Example 4. Do.
The above Examples 1-4 and Comparative Examples 1-4 are compared. In the following examples, the evaluation according to Example 3 is performed.
＜細胞固定化用担体上での細胞接着性評価＞
続いて図４に示す手順に従って、正の誘電泳動力を用いて微粒子を表面に配置して更に、微粒子の上で細胞の培養を行なう。具体的には（１）微粒子の導入と交流電圧の印加、（２）正の誘電泳動力による微粒子の捕捉、（３）捕捉した微粒子の固定化、（４）細胞の導入、（５）細胞培養である。図の矢印は送液の方向を示している。なお、誘電泳動の条件および微粒子の固定化は実施例３の方法を用いて行なう。そして、様々な粒径を有する微粒子に対して細胞接着状態の観察を行なう。
<Evaluation of cell adhesion on cell immobilization carrier>
Subsequently, according to the procedure shown in FIG. 4, fine particles are arranged on the surface by using a positive dielectrophoretic force, and cells are further cultured on the fine particles. Specifically, (1) introduction of fine particles and application of AC voltage, (2) capture of fine particles by positive dielectrophoretic force, (3) fixation of captured fine particles, (4) introduction of cells, (5) cells Culture. The arrows in the figure indicate the direction of liquid feeding. The conditions of dielectrophoresis and immobilization of fine particles are performed using the method of Example 3. Then, the cell adhesion state is observed for fine particles having various particle sizes.
［微粒子径における細胞の接着状態の観察］
（実施例５）
実施例３の手法で表面置換基にアミノ基を有する直径６ μｍのラテックス微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ）を架橋剤で固定化させた細胞固定用基板上でウシ大動脈由来の内皮細胞の培養を行なう。
[Observation of cell adhesion at fine particle size]
(Example 5)
Endothelial cells derived from bovine aorta are cultured on a cell-fixing substrate on which latex microparticles (Polysciences, Inc) having a diameter of 6 μm and having amino groups as surface substituents are immobilized with a crosslinking agent by the method of Example 3.
（実施例６）
実施例３の手法で表面置換基にアミノ基を有する直径３ μｍのラテックス微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ）を架橋剤で固定化させた細胞固定用基板上でウシ大動脈由来の内皮細胞の培養を行なう。
(Example 6)
Endothelial cells derived from bovine aorta are cultured on a cell immobilization substrate on which latex microparticles (Polysciences, Inc) having a diameter of 3 μm having an amino group as a surface substituent are immobilized with a crosslinking agent by the method of Example 3.
（実施例７）
実施例３の手法で表面置換基にアミノ基を有する直径１ μｍのラテックス微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ）を架橋剤で固定化させた細胞固定用基板上でウシ大動脈由来の内皮細胞の培養を行なう。
(Example 7)
Endothelial cells derived from bovine aorta are cultured on a cell immobilization substrate on which latex microparticles (Polysciences, Inc) having a diameter of 1 μm and having an amino group as a surface substituent are immobilized with a crosslinking agent by the method of Example 3.
（実施例８）
実施例３の手法で表面置換基にアミノ基を有する直径０．７５ μｍのラテックス微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ）を架橋剤で固定化させた細胞固定用基板上でウシ大動脈由来の内皮細胞の培養を行なう。
(Example 8)
Incubation of bovine aorta-derived endothelial cells on a cell-fixing substrate on which latex fine particles (Polysciences, Inc) having an amino group as a surface substituent and having a diameter of 0.75 μm were immobilized with a crosslinking agent by the method of Example 3 Do.
（実施例９）
実施例３の手法で表面置換基にアミノ基を有する直径０．５ μｍのラテックス微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ）を架橋剤で固定化させた細胞固定用基板上でウシ大動脈由来の内皮細胞の培養を行なう。
Example 9
Incubation of bovine aorta-derived endothelial cells on a cell-fixing substrate on which latex microparticles (Polysciences, Inc) having a diameter of 0.5 μm and having amino groups as surface substituents were immobilized with a crosslinking agent by the method of Example 3 Do.
（実施例１０）
実施例３の手法で表面置換基にアミノ基を有する直径０．２ μｍのラテックス微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ）を架橋剤で固定化させた細胞固定用基板上でウシ大動脈由来の内皮細胞の培養を行なう。
(Example 10)
Incubation of bovine aorta-derived endothelial cells on a cell-fixing substrate on which latex microparticles (Polysciences, Inc) having a diameter of 0.2 μm and having amino groups as surface substituents were immobilized with a crosslinking agent by the method of Example 3 Do.
（実施例１１）
実施例３の手法で表面置換基にアミノ基を有する直径０．１ μｍのラテックス微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ）を架橋剤で固定化させた細胞固定用基板上でウシ大動脈由来の内皮細胞の培養を行なう。
(Example 11)
Incubation of bovine aorta-derived endothelial cells on a cell-fixing substrate on which latex microparticles (Polysciences, Inc) having a diameter of 0.1 μm and having amino groups as surface substituents were immobilized with a crosslinking agent by the method of Example 3 Do.
（比較例５）
スライドガラス表面にアミノプロピルトリエトキシシラン（信越化学）を用いてアミノ基を導入した平板の細胞培養基板を作製し、ウシ大動脈由来の内皮細胞の培養を行なう。
(Comparative Example 5)
A flat cell culture substrate having amino groups introduced onto the surface of a slide glass using aminopropyltriethoxysilane (Shin-Etsu Chemical) is prepared, and endothelial cells derived from bovine aorta are cultured.
（比較例６）
市販のＰＳディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ）上でウシ大動脈由来の内皮細胞の培養を行なう。
(Comparative Example 6)
Endothelial cells derived from bovine aorta are cultured on a commercially available PS dish (FALCON).
実施例５〜１１および比較例から作製された微粒子アレイ表面でウシ大動脈由来の内皮細胞の培養を行なう。細胞を播種する前に予めフィブロネクチン等の細胞外足場蛋白質で前処理を行っておくことも可能である。細胞培養液には１０ ％ウシ血清を添加したハイグルコースのダルベッコ調整培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いる。流路中に５．０×１０６ ｃｅｌｌｓ ／ ｍＬの濃度に調整した内皮細胞懸濁液を流通させて空間内を満たす、その後流れを止めて３０分間静置することで基板表面に細胞を接着させる。更にＤＭＥＭを流通させ余分な細胞を基板表面から洗浄により取り除いた後に３７ ℃，５ ％ＣＯ２の雰囲気下で２４時間培養を行なう。その後内皮細胞の細胞骨格のアクチンフィラメントをＦＩＴＣ−ファロイジン（ＳＩＧＭＡ）を固定染色し蛍光顕微鏡で観察を行う。固定染色は培養液を取り除いた後に、中性緩衝ホルムアルデヒド液（和光純薬）を入れて室温で１０分間静置して細胞を固定する。さらに、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ 溶液を入れて室温で５分間静置して、細胞膜を溶解させることで細胞の透過処理をする。その後、ＦＩＴＣ−ファロイジン水溶液に２０分間浸漬させることで内皮細胞のアクチンフィラメントの固定染色を行った。最後にリン酸緩衝液でさらに十分に洗浄し、余分な蛍光試薬を取り除いてから蛍光観察を行う。培養基板上に接着した血管内皮細胞の形状を細胞の伸展率から算出する。細胞の伸展率は細胞を楕円に近似した際の長軸と短軸の比で定義する。伸展率を算出するに当たっての楕円の長軸および短軸長さは顕微鏡のデータをＰＣに取り込み、Ｓｃｉｏｎ ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ）を用いて数値化したものを用いて計算する。
すると、微粒子サイズを変化させることで細胞の伸展率を様々に変化させることが可能であることが分かる。上記の特長は様々サイズを有する微粒子を単一基板上に導入することで伸展率を変化させた細胞形状を基板加工技術を直接用いることなく簡便に再現できる可能性を示したものである。
（実施例１２）
本実施例においては、負の誘電泳動力を用いて微粒子を固定化して細胞固定用担体の作製を行なった。用いた電極構成の概略図を図５，図６に示す。本実施例においては用いたスペーサ厚みは７５ μｍとする。流路内の天井部にくし型電極１２を配置し、負の誘電泳動力を用いて底面部で微粒子を捕捉する構成である。負の誘電泳動力を用いる方法は電気的な反発力を用いて対向する壁面に微粒子を押し付けるために、電極部分に直接捕捉させる正の誘電泳動力に比べると弱い捕捉力である。しかし電極部に直接微粒子を捕捉する訳ではないので、電極部分が繰り返し利用できる等の特徴がある。電極材料には、ＩＴＯ（インジウム―スズ―酸化物）を用いる。ＩＴＯ薄膜基板を酸素プラズマ処理によりクリーニングした後に一般的なフォトリソグラフィー法によってレジストパターンを形成する（厚さ１．５ μｍ）。濃塩酸と塩化第２鉄を等量混合したエッチャントに浸漬させて（４５℃， ３ ｍｉｎ）、露出しているＩＴＯ部分を取り除く。その後流水で基板表面を洗浄し剥離材でレジストを取り除くことでＩＴＯくし型電極を作製する。その後両基板は有機系溶剤，アルコール系溶剤，水系溶剤，脱イオン水で順に洗浄を行ない、使用する直前まで脱イオン水中で保管する。天井部および底面部はそれぞれリードを介してマルチファンクションシンセサイザに接続する。底面部には表面にアミノ基を導入したガラス基板、微粒子はポリスチレンからなり、外殻がアミノ基修飾されているもの（直径１０ μｍ）、溶媒には脱イオン水をそれぞれ用いる。ここで更にリフトオフ法またはステンシルを用いた方法等によりアレイ状にアミノ基が導入されていても良い。マルチファンクションシンセサイザを用いて印加周波数を１０ ＭＨｚ， 印加電圧を±５ Ｖに設定した正弦交流波を５分間印加することにより、微粒子を底面部の所望の位置に捕捉する。交流電圧を印加している際に、目的領域外へのブロッキング処理や液体を流通させる等の非特異吸着防止のための処置は適宜行なう。微粒子を捕捉した後にアミノ基認識部位を両末端に備える架橋剤によって固体基板上に微粒子を固定化する。例えばアルデヒド基やスクシンイミド基を末端に有するものから選択される。その後１００℃で２時間加熱することで基板表面に微粒子を強固に固定化する。さらに、微粒子表面を細胞外基質蛋白質等でコーティングすることで細胞固定用担体を提供できる。
Endothelial cells derived from bovine aorta are cultured on the surface of the fine particle array prepared from Examples 5 to 11 and Comparative Example. It is also possible to pre-treat with an extracellular scaffold protein such as fibronectin before seeding the cells. High glucose Dulbecco's conditioned medium (INVITROGEN) supplemented with 10% bovine serum is used as the cell culture medium. An endothelial cell suspension adjusted to a concentration of 5.0 × 10 6 cells / mL is circulated in the flow path to fill the space, and then the flow is stopped and allowed to stand for 30 minutes to adhere the cells to the substrate surface. . Further, after DMEM is circulated and excess cells are removed from the substrate surface by washing, the cells are cultured in an atmosphere of 37 ° C. and 5
Then, it turns out that it is possible to change the extension rate of a cell variously by changing microparticle size. The above features show the possibility of easily reproducing cell shapes with different stretch rates by introducing fine particles having various sizes onto a single substrate without directly using the substrate processing technique.
Example 12
In this example, a cell immobilization carrier was prepared by immobilizing fine particles using negative dielectrophoretic force. Schematic diagrams of the electrode configuration used are shown in FIGS. In this embodiment, the spacer thickness used is 75 μm. In this configuration, the comb-shaped
（実施例１３）
本実施例においては、流路内の空間ごとゲルによって固定することによってソフトマテリアル表面に微粒子を固定化し、電極および流路系の繰り返し使用を検討する。微粒子は正の誘電泳動を用いて基板上に配列される。電極構成は実施例１と同様となる。厚さ１００ μｍのスペーサを介して天井部と底面部の固体基板を貼り付けて、液の導入口と排出口を備えた流路内で行なう。固体基板にはスライドガラス、電極材料にはＩＴＯを用いた。底面部においてはＩＴＯ基板を酸素プラズマ処理によりクリーニングした後に一般的なフォトリソグラフィー法によってネガタイプのレジストパターンを形成する（厚さ１０ μｍ）。その後基板表面にフッ素化合物等を導入して基板表面の撥水性を予め高めておく。例えば末端にフッ素化合物が修飾されているシランカップリング材等を用いる。上記処理は後述のように基板とハイドロゲルとの密着性を軽減し、ゲル化した後に基板からの容易な剥離を可能にするためである。撥水処理は上下の両面の基板について施しておく。マルチファンクションシンセサイザを用いて印加周波数を１０ ＭＨｚ， 印加電圧を±５ Ｖに設定した正弦交流波を５分間印加することにより、微粒子を底面部の所望の位置に捕捉する。微粒子には直径が０．５〜５０ μｍのポリスチレンを、ハイドロゲルは生体適合性が高い材料として公知のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を架橋剤として用いた。誘電泳動は導電率を１５ ｍＳｍ-1以下に調整したＨＥＰＥＳバッファーに２アクリル酸ＰＥＧ（ＰＥＧＤＡ， Ｍｗ５００）と光重合開始材をそれぞれ重量％濃度で１０ ％ と０．１ ％ずつで混合した溶液中で行なう。正の誘電泳動力によって微粒子が所望の位置に捕捉されている状態で、ＵＶランプを３０〜１００秒間照射してＰＥＧハイドロゲルの作製を行なった。脱イオン水およびリン酸バッファー等でゲル表面の洗浄をした後にゲル自体を基板から剥離し、ソフトマテリアル表面に微粒子が固定化された細胞固定用担体を提供することができる。
(Example 13)
In the present embodiment, the fine particles are fixed on the surface of the soft material by fixing the space in the flow channel with gel, and the repeated use of the electrode and the flow channel system is studied. The microparticles are arranged on the substrate using positive dielectrophoresis. The electrode configuration is the same as in Example 1. The ceiling and bottom solid substrates are pasted through a spacer having a thickness of 100 μm, and this is performed in a flow path having a liquid inlet and outlet. A glass slide was used for the solid substrate, and ITO was used for the electrode material. On the bottom surface, after the ITO substrate is cleaned by oxygen plasma treatment, a negative type resist pattern is formed by a general photolithography method (thickness: 10 μm). Thereafter, a fluorine compound or the like is introduced into the substrate surface to increase the water repellency of the substrate surface in advance. For example, a silane coupling material whose end is modified with a fluorine compound is used. The above treatment is for reducing the adhesion between the substrate and the hydrogel as described later, and enabling easy peeling from the substrate after gelation. The water repellent treatment is applied to the upper and lower substrates. By applying a sinusoidal AC wave with an applied frequency set to 10 MHz and an applied voltage set to ± 5 V using a multi-function synthesizer for 5 minutes, fine particles are captured at a desired position on the bottom surface. As fine particles, polystyrene having a diameter of 0.5 to 50 μm was used as a crosslinking agent, and as hydrogel, polyethylene glycol (PEG) known as a material having high biocompatibility was used as a crosslinking agent. Dielectrophoresis is performed in a solution in which 2 PEG acrylate (PEGDA, Mw500) and photopolymerization initiator are mixed at a concentration of 10% and 0.1% by weight in a HEPES buffer whose conductivity is adjusted to 15 mSm −1 or less, respectively. To do. A PEG hydrogel was prepared by irradiating a UV lamp for 30 to 100 seconds in a state where fine particles were captured at a desired position by a positive dielectrophoretic force. After washing the gel surface with deionized water, phosphate buffer, or the like, the gel itself can be peeled from the substrate to provide a cell immobilization carrier in which fine particles are immobilized on the soft material surface.
１．導入口
２．排出口
３．捕捉部
４．電極
５．電極
６．天井部基板
７．底面部基板
８．スペーサ
９．配線（リード）
１０．マルチファンクションシンセサイザ
１１．微粒子
１２．電極
1. Introduction
10.
Claims (13)
表面に凹凸を形成する微粒子を固定化した固体基板を有し、
前記微粒子が細胞の接着、固定を可能とする表面を有することを特徴とする細胞固定用基板。 A cell-fixing substrate for culturing with cells fixed,
Having a solid substrate on which fine particles that form irregularities on the surface are fixed,
A cell-fixing substrate, wherein the fine particles have a surface that enables cell adhesion and fixation.
（ａ）細胞接着性置換基、
（ｂ）細胞外マトリックス蛋白質、
（ｃ）細胞表面に提示された抗原に対して特異的に結合する抗体、
（ｄ）細胞表面に提示された抗体に対して特異的に結合する抗原、
（ｅ）特定の細胞膜レセプター蛋白質に対して特異的に結合するリガンド、
（ｆ）多糖類と結合する結合する蛋白質。 6. The cell-fixing substrate according to claim 1, wherein the fine particles hold at least one of the following (a) to (f) on the surface thereof.
(A) a cell adhesive substituent,
(B) an extracellular matrix protein,
(C) an antibody that specifically binds to an antigen presented on the cell surface;
(D) an antigen that specifically binds to an antibody displayed on the cell surface;
(E) a ligand that specifically binds to a specific cell membrane receptor protein;
(F) A binding protein that binds to a polysaccharide.
（ｇ）増殖因子・サイトカイン、
（ｈ）ホルモン、
（ｉ）酵素、
（ｊ）抗体。 The cell fixing substrate according to any one of claims 1 to 6, wherein the fine particles include at least one of the following (g) to (j) so as to be releasable.
(G) Growth factor / cytokine,
(H) hormones,
(I) an enzyme,
(J) Antibody.
前記微粒子を誘電泳動力により前記固体基板表面にアレイ状に配列させる工程と、
前記配列された微粒子を前記固体基板表面に固定化する工程と、
を有することを特徴とする細胞固定用基板の製造方法。 It is a manufacturing method of the substrate for cell fixation according to claim 8,
Arranging the fine particles in an array on the surface of the solid substrate by dielectrophoretic force;
Immobilizing the arranged microparticles on the surface of the solid substrate;
A method for producing a cell immobilization substrate, comprising:
（ｋ）化学吸着、
（ｌ）物理吸着、
（ｍ）ゲル包埋、
（ｎ）電気的な相互作用、
（ｏ）表面の親水・疎水性、
（ｐ）熱、
（ｑ）生化学反応。 The cell immobilization substrate according to any one of claims 9 to 11, wherein the fine particles are immobilized by a method selected from at least one of the following (k) to (q). Production method.
(K) chemisorption,
(L) physical adsorption,
(M) gel embedding,
(N) electrical interaction,
(O) Surface hydrophilic / hydrophobic,
(P) heat,
(Q) Biochemical reaction.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006229658A JP2008048684A (en) | 2006-08-25 | 2006-08-25 | Substrate plate for immobilizing cell, capable of regulating cellular function, and device for producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006229658A JP2008048684A (en) | 2006-08-25 | 2006-08-25 | Substrate plate for immobilizing cell, capable of regulating cellular function, and device for producing the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008048684A true JP2008048684A (en) | 2008-03-06 |
Family
ID=39233308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006229658A Withdrawn JP2008048684A (en) | 2006-08-25 | 2006-08-25 | Substrate plate for immobilizing cell, capable of regulating cellular function, and device for producing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2008048684A (en) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010136706A (en) * | 2008-12-15 | 2010-06-24 | Covalent Materials Corp | Cell culture carrier |
| CN101948824A (en) * | 2010-05-24 | 2011-01-19 | 南京林业大学 | Novel technology for granular latex gel complex carrier immobilized cell |
| JP2012060885A (en) * | 2010-09-14 | 2012-03-29 | Keio Gijuku | Method for accumulating cell |
| WO2012049784A1 (en) * | 2010-10-15 | 2012-04-19 | 大日本印刷株式会社 | Substrate for measuring cell migration and method for examining cell migration |
| JP2012120453A (en) * | 2010-12-06 | 2012-06-28 | Dainippon Printing Co Ltd | Container for cell test and method for testing cell using the same |
| JP2014176308A (en) * | 2013-03-13 | 2014-09-25 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | Microarray, production method thereof, and applications thereof |
| US9062341B2 (en) | 2009-10-16 | 2015-06-23 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | Substrate used for cell migration assays and method for cell migration assays |
| JP7467866B2 (en) | 2019-10-02 | 2024-04-16 | 住友ゴム工業株式会社 | Hydrophilic substrate and method for producing hydrophilic substrate |
-
2006
- 2006-08-25 JP JP2006229658A patent/JP2008048684A/en not_active Withdrawn
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010136706A (en) * | 2008-12-15 | 2010-06-24 | Covalent Materials Corp | Cell culture carrier |
| US9062341B2 (en) | 2009-10-16 | 2015-06-23 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | Substrate used for cell migration assays and method for cell migration assays |
| CN101948824A (en) * | 2010-05-24 | 2011-01-19 | 南京林业大学 | Novel technology for granular latex gel complex carrier immobilized cell |
| JP2012060885A (en) * | 2010-09-14 | 2012-03-29 | Keio Gijuku | Method for accumulating cell |
| WO2012049784A1 (en) * | 2010-10-15 | 2012-04-19 | 大日本印刷株式会社 | Substrate for measuring cell migration and method for examining cell migration |
| JP2012120453A (en) * | 2010-12-06 | 2012-06-28 | Dainippon Printing Co Ltd | Container for cell test and method for testing cell using the same |
| JP2014176308A (en) * | 2013-03-13 | 2014-09-25 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | Microarray, production method thereof, and applications thereof |
| JP7467866B2 (en) | 2019-10-02 | 2024-04-16 | 住友ゴム工業株式会社 | Hydrophilic substrate and method for producing hydrophilic substrate |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2008048684A (en) | Substrate plate for immobilizing cell, capable of regulating cellular function, and device for producing the same | |
| US9476024B2 (en) | Thermoresponsive substrate with microgels, method for its preparation and culture method for biological cells | |
| Tsuda et al. | Monodisperse cell-encapsulating peptide microgel beads for 3D cell culture | |
| JP4567936B2 (en) | Support material for cell culture, cell co-culture method and co-culture cell sheet obtained therefrom | |
| Cheng et al. | Novel cell patterning using microheater‐controlled thermoresponsive plasma films | |
| WO2016208777A1 (en) | Cell culture container | |
| JP2008054511A (en) | Apparatus for immobilizing plurality of cells and method for immobilizing cell | |
| US20080057561A1 (en) | Cell culture treatment apparatus and cell culture treatment method | |
| US20100273667A1 (en) | Cell culture well-plates having inverted colloidal crystal scaffolds | |
| Choudhury et al. | Exploitation of physical and chemical constraints for three-dimensional microtissue construction in microfluidics | |
| Mikulikova et al. | Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene | |
| Sun et al. | Inkjet-printing patterned chip on sticky superhydrophobic surface for high-efficiency single-cell array trapping and real-time observation of cellular apoptosis | |
| Ishihara et al. | Spontaneously and reversibly forming phospholipid polymer hydrogels as a matrix for cell engineering | |
| Bong et al. | Synthesis of Cell-Adhesive Anisotropic Multifunctional Particles by Stop Flow Lithography and Streptavidin–Biotin Interactions | |
| Alvarez-Paino et al. | Polymer microparticles with defined surface chemistry and topography mediate the formation of stem cell aggregates and cardiomyocyte function | |
| JP2020062009A (en) | Cell culture substrate, production method of cell culture substrate, and production method of spheroid | |
| Huang et al. | Microchip system for patterning cells on different substrates via negative dielectrophoresis | |
| JP2008173018A (en) | Method for culturing cell and substrate for cell culture | |
| Li et al. | Adsorption–desorption control of fibronectin in real time at the liquid/polymer interface on a quartz crystal microbalance by thermoresponsivity | |
| EP1363961B1 (en) | End group activated polymers with oligonucleotide ligands | |
| JP2014193126A (en) | Molecule introduction method | |
| EP4190891A1 (en) | Method for manufacturing cell mass | |
| JP2005021082A (en) | System and method for controlling culture of cell or tissue | |
| Yahya | 3-Dimensional Carbon Micro-Electro Mechanical System (MEMS) Electrode for Potential Dielectrophoretic Hepatic Cell Patterning Application | |
| Wan Nurlina | 3-dimensional carbon Micro-electro Mechanical System (MEMS) electrode for potential dielectrophoretic hepatic cell patterning application/Wan Nurlina Wan Yahya |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090825 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20091210 |